Cooper - Stanica, 3. Izdanje

UD@BENICI SVEUÎLI[TA U OSIJEKU, RIJECI, SPLITU I ZAGREBU
STANICA
MOLEKULARNI PRISTUP
TRE]E IZDANJE
MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB
MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB BIBLIOTEKA SVEUÎLI[NI UD@BENICI GEOFFREY M. COOPER i ROBERT E. HAUSMAN / STANICA MOLEKULARNI PRISTUP Napisali: GEOFFREY M. COOPER ROBERT E. HAUSMAN
Stru~ni urednik hrvatskoga izdanja: prof. dr. sc. GORDAN LAUC
Recenzenti: akademkinja SIBILA JELASKA, Sveu~ili{te u Zagrebu akademik STJEPAN GAMULIN, Sveu~ili{te u Zagrebu prof. dr. sc. DRA[KO [ERMAN, Sveu~ili{te u Zagrebu prof. dr. sc. MAJA PAVELA-VRANÎ], Sveu~ili{te u Splitu doc. dr. sc. VERA CESAR, Sveu~ili{te J. J. Strossmayera u Osijeku
CIP - Katalogizacija u publikaciji Nacionalna i sveu~ili{na knji`nica - Zagreb UDK 576(075.8) 577.2(075.8) COOPER, Geoffrey M. Stanica : molekularni pristup / Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman ; urednik hrvatskog izdanja Gordan Lauc ; <prevoditelji Vesna Crnek Kunstelj ... et al.>. - Zagreb : Medicinska naklada, 2004. (Ud`benici Sveu~ili{ta u Zagrebu = Manualia Universitatis studiorum Zagrabiensis) (Biblioteka Sveu~ili{ni ud`benici) Prijevod djela: The Cell, 3rd ed. Bibliografija iza svakog poglavlja. Kazalo. ISBN 953-176-248-1 1. Hausman, Robert E. I. Citologija II. Molekularna biologija 440916191 ISBN 953-176-248-1
Kori{tenje naziva sveu~ili{ni ud`benik odobreno je: Odlukom Senata Sveu~ili{ta J. J. Strossmayera u Osijeku pod brojem 12/04. Klasa: 612-10/04-01/12, ur. br. 2158-60-01/05-02 na sjednici odrànoj 19. srpnja 2004. godine, Odlukom Senata Sveu~ili{ta u Rijeci pod brojem: Klasa: 602-09/04-01/13, ur. br. 2170-57-05-04-2 na sjednici odrànoj 16. rujna 2004. godine, Odlukom Senata Sveu~ili{ta u Splitu po brojem 01-12/6-6-2004. na sjednici odrànoj 19. srpnja 2004. godine (Manualia universitatis studiorum Spalatensis), te Odlukom Senata Sveu~ili{ta u Zagrebu br. 02-3420/3/2003. na sjednici odrànoj 12. listopada 2004. godine odobreno je kori{tenje naziaa sveu~ili{ni ud`benik (Manualia universitatis studiorum Zagrabiensis). Sva prava za hrvatsko izdanje Medicinska naklada, Zagreb
STANICA
MOLEKULARNI PRISTUP
TRE]E IZDANJE
GEOFFREY M. COOPER ROBERT E. HAUSMAN

Boston University
GORDAN LAUC
stru~ni urednik hrvatskoga izdanja
MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB, 2004.
Naslovnica Na slici je prikazan dio unutra{njosti stani~ne jezgre s nekim od brojnih proteina koji kopiraju, popravljaju i pakiraju DNA. Niti DNA prikazane su ùto. U sredi{tu slike, od vrha do dna, nalaze se replikacijske ra{lje u kojima DNA-polimeraza kopira DNA. Na lijevoj i desnoj strani slike RNA-polimeraza sintetizira glasni~ku RNA. Ve}ina DNA na slici omotana je oko nukleosoma. (David S. Goodsell, The Scripps Research Institute) Slika na po~etku I. dijela Mikrotubuli obojeni crvenom fluorescentnom bojom, a aktinska vlakna obojena zelenom fluorescentnom bojom. Slika na po~etku II. dijela Visokorezolucijska kristalna struktura (dobivena X-zrakama) ribosomnih podjedinica Slika na po~etku III. dijela Sonde koje prepoznaju ponovljene sljedove DNA na kromosomu 4 hibridizirane su s ljudskom stanicom. Slika na po~etku IV. dijela Slijed mitoze: telofaza.
The Cell: A Molecular Approach, Third Edition Copyright 2004 by Geoffrey M. Cooper. All rights reserved. This book may not be reproduced in whole or in part without permission. Address editorial correspondence to ASM Press, c/o The American Society for Microbiology, 1752 N Street NW, Washington, DC 20036 U.S.A. Address orders and requests for examination copies to Sinauer Associates, Inc., P Box 407, 23 Plumtree Road, Sunderland, MA 01375 U.S.A. .O. Phone: 413-549-4300 FAX: 413-549-1118 email: orderssinauer.com www.sinauer.com Library of Congress Cataloging-in-Publication Data Cooper, Geoffrey M. The cell : a molecular approach / Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman. 3rd ed. p. ; cm. Includes bibliographical references and index. ISBN 0-87893-214-3 (alk. paper) 1. Cytology. 2. Molecular biology. DNLM: 1. Cytology. 2. Molecular Biology. QH 581.2 C776c 2004 I. Hausman, Robert E., 1947- II. Title. QH581.2.C66 2004 571.6dc21 2003008953 Printed in U.S.A. 5 4 3 2 1
Ova je knjiga posve}ena Florance Haseltine sa zahvalno{}u {to me je pou~ila kako }u napraviti svoj prvi pokus. G.M.C.
Prevoditelji
Stru~ni urednik:
prof. dr. sc. Gordan Lauc 6. poglavlje dr. sc. Karmela Bari{i}, izvanredni profesor Farmaceutsko -biokemijskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 7. poglavlje dr. sc. Jerka Dumi} Belamari}, docent Farmaceutsko -biokemijskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 8. poglavlje dr. sc. Maja Vlahovi}, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 9. poglavlje dr. sc. Sre}ko Gajovi}, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 10. poglavlje dr. sc. Marijana Peruzovi}, redoviti profesor Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Splitu dr. sc. Irena Dr mi}, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Splitu 11. poglavlje dr. sc. Goran [imi}, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 12. poglavlje dr. sc. Marija Heffer-Lauc, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Osijeku 13. poglavlje dr. sc. Dora Vi{nji}, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu dr. sc. Vladiana Crljen-Manestar, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 14. poglavlje dr. sc. Miljenko Kapovi}, redoviti profesor Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Rijeci 15. poglavlje dr. sc. Igor Aurer, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu Rje~nik pojmova dr. sc. Ana Maru{i}, redoviti profesor Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu
Uredni~ki odbor:
prof. dr. sc. Floriana Buli}-Jaku{ Predstojnica Zavoda za biologiju Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu doc. dr. sc. Marija Heffer-Lauc Pro~elnica Katedre za biologiju Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta J. J. Strossmayera u Osijeku prof. dr. sc. Miljenko Kapovi} Pro~elnik Katedre za biologiju Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Rijeci prof. dr. sc. Marijana Peruzovi} Pro~elnica Katedre za biologiju Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Splitu
Prevoditelji
1. poglavlje dr. sc. Vesna Crnek Kunstelj, izvanredni profesor Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu dr. sc. Lukrecija Bre~evi}, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 2. poglavlje dr. sc. Mir na Flgel, redoviti profesor Far maceutsko biokemijskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 3. poglavlje dr. sc. Gordan Lauc, izvanredni profesor Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta J. J. Strossmayera u Osijeku i Farmaceutsko -biokemijskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 4. poglavlje dr. sc. Floriana Buli}-Jaku{, izvanredni profesor Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Zagrebu 5. poglavlje dr. sc. Dragan Primorac, docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta J. J. Strossmayera u Osijeku i naslovni docent Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Splitu
Kratki sadràj
Dio I. Uvod
1 2 3
Pregledno o stanicama i istraìvanju stanica 3 Stani~na kemija 41 Osnove molekularne biologije 89
Dio II. Protok geneti~kih informacija

4 5 6 7
137
Organizacija i redoslijed stani~nih genoma 139 Replikacija, odràvanje i preslagivanje genomske DNA 179 Sinteza i dorada RNA 231 Sinteza, dorada i regulacija proteina 281
Dio III. Struktura i funkcija stanice 321

8 9 10 11 12 Jezgra 323 Razvrstavanje i prijenos proteina: endoplazmatski retikul, Golgijev aparat i lizosomi 355 Bioenergetika i metabolizam: mitohondriji, kloroplasti i peroksisomi 399 Citoskelet i stani~no kretanje Stani~na povr{ina 483 435
Dio IV. Stani~na regulacija 539

13 14 15 Stani~no signaliziranje 541 Stani~ni ciklus 591 Rak 631
Sadràj
Predgovor XV Predgovor hrvatskom izdanju XVII Organizacija i obilje`ja knjige Stanica XIX
DIO I
Uvod
KLJU^NI POKUS
1
Pregledno o stanicama i istraìvanju stanica 3
PODRIJETLO I EVOLUCIJA STANICA 4
Prva stanica 4 Evolucija metabolizma 7 Dana{nji prokarioti 8 Eukariotske stanice 9 Razvoj vi{estani~nih organizama 12
Kultura animalnih stanica 32

MOLEKULARNA MEDICINA
BIOSINTEZA STANI^NIH SASTOJAKA 74

Ugljikohidrati 74 Lipidi 75 Proteini 75 Nukleinske kiseline 77
Virusi i rak 35
SA@ETAK I KLJU^NI POJMOVI 37 PITANJA 38 LITERATURA 39
STANI^NE MEMBRANE
79
2
Stani~na kemija 41
MOLEKULARNI SASTAV STANICA 41
Ugljikohidrati 42 Lipidi 44 Nukleinske kiseline 47 Proteini 50
Membranski lipidi 80 Membranski proteini 81 Transport kroz stani~ne membrane 82

KLJU^NI POKUS Smatanje
polipeptidnih lanaca 52
MOLEKULARNA MEDICINA
STANICE KAO EKSPERIMENTALNI MODELI 15

Escherichia coli 15 Kvasci 16 Dictyostelium discoideum 17 Caenorhabditis elegans 17 Drosophila melanogaster 18 Arabidopsis thaliana 18 Kralje`njaci 19
Fenilketonurija 79
SREDI[NJA ULOGA ENZIMA KAO BIOLO[KIH KATALIZATORA 56

Kataliti~ka aktivnost enzima 56 Mehanizmi enzimske katalize 57 Koenzimi 59 Regulacija enzimske aktivnosti 61
3
Osnove molekularne biologije 89
NASLJE\IVANJE, GENI I DNA 89
Geni i kromosomi 90 Geni i enzimi 91 Molekula DNA nositelj je geneti~ke informacije 93 Struktura DNA 94 Replikacija DNA 95
ORU\A STANI^NE BIOLOGIJE
20
Svjetlosna mikroskopija 21 Elektronska mikroskopija 25 Frakcioniranje stanice 28 Rast ìvotinjskih stanica u kulturi 29 Kultura biljnih stanica 34 Virusi 34
METABOLI^KA ENERGIJA
63
Slobodna energija i ATP 63 Stvaranje ATP iz glukoze 65 Dobivanje energije iz drugih organskih molekula 69 Fotosinteza 72
Sadràj
XI
EKSPRESIJA GENETI^KE INFORMACIJE 96

Kolinearnost gena i proteina 97 Uloga glasni~ke RNA 98 Geneti~ki kod 99 RNA-virusi i obrnuto prepisivanje 100
Ekspresija kloniranih gena 113 Umnoàvanje DNA lan~anom reakcijom polimeraze 115
FUNKCIJA EUKARIOTSKIH GENA 123

Geneti~ke analize u kvascima 123 Prijenos gena u biljke i ìvotinje 125 Mutageneza klonirane DNA 128 Uno{enje mutacija u stani~ne gene 128
KLJU^NI POKUS Pretpostavka
DETEKCIJA NUKLEINSKIH KISELINA I PROTEINA 117

Hibridizacija nukleinskih kiselina 117 Detekcija RNA lan~anom reakcijom polimeraze 119 Protutijela kao sonde za proteine 119 Sonde za pretraìvanje knji`nica rekombinantne DNA 121
REKOMBINANTNA DNA
104
DNA-provirusa 102
MOLEKULARNA MEDICINA HIV i
Restrikcijske endonukleaze 104 Proizvodnja rekombinantnih molekula DNA 107 Vektori za rekombinantnu DNA 108 Sekvenciranje DNA 111
AIDS 105
DIO II
Protok geneti~kih informacija

PITANJA 175 LITERATURA 175
4
Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 139
SLO@ENOST EUKARIOTSKIH GENOMA 139
Introni i egzoni 141 Ponovljeni sljedovi DNA 145 Duplikacija gena i pseudogeni 148 Sastav genoma vi{ih eukariota 149
5
Replikacija, odràvanje i preslagivanje genomske DNA 179
REPLIKACIJA DNA 179
DNA-polimeraze 180 Replikacijske ra{lje 182 Vjernost replikacije 188 Ishodi{te i inicijacija replikacije 189 Telomere i telomeraze: umnaànje krajeva kromosoma 191
Modeli homologne rekombinacije 207 Enzimi uklju~eni u homolognu rekombinaciju 209
PRESLAGIVANJE DNA
211
Mjesno-specifi~na rekombinacija 211 Transpozicija posredovana DNA intermedijarima 216 Transpozicija posredovana RNA intermedijarima 220 Amplifikacija gena 225
KLJU^NI POKUS Preslagivanje
imunoglobulinskih gena 218

MOLEKULARNA MEDICINA Karcinom
KROMOSOMI I KROMATIN 150

Kromatin 150 Centromere 154 Telomere 157
debeloga crijeva i popravak DNA 203

POPRAVAK DNA
192
SLJEDOVI ÎTAVIH GENOMA 158

Prokariotski genomi 159 Kva{~ev genom 161 Genomi Caenorhabditis elegans i vinske mu{ice 163 Biljni genomi 165 Ljudski genom 167 KLJU^NI POKUS Otkri}e introna 142 KLJU^NI POKUS Ljudski genom 170
SA@ETAK I KLJU^NI POJMOVI 173
Izravni obrat o{te}enja DNA 194 Popravak izrezivanjem (ekscizijski popravak) 197 Popravak sklon pogrje{kama 201 Rekombinacijski popravak 202
6
Sinteza i dorada RNA 231
TRANSKRIPCIJA U PROKARIOTA 231
RNA-polimeraza i transkripcija 232 Represori i negativna kontrola transkripcije 236 Pozitivna kontrola transkripcije 238
REKOMBINACIJA IZME\U HOMOLOGNIH SLJEDOVA DNA 204

Molekule DNA se rekombiniraju lomljenjem i ponovnim spajanjem 205
XII
Sadràj
EUKARIOTSKE RNA-POLIMERAZE I TRANSKRIPCIJSKI FAKTORI 239

Eukariotske RNA-polimeraze 239 Transkripcijski faktori i zapo~injanje transkripcije s pomo}u RNA-polimeraze II 240 Transkripcija polimerazom I i III 243
Mehanizam prekrajanja 266 Alternativno prekrajanje 272 Ure|ivanje RNA 273 Razgradnja RNA 274 KLJU^NI POKUS Izolacija eukariotskoga transkripcijskoga faktora 251 KLJU^NI POKUS Otkri}e snRNP 268
SMATANJE I DORADA PROTEINA 298

[aperoni i smatanje proteina 298 Enzimi i smatanje proteina 303 Kidanje proteina 303 Glikozilacija 305 Vezanje lipida 307
REGULACIJA TRANSKRIPCIJE U EUKARIOTA 244

cis-Djeluju}i regulatorni sljedovi: promotori i poja~iva~i 245 Transkripcijski regulatorni proteini 249 Struktura i funkcija transkripcijskih aktivatora 252 Eukariotski represori 255 Povezanost kromatinske strukture i transkripcije 256 Reguliranje transkripcije nekodiraju}im RNA 259 Metiliranje DNA 260
REGULACIJA FUNKCIJE PROTEINA 309

Regulacija malim molekulama 310 Fosforilacija proteina 311 Interakcija protein-protein 313
7
Sinteza, dorada i regulacija proteina 281
TRANSLACIJA mRNA 281
Transportne RNA 282 Ribosom 283 Organizacija mRNA i inicijacija translacije 289 Proces translacije 290 Regulacija translacije 296
RAZGRADNJA PROTEINA 313

Put ubikvitin-proteasom 313 Lizosomalna proteoliza 315
KLJU^NI POKUS Kataliti~ka uloga
ribosomne RNA 288

MOLEKULARNA MEDICINA Antibiotici
i sinteza proteina 292

DORADA I PROMET RNA 261

Dorada ribosomnih i transportnih RNA 262 Dorada mRNA u eukariotima 264
DIO III
Struktura i funkcija stanice

UNUTARNJA ORGANIZACIJA JEZGRE 335
Kromosomi i struktura kromatina na vi{oj razini 335 Funkcionalne domene unutar jezgre 337 Kondenzacija kromosoma 348 Ponovno formiranje interfazne jezgre 349
KLJU^NI POKUS Identifikacija
8
Jezgra 323
JEZGRINA OVOJNICA I PROMET IZME\U JEZGRE I CITOPLAZME 323
Struktura jezgrine ovojnice 324 Kompleks jezgrine pore 326 Selektivni transport proteina u jezgru i iz jezgre 328 Regulacija ulaska proteina u jezgru 332 Transport molekula RNA 334
jezgrinih lokalizacijskih signala 330

MOLEKULARNA MEDICINA Bolesti
JEZGRICA (NUCLEOLUS)
Geni za ribosomsku RNA i organizacija jezgrice 339 Transkripcija i dorada ribosomne rRNA 342 Sastavljanje ribosoma 344
339
jezgrinih lamina 340

JEZGRA ZA VRIJEME MITOZE 345

Raspadanje jezgrine ovojnice 345
Sadràj
XIII
9
Razvrstavanje i prijenos proteina:
endoplazmatski retikul, Golgijev aparat i lisozomi 355
ENDOPLAZMATSKI RETIKUL 355
Endoplazmatski retikul i izlu~ivanje proteina 356 Usmjerivanje proteina u endoplazmatski retikul 357 Ugradnja proteina u membranu ER 362 Smatanje i dorada proteina u ER 366 Glatki ER i sinteza lipida 369 Izlazak proteina i lipida iz ER 372
10
Bioenergetika i metabolizam:
mitohondriji, kloroplasti i peroksisomi 399
MITOHONDRIJI 399
Organizacija i funkcija mitohondrija 400 Geneti~ki sustav mitohondrija 401 Unos proteina i postanak mitohondrija 403
11
Citoskelet i stani~no kretanje 435
STRUKTURA I ORGANIZACIJA AKTINSKIH VLAKANA 435
Izgradnja i razgradnja aktinskih vlakana 436 Organizacija aktinskih vlakana 440 Udruìvanje aktinskih vlakana sa stani~nom membranom 442 Izbo~enja stani~ne povr{ine 445
MEHANIZAM OKSIDATIVNE FOSFORILACIJE 408

Transportni lanac elektrona 408 Kemiosmoti~ko zdruìvanje 410 Transport metabolita kroz unutra{nju membranu 414
AKTIN, MIOZIN I STANI^NO KRETANJE 447

Mi{i}na kontrakcija 447 Kontraktilne nakupine aktina i miozina u nemi{i}nim stanicama 451 Nekonvencionalni miozini 453 Migracija i puzanje stanica 454
GOLGIJEV APARAT
374
Organizacija Golgijeva aparata 375 Glikozilacija proteina u Golgijevu aparatu 377 Metabolizam lipida i polisaharida u Golgijevu aparatu 379 Razvrstavanje proteina i njihov odlazak iz Golgijeva aparata 380
KLOROPLASTI I OSTALI PLASTIDI 415

Struktura i funkcija kloroplasta 415 Genom kloroplasta 417 Unos i razvrstavanje proteina kloroplasta 418 Ostali plastidi 420
INTERMEDIJARNA VLAKNA 455

Proteini intermedijarnih vlakana 455 Izgradnja intermedijarnih vlakana 456 Unutarstani~na organizacija intermedijarnih vlakana 457 Funkcije keratina i neurofilamenata: bolesti koè i ìv~anoga sustava 459
MEHANIZAM VEZIKULARNOGA TRANSPORTA 382

Eksperimentalni pristup razumijevanju vezikularnoga transporta 383 Odabir tereta, oblaù}i proteini i pupanje vezikula 385 Stapanje vezikula 387
FOTOSINTEZA
422
Protok elektrona kroz fotosustave I i II 422 Kru`ni tok elektrona 425 Sinteza ATP 426
MIKROTUBULI
462
PEROKSISOMI
426
LIZOSOMI
389
Funkcije peroksisoma 427 Nastajanje peroksisoma 429

KLJU^NI POKUS Kemiosmoti~ka teorija 412 MOLEKULARNA MEDICINA Bolesti mitohondrija: Leberova hereditarna opti~ka neuropatija 406 SA@ETAK I KLJU^NI POJMOVI 430 PITANJA 432 LITERATURA 433
Struktura, izgradnja i dinami~ka nestabilnost mikrotubula 462 Centrosomi, centrioli i organizacija mikrotubula 463 Reorganizacija mikrotubula tijekom mitoze 466 Stabilizacija mikrotubula i stani~na polarnost 467
Lizosomske kisele hidrolaze 389 Endocitoza i nastanak lisozoma 390 Fagocitoza i autofagija 393
KLJU^NI POKUS Signalna
MIKROTUBULARNI MOTORI I KRETANJA 468

Identifikacija mikrotubularnih motori~kih proteina 468 Prijenos organela i unutarstani~na organizacija 472 Odvajanje mitoti~kih kromosoma 474 Trepetljike i bi~evi 474
KLJU^NI POKUS Ekspresija mutantnoga
hipoteza 360
MOLEKULARNA MEDICINA Gaucherova
bolest 392
keratina uzrokuje nenormalan razvitak koè 460

KLJU^NI POKUS Izolacija kinezina 470 SA@ETAK I KLJU^NI POJMOVI 478
XIV
Sadràj
PITANJA 480 LITERATURA 481
12
Stani~na povr{ina 483
STRUKTURA STANI^NE MEMBRANE 483
Fosfolipidni dvosloj 483 Membranski proteini 486 Pokretljivost membranskih proteina 490 Glikokaliks 492
Pasivna difuzija 494 Olak{ana difuzija i proteini nosa~i 494 Ionski kanali 496 Aktivni transport tjeran hidrolizom ATP 503 Aktivni transport tjeran ionskim gradijentom 507
Stani~ne stijenke biljnih stanica 519 Izvanstani~ni matriks 522
ME\USTANI^NE INTERAKCIJE 528

Proteini stani~ne adhezije 528 ^vrsti spojevi 531 Tijesni spoj ili premosnica 531 Adhezije izme|u biljnih stanica i plazmodezmosomi 532
KLJU^NI POKUS LDL-receptor 512 MOLEKULARNA MEDICINA Cisti~na
ENDOCITOZA
510
Fagocitoza 510 Endocitoza posredovana receptorom 511 Promet proteina u endocitozi 515
fibroza 509
TRANSPORT MALIH MOLEKULA 493
STANI^NA STIJENKA I IZVANSTANI^NI MATRIKS
518
Bakterijska stani~na stijenka 518
DIO IV
Stani~na regulacija
Cikli~ki GMP 561 Fosfolipidi i Ca2+ 562 Ras, Raf i signalni put MAP-kinaze 565 JAK/STAT put 570
13
Stani~no signaliziranje 541
SIGNALNE MOLEKULE I NJIHOVI RECEPTORI 541
Oblici signaliziranja izme|u dviju stanica 542 Steroidni hormoni i superporodica receptora u jezgri 543 Du{ikov oksid i ugljikov monoksid 545 Neurotransmitori 546 Peptidni hormoni i faktori rasta 546 Eikozanoidi 548 Biljni hormoni 549
PRIJENOS SIGNALA I CITOSKELET 571

Integrini i prijenos signala 571 Regulacija aktinskoga citoskeleta 574
14
Stani~ni ciklus 591
STANI^NI CIKLUS EUKARIOTSKE STANICE 591
Faze stani~noga ciklusa 592 Djelovanje stani~noga rasta i izvanstani~nih signala na regulaciju stani~noga ciklusa 594 Kontrolne to~ke stani~noga ciklusa 596 Ograni~avanje na samo jednu replikaciju DNA tijekom stani~noga ciklusa 598
SIGNALIZACIJA U RAZVOJU I DIFERENCIAJACIJI 575

Receptorska tirozin-kinaza/Ras/Raf/ ERK put u vinske mu{ice i C. elegans 575 Hedgehog i Wnt 577 Notch-signaliziranje 578
DJELOVANJE STANI^NIH POVR[INSKIH RECEPTORA 550

Receptori povezani s G-proteinom 551 Receptorske protein-tirozin kinaze 553 Receptori za citokine i nereceptorske protein-tirozin-kinaze 557 Receptori povezani s drugim enzimatskim aktivnostima 557
REGULACIJA PROGRAMIRANE STANI^NE SMRTI 579

Kaspaze i apoptoza 580 Receptori stani~ne smrti i aktivacija kaspaza 582 Signaliziranje stani~nog preìvljenja 582
KLJU^NI POKUS Src protein-
REGULATORI NAPREDOVANJA KROZ STANI^NI CIKLUS 599

MPF: Dimer Cdc2 i ciklina 599 Porodice ciklina i kinaza ovisnih o ciklinima 603 Faktori rasta ciklini tipa D 605 Inhibitori napredovanja kroz stani~ni ciklus 606
-tirozin-kinaza 554
MOLEKULARNA MEDICINA Karcinom:
PUTEVI UNUTARSTANI^NOGA PRIJENOSA SIGNALA 558

cAMP put: drugi glasnici i fosforilacija proteina 559
Prijenos signala i onkogen ras 572
DOGA\AJI U M-FAZI
Faze mitoze 608
608
Sadràj
XV
MPF i napredovanje do metafaze 611 Proteoliza i deaktivacija MPF: anafaza i telofaza 613 Citokineza 614
15
Rak 631
NASTANAK I UZROCI RAKA 631
Vrste raka 631 Nastanak raka 633 Uzroci raka 634 Svojstva stanica raka 636 Transformacija stanica u kulturi 640
TUMORSKI SUPRESORSKI GENI 657

Otkri}e tumorskih supresorskih gena 657 Djelovanje produkata tumorskih supresorskih gena 660 Uloge onkogena i tumorskih supresorskih gena u nastanku tumora 663
MEJOZA I OPLODNJA
615
Proces mejoze 615 Regulacija mejoze oocita 618 Oplodnja 620
MATI^NE STANICE I ODR@AVANJE ODRASLOGA TKIVA 621

Proliferacija diferenciranih stanica 621 Mati~ne stanice 622 Medicinska primjena mati~nih stanica 624
KLJU^NI POKUS Otkri}e MPF 600 KLJU^NI POKUS Kultura zametnih
PRIMJENA MOLEKULARNE BIOLOGIJE U SPRJEÂVANJU I LIJEÊNJU RAKA 664

Sprje~avanje i rano otkrivanje 664 Molekularna dijagnostika 665 Lije~enje 666
KLJU^NI POKUS Otkri}e
TUMORSKI VIRUSI 640

Virusi hepatitisa B i C 641 SV40 i poliomavirus 641 Papilomavirusi 642 Adenovirusi 642 Herpesvirusi 643 Retrovirusi 644
protoonkogena 648
MOLEKULARNA MEDICINA STI-571:
mati~nih stanica 622

lijek protiv raka usmjeren protiv bcr/abl onkogena 667

ONKOGENI 644
Retrovirusni onkogeni 645 Protoonkogeni 646 Onkogeni u ljudskim tumorima 648 Djelovanje onkogenih proteina 653
Odgovori na pitanja 675 Pojmovnik Kazalo 699 681
Predgovor
Knjiga Stanica pokriva jedno od najbrè napreduju}ih podru~ja prirodnih znanosti. Od izlaska prethodnoga izdanja 2000. godine dogodilo se nekoliko zna~ajnih napredaka od kojih je posebice potrebno istaknuti dovr{etak projekta sekvenciranja ljudskoga genoma. Godine 2001. objavljen je po~etni nacrt, a 2003. godine, to~no 50 godina nakon objavljivanja povijesnog rada Watsona i Cricka u kojem su objasnili strukturu molekule DNA, kompletiran je cjelokupan slijed nukleotida ljudskoga genoma. Poznavanje cjelokupnoga slijeda nukleotida u ljudskom genomu, a i nekih drugih organizama, omogu}ili su nam da odemo korak dalje od karakterizacije pojedina~nih gena i da na sadràj i organizaciju genoma gledamo globalno. Takva cjelovita perspektiva genoma otvara nove pristupe ispitivanju funkcije i regulacije gena i nedvojbeno }e nastaviti imati snaàn u~inak na istraìvanja u podru~ju stani~ne i molekularne biologije i u godinama koje slijede. Zna~ajan napredak postignut je i u razumijevanju nekoliko drugih podru~ja molekularne biologije stanice. Opisani su novi mehanizmi koji nadziru gensku ekspresiju, uklju~uju}i uzorke modifikacije histona koji reguliraju transkripcijsku aktivnost kromatina, te nekodiraju}e RNA koje reguliraju gensku ekspresiju na razini transkripcije i translacije. Analiza strukture ribosoma pri visokom razlu~ivanju razjasnila je mehanizam sinteze proteina i nedvojbeno pokazala da ribosomna RNA katalizira stvaranje peptidne veze. Bitno je napredovalo i poznavanje procesa prometovanja proteina, uklju~uju}i unos i iznos proteina iz jezgre, mitohondrija i kloroplasta, molekularne mehanizme koji reguliraju pupanje, pristajanje i stapanje transportnih vezikula. Trajno napreduje i razumijevanje stani~ne signalizacije, proliferacije i programirane smrti stanica. Medicinski usmjereni napredci uklju~uju uspje{an razvoj prvih dizajniranih lijekova kreiranih tako da djeluju protiv onkogenih proteina, primjenu profiliranja genske ekspresije radi dijagnostike tumora, kao i napredak i kontroverze povezane s potencijalnom terapijskom primjenom embrionalnih mati~nih stanica. Tre}e izdanje Stanice dopunjeno je tim uzbudljivim napretcima, no cilj i prepoznatljive osobine Stanice nisu se promijenili. Stanica je i dalje pristupa~an i razumljiv tekst kojega mogu savladati studenti koji poha|aju uvodni kolegij stani~ne i molekularne biologije. U isto smo vrijeme èljeli prenijeti uzbu|enje i izazove istraìvanja u na{em podru~ju. S tim su ciljem reprezentativni eksperimenti prikazani {irom teksta. Svako poglavlje sadrì i dio
XVIII
Predgovor
nazvan Klju~ni pokus koji detaljno opisuje jedan temeljni znanstveni rad i njegovu pozadinu u èlji da ~itatelj dobije osje}aj kako to izgleda baviti se znano{}u. Kao i prethodna izdanja, i ovo je izdanje Stanice zna~ajno oboga}eno zahvaljuju}i komentarima i prijedlozima recenzenata, kolega, nastavnika i studenata. Kao odgovor na prijedlog brojnih nastavnika, u ovom je izdanju pove}an broj prikaza Klju~nih pokusa. Novi Klju~ni pokusi uklju~uju sekvenciranje ljudskoga genoma, otkri}e novih snRNP ~estica, razja{njenje uloge intermedijarnih vlakana i izolaciju embrionalnih mati~nih stanica koji prikazuju rad Craiga Ventera, Erica Landera, Joane Steitz, Elaine Fuchs i Gail Martin. Osim toga, nova poglavlja Molekularne medicine prikazuju bolesti jezgrine lamine i razvoj STI-571 kao lijeka usmjerena na onkogene za tretman kroni~ne mijeloidne leukemije. Tako|er na zahtjev i nastavnika i studenata, broj pitanja na kraju svakoga poglavlja vi{e je nego udvostru~en kako bi dodatno potpomogao pregledu gradiva. S posebnim zadovoljstvom zahvaljujemo Dennisu Goodeu (University of Maryland) na doprinosu ovom izdanju. Dennis je ne samo napisao pro{ireni set pitanja na kraju poglavlja, ve} je i ponudio velik broj korisnih prijedloga u tekstu. Rob Hausman tako|er zahvaljuje Susan Wood za njezino strpljenje u ure|ivanju teksta i vrednovanju slika. Ponovno nam je drago da moèmo zahvaliti na{im izdava~ima, Andy Sinauer i Deanu Scudderu iz Sinauer Associates i Jeffi Holtmeieru iz ASM Press za njihovu trajnu podr{ku, a Chelsea Holabird zahvaljujemo na strpljivosti, pa`ljivom radu i dobrom humoru tijekom ure|ivanja i produkcije tre}ega izdanja Stanice.
GEOFFREY M. COOPER ROBERT E. HAUSMAN MAY 2003
Predgovor hrvatskom izdanju
Knjiga The Cell a Molecular Approach G. Coopera i R. Hausmana jedan je od najpopularnijih ud`benika molekularne i stani~ne biologije u svijetu. Svoju veliku popularnost stekla je poglavito zbog jednostavnog i studentu prilago|enog prikazivanja gradiva. Iako se radi o vrlo opse`nom ud`beniku koji dodiruje i najsuvremenije teme stani~ne i molekular ne biologije, njegova organizacija i pedago{ki pristup izlaganju gradiva omogu}uje studentu da to, ina~e vrlo sloèno gradivo, razmjerno lako usvoji. Iznimno nas veseli ~injenica da se hrvatski prijevod tre}eg izdanja ove knjige pojavljuje gotovo istovremeno s engleskim originalom. Kako je hrvatska stru~na literatura ve} niz godina optere}ena pomanjkanjem ud`benika iz molekular ne i stani~ne biologije, prevo|enje ove knjige bio je donekle i pionirski poduhvat. Za velik broj stru~nih pojmova nisu postojali hrvatski prijevodi, a ~esto je za isti pojam u istovremenoj uporabi bilo vi{e hrvatskih rije~i. Pri prevo|enju ove knjige poku{ali smo na}i optimalni kompromis izme|u uvo|enja novih hrvatskih rije~i i usvajanja uvrijeène anglosaksonske terminologije. Iako smo uloìli velik trud u usugla{avanje terminologije, svjesni smo da je na{ trud samo mali korak u, nadamo se, pravom smjeru. Nekim rje{enjima na àlost ni sami nismo zadovoljni, no bolja nismo uspjeli prona}i. Prevo|enje ove knjige u najve}em je dijelu djelo biomedicinskih fakulteta (Medicinskih fakulteta u Osijeku, Rijeci, Splitu i Zagrebu, te Farmaceutsko biokemijskog fakulteta), no nadamo se da }e ovu knjigu prihvatiti studenti i nastavnici i na drugim fakultetima. Molekularna se biologija u~vrstila kao pokreta~ napretka medicine, biotehnologije, poljodjeljstva, farmaceutske, kozmeti~ke i brojnih drugih industrija, pa u XXI stolje}u poznavanje osnova molekularne biologije vi{e nije privilegija nekolicine odabranih, ve} dio op}e kulture. Nadamo se da }e ova knjiga pridonijeti podizanju razumijevanja ove nove znanosti na kojoj se temelji velik dio napretka suvremenog dru{tva. Svako poglavlje knjige Stanica prevodio je drugi prevoditelj, pa se poglavlja me|usobno razlikuju stilom, a ponegdje i na~inom prevo|enja odre|enih stru~nih pojmova. Urednici su uloìli velik trud na ujedna~avanju tih razlika, u ~emu su nam iznimno pomogli asistenti i studenti Medicinskog fakulteta u Osijeku: Ivan Biru{, Katarina Vajn, Goran ]uri}, Martina Butko-
vi}, Martina Kori~i}, Valentina Lenardi} i mnogi drugi, na ~emu im iskreno zahvaljujemo. I pored svog tog uloènog truda, u knjizi vjerojatno jo{ uvijek ima nedosljednosti, a mo`da ~ak i neto~nosti u prevo|enju. Uo~ene pogre{ke poku{at }emo ispraviti u sljede}em izdanju, a svima koji svoje ispravke, komentare ili prijedloge po{alju elektronskom po{tom na medicinska-nakladazg.htnet.hr bit }emo iznimno zahvalni. Zagreb, u rujnu 2004. Gordan Lauc
ORGANIZACIJA I OBILJE@JA KNJIGE
Stanica
molekularni pristup
Knjiga Stanica napisana je tako da bude pristupa~an i pou~an tekst kojeg student moè cijelog usvojiti tijekom jednog semestra. Knjiga pretpostavlja da je student ve} savladao osnove biologije i op}u kemiju, ali da nije slu{ao organsku kemiju, biokemiju ili molekularnu biologiju. Organizacija knjige i njena obilje`ja pomo}i }e studentu da pristupi gradivu i uspje{no ga usvoji.
ORGANIZACIJA
Knjiga Stanica podijeljena je u ~etiri dijela. Dijelovi su me|usobno neovisni tako da je opseg i redoslijed tema mogu}e prilagoditi razli~itim kolegijima. U I. dijelu nalaze se temeljna poglavlja o evoluciji stanica, metodama za ispitivanje stanica, stani~noj kemiji i osnovama suvremene molekularne biologije. Oni studenti koji su predznanje iz ovih podru~ja stekli ili u op{irnom uvodnom kolegiju biologije, ili u prethodnom kolegiju iz molekularne biologije mogu presko~iti razli~ite dijelove ovih poglavlja. Naglasak II. dijela je na molekularnoj biologiji stanice i u njemu se nalaze poglavlja o organizaciji i redoslijedima genoma, replikaciji, odràvanju i preslagivanju DNA, transkripciji i doradi RNA, te o sintezi, doradi i regulaciji proteina. Slijed poglavlja prati tijek geneti~ke informacije (DNA RNA protein) i pruà kratki, ali suvremeni pregled ovih tema. III. dio sadràva sredi{nja poglavlja o strukturi i funkciji stanice, uklju~uju}i poglavlja o jezgri, citoplazmatskim organelima, citoskeletu i stani~noj povr{ini. Ovaj dio knjige po~inje poglavljem o jezgri koje molekularnu biologiju iz II dijela stavlja u kontekst eukariotske stanice, a zatim slijede citoplazmatski organeli, citoskelet i stani~na membrana. Sva su ova poglavlja u velikoj mjeri neovisna i mogu biti prikazana druga~ijim redoslijedom ako je to pogodnije za pojedini kolegij. Posljednji, IV dio, pokriva uzbudljivo i brzo napreduju}e podru~je stani. ~ne regulacije, a uklju~uje i teme kao {to su stani~na signalizacija, stani~ni ciklus i programirana stani~na smrt. Ovaj dio knjige zavr{ava poglavljem o raku koje prikazuje posljedice poreme}aja u osnovnim mehanizmima stani~ne regulacije.
XXII
Organizacija i obilje`ja knjige
OBILJE@JA
U knjigu Stanica ugra|eno je nekoliko pedago{kih obilje`ja koja bi trebala pomo}i studentu da savlada i poveè gradivo. Ta su obilje`ja ovdje navedena kao uputa studentu za u~enje s pomo}u ove knjige. Organizacija poglavlja. Svako je poglavlje podijeljeno na ~etiri ili pet glavnih odjeljaka, koja su zatim podijeljena na sli~an broj pododjeljaka. Popis glavnih odjeljaka koji se nalazi na po~etku svakoga poglavlja daje kratki pregled sadràja. Klju~ni pojmovi i pojmovnik. Klju~ni pojmovi su prikazani podebljano kad se prvi puta pojavljuju u poglavlju. Ti su klju~ni pojmovi ponovljeni u saètku poglavlja, a njihova definicija nalazi se u pojmovniku na kraju knjige. Ilustracije i mikrofotografije. Ilustracije u obliku crteà u boji i mikrofotografija pa`ljivo su odabrane da nadopune i vizualno poja~aju tekst. Klju~ni pokusi i Molekular na medicina. Svako poglavlje sadrì ili dva prikaza klju~nih pokusa, ili jedan prikaz klju~nog pokusa i jedan odjeljak molekularna medicina. Svrha ovih odjeljaka je studentu dati osje}aj za eksperimentalnu osnovu stani~ne i molekularne biologije i njezinu primjenu u suvremenoj medicini. Uo~ili smo da ova poglavlja mogu biti odli~na podloga za studentske seminare koji mogu biti i upotpunjeni pregledom originalnih znanstvenih ~lanaka na kojima su utemeljeni prikazi klju~nih pokusa. Saèci poglavlja. Saèci su organizirani u obliku kratkih izvoda iz glavnih odjeljaka i pododjeljaka svakog poglavlja. Ovaj odjeljak-po -odjeljak prikaz upotpunjen je popisom klju~nih pojmova koji su uvedeni u svakom poglavlju {to daje kratki, ali potpuni pregled gradiva. Pitanja i odgovori. Pro{ireni set pitanja na kraju svakog poglavlja (s odgovorima na pitanja pod neparnim rednim brojem koji se nalaze na kraju knjige) namijenjen je dodatnom ponavljanju gradiva prikazanog u poglavlju i poticanju studenta da koristi ste~eno znanje kako bi predvidio ili objasnio eksperimentalne rezultate. Literatura. Opseàn popis literature na kraju svakog poglavlja upu}uje i na pregledne i odabrane izvorne znanstvene ~lanke. Kako bi studentu bilo lak{e prona}i ~lanke koji ga zanimaju, literatura je organizirana prema odjeljcima u tekstu. Pregledni ~lanci obiljeèni su s P, a izvorni znanstveni ~lanci s I.
Dio
Uvod
1 Pregledno o stanicama i istraìvanju stanica 2 Stani~na kemija 3 Osnove molekularne biologije
Poglavlje
Pregledno o stanicama i istraìvanju stanica
Podrijetlo i evolucija stanica 4 Stanice kao eksperimentalni modeli 15 Oru|a stani~ne biologije 20
KLJU^NI POKUS: Kultura
animalnih stanica 32 Virusi i rak 35
MOLEKULARNA MEDICINA:
Spoznaje prikupljene istraìvanjima ne primjenjuju se samo u temeljnim znanostima, ve} sve vi{e i u medicini, poljoprivredi i biotehnologiji. Posebice nakon zavr{etka sekvenciranja ljudskoga genoma, napredak u stani~noj i molekularnoj biologiji otvara nove horizonte u medicinskoj praksi. Me|u udarne primjere pripada razvoj novih lijekova koji specifi~no sprje~avaju rast tumorskih stanica te potencijalna uporaba mati~nih stanica (engl. stem cells) u zamjeni o{te}enih tkiva i lije~enju bolesnika oboljelih od stanja kao {to su dijabetes, Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest, ozljede kralje`ni~ne mo`dine i sr~ane bolesti. Budu}i da se polje istraìvanja stani~ne i molekularne biologije naglo {iri, va`no je razumjeti njegove eksperimentalne osnove kao i sada{nje spoznaje. Prema tomu, ovo }e se poglavlje usredoto~iti na na~ine istraìvanja stanica te na pregledni prikaz nekih njihovih osnovnih svojstava. Za razumijevanje stani~ne biologije posebice je va`no shvatiti sli~nosti i razlike me|u stanicama. Prvi dio poglavlja raspravlja stoga i o jedinstvenosti i o razli~itosti dana{njih stanica uzimaju}i u obzir njihovu evoluciju iz zajedni~kog pretka. S jedne strane, sve stanice dijele zajedni~ke temeljne osobine koje su ostale o~uvane tijekom evolucije. Primjerice, sve stanice upotrebljavaju DNA kao svoj geneti~ki materijal, okruène su membranama i koriste iste temeljne mehanizme za metabolizam potreban pri proizvodnji energije. S druge strane, dana{nje su stanice razvile razli~ite stilove ìvota. Mnogi organizmi, poput bakterija, ameba i kvasaca sastoje se od jedne jedine stanice koja je sposobna za samostalno umnaànje. Sloèniji organizmi izgra|eni su od skupina stanica ~ije je djelovanje uskla|eno, a razli~ite stanice specijalizirane su za izvr{avanje odre|enih zadataka. Primjerice, ljudsko je tijelo izgra|eno od vi{e od 200 razli~itih vrsta stanica od kojih je svaka specijalizirana za neku od posebnih funkcija kao {to je pam}enje, vid, kretanje ili probava. Raznolikost koju iskazuju razli~ite vrste stanica vrlo je dojmljiva; primjerice, zamislimo razlike izme|u bakterija i stanica ~ovje~jega mozga. Temeljne sli~nosti izme|u razli~itih vrsta stanica predstavljaju zajedni~ku temu stani~ne biologije koja omogu}uje da se temeljni principi ste~eni iz eksperimenata s jednom vrstom stanica ekstrapoliraju na druge tipove stanica i uop}e. Nekoliko vrsti stanica i organizama na veliko se koristi u prou~avanju razli~itih
OLEKULARNA BIOLOGIJA STANICE OSNOVA JE SVIH BIOLO[KIH ZNANOSTI.
Poglavlje 1
aspekata stani~ne i molekularne biologije; u sljede}em odjeljku ovoga poglavlja raspravlja se o nekim svojstvima tih stanica koja ih ~ine osobito vrijednim eksperimentalnim modelima. Kona~no, va`no je shvatiti da napredak stani~ne biologije posebno ovisi o raspoloìvosti eksperimentalnih oru|a koja znanstvenicima omogu}uju postizanje novih opaànja ili provo|enje novih tipova eksperimenata. Prema tome, uvodno poglavlje zavr{ava raspravom o nekim eksperimentalnim pristupima koji se koriste za istraìvanje stanica, te tako|er pregledom nekih najzna~ajnijih povijesnih napredaka koji su doveli do sada{njeg razumijevanja stani~ne strukture i funkcije.
Podrijetlo i evolucija stanica

Stanice su podijeljene u dvije velike skupine koje su po~etno odre|ene time sadràvaju li ili ne sadràvaju jezgru. Prokariotske stanice (bakterije) nemaju jezgrinu ovojnicu, a eukariotske stanice imaju jezgru u kojoj je geneti~ki materijal odvojen od citoplazme. Prokariotske stanice op}enito su manje i jednostavnije od eukariotskih; osim {to im nedostaje jezgra, njihovi su genomi jednostavniji i ne sadràvaju citoplazmatske organele niti citoskelet (tabl. 1-1). Unato~ ovim razlikama, isti osnovni molekularni mehanizmi upravljaju ìvotom kako prokariota tako i eukariota, {to pokazuje da sve dana{nje stanice potje~u od zajedni~koga prvobitnog pretka. Kako se razvila ta prva stanica? A kako se razvila sloènost i raznolikost koju posjeduju dana{nje stanice?
Prva stanica
îni se da je prvi ìvot nastao prije najmanje 3,8 milijardi godina, pribli`no 750 milijuna godina nakon {to se Zemlja formirala (sl. 1-1). Kako se ìvot pojavio i kako je nastala prva stanica predmet je ~iste spekulacije, budu}i da se ti doga|aji ne mogu reproducirati u laboratoriju. Unato~ tomu, nekoliko razli~itih vrsti pokusa dalo je va`ne podatke u vezi s nekim stupnjevima toga procesa. Dvadesetih godina pro{loga stolje}a prvi je put predloèno da se jednostavne organske molekule mogu spontano polimerizirati u makromolekule u uvjetima za koje se pretpostavlja da su postojali u primitivnoj Zemljinoj atmosferi. Smatra se da je, u vrijeme kad se ìvot pojavio, Zemljina atmosfera sadràvala malo ili nije sadràvala ni{ta slobodnoga kisika nego je umjesto toga sadràvala uglavnom CO2 i N2 i uz to manje koli~ine plinova kao {to su H2, H2S i CO. Takva atmosfera osigurava reduciraju}e uvjete u kojima se mogu spontano formirati organske molekule, uz izvore energije kao {to je Sun~eva svjetlost ili elektri~no pra`njenje. Spontano formiranje organskih molekula prvi je put eksperimentalno dokazano 1950-ih, kad je
Tablica 1-1. Prokariotske i eukariotske stanice

Osobine
jezgra promjer tipi~ne stanice citoskelet citoplazmatski organeli sadràj DNA (parovi baza) kromosomi
Prokarioti
nedostaje 1 mm nedostaje nedostaje 1 106 do 5 106 jedna kru`na molekula DNA
Eukarioti
prisutna 10100 mm prisutan prisutan 1,5 107 do 5 109 mnoge linearne DNA molekule
Slika 1-1. Vremenska skala evolucije.

0 sada{njost
Skala prikazuje pribli`no vrijeme za koje se pretpostavlja da su se upravo tada zbili neki od glavnih doga|aja u evoluciji stanica.
vi{estani~ni organizmi 2
pro{lost u milijardama godina 3
prvi eukarioti oksidativni metabolizam fotosinteza
elektroda prve stanice NH3
CH4 H2O H 2O H2 H2 NH3 CH4
4.6
formiranje Zemlje
elektri~no izbijanje hla|enje voda
Stanley Miller (tada jo{ student) pokazao da izbijanje elektri~ne iskre u mje{avini H2, CH4 i NH3, u prisutnosti vode, omogu}uje formiranje razli~itih organskih molekula, uklju~uju}i i nekoliko aminokiselina (slika 1-2). Iako Millerovi eksperimenti nisu to~no ponovili uvjete na primitivnoj Zemlji, ipak su jasno pokazali vjerojatnost spontanih sinteza organskih molekula kao osnovnih materijala iz kojih su nastali prvi ìvi organizmi. Idu}i korak u evoluciji bilo je formiranje makromolekula. Dokazano je da se monomeri kao osnovne gradivne jedinice makromolekula mogu spontano polimerizirati u vjerojatnim prebioti~kim uvjetima. Zagrijavanje suhe mje{avine aminokiselina, primjerice, rezultira njihovom polimerizacijom i formiranjem polipeptida. Ali, kriti~na osobina makromolekule iz koje
zagrijavanje
Slika 1-2. Spontano formiranje organskih molekula.

Vodena para cirkulirala je kroz atmosferu koja je sadràvala CH4, NH3, i H2 u kojoj je dolazilo do elektri~nog pra`njenja. Analize produkata reakcije otkrile su nastanak razli~itih organskih molekula, uklju~uju}i aminokiseline alanin, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu i glicin.
organske molekule alanin asparaginska kiselina glutaminska kiselina glicin urea mlije~na kiselina octena kiselina mravlja kiselina
Poglavlje 1
C G A G A U U G A C
C G A G A U U G A C
G C U C
U
A
C G A G A U U
C
U
G C U C U A A C U G
C G A G A U U G A C
G C U C U A A C U G
C G A G A U U G A C
G C U C
U
G C U C U A U A C U G G A C
U
A
C
G A C
U
G
Slika 1-3. Samoumnoàvanje RNA.

Komplementarno sparivanje izme|u nukleotida (adenina A s uracilom U i gvanina G s citozinom C) omogu}uje jednom lancu RNA da posluì kao kalup za sintezu novoga lanca s komplementarnim slijedom.
se razvio ìvot morala je biti njezina sposobnost da se replicira. Jedino makromolekula sposobna da upravlja sintezom vlastitih novih kopija trebala bi biti sposobna za reprodukciju i daljnju evoluciju. Od dviju glavnih vrsti informacijskih makromolekula u dana{njim stanicama (nukleinske kiseline i proteini), jedino su nukleinske kiseline sposobne upravljati vlastitom replikacijom. Nukleinske kiseline sluè kao kalupi za vlastitu sintezu, {to se temelji na specifi~nom sparivanju baza izme|u komplementarnih nukleotida (slika 1-3). Zna~ajan korak u razumijevanju molekularne evolucije bio je postignut u ranim 1980-im godinama, kad je u laboratoriju Sida Altmana i Toma Cecha otkriveno da je RNA sposobna katalizirati odre|eni broj kemijskih reakcija, uklju~uju}i i polimerizaciju nukleotida. Daljnje studije pro{irile su opseg poznatih kataliti~kih aktivnosti RNA, uklju~uju}i opis molekula RNA koje upravljaju sintezom novoga lanca RNA prema RNA kalupu. Prema tome, RNA ima jedinstvenu sposobnost da sluì kao kalup i da katalizira vlastitu replikaciju. Stoga se op}enito vjeruje da je RNA bila inicijalni geneti~ki sustav, a smatra se da su se rani stupnjevi kemijske evolucije temeljili na samorepliciraju}im molekulama RNA razdoblje evolucije poznato kao RNA-svijet. Zatim su pravilne interakcije izme|u RNA i aminokiselina evoluirale u dana{nji geneti~ki kod, a DNA je kona~no zamijenila RNA kao geneti~ki materijal. Pretpostavlja se da se prva stanica razvila tako da se samorepliciraju}a RNA okruìla membranom izgra|enom od fosfolipida (slika 1-4). Kako se podrobno raspravlja u sljede}em poglavlju, fosfolipidi su osnovne komponente svih dana{njih biolo{kih membrana, uklju~uju}i stani~ne membrane kako prokariotskih tako i eukariotskih stanica. Klju~nu osobinu fosfolipida koji formiraju membrane predstavlja ~injenica da su oni amfipati~ne molekule, {to zna~i da je jedan dio molekule topljiv u vodi, a drugi nije. Fosfolipidi imaju duge, ugljikovodi~ne lance netopljive u vodi (hidrofobne), vezane za u vodi topljive (hidrofilne) glave koje sadràvaju fosfat. Kad ih stavimo u vodu, fosfolipidi spontano stvaraju dvosloj tako da su fosfatne glave izvana u vodenoj sredini, a ugljikovodi~ni repovi u unutra{njosti, me|usobno se dodiruju}i. Takav lipidni dvosloj oblikuje stabilnu barijeru izme|u dvaju vodenih odjeljaka pa tako, primjerice, odvaja unutra{njost stanice od vanjskog okoli{a. Ogra|ivanje samorepliciraju}e RNA i pridruènih joj molekula unutar fosfolipidne membrane moglo ih je tako odràti kao jedinicu, sposobnu za samoreprodukciju i daljnju evoluciju. U to vrijeme mogla se ve} razviti i

RNA folipidna membrana
Slika 1-4. Ogra|ivanje samoumnoàvaju}e RNA fosfolipidnom membranom.

Pretpostavlja se da su se prve stanice razvile ogra|ivanjem samoumnoàvaju}e RNA i pridruènih okolnih molekula membranom gra|enom od fosfolipida. Svaka fosfolipidna molekula ima dva duga hidrofobna repa vezana za hidrofilnu skupinu. Hidrofobni su repovi ugra|eni u lipidni dvosloj; hidrofilne glave izloène su vodi na obje strane membrane.
lipidna kula: filna h hidrofobni r rep
voda
sinteza proteina ovisna o RNA, pa se u tom slu~aju prva stanica mogla sastojati od samoumnoàvaju}e RNA i proteina koje je ona kodirala.
Evolucija metabolizma
Budu}i da su se stanice razvile u moru organskih molekula, bile su sposobne dobivati hranu i energiju izravno iz svog okoli{a. Ali takvo je stanje samo po sebi ograni~avaju}e, pa su stanice trebale razviti svoje vlastite mehanizme za proizvodnju energije i sintezu molekula potrebnih za svoju replikaciju. Proizvodnja i kontrolirana uporaba metaboli~ke energije klju~na je za sve stani~ne aktivnosti, pa su osnovni metaboli~ki putovi i dobivanje energije (potanko opisano u pogl. 2) uvelike evolucijski o~uvani u dana{njim stanicama. Sve stanice koriste adenozin-5'-trifosfat (ATP) kao svoj izvor metaboli~ke energije za provo|enje sinteze stani~nih dijelova i izvr{avanje drugih aktivnosti za koje je potrebna energija, poput kretanja (primjerice, mi{i}na kontrakcija). Smatra se, da su se mehanizmi koje stanice koriste za proizvodnju ATP razvili u tri stupnja, {to odgovara evoluciji glikolize, fotosinteze i oksidativnoga metabolizma (slika 1-5). Razvoj ovih metaboli~kih puteva promijenio je atmosferu Zemlje, ~ime se promijenio i tijek daljnje evolucije.
glikoliza C
12 6
2 C3H6
nastaje 2 ATP
fotosinteza 6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2 glukoza oksidativni metabolizam C

12 6 2
Slika 1-5. Stvaranje metaboli~ke energije.

Glikoliza je anaerobna razgradnja glukoze do mlije~ne kiseline. Fotosinteza iskori{tava energiju Sun~eve svjetlosti za sintezu glukoze iz CO2 i H2O, a pri tomu se osloba|a O2 kao sporedni produkt. O2 oslobo|en fotosintezom iskori{tava se u oksidativnom metabolizmu, u kojem se glukoza razgra|uje do CO2 i H2O osloba|aju}i mnogo vi{e energije nego {to se dobije glikolizom.
6 CO2 + 6 H2O
nastaje 3638 ATP
Poglavlje 1
stani~ mem stani~ stijen
Pretpostavlja se da su prve reakcije stvaranja energije, u Zemljinoj atmosferi koja je u po~etku bila anaerobna, uklju~ivale razlaganje organskih molekula u odsutnosti kisika. Te su reakcije vjerojatno bile oblik dana{nje glikolize anaerobne razgradnje glukoze u mlije~nu kiselinu s ~istim dobitkom energije od dviju molekula ATP Uz kori{tenje ATP kao svojeg izvora . stani~ne kemijske energije, sve dana{nje stanice obavljaju glikolizu, {to je u skladu s idejom da su se te reakcije pojavile vrlo rano tijekom evolucije. Glikoliza je omogu}ila mehanizam kojim se energija sadràna u ve} oblikovanim organskim molekulama (primjerice, glukoza) moè pretvoriti u ATP koji se tada moè iskoristiti kao izvor energije za pokretanje drugih metaboli~kih reakcija. Op}enito je mi{ljenje da je razvoj fotosinteze bio idu}i veliki evolucijski korak koji je dopustio da stanica iskoristi energiju Sun~eve svjetlosti ~ime se postigla neovisnost o kori{tenju ve} oblikovanih organskih molekula. Prva fotosinteti~ka bakterija, koja se razvila prije vi{e od 3 milijarde godina, vjerojatno je koristila H2S da pretvori CO2 u organske molekule put fotosinteze koji neke bakterije jo{ uvijek koriste. Kori{tenje H2O kao donora elektrona i vodika za pretvorbu CO2 u organske spojeve razvilo se kasnije, a va`na posljedica bila je mijenjanje Zemljine atmosfere. Kori{tenje H2O u fotosinteti~kim reakcijama stvara kao nusprodukt slobodni O2; misli se da je ovaj mehanizam bio odgovoran za stvaranje obilnih koli~ina O2 u Zemljinoj atmosferi. Osloba|anje O2 kao posljedica fotosinteze promijenilo je okoli{ u kojem su se stanice razvijale pa se op}enito smatra da je to dovelo do razvoja oksidativnoga metabolizma. S druge strane, mogu}e je da se oksidativni metabolizam razvio prije fotosinteze porastom atmosferskog O2 koji je tada pruìo jaku selektivnu prednost za organizme sposobne za kori{tenje O2 u reakcijama koje proizvode energiju. U svakom slu~aju, O2 je visoko reaktivna molekula, pa je oksidativni metabolizam, koriste}i tu reaktivnost, omogu}io mehanizam za stvaranje energije iz organskih molekula koji je puno efikasniji od anaerobne glikolize. Primjerice, potpuna oksidativna razgradnja glukoze na CO2 i H2O stvara energetski ekvivalent od 36 do 38 molekula ATP za razliku od 2 molekule ATP koje nastaju anaerobnom glikolizom. , Uz nekoliko iznimaka, dana{nje stanice koriste oksidativne reakcije kao svoj glavni izvor energije.
Dana{nji prokarioti
Dana{nji prokarioti, u koje ubrajamo sve razli~ite tipove bakterija, podijeljeni su u dvije skupine arhebakterije i eubakterije koje su se rano razdvojile tijekom evolucije. Neke arhebakterije ìve u ekstremnom okoli{u koji danas nije uobi~ajen, ali je vjerojatno prevladavao na primitivnoj Zemlji. Primjerice, termoacidofili ìve u vru}im sumpornim vrelima na temperaturama do 80 C s niskom pH vrijedno{}u do 2. Eubakterije, me|u koje spadaju uobi~ajeni oblici dana{njih bakterija, velika su skupina organizama koja ìvi u razli~itim vrstama okoli{a kao {to su zemlja, voda, i drugi organizmi (primjerice, ljudski patogeni). Bakterijske su stanice ve}inom okrugle, {tapi}aste ili spiralne, s promjerom od 1 10 mm. Sadràj DNA varira od 0,6 milijuna do 5 milijuna parova baza, {to je dovoljna koli~ina da kodira oko 5.000 razli~itih proteina. Najve}i i najsloèniji prokarioti su cijanobakterije, bakterije u kojima se razvila fotosinteza. Struktura tipi~ne prokariotske stanice obja{njena je na primjeru bakterije Escherichia coli (E. coli), uobi~ajena stanovnika ljudskoga probavnog trakta (slika 1-6). Stanica je {tapi}asta, promjera oko 1 mm i duljine oko 2 mm. Kao i mnogi drugi prokarioti, E. coli obavijena je krutom stani~nom stijen-
nukle
0.5 mm
Slika 1-6. Elektronskomikroskopska slika E. coli.

Stanica je obavijena stani~nom stijenkom ispod koje se nalazi stani~na membrana. DNA je smje{tena u nukleoidu. (Menge i Wurtz/Biozentrum, University of Basel/Science Photo Library/Photo Researches, Inc.)
kom izgra|enom od polisaharida i peptida. Ispod stani~ne stijenke je stani~na membrana, gra|ena od dvosloja fosfolipida i pridruènih proteina. Dok je stani~na stijenka porozna i lako propu{ta razli~ite molekule, stani~na membrana osigurava funkcionalno odvajanje izme|u unutra{njosti stanice i vanjskog okoli{a. DNA E. coli je jedna kru`na molekula u nukleotidu, koji za razliku od jezgre eukariota, nije obavijen membranom koja ga odvaja od citoplazme. Citoplazma sadràva pribli`no 30.000 ribosoma (mjesta sinteze proteina), koji su odgovorni za njezin zrnati izgled.
Eukariotske stanice
Poput prokariotskih stanica, sve eukariotske stanice okruène su membranama i sadràvaju ribosome. Me|utim, eukariotske stanice mnogo su sloènije gra|e i sadràvaju jezgru, razli~ite citoplazmatske organele i citoskelet (sl. 1-7). Najve}i i najbolje vidljiv organel eukariotskih stanica jest jezgra, s promjerom od oko 5 mm. Jezgra sadràva geneti~ku informaciju stanice, koja je u eukariota sadràna u linearnim, a ne kru`nim molekulama DNA. Jezgra je mjesto gdje se replicira DNA i sintetizira RNA; translacija RNA u proteine odvija se na ribosomima u citoplazmi. Uz jezgru, eukariotska stanica sadràva u svojoj citoplazmi razli~ite organele okruène membranama. Ovi organeli odre|uju odjeljke u kojima su lokalizirane razli~ite metaboli~ke aktivnosti. Eukariotske su stanice op}enito mnogo ve}e od prokariotskih stanica, ~esto s najmanje tisu}u puta ve}im stani~nim volumenom. Stvaranje odjeljaka s pomo}u citoplazmatskih organela osigurava eukariotskoj stanici efikasnije funkcioniranje. Dvije vrste ovih organela, mitohondriji i kloroplasti, imaju klju~nu ulogu u stvaranju metaboli~ke energije. Mitohondriji, koji se nalaze u gotovo svim eukariotskim stanicama, mjesta su odvijanja oksidativnoga metabolizma i prema tomu odgovorni su za proizvodnju ve}ine ATP dobivenog razgradnjom organskih molekula. Kloroplasti su mjesta gdje se odvija fotosinteza i na|eni su samo u biljnim stanicama i zelenim algama. Lizosomi i peroksisomi tako|er odre|uju specijalizirane metaboli~ke odjeljke za probavu makromolekula kao i za razli~ite oksidativne reakcije. Uz to, mnoge biljne stanice sadràvaju velike vakuole koje obavljaju razli~ite funkcije, uklju~uju}i probavu makromolekula i spremanje kako otpadnih produkata tako i hranjivih tvari. Zbog veli~ine i sloène gra|e eukariotskih stanica, transport proteina na njihovo to~no odredi{te unutar stanice golem je zadatak. Dva citoplazmatska organela, endoplazmatski retikul i Golgijev aparat, specifi~no su odre|eni za raspore|ivanje i transport proteina namijenjenih za sekreciju, ugradnju u stani~nu membranu i uno{enje u lizosome. Endoplazmatski je retikul opse`na mreà unutarstani~nih membrana, koja se prostire od jezgrine ovojnice kroz ~itavu citoplazmu. Njegova funkcija nije samo u doradi i transportu proteina nego tako|er u sintezi lipida. Od endoplazmatskog retikula proteini se transportiraju unutar malih membranskih vezikula do Golgijeva aparata, gdje se dalje dora|uju i razvrstavaju za transport do kona~nih odredi{ta. Uz ulogu u transportu proteina, Golgijev aparat predstavlja mjesto gdje se sintetiziraju lipidi i (u biljnim stanicama) mjesto gdje se sintetiziraju neki polisaharidi koji izgra|uju stani~nu stijenku. Eukariotske stanice imaju jo{ jednu razinu unutra{nje organizacije: citoskelet, mreù proteinskih vlakana koja se prostire kroz citoplazmu. Citoskelet je strukturna osnova stanice, odre|uje stani~ni oblik i op}enitu organizaciju citoplazme. Uz to, citoskelet je odgovoran za pokretanje cijelih stanica (primjerice, kontrakcija mi{i}nih stanica) i za unutarstani~ni transport
10
Poglavlje 1
animalna stanica peroksisom centriol mitohondrij
hrapavi endoplazmatski retikul
jezgra
glatki endoplazmatski retikul
jezgrica
lizosom citoskelet
stani~na membrana
Golgijev aparat
ribosomi
Slika 1-7. Strukture ìvotinjskih i biljnih stanica.

Obje stanice, i animalna i biljna, okruène su membranom i sadràvaju jezgru, citoskelet i mnoge zajedni~ke citoplazmatske organele. Biljne su stanice jo{ obavijene stani~nom stijenkom i sadràvaju kloroplaste i velike vakuole.
i poloàj organela i drugih struktura, uklju~uju}i i kretanje kromosoma tijekom stani~ne diobe. Eukarioti su se razvili prije barem 2,7 milijardi godina, {to je uslijedilo nakon 1 do 1,5 milijarde godina tijekom kojih su se razvili prokarioti. Istraìvanja sljedova nukleotida u njihovoj DNA pokazala su da se arhebakterije i eubakterije me|usobno razlikuju podjednako kao {to se i svaka od njih razlikuje od dana{njih eukariota. Prema tomu, izgleda da je vrlo rani doga|aj u evoluciji bilo grananje u tri linije potomstva od zajedni~koga pretka, daju}i dana{nje arhebakterije, eubakterije i eukariote. Zanimljivo je da su mnogi geni arhebakterija mnogo sli~niji genima eukariota nego genima eubakterija, {to pokazuje da arhebakterije i eukarioti dijele zajedni~ko evolucijsko podrijetlo i put i da su me|usobno srodniji, nego ijedno od njih s eubakterijama (slika 1-8). Vaàn je korak u evoluciji eukariotskih stanica stjecanje stani~nih organela okruènih membranom, {to je omogu}ilo razvoj sloènih karakteristika tih stanica. Pretpostavlja se da su organeli bili ste~eni kao rezultat povezivanja prokariotskih stanica s pretkom eukariota. Hipoteza da su eukariotske stanice evoluirale simbioti~kim povezivanjem s prokariotima endosimbioza osobito je dobro potkrijepljena istraìvanjima mitohondrija i kloroplasta za koje se pretpostavlja da su se razvili iz bakterija koje su ìvjele u ve}im stanicama. I mitohondriji i kloroplasti sli~ni su bakterijama po veli~ini, a kao i bakterije, umnaàju se diobom. Kao najva`nije treba istaknuti da i mitohondriji i kloroplasti sadràvaju vlastitu
11
biljna stanica peroksisom
citoskelet
mitohondrij vakuola
kloroplast
ribosom
jezgrica jezgra
stani~na stijenka
Golgijev aparat stani~na membrana
cijanobakterije
druge eubakterije
biljke
ìvotinje
gljive (kvasci) protisti
arhebakterije
kloroplasti
mitohondriji
Slika 1-8. Evolucija stanica.

Dana{nje su se stanice razvile iz zajedni~koga prokariotskoga pretka u tri pravca, pa imamo arhebakterije, eubakterije i eukariote. Podrijetlo mitohondrija i kloroplasta je endosimbioti~ko udruìvanje aerobnih bakterija odnosno cijanobakterija s pretcima eukariota.
12
Poglavlje 1
Tablica 1-2. Sadràj DNA u stanicama

Organizam Koli~ina haploidne DNA (milijuni parova baza)
0,6 4,6
Bakterije
Mycoplasma E. coli
Jednostani~ni eukarioti
Saccharomyces cerevisiae (kvasac) Dictyostelium discoideum Euglena 12 70 3.000
5 mm
Biljke
Arabidopsis thaliana Zea mays (kukuruz) 125 5.000
@ivotinje
Caenorhabditis elegans (obli}) Drosophilae melanogaster (vinska mu{ica) pile zebrasta riba mi{ ~ovjek 97 180 1.200 1.700 3.000 3.000
Slika 1-9. Pretra`na elektronskomikroskopska slika Saccaharomyces cerevisiae.

Fotografija je umjetno obojena. (Andrew Syed/Science Photolibrary/Photo Researchers, Inc.)
DNA koja kodira neke njihove dijelove. DNA mitohondrija i kloroplasta replicira se svaki put kad se organel dijeli, a njezini geni prepisuju se unutar organela i informacija se prevodi na ribosomima organela. Tako mitohondriji i kloroplasti imaju vlastite geneti~ke sustave, koji se razlikuju od genoma stani~ne jezgre. Nadalje, ribosomi i ribosomne RNA tih organela srodniji su bakterijskima nego onima koji su kodirani genomom jezgre eukariota. Endosimbioti~ko podrijetlo ovih organela sada je op}e prihva}eno, s time da se smatra da su se mitohondriji razvili iz aerobnih bakterija, a kloroplasti iz fotosinteti~kih bakterija, kao {to su cijanobakterije. Udruìvanje s aerobnom bakterijom osiguralo je anaerobnoj stanici provo|enje oksidativnog metabolizma. Udruìvanje s fotosinteti~kom bakterijom osiguralo je neovisnost stanice preko sposobnosti obavljanja fotosinteze. Ovakva endosimbioti~ka udruìvanja davala su neobi~no veliku prednost partnerima {to je bilo va`no za njihov evolucijski odabir. Tijekom vremena, ve}ina originalnih gena iz ovih bakterija o~ito se ugradila u genom stani~ne jezgre, tako da genomi organela kodiraju jo{ samo nekoliko sastavnih dijelova mitohondrija i kloroplasta.
Razvoj vi{estani~nih organizama

Mnogi su eukarioti jednostani~ni organizmi koji su, poput bakterija, izgra|eni samo od jedne stanice sposobne za samoumnaànje. Najjednostavniji eukarioti su kvasci. Kvasci su mnogo sloèniji od bakterija, ali mnogo manji i jednostavniji nego stanice ìvotinja ili biljaka. Primjerice, naj~e{}e istraìvani kvasac Saccharomyces cerevisiae promjera je oko 6 mm, a njegova DNA sadràva 12 milijuna parova baza (slika 1-9). Ostali jednostani~ni eukarioti, me|utim, mnogo su sloènije stanice, a neke sadràvaju jednako DNA kao i ljudske stanice (tablica 1-2). Me|u njima su organizmi specijalizirani za izvr{avanje najrazli~itijih zadataka, uklju~uju}i fotosintezu, pokretanje, te hvatanje i gutanje drugih organizama kao hrane. Amoeba proteus, primjeri-
0,2 mm
Slika 1-10. Svjetlosnomikroskopska snimka Amoeba proteus.

(M. I. Walker/Photo Researchers, Inc.)
13
ce, velika je stanica, sloène gra|e. Njezin je volumen vi{e od 100.000 puta ve}i od E. coli, a duljina prema{uje 1 mm kad je stanica potpuno ispruèna (slika 1-10). Ameba je vrlo pokretan organizam koji upotrebljava citoplazmatske produètke (izdanke), nazvane pseudopodiji, za kretanje i pro`diranje hrane koju ~ine drugi organizmi poput bakterija i kvasaca. Drugi jednostani~ni eukarioti (zelene alge) sadràvaju kloroplaste i sposobni su obavljati fotosintezu. Vi{estani~ni organizmi razvili su se iz jednostani~nih eukariota pred najmanje 1,7 milijardi godina. Neki jednostani~ni eukarioti oblikuju vi{estani~ne agregate, pa se smatra da predstavljaju evolucijski prijelaz od jedne stanice prema vi{estani~nim organizmima. Tako se stanice mnogih algi (primjerice, zelene alge Volvox) me|usobno udruùju i tvore vi{estani~ne kolonije (slika 1-11), za koje se smatra da su evolucijske prete~e dana{njih biljaka. Pove}anje stani~ne specijalizacije tada je dovelo do prjelaska kolonijalnih agregata u prave vi{estani~ne organizme. Nastavljanje stani~ne specijalizacije i podjela rada me|u stanicama jednog organizma dovele su do sloènosti i razli~itosti koje se mogu opaziti kod mnogih tipova stanica koji grade dana{nje biljke i ìvotinje te ljudska bi}a. Biljke su izgra|ene od manjeg broja vrsta stanica nego ìvotinje, ali svaka od razli~itih vrsta biljnih stanica specijalizirana je za provo|enje specifi-
Slika 1-11. Kolonije zelenih algi.

Pojedina~ne stanice alge Volvox oblikuju kolonije, koje se sastoje od {upljih lopti u kojima je u èlatinozni matriks uklopljeno stotine ili tisu}e stanica. (Cabisco/Visuals Unlimited.)
(A)
(B)
Slika 1-12. Svjetlosnomikroskopske snimke tipi~nih biljnih stanica.

(C) (D)
50 m
(A) Parenhimske stanice koje su odgovorne za fotosintezu i druge metaboli~ke reakcije. (B) Kolenhimske stanice, specijalizirane su potporne stanice s debelim stani~nim stijenkama. (C) Epidermalne stanice na povr{ini lista. Si}u{ne pore (stome, pu~i) okruène su specijaliziranim stanicama koje se zovu za{titne stanice. (D) Elementi ìle (provodni) i traheide izduène su stanice poredane u nizu krajem na kraj i oblikuju ìle ksilema. (A, Jack M. Bastsack/Visuals Unlimited; B, A. J. Karpoff/ Visuals Unlimited; C, Alfred Owczarzak/Biological Photo Service; D, Biophoto Associates/ Science Source/Photo Researchers Inc.)
14
Poglavlje 1
~nih zadataka potrebnih cijelom organizmu (slika 1-12). Stanice biljaka organizirane su u tri glavna sustava tkiva: osnovno tkivo, ko`no tkivo i provodno tkivo. Osnovno tkivo sadràva parenhimske stanice koje izvode ve}inu metaboli~kih reakcija biljke, uklju~uju}i i fotosintezu. Osnovno tkivo tako|er sadràva dvije specijalizirane vrste stanica (kolenhimske stanice i
(A)i usta
(A)ii ù~ovod
(A)iii crijevo
(B)
Slika 1-13. Svjetlosnomikroskopske snimke tipi~nih ìvotinjskih stanica.

Epitelne stanice ustiju (debeli, mnogoslojni pokrov), ù~ovoda i crijeva. (B) Fibroblasti su stanice vezivnoga tkiva karakteristi~nog izduènog, vretenastog oblika. (C) Eritrociti, granulociti, limfociti i monociti u ljudskoj krvi. (A)i i (A)ii, G. W. Willis/Biological Photo Service; (A)iii, Biophoto Associates/Photo Researchers, Inc.; B, Don W. Fawcett/ Vissuals Unlimited; C, G. W. Willis/ Biological Photo Service.
(C)
eritrocit
limfocit
monocit
granulocit
15
sklerenhimske stanice) koje imaju karakteristi~nu debelu stani~nu stijenku i omogu}uju strukturnu potporu biljke. Ko`no tkivo pokriva povr{inu biljke i izgra|eno je od epidermalnih stanica koje oblikuju za{titni sloj te omogu}uju apsorpciju hranjivih tvari. Kona~no, nekoliko razli~itih tipova izduènih stanica gradi provodni sustav (ksilem i floem), koji je odgovoran za transport vode i hranjivih tvari kroz biljku. U ìvotinja se nalazi mnogo vi{e razli~itih stanica nego u biljaka. Primjerice, ljudsko je tijelo izgra|eno od vi{e od 200 razli~itih vrsta stanica, za koje se op}enito smatra da su sastavni dijelovi pet glavnih tkiva: epitelnoga tkiva, vezivnoga tkiva, krvi, ìv~anoga tkiva i mi{i}noga tkiva (slika 1-13). Epitelne stanice tvore slojeve koji pokrivaju povr{inu tijela i unutarnjih organa. Ima mnogo razli~itih vrsta epitelnih stanica, a svaka je specijalizirana za odre|enu funkciju kao {to je za{tita (koà), apsorpcija (primjerice, stanice tankoga crijeva) i sekrecija (primjerice, stanice `lijezda slinovnica). U vezivno tkivo ubrajamo kost, hrskavicu i masno tkivo, a svako od njih tvore razli~ite vrste stanica (osteoblasti, kondrociti, adipociti). Rahlo vezivno tkivo koje leì ispod epitelnoga sloja i popunjava prostore izme|u organa i tkiva u tijelu sa~injeno je od druge vrste stanica, fibroblasta. Krv sadràva nekoliko razli~itih vrsta stanica, koje imaju funkciju u transportu kisika (crvene krvne stanice ili eritrociti), upalnim reakcijama (granulociti, monociti i makrofagi) i imunoodgovoru (limfociti). @iv~ano je tkivo gra|eno od ìv~anih stanica ili neurona, koje su visoko specijalizirane za prijenos signala kroz tijelo. Razli~ite su vrste osjetilnih stanica, kao {to su stanice u oku ili uhu, jo{ k tome specijalizirane za primanje signala iz okoli{a. Kona~no, nekoliko razli~itih tipova mi{i}nih stanica odgovorno je za stvaranje sile i kretanja. Jasno je da je evolucija ìvotinja uklju~ivala razvoj odgovaraju}e raznolikosti i specijalizacije na stani~noj razini. Razumijevanje mehanizama koji kontroliraju rast i diferencijaciju tako sloènog niza specijaliziranih stanica, polaze}i od jedne oplo|ene jajne stanice, jedan je od glavnih izazova s kojim se suo~ava suvremena stani~na i molekularna biologija.
Stanice kao eksperimentalni modeli

Evolucija dana{njih stanica iz zajedni~koga pretka vrlo je zna~ajna za stani~nu i molekularnu biologiju kao eksperimentalnu znanost. Budu}i da su osnovna svojstva svih stanica o~uvana tijekom evolucije, temeljni principi spoznani iz eksperimenata s jednom vrstom stanica, op}enito su primjenjivi na druge vrste stanica. S druge strane, zbog velike raznolikosti dana{njih stanica, mnoge vrste eksperimenata mogu se mnogo lak{e izvesti s jednom vrstom stanica nego s nekom drugom. Nekoliko razli~itih vrsta stanica i organizama op}enito se koristi kao eksperimentalne modele u istraìvanju razli~itih podru~ja stani~ne i molekularne biologije. Kao {to je prikazano u sljede}im odlomcima svojstva odre|enih stanica ~ine ih posebno pogodnim pokusnim modelima.
Escherichia coli
Zbog njihove relativne jednostavnosti, prokariotske stanice (bakterije) idealni su modeli za istraìvanje temeljnih procesa u biokemiji i molekularnoj biologiji. Najtemeljitije istraìvana vrsta bakterija je E. coli, koja je dugo bila najomiljeniji organizam za istraìvanje bazi~nih mehanizama molekularne genetike. Ve}ina na{ih dana{njih spoznaja iz molekularne biologije uklju~uju}i na{e razumijevanje replikacije DNA, geneti~koga koda, ekspresije gena i sinteze proteina proizi{le su iz istraìvanja ove skromne bakterije.
16
Poglavlje 1
Slika 1-14. Bakterijske kolonije.

Slika kolonija E. coli koje rastu na povr{ini agarnog medija. (A. M. Siegelman/ Visuals Unlimited)
E. coli izuzetno je korisna molekularnim biolozima zbog svoje relativne jednostavnosti i lako}e kojom se moè razmnoàvati i istraìvati u laboratoriju. Genom E. coli, primjerice, sastoji se od otprilike 4,6 milijuna parova baza i sadràva oko 4.000 gena. Ljudski je genom gotovo tisu}u puta ve}i (pribli`no 3 milijarde parova baza) i pretpostavlja se da sadràva 3040.000 gena (tabl. 1-2). Mali genom E. coli (koji je potpuno sekvenciran 1997. godine) predstavlja o~iglednu prednost za geneti~ke analize. Molekularno geneti~ke eksperimente nadalje olak{ava brzi rast E. coli pod dobro definiranim laboratorijskim uvjetima. U optimalnim uvjetima kulture, E. coli dijeli se svakih 20 minuta. [tovi{e, klonalna populacija E. coli, u kojoj su sve stanice dobivene diobama iz jedne ishodne stanice, moè biti lako izolirana kao kolonija koja raste u poluteku}em mediju (slika 1-14). Budu}i da se bakterijske kolonije koje sadràvaju ~ak 108 stanica mogu razviti preko no}i, izoliranje geneti~ke varijante soja E. coli na primjer, mutante rezistentne na antibiotik kao {to je penicilin lako je i brzo. Lako}a kojom takvi mutanti mogu biti izoliranp i analizirani bila je odlu~na za uspjeh eksperimenata koji su definirali temeljna na~ela molekularne genetike, {to je prikazano u 3. poglavlju. Hranjivi medij u kojem se E. coli najbrè dijeli sastoji se od glukoze, soli, i razli~itih organskih spojeva, poput aminokiselina, vitamina i prethodnika nukleinskih kiselina. Me|utim, E. coli moè tako|er rasti na mnogo jednostavnijim medijima koji sadràvaju samo soli, izvor du{ika (kao {to je amonijak) i izvor ugljika i energije (kao {to je glukoza). U takvom mediju, bakterije rastu ne{to sporije (vrijeme diobe je oko 40 minuta) jer moraju same sintetizirati sve aminokiseline, nukleotide i druge organske spojeve. Sposobnost E. coli da obavi ove biosinteti~ke reakcije u jednostavnim definiranim medijima u~inila ih je izuzetno pogodnim za razja{njavanje biokemijskih putova. Dakle, brzi rast i jednostavni hranidbeni zahtjevi E. coli uvelike su olak{ali osnovne eksperimente u molekularnoj biologiji i biokemiji.
Kvasci
Iako su bakterije bile neobi~no vrijedan model za istraìvanje mnogih evolucijski o~uvanih svojstava stanice, one o~igledno nisu mogle biti uporabljene za istraìvanje stani~ne strukture i funkcije jedinstvene za eukariote. Kvasci, najjednostavniji eukarioti, imaju brojne eksperimentalne prednosti sli~ne onima u E. coli. To je bilo razlogom da su kvasci postali klju~ni model za studij mnogih temeljnih procesa u stani~noj biologiji eukariota. Genom najistraènijega kvasca, Saccharomyces cerevisiae, sastoji se od oko 12 milijuna parova baza DNA i sadràva oko 6.000 gena. Premda je genom kvasca oko tri puta ve}i nego genom E. coli, s njim se moè puno lak{e iza}i na kraj prigodom istraìvanja nego s genomima sloènije gra|enih eukariota, kao {to su ljudi. I u svojoj jednostavnosti, stanica kvasca pokazuje sve tipi~ne osobine eukariotske stanice (slika 1-15). Ona ima jezgru obavijenu jezgrinom ovojnicom, njezina je genomska DNA organizirana u 16 linearnih kromosoma, a citoplazma sadràva citoskelet i stani~ne organele. Kvasci se mogu lako uzgajati u laboratoriju i mogu se istraìvati mnogim od molekularnih pristupa koji su bili toliko uspje{ni u E. coli. Premda se kvasci ne mogu replicirati tako brzo kao bakterije, oni se ipak ~esto dijele, svaka 2 sata, a mogu lako stvarati kolonije iz jedne stanice. Prema tomu, kvasci se mogu koristiti za razli~ite geneti~ke manipulacije sli~ne onima koje se mogu izvoditi u bakterijama. Ove su osobine u~inile stanicu kvasca najpristupa~nijom eukariotskom stanicom sa stajali{ta molekularne biologije. Mutanti kvasca postali su va`ni za razumijevanje mnogih temeljnih procesa u eukariota, uklju~uju}i rep-
2 mm
Slika 1-15. Elektronskomikroskopska snimka Saccharomyces cerevisiae.

(David Scharf/Peter Arnold, Inc.)
17
likaciju DNA, transkripciju, doradu RNA, razvrstavanje proteina i regulaciju stani~ne diobe, o ~emu }emo raspravljati u sljede}im poglavljima. Jedinstvo molekularne biologije stanica postalo je prili~no jasno ~injenicom da su temeljna na~ela stani~ne strukture i funkcije otkrivena u prou~avanjima kvasaca primjenjiva na sve eukariotske stanice.
Dictyostelium discoideum
Dictyostelium discoideum jest praìvotinja koja je poput kvasca relativno jednostavan jednostani~ni eukariot. Genom D. discoideum pribli`no je deset puta ve}i od genoma E. coli mnogo sloèniji nego genom kvasca, ali znatno jednostavniji nego genomi vi{ih eukariota. [tovi{e, D. discoideum moè dobro rasti u laboratoriju i pogodan je za razli~ite genske manipulacije. U obilnim prehrambenim uvjetima, D. discoideum ìvi kao jednostani~na ameba, hrane}i se bakterijama i kvascima. Vrlo je pokretna stanica, a to svojstvo ~ini D. discoideum va`nim modelom za studiranje molekularnih mehanizama odgovornih za pokretanje animalnih stanica (slika 1-16). Primjerice, uvo|enjem odgovaraju}ih mutacija u D. discoideum bila je otkrivena uloga nekolicine gena odgovornih za stani~no pokretanje. Sljede}a je zanimljiva osobina D. discoideum sposobnost jedne stanice da agregira u vi{estani~ne strukture. Kad je opskrba hranom nedostatna, stanice se udruùju u crvolike strukture nazvane puèvima (engl. slug), od kojih svaka sadràva i do 100.000 stanica koje funkcioniraju kao jedinka. Prema tomu, ~ini se da je D. discoideum na granici izme|u jednostani~nih i vi{estani~nih organizama i vaàn je model za prou~avanje stani~ne signalizacije i interakcije izme|u stanica.
Caenorhabditis elegans
Jednostani~ni eukarioti Saccharomyces i Dictyostelium va`ni su modeli za istraìvanje eukariotskih stanica, ali za razumijevanje razvoja vi{estani~nih organizama potrebne su eksperimentalne analize biljaka i ìvotinja, koje su mnogo sloèniji organizmi. Obli} Caenorhabditis elegans (slika 1-17.) ima nekoliko zna~ajnih osobina koje ga ~ine jednim od najvi{e rabljenih modela za prou~avanje razvoja ìvotinja i stani~ne diferencijacije. Premda je genom C. elegans (oko 100 milijuna parova baza) ve}i nego genomi jednostani~nih eukariota, ipak je jednostavniji i mnogo pogodniji za rukovanje od genoma ve}ine ìvotinja. Cjeloviiti slijed njegova genoma odre|en je, pa je otkriveno da genom C. elegans sadràva oko 19.000 gena otprilike trostruki broj gena kvasca i pola od broja gena u ljudi. Biolo{ki, C. elegans relativno je jednostavan vi{estani~ni organizam: odrasle jedinke
10 mm
Slika 1-16. Dictyostelium discoideum.

Ova fotografija pokazuje gibanje dviju ameba tijekom ~etrdesetak sekundi. (ljubazno{}u Davida Knechta, University of Connecticut).
jajnik
crijevo
`drijelo
jaja 1 mm
rektum
anus
Slika 1-17. Caenorhabditis elegans.

(Od J. E. Sulston i H. R: Horvitz, 1997. Dev. Biol. 56:110.)
18
Poglavlje 1
sadràvaju samo 959 somatskih stanica, plus 1.000 do 2.000 zametnih stanica. Uz to, C. elegans se moè lako uzgajati i podvrgavati geneti~kim manipulacijama u laboratoriju. Jednostavnost gra|e C. elegans omogu}ila je detaljno prou~avanje tijeka njegova razvitka s pomo}u mikroskopa. Ovakve analize uspje{no su u{le u trag embrionalnom podrijetlu i lozi svih stanica odrasle jedinke. Geneti~ka su istraìvanja tako|er otkrila mnoge mutacije odgovorne za razvojne abnormalnosti, {to je dovelo do izolacije i karakterizacije klju~nih gena koji kontroliraju razvitak i diferencijaciju obli}a. Va`no je da sli~ni geni tako|er djeluju u sloènim ìvotinjama (uklju~uju}i ~ovjeka), {to C. elegans ~ini va`nim modelom za prou~avanje razvitka ìvotinja.
Drosophila melanogaster
Slika 1-18. Drosophila melanogaster.
(Darwin Dale/Photo Researchers, Inc.)
Poput C. elegans, vinska mu{ica Drosophila melanogaster (slika 1-18) bila je klju~ni model ìvotinjskog organizma u razvojnoj biologiji. Genom vinske mu{ice veli~inom je sli~an onom C. elegans, iako genom vinske mu{ice sadràva samo oko 14.000 gena. Nadalje, vinska se mu{ica moè lako odràvati i uzgajati u laboratoriju, a njezin kratak reprodukcijski ciklus (oko dva tjedna) ~ini je vrlo pogodnim organizmom za geneti~ke eksperimente. Mnogi temeljni pojmovi genetike kao {to je odnos izme|u gena i kromosoma proizi{li su iz istraìvanja vinske mu{ice po~etkom dvadesetoga stolje}a (vidi 3. poglavlje). Iscrpna geneti~ka analiza vinske mu{ice otkrila je mnoge gene koji kontroliraju razvoj i diferencijaciju, a sada{nje metode molekularne biologije omogu}ile su detaljnu analizu funkcije tih gena. Kao rezultat toga, istraìvanja vinske mu{ice dovela su do zna~ajnoga napretka u razumijevanju molekularnih mehanizama koji upravljaju ìvotinjskim razvojem, osobito s obzirom na uspostavljanje plana gra|e tijela sloènih vi{estani~nih organizama. Kao kod C. elegans, sli~ni geni i mehanizmi postoje kod kralje`njaka, pa je kori{tenje vinske mu{ice kao glavnog eksperimentalnog modela u suvremenoj razvojnoj biologiji nesporno.
Arabidopsis thaliana
Istraìvanje biljne molekularne biologije i razvoja jest aktivno i sve opse`nije podru~je zna~ajne ekonomske va`nosti kao i intelektualnog interesa. Budu}i da genomi biljaka imaju razinu sloènosti usporedivu sa ìvotinjskim genomima (vidi tabl. 1-2), optimalni model za istraìvanje biljnog razvoja bio bi relativno jednostavan organizam s nekim pogodnim svojstvima C. elegans i vinske mu{ice. Malena cvjetnica Arabidopsis thaliana (slika 1-19) ispunjava te kriterije i zbog toga se naveliko koristi kao model za istraìvanje biljne molekularne biologije. A. thaliana zna~ajna je zbog svojega genoma od samo oko 120 milijuna parova baza, koji sadràva otprilike 15.000 razli~itih gena sloènost sli~na onoj C. elegans i vinske mu{ice. Osim toga, A. thaliana relativno se lako uzgaja u laboratoriju, pa su razvijene metode molekularnih geneti~kih manipulacija ovom biljkom. Istraìvanja su dovela do identifikacije gena uklju~enih u razli~ite aspekte biljnog razvoja, kao {to je razvoj cvijeta. Analiza ovih gena pokazuje mnoge sli~nosti, ali i izrazite razlike, izme|u mehanizama koji kontroliraju razvoj biljaka i ìvotinja.
Kralje`njaci
Slika 1-19. Arabidopsis thaliana.
(Jeremy Burgess/Photo Researchers, Inc.)
Najsloènije ìvotinje jesu kralje`njaci, uklju~uju}i ljude i druge sisavce. Ljudski genom ima otprilike 3 milijarde parova baza oko 30 puta je ve}i od genoma C. elegans, vinske mu{ice ili A. thaliana i sadràva 30 40 tisu}a
19
gena. Osim toga, ljudsko se tijelo sastoji od vi{e od 200 razli~itih vrsta specijaliziranih tipova stanica. Ta je sloènost problem za istraìvanje kralje`njaka sa stajali{ta stani~ne i molekularne biologije, ali zanimanje za biolo{ke znanosti ipak preteìto izvire iz èlje za razumijevanjem ljudskog organizma. [tovi{e, odgovori na mnoga pitanja neposredno prakti~no vrijedna (primjerice, u medicini) moraju biti zasnovani na izravnim istraìvanjima ljudskih (ili blisko srodnih) tipova stanica. Vaàn pristup istraìvanju ljudskih stanica i stanica ostalih sisavaca uzgoj je izoliranih stanica u kulturi, gdje se njima moè manipulirati pod kontroliranim laboratorijskim uvjetima. Uporaba kultiviranih stanica omogu}ila je istraìvanje mnogih aspekata stani~ne biologije sisavaca, uklju~uju}i eksperimente koji su razjasnili mehanizme replikacije DNA, ekspresije gena, sinteze i dorade proteina i stani~ne diobe. [tovi{e, svojstvo stanica da se mogu kultivirati u kemijski definiranim medijima, omogu}ilo je istraìvanja signalnih mehanizama koji normalno kontroliraju stani~ni rast i diferencijaciju unutar organizma. Specijalizirane osobine nekih visoko diferenciranih tipova stanica u~inile su ih va`nim modelima za istraìvanja odre|enih aspekata stani~ne biologije. Primjerice, mi{i}ne su stanice visoko specijalizirane za kontrakciju, proizvode}i silu i pokret. Zbog te specijalizacije, mi{i}ne su stanice klju~ni model za istraìvanje stani~noga kretanja na molekularnoj razini. Drugi primjer pruàju ìv~ane stanice (neuroni), koje su specijalizirane za provo|enje elektrokemijskih signala na velike udaljenosti. U ljudi, aksoni ìv~anih stanica mogu biti dulji od jednog metra, a neki beskralje`njaci, poput lignje, imaju goleme neurone s velikim aksonima koji imaju i do 1 mm u promjeru. Zbog njihove visoko specijalizirane strukture i funkcije, ovi golemi neuroni va`ni su modeli za istraìvanja prijenosa iona kroz stani~nu membranu i ulogu citoskeleta u prijenosu organela iz citoplazme. @aba Xenopus laevis vaàn je model za istraìvanje ranog razvoja kralje`njaka. Jaja X. laevis neobi~no su velike stanice, s promjerom otprilike 1 mm (slika 1-20). Budu}i da se ta jaja razvijaju izvan majke, svi stupnjevi razvoja od jaja do punoglavca mogu se lako prou~avati u laboratoriju. Uz to, lako se moè pribaviti velik broj jaja X. leavis {to olak{ava biokemijsku analizu. Zbog ovih tehni~kih prednosti, X. laevis mnogo se koristio u istraìvanjima razvojne biologije i omogu}io je va`ne uvide u molekularne mehanizme koji kontroliraju razvoj, diferencijaciju i diobu stanica zametka. Zebrasta ribica (slika 1-21) ima brojne prednosti za istraìvanje genetike razvoja kralje`njaka. Ove malene ribe lako je odràvati u laboratoriju i brzo se mnoè. Uz to, zametci se razvijaju izvan majke i prozirni su, tako da se rane faze razvoja mogu lako promatrati. Mo}ne metode razvijene su da olak{aju izolaciju mutacija koje zajedni~ki utje~u na razvoj zebraste ribe, a nekoliko tisu}a takvih mutacija ve} je identificirano. Budu}i da je zebrasta ribica kralje`njak koji se lako prou~ava, obe}ava premo{}ivanje jaza izme|u ljudskih i jednostavnijih beskralje`nja~kih sustava, poput C. elegans i vinske mu{ice. Me|u sisavcima je mi{ najprikladniji za geneti~ke analize, koje }e biti olak{ane nedavnim dovr{avanjem sekvenciranja mi{jega genoma. Iako su tehni~ke pote{ko}e u istraìvanju genetike mi{a velike (u usporedbi, primjerice, s genetikom kvasa1 mm ca ili vinske mu{ice), identificirane su mnoge mutacije koje utje~u na razvoj mi{a. Najva`nije je, da su nedavna postignu}a u Slika 1-20. Jaja àbe Xenopus laevis. (ljubazno{~u Michaela Danilchika i Kimberly Ray.) molekularnoj biologiji omogu}ila stvaranje transgeni~nih mi{e-
20
(A)
Poglavlje 1
(B)
va, u kojima su specifi~ni mutirani geni uvedeni u zametne stanice mi{jeg zametka, tako da se u~inak unesenih gena na razvoj ili druge stani~ne funkcije moè istraìti izravno u cijeloj ìvotinji. Prikladnost mi{a kao modela za prou~avanje ljudskog razvoja indicirana je ne samo sli~no{}u mi{jega i ljudskoga genoma nego i ~injenicom da mutacije homolognih gena rezultiraju sli~nim razvojnim nepravilnostima kod obiju vrsta; poseban oblik poreme}aja pigmentacije predstavlja izvanredan primjer (slika 1-22).
Slika 1-21. Zebrasta ribica.
Zametak star 24 sata. (B) Odrasla riba. (A, ljubazno{}u Charlesa Kimmela, University of Oregon; B, ljubazno{}u S. Kondo.)
Oru|a stani~ne biologije

Sva znanstvena eksperimentalna istraìvanja, a to podrazumijeva i istraìvanja u stani~noj biologiji, ovise o laboratorijskim metodama koje se koriste u ispitivanju strukture i funkcije stanice. Brojni zna~ajni pomaci u na{em razumijevanju stanica izravna su posljedica razvoja novih metoda koje su omogu}ile potpuno nove pristupe istraìvanjima. Stoga je poznavanje i pravilno razumijevanje eksperimentalnih oru|a i metoda koje stoje na raspolaganju stani~nom biologu presudno ne samo za razumijevanje sada{njeg stanja, ve} i za razumijevanje budu}eg razvoja kojemu teì ovo vrlo propulzivno podru~je znanosti. U odlomcima koji slijede opisane su neke od va`nih metoda stani~ne biologije. Preostali eksperimentalni pristupi, uklju~uju}i biokemijske metode i metode molekularne biologije, bit }e opisani u idu}im poglavljima.
Slika 1-22. Mi{ kao model za razvoj ~ovjeka.

Dijete i mi{ pokazuju sli~ne defekte pigmentacije ({arenilo) {to je rezultat mutacije u genu odgovornom za normalnu migraciju melanocita (stanice odgovorne za pigmentaciju koè) tijekom embrionalnoga razvitka (ljubazno{}u R.A. Fleischman, Markey Cancer Center, University of Kentucky).
21
Svjetlosna mikroskopija
Zbog ~injenice da je ve}ina stanica premalena da bi se vidjele golim okom, istraìvanje stanica uvelike je ovisilo o uporabi mikroskopa. Doista, otkri}e stanice potaknuto je razvojem mikroskopa: Robert Hooke prvi je uveo naziv stanica 1665. godine promatraju}i komadi} pluta jednostavnim svjetlosnim mikroskopom (slika 1-23). Antony van Leeuwenhoek 1670. godine, promatrao je razli~ite tipove stanica (spermije, crvene krvne stanice, i bakterije) koriste}i mikroskop koji je pove}avao objekte oko 300 puta. Matthias Schleiden i Theodor Schwann 1838. godine predloìli su stani~nu teoriju, {to se moè smatrati ro|enjem suvremene stani~ne biologije. Mikroskopska istraìvanja biljnih tkiva, kojima se bavio Schleiden, te istraìvanja animalnih tkiva, koja je provodio Schwann, dovela su do istog zaklju~ka: svi se organizmi sastoje i gra|eni su od stanica. Nedugo nakon tog otkri}a, shvatilo se da stanice ne nastaju de novo, nego diobom ve} postoje}ih stanica. Tako prepoznavanje stanice kao osnovne jedinice svih ìvih organizama zahvaljujemo opaànjima s pomo}u svjetlosnog mikroskopa. Uz tehni~ka pobolj{anja koja dopu{taju vizualizaciju sve ve}eg broja pojedinosti stani~ne strukture, svjetlosni mikroskop i dalje ostaje osnovnim oru|em stani~ne biologije. Dana{nji svjetlosni mikroskopi mogu pove}ati objekte do pribli`no 1.000 puta njihove stvarne veli~ine. Kako je promjer ve}ine stanica izme|u 1 i 100 mm, cijele se stanice kao i neki od ve}ih stani~nih organela (jezgre, kloroplasti i mitohondriji) mogu promatrati svjetlosnim mikroskopom. Me|utim, mo} razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa nije dovoljno velika za uo~avanje finih pojedinosti stani~ne strukture. Mo} razlu~ivanja, a to je sposobnost mikroskopa da susjedne bliske objekte razlikuje kao odvojene strukture, va`nija je od same sposobnosti pove}avanja. Slike mogu biti pove}ane po èlji (na primjer, projekcijom na veliki pano), ali na taj na~in dobivena pove}anja ne pridonose ujedno i razaznavanju ve}eg broja detalja. Maksimalna mo} razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa iznosi pribli`no 0,2 m. Stoga se dva objekta koji se nalaze na manjoj udaljenosti od 0,2 mm uo~avaju kao jedan objekt ili slika, i ne mogu se me|usobno razlikovati jedan od drugoga. Teoretska granica mo}i razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa odre|ena je valnom duljinom (l) vidljive svjetlosti i sposobno{}u le}e mikroskopa da sakuplja svjetlost (numeri~ka apertura, NA), a izra~unava se prema jednad`bi: mo} razlu~ivanja = 0,61 l NA Valna duljina vidljive svjetlosti iznosi 0,4 do 0,7 mm, pa se uzima da je vrijednost l svjetlosnoga mikroskopa pribli`no 0,5 mm. Numeri~ka apertura moè se definirati kao stoàsti snop svjetla koji nakon prolaska kroz biolo{ki uzorakulazi u le}e mikroskopa (slika 1-24). Numeri~ka se apertura izra~unava prema jednad`bi: NA = h sin a gdje je h indeks loma svjetlosti medija kroz koji prolazi svjetlost na putu izme|u uzorka i le}e. Vrijednost h za zrak je 1,0, no moè se pove}ati do pribli`no 1,4, koriste}i le}e (imerzijske le}e, imerzijske objektive) prilago|ene gledanju uzorka kroz kap imerzijskog ulja. Kut a odgovara polovini {irine stoàstog snopa svjetla koji je pro{ao kroz le}u. Maksimalna vrijednost za a je 90, kod koje je sin a = 1, pa je najve}a mogu}a vrijednost numeri~ke aperture 1,4. Teoretska maksimalna mo} razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa moè se prema tome izra~unati na sljede}i na~in:
Slika 1-23. Stani~na struktura pluta.

Reprodukcija originalnog crteà Roberta Hooka tankoga reza pluta koji je promatrao pod svjetlosnim mikroskopom. Stanice koje je Hook gledao zapravo su bile samo stani~ne stijenke preostale od stanica koje su davno uginule.
22
Poglavlje 1
Slika 1-24. Numeri~ka apertura.

Svjetlo se fokusira na uzorak s pomo}u le}e kondenzora {to ga potom sakuplja le}a objektiva mikroskopa. Numeri~ka apertura odre|ena je kutom (a) stoàstoga snopa svjetla koje ulazi u le}u objektiva i indeksom refrakcije medija (obi~no zrak ili ulje) izme|u le}e i biolo{kog uzorka.
le}a objektiva a uzorak
le}a kondenzora
mo} razlu~ivanja = 0,61 0,5 = 0,22 mm 1,4 Mikroskopi koji su sposobni dosegnuti tu mo} razlu~ivanja izra|eni su ve} krajem devetnaestoga stolje}a, pa se u tom smislu daljnja pobolj{anja svjetlosnoga mikroskopa ne o~ekuju. Nekoliko se tipova svjetlosnih mikroskopa koristi rutinski u istraìvanju razli~itih aspekata stani~ne strukture. Najjednostavniji je svjetlosni mikroskop na principu prolaznog svjetla, odnosno mikroskopija svijetlog polja, kod koje svjetlost prolazi izravno kroz stanicu, a sposobnost razlikovanja pojedinih stani~nih dijelova ovisi o kontrastu kao rezultatu apsorpcije vidljive svjetlosti u stani~nim komponentama. Da bi se pove}ao kontrast izme|u razli~itih dijelova stanice, stanice se ~esto boje bojama koje reagiraju s proteinima ili nukleinskim kiselinama. Prije samog bojenja, uzorci se obi~no podvrgavaju fiksaciji (alkoholom, octenom kiselinom, ili formaldehidom) ~ija je svrha stabilizacija i o~uvanje stani~nih struktura. Analiza fiksiranih i obojenih uzoraka tkiva svjetlosnim mikroskopom, standardan je pristup istraìvanjima uzoraka tkiva u histolo{kim laboratorijima (slika 125). Tehnike bojenja ubijaju stanice, pa stoga takav na~in pripremanja stanica za analizu nije prikladan za mnogobrojne eksperimente kojima se èli ispitati ìve stanice. Izravan pak prolazak svjetlosti bez bojenja ne stvara kontrast potreban za razlikovanje mnogih unutarstani~nih dijelova, {to ograni~ava uporabu mikroskopa sa svijetlim poljem. Me|utim, kontrast izme|u valova svjetlosti koji prolaze kroz regije stanice razli~itih gusto}a moè se pove}ati modificiranjem optike svjetlosnoga mikroskopa. Dva naj~e{}a na~ina vizualizacije ìvih stanica jesu njihoSlika 1-25. Mikrofotografija obojenoga tkiva sniva analiza fazno-kontrastnom i diferencijalnom interfemljena svjetlosnim mikroskopom (svijetlo polje). rencijsko-kontrastnom mikroskopijom (slika 1-26). Oba Sekcija benignog tumora bubrega (G. W. Willis/Biological se tipa mikroskopije koriste opti~kim sustavima za pretvaPhoto Service)
23
Slika 1-26. Promatranje ìvih stanica mikroskopom.

Mikrofotografije stanica bukalne sluznice dobivene u (A) svijetlom polju, (B) faznim kontrastom, i (C) diferencijalnom interferencijsko kontrastnom mikroskopijom (susretljivo{}u Morta Abramowitza, Olympus America, Inc.)
(A)
ranje razlika u gusto}i, ili debljini razli~itih stani~nih dijelova, u razlike u kontrastu na kona~noj slici. Kod mikroskopa sa svijetlim poljem su strukture (kao {to je jezgra) slabo kontrastne jer slabo apsorbiraju svjetlo. Me|utim, brzina svjetla smanjuje se prolaskom kroz te strukture, pa je faza svjetlosti promijenjena (zaostaje) u usporedbi s fazom svjetla koje je pro{lo kroz okolnu citoplazmu. Fazno-kontrastna i interferencijska mikroskopija pretvaraju razlike u fazi svjetlosti u razlike u kontrastu, {to rezultira pobolj{anom kvalitetom slika ìvih, neobojenih stanica. Snaga svjetlosnoga mikroskopa moè se unaprijediti uporabom videokamera i kompjutera za analizu i obradu slika. Takvi elektroni~ki sustavi za obradu slika mogu bitno pove}ati kontrast slike dobiven svjetlosnim mikroskopom, omogu}uju}i vizualizaciju malih objekata koji se ina~e ne bi mogli uo~iti. Na primjer, videokamerom unaprije|ena diferencijalna interferencijsko kontrastna mikroskopija dopu{ta vizualizaciju pomicanja organela du` mikrotubula, proteinskih filamenata citoskeleta promjera 0,025 mm (slika 1-27). Me|utim, to unapre|enje ne prelazi teoretsku granicu mo}i razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa od pribli`no 0,2 mm. Iako razlu~ivanje poja~ano videokamerom omogu}uje vizualizaciju mikrotubula, oni su na kona~noj slici neo{tri i mutni, promjera najmanje 0,2 mm. Pri tomu se pojedini mikrotubuli ne mogu razlikovati od susjednih struktura. Svjetlosna mikroskopija dosegla je razinu molekularnih analiza metodama obiljeàvanja s pomo}u specifi~nih molekula koje se unutar stanica mogu vizualizirati. Specifi~ni geni i RNA transkripti mogu se detektirati hibridizacijom sa sondama koje su gra|ene od komplementarnih slijedova nukleinskih kiselina, a proteini uporabom odgovaraju}ih protutijela (vidi 3. poglavlje). I sonde i protutijela mogu se ozna~iti razli~itim biljezima koje omogu}uju njihovu vizualizaciju u svjetlosnom mikroskopu, ~ine}i mogu}im odre|ivanje poloàja specifi~nih molekula unutar pojedina~ne stanice. Fluorescentna mikroskopija u {irokoj je primjeni kao izuzetno osjetljiva metoda istraìvanja unutarstani~ne raspodjele molekula (slika 1-28). Fluorescentna boja (fluorokrom, fluorofor) primjenjuje se za ozna~ivanje odre|ene molekule unutar fiksiranih ili ìvih stanica. Fluorescentna boja je molekula koja apsorbira svjetlost jedne valne duljine, a emitira svjetlost druge valne duljine. Fluorescencija se postiè osvjetljivanjem uzorka svjetlo{}u valne duljine koja pobu|uje fluorescentnu boju, a uporabom odgovaraju}ih filtara izabire se specifi~na valna duljina svjetlosti koju potom emitira fluorescentna boja. Fluorescentni se mikroskop danas rabi u istraìvanjima razli~itih molekula unutar stanica. êsto se primjenjuje ozna~ivanje specifi~nih protutijela fluorescentnim bojama te se rabi za odre|ivanje distribucije nekog proteina unutar pojedinih stanica. Primjena zelenoga fluorescentnog proteina (GFP, engl.: green fluorescent protein) meduze za vizualizaciju proteina unutar ìvih stanica, va`no je ne-
(B)
(C)
50 mm
Slika 1-27. Videokamerom poja~ana interferencijska mikroskopija.

Elektronska obrada slike omogu}uje vizualizaciju pojedinih mikrotubula (susretljivo{}u E. D. Salmon, University of North Carolina, Chapel Hill).
2.5 mm
24
Poglavlje 1
(A)
okular
(B)
zapreka (filtar)
dihori~no ogledalo fluorescentno svjetlo pobudni (ekscitacijski) filtar le}a objektiva uzorak 10 mm
Slika 1-28. Fluorescentna mikroskopija.

(A) Svjetlo prolazi kroz pobudni (ekscitacijski) filtar koji selekcionira svjetlo odre|ene valne duljine (primjerice, plavo svjetlo), koje pak ekscitira fluorescentnu boju. Dihori~no ogledalo tad odbija ekscitacijsko svjetlo usmjeruju}i ga dolje na uzorak. Fluorescentno svjetlo koje emitira uzorak (primjerice, zeleno svjetlo) tada prolazi kroz dihori~no ogledalo i drugi filtar (engl. barrier filter) koji odabire svjetlo valne duljine koje emitira fluorescentna boja (boja kojom su ozna~ene specifi~ne molekule u uzorku). (B) Fluorescentnim mikroskopom dobivena mikrofotografija stanice plu}a da`devnjaka u kojoj je DNA obojena plavo, a mikrotubuli u citoplazmi obojeni su zeleno (Conly S. Rieder/ Biological Photo Service).
davno unapre|enje fluorescentne mikroskopije. Standardnim metodama rekombinantne DNA, GFP se moè vezati za bilo koji odabrani protein. Protein ozna~en s GFP moè se unijeti u stanicu i vizualizirati fluorescentnim mikroskopom, bez potrebe za fiksacijom i bojenjem stanica ({to bi bilo potrebno u slu~aju detekcije proteina protutijelima). Zbog svoje svestranosti, GFP je u stani~noj biologiji izuzetno popularan, a primjenjuje se u pra}enju poloàja i kretanja velikog broja razli~itih proteina u ìvim stanicama (slika 1-29). Konfokalna mikroskopija sjedinjuje zna~ajke fluorescentnog mikroskopa s elektroni~kom analizom i obradom slike, ~ime se postiè dobivanje slika s vi{e pojedinosti i ja~ega kontrasta. Malen snop svjetla, u pravilu dobiven laserom, fokusira se na odre|enu dubinu uzorka. Emitirano fluorescentno svjetlo potom se sakuplja s pomo}u detektora (videokamere). Prije nego emitirano svjetlo dosegne detektor, ono mora pro}i kroz si}u{nu konfokalnu aperturu. Konfokalna apertura je precizno smje{tena na mjestu gdje se svjetlo emitirano s odabrane dubine uzorka nalazi u fokusu (slika 1-30). Stoga samo ono svjetlo koje je emitirano s ravnine u fokusu moè dosegnuti detektor. Skeniranje uzorka proizvodi dvodimenzionalnu sliku ravnine u fokusu, koja je mnogo o{trija od slike {to se moè posti}i standardnim fluorescentnim mikroskopom (slika 1-31). [tovi{e, serija slika dobivenih s razli-
Slika 1-29. Fluorescentna mikroskopija proteina obiljeènog s GFP-om.

Protein mitohondrija spojen s GFP-om unesen je u kultivirane stanice ~ovjeka i vizualiziran fluorescentnom mikroskopijom (susretljivo{}u BD Biosciences Clontech).
25
Slika 1-30. Konfokalna mikroskopija.

Uski snop svjetla fokusira se na odre|enu dubinu uzorka, a emitirano fluorescentno svjetlo sakuplja detektor. Prije nego stigne do detektora, fluorescentno svjelo emitirano s uzorka mora pro}i kroz konfokalnu aperturu smje{tenu na mjestu gdje se svjetlo emitirano iz odabrane dubine uzorka nalazi u fokusu. Rezultat je da se detektira samo fokusirano svjetlo emitirano s odabrane dubine uzorka.
detektor fokusirano svjetlo doseè detektor konfokalna apertura svjetlo izvan fokusa ne moè dose}i detektor
~itih dubina moè posluìti za rekonstrukciju trodimenzionalne strukture uzorka koji se ispituje. Multifotonska ekscitacijska mikroskopija alternativa je konfokalnom mikroskopu u primjeni analize ìvih stanica. Uzorak se osvjetljava valnom duljinom svjetla na na~in da ekscitacija fluorescentne boje zahtijeva istovremenu apsorpciju dvaju ili vi{e fotona (slika 1-32). Vjerojatnost da dva fotona istovremeno pobude fluorescentnu boju zna~ajna je samo u onoj to~ki uzorka gdje se ulazni laserski snop svjetla nalazi u fokusu. Tako se postiè emisija fluorescencije samo s ravnine fokusa ulaznog svjetla. Ta vrlo precizno lokalizirana ekscitacija automatski proizvodi trodimenzionalo razlu~ivanje stvaraju}i trodimenzionalni slikovni prikaz ìvih stanica, bez potrebe da emitirano svjetlo prolazi kroz aperturu (kao u slu~aju konfokalnoga mikroskopa). [tovi{e, precizna lokalizacija ekscitacije smanjuje na minimum o{te}ivanje biolo{kog uzorka tijekom mikroskopiranja.
fluorescentno svjetlo u fokusu izvan fokusa uzorak
Elektronska mikroskopija
Zbog ograni~ene mo}i razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa, analiza pojedinosti stani~ne strukture zahtijevala je sna`niju mikroskopsku tehniku elektronsku mikroskopiju (EM), koja je razvijena tridesetih godina 20. stolje}a. Albert Claude, Keith Porter i George Palade, ~etrdesetih i pedesetih godina prvi su primijenili elektronsku mikroskopiju u analizi biolo{kih uzoraka. Elektronski mikroskop moè dose}i znatno ve}e razlu~ivanje od svjetlosnoga mikroskopa jer je valna duljina elektrona kra}a od valne duljine svjetlosti. Valna duljina elektrona u elektronskom mikroskopu moè biti i do 0,004 nm, {to je stostruko manja vrijednost od valne duljine vidljive svjetlosti. Teoretski bi se tom valnom duljinom mogla posti}i mo} razlu~ivanja od 0,002 nm. Me|utim, to se razlu~ivanje u praksi ne moè posti}i, budu}i da je razlu~ivanje odre|eno ne samo valnom duljinom, ve} i numeri~kom aperturom le}a mikroskopa. Numeri~ka je apertura ograni~avaju}i
Slika 1-31. Konfokalna mikrofotografija stanica ~ovjeka.

Mikrotubuli i aktinska vlakna obojeni su crvenom odnosno zelenom fluorescentnom bojom. (K. G. Murti/Visuals Unlimited.)
26
Poglavlje 1
Slika 1-32. Dvofotonska ekscitacijska mikroskopija.

Za ekscitaciju fluorescentne boje potrebna je istodobna apsorpcija dvaju fotona. To se doga|a samo u to~ki uzorka na koju je ulazno svjetlo fokusirano, tako da se fluorescentno svjetlo emitira samo s odabrane dubine uzorka.
laserski snop
fluorokrom
uzorak koji sadr` fluorokrome
dvofotonska ekscitacija
foton
5 mm
Slika 1-33. Pozitivno bojenje.

Transmisijsko-elektronska mikrofotografija pozitivno obojene bijele krvne stanice (Don W. Fawcett/Visuals Unlimited).
faktor u elektronskoj mikroskopiji jer zna~ajke elektromagnetnih le}a odre|uju veli~inu kuta njihove aperture na pribli`no 0,5, {to odgovara numeri~kim aperturama od svega oko 0,01. Zato je, u optimalnim uvjetima, mo} razlu~ivanja elektronskoga mikroskopa oko 0,2 nm. Nadalje, razlu~ivanje koje se moè posti}i na biolo{kim uzorcima ograni~eno je i njima svojstvenom nedostatno{}u kontrasta. To je razlog da maksimalna mo} razlu~ivanja elektronskoga mikroskopa iznosi 1 do 2 nm za biolo{ke uzorke. Premda je to razlu~ivanje EM-a znatno manje od razlu~ivanja predvi|enog izra~unavanjem valne duljine elektrona, ono je vi{e no stostruko ve}e mo}i razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa. Dva osnovna tipa elektronskoga mikroskopa, transmisijski (TEM) i pretra`ni (engl. scanning, SEM), na veliko se primjenjuju u istraìvanjima stanica, a zajedni~ko im je to da se u stvaranju slike koriste snopom elektrona. Princip transmisijske elektronske mikroskopije sli~an je mikroskopiji u svijetlom polju. Uzorci se fiksiraju i boje solima te{kih metala koje omogu}uju stvaranje kontrasta jer raspr{uju elektrone. Snop elektrona prolazi kroz uzorak i fokusira se na fluorescentnom zaslonu gdje se stvara slika. Elektroni koji nalije}u na ione te{kih metala prolaze}i kroz uzorak skre}u i udaljuju se, pa ne pridonose kona~noj slici. Na kona~noj slici obojena podru~ja uzorka tamne su boje. Uzorci koji se ispituju transmisijskim elektronskim mikroskopom mogu se prirediti s pozitivnim ili negativnim bojenjem. U pozitivnom bojenju, uzorci tkiva reù se u ultratanke rezove koji se boje solima te{kih metala (osmijev tetraoksid, uranov acetat, olovni citrat), koje pak reagiraju s lipidima, proteinima, i nukleinskim kiselinama. Ioni te{kih metala veù se na razne stani~ne strukture, {to rezultira tamnim obojenjem na finalnoj slici (slika 1-33). Alternativne procedure pozitivnog bojenja tako|er se koriste u identifikaciji specifi~nih makromolekula u stanici. Na primjer, protutijela ozna~ena te{kim metalima (~esticama zlata) koriste se ~esto u unutarstani~noj lokalizaciji specifi~nih proteina. Ta je metoda sli~na fluorescentnoj mikroskopiji kod koje se protutijela ozna~uju fluorescentnim bojama. Negativno bojenje korisno je za vizualizaciju intaktnih i neo{te}enih stani~nih struktura (bakterija, izoliranih stani~nih organela, i makromolekula) (slika 1-34). Kod te metode, biolo{ki uzorak postavlja se na nosa~ prekriven tankim filmom. Metalna se boja ostavi da se osu{i oko povr{ine uzorka, ~ime se neobojeni uzorak okruì filmom boje, stvaraju}i tako sliku u kojoj uzorak izgleda svijetao nasuprot tamno obojenoj pozadini. Sjen~anje metalom jo{ je jedna tehnika koja se koristi u vizualizaciji povr{ine izoliranih stani~nih struktura ili makromolekula u transmisijskom
27
Slika 1-34. Negativno bojenje.

Transmisijsko-elektronska mikrofotografija negativno obojenih aktinskih vlakana (susretljivo{}u Rogera Craiga, University of Massachusetts Medical Center).
elektronskom mikroskopu (slika 1-35). Uzorak se prekrije tankim slojem metalnih para (primjerice, platine). Metalne se pare raspr{e po uzorku pod odre|enim kutem, pa su povr{ine biolo{kog uzorka koje su izravno usmjerene prema izvoru molekula metalnih para deblje premazane negoli ostale povr{ine uzorka. Te razlike u debljini sloja metalnih para stvaraju efekt sjene, daju}i uzorku trodimenzionalni izgled na elektronskoj mikrofotografiji. Prepariranje uzoraka metodom smrzavanja i lomljenja (engl. freeze fracture), u kombinaciji s tehnikom sjen~anja metalom, bilo je napose va`no u istraìvanju strukture membrane. Uzorci se smrznu u teku}em du{iku (na 196C), a zatim lome o{tricom noà. Taj proces ~esto razdvoji dvostruki lipidni sloj, {to omogu}uje prikazivanje unutra{njih povr{ina stani~ne membrane (slika 1-36). Uzorak se zatim sjen~a platinom, a biolo{ki se materijal otopi kiselinom, ~ime se stvara metalna replika povr{ine biolo{kog uzorka. Analizom replika u elektronskom mikroskopu vide se brojna povr{inska ispup~enja, koja odgovaraju proteinima koji se proteù kroz dvosloj lipida. Varijacija ove tehnike nazvana smrzavanje i jetkanje (engl. freeze etching) omogu}uje ujedno vizualizaciju i izvanjskih povr{ina stani~nih membrana i unutra{njih strana membrana. Drugi tip elektronskog mikroskopa, pretra`ni (engl. scanning) elektronski mikroskop koristi se za dobivanje trodimenzionalne slike stanica (slika 1-37). Kod pretra`nog elektronskog mikroskopa snop elektrona ne prolazi kroz biolo{ki uzorak. Umjesto toga, povr{ina stanice prekriva se te{kim me-
Slika 1-35. Sjen~anje metalom.

Elektronska mikrofotografija aktinskih/ miozinskih vlakana citoskeleta prepariranih sjen~anjem metalom.
28
(A)
Poglavlje 1
(B)
Slika 1-36. Smrzavanje i lomljenje.

(A) Postupak smrzavanja i lomljenja razdvaja dvosloj lipida, ostavljaju}i uklopljene membranske proteine vezane s jednom od dviju polovina membrane. (B) Mikrofotografija smrzavanja i lomljenja stani~nih membrana dviju susjednih stanica. Proteini koji se proteù kroz dvosloj lipida izgledaju kao intramembranske ~estice (strjelica) (Don W. Fawcett/Phozo Researchers, Inc.).
talom, a snop elektrona koristi se za pretraìvanje po uzorku. Elektroni koji se raspr{uju ili emitiraju s povr{ine uzorka, sakupljaju se da stvore trodimenzionalnu sliku kako se snop elektrona pomi~e po stanici. Budu}i da je razlu~ivanje pretra`nog elektronskog mikroskopa samo oko 10 nm, njegova je primjena uglavnom ograni~ena na istraìvanje cijelih stanica, a ne na istraìvanje unutarstani~nih organela ili makromolekula.
Frakcioniranje stanice
Premda je elektronski mikroskop omogu}io podrobnu vizualizaciju stani~ne strukture, sama mikroskopija nije dostatna za definiranje funkcija raznih komponenata eukariotskih stanica. Kako bi se moglo posvetiti brojnim pitanjima vezanim uz funkciju stani~nih organela, pokazalo se da je neophodno izolirati organele eukariotskih stanica u takvom obliku koji se moè uporabiti u biokemijskim ispitivanjima. Ovo se obi~no postiè diferencijalnim centrifugiranjem, metodom koju su uglavnom razvili Albert Claude, Christian de Duve i njihovi suradnici, ~etrdesetih i pedesetih godina 20. stolje}a, a kojom se stani~ne komponente me|usobno odvajaju na osnovi svoje veli~ine i gusto}e. Prvi je korak u stani~nom frakcioniranju razbijanje stani~ne membrane u uvjetima koji ne uni{tavaju ostale unutarstani~ne komponente. Primjenjuje se nekoliko metoda, uklju~uju}i sonikaciju (izlaganje uzorka visokim frekvencijama zvuka), usitnjavanje u mehani~kom homogenizatoru ili tretiranje u mije{alici velike brzine. Svi ti postupci dovode do kidanja stani~ne membrane i endoplazmatskog retikula na male fragmente, dok ostale komponente stanice (jezgra, lizosomi, peroksisomi, mitohondriji i kloroplasti) ostaju neo{te}ene. Suspenzija razbijenih stanica (koja se naziva lizat ili homogenat) zatim se frakcionira u komponente serijom centrifugiranja u ultracentrifugi, koja rotira uzorke vrlo velikom brzinom (preko 100.000 rpm), pri ~emu se stvaraju sile i do 500.000 puta ve}e od sile gravitacije. Ta sila uzrokuje da se stani-
5 mm
Slika 1-37. Pretra`na elektronska mikroskopija.

Pretra`na elektronska mikrofotografija makrofaga (David Phillips/Visuals Unlimited).
29
~ne komponente pomi~u prema dnu epruvete stvaraju}i sediment (proces se naziva sedimentacija) brzinom koja ovisi o njihovoj veli~ini i gusto}i, s time da se najve}e i najteè strukture najbrè sedimentiraju (slika 1-38). Obi~no se stani~ni homogenati prvo centrifugiraju na malim brzinama, na kojima se sedimentiraju netaknute stanice i jezgre kao najve}e stani~ne strukture. Tako se kod niìh brzina centrifugiranja u talogu moè dobiti oboga}ena frakcija jezgara, dok ostale stani~ne komponente ostaju u suspenziji supernatanta (u teku}em dijelu iznad taloga). Supernatant se zatim centrifugira na ve}im brzinama za sedimentiranje mitohondrija, kloroplasta, lizosoma i peroksisoma. Ponovnim centrifugiranjem supernatanta na jo{ ve}im brzinama sedimentiraju se fragmenti stani~ne membrane i endoplazmatski retikul. êtvrto uzastopno centrifugiranje na jo{ ve}oj brzini dovodi do sedimentacije ribosoma, ostavljaju}i samo topljiv dio citoplazme (citosol) u supernatantu. Razli~ite frakcije dobivene diferencijalnim centrifugiranjem predstavljaju oboga}ene, ali ne i ~iste pripravke organela. Ve}i stupanj pro~i{}enja moè se posti}i centrifugiranjem u gradijentu gusto}e, u kojem se organeli razdvajaju sedimentiranjem kroz gradijent guste tvari, kao {to je primjerice otopina saharoze. U centrifugiranju temeljenom na brzini sedimentacije po~etni se materijal nadsloji na vrh gradijenta otopine {e}era (slika 1-39). êstice razli~itih veli~ina sedimentiraju kroz gradijent razli~itim brzinama, pokre}u}i se kao zasebne pruge. Nakon centrifugiranja, sakupljanjem pojedinih frakcija gradijenta postiè se dostatno razlu~ivanje za razdvajanje organela sli~ne veli~ine poput mitohondrija, lizosoma i peroksisoma. Ravnote`no centrifugiranje u gradijentu gusto}e moè se uporabiti za razdvajanje stani~nih komponenti na bazi njihova plutanja uzrokovanog uzgonom, {to je neovisno o njihovoj veli~ini i obliku. U tom postupku, uzorak se centrifugira u gradijentu koji sadràva vrlo koncentriranu otopinu saharoze ili cezijeva klorida. Umjesto da ih se razdvoji na osnovi brzine sedimentacije, uzorak se centrifugira sve dok ~estice ne dosegnu poloàj ravnoteè u kojem je gusto}a ~estica jednaka gusto}i okolne otopine saharoze ili otopine cezijeva klorida. Ravnote`no centrifugiranje korisno je za razdvajanje razli~itih tipova membrana jedne od drugih, a dostatno je osjetljivo i za razdvajanje makromolekula koje su obiljeène razli~itim izotopima. Klasi~an primjer (opisan u 3. poglavlju) predstavlja analiza replikacije DNA razdvajanjem DNA molekula s te{kim i lakim izotopima du{ika (15N i 14N) ravnote`nim centrifugiranjem u gradijentu gusto}e otopine cezijeva klorida.
Rast ìvotinjskih stanica u kulturi

Prou~avanje stanica uvelike ovisi o njihovoj sposobnosti rasta u laboratorijskim uvjetima, kao i o mogu}nosti obrade stanica u laboratoriju. Iako je proces tehni~ki puno zahtjevniji od kultiviranja bakterija ili kvasca, velik broj ìvotinjskih i biljnih stanica moè rasti i s njima se moè manipulirati u kulturi. Takvi in vitro sustavi stani~nih kultura omogu}ili su znanstvenicima istraìvanje rasta i diferencijacije stanica, kao i izvo|enje geneti~kih manipulacija nu`nih za razumijevanje strukture i funkcije gena. Kulture animalnih stanica zapo~inju usitnjavanjem tkiva tako da se dobije suspenzija stanica koja se zatim stavlja u posudicu za kulturu s hranjivim medijem. Ve}ina tipova animalnih stanica (kao fibroblasti i epitelne stanice), prihva}aju se za dno plasti~ne povr{ine posudice za stani~nu kulturu i na njoj rastu (slika 1-40). Zametci i tumori ~esto se u istraìvanjima rabe kao po~etni materijal jer sadràvaju stanice koje brzo rastu. Fibroblasti embrija posebno dobro rastu u kulturi, pa pripadaju me|u naj~e{}e istraìvane tipove ìvotinjskih stanica. No, pod odgovaraju}im uvjetima mnogi
30
Poglavlje 1
centrifugiranje 800 g (10 minuta)
suspenzija razbijenih stanica sadràva stani~ne komponente kao {to su lizosomi, peroksisomi i dijelovi membrane
centrifug supernatanta 15.000 g (10 minuta)
sediment jezgara centrifugiranje supernatanta 100.000 g (60 minuta) sediment mitohondrija, lizosoma i peroksisoma
centrifugiranje supernatanta 200.000 g (3 sata) sediment fragmenata stani~ne membrane i endoplazmatskog retikula
Slika 1-38. Frakcioniranje stanice.

Stanice se liziraju, a stani~ne se komponente odvajaju serijom centrifugiranja pri sve ve}im brzinama. Nakon svakog centrifugiranja, pojedini se organeli sedimentirani na dnu epruvete mogu izdvojiti iz taloga. Supernatant se zatim ponovno centrifugira na ve}oj brzini da bi se sedimentirali organeli koji su sljede}i po veli~ini.
citosol
sediment ribosoma
31
Uzorak se nadsloji na vrh gradijenta saharoze sporo sedimentiraju}e ~estice centrifugiranje gradijent saharoze êstice razli~itih veli~ina sedimentiraju se kao odvojene pruge. brzo sedimentiraju}e ~estice
Slika 1-39. Brzinsko centrifugiranje u gradijentu gusto}e.

Uzorak se nadsloji na vrh gradijenta saharoze, a ~estice razli~itih veli~ina sedimentiraju se du` gradijenta kao odvojene pruge. Odvojene ~estice mogu se sakupiti u pojedine frakcije gradijenta, {to se jednostavno postiè probadanjem dna epruvete za centrifugiranje i sakupljanjem kapljica.
Sakupljanje frakcija gradijenta.
brzo sedimentiraju}e j ~estice
sporo sedimentiraju}e ~estice
specijalizirani tipovi stanica mogu tako|er rasti u kulturi, ~ime je omogu}eno da se njihova diferencijacija istraùje u kontroliranim eksperimentalnim uvjetima. Embrionalne mati~ne stanice predstavljaju odli~an primjer za to. Ove stanice potje~u od ranog embrija, a u kulturi in vitro zadràvaju sposobnost diferencijacije u sve tipove stanica koje su prisutne u odraslome organizmu. Stoga su ove stanice imale va`nu ulogu u istraìvanju funkcije brojnih gena tijekom (embrionalnog) razvoja mi{a. Osim toga, embrionalne mati~ne stanice mogle bi se iskoristiti za lije~enje bolesti ~ovjeka jer bi mogle postati izvorom tkiva za transplantacijsku terapiju. Medij (ili hranjiva podloga) za uzgajanje animalnih stanica puno je sloènijeg sastava od minimalnog medija potrebnog za rast bakterija i kvasaca. Rana istraìvanja stani~nih kultura koristila su se medijima s nedefiniranim sastojcima (kao {to su plazma, serum ili ekstrakt embrija). Prekretnica u ovom podru~ju u~injena je 1955. godine, kad je Harry Eagle opisao prvi to~no definiran medij koji omogu}uje rast animalnih stanica. Uz soli i glukozu, medij za rast animalnih stanica sadràva razli~ite aminokiseline i vita-
10 mm
Slika 1-40. Animalne stanice u kulturi.

Mikrofotografija humanih fibroblasta prihva}enih za povr{inu posudice za kulturu, dobivena pretra`nim elektronskim mikroskopom (David M. Phillips/Visual Unlimited).
32
Poglavlje 1
K L J U ^ N I P O KU S
Kultura animalnih stanica

Nutrition Needs of Hummalian Cells in Tissue Culture Harry Eagle
National Institutes of Health, Bethesda, MD Science, Volume 122, 1955, pages 501504
Kontekst
U pr vim stani~nim kulturama stanice fragmenata tkiva rasle su uklopljene u ugru{ku plazme, a to je bio sustav koji je bio vrlo neprikladan za eksperimentalnu analizu. Kasnih ~etrdesetih godina 20. stolje}a, glavni je napredak u~injen uspostavom stani~nih linija koje su nastale rastom izoliranih stanica prihva}enih za stijenku posudice za kulturu. Me|utim, te su se stanice jo{ uvijek uzgajale u nedefiniranom mediju sastavljenom od razli~itih kombinacija seruma i ekstrakata embrija. Na primjer, ~esto upotrebljavana tumorska stani~na linija (HeLa stanice) pr votno je uspostavljena 1952. godine rastom u mediju koji se sastojao od pile}e plazme, ekstrakta gove|eg embrija i seruma iz pupkovine ~ovjeka. Kori{tenje tako kompleksnih i neprecizno definiranih medija ~inilo je analizu specifi~nih potreba rasta animalnih stanica nemogu}om. Harry Eagle prvi je rije{io taj problem, provev{i sustavnu analizu hranjivih sastojaka potrebnih za rast animalnih stanica u kulturi.
tako|er bila potrebna. Osnovni medij koji je razvio Eagle opisan je u priloènoj tablici prevedenoj iz njegova rada objavljenog 1955. godine.
Harry Eagle
Utjecaj
Medij, koji je definirao Eagle, jo{ se uvijek koristi kao osnovni medij za kulturu animalnih stanica. Njegova je uporaba omogu}ila znanstvenicima da kultiviraju razne stanice u definiranim eksperimentalnim uvjetima, koji su kriti~ni za prou~avanje rasta i diferencijacije animalnih stanica, uklju~uju}i identifikaciju faktora rasta prisutnih u serumu (za koje se danas zna da uklju~uju polipeptide koji kontroliraju pona{anje pojedinih stanica u intaktnim ìvotinjama).
Tablica 4. Osnovni medij za kultiviranje HeLa stanica i mi{jih fibroblasta (10) L-aminokiseline* (mM)
arginin cistein glutamin histidin izoleucin leucin lizin metionin fenilalanin treonin triptofan tirozin valin 0,1 0,05 2,0 0,05 0,2 0,2 0,2 0,05 0,1 0,2 0,02 0,1 0,2 (0,02) (1,0) (0,02) (0,1) (0,1) (0,05) (0,1) (0,01) (0,1)
vitamini + (mM)
biotin kolin folna kiselina nikotinamid pentotenska kisel. piridoksal tiamin riboflavin 103 103 103 103 103 103 103 104
razno
glukoza penicilin streptomicin fenolno crvenilo 5 mM 0,005%# 0,005%# 0,0005%#
Za istraìvanje stani~ne prehrane dijalizirani serum konja, 1% dijalizirani humani serum, 10% Za osnovne kulture konjski serum, 5% humani serum, 10%
Soli (mM)
NaCl KCl NaH2PO4 H2O NaHCO3 CaCl2 MgCl2 100 5 1 20 1 0,5
Eksperimenti
Eagle je istraìvao rast dviju stani~nih linija: HeLa stanica i stani~ne linije mi{jih fibroblasta nazvane L stanice. Uzgajao je te stanice u mediju sastavljenom od smjese soli, ugljikohidrata, aminokiselina i vitamina, uz dodatak proteina seruma. Sustavnim variranjem komponenti tog medija, Eagle je uspio odrediti specifi~ne hranjive tvari za stani~ni rast. Uz sol i glukozu, te hranjive tvari uklju~ivale su 13 aminokiselina i nekoliko vitamina. Mala je koli~ina seruma
* Prikladno ~uvati u hladnjaku kao pojedina~ne 20 puta koncentrirane osnovne otopine aminokiselina Za mi{je fibroblaste Prikladno ~uvati kao pojedina~ne 100 ili 1.000 puta koncentrirane osnovne otopine; ~uvati osnovne Prikladno ~uvati u hladnjaku kao dvije osnovne otopine; jedna neka sadràva NaCl, KCl, NaH PO , 2 4
otopine u smrznutom stanju
NaHCO3, i glukozu u 10 puta koncentriranijoj osnovnoj otopini, a druga neka sadràva CaCl2 i MgCl2 u 20 puta koncentriranijoj otopini ûva se kao 100 mM osnovna otopina; ~uva se u smrznutom obliku kad nije u uporabi # ûva se kao pojedina~na 100 puta koncentrirana osnovna otopina penicilina, streptomicina i fenolnoga crvenila.
33
mine koje stanice ne mogu same sintetizirati. Medij za kulturu ve}ine animalnih stanica tako|er sadràva i serum koji predstavlja izvor polipeptidnih faktora rasta, nu`nih za stimulaciju stani~nih dioba. Identificirano je nekoliko faktora rasta. Oni sluè kao klju~ni regulatori rasta i diferencijacije stanica u vi{estani~nih organizama, daju}i signale kojima razli~ite stanice komuniciraju me|usobno. Primjerice, jedna od va`nih funkcija fibroblasta koè u intaktnih ìvotinja jest da proliferiraju kad je potrebno popraviti o{te}enje uzrokovano ranom ili porezotinom. Njihovu diobu zapo~inju faktori rasta koji se osloba|aju iz trombocita za vrijeme zgru{avanja krvi, te na taj na~in poti~u proliferaciju fibroblasta oko o{te}enog tkiva. Identifikacija pojedinih faktora rasta omogu}ila je uspostavu kultura raznih stanica u medijima bez seruma (engl. serum-free media; mediji u kojima je serum zamijenjen specifi~nim faktorima rasta potrebnim za proliferaciju odre|enih stanica). Slika 1-41. Kultiviranje animalnih Inicijalno uspostavljene stani~ne kulture zovu stanica. se primarne stani~ne kulture (slika 1-41). Stanice u primarnoj kulturi obi~no rastu dok ne prekriju tkivo povr{inu dna posudice u kojoj se nalaze. Nakon toga, stanice se mogu izvaditi iz posudice i u razrije|enoj koncentraciji ponovno nasaditi {to predstavlja sekundarnu kulturu. Taj proces presa|ivanja moè se ponoviti mnogo puta, no ve}ina normalnih stanica u kulturi ne moè beskona~no Komadi} tkiva usitnjen na rasti. Na primjer, normalni fibroblasti ~ovjeka pojedina~ne stanice mogu se podijeliti 50 do 100 puta (doseù}i 50 do resuspendira se u medij. 100 populacijskih udvostru~enja), nakon ~ega prestaju rasti i ugibaju. Nasuprot tomu, embrionalne mati~ne stanice kao i stanice tumorskoga Stanice se nasade u podrijetla u kulturi imaju sposobnost neograni~eposudicu s hranjivim ne proliferacije i te se kulture nazivaju permamedijem. nentnim ili besmrtnim stani~nim linijama. Nadasuspenzija stanica lje, odre|eni broj besmrtnih stani~nih linija glodavaca izoliran je iz kultura normalnih fibroblasta. Umjesto da nakon 50100 populacijskih teku}i medij udvostru~enja uginu kao ve}ina ostalih stanica primarna fibroblasta, nekoliko stanica u tim kulturama nakultura stavlja s beskona~nom proliferacijom, tvore}i stani~ne linije nalik onima izvedenim od tumora. Te Stanice u primarnoj kulturi prihvate se za posudicu i rastu dok ne prekriju su permanentne stani~ne linije osobito korisne u cijelu povr{inu posudice za kulturu. najrazli~itijim tipovima eksperimenata, jer predstavljaju kontinuirani i uniformni izvor stanica za obradu, kloniranje i neograni~eno propagiranje stanica u laboratoriju. âk i u optimalnim uvjetima, stani~ni ciklus (vrijeme jedne stani~ne diobe) animalnih stanica koje najaktivnije rastu u kulturi traje oko 20 sati, a to je deset puta dulje od vremena potrebnog Stanice se potom mogu presaditi u niòj da se podijeli stanica kvasca. Zato su eksperimenkoncentraciji tvore}i sekundarnu kulturu. ti s kulturama animalnih stanica mnogo teì i traju znatno dulje od eksperimenata s bakterijama ili s kvascem. Primjerice, porast vidljive kolonije animalnih stanica iz jedne jedine stanice traje tjesekundarna kultura dan dana ili dulje, dok se kolonija E. coli ili kvasca razvije iz jedne stanice preko no}i. Unato~ tomu, geneti~ke manipulacije animalnih stanica u
34
Poglavlje 1
kulturi neophodne su nam za razumijevanje strukture i funkcije stanice.
Kultura biljnih stanica

Biljne se stanice tako|er mogu kultivirati u hranjivom mediju koji sadràva odgovaraju}e molekule za regulaciju rasta. Nasuprot polipeptidnim regulatorima rasta animalnih stanica, regulatori rasta biljnih stanica jesu male molekule koje mogu pro}i kroz stijenku biljne stanice. U prisutnosti odgovaraju}e smjese tih molekula regulatora rasta, mnogi tipovi biljnih stanica proliferiraju u kulturi, stvaraju}i masu nediferenciranih stanica koja se naziva kalus (slika 1-42). Vrijedno je spomenuti da su mnoge biljne stanice sposobne stvarati bilo koji od razli~itih tipova tkiva koji su u kona~nici potrebni za regeneraciju ~itave biljke. Stoga se odgovaraju}om manipulacijom hranjivim sastojcima i molekulama regulatora rasta, nediferencirane biljne stanice u kulturi mogu potaknuti na diferencijaciju u razli~ita biljna tkiva, uklju~uju}i korijen, stabljiku i li{}e. U mnogim slu~ajevima, ~ak se i cijela biljka moè regenerirati iz jedne jedine stanice u kulturi. Osim teoretske va`nosti, sposobnost stvaranja nove biljke od jedne jedine stanice manipulacijom u kulturi, ~ini jednostavnim uno{enje geneti~kih promjena u biljke {to stvara va`ne pretpostavke za geneti~ko inènjerstvo na poljoprivrednim kulturama.
Slika 1-42. Biljne stanice u kulturi.

Nediferencirana masa biljnih stanica (kalus) raste na krutoj podlozi. (John N. A. Lott/Biological Photo Service.)
Virusi
Virusi su unutarstani~ni paraziti koji se ne mogu sami replicirati. Oni se razmnoàvaju infekcijom stanice doma}ina uzurpiraju}i stani~nu ustrojbu za produkciju ve}e koli~ine virusnih ~estica. U svojem najjednostavnijem obliku, virusi su gra|eni samo od genomske nukleinske kiseline (DNA ili RNA) obavijene proteinskim omota~em (slika 1-43). Virusi su va`ni za stani~nu i molekularnu biologiju jer su oni najjednostavniji sustav koji se moè iskoristiti za istraìvanje stani~nih funkcija. S obzirom na to da replikacija virusa ovisi o metabolizmu zaraène stanice, istraìvanja na virusima otkrila su brojne fundamentalne aspekte stani~ne biologije. Istraìvanja bakterijskih virusa znatno su pridonijela na{em razumijevanju bazi~nih mehanizama molekularne genetike, a eksperimenti s biljnim virusima (virus mozai~ne bolesti duhana) prvi su demonstrirali geneti~ki potencijal RNA. Animalni
(A)
(B)
Slika 1-43. Gra|a jednog animalnog virusa.

(A) êstice virusa papiloma sadràvaju malu prstenastu DNA molekulu obavijenu proteinskim omota~em (kapsidom). (B) Elektronska mikrofotografija ~estice humanog papiloma virusa obojena umjetnom bojom. (B, Linda Stannard/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)
50 nm DNA proteini kapside
35
M O L E KU L A R N A M E D I C I N A
Virusi i rak
Bolest
Rak je skupina bolesti koju karakterizira nekontrolirana proliferacija stanica. Rast nor malnih animalnih stanica pa`ljivo je reguliran sa svrhom zadovoljenja potreba cijelog organizma. Nasuprot tomu, stanice raka rastu na neregularan na~in te u kona~nici metastaziraju i interferiraju s funkcijom normalnih tkiva i organa. Rak je nakon bolesti srca drugi naj~e{}i uzrok smrti u SAD-u. Pribli`no }e jedan od tri Amerikanca oboliti od raka tijekom svoga ìvota, a unato~ velikom napretku u lije~enju, gotovo jedan od ~etiriju Amerikanaca na kraju i umire od ove bolesti. Stoga je jedan od glavnih ciljeva istraìvanja u medicini razumijevanje uzroka raka i razvijanje efikasnijih metoda lije~enja. lje`njaka, uklju~uju}i i ~ovjeka. Danas je poznato da su neki tipovi raka u ~ovjeka uzrokovani virusima; drugi su pak rezultat mutacija normalnih stani~nih gena sli~nih onkogenu prvi put identificiranom u RSV. kojih se doga|a tijekom ìvota neke osobe, a rje|e nasljednim mutacijama. Istraìvanja virusa koji uzrokuju rak dovela su do identifikacije mnogih gena odgovor nih za tipove raka koji nisu izazvani virusima te do razumijevanja molekular nih mehanizama odgovor nih za razvoj raka. Glavni napori upravljeni su danas primjeni tih spoznaja u molekular noj i stani~noj biologiji raka za razvoj novih pristupa lije~enju raka. Pr vi dizajnirani efikasan lijek u tretmanu raka u ljudi (STI-571, opisan je u 15. poglavlju) razvijen je protiv gena vrlo sli~nog RSV onkogenu.
Prevencija i lije~enje
Rak u ljudi, koji je izazvan virusima uklju~uje rak cer viksa i druge anogenitalne karcinome (papilloma virus), karcinome jetre (hepatitis B i C virusi), i neke tipove limfoma (Epstein-Barrov virus i humani T-limfotropni virus). Tumori inducirani tim virusima ~ine ukupno oko 20% incidencije raka u svijetu. U principu, ti bi se tumori mogli prevenirati vakcinacijom protiv odgovor nih virusa. Razvojem efikasnih cjepiva protiv hepatitisa B u~injen je prili~an napredak u tom podru~ju. Ostali tumori u ljudi izazvani su mutacijama nor malnih gena, ve}ina
Literatura
Rous, P. 1911. A sarcoma of the fowl transmissible by an agent separable from the tumor cells. J. Exp. Med. 13: 397411.
Molekular na i stani~na osnova

Danas je poznato da je rak rezultat mutacija gena koji normalno kontroliraju proliferaciju stanica. Glavni uvid koji je vodio k identifikaciji tih gena proiza{ao je iz istraìvanja virusa koji uzrokuju rak u ìvotinja, a ~iji je prototip izolirao Peyton Rous 1911. godine. Rous je prona{ao da se sarkomi (rak vezivnih tkiva) pili}a mogu prenijeti virusom koji je danas poznat kao Rousov sarkomski virus (engl. Rous sarcoma virus, ili RSV). S obzirom na to da je RSV retrovirus ~iji genom ima samo 10.000 parova baza, on se moè puno lak{e prou~avati na molekularnoj razini negoli kompleksan genom pili}a ili genom neke druge animalne stanice. Takva istraìvanja kona~no su dovela do identifikacije specifi~nih virusnih gena koji uzrokuju rak (onkogeni) i otkri}a srodnih gena u nor malnim stanicama svih vrsta kra-
Tumor iz kojega je izoliran RSV.
virusi dali su vrlo osjetljive sonde za istraìvanje raznih aktivnosti eukariotskih stanica. Brzi rast i mali genom, ~ini bakterije odli~nim eksperimentalnim modelom molekularne biologije, a bakterijski virusi (bakteriofagi) jo{ su vi{e pojednostavnili istraìvanje genetike bakterija. Jedan od najva`nijih bakterio-
36
Poglavlje 1
Slika 1-44. Plakovi bakteriofaga.

T4 plakovi vidljivi su na plo~i kulture E. coli. Svaki plak nastaje replikacijom jedne jedine virusne ~estice. (E. C. S. Chen/Visuals Unlimited.)
faga je bakteriofag T4 koji inficira i umnoàva se u E. coli. Infekcija jednom ~esticom T4 vodi ka stvaranju pribli`no 200 potomaka virusnih ~estica u roku od 2030 minuta. To dovodi do lize odnosno prsnu}a inficirane stanice i osloba|anja virusnih partikula u medij, u kojem mogu inficirati nove stanice. U kulturi bakterija koje rastu na agaru, replikacija T4 izaziva stvaranje plakova (engl. plaque), jasnih podru~ja liziranih stanica na sloju bakterija (slika 1-44). Jednako tako kako je lako kultivirati i istraìti virusne ~estice, tako je lako izolirati i virusne mutante koje rastu u jednom soju E. coli, ali ne rastu u drugom soju E. coli. Prema tome, baratanje s T4 pogodnije je za istraìvanje molekularne genetike, od baratanja s E. coli. Nadalje, genom T4 je 20 puta manji od genoma E. coli (sadràva oko 200.000 parova baza) {to dodatno olak{ava geneti~ku analizu. Neki drugi bakteriofagi imaju jo{ manje genome, a najjednostavniji su gra|eni od molekula RNA sastavljenih od samo 3.600 nukleotida. Iz tih su razloga bakterijski virusi postali krajnje jednostavan eksperimentalni sustav za molekularnu genetiku. Istraìvanja provedena na bakteriofagima u mnogome su pridonijela razja{njenju brojnih fundamentalnih principa molekularne biologije. Zbog pove}ane sloènosti genoma animalnih stanica, virusi su jo{ va`niji u istraìvanjima animalnih stanica nego u istraìvanjima bakterija. Mnogi animalni virusi repliciraju se i mogu se pregledati na stvaranje plakova u stani~noj kulturi kao i bakteriofagi. [tovi{e, genomi animalnih virusa sli~ne su sloènosti kao i genomi bakteriofaga (veli~ina genoma kre}e im se od 3.000 do 300.000 parova baza), pa je baratanje animalnim virusima daleko lak{e, nego njihovim stanicama doma}inima. Mnogo je razli~itih animalnih virusa, koji sadràvaju DNA ili RNA kao geneti~ki materijal (tablica 1-3). Ve}ina virusa s RNA-genomom replicira se u inficiranim stanicama sintetiziraju}i nove RNA-kopije svoga genoma s RNA-kalupa. Me|utim, retrovirusi (jedna od porodica animalnih virusa) sadràvaju RNA-genom u svojim virusnim ~esticama, ali u zaraènoj stanici sintetiziraju DNA-kopiju svoga genoma. Ovi su virusi dobar primjer va`nosti virusa kao eksperimentalnih modela jer su prou~avanja retrovirusa prvi put pokazala mogu}nost sinteze DNA s RNA-kalupa, {to predstavlja fundamentalni na~in prijenosa geneti~ke informacije za koji se danas zna da se zbiva u svim eukariotskim stanicama. Ostali primjeri u kojima su animalni virusi bili va`ni modeli za istraìvanje njihovih stanica doma}ina, uklju~uju istraìvanje replikacije DNA, transkripcije, dorade RNA te prijenos i sekreciju proteina. Tablica 1-3. Primjeri animalnih virusa
Porodica virusa RNA-genom
Pikorna virus Togavirus Flavivirus Paramiksovirus Orhomiksovirus Retrovirus virus poliomijelitisa virus rubeole virus ùte groznice virus ospica virus influence HIV hepatitis B human papiloma virus adenovirus herpes simpleks virus vakcinije 78 12 10 1620 14 9 3,2 58 36 120200 130280
Reprezentativni primjer
Veli~ina genoma ( 1.000 parova baza)
DNA-genom
Hepadnavirusi Papovavirusi Adenovirusi Herpesvirusi Poksvirusi
37
Napose je va`no istaknuti, da infekcija nekim animalnim virusima ne ubija stanice, ve} pretvara (transformira) normalnu stanicu u tumorsku stanicu. Istraìvanja ovakvih virusa koji uzrokuju rak, {to je prvi opisao Peyton Rous jo{ 1911. godine, ne samo da su stvorila bazu za na{e dana{nje razumijevanje raka na molekularnoj i stani~noj razini, ve} su dovela do rasvjetljivanja mnogih molekularnih mehanizama koji kontroliraju rast i diferencijaciju animalnih stanica.
S A @ E TA K PODRIJETLO I EVOLUCIJA STANICE

Pr va stanica: Sve dana{nje stanice, prokariotske i eukariotske, potje~u od jedne jedine stanice pretka. Smatra se da se prva stanica pojavila prije 3,8 milijardi godina kao rezultat okruìvanja samorepliciraju}e RNA s fosfolipidnom membranom. Evolucija metabolizma: Najranije reakcije za stvaranje metaboli~ke energije bile su oblik anaerobne glikolize. Nakon toga pojavila se fotosinteza, iza koje je slijedio oksidativni metabolizam. Dana{nji prokarioti: Dana{nji se prokarioti dijele u skupinu arhebakterija i skupinu eubakterija, koje su se razdvojile rano u evoluciji. Eukariotske stanice: Eukariotske stanice, koje su ve}e i sloènije od prokariotskih stanica, sadràvaju jezgru, citoplazmatske organele i citoskelet. Smatra se da su evoluirale od simbiontskih zajednica prokariota. Razvoj vi{estani~nih organizama: Najjednostavniji eukarioti su jednostani~ni organizmi (primjerice, kvasci i amebe). Vi{estani~ni su organizmi evoluirali od asocijacija tih jednostani~nih eukariota, a podjela rada dovela je do razvoja mnogih vrsta specijaliziranih stanica koje ~ine dana{nje biljke i ìvotinje.
KLJU^NI POJMOVI
prokariotska stanica, eukariotska stanica, RNA svijet, fosfolipid, amfipati~an, hidrofoban, hidrofilan adenozin 5'-trifosfat (ATP), glikoliza, fotosinteza, oksidativni metabolizam arhebakterije, eubakterije, cijanobakterije, Escherichia coli (E. coli), stani~na stijenka, stani~na membrana, ribosom jezgra, mitohondrij, kloroplast, lizosom, peroksisom, vakuola, endoplazmatski retikul, Golgijev aparat, citoskelet, endosimbioza kvasac, Saccharomyces cerevisiae, pseudopodij, epitelne stanice, fibroblast, eritrocit, granulocit, monocit, makrofag, limfocit, neuron
STANICE KAO EKSPERIMENTALNI MODELI

E. coli: Zbog geneti~ke jednostavnosti i lako}e istraìvanja, bakterije kao {to je E. coli napose su korisne za istraìvanje fundamentalnih postavki biokemije i molekularne biologije. Kvasci: Kao najjednostavnije eukariotske stanice, kva{~eve gljivice vaàn su model za ispitivanje raznih aspekata stani~ne biologije eukariota. Dictyostelium discoideum: Jednostani~an eukariot koji se ~esto koristi za eksperimentalnu analizu pokretanja stanice. Caenorhabditis elegans: Obli} C. elegans jednostavan je vi{estani~an organizam koji sluì kao vaàn model u razvojnoj biologiji. Drosophila melanogaster: Zbog ekstenzivne geneti~ke analize, istraìvanja vinske mu{ice dovela su do glavnih napredaka u razumijevanju animalnog razvoja. Arabidopsis thaliana: Mala biljka cvjetnica Arabidopsis ~esto se koristi kao model u istraìvanjima molekularne biologije i razvoja biljaka.
Dictyostelium discoideum Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster
Arabidopsis thaliana
38
Poglavlje 1
Xenopus laevis, zebrasta ribica, transgeni~ni mi{
Kralje`njaci: Mnoge vrste stanica kralje`njaka mogu rasti u kulturi, gdje se mogu istraìvati u kontroliranim laboratorijskim uvjetima. Specijalizirani tipovi stanica, kao {to su neuroni i mi{i}ne stanice, predstavljaju korisne modele za ispitivanje odre|enih aspekata stani~ne biologije. @aba Xenopus laevis i zebrasta ribica va`ni su modeli za ispitivanje ranih stadija razvoja kralje`njaka, a mi{ je kao vrsta sisavca prikladan za geneti~ku analizu.
ORU\A STANI^NE BIOLOGIJE

mo} razlu~ivanja, mikroskopija svijetlog polja, fazno-kontrastna mikroskopija, diferencijalna interferencijsko-kontrastna mikroskopija, videokamerom unaprije|ena diferencijalna interferencijsko-kontrastna mikroskopija, fluorescentna mikroskopija, zeleni fluorescentni protein (GFP), konfokalna mikroskopija, multifotonska ekscitacijska mikroskopija transmisijska elektronska mikroskopija, sjen~anje metalom, smrzavanje i lomljenje, pretra`ni elektronski mikroskop diferencijalno centrifugiranje, ultracentrifuga, centrifugiranje u gradijentu gusto}e, centrifugiranje temeljeno na brzini, ravnote`no centrifugiranje embrionalne mati~ne stanice, primarna kultura, stani~na linija kalus
Svjetlosna mikroskopija: Koriste}i svjetlosni mikroskop u vizualizaciji stanica i unutarstani~nih struktura kao i za otkrivanje lokalizacije specifi~nih unutarstani~nih molekula primjenjuju se brojne metode.
Elektronska mikroskopija: Elektronska mikroskopija, ~ije je razlu~ivanje pribli`no sto puta ve}e od razlu~ivanja svjetlosnoga mikroskopa, koristi se u analizi detalja stani~ne strukture.
Frakcioniranje stani~nih organela: Organeli eukariotskih stanica mogu se izolirati diferencijalnim centrifugiranjem za biokemijsku analizu.
Rast animalnih stanica u kulturi: Razmnoàvanje animalnih stanica u kulturi omogu}ilo je istraìvanje mehanizama koji kontroliraju rast i diferencijaciju stanica. Kultura biljnih stanica: Kultivirane stanice biljaka mogu se diferencirati u specijalizirane stani~ne tipove, a u nekim slu~ajevima mogu regenerirati ~itavu biljku. Virusi: Virusi predstavljaju jednostavne modele za istraìvanje stani~ne funkcije.
bakterioflag, retrovirus
Pitanja
1. Koje su zajedni~ke fundamentalne zna~ajke svih ìvih stanica na Zemlji? (navedi barem tri)? 2. [to su pokazali eksperimenti o nastanku organskih molekula koje je radio Stanley Miller? 3. Koji je tip makromolekula sposoban upravljati svojom vlastitom replikacijom? 4. Za{to se smatra da je evolucija fotosinteze pogodovala evoluciji oksidativnog metabolizma? 5. Za{to je stvaranje polupropusne stani~ne membrane oko skupa samorepliciraju}ih makromolekula tako vaàn korak u nastanku ìvota? 6. Raspravi ~injenicu da su mitohondriji i kloroplasti podrijetlom od bakterija koje
39
su progutali prethodnici eukariotskih stanica. 7. Koliko se razlu~ivanje moè posti}i sa svjetlosnim mikroskopom ako se uzorak promatra kroz zrak (suhi objektiv), a ne kroz ulje (uljni ili imerzijski objektiv)? Pretpostavi da je valna duljina vidljive svjetlosti 0,5 mm. 8. Koje su prednosti zelenoga fluorescentnog proteina u istraìvanju poloàja i kre-
tanja proteina u stanicama, u usporedbi s protutijelima koja su ozna~ena fluorokromom? 9. Identificiraj razli~ite karakteristike organela koji se razdvajaju centrifugiranjem temeljenim na brzini u gradijentu saharoze i ravnote`nim centrifugiranjem u gradijentu saharoze. 10. Kva{~eve gljivice koriste se kao model za istraìvanje mnogih aspekata biologije
eukariotskih stanica. Za{to one nisu pogodan model za analizu pokretanja eukariotskih stanica? 11. Za{to je va`no kultiviranje embrionalnih mati~nih stanica? 12. Koja je razlika izme|u primarne stani~ne kulture i besmrtnih stani~nih linija?
Literatura
Podrijetlo i evolucija stanica
Andersson, S. G. E., A. Zomorodipour, J. O. Andersson, T. Sicheritz-Ponten, U. C. M. Alsmark, R. M. Podowski, A. K. Naslund, A.-S. Erksson, H. H. Winkler and C. G. Kurland. 1998. The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria. Nature 396: 133140. I Brocks, J. J., G. A. Logan, R. Buick and R. E. Summons. 1999. Archean molecular fossils and the early rise of eukaryotes. Science 285: 10331036. I Bult, C. J. and 39 others. 1996. Complete genome sequence of the methanogenic Archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 273: 10581073. I Cech, T. R. 1986. A model for the RNA-catalyzed replication of RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 43604363. I Crick, F. H. C. 1968. The origin of the genetic code. J. Mol. Biol. 38: 367379. I Darnell, J. E. and W. F. Doolittle. 1986. Speculations on the early course of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 12711275. I Doolittle, W. F. 1999. Phylogenetic classification and the universal tree. Science 284: 21242128. P Gesteland, R. F., T. R. Cech and J. F., Atkins (eds.). 1999. The RNA World. 2nd ed. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gilbert, W. 1986. The RNA world. Nature 319: 618. P Johnston, W. K., P J. Unrau, M. S. Lawrence, . M. E. Glasner and D. P Bartel. 2001. RNA. catalyzed RNA polymerization: accurate and general RNA-templated primer extension. Science 292: 13191325. I Joyce, G. F. 1989. RNA evolution and the origins of life. Nature 338: 217224. P Kasting, J. F. and J. L. Siefert. 2002. Life and the evolution of Earths atmosphere. Science 296: 10661068. P Knoll, A. H. 1992. The early evolution of eukaryotes: A geological perspective. Science 256: 622627. P Margulis, L. 1992. Symbiosis in Cell Evolution. 2nd ed. New York: W. H. Freeman. Miller, S. L. 1953. A production of amino acids under possible primitive earth conditions. Science 117: 528529. I Mojzsis, S. J., G. Arrhenius, K. D. McKeegan, T. M. Harrison, A. P Nutman and C. R. L. . Friend. 1996. Evidence for life on Earth before 3,800 million years ago. Nature 384: 5559. I Orgel, L. E. 1998. The origin of life a review of facts and speculations. Trends Biochem. Sci. 23: 491495. P Pace, N. R. 1997. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science 276: 734740. P Shixing, Z. and C. Huineng. 1995. Megascopic multicellular organisms from the 1700million-year-old Tuanshanzi formation in the Jixian area, north China. Science 270: 620622. I Woese, C. R., O. Kandler and M. L. Wheelis. 1990. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archae, Bacteria, and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 45764579. I lado-Vides, J. D. Glasner, C. K. Rode, G. F. Mayhew, J. Gregor, N. W. Davis, H. A. Kirkpatrick, M. A. Goeden, D. J. Rose, B. Mau and Y. Shao. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 14531462. I Botstein, D., S. A. Chervitz and J. M. Cherry. 1997. Yeast as a model organism. Science 277: 12591260. P Goffeau, A. and 15 others. 1996. Life with 6000 genes. Science 274: 546567. I Hamilton, B .A. and W. N. Frankel. 2001. Of mice and genome sequence. Cell 107: 1316. P Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini and E. Lacey. 1994. Manipulating the Mouse Embryo. 2nd ed. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860921. I Maliga, P D. F. Klessig, A. R. Cashmore, W. ., Gruissem and J. E. Varner (eds.). 1995. Methods in Plant Molecular Biology. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Meyerowitz, E. M. 2002. Plants compared to animals: the broadest comparative study of development. Science 295: 14821485. P Neidhardt, F. C., R. Curtiss III., J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low Jr., B. Magasanik, W. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H. E. Umbarger (eds.). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. 2nd ed. Washington, DC: ASM Press. Sive, H. L., R. M. Grainger and R. M. Harland (eds.). 1999. Early Development of Xenopus laevis: A Course Manual. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. The Arabidopsis Genome Initiative. 2000. Analysis of the genome sequence of the
Stanice kao eksperimentalni modeli

Adams, M. D. and 194 others. 2000. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287: 21852195. I Blattner, F. R., G. Plunkett III., C. A. Bloch, N. T. Perna, V. Burland, M. Riley, J. Col-
40
Poglavlje 1
flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796815. I The C. elegans Sequencing Consortium. 1998. Genome sequence of the nematode C. elegans: A platform for investigating biology. Science 282: 20122018. I Thisse, C. and L. I. Zon. 2002. Organogenesis heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science 295: 457462. P Venter, J. C. and 273 others. 2001. The sequence of the human genome. Science 291: 13041351. I
Chalfie, M. 1995. Green fluorescent protein. Photochem. Photobiol. 62: 651656. P Claude, A. 1975. The coming of age of the cell. Science 189: 433435. P De Duve, C. 1975. Exploring cells with a centrifuge. Science 189: 186194. P Eagle, H. 1955. Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture. Science 235: 442447. I Flint, S. J., L. W. Enquist, R. M. Krug, V. R. Racaniello and A. M. Skalka. 1999. Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. Washington, DC: ASM Press. Graham, J. and D. Rickwood (ed.). 1997. Subcellular Fractionation: A Practical Approach. New York: Oxford University Press. Kam, Z., E. Zamir and B. Geiger. 2001. Probing molecular processes in live cells by quantitative multidimensional microscopy. Trends Cell Biol. 11: 329334. P Lacey, A. J. (ed.) 1999. Light Microscopy in Biology: A Practical Approach. New York: Oxford University Press.
Palade, G. 1975. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science 189: 347358. P Piston, D. W. 1999. Imaging living cells and tissues by two-photon excitation microscopy. Trends Cell Biol. 9: 6669 P Porter, K. R., A. Claude and E. F. Fullam. 1945. A study of tissue culture cells by electron microscopy. J. Exp. Med. 81: 233246. I Rous, P 1911. A sarcoma of the fowl transmis. sible by an agent separable from the tumor cells. J. Exp. Med. 13: 397411. I Salmon, E. D. 1995. VE-DIC light microscopy and the discovery of kinesin. Trends Cell Biol. 5: 154158. P Spector, D. L., R. Goldman and L. Leinwand. 1998. Cells: A Laboratory Manual. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Tsien, R. Y. and A Miyawaki. 1998. Seeing the machinery of live cells. Science 280: 19541955. P
Oru|a stani~ne biologije

Bowers, W. E. 1998. Christian de Duve and the discovery of lysosomes and peroxisomes. Trends Cell Biol. 8: 330333 P Cairns, J., G. S. Stent and J. D. Watson (eds.). 1992. Phage and the Origins of Molecular Biology. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Poglavlje
Stani~na kemija
Molekularni sastav stanica 41 Sredi{nja uloga enzima kao biolo{kih katalizatora 56 Metaboli~ka energija 63 Biosinteza stani~nih sastojaka 74 Stani~ne membrane 80
KLJU^NI POKUS: Smatanje
polipeptidnih lanaca 53 Fenilketonurija 79
Uz samoreplikaciju, koja je bit ìvota, sposobne su obavljati najrazli~itije specijalizirane zada}e u vi{estani~nom organizmu. Stanice se pri tome pokoravaju istim kemijskim i fizi~kim zakonima koji odre|uju pona{anje neìvih sustava. Stoga moderna stani~na biologija nastoji razumjeti stani~ne procese u obliku kemijskih i fizi~kih reakcija. Ovo poglavlje razmatra temeljna na~ela biolo{ke kemije koja upravljaju ìvotom stanica. Ne namjerava raspraviti sva pitanja biokemije, niti ispisati sve metaboli~ke reakcije unutar stanica. Poglavlje usmjerava pozornost na pet glavnih tema: (1) tipove stani~nih molekula, (2) sredi{nju ulogu proteina kao biolo{kih katalizatora, (3) stvaranje i kori{tenje metaboli~ke energije, (4) biosintezu glavnih stani~nih sastojaka i (5) strukturu biolo{kih membrana. Poznavanje ovih kemijskih temelja ~ini osnovicu za razumijevanje raznolikosti stani~nih struktura i funkcija, o kojima raspravlja ostatak teksta.
TANICE SU NEVJEROJATNO SLO@ENE I RAZNOLIKE TVOREVINE.
Molekularni sastav stanica

Stanice su sastavljene od vode, anorganskih iona i (organskih) molekula koje sadràvaju ugljik. U stanicama ima najvi{e molekula vode. Voda ~ini najmanje 70% ukupne stani~ne mase. Stoga su u biolo{koj kemiji osobito va`ne interakcije izme|u vode i drugih stani~nih sastojaka. U tom smislu klju~no je svojstvo vode da je ona polarna molekula u kojoj su vodikovi atomi blago pozitivno nabijeni, dok su kisikovi atomi blago negativni (slika 2-1). Zbog svoje polarne naravi molekule vode mogu me|usobno i s drugim polarnim molekulama stvarati vodikove veze. Tako|er mogu stupiti u interakciju s pozitivno ili negativno nabijenim ionima. Posljedica takvih interakcija jest da su ioni i polarne molekule topljivi u vodi (hidrofilni). Suprotno tomu, nepolarne molekule koje ne mogu stupiti u interakciju s vodom slabo su topljive u vodenom okoli{u (hidrofobne). Nepolarne molekule nastoje stoga smanjiti dodir s vodom pa se zdruùju me|usobno. Kasnije u poglavlju pokazat }emo da takve interakcije polarnih i nepolarnih molekula, bilo s vodom, bilo me|usobne, imaju klju~nu ulogu u oblikovanju biolo{kih struktura kao {to su stani~ne membrane.
42
Poglavlje 2
(A)
2 d O H d+ H d+
Slika 2-1. Svojstva vode.
Voda je polarna molekula (A), djelomice negativnog naboja (d) na kisikovu atomu, a djelomice pozitivnog naboja (d+) na vodikovim atomima. Zbog svoje polarnosti molekule vode mogu se povezati vodikovim mostovima me|usobno ili s drugim polarnim molekulama (B) i, dakako, ostvaruju interakcije s nabijenim ionima (C).
(B) Vodikova veza
Najvi{e 1% stani~ne mase ~ine anorganski ioni: natrijev (Na+), kalijev (K ), magnezijev (Mg2+) i kalcijev (Ca2+) ion te fosfat (HPO42), klorid (Cl) i bikarbonat (HCO3). Ti su ioni uklju~eni na razli~ite na~ine u stani~ni metabolizam pa su bitni za stani~nu funkciju. Dakako, stanici svojstvene molekule su organski spojevi. Ve}ina njih pripada jednom od ~etiriju molekularnih tipova: ugljikohidratima, lipidima, proteinima ili nukleinskim kiselinama. Proteini, nukleinske kiseline i ve}ina ugljikohidrata (polisaharidi) su makromolekule oblikovane povezivanjem stotina ili tisu}a molekula-prete~a male molekularne mase. Makromolekule ~ine 80 do 90% suhe tvari u ve}ini stanica. Lipidi tako|er pripadaju glavnim sastojcima stanice. Ostatak stani~ne mase sastoji se od razli~itih malih organskih molekula, uklju~uju}i i makromolekularne prete~e. Prema tome struktura i funkcija ~etiriju glavnih skupina organskih molekula omogu}uje na~elno razumijevanje stani~ne kemije.
+
Ugljikohidrati
Ugljikohidrati obuhva}aju jednostavne {e}ere i polisaharide. Jednostavni {e}eri poput glukoze glavna su stani~na hrana. Njihova razgradnja istovremeno osigurava stani~nu energiju i ishodne tvari za sintezu drugih stani~nih sastojaka, o ~emu se raspravlja dalje u poglavlju. Polisaharidi su skladi{ni oblici {e}era ili osiguravaju strukturnu ~vrsto}u stanice. Uz to polisaharidi i kra}i {e}erni polimeri djeluju kao oznake u raznim procesima stani~nog prepoznavanja, uklju~uju}i adheziju stanica na susjede i transport proteina do predvi|enog unutarstani~nog odredi{ta. Slika 2-2. prikazuje strukture reprezentativnih jednostavnih {e}era (monosaharida). Osnovna formula tih molekula je (CH2O)n i od nje potje~e naziv ugljikohidrat (C = ugljiko i H2O = hidrat). U stanicama je osobito vaàn 6C-atomni {e}er (n=6) glukoza, jer je glavni izvor stani~ne energije. Drugi jednostavni {e}eri imaju od tri do sedam ugljika. Me|u njima su naju~estaliji 3C-atomni i 5C-atomni {e}eri. [e}eri koji sadrè pet ili vi{e atoma mogu ciklizacijom tvoriti prstenaste strukture koje su u stanici preteìti oblici tih molekula. Slika 2-2 pokazuje da cikli~ki {e}eri mogu postojati u dva oblika (a i b), ovisno o konfiguraciji na atomu C1. Monosaharidi se mogu povezati reakcijom dehidracije, pri kojoj se odvaja H2O, a {e}eri se veù glikozidnom vezom izme|u njihova dva ugljika (slika 2-3). Poveè li se samo nekoliko molekula {e}era, nastali oligomer naziva se oligosaharidom. Kad se povezuje mno{tvo (stotine i tisu}e) {e}era, nastali makromolekularni polimeri nazivaju se polisaharidima. Polisaharidi glikogen i {krob dva su skladi{na oblika ugljikohidrata, prvi u ìvotinjskim, a drugi u biljnim stanicama. Glikogen i {krob izgra|eni su isklju~ivo od molekula glukoze u a-konfiguraciji (slika 2-4). Glavna se veza uspostavlja izme|u ugljika 1 jedne glukoze i ugljika 4 druge glukoze. Uz to glikogen i jedan oblik {kroba (amilopektin) sadràvaju ponegdje veze a(16), u kojima je ugljik 1 jedne glukoze povezan s ugljikom 6 druge glukoze. Iz prikaza na slici 2-4. o~ito je da te veze dovode do grananja, jer pove-
(C)
Na+
Stani~na kemija
43
Trioze (C3H6O3) H C H H C C H gliceraldehid Pentoze (C5H10O5) OH OH H O H H C C C H dihidroksiaceton OH O OH
Slika 2-2. Struktura jednostavnih {e}era.

Prikazani su primjeri {e}era (trioza, pentoza, heksoza) koji sadràvaju tri, pet i {est C-atoma. [e}eri s pet ili vi{e ugljikovih atoma mogu ciklizirati. Oblikovani prsteni postoje u dvama oblicima ovisno o konfiguraciji na prvom C-atomu (C1).
H H H H H
O OH OH OH OH
Heksoze (C6H12O6)
1 2 3 4 5 6
O OH lan~ani oblik
C
2
riboza
C C
lan~ani oblik
glukoza
4 5
C C H
OH OH
C H
6 5
CH2OH O C H H C3 OH a
2
H C
1 4
CH2OH O C H
3
CH2OH C H OH C H
3
6 5
CH2OH C H
3
OH H C 2 C H OH
1 4
H C
O H
2
H
1 4
O
1
H
2
prstenasti oblici
HO
C OH
OH
prstenasti oblici
HO H
H OH
OH
OH b
CH2OH
CH2OH H C OH H C H OH C H H2O O H C OH H C OH
zuju dva zasebna lanca izgra|ena vezama a(14). Razgranatost postoji samo u glikogenu i amilopektinu, dok drugi oblik {kroba (amiloza) nije razgranat. Glikogen i {krob imaju osim na~elno sli~ne strukture i sli~nu funkciju da uskladi{te glukozu. Nasuprot tomu funkcija celuloze bitno je razli~ita. Celuloza je glavni gradbeni sastojak stani~ne stijenke u bilju. Mo`da iznena|uje da je i celuloza sazdana samo od molekula glukoze. Me|utim, celuloza je nerazgranani polisaharid, a glukozne jedinice u celulozi nisu a-, nego su b-konfiguracije. Za razliku od veza a(14), veza b(14) izme|u glukoznih jedinica uvjetuje stvaranje ispruènih lanaca celuloze koji se zatim bo~no zdruùju i oblikuju vlakna velike mehani~ke ~vrsto}e. Oligosaharidi i polisaharidi stani~ni su oblici energetskih zaliha, imaju konstruktivnu ulogu, ali povrh toga su i va`ni sudionici u brojnim informacijskim procesima. Primjerice, oligosaharidi su ~esto vezani na proteine, gdje imaju zna~ajnu ulogu u proteinskom smatanju ili obiljeàvanju i usmjeravanju proteina pri transportu na povr{inu stanice ili za ugradbu u razli~ite stani~ne organele. Oligosaharidi i polisaharidi tako|er obiljeàvaju stani~nu povr{inu, pa stoga imaju va`nu ulogu u stani~nom prepoznavanju i stani~nim interakcijama u tkivima vi{estani~nih organizama.
H C HO
C H OH C H
O H C OH
C HO
CH2OH C H O H C H OH H C O C
CH2OH C H OH C H O H C C OH OH
a(1 4) glikozidna veza
Slika 2-3. Oblikovanje glikozidne veze.

Dva se jednostavna {e}era povezuju reakcijom dehidracije (uklanjanjem molekule vode). Primjer prikazuje povezivanje dviju molekula glukoze u a-konfiguraciji vezom izme|u atoma C1 i C4, koja se stoga naziva a (14) glikozidnom vezom.
44
Poglavlje 2
amilopektin ({krob)
H OH H OH H
O H H O H OH H OH H
O
CH
2O
H O H
a(1 6) veze povezuju dva lanca u to~ku grananja.
CH 2O O H OH H H O H OH H
glikogen
CH 2 H CH 2O O O H OH H H O H OH H H OH H H O H OH H
je a
4) vezama.
H O
CH2OH O H OH H H OH H
H O
H O
H O
Slika 2-4. Struktura polisaharida.

Polisaharidi su makromolekule koje se sastoje od stotina ili tisu}a jednostavnih {e}era. Glikogen, {krob i celuloza izgra|eni su isklju~ivo od glukoza povezanih a(14) glikozidnim vezama u glikogenu i {krobu, a b(14) vezama u celulozi. Glikogen i jedan oblik {kroba (amilopektin) sadràvaju tako|er ponegdje a(16) veze, koje sluè kao mjesta grananja pri povezivanju dvaju odvojenih a(14) lanaca.
Jedinice su povezane b(1 4) vezama.
Lipidi
Lipidi imaju tri izrazite uloge u stanicama: (1) osiguravaju vaàn oblik uskladi{tene energije, (2) lipidi su glavni sastojci stani~nih membrana, {to je u stani~noj biologiji osobito va`no, i (3) lipidi su vrlo va`ni u stani~noj signalizaciji, bilo kao steroidni hormoni (npr. estrogen i testosteron), bilo kao glasni~ke molekule koje prenose signal od receptora na stani~noj povr{ini do odredi{ta unutar stanice. Najjednostavniji lipidi su masne kiseline. Sastoje se od dugih ugljikovodi~nih lanaca, koji na jednom kraju zavr{avaju karboksilnom skupinom (COO) (slika 2-5). Ugljikovodi~ni lanci naj~e{}e sadràvaju 16 ili 18 ugljikovih atoma. Nezasi}ene masne kiseline imaju jednu ili vi{e dvostrukih veza me|u ugljikovim atomima. U zasi}enim masnim kiselinama svi atomi ugljika veù maksimalni broj vodikovih atoma. Dugi ugljikovodi~ni lanci masnih kiselina imaju samo nepolarne veze CH koje ne ulaze u interakciju s vodom. Hidrofobna narav masnokiselinskih lanaca odgovorna je za mnoge osobitosti u pona{anju kompleksnih lipida pri stvaranju biolo{kih membrana. Masne se kiseline pohranjuju u obliku triacilglicerola ili masti. Triacilgliceroli sadràvaju tri masne kiseline povezane s molekulom glicerola (slika 2-6). Netopljivi su u vodi pa se u citoplazmi gomilaju kao masne nakupine. Zatreba li, one se kidaju za kori{tenje u reakcijama koje proizvode energiju,
Stani~na kemija
45
palmitat (C16) O C CH2 CH2 CH2

2
stearat (C18) O C CH2 CH2 CH2

2
oleat (C18) O C CH2 CH2 CH2

2
Slika 2-5. Struktura masnih kiselina.

Masne se kiseline sastoje od dugih ugljikovodi~nih lanaca koji zavr{avaju karboksilnom skupinom (COO). Palmitat i stearat su zasi}ene masne kiseline koje imaju 16 odnosno 18 C-atoma. Oleat je nezasi}ena masna kiselina s 18 C-atoma koja ima dvostruku vezu izme|u C9 i C10. Valja uo~iti da dvostruka veza lomi ugljikovodikov lanac.
CH CH2 CH2 CH2

2
CH CH2 CH2 CH2

2
CH2 CH2 HC HC CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3
CH CH2 CH2 CH3
CH CH2 CH2 CH2

2
CH3
glicerol
H2C O C CH2
CH O C CH2 O
CH2 O C CH2 O
masne kiseline
o ~emu }emo raspravljati dalje u poglavlju. Vrijedno je napomenuti da su masti u~inkovitiji oblik zalihe energije od ugljikohidrata, jer daju vi{e no dvostruko energije po masi razgra|ene tvari. Stoga masti omogu}uju skladi{tenje energije u upola manje tjelesne mase nego {to bi zahtijevali ugljikohidrati. To je osobito va`no kad se ima na umu pokretljivost ìvotinja. Fosfolipidi, glavni sastojci stani~nih membrana, sadràvaju dvije masne kiseline vezane na jednu polarnu ~eonu skupinu (slika 2-7.). U glicerolnim fosfolipidima dvije su masne kiseline vezane na ugljikove atome glicerola, kao u trigliceridima. Me|utim, tre}i ugljikov atom glicerola vezan je na fosfatnu skupinu, koja je pak ~esto pripojena na neku drugu malu polarnu molekulu kao {to su kolin, serin, inozitol ili etanolamin. Sfingomijelin, jedini neglicerolni fosfolipid stani~nih membrana, sadràva dva ugljikovodi~na lanca vezana na ~eonu polarnu skupinu koju tvori serin, a ne glicerol. Svi fosfolipidi imaju nepolarne repove koji se sastoje od dva ugljikovodi~na lanca, jedne hidrofilne ~eone skupine koja sadràva fosfatnu skupinu i njezine polarne privjeske. Stoga su fosfolipidi amfipati~ne molekule, djelomice topljive, a djelomice netopljive u vodi. Na tom se svojstvu fosfolipida temelji stvaranje biolo{kih membrana, o ~emu }emo raspravljati dalje u poglavlju. Uz fosfolipide mnoge stani~ne membrane sadràvaju glikolipide i kolesterol. Glikolipidi se sastoje od dvaju ugljikovodi~nih lanaca vezanih na polarne ~eone skupine koje sadràvaju ugljikohidrate (slika 2-8.). Budu}i
CH3
CH3
CH3
glicerol
masne kiseline
Slika 2-6. Struktura triacilglicerola.

Triacilgliceroli (masti) sadràvaju tri masne kiseline vezane na glicerol. U prikazanom primjeru tri masne kiseline su palmitat, ali triacilgliceroli ~esto sadràvaju smjesu razli~itih masnih kiselina.
46
Poglavlje 2
fosfatidna kiselina
fosfatidiletanolamin
NH3 CH2 CH2 etanolamin
fosfatidilkolin
(CH ) CH2 CH2 kolin
O O
O O fosfat
O
P O
2
P O
glicerol CH2 O O C CH2 O
CH2 CH O C CH2 O CH2 O C CH2 O
CH2 CH O C CH2 O CH2 O C CH2 O
CH O C CH2
R1
R2
R1
R2
R1
R2
fosfatidilserin
3
fosfatidilinozitol
+
sfingomijelin
+
O serin O HO
OH
OH inozitol
H
2
2 2
kolin
OH OH
O
P O CH2 CH O C CH2
O P O O serin CH2 O O C CH2 O
CH2 O O C CH2 O
CH2 CH O C CH2
CH2 CH HN C CH2 O
OH CH HC CH CH2
R2 R1 R2 R1 R2 R1
Stani~na kemija
47
Slika 2-7. Struktura fosfolipida.

Glicerolni fosfolipidi sadràvaju dvije masne kiseline vezane na glicerol. Masne se kiseline mogu razlikovati pa ih obiljeùjemo kao R1 i R2. Tre}i ugljikov atom glicerola povezan je s fosfatnom skupinom (oblikuju}i fosfatidnu kiselinu). Ta fosfatna skupina zatim je ~esto povezana s nekom malom polarnom molekulom (pri ~emu nastaju fosfatidiletanolamin, fosfatidilkolin, fosfatidilserin ili fosfatidilinozitol). U sfingomijelinu dva ugljikovodikova lanca vezana su na polarnu ~eonu skupinu koja pripada serinu umjesto glicerolu.
glukoza (ugljikohidrat) CH2 HO OH OH serin CH2 CH HN OH CH CH O HC CH2 O O
da su amfipati~ne molekule uglavnom su na~elno sli~ni fosfolipidima. Za razliku od fosfolipida, kolesterol se sastoji od ~etiri ugljikovodi~na prstena, a ne od linearnih ugljikovodi~nih lanaca (slika 2-9.). Ugljikovodi~ni su prsteni izrazito hidrofobni, ali je hidroksilna skupina (OH), vezana na jednom kraju kolesterola, slabo hidrofilna, pa je i kolesterol amfipati~an. Osim uloge u izgradnji stani~nih membrana, lipidi djeluju kao signalne molekule unutar i izme|u stanica. Steroidni hormoni (primjerice estrogen i testosteron) derivati su kolesterola (vidi sliku 2-9). Ti hormoni ~ine raznorodnu skupinu kemijskih glasnika. Svi imaju ~etiri ugljikovodi~na prstena na koje su pripojene razli~ite funkcionalne skupine. Derivati fosfolipida sluè tako|er kao glasni~ke molekule unutar stanica proslje|uju}i signale od receptora na stani~noj povr{ini do unutarstani~nih odredi{ta koja reguliraju mnoge stani~ne procese, uklju~uju}i stani~nu proliferaciju, kretanje, opstanak i diferencijaciju (vidi 13. poglavlje).
C CH2
R2 R1
Nukleinske kiseline
Nukleinske kiseline DNA i RNA glavne su informacijske molekule u stanicama. Deoksiribonukleinska kiselina (DNA) ima jedincatu ulogu kao ge-
Slika 2-8. Struktura glikolipida.

Dva ugljikovodi~na lanca vezana su na polarnu ~eonu skupinu koja potje~e od serina i sadràva ugljikohidrate (primjerice glukozu).
H kolesterol C C C C C HO C CH3 C C C C C C C C H3C

3
H CH2 C C CH2 CH2 C CH3 CH3
C C
OH C C C C C O C CH3 C C C C C testosteron C HO C C C C C CH3 C C C C C C C C C C C C CH3 C C
OH C C C
Slika 2-9. Kolesterol i steroidni hormoni.

Kolesterol, vaàn sastojak stani~nih membrana, amfipati~na je molekula zbog svoje polarne hidroksilne skupine. Kolesterol je tako|er prete~a steroidnih hormona kao {to su testosteron i estradiol (oblik estrogena). Slika ne prikazuje vodikove atome vezane na ugljike u prstenu.
estradiol
48
Poglavlje 2
purini NH2 N HC
8
O N HC CH N
8
C
7 9
C
7 9
C5 C
4
6 1 2 3
C C
5 4
6 1 2 3
NH C
N H
N adenin (A)
N H
N gvanin (G)
NH2
pirimidini NH2 C HC HC
5 6 1 4 3 2
O H3C N C O C HC N H timin (T) C NH C O HC HC
O C NH C N H uracil (U) O
N H citozin (C) {e}eri HOCH2

4' 5'
OH
1' H C C H 2'
HOCH2 C H H C
OH H C C H H
C H H C
3'
OH
OH
OH
riboza nukleozid O C HC
5' 5 6 1 4 3 2
2'-deoksiriboza nukleotid O C NH baza C O

1' O
HC O P
O
NH C N O
HOCH2
4'
HC O
CH2 C H H C
HC O
C H H C 3' OH
H C {e}er C H
2'
H C C H OH
OH
OH
uridin
uridin-5'-monofosfat (UMP)
Slika 2-10. Sastojci nukleinskih kiselina.

Nukleinske kiseline sadràvaju purinske i pirimidinske baze vezane na fosforilirane {e}ere. Baza nukleinske kiseline vezana samo na {e}er je nukleozid. Nukleotidi dodatno sadràvaju jednu ili vi{e fosfatnih skupina.
neti~ka tvar koja je u eukariotskim stanicama smje{tena u jezgri. Razli~iti tipovi ribonukleinskih kiselina (RNA) sudjeluju u nekoliko stani~nih aktivnosti. Glasni~ka RNA (mRNA) nosi informaciju od DNA do ribosoma, gdje sluì kao kalup za sintezu proteina. Druga dva tipa RNA (ribosomna RNA i transportna RNA) sudjeluju u sintezi proteina. Ostali tipovi RNA uklju~eni su u doradu i prijenos ribonukleinskih kiselina i proteina. Osim {to djeluje kao informacijska molekula, RNA je tako|er sposobna katalizirati neke kemijske reakcije. U dana{njim stanicama takve su reakcije uklju~ene u sintezu proteina i doradu RNA. DNA i RNA su nukleotidni polimeri koji sadràvaju purinske i pirimidinske baze vezane na fosforilirane {e}ere (slika 2-10). DNA sadràva dva purina (adenin i gvanin) i dva pirimidina (citozin i timin). Adenin, gvanin i cito-
Stani~na kemija
49
Slika 2-11. Polimerizacija nukleotida.

Fosfodiesterska se veza oblikuje izme|u 3'-hidroksilne skupine jednoga nukleotida i 5'-fosfatne skupine drugoga. Polinukleotidni lanac je usmjerena molekula: jedan kraj zavr{ava 5'-fosfatnom skupinom (5'-kraj), a drugi 3'-hidroksilnom skupinom (3-kraj).
O
O P
O
baza O CH2 C C OH O {e}er C OH C
+
zin tako|er su prisutni u RNA, ali RNA sadràva uracil umjesto timina. Baze se veù na {e}ere (2'-deoksiribozu u DNA, ili ribozu u RNA) da nastanu nukleozidi. Nukleotidi dodatno sadrè jednu ili vi{e fosfatnih skupina vezanih na 5'-ugljik nukleozidnog {e}era. Polimerizacija nukleotida, kojom se oblikuju nukleinske kiseline, uklju~uje stvaranje fosfodiesterskih veza izme|u 5'-fosfata jednoga nukleotida i 3'-hidroksila drugog nukleotida (slika 2-11.). Oligonukleotidi su oligomeri koji sadràvaju samo nekoliko nukleotida. Veliki polinukleotidi koji oblikuju stani~ne RNA i DNA mogu sadràti tisu}e i milijune nukleotida. Vrijedno je istaknuti da je polinukleotidni lanac usmjerena molekula kojoj je na jednom kraju 5'-fosfat, a na drugom 3'-hidroksilna skupina. Polinukleotidi se uvijek sintetiziraju u smjeru od 5' prema 3', tako da se slobodni nukleotid dodaje na 3'-OH-skupinu rastu}ega lanca. Dogovorno slijed baza u DNA i RNA tako|er se ispisuje u smjeru od 5' prema 3'. Informacija u DNA i RNA priop}uje se slijedom baza u polinukleotidu. DNA je dvostruka molekula koja se sastoji od dvaju suprotno usmjerenih polinukleotidnih lanaca (vidi 3. poglavlje). Baze su na unutra{njoj strani molekule pa vodikove veze izme|u komplementarnih parova baza povezuju dva lanca. Adenin se sparuje s timinom, a gvanin s citozinom (slika 2-12). Bitna posljedica takva komplementarna povezivanja baza jest da jedan lanac DNA (ili RNA) moè djelovati kao kalup koji usmjeruje sintezu komplementarnoga lanca. Nukleinske kiseline imaju, dakle, jedincatu sposobnost samoreplikacije. Upravo zbog toga djeluju kao osnovne informacijske molekule u stanici. Informacijski sadràj u DNA i RNA usmjeruje sintezu specifi~nih proteina koji nadziru ve}inu stani~nih aktivnosti. Osim {to su gra|evne jedinice nukleinskih kiselina, nukleotidi imaju i druge klju~ne uloge u stani~nim procesima. Najistaknutiji primjer je adenozin-5'-trifosfat (ATP), koji je glavni oblik kemijske energije unutar stanica.
O
O
baza O CH2 C C OH H+ O {e}er C OH C
P
O
H2O
O 5'-kraj
O
baza O CH2 C C O
O
P
O
O {e}er C OH O baza O {e}er C OH C OH C C
P O
CH2 C 3'-kraj
Slika 2-12. Komplementarno sparivanje baza nukleinskih kiselina.

Stvaranje vodikovih veza izme|u baza suprotno usmjerenih lanaca DNA omogu}uje specifi~no sparivanje gvanina (G) s citozinom (C) i adenin (A) s timinom (T).
H H C H C N C N H O C N C O H N H H N C C N C N H CH3 C H C N C O H N
H N C N C O H H N C C C N H
G
N
A
N
50
Poglavlje 2
Sli~no djeluju i drugi nukleotidi, koji u brojnim metaboli~kim reakcijama donose energiju ili aktivirane kemijske skupine. Neki nukleotidi (primjerice cikli~ki AMP) va`ne su signalne molekule unutar stanica (vidi 13. poglavlje).
Proteini
Dok nukleinske kiseline nose geneti~ku informaciju stanice, primarna je du`nost proteina da izvedu zada}e prema uputama te informacije. Proteini su najraznolikije od svih makromolekula. Svaka stanica sadràva tisu}e razli~itih proteina koji izvode najrazli~itije zada}e. Proteini sluè kao konstruktivne sastavnice stanica i tkiva, prenose i pohranjuju male molekule (primjerice hemoglobin prenosi kisik), prenose tako|er informacije izme|u stanica (primjerice hormoni) te osiguravaju obranu od infekcije (primjerice protutijela). Me|utim, klju~na je uloga proteina da djeluju kao enzimi koji kataliziraju gotovo sve kemijske reakcije u biolo{kim sustavima, {to }emo pokazati dalje u poglavlju. Na taj na~in proteini upravljaju gotovo svim aktivnostima stanice. Sredi{nja uloga proteina u biolo{koj kemiji iskazana je njihovim nazivom, koji potje~e od gr~ke rije~i prwteion, {to zna~i prvo mjesto, prvi red. Proteini su polimeri sastavljeni od dvadeset razli~itih aminokiselina. Svaka se aminokiselina sastoji od ugljikovog atoma (nazvanog a-ugljik) povezanoga s karboksilnom skupinom (COO), amino-skupinom (NH3+), vodikovim atomom i prepoznatljivim bo~nim ogrankom (slika 2-13). Specifi~na kemijska svojstva aminokiselinskih bo~nih ogranaka odre|uju uloge svake pojedine aminokiseline u proteinskoj strukturi i funkciji. Aminokiseline se mogu razvrstati prema svojstvima bo~nih ogranaka u ~etiri vrste (slika 2-14). Deset aminokiselina imaju nepolarne bo~ne ogranke koji ne stupaju u interakciju s vodom. Glicin je najjednostavnija aminokiselina njegov bo~ni ogranak ima samo vodikov atom. Alanin, valin, leucin i izoleucin imaju ugljikovodi~ne bo~ne ogranke koji imaju do ~etiri ugljikova atoma. Bo~ni ogranci tih aminokiselina su hidrofobni, pa se zbog toga nastoje smjestiti u sredi{te proteina, gdje nisu u dodiru s vodom. Sli~no i prolin ima ugljikovodi~ni bo~ni ogranak, ali prolin je jedincat po tome {to je njegov bo~ni ogranak s jedne strane vezan na du{ikov atom amino skupine, a s druge na a-ugljik tako da oblikuje prstenastu strukturu. Bo~ni ogranci dviju aminokiselina, cisteina i metionina, sadràvaju atome sumpora. Metionin je prili~no hidrofoban za razliku od cisteina koji zbog svoje sulfhidrilne skupine (SH) nije hidrofoban. Cisteinska sulfhidrilna skupina ima va`nu ulogu u proteinskoj strukturi, jer omogu}uje stvaranje disulfidnih veza izme|u bo~nih cisteinskih ogranaka, ali o tome }emo raspravljati kasnije. Kona~no, dvije nepolarne aminokiseline, fenilalanin i triptofan, imaju u svojim bo~nim ograncima izrazito hidrofobne aromatske prstene. Pet aminokiselina imaju polarne, ali nenabijene bo~ne ogranke. To su serin, treonin i tirozin, koji posjeduju hidroksilnu skupinu u bo~nom lancu, te asparagin i glutamin, koji sadràvaju polarne amidne skupine (O=C NH2). Budu}i da polarni bo~ni ogranci mogu stvarati vodikove veze s vodom, ove su aminokiseline hidrofilne i nastoje se smjestiti na povr{ini proteina. Aminokiseline lizin, arginin i histidin u bo~nom ogranku imaju nabijene bazi~ne skupine. Lizin i arginin su vrlo bazi~ne aminokiseline. U stanici njihovi bo~ni ogranci nose pozitivni naboj. Zbog toga su vrlo hidrofilni i stoga naj~e{}e smje{teni na povr{ini proteina gdje ostvaruju dodir s vodom. Histidin moè biti nenabijen ili pozitivno nabijen kod fiziolo{koga pH. êsto aktivno sudjeluje u enzimskim reakcijama koje uklju~uju razmjenu vodikovih iona kao {to pokazuje primjer, koji }emo opisati u sljede}em odjeljku.
bo~ni ogranak R
+ amino-skupina H3N
Ca H
karboksilna COO skupina
Slika 2-13. Struktura aminokiselina.

Svaka se aminokiselina sastoji od sredi{njeg atoma ugljika (a-ugljik) vezanog na vodikov atom, karboksilnu skupinu, amino-skupinu i specifi~ni bo~ni ogranak (ozna~en kao R). Kod fiziolo{koga pH karboksilna skupina i amino-skupina su ionizirane kako je prikazano.
Stani~na kemija
51
nepolarne aminokiseline H3C H H3N

+
H3C CH3 CH H3N

+
CH3 CH CH2 H3C COO H3N

+
CH3 CH2 CH C H izoleucin (Ile) I COO H2C H2N

+
CH2 CH2 C H prolin (Pro) P COO
CH3 COO H3N

+
C H
C H
COO
C H
COO
H3N
C H
glicin (Gly) G
alanin (Ala) A CH3 S
valin (Val) V
leucin (Leu) L H N
SH CH2 H3N C H cistein (Cys) C

+ +
CH2 CH2 H3N C H metionin (Met) M COO H3N

+
CH2 C H fenilalanin (Phe) F COO
CH2 H3N
+
COO
C H
COO
triptofan (Trp) W
polarne aminokiseline
OH O NH2 C CH2 H3N

+
O C
NH2 CH2 CH2
OH CH2 H3N
+ +
CH3 HCOH H3N C H treonin (Thr) T COO

+
CH2 COO H3N C H asparagin (Asn) N COO H3N

+
C H
COO
C H
C H
COO
serin (Ser) S bazi~ne aminokiseline
tirozin (Tyr) Y
glutamin (Gln) Q
kisele aminokiseline NH2 C NH CH2 CH2 CH2 H3N

+ +
NH3 CH2 CH2 CH2 CH2 H3N

+
NH2 COO COO CH2 H3N

+ +
HN
NH CH2
CH2 CH2 H3N C H glutaminska kiseline (Glu) E COO
C H
COO
C H
COO
H3N
C H
COO
C H
COO
lizin (Lys) K
arginin (Arg) R
histidin (His) H
asparaginska kiselina (Asp) D
Slika 2-14. Aminokiseline.

Nazna~ene su troslovna i jednoslovna kratica za svaku aminokiselinu. Aminokiseline su razvrstane na temelju svojstava bo~nih ogranaka u ~etiri kategorije: nepolarne, polarne, bazi~ne i kisele.
Kona~no, dvije aminokiseline, asparaginska i glutaminska kiselina, imaju kisele bo~ne ogranke koji zavr{avaju karboksilnim skupinama. Te su aminokiseline negativno nabijene unutar stanice i zato ih se ~esto spominje kao aspartat i glutamat. Sli~no bazi~nim aminokiselinama i kisele su aminokiseline izrazito hidrofilne te su naj~e{}e smje{tene na povr{ini proteina. Aminokiseline su me|usobno povezane peptidnim vezama izme|u aamino-skupine jedne aminokiseline i a-karboksilne skupine druge (slika 215). Polipeptidi su dugi linearni lanci koji sadràvaju stotine ili tisu}e aminokiselina. Svaki polipeptidni lanac ima dva razli~ita kraja, jedan koji zavr{ava a-amino-skupinom (amino- ili N-kraj ili N-terminus) i drugi, koji zavr{a-
52
Poglavlje 2
Smatanje polipeptidnih lanaca

100
Reductive Cleavage of Disulfide Bridges in Ribonucleaze Michael Sela, Frederick H. White, Jr., and Christian B. Anfinsen
National Institutes of Health, Bethesda, MD Science, Volume 125, 1957, pages 691692
aktivnost 75
Kontekst
Funkcionalni su proteini znatno sloèniji od linear nih lanaca aminokiselina. Stvaranje aktivnih enzima ili drugih proteina zahtijeva smatanje polipeptidnih lanaca u preciznu trodimenzialnu konfor maciju. Ta razlika izme|u proteina i polipeptidnih lanaca postavlja klju~na pitanja pri razumijevanju odnosa proteinske strukture i funkcije. Kako je odabrana prava konfor macija od mnogih mogu}ih konformacija koje bi mogao poprimiti polipeptidni lanac? Odakle informacija koja usmjeruje proteinsko smatanje? Klasi~ni pokus Christiana Anfinsena i njegovih suradnika odgovara na ta pitanja. Prou~avaju}i enzim ribonukleazu, Anfinsen i suradnici uspjeli su pokazati da se denaturirani proteini mogu spontano ponovno smotati u aktivnu konfor maciju. Prema tome primar ni aminokiselinski slijed sadr-
àva svu potrebnu infor maciju koja odre|uje pravilnu prostornu konformaciju proteina. Niz eksperimenata naveo je Anfinsena na zaklju~ak da nativna trodimenzionalna struktura proteina odgovara ter modinami~ki najstabilnijoj konformaciji koju odre|uju interakcije sastavnih aminokiselina. Originalna opaànja, koja su dovela do ovoga klju~nog na~ela, autori Michael Sela, Frederick H. White, Jr. i Christian B. Anfinsen objavili su u citiranom radu 1957. godine.
50
25
4 SH grupe
Eksperimenti
Sela, White i Anfinsen prou~avali su gove|u ribonukleazu, mali protein od 124 aminokiseline koji ima ~etiri disulfidne (S-S) veze izme|u bo~nih ogranaka cisteina. Enzimsku aktivnost ribonukleaze mogu}e je pratiti ispitivanjem sposobnosti enzima da pokida RNA u nukleotide, {to omogu}uje jedno-
Saètak eksperimentalnih rezultata renaturacije. Enzimska aktivnost ribonukleaze prikazana je kao funkcija prisutnih sulfhidrilnih skupina nakon razli~itih postupaka. Aktivnost je izraèna kao postotak aktivnosti nativnoga enzima.
stavno odre|ivanje funkcije nativnoga proteina. Enzimska je aktivnost potpuno nestala ukoliko je enzim izloèn tretmanu koji kida nekovalentne veze i reducira disulfidne veze u sulfhidrilne
R1 H3N
+
O C O
R2 C H COO
C H
H +N H H2O
R1 O H3N
+
R2 COO
C H
C N C H H
peptidna veza
Slika 2-15. Stvaranje peptidne veze.

Karboksilna skupine jedne aminokiseline povezana je s amino-skupinom druge aminokiseline.
va a-karboksilnom skupinom (karboksi- ili C-kraj ili C-terminus). Polipeptidi se sintetiziraju dodavanjem aminokiselina na C-kraj. Slijed aminokiselina u polipeptidu ispisuje se (prema dogovoru) istim redoslijedom. Karakteristi~na svojstva proteina odre|ena su specifi~nim slijedom aminokiselina. Godine 1953. Frederick Sanger odredio je prvi potpuni slijed aminokiselina u proteinu. Bio je to slijed u hormonu inzulinu. Pokazalo se da se inzulin sastoji od dvaju polipeptidnih lanaca koji su me|usobno povezani disulfidnim vezama izme|u cisteinskih ogranaka (slika 2-16). Najva`nija spoznaja u Sangerovom eksperimentu jest da se svaki protein sastoji od svoga specifi~noga slijeda aminokiselina. Danas se sljedovi aminokiselina nekog proteina odre|uju dedukcijom iz slijeda nukleotida u mRNA. Do danas su poznati potpuni sljedovi aminokiselina u vi{e od 100.000 proteina. Svaki protein ima jedinstven aminokiselinski slijed koji je odre|en redoslijedom nukleotida u genu (vidi 3. poglavlje). Aminokiselinski slijed proteina tek je prvi element proteinske strukture. Proteini nisu izduèni lanci aminokiselina. Oni
Stani~na kemija
53
(SH) skupine. înilo se da na taj na~in denaturirani protein zauzima slu~ajnu neaktivnu konformaciju. Osobito je va`no da su Sela, White i Anfinsen opazili da se enzimska aktivnost vra}a, ako se denaturirani protein inkubira u uvjetima koji omogu}uju da se polipeptidni lanac ponovno smota i disulfidne veze ponovno uspostave. U tim pokusima uklonjeno je denaturiraju}e sredstvo, a zatim je inaktivirani enzim inkubiran u fiziolo{kom puferu u prisutnosti O2. Taj postupak doveo je do oksidacije sulfhidrilnih skupina i ponovne uspostave disulfidnih veza. Tim procesom enzimu se vratila kataliti~ka aktivnost, {to dokazuje da se enzim ponovno smotao u nativnu konformaciju. Budu}i da nisu bile prisutne druge stani~ne komponente, sva potrebna informacija za proteinsko smatanje o~ito je potjecala od primarnoga slijeda aminokiselina u polipeptidnom lancu.
Utjecaj
Daljnji su pokusi odredili uvjete u kojima denaturirana ribonukleaza potpuno vra}a svoju nativnu strukturu i enzimsku aktivnost potvr|uju}i termodinami~ku hipotezu proteinskog smatanja, koja kaè da nativna trodimenzionalna struktura proteina odgovara ter modinami~ki najstabilnijem stanju u fiziolo{kim uvjetima. Termodinami~ka stabilnost odre|ena je interakcijama me|u aminokiselinama koje ga sa~injavaju, te je stoga trodimenzionalna konfor macija proteina izravno odre|ena primarnim slijedom aminokiselina. Budu}i da redoslijed nukleotida u DNA odre|uje slijed aminokiselina u polipeptidu, proizlazi da redoslijed nukleotida u genu sadràva svu informaciju potrebnu za trodimenzionalnu strukturu svojega proteinskoga produkta. Premda je Anfinsenov rad postavio ter modinami~ki temelj za proteinsko
Christian Anfinsen
smatanje, razumijevanje mehanizma toga procesa jo{ je aktivno podru~je istraìvanja. Smatanje proteina iznimno je sloèno i jo{ uvijek je nemogu}e predvidjeti trodimenzionalnu strukturu proteina izravno iz slijeda aminokiselina. Tako|er je va`no napomenuti da je spontano smatanje proteina in vitro mnogo sporije nego proteinsko smatanje u stanici, gdje pomaù enzimi (vidi 7. poglavlje). Smatanje proteina ostaje sredi{nji izazov biolo{ke kemije.
poprimaju svojstvenu trodimenzionalnu konformaciju koja je bitna za njihovu funkciju. Trodimenzionalne (prostorne) konformacije proteina posljedica su me|usobne interakcije sastavnih aminokiselina tako da su i prostorni oblici proteina odre|eni aminokiselinskim slijedom. Prvi je to pokazao Christian Anfinsen eksperimentom u kojem je zagrijavanjem pokidao trodimenzionalnu proteinsku strukturu. Popucale su samo nekovalentne veze. Taj proces nazivamo denaturacijom (slika 2-17). Proteini denaturirani na takav na~in ~esto se nakon inkubacije u blagim uvjetima spontano vra}aju u
Slika 2-16. Aminokiselinski slijed inzulina.

Inzulin se sastoji od dvaju polipeptidnih lanaca od kojih jedan sadràva 21, a drugi 30 aminokiselina (nazna~enih odgovaraju}im jednoslovnim simbolom)
O C N H
H O C C N H Disulfidni most izme|u cisteinskih ogranaka. H
CH2 S S
S N G I V E QC
1
S A S S S S C S L Y Q L E N Y C S
21
H C C N O
CH2 C
C N
H O
F V NQH L C G S H L V E A L Y L
1
C G E R G F F Y T P K A
30
54
Poglavlje 2
Grijanjem i obradbom reduktivnim reagensom radi kidanja disulfidnih veza raspada se nativna konformacija - protein se denaturira.
C 4
Ako denaturiranu ribonukleazu vratimo u nativne uvjete, spontano }e se smotati u svoju nativnu konformaciju.
10
40 disulfidni mostovi nativna ribonukleaza 58 denaturirana ribonukleaza
nativna ribonukleaza
Slika 2-17. Denaturacija i ponovno smatanje proteina.

Ribonukleaza je protein sazdan od 124 aminokiseline (nazna~ene brojevima). Normalno se protein smata u svoju nativnu konformaciju koja sadràva ~etiri disulfidne veze (nazna~ene kao spareni kruì}i koji predstavljaju cisteine).
hem-skupina C-kraj
nativnu konformaciju, {to je pokazatelj da su prostorne konformacije izravno odre|ene aminokiselinskim slijedom. Trodimenzionalna struktura proteina naj~e{}e se analizira difrakcijom X-zraka (kristalografijom), {to je tehnika visoke rezolucije koja razotkriva razmje{taj pojedina~nih atoma unutar molekule. Snop X-zraka usmjeruje se na kristal analiziranog proteina. X-zrake koje pro|u kroz proteinski kristal detektiraju se filmom osjetljivim na X-zrake. Kad X-zrake udare kristal, raspr{uju se na karakteristi~an na~in koji je odre|en rasporedom atoma u molekuli. Stoga je mogu}e izvesti strukturu molekule na temelju slike raspr{enih X-zraka (difrakcijski uzorak). Godine 1958. John Kendrew prvi je odredio trodimenzionalnu strukturu proteina mioglobina, jednostavnoga proteina sazdanog od 153 aminokiseline (slika 2-18.). Od tada su analizirane tisu}e proteina. Ve}ina tih proteina su globularni proteini, kao {to je i mioglobin. Polipeptidni lanci globularnih proteina smotani su u kompaktne strukture. Neki proteini (primjerice konstruktivni proteini vezivnih tkiva) duga~ke su vlaknaste strukture. Ispitivanje trodimenzionalnih struktura proteina razjasnilo je nekoliko temeljnih principa koji upravljaju procesom smatanja, no struktura proteina toliko je sloèna da iz poznavanja slijeda aminokiselina jo{ uvijek nije mogu}e odrediti trodimenzionalnu strukturu proteina. Op}enito se proteinska struktura opisuje na ~etiri razine. Primarna struktura proteina je slijed aminokiselina u proteinskom lancu. Sekundarna struktura je pravilni lokalni raspored aminokiselina unutar odre|ene regije polipeptida. Godine 1951. Linus Pauling i Robert Corey uo~ili su dva naj~e{}a tipa sekundarne strukture: a-uzvojnicu i b-nabranu plo~u. Obje su te sekundarne strukture u~vr{}ene vodikovim vezama izme|u skupina CO i NH u peptidnim vezama. a-uzvojnica nastaje kad se dio polipeptidnog lanca ovija oko svoje osi, tako da CO skupina jedne peptidne veze uspostavi
N-kraj
Slika 2-18. Trodimenzionalna struktura mioglobina.

Mioglobin je protein izgra|en od 153 aminokiseline koji sudjeluje u transportu kisika. Polipeptidni lanac se smata oko hem-skupine koja sluì kao vezno mjesto za kisik.
Stani~na kemija
55
a-uzvojnica
vodikova veza
Slika 2-19. Sekundarna struktura proteina.

C O C C N C C H N H
C N O C H O C
C O C O N C N C H C H
C N C N H O C O C C N H O C C N O H C N O N H
Naj~e{}i oblici sekundarne strukture su a-uzvojnica i b-nabrana plo~a. U -uzvojnici oblikuju se vodikove veze izme|u skupina CO i NH u peptidnim vezama udaljenim za ~etiri aminokiseline. U -plo~i vodikove veze povezuju dva prilegnuta dijela polipeptidnog lanca. Nisu prikazani bo~ni ogranci aminokiselina.
b-plo~a C N
H C O H O C H N O C C H C N C
O C C C N H N C C H N
H C O O N O H C C C N C
O N C O H N C
H C C
C O
vodikova veza
vodikovu vezu s NH-skupinom peptidne veze ~etvrte aminokiseline u aminokiselinskom nizu polipeptida (slika 2-19). Nasuprot tome b-nabrana plo~a nastane kad se dva dijela polipeptidnog lanca, koji leè jedan do drugoga, poveù vodikovim vezama. Takve se b-plo~e mogu oblikovati izme|u vi{e dijelova polipeptidnog lanca koji mogu biti me|usobno paralelno ili antiparalelno usmjereni. Tercijarna struktura je smotanost polipeptidnog lanca koja nastaje kao posljedica interakcija izme|u bo~nih ogranaka aminokiselina iz razli~itih regija u primarnom slijedu (slika 2-20.). U ve}ini se proteina a-uzvojnice i b-nabrane plo~e, poveN-kraj zane regijama petlji, smataju u kompaktne globularne strukture nazvane domenama i ~ine osnovne jedinice tercijarne strukture. Mali proteini, a-uzvojnica kao {to su ribonukleaza ili mioglobin, imaju samo jednu domenu; ve}i proteini mogu imati vi{e razli~itih domena koje su ~esto povezane s razli~itim funkcijama. Kriti~na odrednica tercijarne strukture jest poloàj hidrofobnih aminokiselina u unutra{njosti proteina i hidrofilnih aminokiselina na povr{ini, gdje mogu stupiti u interakciju
podru~je petlje
Slika 2-20. Tercijarna struktura ribonukleaze.
Podru~ja sekundarne strukture, a-uzvojnice i b-plo~e, povezana podru~jima petlji smataju se u nativnu konformaciju proteina. U shematskom prikazu vrp~astoga modela polipeptidnog lanca prikazane su a-uzvojnice kao spirale, a b-plo~e kao {iroke strjelice.
b-plo~a
C-kraj
56
Poglavlje 2
hem-skupina
b-lanci
a-lanci
Slika 2-21. Kvarterna struktura hemoglobina.

Hemoglobin se sastoji od ~etiriju polipeptidnih lanca od kojih je svaki povezan sa hem-skupinom. Identi~na su dva a-lanca i dva b-lanca.
s vodom. Unutra{njost smotanih proteina sastoji se, dakle, preteìto od hidrofobnih aminokiselina postrojenih u a-uzvojnice i b-plo~e. Te sekundarne strukture nalaze se u hidrofobnim jezgrama proteina, jer vodikove veze neutraliziraju polarni karakter skupina CO i NH u polipeptidnom kosturu. Regije petlji, koje povezuju pravilne elemente sekundarne strukture, nalaze se na povr{ini smotanih proteina, gdje polarne komponente peptidnih veza uspostavljaju vodikove veze s vodom ili s polarnim bo~nim ograncima hidrofilnih aminokiselina. Interakcije izme|u polarnih bo~nih ogranaka (vodikove i ionske veze) na proteinskoj povr{ini tako|er su va`ne odrednice u tercijarnoj strukturi. Povrh toga, kovalentne disulfidne veze izme|u sulfhidrilnih skupina cisteinskih ogranaka stabiliziraju smotane strukture mnogih sekretornih proteina i proteina na stani~noj povr{ini. êtvrta razina proteinske strukture je kvarterna struktura. Sastoji se od interakcija izme|u razli~itih polipeptidnih lanaca u proteinima koji sadràvaju vi{e od jednoga polipeptida. Hemoglobin je, primjerice, sastavljen od ~etiri polipeptidna lanca. Ti su lanci me|usobno povezani istim vrstama interakcija koje odràvaju tercijarnu strukturu (slika 2-21). Razli~ita kemijska svojstva dvadeset razli~itih aminokiselina dovode do znatnih varijacija u trodimenzionalnoj konformaciji smotanih proteina. Stoga proteini ~ine ekstremno sloènu i raznoliku skupinu makromolekula, prikladnu za mno{tvo zada}a koje proteini obavljaju u stani~noj biologiji.
Sredi{nja uloga enzima kao biolo{kih katalizatora

Osnovna zada}a proteina jest da djeluju kao enzimi katalizatori koji ubrzavaju prakti~ki sve kemijske reakcije u stanici. Premda su ribonukleinske kiseline sposobne katalizirati odre|ene reakcije, ve}inu biolo{kih reakcija kataliziraju proteini. Bez enzimske katalize ve}ina biokemijskih reakcija bila bi tako spora da se reakcije ne bi mogle dogoditi u blagim uvjetima temperature i pritiska u kojima se odvija ìvot. Enzimi ubrzavaju takve reakcije znatno vi{e od milijun puta. Reakcije, koje bi u odsutnosti enzima trajale godinama, dogode se u djeli}u sekunde, ako ih katalizira odgovaraju}i enzim. Stanice sadràvaju tisu}e razli~itih enzima. Enzimske aktivnosti odre|uju koje }e se reakcije doista dogoditi unutar stanice.
Kataliti~ka aktivnost enzima

Enzimi imaju dva temeljna svojstva, bitna i za druge katalizatore: (1) oni ubrzavaju kemijske reakcije, a da se tim reakcijama ne tro{e niti trajno mijenjaju, (2) enzimi ubrzavaju reakcije ne mijenjaju}i poloàj ravnoteè izme|u reaktanata i produkata. Ta na~ela enzimske katalize predo~uje sljede}i primjer. Molekula na koju djeluje enzim (koju nazivamo supstrat S) prevodi se reakcijom u produkt P . U odsutnosti enzima reakcija te~e na sljede}i na~in: S P
Kemijsku ravnoteù izme|u S i P odre|uju termodinami~ki zakoni (o ~emu }emo raspravljati dalje u poglavlju), a predstavlja je omjer specifi~nih brzina polazne i povratne reakcije (SP i PS). U prisutnosti odgovaraju}eg enzima ubrzava se pretvorba S u P ali ravnoteà izme|u S i P ostaje , nepromijenjena. Stoga enzim mora jednako ubrzati obje reakcije, polaznu i povratnu. Odgovaraju}i prikaz te reakcije jest S
E
P.
Stani~na kemija
57
Valja uo~iti da se enzim reakcijom ne mijenja pa kemijska ravnoteà ostaje nepromijenjena, jer je odre|ena isklju~ivo termodinami~kim svojstvima SiP . Promjene energije koje se moraju dogoditi tijekom konverzije S u P (slika 2-22) najbolje predo~uju u~inak enzima u takvoj reakciji. Reakcijska ravnoteà odre|ena je kona~nim energijskim stanjima S i P Na ta stanja ne . utje~e enzimska kataliza. Me|utim, da bi moglo do}i do reakcije, supstrat se najprije mora dovesti u vi{e energijsko stanje, takozvano prijelazno stanje. Energija koja je potrebna da se dosegne prijelazno stanje (energija aktivacije) predstavlja prepreku za napredovanje reakcije i ona ograni~uje brzinu reakcije. Enzimi (i drugi katalizatori) djeluju tako da smanjuju energiju aktivacije i na taj na~in pove}avaju brzinu reakcije. Ubrzanje je jednako u oba smjera, u polaznom i u povratnom, jer oba puta prolaze preko istoga prijelaznoga stanja. Kataliti~ka aktivnost enzima uklju~uje vezanje supstrata da nastane kompleks enzim-supstrat (ES). Supstrat se veè na specifi~no mjesto enzima, takozvano aktivno sredi{te (mjesto). Supstrat vezan na aktivno sredi{te prevodi se u reakcijski produkt, koji zatim napu{ta enzim. Enzimski kataliziranoj reakciji odgovara stoga sljede}i prikaz: ES E + P. S+E Valja uo~iti da se E pojavljuje nepromijenjen na obje strane jednad`be, tako da ravnoteà ostaje nedirnuta. Me|utim enzim osigurava okruènje u kojem reakcije pretvorbe S u P teku spremnije. To je posljedica interakcije izme|u enzima i supstrata kojom se smanjuje energija aktivacije i poti~e stvaranje prijelaznoga stanja.
prijelazno stanje nekatalizirana reakcija energija nergi aktivacije tivac
energija
S)
katalizirana reakcija produkt (P)
napredovanje reakcije
Slika 2-22. Energijske promjene tijekom katalizirane i nekatalizirane reakcije.

Prikazana reakcija je jednostavna pretvorba supstrata S u produkt P Budu}i . da je kona~no energijsko stanje P niè od stanja S, reakcija te~e udesno. Me|utim, da bi do{lo do reakcije, S mora najprije pro}i preko vi{ega prijelaznog stanja. Potrebna energija za postizanje prijelaznoga stanja (energija aktivacije) predstavlja prepreku pri odvijanju reakcije i stoga odre|uje brzinu kojom }e reakcija napredovati. U prisutnosti katalizatora (primjerice enzima) smanjuje se aktivacijska energije pa reakcija te~e brè.
Mehanizmi enzimske katalize

Vezanje supstrata na aktivno mjesto enzima vrlo je specifi~na interakcija. Aktivna mjesta su udubljenja ili utori na povr{ini enzima i obi~no su sazdana od aminokiselina iz razli~itih dijelova polipeptidnog lanca koje je tercijarna struktura pribliìla u smotanom proteinu. Supstrati se najprije veù na aktivno mjesto nekovalentnim interakcijama koje uklju~uju vodikove veze, ionske veze i hidrofobne interakcije. Jednom kad je supstrat vezan na aktivno mjesto enzima, mogu}i su razli~iti mehanizmi koji }e ubrzati pretvorbu supstrata u reakcijski produkt. Jednostavan primjer, o kojem je raspravljano, odnosio se na jednosupstratnu reakciju, premda ve}ina biokemijskih reakcija uklju~uje interakciju dvaju ili vi{e supstrata. Primjerice stvaranje peptidne veze uklju~uje povezivanje dviju aminokiselina. U reakcijama toga tipa odvijanje reakcije pospje{uje vezanje dvaju ili vi{e supstrata na aktivno sredi{te u pravom poloàju i u pravoj orijentaciji (slika 2-23). Enzim osigurava kalup koji okuplja reaktante usmjerene na pravi na~in da se pospje{i stvaranje prijelaznoga stanja putem kojega }e stupiti u me|usobnu interakciju. Enzimi ubrzavaju reakcije i time {to mijenjaju konformaciju svojih supstrata radi pribliènja konformaciji prijelaznoga stanja. Najjednostavniji model interakcije enzim-supstrat je model klju~-brava u kojem supstrat savr{eno pristaje u aktivno sredi{te (slika 2-24.). Me|utim, u mnogo slu~ajeva vezanjem supstrata dolazi do promjene konformacije enzima i substrata, {to nazivamo inducirana prilagodba. U takvim se slu~ajevima konformacija substrata promijeni da postane {to sli~nija prijelaznom stanju. Napregnutost izazvana distorzijom supstrata moè oslabiti klju~ne veze i time dodatno olak{ati postizanje prijelaznoga stanja. [tovi{e, prijelazno se stanje stabilizira tijesnim vezanjem na enzim, ~ime se smanjuje potrebna energija aktivacije.
58
Poglavlje 2
supstrati
enzim prijelazno stanje
produkt
kompleks enzim-supstrat
Slika 2-23. Enzimska kataliza dvosupstratne reakcije.

Enzim osigurava kalup putem kojega se dva supstrata zbliùju u prikladnom poloàju i orijentaciji da me|usobno reagiraju.
Povrh privo|enja supstrata i distorzije konformacije supstrata radi pribliènja prijelaznom stanju mnogi enzimi sudjeluju izravno u kataliti~kom procesu. U takvim slu~ajevima bo~ni ogranci specifi~nih aminokiselina u aktivnom sredi{tu mogu reagirati sa supstratima i stvoriti veze s reakcijskim intermedijarima. Kisele i bazi~ne aminokiseline ~esto su uklju~ene u takve kataliti~ke mehanizme {to }e predo~iti rasprava o kimotripsinu kao primjeru enzimske katalize. Kimotripsin je ~lan enzimske obitelji (serinske proteaze) koja razgra|uje proteine kataliziraju}i kidanje peptidnih veza. Reakcija se moè prikazati na sljede}i na~in: protein + H2O peptid1 + peptid2 Razli~iti ~lanovi obitelji serinskih proteaza (uklju~uju}i kimotripsin, tripsin, elastazu i trombin) specifi~ni su za razli~ite supstrate biraju}i razli~ite susjedne aminokiseline me|u kojima }e pokidati peptidne veze. Primjerice, kimotripsin razgra|uje veze uz hidrofobne aminokiseline kao {to su triptofan i fenilalanin, dok tripsin razgra|uje veze uz bazi~ne aminokiseline kao {to su lizin i arginin. Sve serinske proteaze imaju, me|utim, sli~nu strukturu i koriste isti mehanizam katalize. Aktivna mjesta tih enzima sadràvaju tri klju~ne aminokiseline serin, histidin i aspartat koje pokre}u hidrolizu peptidne veze. Ti su enzimi nazvani serinskim proteazama zbog sredi{nje uloge serinskog ogranka. Supstrati se veù na serinske proteaze umetanjem aminokiselina uz mjesto kidanja u dèp na aktivnom sredi{tu enzima (slika 2-25). Svojstva dèpa odre|uju specifi~nost razli~itih serinskih proteaza prema odre|enom supstratu. Primjerice, vezni dèp kimotripsina sadràva hidrofobne aminokiseline koje stupaju u interakciju s hidrofobnim ograncima izabranih supstrata. Suprotno tome
(A)
supstrat
model klju~-brava enzim
(B)
Supstrat i enzim su promijenjeni u konformaciju prijelaznoga stanja. inducirana prilagodba
Slika 2-24. Modeli interakcije enzim-supstrat.

Model klju~-brava pretpostavlja da supstrat precizno pristaje u aktivno sredi{te enzima. (B) Model inducirane prilagodbe pretpostavlja da vezanje supstrata mijenja konformacije supstrata i enzima. Ta promjena pribliùje supstrat konformaciji prijelaznoga stanja, {to ubrzava reakciju.
Stani~na kemija
59
peptidna veza za kidanje H O N C C N H H CH2 H O N C C N H H CH2 CH2 CH2 CH2 kimotripsin NH3 + Asp Ionska interakcija tripsin
Slika 2-25. Vezanje supstrata na serinske proteaze.

Aminokiselina uz peptidnu vezu koju treba pokidati umetnuta je u dèp aktivnoga sredi{ta enzima. Kod kimotripsina dèp veè hidrofobne aminokiseline; vezni dèp tripsina sadràva negativno nabijeni ogranak aspartata koji veè bazi~ne aminokiseline ionskom interakcijom.
Hidrofobna interakcija
vezni dèp tripsina sadràva negativno nabijenu kiselu aminokiselinu (aspartat) koja moè stvoriti ionsku vezu s ograncima lizina ili arginina u svojim supstratima. Vezanje supstrata postavlja peptidnu vezu koju treba pokidati uz serin aktivnoga mjesta (slika 2-26). Proton toga serina prenosi se tada na aktivno mjesto histidina. Konformacija aktivnoga sredi{ta pogoduje tom prijenosu protona, jer je histidin u interakciji s negativno nabijenim ogrankom aspartata. Serin reagira sa supstratom stvaraju}i tetraedarsko prijelazno stanje. Peptidna se veza zatim pokida, a C-kraj supstrata napu{ta enzim. Me|utim N-kraj peptida ostaje vezan na serin. Nastalo se stanje razrje{uje kad molekula vode (drugi supstrat) u|e u aktivno sredi{te i obrne slijed reakcija koje su se bile dogodile. Proton molekule vode prenosi se na histidin, a hidroksilna skupina na peptid, pri ~emu nastane drugo tetraedarsko prijelazno stanje. Proton se zatim prenosi od histidina natrag na serin, a peptid napu{ta enzim, ~ime je reakcija dovr{ena. Ovaj primjer osvjetljava nekoliko svojstava enzimske katalize: specifi~nost interakcija enzim-supstrat, smje{taj razli~itih supstrata u aktivnom sredi{tu i uklju~enost ogranaka aktivnoga sredi{ta u stvaranju i stabilizaciji prijelaznoga stanja. Premda tisu}e enzima kataliziraju mno{tvo razli~itih vrsta kemijskih reakcija u stanici, za njihovo djelovanje vrijede ista temeljna na~ela.
Koenzimi
Osim {to veù supstrate, aktivna mjesta mnogih enzima veù i druge male molekule koje sudjeluju u katalizi. Prosteti~ke skupine su male molekule vezane na proteine i imaju klju~nu ulogu u proteinskoj funkciji. Primjerice kisik, koji se prenosi mioglobinom ili hemoglobinom, vezan je na hem, prosteti~ku skupinu tih proteina. U mnogo slu~ajeva na enzime su vezani metalni ioni (npr. cink ili èljezo) i imaju klju~nu ulogu u kataliti~kom procesu. U specifi~nim vrstama enzimskih reakcija sudjeluju tako|er mnoge organske molekule male molekularne mase. Takve se molekule nazivaju koenzimima, jer sura|uju s enzimima pri ubrzavanju reakcija. Suprotno supstratima, koenzimi se u reakcijama u koje su uklju~eni ne mijenjaju nepovratno. Oni recikliraju i sudjeluju u mnogima enzimskim reakcijama.
60
Poglavlje 2
Slika 2-26. Kataliti~ki mehanizam kimotripsina.

Tri aminokiseline u aktivnom sredi{tu (Ser-195, His-57 i Asp-102) imaju klju~nu ulogu u katalizi.
N-kraj
NH C O N H O H CH2 C
mjesto kidanja C-kraj
NH
O C
CH2 Vezni dèp Ser-195 His-57
Asp-102
N-kraj
NH C O N H HN + NH O C His-57 Asp-102 O
C-kraj
CH2 C O
Ser-195 prenosi H+ na His-57 i oblikuje tetraedarsko prijelazno stanje sa supstratom. Asp-102 stabilizira prijenos H+ na His-57 ionskom interakcijom.
CH2 Ser-195
N-kraj C-kraj
NH C CH2 C O NH2
slobodni peptid
NH O C His-57 Asp-102 O
Preneseni H+ od His-57 na supstrat; kidanje peptidne veze.
O CH2 Ser-195
N-kraj
NH C O O H H N NH O C His-57 Asp-102 O
H2O ulazi u aktivno mjesto stvaraju}i vodikovu vezu s His-57.
CH2 C O CH2
Ser-195
N-kraj
NH CH2 O CH2 Ser-195 HN + NH O C His-57 Asp-102 O O OH
C C
H2O prenosi H+ na His-57 i OH na supstrat oblikuju}i drugo prijelazno stanje.
N-kraj
NH C CH2 C OH O
H+ vra}en od His-57 na Ser-195; peptid na strani N-kraja napu{ta enzim.
O CH2
NH
O C
Ser-195
His-57
Asp-102
Stani~na kemija
61
(A) NAD+ H NADH H C NH2 H O O P O O P O O OH CH2 O N N OH N NH2 N O CH2 O + N H O O P O O P O O OH CH2 O N N OH N NH2 N O CH2 O H H H C NH2 H O N H O
2e
H+
OH
OH (B) 1 H H C OH H NAD + C
OH
OH
NADH
H+
S1(red) S1(oks) Koenzimi sluè kao prenositelji razli~itih vrsta kemijskih skupina. Izraziti primjer je koenzim niko2 tinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) koji djeluje H H O kao prenositelj elektrona u oksido-redukcijskim + C H C OH + NAD + + NADH + H reakcijama (slika 2-27). NAD+ moè od nekog supS2(oks) S2(red) strata prihvatiti vodikov ion (H+) i dva elektrona, pri ~emu nastaje NADH. NADH moè predati te zbroj: elektrone drugom supstratu da opet nastane H H + + H O H O NAD . Na taj na~in NAD prenosi elektrone od H C OH H C OH + C C + prvoga supstrata (koji se oksidira) na drugi supS2(red) S1(red) S2(oks) S1(oks) strat (koji se reducira). Ima jo{ nekoliko koenzima koji tako|er djeluju kao prenositelji elektrona. Drugi pak koenzimi sudjeluju u prijenosu kemijskih skupina (npr. karbokSlika 2-27. Uloga NAD+ u oksidosilne ili acilne skupine; tablica 2-1). Isti koenzimi sura|uju s razli~itim enziredukcijskim reakcijama. (A) nikotinamid-adenin-dinukleotid mima u kataliti~kom prijenosu specifi~nih kemijskih skupina izme|u razli(NAD+) djeluje kao nosa~ elektrona u ~itih supstrata. Mnogi su koenzimi blisko srodni vitaminima koji imaju dio oksido-redukcijskim reakcijama: primaili cjelovitu strukturu koenzima. Vitamini nisu nu`ni bakterijama, primjeriju}i elektrone (e) prelazi u NADH. (B) ce E. coli, ali su bitan sastojak u prehrani ljudi i vi{ih ìvotinja, kod kojih je NAD+ moè primjerice preuzeti eleki{~eznula sposobnost sinteze tih spojeva. trone supstrata (S1) pri ~emu nastaje
Regulacija enzimske aktivnosti

Va`no svojstvo ve}ine enzima jest aktivnost koja nije konstantna, nego se moè prilago|avati. Enzimske se aktivnosti mogu regulirati tako da svojim u~inkom odgovaraju na promjenjive fiziolo{ke potrebe do kojih dolazi u ìvotu stanice. Jedan od ~estih tipova enzimske regulacije jest inhibicija povratnom spregom, pri kojoj produkt metaboli~kog puta inhibira aktivnost odre|enog enzima na putu sinteze tog produkta. Aminokiselina izoleucin se primjerice sintetizira nizom reakcija po~ev{i od treonina (slika 2-28). Prvi ko-
oksidirani S1 i NADH. NADH nastao tom reakcijom prenosi elektrone na drugi supstrat (S2) pa nastaje reducirani S2 uz regeneraciju NAD+. Stvarni u~inak jest prijenos elektrona (prenesenih s pomo}u NADH) od S1 (koji se oksidira) na S2 (koji se reducira).
62
Poglavlje 2
Tablica 2-1. Primjeri koenzima i vitamina

Koenzim
NAD+, NADP+ FAD tiamin-pirofosfat koenzim A tetrahidrofolat biotin piridoksal fosfat
Srodni vitamin
niacin riboflavin (B2) tiamin (B1) pantotenat folat biotin piridoksal (B6)
Kemijska reakcija
oksido-redukcija oksido-redukcija prijenos aldehidne skupine prijenos acilne skupine prijenos 1C-skupine karboksilacija transaminacija
treonin treonin-deaminaza aketoglutarat
izoleucin
Slika 2-28. Inhibicija povratnom spregom.

Prvi korak pretvorbe treonina u izoleucin katalizira enzim treonin-deaminaza. Izoleucin, krajnji produkt reakcijskoga puta, inhibira aktivnost tog enzima.
rak na tom putu katalizira enzim treonin-deaminaza koju inhibira izoleucin, kona~ni produkt puta. Odgovaraju}a koli~ina izoleucina u stanici inhibira treonin-deaminazu, onemogu}uju}i na taj na~in daljnju sintezu izoleucina. Ako se koncentracija izoleucina smanji, prestaje inhibicija povratnom spregom i sintetizira se dodatni izoleucin. Regulacijom aktivnosti treonindeaminaze stanica sintetizira potrebni izoleucin izbjegavaju}i rasipanje energije na sintezu nepotrebnoga vi{ka izoleucina. Inhibicija povratnom spregom primjer je alosteri~ke regulacije pri kojoj se enzimska aktivnost nadzire vezanjem malih molekula na regulacijska mjesta u enzimu (slika 2-29). Naziv alosteri~ka regulacija izvodi se iz ~injenice da se regulacijska molekula ne veè na kataliti~ko mjesto nego na odre|eno drugo mjesto na proteinu (alloj=drugi, stereoj=mjesto). Vezanje regulacijske molekule mijenja konformaciju proteina zbog koje se promijeni oblik aktivnoga sredi{ta i kataliti~ka aktivnost enzima. U slu~aju treonin-deaminaze vezanje regulacijske molekule (izoleucina) inhibira enzimsku aktivnost. U drugim slu~ajevima regulacijske molekule sluè kao aktivatori. Aktivatori ne inhibiraju nego ciljano stimuliraju svoje enzime. Aktivnosti enzima mogu se tako|er regulirati interakcijom s drugim proteinima ili kovalentnim modifikacijama kao {to je vezanje fosfatne skupine
Akivna supstrat vezan u aktivnom mjestu
Neaktivna
Slika 2-29. Alosteri~ka regulacija.

U prikazanom primjeru enzimsku aktivnost inhibira vezanje regulacijske molekule na alosteri~ko mjesto. U odsutnosti inhibitora supstrat se veè u aktivno mjesto enzima i reakcija te~e. Vezanje inhibitora na alosteri~ko mjesto uzrokuje konformacijsku promjenu enzima i sprje~ava vezanje supstrata. Ve}ina alosteri~kih enzima imaju vi{e podjedinica.
inhibitor vezan na alosteri~ko mjesto
Stani~na kemija
63
Slika 2-30. Fosforilacija proteina.

O C O C
N H
H C CH2 OH serin
fosforilacija proteina
N H
H C
CH2 O P
ADP
Neki su enzimi regulirani vezanjem fosfatnih skupina na hidroksilne skupine bo~nih ogranaka serina (kao {to je prikazano), treonina ili tirozina. Primjerice, glikogen-fosforilaza, koja katalizira pretvorbu glikogena u glukozu-1-fosfat, aktivira se fosforilacijom na poticaj vezanja epinefrina na mi{i}ne stanice.
epinefrin
neaktivna glikogen-fosforilaza fosforilaza-kinaza
ADP
glikogen
glukoza-1-fosfat
na bo~ni ogranak serina, treonina ili tirozina. Fosforilacija je osobito ~est mehanizam regulacije enzimske aktivnosti. Vezanje fosfatnih skupina stimulira ili inhibira aktivnosti mnogih enzima (slika 2-30). Primjerice, mi{i}ne stanice odgovaraju na epinefrin (adrenalin) razgradnjom glikogena na glukozu. Na taj se na~in osigurava izvor energije za poja~anu mi{i}nu aktivnost. Razgradnju glikogena katalizira enzim glikogen-fosforilaza, koju aktivira fosforilacija na poticaj vezanja adrenalina za receptor na povr{ini mi{i}ne stanice. Fosforilacija proteina ima sredi{nju ulogu u kontroli, ne samo metaboli~kih, nego i mnogih drugih stani~nih funkcija, uklju~uju}i stani~ni rast i diferencijaciju.
Metaboli~ka energija
Za mnoge zada}e (primjerice kretanje, sintezu makromolekula) koje stanica mora obaviti potrebna je energija. Zbog toga je veliki dio stani~nih aktivnosti usmjeren na dobavu energije iz okoline i na kori{tenje te energije za pokretanje energijski zahtjevnih reakcija. Premda enzimi kontroliraju gotovo sve kemijske reakcije unutar stanica, enzimska kataliza ne utje~e na poloàj ravnoteè kemijskih reakcija. Zakoni termodinamike upravljaju kemijskom ravnoteòm i odre|uju energijski povoljan smjer svih kemijskih reakcija. Mnoge reakcije koje se moraju dogoditi unutar stanice nisu energijski povoljne i stoga se mogu odvijati samo dovo|enjem energije. Zato stanica mora neprekidno tro{iti energiju koju crpi iz okoline. Stoga je stvaranje i kori{tenje metaboli~ke energije bitno za cjelokupnu stani~nu biologiju.
Slobodna energija i ATP

Energetiku biokemijskih reakcija moè se najbolje opisati termodinami~kom funkcijom nazvanom Gibbsova slobodna energija (G) prema Josiahu Willardu Gibbsu. Promjena slobodne energije (G) neke reakcije povezuje
64
Poglavlje 2
u~inke promjene entalpije (oslobo|ene ili apsorbirane topline tijekom kemijske reakcije) i entropije (stupnja nereda koji nastaje reakcijom) pretkazuju}i ho}e li reakcija biti ili ne}e biti energijski povoljna. Sve se kemijske reakcije spontano odvijaju u energijski povoljnom smjeru i prati ih smanjenje slobodne energije (G < 0). Razmotrimo primjer zami{ljene reakcije kojom se A prevodi u B: A B. Ako je G < 0, reakcija }e te}i u smjeru kako je napisana. Me|utim, ako je G > 0, reakcija }e te}i u suprotnom smjeru: B }e prelaziti u A. G reakcije ne odre|uju samo intrinzi~ka svojstva reaktanata i produkata nego i njihove koncentracije i drugi reakcijski uvjeti (npr. temperatura). Stoga je korisno odrediti promjenu slobodne energije u standardnim uvjetima. (Standardni uvjeti podrazumijevaju da su koncentracije svih reaktanata i produkata 1 M te da je pritisak 1 atm). Promjena standardne slobodne energije (G) neke reakcije u izravnoj je vezi s poloàjem ravnoteè, jer je stvarna G funkcija G i koncentracija reaktanata i produkata. Kao primjer razmotrimo reakciju A B. Promjena slobodne energije odre|ena je izrazom DG = DG + RT ln B/A, gdje je R plinska konstanta, a T apsolutna temperatura. U ravnoteì je G = 0 i reakcija se ne odvija ni u kojem smjeru. Ravnote`na konstanta reakcije (K = B/A u ravnoteì) prema gornjoj jednad`bi izravno ovisi o G, {to se moè prikazati kao 0 = DG +RT ln K ili DG = RT ln K. Ako je stvarni omjer B/A ve}i od ravnote`nog omjera (K), G > 0 i reakcija te~e u suprotnom smjeru (konverzija B u A). Nasuprot tomu, ako je omjer B/A manji od ravnote`noga, G < 0 pa se A prevodi u B. Zbog toga promjena standardne slobodne energije (G) neke reakcije odre|uje njezinu kemijsku ravnoteù i pokazuje u kojemu }e smjeru te}i reakcija u zadanim okolnostima. Promjena standardne slobodne energije biokemijskih reakcija obi~no se izraàva kao G, i odnosi se na promjenu standardne slobodne energije u vodenoj otopini kod pH = 7, {to pribli`no odgovara uvjetima unutar stanice. Mnoge biolo{ke reakcije (primjerice sinteza makromolekula) termodinami~ki su nepovoljne (G > 0) u stani~nim uvjetima. Za odvijanje takvih reakcija potreban je dodatni izvor energije. Razmotrimo primjer reakcije A B G = +42 kJ/mol. Pretvorba A u B energijski je nepovoljna pa reakcija te~e u suprotnom smjeru umjesto u smjeru stvaranja produkta B. Me|utim reakciju u smjeru stvaranja B moè pokrenuti povezivanje nepovoljne konverzije A u B s energijski povoljnom reakcijom kao {to je reakcija C D G = 84 kJ/mol.
Ako se poveù ove dvije reakcije, ukupnu reakciju moèmo zdruìvanjem prikazati kao A+C B+D G = 42 kJ/mol.
Stani~na kemija G vezane reakcije jednaka je zbroju promjena slobodnih energija pojedina~nih sastavnih reakcija pa je ukupna zdruèna reakcija energijski povoljna i te}i }e kao {to je napisana. Tako se energijski nepovoljna konverzija A u B pokre}e povezivanjem s drugom reakcijom koja se odvija uz veliko smanjenje slobodne energije. Enzimi su zaduèni za provedbu takvih vezanih reakcija na koordinirani na~in. Stanica rabi ovaj temeljni mehanizam za pokretanje mnogih energijski nepovoljnih reakcija koje su nu`ne u biolo{kim sustavima. Adenozin-5-trifosfat (ATP) ima sredi{nju ulogu u takvim procesima i djeluje kao spremi{te slobodne energije unutar stanice (slika 2-31). Veze izme|u fosfata u ATP poznate su kao visoko-energijske veze, jer njihovu hidrolizu prati relativno veliko smanjenje slobodne energije. Nema ni{ta posebno u tim kemijskim vezama. Nazivaju ih visoko-energijskima samo zbog velike slobodne energije koja se oslobodi prigodom hidrolize unutar stanice. Hidroliza ATP do ADP i fosfata (Pi) te~e uz G =30 kJ/mol. Podsjetimo se, me|utim, da se G odnosi na standardne uvjete, kod kojih su koncentracije produkata i reaktanata 1 M. Stvarne unutarstani~ne koncentracije Pi pribli`no su . 10-2 M, a koncentracije ATP ve}e su od koncentracija ADP Te razlike izme|u unutarstani~nih koncentracija i standardnog stanja pogoduju hidrolizi ATP tako da G za hidrolizu ATP unutar stanice iznosi pribli`no 50 kJ/mol. ATP se alternativno moè hidrolizirati do AMP i pirofosfata (PPi). Osloba|a se pribli`no jednaka koli~ina slobodne energije kao pri hidrolizi ATP do ADP Me|utim, nastali pirofosfat u toj se reakciji sam brzo hidrolizira uz . G sli~nu hidrolizi ATP Na taj je na~in ukupna promjena slobodne energije . pri hidrolizi ATP do AMP pribli`no dvostruka od energije dobivene hidrolizom ATP do ADP Radi usporedbe, energija veze izme|u {e}erne i fosfatne . skupine AMP nije velika i tipi~na je za kovalentne veze: G = 14 kJ/mol. Zbog popratnoga smanjenja slobodne energije hidroliza ATP moè po kretati druge energijski zahtjevne reakcije unutar stanice. Primjerice, prva reakcija glikolize (o kojoj raspravljamo u sljede}em poglavlju) konverzija je glukoze u glukoza-6-fosfat. Reakciju moèmo prikazati kao glukoza + fosfat (HPO42) glukoza-6-fosfat + H2O. Budu}i da je napisana reakcija energijski nepovoljna (G = + 14 kJ/ mol), mora se povezati s hidrolizom ATP da se pokrene u napisanom smjeru (G = 30 kJ/mol). Zdruènu reakciju moèmo napisati kao glukoza + ATP glukoza-6-fosfat + ADP . Promjena slobodne energije za tu reakciju zbroj je promjena slobodnih energija pojedina~nih reakcija, tako da je za zdruènu reakciju G = 16 kJ/mol {to poti~e stvaranje glukoza-6-fosfata. Postoje i druge molekule, uklju~uju}i nukleozid-trifosfate (primjerice GTP), koje posjeduju visoko-energijske veze pa se i one koriste, kao i ATP , za pokretanje energijski zahtjevnih reakcija. Me|utim, za ve}inu reakcija energiju dobavlja ATP Zbog toga su reakcije u stanici povezane: one koje . osloba|aju energiju sa sintezom ATP a one koje zahtijevaju energiju s hi, drolizom ATP Stoga visoko-energijske veze ATP imaju sredi{nju ulogu u . stani~nom metabolizmu i sluè kao uporabivi oblik pohranjene slobodne energije.
65
Stvaranje ATP iz glukoze

Razgradnja ugljikohidrata, posebice glukoze, glavni je izvor stani~ne energije. Potpuna oksidativna razgradnja glukoze do CO2 i H2O moè se napisati kao C6H12O6 +6O2 6CO2 + 6H2O.
66
Poglavlje 2
NH2 ATP O
O
O O P O O
O P O O CH2 O N N
P O
H2O
OH
OH
H2O
NH2 NH2 ADP O

O
O N
O
AMP O CH2 O
O O P O O CH2 O N N
P O
P O
OH OH OH
OH
+
Slika 2-31. ATP kao uskladi{tena energija.
O
O
+
O
O
O O P O H2O OH
P O
OH
P i)
Veze izme|u fosfatnih skupina ATP nazivaju se visokoenergijskim vezama zbog velikog smanjenja slobodne energije nakon njihove hidrolize. Hidrolizom ATP moè nastati ADP i fosfatna skupina (HPO42) ili AMP i pirofosfat. Nastali pirofosfat sam se brzo hidrolizira osloba|aju}i dodatnu slobodnu energiju.
P O
P P i)
2 Pi
Reakcija proizvodi veliku koli~inu slobodne energije: G = 867,5 kJ/mol. Da bi se ova energija prikupila u uporabivom obliku, glukoza se u stanici oksidira u nizu koraka koji su povezani sa sintezom ATP . Glikoliza, po~etna faza razgradnje glukoze, zajedni~ka je prakti~ki svim stanicama. Glikoliza se zbiva u odsutnosti kisika pa anaerobnim organizmima moè osigurati svu potrebnu metaboli~ku energiju. U aerobnim stanicama glikoliza je tek prva faza razgradnje glukoze. Reakcije glikolize razgra|uju glukozu do piruvata uz neto-dobitak od dvije molekule ATP (slika 2-32). Po~etne reakcije na glikoliti~kom putu u stvari tro{e energiju rabe}i ATP za fosforilaciju glukoze do glukoza-6-fosfata i zatim fruktoza-fosfata do fruktoza-1,6-bisfosfata. Enzimi koji kataliziraju ove dvije reakcije, heksokinaza i fosfofruktokinaza, va`ne su regulacijske to~ke glikoliti~kog puta. Klju~ni nadzor provodi fosfofruktokinaza, koju inhibira visoka razina ATP Inhibicija fosfofruktokinaze izaziva nagomila. vanje glukoza-6-fosfata, koji tada inhibira heksokinazu. Na taj je na~in inhibirana razgradnja glukoze kad stanica ima dovoljno raspoloìve metaboli~ke energije u obliku ATP .
Stani~na kemija
67
Reakcije koje slijede nakon stvaranja fruktoza-1,6-bisfosfata pripadaju dijelu glikoliti~kog puta kojim se proizvodi energija. Raspadom fruktoza1,6-bisfosfata nastaju dvije molekule {e}era s tri ugljikova atoma. Gliceraldehid-3-fosfat oksidira se u 1,3-bisfosfoglicerat. Fosfatna skupina toga spoja ima vrlo veliku slobodnu energiju hidrolize (G = 48,1 kJ) pa se koristi u sljede}oj reakciji glikolize za pokretanje sinteze ATP iz ADP Produkt te . reakcije, 3-fosfoglicerat, prevodi se zatim u fosfoenolpiruvat, drugi visokoenergijski intermedijar u glikolizi. Hidroliza visokoenergijskog fosfata u fosfoenolpiruvatu te~e uz G = 61 kJ/mol pa se konverzija fosfoenolpiruvata u piruvat povezuje sa sintezom ATP Svaka molekula gliceraldehid-3. fosfata, koja se prevede u piruvat, povezana je s proizvodnjom dviju molekula ATP Od ishodne molekule glukoze ukupno se sintetiziraju ~etiri mole. kule ATP Budu}i da su dvije molekule ATP bile potrebne za otpo~injanje . prvih reakcija, neto-dobitak od glikolize su dvije molekule ATP . Povrh proizvedenog ATP glikoliza pretvara dvije molekule koenzima , NAD+ u NADH. U toj reakciji NAD+ djeluje kao oksidacijsko sredstvo koje prima elektrone od gliceraldehid-3-fosfata. NADH, nastali produkt te reakcije, reciklira, i sluì kao donor elektrona u drugim oksido-redukcijskim reakcijama unutar stanice. U anaerobnim uvjetima konverzijom piruvata u laktat ili etanol NADH nastao glikolizom reoksidira se u NAD+. Me|utim, u aerobnim organizmima NADH sluì kao dodatni izvor energije daju}i svoje elektrone transportnom lancu elektrona putem kojega }e na kraju . posluìti za redukciju O2 u H2O uz povezano stvaranje dodatnog ATP U eukariotskim stanicama glikoliza se odvija u citosolu. Piruvat se zatim prenosi u mitohondrij, gdje se njegovom potpunom oksidacijom do CO2 i H2O proizvede ve}ina ATP dobivenog razgradnjom glukoze. Sljede}i je korak u metabolizmu piruvata njegova oksidativna dekarboksilacija u prisutnosti koenzima A (CoA) koji sluì kao nosa~ acilnih skupina u razli~itim metaboli~kim reakcijama (slika 2-33). Jedan se ugljik piruvata oslobodi kao CO2, a preostala dva ugljika predaju se koenzimu A da nastane acetil-CoA. U tom se procesu reducira molekula NAD+ u NADH. Acetil-CoA nastao ovom reakcijom ulazi u ciklus limunske kiseline ili Krebsov ciklus (slika 2-34) koji je sredi{nji put oksidativnog metabolizma. Dva ugljikova atoma acetilne skupine povezuju se s oksaloacetatom (~etiri ugljika) da nastane citrat ({est ugljika). Tijekom osam sljede}ih reakcija dva se citratna ugljika potpuno oksidiraju do CO2 pri ~emu se regenerira oksaloacetat. Tijekom ciklusa stvori se jedna visokoenergijska fosfatna veza u GTP koja se izravno koristi za pokretanje sinteze molekule ATP Povrh toga . svaki krug ciklusa proizvede tri molekule NADH i molekulu reduciranoga flavin-adenin-dinukleotida (FADH2) koji je tako|er nosa~ elektrona u oksido-redukcijskim reakcijama. Ciklus limunske kiseline dovr{ava oksidaciju glukoze do {est molekula CO2. êtiri molekule ATP izravno su dobivene od svake molekule glukoze dvije tijekom glikolize i dvije ciklusom limunske kiseline (po jedna od svake molekule piruvata). Osim toga, nastaje deset molekula NADH (dvije iz glikolize, dvije konverzijom piruvata u acetil-CoA i {est iz ciklusa limunske kiseline) te dvije molekule FADH2. Preostala energija, kojoj je izvor razgradnja glukoze, dolazi od reoksidacije NADH i FADH2, kad se njihovi elektroni prenesu transportnim lancem elektrona do kisika koji se reducira u H2O. Tijekom oksidativne fosforilacije povezuju se elektroni NADH i FADH2 s O2, a oslobo|ena energija tim procesom pokre}e sintezu ATP od ADP Prije. nos elektrona od NADH na O2 oslobodi golemu koli~inu slobodne energije: G = 219,5 kJ za svaki par prenesenih elektrona. Da bi se ta energija prikupila u uporabivom obliku, proces se odvija postupnim prolaskom
68
Poglavlje 2
tro{enje energije H2OH O H H glukoza
proizvodnja energije Pi Pi NAD + + NAD NADH NADH O OP P H H

2
OH
1,3-bisfosfoglicerat
ADP H2O P H O H H HO H OH OH H glukoza-6-fosfat H H2
P ADP
OO
3-fosfoglicerat P
PO
H2 O H H OH H
H2OH OH fruktoza-6-fosfat H
2
P OH
2 -fosfoglicerat
ADP PO H H H OH H O HO OH H2O P fruktoza-1,6-bisfosfat ADP AD ADP ADP
fosfoenolpiruvat
H2 O
OP
H H H2
O OH OP H3
piruvat
aerobni uvjeti prema ciklusu limunske kiseline
H2OH dihidroksiaceton fosfat
gliceraldehid-3-fosfat NADH NADH
anaerobni uvjeti
2
Slika 2-32. Reakcije glikolize.

Glukoza se razgra|uje do piruvata uz osloba|anje dviju molekula ATP i dviju molekula NADH. U anaerobnim uvjetima NADH se reoksidira konverzijom piruvata u etanol ili laktat. U aerobnim uvjetima piruvat se dalje metabolizira u ciklusu limunske kiseline. Obrati pozornost na ~injenicu da od jedne molekule glukoze nastanu dvije molekule 3C-atomnih derivata za proizvodnju energije.
NAD + + NAD
OO H
NADH NADH OO OH H3 H O H3 acetaldehid
NAD + + NAD
OH
3
laktat
etanol
Stani~na kemija
69
OO
+
3
CoASH A
NAD +
O2
CoAS A
H3
Slika 2-33. Oksidativna dekarboksilacija piruvata.

NADH
piruvat CoASH A N O
O
Piruvat se prevodi u CO2 i acetil-CoA. U tom se procesu proizvodi molekula NADH. Koenzim A (CoA-SH) je op}i nosa~ aktiviranih acilnih skupina u razli~itim reakcijama.
NH2 N
H2C O
P O
O C HN CH2 CH2 SH CH2 CH2
O H N C H C
CH3 C CH2 O
P O
O
O
O P O O
OH
OH CH3
elektrona preko niza nosa~a koji ~ine transportni lanac elektrona (slika 235.). Sastavnice transportnog lanca elektrona smje{tene su u unutra{njoj mitohondrijskoj membrani eukariotskih stanica. Pojedinosti oksidativne fosforilacije razmotrit }emo u 10. poglavlju u raspravi o mitohondrijima. U aerobnim bakterijama, koje rabe usporedivi sustav, sastavnice lan~anog prijenosa elektrona smje{tene su u stani~nu membranu. U svakom slu~aju prijenos elektrona od NADH na O2 stvara dovoljno energije za pokretanje sinteze pribli`no triju molekula ATP Elektroni od FADH2 ulaze u transport. ni lanac na niòj energijskoj razini pa njihov prijenos na O2 donosi manje uporabive energije, za dvije molekule ATP . Sada moèmo izra~unati ukupni prinos ATP oksidacijom glukoze. Netodobitak od glikolize jesu dvije molekule ATP i dvije molekule NADH. Pretvorba piruvata do acetil-CoA i njegov metabolizam putem ciklusa limunske kiseline donosi jo{ dvije molekule ATP osam molekula NADH i dvije , molekule FADH2. Pretpostavimo li da se oksidacijom svakog NADH sintetiziraju tri molekule ATP i po dvije od svakog FADH2, ukupan prinos je 38 molekula ATP po molekuli glukoze. Me|utim, u nekim je stanicama prinos ne{to niì, jer dvije molekule NADH, nastale glikolizom u citosolu, ne mogu izravno u}i u mitohodrij. Elektroni tih molekula NADH prenose se u mitohondrij posebnim prijenosnim sustavom. Ovisno o kori{tenom sustavu, mogu}e je da ti elektroni u|u u transportni lanac na razini FADH2. U takvim slu~ajevima dvije molekule NADH iz glikolize ne omogu}uju sintezu triju nego samo dviju molekula ATP pa na taj na~in smanjuju ukupno iskori{tenje od 38 ATP na 36 ATP po molekuli glukoze.
Dobivanje energije iz drugih organskih molekula

Energiju u obliku ATP mogu}e je dobiti razgradnjom i drugih organskih molekula pri ~emu sredi{nju ulogu imaju putovi uklju~eni u razgradnju glukoze. Nukleotidi se, primjerice, mogu razgraditi do {e}era koji zatim ulaze u glikoliti~ki put. I aminokiseline se razgra|uju putem ciklusa limunske kiseline. Dva osnovna oblika uskladi{tene energije unutar stanica, polisaharidi i lipidi, tako|er se mogu razgraditi za proizvodnju ATP Polisaharidi se . kidaju na slobodne {e}ere koji se metaboliziraju kako je opisano u prethod-
70
Poglavlje 2
S
H3
CoA
acetil-CoA
CoASH A oksaloacetat
OO
citrat
OO H2
NADH NAD +
O H2 OO
HO H2 OO
OO
H2O
OO
malat
HO
2
OO H2
cis-akonitat
OO
H2O
OO
OO
H2O
fumarat
ciklus limunske kiseline
OO H2 H OO H2 OO
izocitrat
FADH2 FAD
OO H2 H2
HO
NAD + CoASH A
OO H O H
sukcinat
OO
NADH
CoA GDP
CoASH A
O OO
CO2
NAD + NADH CO2
a-ketoglutarat
Slika 2-34. Ciklus limunske kiseline.

2C-atomna acetilna skupina prenosi se od acetil-CoA na oksaloacetat da nastane citrat. Dva ugljika citrata oksidiraju se u CO2 i regenerira se oksaloacetat. Svaki krug ciklusa stvara molekulu GTP tri , molekule NADH i molekulu FADH2.
sukcinil-CoA
nom odlomku. Lipidi su me|utim jo{ u~inkovitija molekularna skladi{ta energije. Budu}i da su lipidi reduciraniji od ugljikohidrata, jer sadràvaju preteìto ugljikovodi~ne lance, njihova oksidacija donosi osjetno vi{e energije po masi ishodne tvari. Masti (triacilgliceroli) su glavni oblik skladi{tenja lipida. Prvi je korak u njihovom iskori{tavanju razgradnja do glicerola i slobodnih masnih kiselina. Svaka masna kiselina povezuje se s koenzimom A da nastane acil-CoA uz utro{ak jedne molekule ATP (slika 2-36). Masne kiseline razgra|uju se u
Stani~na kemija
71
NADH 2 e Elektroni se prenose od NADH do flavin-mononukleotida (FMN) pa putem nosa~a èljezo-sumpor (Fe-S) do koenzima Q (CoQ).
Slika 2-35. Transportni lanac elektrona.

Elektroni se prenose od NADH i FADH2 na O2 preko niza nosa~a organiziranih u ~etiri proteinska kompleksa unutar mitohondrijske membrane. Slobodna energija oslobo|ena reakcijama elektronskoga transporta na kompleksima I, III i IV koristi se za pokretanje sinteze ATP .
kompleks I
FMN
FeS
FADH2
2 e kompleks II
FeS Elektroni FADH2 ulaze u transportni lanac elektrona na niòj energijskoj razini gdje se prenose na CoQ.
CoQ
CoQ je mobilni nosa~ koji prenosi elektrone do citokroma b (cyt b) u kompleksu III
Elektroni se prenose na citokrom c (cyt c) i dalje na kompleks IV. kompleks III
Cyt b
FeS
Cyt c1
Cyt c Elektroni se napokon koriste za redukciju O2 u H2O. kompleks IV Cyt a3
Cyt a
2 H+
1/
O2 H2O
postupnom oksidativnom procesu od po dva ugljika. Nastaje acetil-CoA i acil-CoA skra}en za dva C-atoma. U svakom krugu oksidacije nastaje molekula NADH i molekula FADH2. Acetil-CoA ulazi zatim u ciklus limunske kiseline, a ostatak se masne kiseline nastavlja razgra|ivati na isti na~in. Razgradnja masne kiseline sa 16 ugljikovih atoma proizvodi sedam molekula NADH, sedam FADH2 i osam molekula acetil-CoA. Izrazi li se taj rezultat prinosom ATP dobivamo 21 molekulu ATP od NADH (3 7), 14 ATP , od FADH2 (2 7) i 96 od acetil-CoA. Budu}i da je jedan ATP potro{en za otpo~injanje procesa, neto-dobitak je 130 molekula ATP po molekuli masne kiseline sa 16 ugljikovih atoma. Usporedimo taj prinos s dobivenih 38 ATP po molekuli glukoze. Budu}i da je relativna molekularna masa zasi}ene
72
Poglavlje 2
CoASH A
O C
O
(CH2)14
CH3
Slika 2-36. Oksidacija masnih kiselina.

Prvo se masna kiselina (primjerice 16-C-atomna zasi}ena masna kiselina palmitat) veè na koenzim A uz utro{ak jedne molekule ATP Oksidacija masne kiseline zatim . te~e postupnim uklanjanjem po dvije C-atomne jedinice u obliku acetil-CoA uz istovremeno stvaranje po jedne molekule NADH i FADH2.
AMP
+
P Pi H2O O CoA S C (CH2)14 C16-acil CoA CH3 2 Pi
masne kiseline sa 16 ugljikovih atoma 256, a glukoze 180, dobivena koli~ina ATP je pribli`no 2,5 puta ve}a po gramu masne kiseline. Prema tome lipidi su bolje molekularno skladi{te energije od ugljikohidrata.
Fotosinteza
Stvaranje energije oksidacijom ugljikohidrata i lipida temelji se na razgradnji prethodno oblikovanih organskih spojeva. Potrebna energija za sintezu tih spojeva potje~e od Sun~eva svjetla. Biljke i fotosintetiziraju}e bakterije prikupljaju i koriste tu energiju za pokretanje sinteze ugljikohidrata. Pretvorbom Sun~eve energije u uporabivi oblik kemijske energije fotosinteza je izvor prakti~ki svekolike metaboli~ke energije u biolo{kim sustavima. Ukupna jednad`ba fotosinteze moè se prikazati kao svjetlo
FAD
FADH2
O CoA S C C H
H C (CH2)12 CH3
6 CO2 + 6 H2O
C6H12O6 + 6 O2
H2O
O CoA S C CH2
OH C H NAD + NADH (CH2)12 CH3
+ H+
O CoA S C CH2
O C (CH2)12 CH3
CoASH A
O CoA S C CH3 acetil CoA
+
O CoA S C (CH2)12 CH3
C14-acil CoA
Me|utim, taj je proces mnogo sloèniji, i odvija se u dvije odvojene faze. U prvoj fazi, nazvanoj reakcije svjetla, apsorbirana Sun~eva energija pokre}e sintezu ATP i NADPH (koenzim sli~an NADH) povezanu s oksidacijom H2O u O2. ATP i NADPH, nastali reakcijama svjetla, pokre}u sintezu ugljikohidrata od CO2 i H2O u drugom skupu reakcija, koje su nazvane reakcije tame, jer ne zahtijevaju Sun~evo svjetlo. U eukariotskim stanicama reakcije svjetla i reakcije tame odvijaju se u kloroplastima. Fotosintezni pigmenti hvataju Sun~evu energiju apsorpcijom fotona. Svjetlo apsorbirano tim pigmentima izaziva pokretanje elektrona iz normalne molekularne orbitale u orbitalu vi{e energije pretvaraju}i na taj na~in Sun~evu energiju u kemijsku energiju. U bilju su najobilniji fotosintezni pigmenti klorofili (slika 2-37) koji, osim zelenoga, zajedno apsorbiraju vidljivo svjetlo svih valnih duljina. Dodatni pigmenti apsorbiraju svjetlo drugih valnih duljina tako da se na~elno uhvati potpuni spektar vidljivog svjetla i iskoristi za fotosintezu. Energija uhva}ena apsorpcijom svjetla tro{i se na pretvorbu H2O u O2 (slika 2-38). Tim procesom proizvedeni elektroni visoke energije ulaze zatim u transportni lanac elektrona, gdje prijenosom preko niza nosa~a budu povezani sa sintezom ATP Osim toga elektroni visoke energije reduciraju . NADP+ u NADPH. U reakcijama tame ATP i NADPH (proizvedeni reakcijama svjetla) pokre}u sintezu ugljikohidrata od CO2 i H2O. Po jedna molekula CO2 ulazi u reakcijski ciklus poznat kao Calvinov ciklus (Melvin Calvin otkrio je taj ciklus), koji dovodi do stvaranja ugljikohidrata (slika 2-39). Calvinov ciklus utro{i ukupno 18 molekula ATP i 12 NADPH za sintezu svake molekule glukoze. Dva su elektrona potrebna za pretvorbu svake molekule NADP+ u NADPH, tako da 24 elektrona moraju pro}i transportnim lancem elektrona da stvore dovoljno NADPH za sintezu jedne molekule glukoze. Ti se elektroni dobivaju pretvorbom 12 molekula H2O u {est molekula O2 {to je u
Stani~na kemija
73
Slika 2-37. Struktura klorofila.

Klorofili se sastoje od struktura porfirinskoga prstena vezanih na ugljikovodi~ne lance. Klorofili a i b razlikuju se u jednoj funkcionalnoj skupini u porfirinskom prstenu.
CH2 CH C H3C H H3C C C C C C N C C C C N
CHO u klorofilu b CH3 u klorofilu a H C C N Mg N C C C C C O O CH3 C H CH3 C C
porfirinski prsten CH2 CH3
skladu sa stvaranjem {est molekula O2 uz svaku molekulu glukoze. Nije me|utim jasno dostaje li prolazak istih 24 elektrona niz transportni lanac elektrona za proizvodnju 18 ATP koje predvi|a Calvinov ciklus. Mo`da neke od molekula ATP nastanu alternativnim transportnim lancima koji koriste Sun~evu energiju za sintezu ATP bez sinteze NADPH (vidi 10. poglavlje).
C H C H H2C H
2
Biosinteza stani~nih sastojaka

Prethodni odlomak predo~io je pregled glavnih metaboli~kih reakcija putem kojih stanica dobavlja i pohranjuje energiju u obliku ATP Ta se metabo. li~ka energija zatim iskori{tava za obavljanje razli~itih zada}a uklju~uju}i i sintezu makromolekula i drugih stani~nih sastojaka. Energija, koja se dobiva razgradnjom organskih molekula (katabolizam), tro{i se za pokretanje sinteze drugih stanici potrebnih sastojaka. Ve}ina kataboli~kih putova uklju~uje oksidaciju organskih molekula povezanu sa stvaranjem energije (ATP) i reduktivnoga potencijala (NADH). Nasuprot tomu, biosintezni putevi naj~e{}e tro{e i ATP i reduktivni potencijal (obi~no u obliku NADPH) za proizvodnju novih organskih spojeva. Jedan od glavnih biosinteznih putova je sinteza ugljikohidrata od CO2 i H2O tijekom fotosinteznih reakcija u tami, o ~emu je raspravljano u prethodnom odlomku. O postoje}im alternativnim putevima koji dovode do biosinteze glavnih stani~nih sastojaka (ugljikohidrata, lipida, proteina i nukleinskih kiselina) raspravljat }emo u sljede}im odlomcima.
C O CH2 CH C
O CH3
CH3
CH2 CH2 CH2 HC CH3 ugljikovodi~ni rep
CH2 CH2 CH2 HC CH3
CH2 CH2 CH2 CH H3C CH3
H2O 2 e
1/
2 O2
+ 2 H+
transportni lanac elektrona
Slika 2-38. Reakcije svjetla u fotosintezi.

2
+
H+
Sun~eva se energija koristi da rastavi H2O u O2 i protone. Visokoenergijski elektroni iz tog procesa prenose se nizom nosa~a i koriste se za prevo|enje NADP+ u NADPH. Energija reakcija elektronskoga transporta pokre}e tako|er sintezu ATP . O pojedinostima ovih reakcija raspravljamo u 10. poglavlju.
74
Poglavlje 2
Slika 2-39. Calvinov ciklus.

Prikazana je sinteza molekule glukoze iz {est molekula CO2. Svaka molekula CO2 dodaje se ribuloza-1,5-bisfosfatu da nastanu dvije molekule 3-fosfoglicerata. Tih {est molekula CO2 dovode do stvaranja 12 molekula 3-fosfoglicerata koje se prevode u 12 molekula gliceraldehid-3-fosfata uz utro{ak po 12 molekula ATP i NADPH. Zatim se dvije molekule gliceraldehid3-fosfata koriste za sintezu jedne molekule glukoze, a deset molekula nastavljaju u Calvinovom ciklusu oblikovati {est molekula ribuloza-5-fosfata. Ciklus je dovr{en uporabom {est dodatnih molekula ATP za sintezu ribuloza-1,5-bisfosfata.
CO2
6 molekula
2
12 molekula P H C COO 12 P 12 ADP

2O
3-fosfoglicerat
ribuloza-1,5-bisfosfat
H H
2
6 6
ADP Calvinov ciklus H CH2OH 6 molekula ribuloza-1-fosfat H H C C C O OH OH 12 molekula

2O
CH O P C C O OP 12 12 NADP + Pi gliceraldehid-3-fosfat OH 1,3-bisfosfoglicerat
CH2O P
H 10 molekula O H
2 molekule
1 glukoza
Ugljikohidrati
Osim {to se glukoza dobavlja izravno iz hrane ili se stvara fotosintezom, mogu}e je sintetizirati glukozu iz drugih organskih molekula. Sinteza glukoze (glukoneogeneza) u animalnim stanicama obi~no po~inje laktatom (proizvedenim anaerobnom glikolizom), aminokiselinama (nastalim razgradnjom proteina) ili glicerolom (nastalim razgradnjom lipida). Biljke su tako|er sposobne (ìvotinje nisu) sintetizirati glukozu iz masnih kiselina, {to je posebice zna~ajno tijekom klijanja sjemenki, kad se energija pohranjena u obliku masti mora prevesti u ugljikohidrate nu`ne za rast biljke. U animalnim i biljnim stanicama jednostavni se {e}eri polimeriziraju i pohranjuju kao polisaharidi. Glukoneogeneza uklju~uje pretvorbu piruvata do glukoze na~elno obrnuti proces glikolize. Me|utim, kako je ve} prije bilo re~eno, glikoliti~ka pretvorba glukoze do piruvata put je koji stvara energiju proizvode}i dvije molekule ATP i NADH. Premda su neke reakcije glikolize povratne, preostale teku samo u smjeru razgradnje glukoze, jer su vezane uz golemo smanjenje slobodne energije. Tijekom glukoneogeneze, takve se energijski povoljne reakcije glikolize zaobilaze pomo}u drugih reakcija koje kataliziraju drugi enzimi, a koje uz utro{ak ATP i NADH teku u smjeru sinteze gluko-
Stani~na kemija
75
ze. Stvaranje glukoze iz dviju molekula piruvata zahtijeva ukupno ~etiri molekule ATP dvije molekule GTP i dvije molekule NADH. Taj je proces iz, razito skuplji nego povratni proces glikolize (koji bi zahtijevao dvije molekule ATP i dvije molekule NADH), {to pokazuje da je potrebna dodatna energija za pokretanje puta u smjeru biosinteze. Biljne i animalne stanice skladi{te glukozu u obliku polisaharida ({kroba odnosno glikogena). Sinteza polisaharida, kao i svih drugih makromolekula, energijski je zahtjevna reakcija. Ve} je ranije spomenuto da je vezu izme|u dvaju {e}era (glikozidna veza) mogu}e prikazati kao produkt reakcije dehidracije kojom se uklanja H2O (vidi sliku 2-3). Takva je reakcija me|utim, energijski nepovoljna pa ne moè spontano te}i u smjeru nastajanja glikozidne veze. Stoga se stvaranje glikozidne veze mora povezati s reakcijom koja osloba|a energiju, {to se postiè uporabom nukleotidnih {e}era kao intermedijara u sintezi polisaharida (slika 2-40). Glukoza se reakcijom koju pokre}e ATP prvo fosforilira u glukoza-6-fosfat koji zatim prelazi u glukoza-1-fosfat. Glukoza-1-fosfat reagira s UTP (uridin-trifosfat), pri ~emu nastane UDP-glukoza i pirofosfat, koji se hidrolizira u fosfat uz osloba|anje dodatne energije. UDP-glukoza je aktivirani intermedijar koji predaje svoj glukozni dio rastu}em lancu polisaharida u energijski povoljnoj reakciji. Na taj na~in kemijska energija u obliku ATP i UTP pokre}e sintezu polisaharida iz jednostavnih {e}era.
Lipidi
Lipidi su va`ne molekule za pohranu energije i glavni su sastojak stani~nih membrana. Sintetiziraju se iz acetil-CoA, koji nastaje razgradnjom ugljikohidrata u nizu reakcija koje su sli~ne obrnutoj oksidaciji masnih kiselina. Me|utim, kao i kod biosinteze ugljikohidrata, reakcije koje dovode do sinteze masnih kiselina razlikuju se od reakcija koje ih razgra|uju, a u smjeru biosinteze pokre}e ih popratni utro{ak energije u obliku ATP i reduktivnoga potencijala u obliku NADPH. Masne se kiseline sintetiziraju postupnim dodavanjem jedinica od po dva C-atoma na rastu}i lanac. Svaka od tih 2Catomnih jedinica, koje donosi acetil-CoA, tro{i jednu molekulu ATP i dvije molekule NADPH. Biosinteza masnih kiselina odvija se u citosolu. Njezin glavni produkt je palmitat, 16C-atomna masna kiselina. Osnovni sastojci stani~nih membrana (fosfolipidi, sfingomijelin i glikolipidi) sintetiziraju se iz masnih kiselina u endoplazmatskom retikulu i Golgijevu aparatu.
Proteini
Dok ugljikohidrati i lipidi sadràvaju samo ugljik, vodik i kisik, proteini (kao i nukleinske kiseline) sadràvaju osim tih elemenata i du{ik. U razli~itim organizmima (slika 2-41) razli~ito je podrijetlo du{ika koji se ugra|uje u organske spojeve. Neke bakterije rabe atmosferski du{ik. U procesu nazvanom fiksacija du{ika, N2 se reducira u NH3 uz utro{ak energije u obliku ATP @ive vrste sposobne za fiksaciju du{ika relativno su malobrojne, me|u. tim ve}ina bakterija, biljaka i gljiva moè koristiti nitrat (NO3), obi~ni sastojak tla, koji se reducira do NH3 putem elektrona koje daju NADH ili NADPH. Bez obzira na razlike svi su organizmi sposobni ugraditi NH3 u organske spojeve. U organske se molekule NH3 ugra|uje prije svega tijekom sinteze aminokiselina glutamata i glutamina iz a-ketoglutarata, intermedijara u ciklusu limunske kiseline. Te aminokiseline zatim sluè kao donori amino skupina tijekom sinteze drugih aminokiselina, koje se tako|er izvode iz intermedijara sredi{njih metaboli~kih puteva, glikolize i ciklusa limunske kiseline (slika
76
Poglavlje 2
Slika 2-40. Sinteza polisaharida.

Prvo se glukoza prevodi u aktivirani oblik, UDP-glukozu, uz utro{ak po jedne molekule ATP i UTP Zatim se energi. jski povoljnom reakcijom glukoza prenosi od UDP-glukoze na rastu}i lanac polisaharida.
glukoza
ADP glukoza-6- P
glukoza-1- P
CH2OH O OH HO OH UDP-glukoza O O P O O O P O CH2OH O OH HO OH CH2OH O UDP CH2OH O OH O OH OH O OH OH O O OH CH2OH O OH O CH2OH O O uridin H2O
P Pi
2 Pi
+
HO
OH
2-42). Sirovine za sintezu aminokiselina dobivaju se, dakle, iz glukoze, a sinteza aminokiselina tro{i energiju (ATP) i reduktivni potencijal (NADPH). Mnoge bakterije i biljke mogu sintetizirati svih 20 aminokiselina. Ljudi i drugi sisavci mogu, me|utim, sintetizirati samo oko polovinu potrebnih aminokiselina, a ostale moraju pribaviti prehranom (tabl. 2-2).
N2 atmosferski du{ik
bakterije koje fiksiraju du{ik
amonijak NH3
svi organizmi
organski spojevi
Slika 2-41. Asimilacija du{ika u organske spojeve.

Svi organizmi ugra|uju amonijak u organske spojeve. Neke su bakterije sposobne prevesti atmosferski du{ik u amonijak, a ve}ina bakterija, gljiva i biljaka moè koristiti nitrat iz tla.
bakterije gljive biljke NO3 nitrat (tlo)
Stani~na kemija
77
glukoza
Slika 2-42. Biosinteza aminokiselina.

His
glukoza-6-fosfat
Ugljikovi kosturi aminokiselina potje~u od intermedijara glikolize i ciklusa limunske kiseline.
Cys 3-fosfoglicerat Ser Gly fosfoenolpiruvat Tyr Phe Trp Ala Val Leu
piruvat
Asn
Asp
oksaloacetat
a-ketoglutarat
Glu
Gln
Met
Thr
Lys
Arg
Pro
Ile
Polimerizacija aminokiselina u proteine tako|er zahtijeva energiju. Sli~no sintezi polisaharida, stvaranje peptidne veze moè se smatrati reakcijom dehidracije koju }e u smjeru sinteze pokretati povezivanje s nekim drugim izvorom metaboli~ke energije. U biosintezi polisaharida takvo se povezivanje ostvaruje konverzijom {e}era u aktivirane intermedijare kao {to je UDP-glukoza. Aminokiseline treba tako|er aktivirati prije nego {to }e biti uporabljene za sintezu proteina. Klju~na razlika izme|u sinteze proteina i sinteze polisaharida jest ~injenica da se aminokiseline ugra|uju u proteine zadanim redoslijedom koji je odre|en genom. Slijed nukleotida u genu odre|uje slijed aminokiselina u proteinu putem translacije pri kojoj glasni~ka RNA (mRNA) sluì kao kalup za proteinsku sintezu (vidi 3. poglavlje). Svaka se aminokiselina najprije veè za specifi~nu molekulu RNA (tRNA) u reakciji koja je povezana s hidrolizom ATP (slika 2-43). Zatim se aminoacil-tRNA privije uz kalup mRNA koji je vezan na ribosomu i svaka se aminokiselina doda C-kraju rastu}ega polipeptidnog lanca nizom reakcija o kojima podrobno raspravljamo u 7. poglavlju. Tijekom toga procesa dodatno se hidroliziraju dvije molekule GTP tako da je ugradba svake aminokiseline u protein povezana s , hidrolizom jedne molekule ATP i dviju molekula GTP .
Tablica 2-2. Potrebe za aminokiselinama u ljudskoj prehrani

Esencijalne aminokiseline
histidin izoleucin leucin lizin metionin fenilalanin treonin triptofan valin
Neesencijalne aminokiseline
alanin arginina asparagin aspartat cistein glutamat glutamin glicin prolin serin tirozin
Nukleinske kiseline
Prete~e nukleinskih kiselina, nukleotidi, sastavljeni su od fosforiliranih 5Catomnih {e}era vezanih na baze nukleinskih kiselina. Nukleotidi se mogu
Esencijalne aminokiseline moraju se dobaviti iz hranidbenih izvora; humane stanice mogu sintetizirati neesencijalne aminokiseline. a Premda je arginin razvrstan u skupinu neesencijalnih aminokiselina, djeci u razvoju potreban je dodatni arginin iz hrane.
78
Poglavlje 2
sintetizirati iz ugljikohidrata i aminokiselina. Mogu}e ih je tako|er dobiti iz prehrambenih izvora ili ponovnim kori{tenjem nakon razgradnje nukleinskih kiselina. Polazi{te u biosintezi nukleotida jest fosforilirani {e}er, riboza5-fosfat, koji se dobiva iz glukoza-6-fosfata. Divergentni putevi vode zatim do sinteze purinskih i pirimidinskih nukleotida koji su izravni prete~e za sintezu RNA. Ribonukleotidi se prevode u deoksiribonukleotide koji su monomerne gradbene jedinice DNA. RNA i DNA su polimeri nukleozidnih monofosfata. Kao i za druge makromolekule, izravna polimerizacija nukleozidnih monofosfata energijski je nepovoljna, pa sinteza polinukleotida umjesto njih koristi nukleozidne
O C
O
R1 C H NH3
+
P Pi O aminoacil-AMP adenozin O P
O
2 Pi R1 C H O tRNA1 P
O
O O C
NH3
CH2 O
O aminoacil-tRNA1 tRNA1 O P
O
OH O CH2 O A
OH
3 kraj
+
O C H rastu}i peptidni lanac
1 H R1
AMP
OH O R1
C
+
NH3
N-kraj
C H
C O
tRNA1
2 2 GDP
Slika 2-43. Stvaranje peptidne veze.

Aminokiselina se prvo aktivira vezanjem na svoju tRNA u dvostupanjskoj reakciji koja uklju~uje hidrolizu ATP do AMP tRNA sluè kao adaptori za . nizanje aminokiselina prema kalupu mRNA koji je vezan na ribosomu.
R1 1 N-kraj N H O
R1 C H C O tRNA1
tRNA1
Stani~na kemija
79
Fenilketonurija
Bolest
Fenilketonurija (PKU) je uro|ena pogre{ka aminokiselinskog metabolizma s razornim u~incima. Poga|a pribli`no jedno od 10.000 novoro|en~adi. Ako se ne lije~i, izaziva te{ku mentalnu retardaciju. Na sre}u, razumijevanje naravi defekta koji uzrokuje fenilketonuriju omogu}uje ranu dijagnozu i u~inkovito lije~enje. klju~no je nagomilavanje abnormalnih metabolita fenilalanina. nati po povi{enoj razini fenilalanina u kr vi. Mogu}e je sprije~iti mentalnu retardaciju prehranom bolesne novoro|en~adi sinteti~kom dijetom koja je siroma{na fenilalaninom. Takav dijetalni postupak uklanja nagomilavanje toksi~nih fenilalaninskih metabolita i u~inkovito sprje~ava per manentnu mentalnu retardaciju do koje bi do{lo bez terapije. Stoga je rutinska analiza fenilalanina u kr vi test bitan za svu novoro|en~ad.
Nedostatak enzima ne stvara probleme dok je fetus u mater nici pa su djeca s fenilketonurijom pri ro|enju nor malna. Me|utim, ako se bolest ne lije~i, bolesna djeca postaju nepovratno i te{ko zaostala tijekom pr ve godine ìvota. Sretna je okolnost da se pri rutinskim testovima novoro|en~adi fenilketonurija moè odmah prepoz-

Fenilketonuriju uzrokuje nedostatak enzima fenilalanin-hidroksilaze, koji prevodi fenilalanin u tirozin. Taj nedostatak uzrokuje nagomilavanje fenilalanina do visokih razina, {to izaziva druge reakcije, primjerice, njegovu konverziju u fenilpiruvat. Fenilalanin, fenilpiruvat i drugi abnor malni metaboliti skupljaju se u kr vi i izlu~uju se u visokim koli~inama u urinu (naziv bolesti potje~e od visoke koncentracije fenilpiruvata, fenilketona koji se pojavljuje u urinu bolesne djece). Premda biokemijski uzrok mentalne retardacije nije precizno poznat, za njezinu pojavu
NH3+ fenilalanin-hidroksilaza NH3+ CH2 C H COO O CH2 Abnormalni metabolizam fenilalanina u pacijenata s fenilketonurijom. C COO HO CH2 tirozin C H COO
fenilalanin
fenilpiruvat (fenilketon)
trifosfate kao aktivirane prete~e (slika 2-44). Nukleozid-5'-trifosfat dodaje se 3'-hidroksilnoj skupini rastu}ega polinukleotidnoga lanca uz otpu{tanje i zatim hidrolizu pirofosfata, {to pokre}e reakciju u smjeru sinteze polinukleotida.
Stani~ne membrane
Struktura i funkcija stanica presudno ovisi o membranama koje ne odvajaju samo unutra{njost stanice od njezine okoline, nego tako|er odre|uju interne odjeljke eukariotskih stanica uklju~uju}i jezgru i citoplazmatske organele. Oblikovanje biolo{kih membrana temelji se na svojstvima lipida. Sve stani~ne membrane imaju zajedni~ku strukturnu organizaciju: dvosloj fosfolipida i pridruène proteine. Membranski proteini obavljaju mnoge specijalizirane zada}e. Neki sluè kao receptori koji omogu}uju stanici da odgovara na izvanjske signale, neki su odgovorni za selektivni transport molekula kroz membranu, a neki sudjeluju u transportu elektrona i oksidativnoj fosforilaciji. Osim toga, membranski proteini nadziru interakcije iz-
80
Poglavlje 2
rastu}i polinukleotidni lanac 5' kraj O O P O O CH2 O baza n1 n
me|u stanica u mnogostani~nim organizmima. Zajedni~ko strukturno ustrojstvo membrana podloga je razli~itim biolo{kim procesima i specijaliziranim membranskim funkcijama, o kojima }emo podrobno raspravljati u sljede}im poglavljima.
P P P
CH2
Membranski lipidi
Osnovne gradbene jedinice svih stani~nih membrana jesu fosfolipidi koji su amfipati~ne molekule, sastavljene od dvaju hidrofobnih masnokiselinOH OH OH OH 3' kraj skih lanaca vezanih na hidrofilnu ~eonu skupinu nukleozid-trifosfat koja sadràva fosfat (vidi sliku 2-7). Fosfolipidi spontano stvaraju dvosloje u vodenim otopinama zbog slabe topljivosti masnokiselinskih repova u 5' kraj vodi. Hidrofobni masnokiselinski repovi skriveni O su u unutra{njosti membrane, a njihove polarne O P O ~eone skupine izloène su dodiru s vodom na H2O O n1 objema stranama (slika 2-45). Takvi fosfolipidni CH2 O dvosloji stvaraju stabilnu pregradu izme|u dvaju 2 Pi + P Pi vodenih odjeljaka i oni su osnovna struktura svih biolo{kih membrana. U ve}ini stani~nih membrana lipidi ~ine pribliO OH `no 50% mase, ali taj postotak varira ovisno o tipu O P O membrane. Primjerice, stani~ne membrane sadràO n vaju pribli`no 50% lipida i 50% proteina. Unutra{nja CH2 O membrana mitohondrija ima pak neobi~no veliki udio proteina (oko 75%) {to je odraz obilja proteinskih kompleksa uklju~enih u transport elektrona i oksidativnu fosforilaciju. Tako|er je raznovrstan li3' kraj OH OH pidni sastav razli~itih stani~nih membrana (tablica 2-3). U E. coli membrane su izgra|ene preteìto od Slika 2-44. Sinteza polinukleotida. fosfatidiletanolamina koji ~ini 80% ukupnih lipida. Membrane sisavaca mnoNukleozid-trifosfati se veù na 3'-kraj go su sloènije i kao ~etiri glavna lipida sadràvaju fosfatidilkolin, fosfatidilserastu}ega polinukleotidnoga lanca uz rin, fosfatidiletanolamin i sfingomijelin. Ti lipidi ~ine 50 60% ukupnih memotpu{tanje pirofosfata. branskih lipida. Osim fosfolipida animalne stanice u membranama sadràvaju glikolipide i kolesterol, koji ~ine oko 40% ukupnih lipidnih molekula. Va`no svojstvo lipidnog dvosloja jest da djeluje kao dvodimenzionalna teku}ina u kojoj se pojedina~ne molekule (lipidi i proteini) slobodno okre}u i lateralno kre}u (slika 2-46). Klju~no svojstvo membrana jest fluidnost koja ovisi o temperaturi i lipidnom sastavu. Interakcije izme|u kratkolan~anih masnih kiselina slabije su od onih izme|u dugolan~anih masnih kiselina, pa su membrane koje sadràvaju kra}e masne kiseline manje krute, te ostaju fluidne i kod niìh temperatura. Lipidi koji sadràvaju nezasi}ene masne kiseline tako|er pove}avaju membransku fluidnost, jer prisutnost dvostrukih veza izaziva izlomljenost masnokiselinskih lanaca pa se oni teH2O è zbliùju u membranskoj strukturi. Zbog svoje ugljikovodi~ne prstenaste strukture (slika 2-9) molekula kolesterola ima zasebnu ulogu u odre|ivanju membranske fluidnosti. Molepolarna ~eona skupina kule kolesterola usa|uju svoje polarne hidroksilne skupine u dvosloj uz hidrofobni rep
Slika 2-45. Fosfolipidni dvosloj.

H2O
Fosfolipidi spontano oblikuju stabilne dvosloje tako da su njihove polarne ~eone skupine izloène vodi, a hidrofobni repovi usa|eni u unutra{njost membrane.
Stani~na kemija
81
Tablica 2-3. Lipidni sastav stani~nih membrana

Stani~na membrana Hrapavi endoplazmatski E. coli eritrocit retikul
0 0 80 0 0 0 17 6 16 17 2 45 55 3 16 3 0 6
Lipid
fosfatidilkolin fosfatidilserin fosfatidiletanolamin sfingomijelin glikolipidi kolesterol
Vanjska mitohondrijska membrana

50 2 23 5 0 <5
Slika 2-46. Pokretljivost fosfolipida u membrani.

Pojedina~ni fosfolipidi mogu se okretati i lateralno kretati unutar dvosloja.
Izvor podataka: P L. Yeagle, 1993. The Membranes of Cells, 2nd ed. San Diego, CA: Academic Press. . a Sastav membrana iskazan je molarnim postotcima glavnih lipidnih sastojaka.
hidrofilne ~eone skupine fosfolipida (slika 2-47). Kruti ugljikovodi~ni prsteni kolesterola stoga su u interakciji s masnokiselinskim lancima koji su privinuti uz fosfolipidne ~eone skupine. Takve interakcije smanjuju pokretljivost udaljenijega dijela masnokiselinskog lanca i stoga ukru}uju pripadnu membransku regiju. S druge strane, usa|eni kolesterol ometa interakcije me|u masnokiselinskim lancima {to odràva membransku fluidnost kod niìh temperatura.
Membranski proteini
Proteini su drugi vaàn sastojak stani~nih membrana i zauzimaju 25 do 75% mase razli~itih stani~nih membrana. Prihva}eni model membranske strukture, koji su predloìli Jonatan Singer i Garth Nicolson 1972. godine, predo~uje membrane kao teku}i mozaik, gdje su proteini usa|eni u lipidni dvosloj (slika 2-48). Dok fosfolipidi osiguravaju osnovnu strukturnu organizaciju membrana, membranski proteini obavljaju specifi~ne zada}e u razli~itim stani~nim membranama. Ovisno o na~inu na koji su udruèni u membranu ti su proteini razvrstani u dvije osnovne skupine. Integralni membranski proteini ukopani su izravno u lipidni dvosloj. Periferni membranski proteini nisu usa|eni u lipidni dvosloj nego su povezani s membranom posredno, naj~e{}e putem interakcija s integralnim membranskim proteinima. Ve}ina integralnih membranskih proteina (nazvanih transmembranskim proteinima) premo{}uju lipidni dvosloj i dijelom su izloèni okruènju na obje strane membrane. Proteinski dio koji premo{}uje membranu obi~no je izgra|en od 20 do 25 aminokiselina koje tvore -uzvojnicu. Hidrofobni bo~ni ogranci tih aminokiselina u interakciji su s masnokiselinskim lancima membranskih lipida, a oblikovanje -uzvojnice neutralizira polarni karakter peptidnih veza, {to je ve} prije spominjano pri smatanju proteina. Poznato je da lipidni dvosloj premo{}uje jo{ samo -ba~vasta struktura, koja nastaje smatanjem -plo~a u ba~vastu konformaciju. Takvi su transmembranski proteini opaèni u bakterijama, kloroplastima i mitohondrijima (slika 2-49). Sli~no fosfolipidima, membranski proteini su amfipati~ne molekule, i njihovi su hidrofilni dijelovi izloèni vodenom okruènju na obje strane membrane. Ima transmembranskih proteina koji premo{}uju membranu samo jednom, ali i onih koji imaju strukturnu regiju za vi{ekratno premo{}enje. Ve}ina transmembranskih proteina u eukariotskim membranama modificirana je dodatkom ugljikohidrata koji su izloèni na povr{ini stanice i ~esto sudjeluju u me|ustani~nim interakcijama.
fosfolipidna ~eona skupina
polarna hidroksilna skupina
kolesterol
masnokiselinski rep
Slika 2-47. Kolesterol umetnuti u membranu.

Kolesterol se usa|uje u membranu tako da svojom polarnom hidroksilnom skupinom bude blizu polarnih ~eonih skupina fosfolipida.
82
Poglavlje 2
izvan
ugljikohidrat
proteini
glikolipid
unutar transmembranska a-uzvojnica masna kiselina ili prenilna skupina lipidni dvosloj
integralni membranski protein
periferni membranski protein
Slika 2-48. Teku}i mozaik model membranske strukture.

Biolo{ke membrane sadràvaju proteine usa|ene u lipidni dvosloj. Integralni membranski proteini ugra|eni su u membranu obi~no putem regija auzvojnica koje se sastoje od 20 do 25 hidrofobnih aminokiselina. Neki transmembranski proteini jednokratno prolaze kroz membranu, drugi imaju vi{e transmembranskih regija. Uz to su neki proteini usidreni u membranu lipidima koji su kovalentno vezani na polipeptidni lanac. Takvi se proteini mogu usidriti na izvanstani~nu stranu membrana s pomo}u glikolipida, a na citosolnu stranu s pomo}u masnih kiselina ili prenilnih skupina (vidi strukture u 7. poglavlju). Periferni membranski proteini nisu usa|eni u membranu nego su povezani interakcijama s integralnim proteinima.
Proteini mogu tako|er biti usidreni u membrane s pomo}u lipida koji su kovalentno vezani na polipeptidni lanac (vidi 7. poglavlje). Specifi~ne lipidne modifikacije usidruju proteine na citosolne i izvanstani~ne strane membrane bilo dodatkom 14C-atomne aminokiseline (miristinske kiseline) na amino kraj, bilo dodatkom 16C-atomne masne kiseline (palmitinske kiseline) ili 15C-atomne odnosno 20C-atomne prenilne skupine na bo~ni ogranak cisteina. Na izvanstani~nu stranu membrane proteini se tako|er mogu usidriti dodatkom glikolipida na proteinskom C-kraju.
Transport kroz stani~ne membrane

Selektivna permeabilnost biolo{kih membrana za male molekule omogu}uje stanici da nadzire svoj unutra{nji sadràj. Samo male nenabijene molekule mogu slobodno difundirati kroz fosfolipidne dvosloje (slika 2-50). Male nepolarne molekule, kao {to su O2 i CO2, topljive su u lipidnom dvosloju i mogu nesmetano prolaziti kroz stani~ne membrane. Male nenabijene polarne molekule, kao {to je H2O, tako|er mogu difundirati kroz membrane, ali to ne mogu ve}e nenabijene polarne molekule, kao {to je glukoza. Nabijene molekule, tj. ioni, ne mogu difundirati kroz fosfolipidni dvosloj bez obzi-
Stani~na kemija ra na veli~inu; ~ak ni ioni H+ ne mogu prije}i lipidni dvosloj slobodnom difuzijom. Premda ioni i ve}ina polarnih molekula ne mogu prije}i lipidni dvosloj, mnoge takve molekule (kao glukoza) ipak prolaze kroz lipidni dvosloj. Takve molekule prolaze kroz membrane djelovanjem specifi~nih transmembranskih proteina koji djeluju kao nosa~i. Ti transportni proteini odre|uju selektivnu permeabilnost stani~nih membrana i stoga imaju klju~nu ulogu u membranskoj funkciji. Sadràvaju strukturne regije za vi{ekratno membransko premo{}enje kojim oblikuju prolaz kroz lipidni dvosloj dopu{taju}i da polarne ili nabijene molekule prije|u kroz membranu putem proteinske pore bez doticaja s hidrofobnim masnokiselinskim lancima membranskih fosfolipida. Postoje na~elno dvije vrste membranskih transportnih proteina (slika 251.), o ~emu podrobno raspravljamo u 12. poglavlju. Kanalni proteini oblikuju u membranama otvorene pore dopu{taju}i nesmetani prolazak svakoj molekuli odgovaraju}e veli~ine. Primjerice ionski kanali dopu{taju prolazak kroz membranu anorganskim ionima kao {to su Na+, K+, Ca2+ i Cl. Kad se otvore, kanalni proteini oblikuju male pore kroz koje mogu slobodnom difuzijom prolaziti ioni odgovaraju}e veli~ine i naboja. Pore oblikovane kanalnim proteinima nisu neprekidno otvorene. One se selektivno otvaraju ili zatvaraju odgovaraju}i na izvanstani~ne signale i na taj na~in omogu}uju stanici da nadzire kretanje iona kroz membranu. Takvi regulirani ionski kanali osobito su dobro prou~eni u ìv~anim i mi{i}nim stanicama, gdje posreduju u prijenosu elektrokemijskih signala. Suprotno kanalnim proteinima, proteinski nosa~i selektivno veù i prenose specifi~ne male molekule kao {to je glukoza. Da bi olak{ali prolazak specifi~nih molekula kroz membranu, proteinski nosa~i ne oblikuju otvorene kanale, nego djeluju kao enzimi. Proteinski nosa~i veù specifi~ne molekule, {to dovodi do konformacijskih promjena koje otvore kanale, da bi transportirana molekula pre{la membranu i bila otpu{tena na drugoj strani. Do sada smo opisali transport molekula kroz membrane putem kanala i proteinskih nosa~a u energijski povoljnom smjeru koji je odre|en koncen-
83
izvan
unutar
Slika 2-49. Struktura b-ba~ve.

Neki se transmembranski proteini ispruè kroz lipidni dvosloj kao -plo~e smotane u ba~vastu strukturu.
male nenabijene molekule
velike polarne molekule i ioni Ca2+
O2
CO2
2
H+
Na+
H2 glicerol etanol
glukoza aminokiseline (npr. alanin)
Cl
Slika 2-50. Propusnost fosfolipidnoga dvosloja.

Male nenabijene molekule mogu slobodno difundirati kroz fosfolipidni dvosloj. Dvosloj je, me|utim, nepropustan za ione i ve}e polarne molekule (kao {to su glukoza i aminokiseline).
84
(A)
Poglavlje 2
(B) kanalni protein proteinski nosa~
konformacijska promjena
Slika 2-51. Proteinski kanal i nosa~.

(A) Kanalni proteini oblikuju u membrani otvorene pore kroz koje mogu prolaziti molekule odgovaraju}ih dimenzija (npr. ioni). (B) Proteinski nosa~i selektivno veù male molekule predvi|ene za prijenos, da bi se zatim dogodila konformacijska promjena pri kojoj se molekula otpusti na drugoj strani membrane.
tracijskim i elektrokemijskim gradijentima. Taj se proces naziva pasivnim transportom. Me|utim proteinski nosa~i osiguravaju tako|er mehanizam kojim se promjene energije, koje prate transport molekula kroz membranu, mogu povezati s kori{tenjem ili osloba|anjem drugih oblika metaboli~ke energije, sli~no enzimskim reakcijama koje se mogu povezati s hidrolizom ili sintezom ATP Molekule se primjerice mogu transportirati kroz membra.
Energija oslobo|ena hidrolizom ATP koristi se za transport H+ usuprot elektrokemijskom gradijentu (od niè koncentracije H+). Vezanje H+ prati fosforilacija proteinskog nosa~a, koja izaziva konformacijsku promjenu {to pokre}e transport H+ protiv elektrokemijskoga gradijenta. Osloba|anje H+ i hidroliza vezane fosfatne skupine ponovno uspostavljaju po~etnu konformaciju nosa~a.
Slika 2-52. Model aktivnog transporta.
H+ niska koncentracija H+ ADP H+ P H2O P P
H+ visoka koncentracija H+
H+
H+
Stani~na kemija
85
nu u energijski nepovoljnom smjeru (primjerice, protiv koncentracijskoga gradijenta), ako se njihov prijenos u tom smjeru poveè s hidrolizom ATP kao izvorom energije. Takav se proces naziva aktivnim transportom (slika 2-52). Slobodna energija pohranjena u ATP moè se na taj na~in iskoristiti za nadzor unutra{njeg sastava stanice kao {to se iskori{tava za pokretanje biosinteze stani~nih sastojaka.
S A @ E TA K MOLEKULARNI SASTAV STANICA

Ugljikohidrati: Ugljikohidrati obuhva}aju jednostavne {e}ere i polisaharide. Polisaharidi sluè kao skladi{ni oblici {e}era, konstruktivni sastojci stanice i biljezi u procesima stani~noga prepoznavanja. Lipidi: Lipidi su osnovni sastojci stani~nih membrana, sluè za pohranu energije i kao signalne molekule. Fosfolipidi se sastoje od dvaju hidrofobnih masnokiselinskih lanaca vezanih na hidrofilnu ~eonu skupinu koja sadràva fosfat. Nukleinske kiseline: Nukleinske su kiseline glavne informacijske molekule u stanici. DNA i RNA su polimeri purinskih i pirimidinskih nukleotida. Vodikove veze izme|u komplementarnih parova baza omogu}uju usmjeravanje samoreplikacije nukleinskih kiselina.
KLJU^NI POJMOVI
ugljikohidrati, monosaharidi, glikozidna veza, oligosaharidi, polisaharidi, glikogen, {krob, celuloza lipid, masna kiselina, triacilglicerol, mast, fosfolipid, sfingomijelin, amfipati~an, glikolipid, kolesterol, steroidni hormon deoksiribonukleinska kiselina (DNA), ribonukleinska kiselina (RNA), glasni~ka RNA (mRNA), ribosomna RNA, transportna RNA (tRNA), nukleotid, purin, pirimidin, adenin, gvanin, citozin, timin, uracil, 2'-deoksiriboza, riboza, nukleozid, fosfodiesterska veza, oligonukleotid, polinukleotid protein, aminokiselina, peptidna veza, polipeptid, kristalografija difrakcijom X-zraka, primarna struktura, sekundarna struktura, a-uzvojnica, b-nabrana plo~a, tercijarna struktura, domena, kvarterna struktura
Proteini: Proteini su polimeri 20 razli~itih aminokiselina od kojih svaka ima razli~iti bo~ni ogranak specifi~nih kemijskih svojstava. Svaki protein ima jedincati aminokiselinski slijed koji odre|uje njegovu trodimenzionalnu strukturu. U ve}ini proteina smata se kombinacija a-uzvojnica i b-nabranih plo~a u globularne domene s hidrofobnim aminokiselinama u unutra{njosti, a s hidrofilnim aminokiselinama na povr{ini.
SREDI[NJA ULOGA ENZIMA KAO BIOLO[KIH KATALIZATORA

Kataliti~ka aktivnost enzima: Enzimi kataliziraju gotovo sve kemijske reakcije u stanici. Mehanizmi enzimske katalize: Enzimi ubrzavaju reakcije vezanjem supstrata u odgovoraju}em poloàju, mijenjaju}i konformaciju supstrata radi postizanja prijelaznoga stanja i izravno sudjeluju}i u kemijskim reakcijama. Koenzimi: Koenzimi djeluju u svezi s enzimima prenose}i kemijske skupine izme|u supstrata. Regulacija enzimske aktivnosti: Aktivnosti enzima reguliraju se u skladu s fiziolo{kim potrebama stanice. Enzimska se aktivnost moè nadzirati vezanjem malih molekula, interakcijom s drugim proteinima i kovalentnim modifikacijama.
enzim, supstrat, produkt, prijelazno stanje, energija aktivacije, aktivno sredi{te model klju~-brava, inducirana prilagodba
prosteti~ka skupina, koenzim, nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) inhibicija povratnom spregom, alosteri~ka regulacija, fosforilacija
86
Poglavlje 2
METABOLI^KA ENERGIJA
Gibbsova slobodna energija (G), adenozin-5'-trifosfat (ATP, visokoenergijska veza glikoliza, koenzim A (CoA), ciklus limunske kiseline, Krebsov ciklus, flavin-adenin-dinukleotid (FADH2), oksidativna fosforilacija, transportni lanac elektrona
Slobodna energija i ATP: ATP sluì kao uskladi{tena slobodna energija koja se koristi za pokretanje energijski zahtjevnih reakcija u stanici. Stvaranje ATP iz glukoze: Razgradnja glukoze glavni je izvor stani~ne energije. U aerobnim stanicama potpuna oksidacija glukoze proizvodi 36 do 38 molekula ATP Ve}ina tog ATP dobiva se transportnim lancem . elektrona koji reduciraju O2 u H2O. Dobava energije iz drugih organskih molekula: Mogu}e je proizvesti ATP razgradnjom organskih molekula druga~ijih od glukoze. Budu}i da su masti reduciranije od ugljikohidrata, one su u~inkovitiji oblik skladi{tenja energije.
reakcije svjetla, reakcije tame, fotosintezni pigmenti, klorofil, Calvinov ciklus
Fotosinteza: Krajnji izvor energije potrebne za sintezu organskih molekula Sun~evo je svjetlo koje iskori{tavaju biljke i fotosintetiziraju}e bakterije. U prvoj fazi fotosinteze Sun~eva se energija koristi za pokretanje sinteze ATP i NADPH uz oksidaciju H2O u O2. Na taj na~in proizvedeni ATP i NADPH koristi se zatim za sintezu glukoze iz CO2 i H2O.
BIOSINTEZA STANI^NIH SASTOJAKA

glukoneogeneza
Ugljikohidrati: Glukozu je mogu}e sintetizirati iz drugih organskih molekula uporabom energije i reduktivnog potencijala u obliku ATP i NADH. Dodatni ATP je zatim potreban za pokretanje sinteze polisaharida iz jednostavnih {e}era. Lipidi: Lipidi se sintetiziraju iz acetil-CoA koji nastaje razgradnjom ugljikohidrata.
fiksacija du{ika
Proteini: Aminokiseline se sintetiziraju iz intermedijara glikolize i ciklusa limunske kiseline. Polimerizacija u proteine zahtijeva dodatnu energiju u obliku ATP i GTP . Nukleinske kiseline: Purinski i pirimidinski nukleotidi sintetiziraju se iz ugljikohidrata i aminokiselina. Njihovu polimerizaciju u DNA i RNA pokre}u nukleozidni trifosfati koji sluè kao aktivirani prete~e.
STANI^NE MEMBRANE
fosfolipidni dvosloj
Membranski lipidi: Osnovnu strukturu svih stani~nih membrana ~ini lipidni dvosloj. Membrane animalnih stanica sadràvaju tako|er glikolipide i kolesterol. Membranski proteini: Proteini mogu biti usidreni u lipidni dvosloj ili se posredno povezuju putem interakcija protein-protein. Neki proteini premo{}uju lipidni dvosloj, drugi su usidreni s jedne strane membrane. Transport kroz stani~ne membrane: Lipidni su dvosloji propusni samo za male nenabijene molekule. Ioni i ve}ina polarnih molekula prenose se kroz membrane specifi~nim transportnim proteinima, ~ije djelovanje moè biti povezano s hidrolizom ili sintezom ATP .
teku}i mozaik, integralni membranski protein, periferni membranski protein, transmembranski protein, b-ba~va kanalni protein, proteinski nosa~, pasivni transport, aktivni transport
Stani~na kemija
87
Pitanja
1. Koja svojstva ~ine vodu idealnom da bude najobilnija molekula u stanici? 2. Obrazloì razliku izme|u oligosaharida i polisaharida. 3. [to razlikuje glikogen i celulozu? 4. Po ~emu se masne kiseline razlikuju od masti? 5. [to su osnovne uloge masti i fosfolipida u stanicama? 6. Koje su va`ne stani~ne zada}e nukleotida osim {to sluè kao gradbene jedinice u sintezi nukleinskih kiselina? 7. Nabroji deset nepolar nih aminokiselina i opi{i kamo se nastoje smjestiti u tipi~nom monomer nom enzimu topljivom u vodi. 8. Vezni dèp tripsina sadràva aspartat. Pretpostavi kako }e zamjena te aminokiseline lizinom utjecati na enzimsku aktivnost. B+C za koju 9. Promatraj reakciju A je DG = +14,6 kJ/mol. Izra~unaj DG u stani~nim uvjetima pri kojima je koncentracija A 102 M, a pojedina~ne koncentracije B i C su 103 M. U kojem }e smjeru te}i reakcija u stanici? (R = 8,28 103 kJ/mol/stupanj; T = 298 K (25 C); ln(x) = 2,3 log 10(x)) 10. Koje su reakcije svjetla i reakcije tame u fotosintezi? 11. Premda su proteinski nosa~i i kanalni proteini sli~ni po mnogo ~emu, primjerice po specifi~nosti i zasi}enju kod visokih koncentracija transportirane molekule, objasni za{to su proteinski nosa~i mnogo sporiji od kanalnih proteina? 12. Za{to su regije transmembranskih proteina koje premo{}uju membranu u obliku a-uzvojnica?
Literatura
Op}enita literatura
Berg, J. M., J. L. Tymoczko and L. Stryer. 2002. Biochemistry. 5th ed. New York: W. H. Freeman. Mathews, C. K., K. E. van Holde and K. G. Ahern. 2000. Biochemistry. 3rd ed. Redwood City, CA: Benjamin Cummings. peptide chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 37: 205211. I Richardson, J. S. 1981. The anatomy and taxonomy of protein structure. Adv. Protein Chem. 34: 167339. P Sanger, F. 1988. Sequences, sequences, and sequences. Ann. Rev. Biochem. 57: 128. P Tanford, C. 1978. The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science 200: 10121018. P Neurath, H. 1984. Evolution of proteolytic enzymes. Science 224: 350357. P Schramm, V. L. 1998. Enzymatic transition states and transition state analog design. Ann. Rev. Biochem. 67: 693720. P
Metaboli~ka energija
Beinert, H., R. H. Holm and E. Munck. 1997. Iron-sulfur clusters: Natures modular, multipurpose structures. Science 277: 653659. P Bennett, J. 1979. The protein that harvests sunlight. Trends Biochem. Sci. 4: 268271. P Calvin, M. 1962. The path of carbon in photosynthesis. Science 135: 879889. P Deisenhofer, J. and H. Michel. 1991. Structures of bacterial photosynthetic reaction centers. Ann. Rev. Cell Biol. 7: 123. P Krebs, H. A. 1970. The history of the tricarboxylic cycle. Perspect. Biol. Med. 14: 154 170. P Kuhlbrandt, W., D. N. Wang and Y. Fujiyoshi. 1994. Atomic model of plant light-harvesting complex by electron crystallography. Nature 367: 614621. I Nicholls, D. G. and S. J. Ferguson. 2002. Bioenergetics. 3rd ed. London: Academic Press. Saraste, M. 1999. Oxidative phosphorylation at the fin de siecle. Science 283: 14881493. P
Molekularni sastav stanica

Anfinsen, C. B. 1973. Principles that govern the folding of protein chains. Science 181: 223230. I Branden, C. and J. Tooze. 1999. Introduction to Protein Structure. 2nd ed. New York: Garland. Chothia, C. and A. V. Finkelstein. 1990. The classification and origins of protein folding patterns. Ann. Rev. Biochem. 59: 10071039. P Holm, L. and C. Sander. 1996. Mapping the protein universe. Science 273: 595602. P Kendrew, J. C. 1961. The three-dimensional structure of a protein molecule. Sci. Am. 205(6): 96111. P Levitt, M., M. Gerstein, E. Huang, S. Subbiah and J. Tsai. 1997. Protein folding: The endgame. Ann. Rev. Biochem. 66: 549 579. P Pauling, L., R. B. Corey, and H. R. Branson. 1951. The structure of proteins: Two hydrogen bonded configurations of the poly-
Sredi{nja uloga enzima kao biolo{kih katalizatora

Koshland, D. E. 1984. Control of enzyme activity and metabolic pathways. Trends Biochem. Sci. 9: 155159. P Lienhard, G. E. 1973. Enzymatic catalysis and transition-state theory. Science 180: 149154. P Lipscomb, W. N. 1983. Structure and catalysis of enzymes. Ann. Rev. Biochem. 52: 1734. P Monod, J., J.-P Changeux and F. Jacob. 1963. . Allosteric proteins and cellular control systems. J. Mol. Biol. 6: 306329. I Narlikar, G. J. and D. Herschlag. 1997. Mechanistic aspects of enzymatic catalysis: Lessons from comparison of RNA and protein enzymes. Ann. Rev. Biochem. 66: 1959. P
88
Poglavlje 2
Biosinteza stani~nih sastojaka

Hers, H. G. and L. Hue. 1983. Gluconeogenesis and related aspects of glycolysis. Ann. Rev. Biochem. 52: 617653. P Jones, M. E. 1980. Pyrimidine nucleotide biosynthesis in animals: Genes, enzymes, and regulation of UMP biosynthesis. Ann. Rev. Biochem. 49: 253279. P Kornberg, A. and T. A. Baker. 1991. DNA Replication. 2nd ed. New York: W. H. Freeman. Tolbert, N. E. 1981. Metabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes. Ann. Rev. Biochem. 50: 133157. P Umbarger, H. E. 1978. Amino acid biosynthesis and its regulation. Ann. Rev. Biochem. 47: 533606. P Van den Bosch, H., R. B. H. Schutgens, R. J. A. Wanders and J. M. Tager. 1992. Biochemistry of peroxisomes. Ann. Rev. Biochem. 61: 157197. P Wakil, S. J., J. K. Stoops and V. C. Joshi. 1983. Fatty acid synthesis and its regulation. Ann. Rev. Biochem. 52: 537579. P
Stani~ne membrane
Bretscher, M. 1985. The molecules of the cell membrane. Sci. Am. 253(4): 100108. P Dowham, W. 1997. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: Why are there so many lipids? Ann. Rev. Biochem. 66: 199212. P Englund, P T. 1993. The structure and bio. synthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Ann. Rev. Biochem. 62: 121138. P Farazi, T. A., G. Waksman and J. I. Gordon. 2001. The biology and enzymology of protein N-myristoylation. Ann. Rev. Biochem. 276: 3950139504. P Petty, H. R. 1993. Molecular Biology of Membranes: Structure and Function. New York: Plenum Press. Singer, S. J. 1990. The structure and insertion of integral proteins in membranes. Ann. Rev. Cell Biol. 6: 247296. P
Singer, S. J. and G. L. Nicolson. 1972. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175: 720731. I Tamm, L. K., A. Arora and J. H. Kleinschmidt. 2001. Structure and assembly of -barrel membrane proteins. J. Biol. Chem. 276: 3239932402. P Towler, D. A., J. I. Gordon, S. P Adams and L. . Glaser. 1988. The biology and enzymology of eukaryotic protein acylation. Ann. Rev. Biochem. 57: 6999. P White, S. H., A. S. Ladokhin, S. Jayasinghe and K. Hristova. 2001. How membranes shape protein structure. J. Biol. Chem. 276: 32395 32398. P Yeagle, P L. 1993. The Membranes of Cells. 2nd . ed. San Diego, CA: Academic Press. Zhang, F. L. and P J. Casey. 1996. Protein pre. nylation: Molecular mechanisms and functional consequences. Ann. Rev. Biochem. 65: 241269. P
Poglavlje
Osnove molekularne biologije
Naslje|ivanje, geni i DNA 89 Ekspresija geneti~ke informacije 96 Rekombinantna DNA 104 Detekcija nukleinskih kiselina i proteina 117 Funkcija eukariotskih gena 123
KLJU^NI POKUS: Pretpostavka
DNA provirusa 102
MOLEKULARNA MEDICINA: HIV
i AIDS 105
teì razumjeti mehanizme odgovorne za naslje|ivanje i ekspresiju geneti~ke informacije koja odre|uje strukturu i funkciju stanice. Kao {to je prikazano u prvom poglavlju, sve stanice dijele odre|ena osnovna svojstva, a to temeljno jedinstvo stani~ne biologije posebice je vidljivo na molekularnoj razini. Postojanje temeljnoga stani~nog jedinstva omogu}ilo je znanstvenicima da izaberu jednostavnije organizme, primjerice bakterije, kao model za provo|enje mnogih fundamentalnih eksperimenata u o~ekivanju da }e molekularni mehanizmi i u organizmima me|usobno razli~itim poput ~ovjeka i E. coli biti sli~ni. Brojni eksperimenti potvrdili su to~nost te pretpostavke i danas je jasno da je molekularna biologija stanice jedinstveni put razumijevanja raznolikih oblika stani~noga pona{anja. Po~etni napredak u molekularnoj biologiji postignut je kori{tenjem prednosti brzog rasta i jednostavne genetike bakterija poput E. coli i njezinih virusa. Razvoj rekombinantne DNA tehnologije, koji je uslijedio, omogu}io je da se osnovni principi i eksperimentalni pristupi razvijeni u prokariotima pro{ire i na eukariotske stanice. Posljedice razvoja rekombinantne DNA tehnologije su goleme. U ranim je fazama rekombinantna DNA tehnologija omogu}ila izolaciju i karakterizaciju pojedinih gena, a od nedavno i odre|ivanje cjelokupnih redoslijeda nukleotida u genomima sloènih organizma poput biljaka i ìvotinja, uklju~uju}i i ~ovjeka.
UVREMENA MOLEKULARNA BIOLOGIJA
Naslje|ivanje, geni i DNA

Mogu}nost reprodukcije temeljno je svojstvo svih ìvih bi}a. Svi organizmi geneti~ku informaciju, koja odre|uje njihovu strukturu i funkciju, naslje|uju od svojih roditelja. Isto tako, sve stanice nastaju iz prethodno postoje}ih stanica, i nu`no je da se geneti~ki materijal umnoì i podijeli pri svakoj podjeli stanice. Na~in na koji se geneti~ka informacija udvostru~uje i prenosi sa stanice na stanicu, ili s organizma na organizam, sredi{nje je pitanje biologije. Prepoznavanje molekule DNA kao nositelja geneti~ke informacije i otkrivanje mehanizama njezina prijenosa stvorilo je temelj na{em dana{njem razumijevanju biologije na molekularnoj razini.
90
Poglavlje 3
Slika 3-1 Naslje|ivanje dominantnih i recesivnih gena.
roditeljski sojevi
YY
yy
Svaki roditeljski soj gra{ka sadràva po dvije kopije (alela) gena koji odre|uje boju sjemenke (npr. ùta (Y) ili zelena (y) boja sjemenke). Roditelji stvaraju spolne stanice (gamete) od kojih svaka sadràva po jednu kopiju gena (ili po jedan alel odre|enoga gena). Dvije se gamete spajaju u novi organizam koji ~ini hibridno F1 potomstvo. Budu}i da je Y dominantan alel, sve F1 biljke imat }e ùte sjemenke.
gamete
F1 generacija
Yy
gamete Y Yy F2 generacija
y yy
y Y Yy Kriànjem dviju biljaka F1 generacije nastaje F2 generacija s karakteristi~nim 3 : 1 omjerom dominantnoga (ùto) i recesivnoga (zeleno) fenotipa.
YY
Geni i kromosomi
Temeljne principe genetike postavio je Gregor Mendel 1865. godine na osnovi pokusa kriànja gra{ka. Ispitivanjem naslje|ivanja nekoliko dobro definiranih svojstava kao {to je primjerice boja sjemenke, Mendel je uspio razumjeti osnovne principe njihova prijenosa. Pretpostavio je da je svako svojstvo odre|eno parom nasljednih elemenata koje danas zovemo genima, i na taj je na~in uspio objasniti sve rezultate dobivene kriànjem. Po jedna kopija gena za svako svojstvo (nazivamo je alel) naslje|uje se od svakog roditelja. Primjerice, kriànje dviju sorti gra{ka, jedne sa ùtim, a druge sa zelenim sjemenkama, daje potomstvo prikazano na slici 3-1. Svaka roditeljska sorta ima po dvije identi~ne kopije gena koji odre|uje ùtu (Y engl. yellow) ili zelenu (y) boju sjemenke. Biljke nastale kriànjem su hibridi koji su naslijedili po jednu kopiju gena koji odre|uje ùtu (Y) i jednu kopiju gena koji odre|uje zelenu (y) boju sjemenke. Sve biljke potomci prikazanoga kriànja (prva filijalna ili F1 generacija) imaju ùte sjemenke, stoga kaèmo da je gen koji odre|uje ùtu boju sjemenki (Y) dominantan, a gen koji odre|uje zelenu boju sjemenki (y) recesivan. Genotip (geneti~ki usroj) biljaka F1 generacije je stoga Yy, a njihov fenotip (fizi~ki izgled) je ùta boja sjemenki. Kriàmo li me|usobno dva potomka F1 generacije dobivamo F2 generaciju u kojoj se aleli za ùtu i zelenu boju sjemenke razdvajaju (segregiraju) tako da je omjer biljaka F2 generacije sa ùtim i zelenim sjemenkama 3 : 1. Mendelovo otkri}e, koje je o~ito bilo ispred svog vremena, uglavnom je zapostavljano do 1900. godine kad su Mendelovi zakoni naslje|ivanja ponovo otkriveni te je kona~no spoznata njihova va`nost. Ubrzo nakon toga predloèno je da su kromosomi nositelji gena. Uo~eno je da je ve}ina stanica vi{ih biljaka i ìvotinja diploidna, tj. da ima po dvije kopije svakoga kromosoma. Iznimka su spolne stanice (spermiji i jajne stanice) koje nastaju posebnim tipom diobe koji nazivamo mejoza, a u kojoj se samo po jedan ~lan kromosomskoga para prenosi na svaku novonastalu stanicu (slika 3-2).
91
mu{ki roditelj
ènski roditelj
Slika 3-2. Kromosomi u mejozi i oplodnja.

Diploidna stanica sadràva po dvije kopije svakoga kromosoma (homologni kromosomi jednoga kromosomskoga para)
Prikazana su dva para kromosoma hipoteti~kog organizma.
diploidan
mejoza spermij oplodnja haploidan jajna stanica
Mejozom nastaju haploidne gamete koje imaju samo po jedan kromosom svakoga para.
embrio
Oplodnjom nastaje diploidni embrio koji ima kromosome obaju roditelja (po dva kromosoma svakoga para).
diploidan
Posljedi~no, spermiji i jajne stanice su haploidne i imaju samo po jednu kopiju svakog kromosoma. Sjedinjenje dviju takvih haploidnih stanica pri oplodnji stvara novi diploidni organizam u kojem jedan kromosom svakoga para potje~e od mu{koga, a drugi od ènskoga roditelja. Pona{anje parova kromosoma tijekom mejoze stoga oslikava pona{anje alela tijekom segregacije, {to je rezultiralo pretpostavkom da su kromosomi nositelji gena. Osnove mutacija, povezanosti gena, i odnosa izme|u gena i kromosoma velikim su dijelom razja{njene i pokusima provedenim na vinskoj mu{ici, Drosophila melanogaster. Vinsku je mu{icu mogu}e jednostavno uzgajati u laboratorijskim uvjetima na odgovaraju}im podlogama, a razmnoàva se pribli`no svaka dva tjedna {to je zna~ajna prednost za geneti~ka ispitivanja. Zbog tih je svojstava Drosophila i dalje vrlo popularan organizam za geneti~ka ispitivanja na ìvotinjama, posebice u podru~ju genetike razvoja i diferencijacije. Po~etkom 20. stolje}a otkriven je velik broj geneti~kih promjena (mutacija) kod vinske mu{ice koje su uglavnom poga|ale lako uo~ljiva svojstva poput boje o~iju i oblika krila. Pokusi kriànja pokazali su da se neki od gena koji odre|uju ta svojstva naslje|uju neovisno jedan o drugom {to je upu}ivalo na to da se nalaze na razli~itim kromosomima koji se neovisno razdvajaju tijekom mejoze (slika 3-3). U isto vrijeme, neki su se drugi geni ~esto naslje|ivali zajedno. U tom slu~aju govorimo o vezanim genima, a povezuje ih smje{taj na istom kromosomu. Broj skupina vezanih gena jednak je broju kromosoma nekog organizma (~etiri kod vinske mu{ice) {to je dodatno podràlo pretpostavku da su kromosomi nositelji gena. Do 1915. godine gotovo je stotinu gena identificirano i kartirano na ~etiri kromosoma vinske mu{ice {to je dovelo do op}eg prihva}anja kromosoma kao nositelja naslje|ivanja.
Geni i enzimi
Rana geneti~ka istraìvanja bila su usmjerena na identifikaciju i kartiranje gena koji odre|uju lako uo~ljiva svojstva poput boje o~iju vinske mu{ice, no na~in na koji ti geni odre|uju fenotip nije bio poznat. Prve spoznaje o
92
Poglavlje 3
(A) Razdvajanje dvaju hipoteti~kih gena smje{tena na dvama razli~itim kromosomima (A/a = ~etvrtast/okrugao i B/b = crveno/plavo)
(B) Vezanost dvaju gena smje{tenih na istom kromosomu
roditeljski soj
A
B a
roditeljski soj
gamete
B A b a
gamete
A a
F1 generacija
A
B a
Budu}i da se kromosomi neovisno razdvajaju tijekom mejoze, F1 generacija stvara ~etiri razli~ita tipa gameta.
F1 generacija
A a
Budu}i da se oba gena nalaze na istom kromosomu, tijekom mejoze ne dolazi do njihova me|usobnog razdvajanja, ve} oni zajedno odlaze u istu gametu s kromosomom koji ih nosi pa F1 generacija stvara samo dva razli~ita tipa gameta.
gamete ab aB Ab AB Aa Bb Aa BB AA Bb AA BB Aa bb Aa Bb AA bb AA Bb aa Bb aa BB Aa Bb Aa BB Stoga F2 generacija dolazi fenotipa: ~etvrtast crveni, ~etvrtast plavi, okrugli crveni i okrugli plavi, u omjeru 9 : 3 : 3 : 1. aa bb aa Bb Aa bb Aa Bb ab aB Ab AB AB Aa Bb ab
gamete ab aa bb Aa Bb AA BB F2 generacija AB
Stoga F2 generacija dolazi u samo dva fenotipa: ~etvrtasti crveni i okrugli plavi, u omjeru 3 : 1 koji je svojstven naslje|ivanju samo jednoga gena.
F2 generacija
Slika 3-3. Razdvajanje (segregacija) i vezanost gena.

(A) Razdvajanje dvaju hipoteti~kih gena za oblik (A/a = ~etvrtast/okrugao) i boju (B/b = crveno/plavo) smje{tenih na razli~itim kromosomima. (B) Naslje|ivanje gena smje{tenih na istom kromosomu (vezani geni).
vezi izme|u gena i enzima pojavile su se 1909. godine, kad je uo~eno da je nasljedna bolest fenilketonurija (vidi: Molekularna medicina u 2. poglavlju) posljedica geneti~koga poreme}aja u metabolizmu aminokiseline fenilalanina. Pretpostavljeno je da je taj poreme}aj posljedica nedostatka enzima koji katalizira odgovaraju}e metaboli~ke reakcije, {to je potaklo formuliranje generalne hipoteze da geni odre|uju sintezu enzima. Jasniji dokaz povezanosti gena sa sintezom enzima proizi{ao je iz eksperimenta koji su 1941. godine na gljivici Neurospora crassa proveli George Beadle i Edvard Tatum. U laboratoriju Neurospora moè biti uzgajana na mi-
93
nimalnom ili bogatom mediju sli~nim onima opisanim u 1. poglavlju za uzgoj E. coli. Za gljivicu Neurospora crassa minimalni se medij sastoji samo od soli, glukoze i biotina. Bogati medij oboga}en je aminokiselinama, vitaminima, purinima i pirimidinima. Beadle i Tatum izolirali su mutante ove gljivice koje normalno rastu na bogatom mediju, no ne mogu rasti na minimalnom mediju. Otkrili su da je svakoj mutanti za rast potreban specifi~an prehrambeni nadomjestak, primjerice odre|ena aminokiselina. [tovi{e, potreba za odre|enim prehrambenim nadomjestkom bila je u korelaciji s nemogu}no{}u sinteze te iste molekule. Na osnovi ovih promatranja Beadle i Tatum su zaklju~ili da svaka mutacija rezultira nedostatkom odre|enoga metaboli~koga puta. Kako je bilo poznato da metaboli~kim putovima upravljaju enzimi, iz eksperimenata na gljivici Neurospora crassa proizi{ao je zaklju~ak da svaki gen odre|uje strukturu jednog enzima, tj. hipoteza jedan gen jedan enzim. Danas znamo da se mnogi enzimi sastoje od vi{e polipeptida, pa je trenutno prihva}en oblik ove hipoteze da svaki gen odre|uje strukturu jednoga polipeptidnog lanca.
Molekula DNA nositelj je geneti~ke informacije

Razumijevanje kromosomske osnove naslje|ivanja i odnosa izme|u gena i enzima nije samo po sebi pruìlo molekularno obja{njenje gena. Kromosomi sadràvaju i proteine i DNA, i prvotno se mislilo da su geni proteini. Prvi dokazi koji su vodili prema suprotnoj ideji da je molekula DNA nositelj geneti~ke informacije do{li su iz eksperimenata provedenih na bakterijama. Ti eksperimenti predstavljaju prototip suvremenog pristupa odre|ivanju uloge gena uno{enjem novih molekula DNA u stanicu, {to }e biti obja{njeno kasnije u ovom poglavlju. Uloga molekule DNA otkrivena je iz rezultata eksperimenata provedenih na bakteriji koja uzrokuje upalu plu}a (Pneumococcus). Virulentni sojevi ove bakterije okruèni su kapsulom izgra|enom od polisaharida koja {titi bakterije od napada imunosustava doma}ina. Budu}i da kapsula bakterijskim kolonijama daje glatki izgled u kulturi, soj bakterija koji proizvodi kapsulu ozna~ujemo sa S (engl. smooth). Mutirani sojevi koji su izgubili sposobnost stvaranja kapsule (ozna~eni sa R, engl. rough) tvore kolonije s hrapavim rubom te nisu letalni ako njima zarazimo mi{a. Godine 1928. uo~eno je da mi{ inficiran smjesom ìvu}ih hrapavih (R) bakterija i toplinom ubijenih glatkih (S) bakterija razvija upalu plu}a i ubrzo umire. Bakterije koje su zatim izolirane iz takvog mi{a bile su tipa S. Kasniji su eksperimenti pokazali da su ekstrakti bakterijskih kultura tipa S u kojima nije bilo ~itavih bakterijskih stanica tako|er u stanju prevesti (transformirati) bakterije tipa R u oblik S. Zaklju~eno je da je neka tvar u ekstraktu bakterija tipa S (nazvana transformiraju}i princip) odgovorna za geneti~ku transformaciju R oblika u S oblik bakterije. Godine 1944. Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarty izolirali su DNA iz bakterijskih ekstrakata i pokazali da enzimi koji razgra|uju DNA uni{tavaju sposobnost transformacije, dok enzimi koji razgra|uju proteine nemaju takav u~inak (slika 3-4). Na taj su na~in dokazali da je transformiraju}i princip zapravo molekula DNA. Ipak, tek }e eksperimenti provedeni tijekom sljede}ih nekoliko godina na bakterijskim virusima rezultirati prihva}anjem DNA kao geneti~kog materijala. Naime, kad bakterijski virus inficira stanicu, DNA virusa, a ne njegovi proteini, mora u}i u stanicu kako bi omogu}ila umnaànje virusa. [tovi{e, DNA roditeljskog virusa (a ne njegovi proteini) prenosi se na novonastale ~estice virusa. Uskla|enost tih rezultata s nastavkom ispitivanja aktivnosti DNA u transformaciji bakterija dovela je do kona~nog prihva}anja ideje da je DNA geneti~ki materijal.
94
Poglavlje 3
patogena S bakterija
nepatogena R bakterija
DNA kapsula pro~istititi DNA dodati pro~i{}enu DNA tipa S bakterijama tipa R
S bakterija
Slika 3-4. Prijenos geneti~ke informacije s pomo}u DNA.
DNA je izolirana iz patogenog tipa bakterije Pneumococcus koji je okruèn kapsulom i tvori glatke kolonije (S, engl. smooth). Dodatak DNA pro~i{}ene iz S tipa u kulturu nepatogenih bakterija koje ne tvoje kapsulu (R, engl. rough) dovodi do stvaranja S kolonija. Zaklju~ak je da pro~i{}ena DNA sadràva geneti~ku informaciju odgovornu za transformaciju tipa R u tip S bakterija.
Struktura DNA
Poznavanje trodimenzionalne strukture DNA koju su 1953. godine otkrili James Watson i Francis Crick temelj je suvremene molekularne biologije. U vrijeme kad su Watson i Crick radili na strukturi DNA bilo je poznato da je DNA polimer koji se sastoji od ~etiri tipa du{ikovih baza, dva purina (adenin A i gvanin G) i dva pirimidina (citozin C i timin T), vezanih za fosforilirane {e}ere. S obzirom na sredi{nju ulogu DNA kao geneti~kog materijala, obja{njenje njezine trodimenzionalne strukture bilo je kriti~no za razumijevanje njezine funkcije. Watsonov i Crickov pogled na taj problem bio je pod zna~ajnim utjecajem Linus Paulingova obja{njenja vodikove veze i a-uzvojnice, ~estog oblika sekundarne strukture proteina (vidi 2. poglavlje). Eksperimentalni podatci o strukturi DNA proizi{li su iz kristalografskih ispitivanja Mauricea Wilkinsa i Rosalind Franklin. Analiza tih podataka otkrila je da je molekula DNA uzvojnica koja ~ini zavoje od 3,4 nm. Podatci su pokazali i da je razmak izme|u susjednih baza 0,34 nm, stoga se jedan zavoj uzvojnice sastoji od 10 parova baza. Va`no je otkri}e bilo da je promjer uzvojnice pribli`no 2 nm, {to je upu}ivalo na to da se molekula DNA sastoji od dvaju, a ne od jednoga lanca DNA. Na osnovi ovih podataka Watson i Crick su izgradili svoj model molekule DNA (slika 3-5). Osnovna svojstva modela jesu da je DNA dvostruka uzvojnica sa {e}erno-fosfatnom okosnicom na vanjskoj strani molekule. Baze
95
su smje{tene u unutra{njosti molekule i orijentirane tako da se vodikove veze stvaraju izme|u nasuprotnih purina i pirimidina. Sparivanje baza vrlo je specifi~no: A se uvijek sparuje s T, a G s C. Ova specifi~nost obja{njava raniji rezultat Erwina Chargaffa koji je analizirao sastav baza u razli~itim molekulama DNA i utvrdio da je koli~ina adenina uvijek jednaka koli~ini timina, a koli~ina gvanina jednaka koli~ini citozina. Zbog specifi~nog su sparivanja baza dva lanca molekule DNA komplementarna i svaki lanac sadràva cjelokupnu informaciju potrebnu za odre|ivanje slijeda baza u drugom lancu.
Replikacija DNA
Otkri}e komplementarnog sparivanja baza izme|u dvaju lanaca u molekuli DNA dalo je odgovor na pitanje kako geneti~ki materijal moè upravljati svojom vlastitom replikacijom, procesom koji se mora dogoditi pri svakoj diobi stanica. Predloèno je da se dva lanca DNA mogu razdvojiti i sluìti kao kalup za sintezu novoga komplementarnog lanca ~iji bi slijed bio odre|en specifi~nim sparivanjem baza (slika 3-6). Ovaj proces naziva-
2 nm 5' G A T 3' C T A A C G C A G A T T G T C A T 3' G T G A 5'

O
DNA je dvostruka uzvojnica s bazama na unutarnjoj i {e}erno-fosfatnom okosnicom na vanjskoj strani molekule.
Slika 3-5. Struktura molekule DNA.

0,34 nm
C G T C T A
Baze na suprotnim lancima povezuju se vodikovim vezama izme|u adenina (A) i timina (T), te izme|u gvanina (G) i citozina (C). Dva lanca u molekuli DNA su antiparalelni (usmjereni su u suprotnim smjerovima odre|enim slobodnim 5' odnosno 3' skupinama deoksiriboze). H 5' kraj O H C O H C N O {e}er C C H CH3 O P O CH2 C C 3' kraj OH O {e}er C H C 5' kraj
O
N H C
O C C
C N
H H C C {e}er O C C CH2
O
3' kraj
3,4 nm A C A
P O
C
C
N C
G
N
CH2 C
O C
H N H
O O
H O C H N C N C O H H N C C N C N C H H C
C O H C N
A
N
C {e}er O C CH2
O O
96
Poglavlje 3
3' G G C A G A T T G T C G A G T C T A A C C C
5'
mo semikonzer vativnom replikacijom jer je u svakoj novonastaloj molekuli DNA sa~uvan po jedan stari lanac roditeljske DNA. Izravnu podr{ku modelu semikonzervativne replikacije DNA pruìo je elegantni eksperiment koji su 1958. godine proveli Matthew Messelson i Frank Stahl obiljeìv{i DNA izotopima koji su promijenili njezinu gusto}u (slika 3-7). E. coli je prvo uzgajana u mediju koji je sadràvao te{ki izotop du{ika (15N) umjesto normalnoga du{ika (14N). DNA tih bakterija umjesto normalnoga du{ika 14N sadràvala je te{ki izotop 15N, te je stoga bila gu{}a od DNA bakterija uzgajanih u normalnom mediju. Takvu te{ku DNA (15N) bilo je mogu}e razdvojiti od normalne DNA (14N) ravnote`nim centrifugiranjem u gradijentu CsCl, {to je omogu}ilo prou~avanje procesa sinteze DNA. E. coli koja je rasla u 15N mediju prenesena je u normalni medij te joj je omogu}eno da se podijeli jo{ jednom. DNA bakterija dobivenih diobom je izolirana i analizirana centrifugiranjem u gradijentu gusto}e CsCl. Rezultat ove analize pokazao je da je sva te{ka DNA zamijenjena novosintetiziranim molekulama DNA ~ija je gusto}a izme|u gusto}e te{kih (15N) i lakih (14N) molekula DNA. Takav rezultat obja{njen je modelom u kojem tijekom replikacije dolazi do razdvajanja dvaju te{kih roditeljskih lanaca DNA od kojih svaki sluì kao kalup za sintezu po jednoga novog lakoga lanca DNA. Rezultat su molekule DNA od kojih svaka sadràva po jedan laki i jedan te{ki lanac te je njihova gusto}a izme|u gusto}e te{ke i lake molekule DNA. Ovaj eksperiment pruìo je izravni dokaz za semikonzervativnu replikaciju DNA i jasno naglasio va`nost komplementarnog sparivanja baza izme|u dvaju lanaca DNA u dvostrukoj uzvojnici. Sposobnost DNA da sluì kao kalup za vlastitu sintezu dodatno je potvr|ena kad je utvr|eno da enzim izoliran iz E. coli (DNA-polimeraza) moè katalizirati replikaciju DNA in vitro. U prisutnosti lanca DNA koji sluì kao kalup, DNA-polimeraza mogla je katalizirati ugradnju nukleotida u komplementarni lanac DNA.
Ekspresija geneti~ke informacije

Geni djeluju tako da odre|uju strukturu proteina koji su odgovorni za funkcioniranje stanice na molekularnoj razini. Identifikacija DNA kao geneti~kog materijala i razja{njenje njezine strukture otkrilo je da geneti~ka infor-
A G T C G T T G C C A G A T T 5' G T C T A A 3' A C 3' C T
T C A 5' G A T G
C stari lanac DNA
T G G C A G A T T 5' G T C
A C novi lanac DNA
T A A 3'
Slika 3-6. Semikonzervativna replikacija DNA.

Dva se lanca roditeljske DNA razdvajaju i svaki od njih sluì kao kalup za sintezu po jednoga novoga lanca. Na taj na~in nastaju dvije nove, potpuno identi~ne molekule DNA. Slijed nukleotida u novonastalim lancima DNA odre|en je komplementarnim sparivanjem baza.
97
Bakterije uzgajane u 14N mediju E. coli izolat DNA centrifugirati u otopini CsCl
Bakterije uzgajane u 15N mediju
Prijenos u
14N
medij za jednu diobu
izolat DNA centrifugirati u otopini CsCl
izolat DNA centrifugirati u otopini CsCl
lagana DNA rastu}a gusto}a te{ka DNA rastu}a gusto}a hibridna DNA rastu}a gusto}a
macija mora biti odre|ena redoslijedom ~etiriju baza (A, C, G i T) koje izgra|uju molekulu DNA. S druge strane, proteini su polimeri izgra|eni od 20 razli~itih aminokiselina ~iji slijed odre|uje njihovu strukturu i funkciju. Prva izravna veza izme|u mutacije gena i promjene u slijedu aminokiselina pokazana je 1957. godine, kad je utvr|eno da je razlika izme|u hemoglobina pacijenata oboljelih od nasljedne bolesti srpaste anemije i normalnoga hemoglobina u svega jednoj aminokiselini, no dublje razumijevanje molekularnog odnosa izme|u DNA i proteina proizi{lo je iz serije eksperimenata koji su iskoristili prednosti E. coli i njezinih virusa kao geneti~kih modela.
Slika 3-7. Eksperimentalni dokaz semikonzervativne replikacije DNA.

Bakterije uzgajane u mediju koji je sadràvao normalni izotop du{ika (14N) prenesene su u medij koji sadràva te{ki izotop du{ika (15N) te su tu uzgajane tijekom nekoliko generacija. Zatim su prenesene ponovo u medij s 14 N du{ikom i uzgajane tijekom jedne dodatne generacije. DNA izolirana iz tih bakterija analizirana je ravnote`nim ultracentrifugiranjem u otopini CsCl. Izloèn velikom gravitacijskom polju CsCl sedimentira i tvori gradijent gusto}e, a molekule DNA tvore vrpcu na poloàju gdje je njihova gusto}a jednaka gusto}i otopine CsCl. DNA bakterija prenesenih iz 15N medija u 14N medij tijekom vremena koje je omogu}ilo samo jednu dodatnu replikaciju tvori vrpcu ~ija je gusto}a izme|u gusto}a 15N DNA i 14N DNA, {to upu}uje na to da se radi o hibridnoj molekuli koja se sastoji od jednoga te{kog i jednoga lakog lanca.
Kolinearnost gena i proteina

Najjednostavnija pretpostavka koja bi objasnila odnos gena i proteina bila je da redoslijed nukleotida u DNA odre|uje redoslijed aminokiselina u proteinima. Mutacije u genu odgovarale bi promjenama u slijedu nukleotida u molekuli DNA koje bi mogle nastati zbog zamjene jednog nukleotida nekim drugim, zbog dodavanja (adicije) ili uklanjanja (delecije) nukleotida. Promjene u slijedu nukleotida u molekuli DNA tada bi rezultirale odgovaraju}im promjenama u slijedu aminokiselina u proteinu {to ga kodira mutirani gen. Ova je pretpostavka predvidjela da bi razli~ite mutacije u istom genu mogle promijeniti razli~ite aminokiseline u proteinu {to ga taj gen kodira, a da bi poloàj mutacije unutar gena trebao odgovarati poloàju promijenjene aminokiseline u proteinu. Brzo umnaànje i jednostavnost geneti~koga sustava E. coli bili su od velike pomo}i pri traènju odgovora na ova pitanja. Bilo je mogu}e izolirati razli~ite mutante bakterije E. coli, uklju~uju}i i nutritivne mutante koje (poput mutanti gljivice Neurospora crassa prikazanih ranije) rastu samo uz dodatak odre|ene aminokiseline. Brz rast bakterije E. coli omogu}io je izolaciju i kartiranje vi{e mutacija unutar jednoga gena, {to je rezultiralo prvim dokazom linearnog odnosa izme|u gena i proteina. Charles Yanofsky i njegovi kolege kartirali su seriju mutacija u genu koji kodira enzim potreban za sintezu aminokiseline triptofana. Analiza enzima koje kodiraju ti mutirani geni pokazala je da relativni poloàj promjena u aminokiselinama odgovara poloàju mutacija u genu (slika 3-8). Dakle, slijed aminokiselina u proteinu kolinearan je sa slijedom nukleotida u genu, {to je u skladu s pretpo-
98
Poglavlje 3
mutacije DNA
normalni protein
Tyr
Leu
Thr
Gly
Gly
Gly
Ser
zamjena aminokiseline kao posljedica mutacije
Cys
Arg
Ile
Arg
Val
Asp
Leu
DNA 3' 5'

T
Serija mutacija (strjelice) kartirana je u genu bakterije E. coli koji kodira triptofan-sintetazu (gornji red). Promjene aminokiselina koje su proiza{le iz svake od tih mutacija utvr|ene su analizom slijeda aminokiselina u proteinima mutiranih bakterija (donji red). Ova ispitivanja pokazala su da redoslijed mutacija u DNA odgovara redoslijedu promijenjenih aminokiselina u proteinu {to ga taj gen kodira.
Slika 3-8. Kolinearnost gena i proteina.
5' RNA
C
G
stavkom da redoslijed nukleotida u molekuli DNA odre|uje redoslijed aminokiselina u proteinu.
G C T C T G A T C C G T T A C C G T G C A C U C U G A U C C G U U A C C G U G T G G C A C G T C A G A G A C T A G
Uloga glasni~ke RNA

Iako se ~inilo da slijed nukleotida u DNA odre|uje slijed aminokiselina u proteinu, iz toga nije nu`no proizlazilo da sama molekula DNA upravlja sintezom proteina. [tovi{e, u prilog tomu nije govorila ni ~injenica da je DNA smje{tena u jezgri eukariotske stanice, dok se sinteza proteina odvija u citoplazmi. înilo se puno vjerojatnijim da neka druga molekula prenosi geneti~ku informaciju s molekule DNA na mjesto sinteze proteina (ribosomi). RNA je djelovala kao vjerojatni kandidat za takvog posrednika jer je sli~nost njezine strukture sa strukturom DNA upu}ivala na to da bi RNA mogla biti sintetizirana na osnovi DNA-kalupa (slika 3-9). Molekula se RNA razlikuje od molekule DNA po tome {to je jednolan~ana, a ne dvolan~ana, {to je njezina {e}erna komponenta riboza, a ne deoksiriboza, i {to sadràva pirimidinsku bazu uracil (U) umjesto timina (T) (vidi sliku 2-10). No ni promjena {e}era, niti zamjena uracila timinom ne utje~e na sparivanje baza, stoga je sintezom RNA mogu}e upravljati koriste}i DNA kao kalup. [tovi{e, kako je RNA smje{tena poglavito u citoplazmi, ~inilo se da je ona logi~ni posrednik u prijenosu informacije s DNA na ribosome. Ova svojstva RNA sugerirala su tijek geneti~ke informacije koji prepoznajemo kao sredi{nju dogmu molekularne biologije: DNA RNA protein. U skladu s ovim konceptom, molekula RNA sintetizira se na osnovi DNAkalupa (proces koji nazivamo prepisivanje ili transkripcija), a proteini se sintetiziraju na osnovi RNA-kalupa (proces koji nazivamo prevo|enje ili translacija). Eksperimentalni dokaz postojanja RNA posrednika koji je predvidjela sredi{nja dogma pruìli su Sidney Brenner, Francois Jacob i Matthew Meselson prou~avanjem E. coli inficirane bakteriofagom T4. Sinteza RNA E. coli prestaje nakon infekcije bakteriofagom T4 i jedina nova RNA koja nastaje u inficiranim bakterijama prepisana je s DNA bakteriofaga T4. RNA bakteriofaga T4 dolazi u kontakt s bakterijskim ribosomima, te stoga prenosi informaciju s DNA na mjesto sinteze proteina. Zbog svoje uloge u prijenosu geneti~ke informacije molekula RNA koja sluì kao kalup za sintezu proteina
3'
T G
A C
A C
T G A
3'
5'
Slika 3-9. Sinteza molekule RNA iz molekule DNA.

Dva se lanca molekule DNA razmotavaju, a jedan od njih se koristi kao kalup za sintezu komplementarnoga lanca molekule RNA.
Osnove molekularne biologije nazvana je glasni~kom RNA (mRNA, od engl. messenger). Sintezu RNA na osnovi DNA-kalupa katalizira enzim nazvan RNA-polimeraza. Osim mRNA, za sintezu proteina va`na su i dva druga tipa RNA ribosomna RNA (rRNA) koja je sastavni dio ribosoma i transportna RNA (tRNA) koja djeluje kao adaptor koji donosi aminokiseline na RNA-kalup. Osnove strukture i funkcije tih molekula opisane su u nastavku ovoga poglavlja, a detaljnije su prikazane u poglavljima 6 i 7.
99
Geneti~ki kod
Na koji se na~in slijed nukleotida u RNA prevodi u slijed aminokiselina u proteinu? U ovom koraku ekspresije gena geneti~ka se informacija prenosi s nukleinskih kiselina na proteine, molekule koje su kemijski jako razli~ite, {to otvara dva nova problema za razumijevanje djelovanja gena. Budu}i da aminokiseline nisu strukturno srodne du{ikovim bazama, izravno komplementarno sparivanje mRNA i aminokiselina tijekom ugradnje aminokiselina u proteine nije se ~inilo vjerojatnim. Kako je onda mogu}e da se aminokiseline slaù na mRNA-kalup tijekom sinteze proteina? Ovaj problem rije{en je otkri}em tRNA koje sluè kao adaptori izme|u aminokiselina i mRNA tijekom prevo|enja geneti~ke informacije (slika 3-10). Prije njezine uporabe u sintezi proteina, svaka aminokiselina se s pomo}u specifi~nog enzima povezuje s odgovaraju}om tRNA. U sljede}em koraku sparivanje baza izme|u prepoznavaju}eg slijeda na molekuli tRNA i komplementarnog slijeda na mRNA usmjerava aminokiselinu vezanu na tRNA na njezin to~an poloàj na mRNA-kalupu. Drugi problem u prevo|enju slijeda nukleotida u slijed aminokiselina bio je odre|ivanje geneti~koga koda. Na koji je na~in mogu}e informaciju sadrànu u slijedu ~etiriju razli~itih nukleotida prevesti u slijed 20 razli~itih aminokiselina u proteinima? Budu}i da je 20 razli~itih aminokiselina potrebno odrediti s pomo}u svega ~etiri nukleotida, bilo je nu`no da najmanje tri nukleotida budu uklju~ena u kodiranje svake aminokiseline. Kori{teni pojedina~no, ~etiri nukleotida mogli bi kodirati svega ~etiri aminokiseline, a kori{teni u parovima, svega {esnaest (42) aminokiselina. Kori{teni u obliku tripleta ~etiri nukleotida mogu kodirati 64 (43) razli~ite aminokiseline, {to je vi{e nego dovoljno za 20 razli~itih aminokiselina koje doista izgra|uju proteine. Da je geneti~ki kod zaista organiziran u triplete potvr|eno je eksperimentima provedenim na bakteriofagu T4 koji je nosio mutacije u intenzivno prou~avanom genu nazvanom rII. Fagi s mutacijama u tom genu tvore jako velike plakove koje je vrlo lako razlikovati od plakova koje tvore virusi divljeg tipa. Identifikacija i kartiranje mutacija u genu rII vrlo je jednostavno pa je napravljena detaljna geneti~ka karta ovog lokusa. Ispitivanje rekombinanata izme|u rII mutanata koji su nastali adicijom ili delecijom nukleotida pokazalo je da adicija ili delecija jednoga ili dvaju nukleotida uvijek rezultira mutantnim fenotipom. Nasuprot tomu, fagi koji su imali deleciju ili adiciju tri nukleotida ~esto bi zadràli funkciju divljeg tipa (slika 3-11). Ovo otkri}e sugeriralo je da se geni ~itaju od neke fiksne to~ke u sku-
5' 3'
His
G GU
tRNAHis
Histidil-tRNA-sintetaza
5' 3'
His
nabijena tRNAHis
G GU
5' 3'
His
Komplementarno sparivanje baza
Slika 3-10. Funkcija transportne RNA (tRNA).

tRNA djeluje kao adaptor u sintezi proteina. Svaka aminokiselina (primjerice histidin) veè se na 3' kraj specifi~ne tRNA s pomo}u odgovaraju}eg enzima (aminoaciltRNA-sintetaze). Nabijena tRNA tada se povezuje s molekulom mRNA koja sluì kao kalup na osnovi komplementarnog sparivanja baza.
G GU C A C
mRNA
100
Poglavlje 3
Slika 3-11. Geneti~ki dokaz tripletnoga koda.

Serija mutacija koje se sastoje od adicije jednoga, dvaju ili triju nukleotida ispitivane su u rII genu bakteriofaga T4. Adicija jednoga ili dvaju nukleotida mijenja okvir ~itanja ostatka gena, te su stoga sve sljede}e aminokiseline pogrje{ne i daju nefunkcionalni protein koji rezultira mutiranim fenotipom faga. S druge strane, adicija triju nukleotida mijenja samo jednu aminokiselinu. Okvir ~itanja ostatka gena je normalan pa }e i protein {to ga kodira taj gen biti funkcionalan, a fag }e imati normalni fenotip (divlji tip faga = WT).
DNA ACG TCA TAT CCG CAT ACC GAG aminokiselina Thr Ser Tyr Pro His Thr Glu
...
normalni gen aktivni protein WT fag
DNA ACG GTC ATA TCC GCA TAC CGA G aminokiselina Thr Val Ile Ser Ala Tyr Arg
..
+1 nukleotid neaktivni protein rI rII mutant
DNA ACG GAT CAT ATC CGC ATA CCG AG aminokiselina Thr Asp His Ile Arg Ile Pro
+2 nukleotida neaktivni protein rI rII mutant
DNA ACG GAC aminokiselina Thr Asp
TAT CCG Tyr Pro
ACC GAG +3 nukleotida Thr aktivni protein WT fag
poli-U kalup U U U U U U U U U U U U
ribosomi aminokiseline tRNA aminoacil-tRNA sintetaze
In vitro prevo|enje
polipeptid
Phe Phe Phe Phe
Slika 3-12. Triplet UUU kodira fenilalanin.
pinama od po tri nukleotida. Adicija ili delecija jednoga ili dvaju nukleotida poremetila bi okvir ~itanja ~itavoga gena, {to bi dovelo do ugradnje pogrje{nih aminokiselina ~itavom duìnom kodiranog proteina. Nasuprot tomu, adicija ili delecija tri nukleotida rezultirala bi samo dodatkom ili gubitkom jedne aminokiseline, dok bi ostatak proteina bio nepromijenjen, a ~esto bi i zadrào prvobitnu funkciju. Sljede}i korak u otkrivanju geneti~koga koda bio je pridruìti odgovaraju}u aminokiselinu svakom tripletu nukleotida. Za rje{avanje ovog problema primijenjen je sustav koji je mogao sintetizirati proteine in vitro (in vitro translacija). Tada je ve} bilo poznato da ekstrakti stanica, koji sadràvaju ribosome, aminokiseline, tRNA i enzime odgovorne za vezanje aminokiselina na pripadaju}e tRNA (aminoacil-tRNA-sintetaze), mogu katalizirati ugradnju aminokiselina u proteine. Takav na~in sinteze proteina ovisi o prisutnosti mRNA vezane na ribosome, a samu je sintezu mogu}e zna~ajno poja~ati dodatkom pro~i{}ene mRNA. Budu}i da u takvom sustavu dodana strana mRNA upravlja sintezom proteina, ispitivanje prevo|enja sinteti~kih mRNA poznatoga slijeda nukleotida omogu}ilo je dekodiranje geneti~koga koda. Prvi eksperiment toga tipa proveli su Marshall Nirenberg i Heinrich Matthaei koriste}i sinteti~ki polimer RNA koji je sadràvao samo uracil kao kalup za in vitro sintezu proteina (slika 3-12). Utvrdili su da poli-U kalup odre|uje ugradnju samo jedne aminokiseline, fenilalanina, u polipeptid koji se sastoji od ponavljaju}ih fenilalaninskih ostataka. Sli~ni eksperimenti s RNA-polimerima koji su sadràvali samo jednu vrstu nukleotida pokazali su da AAA kodira lizin, a CCC kodira prolin. Ostatak geneti~koga koda dekodiran je koriste}i polimere RNA koji su sadràvali smjese nukleotida. Na taj na~in de{ifrirana su sva 64 tripleta (kodona) (tabl. 3-1). Od 64 kodona 61 kodon odre|uje aminokiseline, a preostala tri (UAA, UAG i UGA) predstavljaju STOP kodone koji signaliziraju kraj sinteze proteina. Geneti~ki kod je degeneriran {to zna~i da su mnoge aminokiseline odre|ene s vi{e no jednim kodonom. Uz nekoliko iznimaka (prikazanih u 10. poglavlju), svi se organizmi sluè istim geneti~kim kodom {to je ~vrst dokaz da su se sve dana{nje stanice razvile od istoga zajedni~kog pretka.
In vitro prevo|enje sinteti~ke RNA koja se sastoji od ponavljaju}ih uracila (poliU kalup) rezultira sintezom polipeptida koji se sastoji samo od fenilalanina.
RNA-virusi i obrnuto prepisivanje

Nakon dekodiranja geneti~koga koda ~inilo se da su temeljni principi molekularne biologije postavljeni. U skladu sa sredi{njom dogmom, geneti~ki
101
Tablica 3-1. Geneti~ki kod

Prvo mjesto
U
U
Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val
Drugo mjesto C A
Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Tyr Tyr stop stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu
G
Cys Cys stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly
Tre}e mjesto
U C A G U C A G U C A G U C A G
materijal sastoji se od DNA koja ima svojstvo samoreplikacije i mogu}nost prijenosa informacije (prepisivanja) na molekulu mRNA, koja onda sluì kao kalup za sintezu proteina. Ipak, kao {to je ve} navedeno u prvom poglavlju, mnogi virusi kao geneti~ki materijal sadràvaju RNA umjesto DNA {to zahtijeva neki drugi oblik prijenosa geneti~ke informacije. RNA-genomi su isprva otkriveni kod biljnih virusa od kojih se mnogi sastoje samo od molekula RNA i proteina. Izravni dokaz da RNA obavlja ulogu geneti~kog materijala tih virusa pruìli su eksperimenti provedeni sredinom 20. stolje}a koji su pokazali da pro~i{}ena RNA izolirana iz virusa mozaika duhana moè inficirati nove stanice doma}ina u kojima onda nastaju nove infektivne virusne ~estice. Na~in replikacije ve}ine virusnih RNA-genoma razja{njen je ispitivanjem RNA bakteriofaga bakterije E. coli. Otkriveno je da ti virusi nose informaciju za specifi~ni enzim koji katalizira sintezu molekule RNA na osnovi RNA-kalupa (RNA-upravljana RNA-sinteza) primjenjuju}i isti princip komplementarnog sparivanja baza koji se rabi pri replikaciji DNA ili prepisivanju DNA u RNA. Iako je utvr|eno da se ve}ina ìvotinjskih RNA-virusa (primjerice polio virus ili virus influence) umnoàva RNA-upravljanom sintezom RNA, ovaj mehanizam nije mogao objasniti umnoàvanje jedne porodice ìvotinjskih virusa (RNA tumorskih virusa) koji su bili posebice interesantni zbog svoje sposobnosti da uzrokuju tumore kod inficiranih ìvotinja. Iako ovi virusi sadràvaju genomsku RNA, eksperimenti koje je po~etkom 1960-ih godina proveo Howard Temin pokazali su da za umnoàvanje virusnih ~estica mora do}i do sinteze DNA u inficiranim stanicama, {to je dovelo do pretpostavke da se RNA tumorski virusi (danas ih nazivamo retrovirusi) umnoàvaju sintezom DNA-posrednika koji nazivamo DNA-provirus (slika 3-13). Ova je pretpostavka u po~etku nailazila na veliki otpor znanstvenika jer je uklju~ivala RNA-upravljanu sintezu DNA {to se protivilo sredi{njoj dogmi. Godine 1970. su Howard Temin i David Baltimore neovisno jedan o drugo-
102
Poglavlje 3
Pretpostavka DNA-provirusa
Nature of the Provirus of Rous Sarcoma Howard M. Temin
McArdle Laboratory, University of Wisconsin, Madison, WI National Cancer Institute Monographs, Volume 17, 1964, pages 557570
Kontekst
Rousov sarkomski virus (RSV) pr vi je opisani virus koji moè uzrokovati tumore, te je posluìo kao eksperimentalni model za istraìvanje molekularne biologije tumora. Howard Temin uklju~io se u istraìvanje ovog podru~ja kad je kao poslijediplomand 1958. godine razvio metodu transfor macije normalnih stanica u kulturi u tumorske s pomo}u infekcije Rousovim sarkomskim virusom. Uvo|enje ove kvantitativne in vitro metode omogu}ilo je daljnja istraìvanja transfor macije stanica i umnaànja virusa. Provode}i spomenute eksperimente, Temin je do{ao do serije neo~ekivanih opaànja koja su upu}ivala na to da je replikacija RSV virusa bazi~no razli~ita od replikacije ostalih RNA-virusa. Temin je pretpostavio da se RNA virusa prepisuje u DNA u inficiranim stanicama {to se u to vrijeme izravno sukobljavalo s op}e prihva}enom sredi{njom dogmom molekular ne biologije (pretpostavka DNA-provirusa).
Eksperimenti
Pretpostavka DNA-provirusa zasnovana je na nekoliko razli~itih tipova eksperimentalnih dokaza. Ispitivanja stanica inficiranih mutiranim RSV pokazala su da su neka svojstva tih stanica odre|ena geneti~kom informacijom virusa. Ova se informacija uvijek prenosila na stanice k}eri nakon diobe stanica, ~ak i ukoliko nije dolazilo do umnoàvanja virusa. Na osnovi toga opaànja Temin je zaklju~io da virusni genom postoji u stanicama u stabilnom obliku koji je mogu}e naslijediti, te ga je nazvao provirusom. Dokazi da je provirus zaista DNA izvedeni su iz eksperimenata koji su koristili metaboli~ke inhibitore. Prona|eno je da aktinomicin D, koji inhibira sintezu RNA na osnovi DNA-kalupa, onemogu}uje proizvodnju virusa u stanicama inficiranim RSV (vidi sliku). S druge strane, inhibitori sinteze DNA blokirali su rane stadije infekcije stanice virusom. înilo se da je u ranim stadijima infekcije potrebna sinteza
Howard Temin
DNA, a da je DNA-upravljana sinteza RNA potrebna u kasnijim stadijima za proizvodnju novih virusnih ~estica. Na temelju ovih opaànja pretpostavilo se da je provirus DNA-kopija viralnoga RNA-genoma. Temin je poku{ao dodatno dokazati ovu pretpostavku koriste}i hibridizaciju nukleinskih kiselina za detekciju virusnih slijedova u DNA inficiranih stanica. Ipak, osjetljivost tehnika koje su mu bile na raspolaganju nije bila dostatna i rezultati nisu bili uvjerljivi.
Utjecaj
Teminova pretpostavka da se RSV umnoàva prijenosom infor macije s RNA na DNA u osnovi je predloèna na temelju geneti~kih eksperimenata i u~inaka metaboli~kih inhibitora, a kosila se s op}eprihva}enom sredi-
me otkrili da retrovirusi sadràvaju dosad nepoznati enzim koji katalizira sintezu DNA na osnovi RNA-kalupa, a dobiveni su i jasni dokazi prisutnosti virusne DNA u inficiranim stanicama. S ovim je otkri}ima sinteza DNA na osnovi RNA-kalupa, koju danas nazivamo obrnuto prepisivanje (reverzna transkripcija) prihva}ena kao oblik prijenosa geneti~ke informacije u biolo{kim sustavima. Obrnuto prepisivanje nije va`no samo kao mehanizam umnoàvanja retrovirusa, ve} i u jo{ najmanje dva druga {iroka podru~ja molekularne i stani~ne biologije. Obrnuto prepisivanje nije ograni~eno samo na retroviruse. Odvija se i u stanicama i kao {to je prikazano u poglavljima 4 i 5, ~esto je odgovorno za premje{tanje (transpoziciju) slijeda nukleotida s jednoga na neko drugo mjesto u DNA njihovih kromosoma. [tovi{e, sekvenciranje genoma ~ovjeka pokazalo je da je pribli`no 40% genomske DNA ~ovjeka nastalo obrnutim prepisivanjem. S druge strane, enzimi koji kataliziraju
103
{njom dogmom molekularne biologije. U tom kontekstu, ne samo da nije bila prihva}ena u znanstvenoj zajednici, ve} je bila izloèna op}em odbijanju, gotovo podsmijehu. Temin je ipak ustrajao i tijekom 1960-ih nastavio prikupljati eksperimentalne dokaze koji bi potkrijepili njegovu pretpostavku. Ti su napori kulminirali 1970. godine kad su Temin i Satoshi Mizutani (u isto vrijeme kad i David Baltimore) otkrili virusni enzim, danas poznat kao reverzna transkriptaza, koji sintetizira DNA na osnovi RNA-kalupa. To je bio nedvojbeni biokemijski dokaz da je tijek geneti~ke infor macije mogu}e i obr nuti i da sredi{nju dogmu treba modificirati. U svom radu objavljenom 1970. godine Temin je zaklju~io da njegovi rezultati predstavljaju snaàn dokaz
produkcija virusa (postotak po~etne kontrolne brzine)
0 mg/ml 100 0.1 mg/ml Prisutan aktinomicin D
U~inak aktinomicina D na replikaciju RSV . Stanice inficirane RSV uzgajane su u kulturi u prisutnosti navedenih koncentracija aktinomicina tijekom 8 sati nakon ~ega je aktinomicin D uklonjen te je analizirana koli~ina nastalog virusa.
10 mg/ml
10
12 16 sati
20
24
da je pretpostavka DNA-provirusa to~na i da RNA tumorski virusi imaju DNA-genom kad su u stanicama, a
RNA-genom kad su u virusnim ~esticama. Ovaj rezultat imao bi zna~ajne implikacije na teoriju virusne kancerogeneze, a mo`da i na teorije prijenosa informacije u drugim biolo{kim sustavima. Kao {to je Temin i predvidio, otkri}e RNA-upravljane sinteze DNA dovelo je do zna~ajnoga napretka na{eg razumijevanja tumora, humanih retrovirusa i preure|ivanja gena. Enzim reverzna transkriptaza omogu}io je kloniranje cDNA, te je stoga imao u~inak na prakti~no sva podru~ja suvremene stani~ne i molekularne biologije.
RNA- upravljanu sintezu DNA (reverzne transkriptaze) mogu biti uporabljeni za sintezu DNA kopija bilo koje molekule RNA u eksperimentalnim sustavima. Primjena reverzne transkriptaze omogu}ila je ispitivanje eukariotske mRNA metodama koje se koriste za manipuliranje molekulama DNA, a koje su opisane u nastavku ovog poglavlja.
retrovirusna ~estica RNA-genom
infekcija virusom RNA DNA
obrnuto prepisivanje
ugradnja virusne DNA
DNA-provirus
Slika 3-13. Obrnuto prepisivanje i replikacija retrovirusa.

Retrovirusi sadràvaju RNA-genome u svojim virusnim ~esticama. Tijekom infekcije stanice doma}ina retrovirus sintetizira DNA-kopiju svoga RNA-genoma s pomo}u enzima reverzne transkriptaze. Virusna DNA tada se ugra|uje u kromosomsku DNA doma}ina i tvori DNA-provirus koji se prepisuje kako bi stvorio RNA potrebnu za nastanak novih virusnih ~estica.
Nove virusne ~estice
104
Poglavlje 3
Rekombinantna DNA
Klasi~ni eksperimenti u molekularnoj biologiji zna~ajno su unaprijedili na{e temeljno razumijevanje prirode i ekspresije gena. Budu}i da su ta istraìvanja bila zasnovana poglavito na geneti~kim analizama, njihov je uspjeh u zna~ajnoj mjeri ovisio o kori{tenju jednostavnih organizama koji se brzo razmnoàvaju (kao {to su primjerice bakterije i virusi). Kako su genomi ve}ine eukariota (primjerice genom ~ovjeka) i do tisu}u puta sloèniji od genoma bakterije E. coli, nije bilo jasno kako bi se ti temeljni principi primijenili i na vi{e organizme. Po~etkom 1970-ih mogu}nost istraìvanja sloènih genoma na molekularnoj razini nije djelovala obe}avaju}e. Posebice se ~inilo da nema na~ina na koji bi bilo mogu}e izolirati i ispitivati pojedina~ne gene. Ovu prepreku napretku molekularne biologije savladao je razvoj tehnologije rekombinantne DNA koja je znanstvenicima pruìla mogu}nost da izoliraju, sekvenciraju i manipuliraju genima izoliranim iz bilo kojeg tipa stanica, pa i onih sloènih organizama. Primjena tehnologije rekombinantne DNA omogu}ila je detaljna molekularna ispitivanja strukture i funkcije eukariotskih gena i genoma te je na taj na~in produbila na{e razumijevanje stani~ne biologije.
Restrikcijske endonukleaze
Prvi korak u razvoju tehnologije rekombinantne DNA bila je karakterizacija restrikcijskih-endonukleaza, enzima koji kidaju DNA na specifi~nim redoslijedima. Ovi enzimi otkriveni su u bakterija gdje vjerojatno sluè kao obrambeni mehanizam protiv ulaska strane DNA (primjerice virusne) u stanicu. Bakterije imaju velik broj razli~itih restrikcijskih-endonukleaza koje kidaju DNA na vi{e od stotinu specifi~nih mjesta prepoznavanja, a svako od tih mjesta sastoji se od specifi~nog slijeda od ~etiri do osam parova baza (primjeri su navedeni u tablici 3-2). Budu}i da restrikcijske-endonukleaze razgra|uju DNA u specifi~nim redoslijedima, mogu}e ih je primijeniti za kidanje molekule DNA na jedinstvenim mjestima. Primjerice restrikcijska-endonukleaza EcoRI prepoznaje slijed od {est parova baza GAATTC. Ovakav slijed nukleotida prisutan je na pet mjesta u DNA bakteriofaga l, te stoga EcoRI razgra|uje l DNA u {est fragmenata duljine od 3,6 do 21,2 kilobaze (1 kb = 1.000 parova baza) (slika 3-14). Ti fragmenti mogu biti razdvojeni prema veli~ini gel-elektrofo-
Tablica 3-2. Mjesta prepoznavanja nekih restrikcijskih-endonukleaza

Enzimia
BamHI EcoRI HaeIII HindIII HpaI HpaII MboI NotI SfiI TaqI
Izvor
Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus aegyptius Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzae Haemophilus parainfluenzae Moraxella bovis Nocardia otitidis-caviarum Streptomyces fimbriatus Thermus aquaticus
Mjesto prepoznavanjab
GGATCC GAATTC GGCC AAGCTT GTTAAC CCGG GATC GCGGCCGC GGCCNNNNNGGCC TCGA
a Imena restrikcijskih enzima izvode se iz imena organizma iz kojih su izolirani i rednoga broja koji omogu}uje razlikovanje razli~itih enzima izoliranih iz istog organizma (primjerice HpaI i HpaII dvaju razli~itih enzima izoliranih iz bakterije Haemophilus parainfluenzae). b Mjesta prepoznavanja prikazana su samo kao slijed nukleotida jednoga lanca dvolan~ane DNA. N predstavlja bilo koju bazu.
105
HIV i AIDS
Bolest
Sindrom ste~ene imunodeficijencije (AIDS, engl. acquired immune deficiency syndrome) je nova bolest koja je pr vi puta opisana 1981. godine. Do danas se razvila u pandemiju s vi{e od 50 milijuna inficiranih ljudi {irom svijeta od kojih je pribli`no 20 milijuna umrlo od AIDS. Klini~ka manifestacija AIDS poglavito je posljedica nemogu}nosti imunosustava da nor malno funkcionira. U nedostatku normalne imunosti pacijenti oboljeli od AIDS podlo`ni su oportunisti~kim infekcijama (virusa, bakterija, gljivica i protozoa) na koje bi zdrava osoba bila otpor na. Ljudi s AIDS tako|er ~esto obolijevaju od odre|enih vrsta tumora, posebice limfoma i Kaposijeva sarkoma, no za najve}i dio smrtnosti ipak su odgovor ne oportunisti~ke infekcije. infekcije i tumori koji predstavljaju klini~ku manifestaciju AIDS. time se podrazumijeva pridràvanje pravila sigurnog seksa, te izbjegavanje izmjenjivanja igala za intravenoznu primjenu droga. Otkri}e HIV virusa kao uzro~nika AIDS otvorilo je nove mogu}nosti prevencije i tretmana. Aktivno se radi na razvoju cjepiva koje bi onemogu}ilo infekciju HIV, no tome zna~ajnu prepreku predstavljaju neka biolo{ka svojstva HIV virusa. Alter nativni pristup su lijekovi koji onemogu}uju replikaciju virusa na taj na~in da inhibiraju reverznu transkriptazu ili proteazu HIV. Kombinacije takvih lijekova danas mogu produljiti ìvot oboljelih, no nu`no je potreban daljnji rad na razvoju novih lijekova koji }e biti ne samo u~inkovitiji, ve} i jeftiniji i prakti~niji za primjenu u zemljama u razvoju.
Do danas je jedini na~in prevencije AIDS izbjegavanje infekcije HIV. HIV je vrlo krhki virus koji izvan tijela brzo gubi infektivnost, te stoga ne moè biti prenesen uobi~ajenim kontaktom s inficiranom osobom. Tri su na~ina na koji se prenosi: spolnim kontaktom, kontaminiranim derivatima kr vi i s majke na dijete tijekom trudno}e ili dojenja. Nakon otkri}a HIV razvijeni su testovi koji su osigurali da faktori zgru{avanja i zaliha kr vi koji se koriste za transfuziju budu bezopasni za primatelje. Prevencija infekcije HIV ostalim na~inima trenutno ovisi o osobnom anga`manu na minimalizaciji rizika infekcije. Pod

AIDS je uzrokovan retrovirusom (virus humane imunodeficijencije, HIV, engl. human imunodeficiency virus) {to su ga 1983. godine otkrili istraìva~ki timovi Roberta Galloa i Luca Montagniera. HIV primar no inficira specifi~nu skupinu limfocita (T4 limfocite) koji su potrebni za nor malni imunoodgovor. Za razliku od brojnih drugih retrovirusa, kao {to je primjerice Rousov sarkomski virus, HIV ne uzrokuje transfor maciju inficiranih stanica u tumorske stanice. Umjesto toga, HIV vremenom ubija stanicu u kojoj se replicira {to rezultira smanjenjem broja T4 limfocita, te krahom imunoodgovora inficiranih osoba. Posljedica nedostatnog imunoodgovora su oportunisti~ke
Pretra`na elektronska mikrofotografija HIV virusa koji pupa iz T limfocita (Cecil Fox/Photo Researches, Inc)
rezom, metodom koja razdvaja molekule na osnovi razlika u brzini kojom putuju u elektri~nom polju. Gel, koji je naj~e{}e na~injen od agaroze ili poliakrilamida, smje{ta se izme|u dvaju rezervoara s puferom u kojima se nalaze elektrode. Zatim se uzorak (primjerice smjesa fragmenata DNA koje treba analizirati) pipetom unosi u prethodno napravljene bunari}e u gelu i uklju~uje se elektri~no polje. Nukleinske kiseline su negativno nabijene
106
Poglavlje 3
Slika 3-14. Razgradnja DNA enzimom EcoRI i gel-elektroforeza.
Enzim EcoRI kida DNA na pet mjesta (strjelice) ~ime nastaje {est fragmenata. Ti se fragmenti razdvajaju elektroforezom u agaroznom gelu. Fragmenti DNA putuju prema pozitivnoj elektrodi s tim da se manji fragmenti kre}u brè, a ve}i sporije. Nakon elektroforeze, DNA se boji fluorescentnom bojom i fotografira. Prikazana je veli~ina fragmenata DNA.
DNA razgradnja enzimom EcoRI 21,2 kb 7,5 kb 5,7 kb 5,6 kb 4,9 kb 3,6 kb gel-elektroforeza
48,5 kb
() elektroda
21,2 kb
putovanje DNA
7,5 kb 5,7 kb 5,6 kb 4,9 kb 3,6 kb
(+) elektroda fotografija gela
(zbog fosfata u njihovim okosnicama) te stoga putuju prema pozitivnoj elektrodi (anodi). Gel djeluje kao sito koje selektivno usporava ve}e molekule. Manje molekule se stoga kroz gel kre}u brè {to omogu}uje da se molekule u smjesi razdvoje na osnovi razlika u veli~ini. Razli~itim metodama mogu}e je utvrditi redoslijed restrikcijskih fragmenata i dobiti (primjerice) kartu EcoRI restrikcijskih mjesta u DNA l faga. Utvr|eni poloàji restrikcijskih mjesta za brojne razli~ite restrikcijske endonukleaze mogu se iskoristiti za stvaranje detaljnih restrikcijskih karata molekula DNA kao {to su primjerice genomi virusa (slika 3-15). Osim toga, nakon elektroforeze mogu}e je izolirati pojedine fragmente nastale razgradnjom restrikcijskim-endonukleazama {to omogu}uje njihovo detaljno ispitivanje, primjerice odre|ivanje slijeda nukleotida u molekuli DNA. Na taj je na~in karakterizirana DNA brojnih virusa. Sama razgradnja restrikcijskim-endonukleazama me|utim nema dovoljno razlu~ivanje za analizu ve}ih molekula DNA, kao {to su primjerice stani~ni genomi. Restrikcijska-endonukleaza s mjestom prepoznavanja od {est parova baza (kao {to je primjerice EcoRI) statisti~ki }e gledano prepoznati jedno mjesto svakih 4.096 parova baza (1/46). Stoga se moè o~ekivati da }e razgradnjom molekule veli~ine l DNA (48,5 kb) nastati oko deset EcoRI fragmenata {to je u skladu s rezultatom prikazanim na slici 3-14. Me-
107
Slika 3-15. Restrikcijske karte DNA bakteriofaga i adenovirusa.

l BamHI EcoRI HindIII
Poloàj mjesta kidanja DNA bakteriofaga E. coli (48,5 kb) i humanog adenovirusa 2 (35,9 kb) enzimima BamHI, EcoRI i HindIII.
adenovirus
|utim razgradnja ve}ih genoma restrikcijskim-endonukleazama daje zna~ajno druga~ije rezultate. Primjerice genom ~ovjeka sastoji se od pribli`no 3 106 kb i stoga se moè o~ekivati da }emo restrikcijskom razgradnjom dobiti vi{e od 500.000 EcoRI fragmenata. Tako velik broj fragmenata nije mogu}e razdvojiti, te agarozna gel-elektroforeza genoma ~ovjeka razgra|enog restrikcijskom endonukleazom EcoRI umjesto razdvojenih fragmenata daje samo kontinuirani razmaz DNA. Kako nije mogu}e izolirati pojedine restrikcijske fragmente iz takve smjese, sama razgradnja restrikcijskim nukleazama nije odgovaraju}a metoda za pripravu homogenog uzorka DNA za daljnju analizu. Veliku koli~inu pro~i{}enih fragmenata DNA mogu}e je pripraviti molekularnim kloniranjem.
fragment humane DNA
vektor
spajanje fragmenta humane DNA i vektora rekombinantna molekula
Proizvodnja rekombinantnih molekula DNA

Temeljna je strategija molekularnoga kloniranja unijeti fragment DNA koji nas zanima (primjerice komadi} DNA ~ovjeka) u neku drugu molekulu DNA (zovemo je vektor) koja se moè samostalno umnaàti u stanici doma}inu. Tako nastala hibridna (rekombinantna) molekula ili molekularni klon sastoji se od ugra|enoga èljenog fragmenta DNA povezanoga s DNA vektora. Omogu}imo li takvom vektoru da se umnoì u odgovaraju}em doma}inu dobit }emo velik broj kopija ugra|enoga fragmenta DNA. Primjerice fragment DNA ~ovjeka mogu}e je ugraditi u l vektor (slika 316). Takve rekombinantne molekule tada je mogu}e unijeti u bakteriju E. coli gdje se one u~inkovito razmnoàvaju, a milijuni novih bakteriofaga l sadràvat }e milijune kopija ugra|enoga èljenog fragmenta humane DNA. Dok na{ èljeni fragment predstavlja mo`da jednu stotisu}inku genoma ~ovjeka, nakon ugradnje u l vektor on ~ini pribli`no jednu desetinu DNA vektora. Taj je fragment sada lako razdvojiti od ostatka DNA vektora razgradnjom restrikcijskim endonukleazama i gel-elektroforezom. Rezultat je velik broj kopija homogenoga pro~i{}enog fragmenta humane DNA koji moèmo analizirati i njime dalje rukovati. Fragmente DNA kojima se koristimo za stvaranje rekombinantnih molekula obi~no pripravljamo razgradnjom restrikcijskim endonukleazama. Mnogi od tih enzima kidaju u mjestu prepoznavanja tako da ostavljaju nazubljene (ljepljive) krajeve jednolan~ane DNA koji se me|usobno mogu povezati komplementarnim sparivanjem baza (slika 3-17). Vezu izme|u tih krajeva povezanih komplementarnim sparivanjem baza mogu}e je u~vrstiti tretmanom s DNA-ligazom, enzimom koji zatvara prekide u lancima DNA (vidi 5. poglavlje). Na taj je na~in mogu}e u rekombinantnu molekulu DNA povezati dva razli~ita fragmenta DNA (primjerice fragment DNA ~ovjeka i DNA l vektora) pripravljena razgradnjom s pomo}u iste restrikcijske endonukleaze. Fragmenti DNA koje moèmo klonirati ne moraju nu`no zavr{avati odgovaraju}im slijedom nukleotida koji prepoznaju restrikcijske endonukleaze). Naime, na tupe krajeve bilo kojeg fragmenta DNA mogu}e je dodati sinteti~ke DNA-spojnice koje sadràvaju mjesta prepoznavanja za velik broj razli~itih restrikcijskih endonukleaza. Te su spojnice kratki oligonukleo-
uno{enje u E. coli
replikacija DNA
bakteriofagi koji sadràvaju proizvedenu rekombinantnu DNA
Slika 3-16. Proizvodnja rekombinantnih molekula DNA.

Fragment humane DNA ugra|en je u DNA vektora. Takva rekombinantna molekula zatim se unosi u E. coli gdje se umnoàva i stvara rekombinantno potomstvo bakteriofaga koje sadràva umetnuti fragment humane DNA.
108
Poglavlje 3
Slika 3-17. Povezivanje molekula DNA.

Vektor i fragment DNA koji treba ugraditi razgra|uju se istom restrikcijskomendonukleazom (primjerice EcoRI) koja kida DNA ostavljaju}i produène jednolan~ane ljepljive krajeve. DNA vektora i fragmenta koji se ugra|uje prvo se povezuju komplementarnim sparivanjem baza, a zatim djelovanjem DNAligaze nastaju kovalentne veze koje stabiliziraju rekombinantnu molekulu.
fragment DNA koji se ugra|uje EcoRI 5' G A C 3' EcoRI kidanje pomo}u EcoRI T A T T A T C 3'
DNA vektora EcoRI 5' G A C 5' 3' EcoRI kidanje pomo}u EcoRI T A T T A T C 3'
A G
A G 5'
5' G C 3'
3'
Kidanjem s pomo}u EcoRI nastaju ljepljivi krajevi jednolan~ane DNA. T A A 5'
5' A A T T C G 3'
3'
5'
komplementarno sparivanje baza
5' G A C 3' mRNA povezivanje DNA-ligazom 5' G A rekombinanta molekula C cDNA kopije molekule RNA pripravljaju se obrnutim prepisivanjem s pomo}u enzima reverzne transkriptaze cDNA Oligonukleotidne spojnice koje sadràvaju mjesta prepoznavanja za restrikcijskeendonukleaze dodaju se na krajeve cDNA. 3' T T A A G A T T C T A T T A T C
3'
A G 5'
3'
5'
tidi koje je lako pripraviti kemijskom sintezom, a omogu}uju da se prakti~no bilo koji fragment DNA pripremi za ugradnju u vektor. Osim molekula DNA mogu}e je klonirati i molekule RNA (slika 3-18). Prvi je korak u tom procesu pripraviti DNA kopiju molekule RNA koriste}i enzim reverznu transkriptazu. Tako proizvedenu molekulu DNA (nazivamo je cDNA jer je komplementarna molekuli RNA koju smo koristili kao kalup) mogu}e je ugraditi u vektor na ve} opisani na~in. Budu}i da su eukariotski geni naj~e{}e isprekidani nekodiraju}im redoslijedima (intronima, vidi 4. poglavlje) koji se prekrajanjem (engl. splicing) uklanjaju iz mRNA, mogu}nost kloniranja i cDNA i genomske DNA bila je klju~na za razumijevanje strukture i funkcije gena
cDNA se ugra|uje u odgovaraju}i vektor. cDNA klon
Vektori za rekombinantnu DNA

Ovisno o veli~ini fragmenta DNA koji èlimo ugraditi i svrsi eksperimenta koji planiramo, za pripravu rekombinantnih molekula na raspolaganju nam je vi{e razli~itih tipova vektora za kloniranje. Prema namjeni ih moèmo podijeliti na tri osnovna sustava: vektore za izolaciju i umnaànje klonirane DNA, vektore za ekspresiju klonirane DNA i vektore za unos rekombinantnih molekula DNA u eukariotske stanice.
Slika 3-18. Kloniranje cDNA.
109
fragmenti DNA ~ovjeka cos l vektor EcoRI cos
Slika 3-19. Kloniranje u vektorima bakteriofaga .

Vektor sadràva restrikcijsko mjesto (primjerice mjesto prepoznavanja EcoRI) za ugradnju klonirane DNA. Osim toga, na oba kraja DNA vektora nalaze se cos mjesta (kohezivni krajevi) koji su potrebni za ugradnju DNA u ~estice faga. Umetak DNA (primjerice humane DNA) spaja se s vektorom, a takva se rekombinantna DNA ugra|uje u ~estice faga mije{anjem s proteinima bakteriofaga. Takvim se rekombinantnim bakteriofagima zatim inficira E. coli. Svaki rekombinantni fag nosi po jedan specifi~ni umetak klonirane DNA i tvori odvojeni plak na bakterijskoj kulturi. Iz takvog je pojedinog plaka mogu}e izolirati i u velikoj koli~ini umnoìti potomstvo faga koje sadràva kopije umetnute molekule DNA.
razgradnja pomo}u EcoRI i ligacija
cos
cos
pakiranje u ~estice faga rekombinantni fagi
inficiranje bakterije E. coli
bakterijska livada plak faga
svaki rekombinantni fag tvori odvojeni plak
Vektori izvedeni iz bakteriofaga l ~esto se koriste za po~etnu izolaciju genomske DNA ili cDNA iz eukariotskih stanica (slika 3-19). Iz l vektora za kloniranje uklonjeni su dijelovi genoma bakteriofaga koji nisu nu`ni za umnaànje virusa, a zamijenjeni su s jedinstvenim restrikcijskim mjestima za ugradnju klonirane DNA. Veli~ina fragmenta DNA koji je mogu}e ugraditi u takve vektore ograni~ena je na pribli`no 15 kb zbog nu`nosti pakiranja takvog rekombinantnoga genoma u ~estice faga. @elimo li primjerice izolirati genomske klonove DNA ~ovjeka, spojit }emo nasumi~ne fragmente prosje~ne veli~ine oko 15 kb s krajevima l vektora. Takvu rekombinantnu DNA mogu}e je u~inkovito ugraditi u ~estice faga mije{aju}i je s l proteinima (koje nazivamo ekstrakti za pakiranje) in vitro. S takvim ~esticama faga zatim inficiramo kulture E. coli. Budu}i da svaka ~estica faga stvara odvojeni plak, mogu}e je izolirati rekombinantne molekule koje sadràvaju samo jedan specifi~ni fragment DNA ~ovjeka. Rekombinantne vektore koji sadràvaju specifi~ni gen koji nas zanima mogu}e je identificirati hibridizacijom nukleinskih kiselina ili nekim drugim metodama pretraìvanja (opisano u nastavku ovoga poglavlja). Plazmidni vektori (slika 3-20) omogu}uju lak{e rukovanje kloniranim molekulama DNA od bakteriofagnih vektora. Plazmidi su male kru`ne molekule DNA koje u bakterijskim stanicama postoje kao slobodne molekule
110
Poglavlje 3
fragmenti DNA za ugradnju umetak strane DNA
EcoRI
razgradnja s EcoRI i ligacija
rekombinantni plazmid Ampr
ori plazmidni vektor
Ampr
transformacija E. coli s rekombinantnim plazmidima
ori
Slika 3-20. Kloniranje u plazmidne vektore.

Vektor je mala kru`na molekula koja ima ishodi{te replikacije (ori), gen koji nosi rezistenciju na ampicilin (Ampr) i restrikcijsko mjesto (primjerice EcoRI) u koje je mogu}e ugraditi stranu DNA. Fragment strane DNA ugra|uje se u vektor i rekombinantnim se plazmidima transformira bakterija E. coli. Bakterije se nasa|uju na medij koji sadràva ampicilin na kojem kolonije stvaraju samo one bakterije koje sadràvaju plazmidnu DNA zbog koje su postale rezistentne na ampicilin. Klonove bakterija koji sadràvaju pojedine plazmide mogu}e je izolirati i umnoìti u velikoj koli~ini radi izolacije rekombinantnih plazmida.
medij koji sadràva ampicilin
nasa|ivanje bakterija na medij s ampicilinom
kolonije bakterija koje su rezistentne na ampicilin
izolacija pojedina~ne kolonije
E. coli DNA bakterija koja sadràva rekombinantni plazmid
(nisu integrirane u bakterijski kromosom) te se umnoàvaju neovisno o kromosomskoj DNA. Sve {to je potrebno imati u plazmidnoj DNA je ishodi{te replikacije (slijed nukleotida koji DNA-polimerazu stanice doma}ina upu}uje da replicira stranu molekulu DNA). Osim ishodi{ta replikacije, plazmidni vektori sadràva gene za rezistenciju na antibiotike (primjerice rezistenciju na ampicilin) koji omogu}uju odabir bakterija s rekombinantnim plazmidom. Veli~ina plazmidnih vektora obi~no je izme|u 2 i 4 kb DNA, {to je zna~ajno manje od veli~ine DNA l vektora (30 do 45 kb) i stoga olak{ava analizu ugra|enoga fragmenta DNA.
111
Da bi se odre|eni fragment DNA klonirao u plazmidni vektor on se najprije mora ugraditi u odgovaraju}e restrikcijsko mjesto na tom vektoru, a zatim se tako nastalom rekombiniranom molekulom transformira bakterija E. coli. Zatim se odabiru kolonije koje su rezistentne na antibiotik, jer one sadràvaju plazmidnu DNA. Bakterije u kojima se nalaze plazmidi mogu}e je sad umnoìti u èljenim koli~inama i iz njih izolirati DNA. Male kru`ne molekule plazmidne DNA, kojih ~esto ima vi{e stotina u svakoj stanici, mogu}e je razdvojiti od kromosomske DNA bakterija. Rezultat je pro~i{}ena plazmidna DNA koja je prikladna za daljnju analizu ugra|enoga fragmenta DNA. Brojne analize genomske DNA zahtijevaju kloniranje fragmenata DNA ve}ih no {to ih mogu prihvatiti l vektori. Za tu se namjenu koriste pet glavnih tipova vektora (tabl. 3-3). Kozmidni vektori mogu prihvatiti umetke veli~ine oko 45 kb. Ovi vektori sadràvaju DNA bakteriofaga l koja omogu}uje u~inkovitu ugradnju klonirane DNA u ~estice faga. Kozmidni vektori sadràvaju i ishodi{te replikacije i gene za rezistenciju na antibiotike svojstvene plazmidima, pa se mogu replicirati kao plazmidi u bakterijskim stanicama. Druga dva tipa vektora izvedena su pak iz bakteriofaga P1 i mogu prihvatiti fragmente DNA veli~ine od 70 do 100 kb. Sadràvaju sljedove nukleotida koje omogu}uju in vitro ugradnju rekombinantne DNA u ~estice P1 faga, a u bakteriji E. coli se mogu neovisno replicirati poput plazmida. Takozvani P1 umjetni kromosomi (PAC engl. P1 artificial chromosome) tako|er sadràvaju sljedove bakteriofaga P1, ali se u bakteriju E. coli unose izravno kao plazmidi, a prihva}aju fragmente DNA veli~ine od 130 do 150 kb. Bakterijski umjetni kromosomi (BAC engl. bacterial artificial chromosome) su vektori izvedeni iz prirodnog plazmida koji nalazimo u E. coli (nazivamo ga F faktor). Ishodi{te replikacije i ostali redoslijedi F faktora omogu}uju da se BAC replicira kao stabilni plazmid ~ak i uz umetke od 120 do 300 kb. Jo{ ve}e fragmente DNA (250 400 kb) mogu}e je klonirati u vektoru koji nazivamo kva{~ev umjetni kromosom (YAC engl. yeast artificial chromosome). Ti vektori sadràvaju ishodi{te replikacije kvasca i neke druge elemente (centromere i telomere, vidi 4. poglavlje) koji im omogu}uju da se repliciraju u stanicama kvasca kao linearne molekule sli~ne kromosomima.
Sekvenciranje DNA
Molekularno kloniranje omogu}uje izolaciju pojedina~nih fragmenata DNA u koli~inama koje su prikladne za detaljnu karakterizaciju i odre|ivanje slijeda nukleotida. Odre|ivanje slijeda nukleotida brojnih gena otkrilo je strukture njihovih proteinskih produkata, a razjasnilo je i svojstva sljedova DNA koji reguliraju njihovu ekspresiju. [tovi{e, slijed nukleotida u kodiraju}im regijama novih gena ~esto je srodan slijedu nukleotida u nekim ve} otprije poznatim genima pa je funkciju novootkrivenih gena ~esto mogu}e prepoznati na osnovi sli~nosti u sljedovima nukleotida. Suvremene metode sekvenciranja DNA su brze i to~ne pa je danas odre|ivanje slijeda nukleotida DNA od nekoliko kilobaza razmjerno jednostaTablica 3-3. Vektori za kloniranje velikih fragmenata DNA
Vektor
Kozmidi Bakteriofag P1 P1 umjetni kromosomi (PAC) Bakterijski umjetni kromosomi (BAC) Kva{~ev umjetni kromosom (YAC)
Veli~ina fragmenta (kb)

3045 70100 130150 120300 250400
Stanica doma}in
E. coli E. coli E. coli E. coli kvasac
112
Poglavlje 3
3'
T G A T
C G C
T G T
C A
5'
5' radioaktivna po~etnica
3' sinteza DNA u prisutnosti dideoksinukleotida koji zaustavljaju sintezu
ddG
ddA
ddC
ddT
T G C G A
A C
A G
T G C G A
A C A
A C
T G C G A
A C
T G C G A
A C A G T
T G C G
T G C G A
T G C
T G
T G C G A
P P P O
5' C
elektroforeza autoradiografija G O H
3'
T T G A C A A G C G
baza H
2'
putovanje fragmenata
2', 3' dideoksinukleotid
slijed nukleotida u komplementarnom lancu
Slika 3-21. Sekvenciranje DNA Sangerovom metodom.

Dideoksinukleotidi kojima nedostaje OH skupina i na 3' i na 2' poloàju deoksiriboze koriste se za prekidanja sinteze DNA na specifi~nim bazama. Te se molekule normalno ugra|uju u rastu}e lance DNA. Budu}i da im nedostaje 3' OH skupina, na njih nije mogu}e povezati sljede}i nukleotid pa na tom mjestu prestaje daljnja sinteza DNA. Sinteza DNA zapo~inje radioaktivno obiljeènom po~etnicom. Provode se ~etiri neovisne reakcije od kojih svaka osim ~etiri normalna deoksinukleotida sadràva i manju koli~inu jednog od dideoksinukleotida. Svaka od ~etiriju reakcija rezultirat }e serijom molekula DNA koje zapo~inju radioaktivno obiljeènom po~etnicom, a zavr{avaju dideoksinukleotidom ugra|enim na mjesto odre|ene nor malne baze. Produkti reakcija tada se razdvoje elektroforezom i analiziraju autoradiografijom kako bi se odredio slijed nukleotida.
van zadatak. Stoga je neusporedivo jednostavnije klonirati i sekvencirati DNA nego {to je odrediti slijed aminokiselina u proteinu {to ga taj gen kodira. Budu}i da slijed nukleotida u genu moèmo izravno prevesti u slijed aminokiselina u proteinu, najlak{i na~in odre|ivanja primarne strukture proteina je sekvenciranje kloniranoga gena ili cDNA. Naj~e{}a metoda za sekvenciranje DNA zasniva se na preuranjenom prestanku sinteze DNA zbog ugradnje dideoksinukleotida (koji nemaju 3' OH skupinu na deoksiribozi) koji prekidaju sintezu DNA lanca DNA-polimerazom (slika 3-21). Sinteza DNA zapo~inje po~etnicom koja je na jednom kraju obiljeèna radioizotopom. Provode se ~etiri neovisne reakcije od kojih svaka osim normalnih nukleotida sadràva i po jedan od dideoksinukleotida (A, C, G ili T). Ugradnja dideoksinukleotida zaustavlja sintezu DNA jer je 3' OH skupina nu`na za vezanje sljede}eg nukleotida. Na taj na~in nastaje serija obiljeènih molekula DNA koje sve zavr{avaju bazom koja odgovara dideoksinukleotidu kori{tenom u toj reakciji. Ti se fragmenti DNA zatim razdvajaju prema veli~ini gel-elektroforezom i detektiraju izlaganjem gela filmu osjetljivom na X-zrake (autoradiografija). Veli~ina svakog fragmenta odre|ena je poloàjem na koji se ugradio dideoksinukleotid, stoga slijed nukleotida u DNA odgovara redoslijedu fragmenata koji pro~itamo s gela.
113
jednolan~ana DNA koju treba sekvencirati 3'
T G A
C G C
T G T
C A
5'
reakcija sekvenciranja koristi po~etnice obiljeène razli~itim fluorescentnim biljezima za svaki dideoksinukleotid
ddG
ddA
ddC
ddT
T G A
C G C
T G T
C A
T G A
C G C
T G T
C A
C G C
T G T
C A
T G A
C G C
T G T
C A
A C
A C
A C
A C
spojiti produkte elektroforeza
putovanje fragmenata
fotomultiplikator
laserska zraka
fluorescencija ra~unalo
Slika 3-22. Automatizirano sekvenciranje DNA.

Provode se ~etiri odvojene reakcije sekvenciranja od kojih svaka sadrì po~etnicu obiljeènu specifi~nim fluorescentnim biljegom i jedan od dideoksinukleotida koji }e prekinuti sintezu lanca DNA. Reakcijski produkti se tada mije{aju i analiziraju gel-elektroforezom. Kako lanci DNA putuju kroz gel, nailaze na lasersku zraku koja pobu|uje fluorescentni biljeg. Emitiranu fluorescentnu svjetlost detektira fotomultiplikator povezan s ra~unalom koje prikuplja i analizira podatke.
Sekvenciranje DNA ~esto se izvodi i pomo}u automatiziranih sustava koji koriste fluorescentno obiljeène po~etnice u reakciji ugradnje dideoksinukleotida (slika 3-22). Novosintetizirani lanci DNA izlaze iz gela za elektroforezu i prolaze kroz lasersku zraku koja pobu|uje fluorescentni biljeg. Emitiranu svjetlost od~itava fotomultiplikator, a ra~unalo prikuplja i analizira podatke. Takva automatizacija jako je ubrzala sekvenciranje {to je bilo potrebno za odre|ivanje slijeda nukleotida cjelokupnoga genoma ~ovjeka, kao i genoma brojnih bakterija, gljivica, vrsta poput Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, te mi{a.
Ekspresija kloniranih gena

Osim odre|ivanja slijeda nukleotida pojedinoga gena, te stoga i slijeda aminokiselina u njegovom proteinskom produktu, molekularno kloniranje je omogu}ilo pripravu velikih koli~ina proteina za strukturna i funkcionalna ispitivanja. Ve}ina proteina prisutna je u vrlo malim koli~inama u eukariotskim stanicama, stoga je konvencionalnim biokemijskim metodama nemogu}e pripraviti ve}e koli~ine tih proteina. Me|utim, kad jednom imamo klonirani gen, taj problem moèmo rije{iti koriste}i posebno dizajnirane vektore koji omogu}uju sna`nu ekspresiju kloniranoga gena u bakterijskim ili eukariotskim stanicama.
114
Poglavlje 3
Slika 3-23. Ekspresija kloniranih gena u bakterijama.

Ekspresijski vektori sadràva promotore (pro), koji poti~u prevo|enje umetnutog fragmenta DNA, te redoslijede potrebne za vezanje mRNA na bakterijske ribosome (ShineDelgarnov [SD] slijed). Eukariotska cDNA umetnuta pokraj tih sljedova u~inkovito se eksprimira u E. coli {to rezultira proizvodnjom eukariotskih proteina u transformiranim bakterijama.
bakterijski promotor i slijed za vezanje ribosoma pro SD mjesto za kloniranje
Ampr
ekspresijski vektor
ori ugradnja eukariotske DNA pro
SD cDNA umetak
Ampr
ori transformacija E. coli
proizvodnja eukariotskog proteina
mRNA protein
Da bismo eksprimirali eukariotski gen u E. coli, èljenu cDNA kloniramo u plazmidni ili fagni vektor (nazivamo ga ekspresijski vektor). Vektor sadràva sljedove koje poti~u prepisivanje i prevo|enje umetnutoga gena u bakterijskim stanicama (slika 3-22). Klonirani gen ~esto moè biti tako jako eksprimiran da njegov proteinski produkt predstavlja i do 10% ukupnih proteina bakterije. Nakon toga je pro~i{}avanje proteina kodiranoga kloniranim genom u koli~inama potrebnim za detaljna biokemijska ili strukturna ispitivanja jednostavan zadatak. êsto je potrebno klonirani gen eksprimirati u eukariotskim stanicama umjesto u bakterijama. Taj oblik ekspresije vaàn je da bismo, primjerice, osigurali normalno odvijanje posttranslacijskih modifikacija proteina (kao {to su dodatak ugljikohidrata ili lipida). Sinteza stranih proteina u eukariotskim stanicama postiè se (analogno postupku s E. coli) ugradnjom kloniranoga gena u vektor (obi~no izveden od virusa) koji omogu}uje visoku razi-
115
nu ekspresije toga gena. Sustav koji se ~esto koristi za proizvodnju rekombinantnih proteina u eukariotskim stanicama je infekcija stanica insekata bakulovirusnim vektorima koji omogu}uju visoku razinu ekspresije gena umetnutih na mjesto gena za strukturne proteine virusa. Visoku razinu ekspresije kloniranih gena mogu}e je posti}i i u stanicama sisavaca pomo}u odgovaraju}ih vektora. Tako|er je prakti~no klonirani gen eksprimirati u kvascu zbog mogu}nosti primjene jednostavnih metoda genetike kvasca za ispitivanje interakcija kloniranog proteina s drugim proteinima ili specifi~nim sljedovima DNA.
Umnoàvanje DNA lan~anom reakcijom polimeraze

Molekularno kloniranje omogu}uje pripravu velikih koli~ina specifi~nih fragmenata DNA umnoàvanjem i izolacijom iz bakterija. Alternativni pristup za pripravu velike koli~ine neke molekule DNA je lan~ana reakcija polimeraze (PCR, engl. polymerase chain reaction), koju je 1988. godine razvio Kary Mullis. Ako je poznat dio slijeda nukleotida u nekoj molekuli DNA, lan~anom reakcijom polimeraze mogu}e je u potpunosti in vitro pripraviti goleme koli~ine te molekule. Osnova metode je opetovano umnaànje odre|enog segmenta DNA s pomo}u DNA-polimeraze. Broj molekula DNA dvostruko je ve}i nakon svakoga kruga umnaànja i pove}ava se eksponencijalno, te je iz maloga broja kopija molekula kalupa koje su prisutne na po~etku reakcije mogu}e pripraviti veliku koli~inu DNA. Primjerice, iz jedne }e molekule DNA nakon 30 ciklusa umnaànja teorijski nastati 230 (pribli`no milijardu) identi~nih kopija. To zna~i da je jednu jedinu molekulu DNA mogu}e umnoìti do koli~ine koja je potrebna za molekularno kloniranje, analizu razgradnjom restrikcijskim-endonukleazama, ili odre|ivanje slijeda nukleotida. Osnova metode za umnaànje DNA lan~anom reakcijom polimeraze prikazana je na slici 3-24. Po~etni materijal moè biti klonirani fragment DNA ili pak smjesa razli~itih molekula DNA, primjerice ukupni ekstrakt DNA stanica ~ovjeka. Da bismo mogli umnoìti èljeni segment DNA moramo poznavati slijed nukleotida koji ga okruùju kako bismo mogli kreirati specifi~ne po~etnice koje }e zapo~eti sintezu DNA na èljenim mjestima. Te po~etnice su naj~e{}e kemijski sintetizirane molekule DNA duljine od 15 do 20 nukleotida. Koriste se dvije po~etnice koje }e zapo~eti sintezu u suprotnim smjerovima na dva komplementarna lanca DNA. Reakcija zapo~inje zagrijavanjem kalupa na visoku temperaturu (primjerice 95 C) da bi se razdvojila dva lanca DNA. Temperatura se tada snizuje kako bi se omogu}ilo po~etnicama da se specifi~no poveù s komplementarnim sljedovima na lancima kalupa. DNA-polimeraza tada sintetizira lanac DNA komplementaran kalupu po~ev{i od specifi~no povezanih po~etnica. U jednom ciklusu umnoàvanja iz svake molekule kalupa nastaju po dvije nove identi~ne molekule DNA. Ovaj je proces mogu}e ponoviti velik broj puta, a u svakom }e se ciklusu broj molekula DNA udvostru~iti. Vi{estruki uzastopni ciklusi grijanja i hla|enja, koji su sastavni dio lan~ane reakcije polimeraze, provode se u posebnim termoblokovima koje je mogu}e programirati, a nazivamo ih termocikleri. Enzimi koje koristimo u lan~anoj reakciji polimeraze su stabilni i na visokim temperaturama kojima razdvajamo lance molekule DNA. Naime, ovi su termostabilni enzimi izolirani iz bakterija poput Thermus aquaticus koje ìve u termalnim izvorima na temperaturama od pribli`no 75 C. Takve su polimeraze stabilne i na visokim temperaturama kojima razdvajamo lance dvolan~ane DNA, pa je umnaànje DNA lan~anom reakcijom polimeraze mogu}e jednostavno provesti. Na ovaj je na~in tako|er mogu}e umnoìti molekule RNA prije lan~a-
116
Poglavlje 3
Po~etna DNA 5' C A G T 3'
3' T A T C C G T C C G T G C A zagrijavanje na 95 C razdvajanje lanaca molekule DNA A T T A A T A G C T C G 5'
A G G C A G
5' C A T T C C G T C C G T A T A A G C
3'
G T 3'
A G G C A G
G C A
C G 5'
55 C vezanje po~etnica na lance DNA-kalupa 5' C A T T C C G T C C G T G C A po~etnica 2 5' C A G T 3' 72 C produljenje lanaca s DNA Taq-polimerazom 5'
C A G T T A T C C G T C C G T G C A A T T A A T A G C T C G
3' A T T A A T A G C T C G 5' po~etnica 1
3' 3' C G C A T A T T C G 5'
T A
C C G T
A G G C A G
3'
A G G C A G
5'
C A G T T A T C C G T C C G T G C A A T T A A T A G C T C G A G G C A G
3' 5'
3'
5' 3' dvije nove molekule DNA
dvije nove molekule DNA
itd.
dvije nove molekule DNA
itd.
Slika 3-24. Umnaànje DNA lan~anom reakcijom polimeraze.

Dio DNA koji treba umnoìti ome|en je s dva slijeda nukleotida s kojima zapo~inje sinteza. Po~etnu dvolan~anu DNA zagrijavamo da bismo razdvojili lance, a zatim je hladimo kako bi se po~etnice (naj~e{}e oligonukleotidi od 15 do 20 baza) vezale na svaki od tih lanaca. Po~ev{i od po~etnica, DNA-polimeraza izolirana iz bakterije Thermus aquaticus (Taq-polimeraza) sintetizira nove lance DNA {to dovodi do stvaranja dviju novih dvolan~anih molekula DNA. Ovaj je proces mogu}e vi{estruko ponavljati {to rezultira udvostru~enjem broja molekula DNA nakon svakoga ciklusa.
ne reakcije polimeraze napravimo cDNA kopiju molekule RNA reverznom transkriptazom. Ako je slijed nukleotida nekoga gena poznat u dovoljnoj mjeri da moèmo pripremiti odgovaraju}e po~etnice, lan~ana reakcija polimeraze iznimno je mo}na metoda za pripravu velikih koli~ina DNA iz po~etnog materijala koji moè sadràvati svega nekoliko traènih molekula DNA u smjesi velikog broja razli~itih drugih molekula DNA. Primjerice, ciljane sljedove duljine i do nekoliko kilobaza mogu}e je umnoìti iz ukupne genomske DNA, a jednu jedinu cDNA mogu}e je umnoìti iz ukupne stani~ne RNA. Takve je umnoène dijelove DNA mogu}e dalje obra|ivati ili analizirati, primjerice da bismo otkrili mu-
117
tacije u genu koji nas zanima. Lan~ana reakcija polimeraze stoga zna~ajno pridonosi repertoaru metoda rekombinantne DNA. Njezina je snaga posebice izraèna u dijagnostici nasljednih bolesti, ispitivanju ekspresije gena tijekom razvoja i u sudskoj medicini.
Detekcija nukleinskih kiselina i proteina

Razvoj molekularnoga kloniranja omogu}io je izolaciju i karakterizaciju pojedina~nih gena iz eukariotskih stanica, no za razumijevanje njihove uloge u stanicama bilo je potrebno analizirati i razumjeti brojne procese kao {to su primjerice regulacija ekspresije, ili unutarstani~na organizacija proteina koje oni kodiraju. U ovom }emo poglavlju prikazati temeljne metode koje se danas primjenjuju za detekciju specifi~nih nukleinskih kiselina i proteina. Te su metode va`ne za razli~ita istraìvanja kao {to su, primjerice, kartiranje gena na kromosomima, analiza ekspresije gena i odre|ivanje smje{taja proteina u unutarstani~nim organelima. Iste temeljne metode koriste se i za izolaciju pojedinih gena kao molekularnih klonova.
Smjesa razli~itih dvolan~anih u ukupnoj stani~noj DNA. 95 C denaturacija
Hibridizacija nukleinskih kiselina

Osnova detekcije specifi~nih redoslijeda nukleinskih kiselina je sparivanje baza izme|u komplementarnih niti RNA ili DNA. Pri visokim se temperaturama (90 100 C) komplementarni lanci DNA razdvajaju i nastaju jednolan~ane molekule. Kaèmo da se DNA denaturirala. Ako takve denaturirane molekule DNA inkubiramo na odgovaraju}oj temperaturi (primjerice 65 C), renaturirat }e se u dvolan~ane molekule na osnovi komplementarnog sparivanja baza. Taj proces ponovnog uspostavljanja dvolan~ane strukture nazivamo hibridizacijom nukleinskih kiselina. Hibridne nukleinske kiseline mogu stvoriti dva lanca DNA, dva lanca RNA ili jedan lanac DNA i jedan lanac RNA. Hibridizacija nukleinskih kiselina omogu}uje detekciju molekula DNA ili RNA koje su komplementarne bilo kojoj izoliranoj nukleinskoj kiselini kao {to je primjerice virusni genom ili klonirani gen (slika 3-25). Klonirana DNA je radioaktivno obiljeèna, naj~e{}e time {to je sintetizirana u prisutnosti radioaktivno obiljeènih nukleotida. Takva se radioaktivna DNA tada koristi kao sonda za hibridizaciju s komplementarnim sljedovima DNA ili RNA sljedovima, koje onda detektiramo zahvaljuju}i radioaktivnosti dvolan~anih hibrida. Southern blot (tehnika koju je razvio E. M. Southern) je {iroko rasprostranjena metoda za detekciju specifi~nih gena u stani~noj DNA (slika 326). DNA koju analiziramo razgra|ujemo restrikcijskim-endonukleazama i nastale fragmente DNA razdvajamo gel-elektroforezom. Na gel se tada stavlja nitrocelulozna ili najlonska membrana na koju se prenose (blot) fragmenti DNA. Tako pripravljena replika gela inkubira se s radioaktivnom sondom koja se hibridizira s fragmentima DNA koji sadràvaju komplementarne sljedove nukleotida. Poloàj tih fragmenata postaje vidljiv nakon izlaganja blota filmu osjetljivom na X-zrake. Kad umjesto molekula DNA èlimo detektirati molekule RNA koristimo varijaciju Southern blot metode koju nazivamo Northern blot (ime metode izabrano je prema analogiji s engleskim zna~enjem rije~i south jug; north sjever, o.p.). U ovoj se metodi ukupna stani~na RNA izolira i razdvoji prema veli~ini gel-elektroforezom. Kao i u Southern blotu, RNA se prenosi na membranu i detektira hibridizacijom s radioaktivno obiljeènom sondom. Northern blot se ~esto koristi za analizu ekspresije gena, primjerice, èlimo li utvrditi je li specifi~na mRNA prisutna u razli~itim tipovima stanica.
lanci se razdvajaju
Dodati radioaktivno je komplementarna specifi~nim sljedovima u stani~noj DNA. 65 C renaturacija
Radioaktivna s hibridizira s komplementarnim sljedovima u stani~noj DNA.
Slika 3-25. Detekcija molekula DNA hibridizacijom nukleinskih kiselina.

Hibridizacijom s radioaktivno obiljeènom DNA-sondom mogu}e je detektirati specifi~ne sljedove nukleotida u ukupnoj stani~noj DNA. DNA se denaturira zagrijavanjem na 95 C ~ime dobivamo jednolan~ane molekule. Nakon denaturacije se molekulama DNA dodaje radioaktivno obiljeèna sonda te se takva smjesa molekula inkubira na 65 C. Time se omogu}uje da se specifi~ni sljedovi baza u denaturiranim molekulama DNA spoje sa sljedovima baza u DNA-sondi (hibridizacija molekula DNA) na temelju komplementarnosti. Detekcijom mjesta hibridizacije radioaktivno obiljeène sonde s molekulom DNA detektirali smo specifi~ni slijed DNA u cjelokupnoj stani~noj DNA.
118
DNA
Poglavlje 3
Slika 2-26. Southern blot.

Fragmenti DNA nastali razgradnjom restrikcijskim-endonukleazama razdvoje se gel-elektroforezom, a specifi~ni se fragmenti DNA identificiraju hibridizacijom s odgovaraju}om sondom.
DNA se razgra|uje restrikcijskomendonukleazom.
Nastali se fragmenti razdvajaju prema veli~ini gel-elektroforezom. putovanje
papirnati ru~nici membrana gel spu`va otopina soli film osjetljiv na X-zrake fragmenti DNA Membrana se inkubira s radioaktivnom sondom koja se veè na komplementarne molekule DNA. Sonda vezana na membranu detektira se autoradiografijom, a mjesto vezanja sonde otkriva traène fragmente DNA. DNA se denaturira i prenosi na membranu no{ena otopinom soli koja prolazi kroz gel.
membrana
Umjesto analize jednog po jednog gena {to rade Southern i Northern blot metode, hibridizacija s DNA-mikro~ipovima omogu}uje istovremenu analizu desetina tisu}a gena. Kako cjeloviti genomi eukariota postaju poznati, hibridizacija s DNA-mikro~ipovima pruà znanstvenicima priliku za globalnu analizu sljedova prisutnih u uzorcima stani~ne RNA ili DNA. DNA mikro~ip sastoji se od predmetnog stakalca ili membrane na koju su fragmenti cDNA robotiziranim sustavima utisnuti u velikom broju malih to~aka visoke gusto}e (slika 3-27). U svakoj se to~ki na mikro~ipu nalazi jedan oligonukleotid ili cDNA. Na klasi~no predmetno mikroskopsko stakalce mogu}e je utisnuti vi{e od 100.000 razli~itih oligonukleotida, {to omogu}uje pripravu DNA-mikro~ipova koji pokrivaju cjelokupne genome. Kao {to je prikazano na slici 3-27, DNA-mikro~ipove mogu}e je primijeniti za analizu ekspresije gena, primjerice za uspore|ivanje gena koje eksprimiraju dva razli~ita tipa stanica. U eksperimentima ovog tipa sintetiziraju se cDNA probe od ukupne mRNA koja je eksprimirana u dva tipa stanica (primjerice tumorskim i normalnim stanicama). Te dvije skupine cDNA obiljeùju se razli~itim fluorescentnim bojama (obi~no crvenom i zelenom), pomije{aju i hi-
119
Slika 3-27. DNA mikro~ipovi.

(A) Primjer usporedne analize ekspresije gena u tumorskim i normalnim stanicama. mRNA izolirana iz normalnih i tumorskih stanica koristi se kao kalup za sintezu cDNA sondi koje se zatim obiljeàvaju razli~itim fluorescentnim bojama (primjerice crveni fluorescentni biljeg za tumorske stanice i zeleni za normalne stanice). Dvije razli~ite cDNA sonde tada se mije{aju i hibridiziraju s DNA mikro~ipa. Na mikro~ipu se nalaze to~kice s oligonukleotidima koje predstavljaju 10.000 ili vi{e humanih gena. Relativna ekspresija svakoga gena u tumorskoj stanici u odnosu na njegovu ekspresiju u normalnoj stanici oslikana je omjerom crvene i zelene fluorescencije na odgovaraju}im poloàjima na DNA-mikro~ipu. (B) Fotografija dijela DNA mikro~ipa.
(A)
tumorska stanica
normalna stanica
mRNA
bridiziraju s mikro~ipovima na kojima se nalazi 10.000 ili vi{e humanih gena predstavljenih kao pojedina~ne to~kice. DNA-mikro~ip tada se analizira laserskim ~ita~em visoke rezolucije, a relativni omjeri transkripcije nekoga gena u tumorskim i normalnim stanicama odgovaraju omjeru crvene i zelene fluorescencije na odgovaraju}im to~kicama na DNA-mikro~ipu. Osim u ekstraktima stanica, hibridizacijom nukleinskih kiselina moèmo homologne DNA ili RNA molekule detektirati i na kromosomima ili intaktnim stanicama. Metodu nazivamo hibridizacija in situ, a u njoj radioaktivno ili fluorescentno obiljeènu sondu hibridiziranu na specifi~nim stani~nim ili substani~nim strukturama analiziramo mikroskopom (slika 328). Primjerice obiljeène je sonde mogu}e hibridizirati s intaktnim kromosomima kako bismo odredili podru~ja kromosoma koja sadràvaju gene koji nas interesiraju. Hibridizacijom in situ tako|er moèmo detektirati specifi~ne mRNA u razli~itim tipovima stanica u tkivu.
cDNA
mije{anje i hibridizacija cDN DNA mikro~ip
o~itavanje laserom (B)
Detekcija RNA lan~anom reakcijom polimeraze

Amplifikacija DNA lan~anom reakcijom polimeraze daleko je osjetljivija metoda od detekcije sljedova stani~nih DNA ili RNA Southern ili Northern blot metodom. Dok je za hibridizaciju na blotu potrebno pribli`no 100.000 kopija neke DNA ili RNA molekule, lan~ana reakcija polimeraze moè umnoìti jednu jedinu kopiju DNA (ili RNA nakon obrnutog prepisivanja) do razine koja se moè lako detektirati. Kao {to je ve} opisano, specifi~nost umnoàvanja u lan~anoj reakciji polimeraze postiè se primjenom oligonukleotidnih po~etnica koje se hibridiziraju s komplementarnim sljedovima na molekulama kalupa. Na taj na~in lan~ana reakcija polimeraze moè selektivno umnoìti specifi~nu molekulu DNA u sloènim smjesama kao {to su primjerice ukupna stani~na DNA ili RNA. Zbog toga je lan~anu reakciju polimeraze mogu}e primijeniti za detekciju specifi~ne molekule DNA ili RNA u vrlo malim koli~inama po~etnog materijala, primjerice iz jedne jedine stanice. Ovakva neuobi~ajena osjetljivost omogu}ila je primjenu lan~ane reakcije polimeraze u brojnim podru~jima, uklju~uju}i i analizu ekspresije gena u stanicama koje moèmo pribaviti samo u ograni~enim koli~inama.
Protutijela kao sonde za proteine

Ispitivanje ekspresije i funkcije gena zahtijeva detekciju ne samo DNA i RNA, ve} i specifi~nih proteina. U tim ispitivanjima protutijela preuzimaju ulogu sondi kojima moèmo selektivno reagirati s pojedinim proteinima. Protutijela su proteini koje proizvode stanice imunosustava (B-limfociti) koSlika 3-28. Fluorescentna in situ hibridizacija.
In situ hibridizacija fluorescentno obiljeènih sondi na kromosome ~ovjeka. Svaki od 24 kromosoma obiljeèn je razli~itom bojom jer za svaki humani kromosom postoji specifi~na sonda. (Ljubazno{}u Thomasa Reida i Heseda Padilla-Nasha, National Cancer Institute, SAD)
120
Poglavlje 3
smjesa proteina gel-elektroforeza (SDS-PAGE)
putovanje
prijenos na membranu
vrpce proteina
protutijela
inkubacija membrane s protutijelima koja prepoznaju èljeni protein
protutijelo vezano na specifi~ni protein
detekcija vezanih protutijela radioaktivno{}u ili specifi~nim bojenjem
je reagiraju protiv molekula (antigena) koje organizam doma}ina prepoznaje kao strane, primjerice proteinski omota~ virusa. Imunosustav kralje`njaka sposoban je stvoriti milijune razli~itih protutijela od kojih svako prepoznaje jedinstveni antigen (protein, ugljikohidrat ili neku drugu molekulu koja nije prirodnog podrijetla). Jedan limfocit proizvodi samo jedan tip protutijela, no zbog programiranog preure|ivanja gena tijekom razvoja imunosustava, geni koji kodiraju protutijela razlikuju se od limfocita do limfocita (vidi 5. poglavlje). Ove varijacije rezultiraju velikim brojem razli~itih protutijela koja proizvode razli~iti limfociti programirani da odgovore na razli~ite antigene. Proizvodnju protutijela mogu}e je potaknuti imunizacijom ìvotinje nekim stranim proteinom. Primjerice, protutijela koja prepoznaju proteine ~ovjeka ~esto se proizvode u kuni}u. U serumima takvih ìvotinja nalaze se smjese protutijela (koja proizvode razli~iti limfociti) koja reagiraju s razli~itim dijelovima molekule antigena kojim je ìvotinja imunizirana. Pojedina~na protutijela (monoklonska protutijela) mogu}e je proizvesti uzgajaju}i u kulturi klonalne linije B-limfocita izoliranih iz imuniziranih ìvotinja (naj~e{}e mi{a). Kako je svaki limfocit programiran da proizvodi samo jedno protutijelo, klonalne linije limfocita proizvode monoklonska protutijela koja sva prepoznaju istu antigenu determinantu, te su stoga vrlo specifi~no imunolo{ko oru|e. Iako se naj~e{}e proizvode protutijela koja prepoznaju proteine pro~i{}ene iz stanica, mogu}i su i neki drugi oblici imunizacije. Primjerice, ìvotinje je mogu}e imunizirati intaktnim stanicama kako bi proizvele protutijela na nepoznate proteine koji su eksprimirani u odre|enim vrstama stanica (primjerice tumorskim). Takva je protutijela onda mogu}e iskoristiti za identifikaciju proteina koji su specifi~ni za vrstu stanica koja je kori{tena za imunizaciju. Protutijela se ~esto proizvode i na rekombinantne proteine eksprimirane u bakterijama. Na ovaj na~in molekularno kloniranje omogu}uje proizvodnju protutijela na proteine koje je gotovo nemogu}e u dostatnim koli~inama pro~istiti iz eukariotskih stanica. Osim na cjelovite proteine, protutijela je mogu}e razviti i na sinteti~ke peptide od svega 10 do 15 aminokiselina. Ako je poznat slijed nukleotida u nekom genu, mogu}e je razviti protutijela na sinteti~ke peptide ~iji je slijed aminokiselina izveden iz dijela slijeda toga gena. Budu}i da takva protutijela proizvedena na sinteti~ke peptide ~esto prepoznaju i cjeloviti protein, za uspje{nu nam je proizvodnju protutijela na neki protein dovoljno poznavati slijed nukleotida kloniranoga gena. Protutijela moèmo na razne na~ine primijeniti za detekciju proteina u stani~nim ekstraktima. Dvije uobi~ajene metode su imunoblot (poznat i kao Western blot) i imunoprecipitacija. Western blot (slika 3-29) je jo{ jedna varijacija Southern blot metode. Proteini u ekstraktima stanica isto se prvo razdvajaju prema veli~ini gel-elektroforezom, no kako su proteini razli~iti oblikom i nabojem, ovaj je proces ne{to druga~iji od elektroforeze nukleinskih kiselina. Proteine razdvajamo metodom koju nazivamo SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza (SDS-PAGE) u kojoj su proteini otopljeni u otopini koja sadràva negativno nabijeni detergent natrij-dodecilsulfat (SDS). Na svaki se protein veè velik broj molekula detergenta koje ga denaturiraju i daju mu ukupni negativni naboj. Pod tim uvjetima svi proteini putuju prema pozitivnoj elektrodi, a brzina putovanja (kao i kod nukleinSlika 3-29. Western blot.
Proteini se razdvajaju prema veli~ini SDS-poliakrilamidnom gel-elektroforezom i prenose s gela na membranu. Membrana se inkubira s protutijelima koja prepoznaju protein koji nas zanima, a vezana protutijela mogu}e je detektirati raznim metodama, primjerice radioaktivnom sondom koja se veè na protutijelo.
121
inkubacija s protutijelima koja prepoznaju èljeni protein
prikupiti kompleks protutijelo-antigen zrncima koja veù protutijela
zrnca razdvojiti kompleks zakuhavanjem kompleks protutijelo-antigen vezan na zrnca
smjesa radioaktivno obiljeènih proteina
protutijela
protutijela veù specifi~ni protein
detekcija radioaktivno obiljeènih proteina autoradiografijom
gel elektroforeza putovanje
skih kiselina) odre|ena je samo njihovom veli~inom. Nakon elektroforeze proteini se prenose na membranu i zatim inkubiraju s protutijelima koja prepoznaju èljeni protein. Protutijela vezana na membranu mogu}e je detektirati razli~itim metodama, ~ime se otkriva i protein na koji su se ta protutijela vezala. Imunoprecipitaciju koristimo kako bismo izolirali proteine koje prepoznaju specifi~na protutijela (slika 3-30). Stanice se naj~e{}e uzgajaju u prisutnosti radioaktivno-obiljeène aminokiseline kako bismo dobili radioaktivno obiljeène proteine. Takvi radioaktivni ekstrakti stanica inkubiraju se s protutijelima koja se veù na ciljne proteine protiv kojih su razvijena (antigene). Nastali kompleksi protutijelo-antigen izoliraju se i analiziraju elektroforezom {to omogu}uje detekciju radioaktivno obiljeènog antigena autoradiografijom. Kao {to je ve} prikazano u 1. poglavlju, protutijelima moèmo vizualizirati proteine unutar stanica, a i u lizatima stanica. Primjerice, stanice moèmo obojiti protutijelima obiljeènim fluorescentnim bojama, a unutarstani~nu lokalizaciju antigenih proteina moèmo analizirati fluorescentnim mikroskopom (vidi sliku 1-28). Protutijela je mogu}e obiljeìti i biljezima koji su vidljivi pod elektronskim mikroskopom, primjerice te{kim metalima, {to omogu}uje ispitivanja i na ultrastrukturnoj razini.
Slika 3-30. Imunoprecipitacija.

Radioaktivno obiljeèni proteini inkubiraju se s protutijelima koja tvore komplekse s proteinima koje prepoznaju (antigen). Kompleksi protutijelo-antigen prikupljaju se na zrncima koja veù protutijela. Zrnca se zatim zakuhaju kako bi se kompleks protutijelo-antigen razdvojio, a oslobo|eni proteini analiziraju se SDS-poliakrilamidnom gel-elektroforezom. Radioaktivno obiljeène proteine koji su imunoprecipitirali detektiramo autoradiografijom.
Sonde za pretraìvanje knji`nica rekombinantne DNA

Iste metode koje koristimo za detekciju nukleinskih kiselina i proteina u ekstraktima stanica primjenjujemo i za otkrivanje molekularnih klonova koji sadràvaju umetnute specifi~ne fragmente stani~ne DNA. Primjerice hibridizaciju nukleinskih kiselina moèmo primijeniti da identificiramo genomski ili cDNA klon koji sadràva sljedove DNA za koje postoje odgovaraju}e sonde. Ako je cDNA klonirana u ekspresijski vektor, mogu}e ju je identificirati koriste}i protutijela koja prepoznaju proteine kodirane u toj cDNA. Prvi korak u izolaciji genomskog ili cDNA klona ~esto je priprava knji`nice rekombinantne DNA, zbirke klonova koji sadràvaju sve genomske ili mRNA sljedove odre|enog tipa stanica (slika 3-31). Primjerice genomsku knji`nicu DNA ~ovjeka mogu}e je pripraviti kloniraju}i nasumi~ne fragmente veli~ine oko 15 kb u l vektor. Kako je veli~ina genoma ~ovjeka
122
Poglavlje 3
Slika 3-31. Pretraìvanje rekombinantne knji`nice hibridizacijom.

Fragmenti stani~ne DNA klonirani su u vektor bakteriofaga i ugra|eni u ~estice faga. Tako nastalom zbirkom rekombinantnih faga koji sadràvaju razli~ite umetke stani~ne DNA inficiraju se bakterije i kultura se prekriva membranom. Dio faga iz svakoga plaka prenosi se na membranu koja se zatim hibridizira s radioaktivno obiljeènom sondom kako bi se identificirao plak u kojem se nalaze fagi nositelji èljenoga gena. Te je fage tada mogu}e izolirati iz originalne plo~ice s bakterijskom kulturom.
fragmenti stani~ne DNA ugradnja u vektor ugradnja vektora u ~estice faga rekombinantni fagi koji nose razli~ite fragmente stani~ne DNA
Inficiranje E. coli fagima
svaki rekombinantni fag tvori plak plakovi faga
prijenos na membranu DNA faga
radioaktivno obiljeèna DNA-sonda
hibridizacija sa specifi~nom sondom ispiranje membrane i autoradiografija film osjetljiv na X-zrake
rekombinantni fag koji sadràva èljeni fragment stani~ne DNA
oko 3106 kb, DNA ekvivalent jednoga genoma bio bi predstavljen s 200.000 takvih l klonova. Zbog statisti~kih fluktuacija u uzorkovanju, u knji`nici od 200.000 klonova mnogi geni ne bi bili prisutni, a neki bi bili prisutni u vi{e klonova. Zbog toga se, kako bismo postigli visoku vjerojatnost da }e svaki gen biti predstavljen u knji`nici, obi~no pripravljaju ve}e knji`nice od pribli`no milijun rekombinantnih bakteriofaga. Bilo koji gen za koji postoji odgovaraju}a sonda mogu}e je lagano izolirati iz takve rekombinantne knji`nice. Rekombinantne bakteriofage nasa|ujemo na E. coli i svaki se fag umnoàva i stvara plak na sloju bakterija. Plakovi se tada prenose na membrane u procesu sli~nom prijenosu DNA s gela na membranu u Southern blot metodi i zatim hibridiziraju s radioaktivno obiljeènom sondom radi otkrivanja plakova faga koji sadràvaju èljeni gen. Odgovaraju}e rekombinantne bakteriofage tada je mogu}e izolirati s originalne plo~ice i umnoìti èljeni umetak stani~ne DNA. Na sli~an je na~in mogu}e pretraìvati i bakterijske kolonije koje nose plazmidne DNA klonove, pa je specifi~ne klonove mogu}e hibridizacijom izolirati i iz fagnih i iz plazmidnih knji`nica gena.
123
Rekombinantne knji`nice mogu}e je pretraìvati razli~itim sondama. Primjerice cDNA klon mogu}e je koristiti kao sondu za izolaciju odgovaraju}ega genomskog klona, a genom kloniranim iz jednog organizma (primjerice mi{a) mogu}e je izolirati srodni gen iz neke druge vrste (primjerice ~ovjeka). Osim izoliranih fragmenata DNA, sonde mogu biti i sinteti~ki oligonukleotidi {to omogu}uje izolaciju gena na osnovi djelomi~no poznatog slijeda aminokiselina u proteinima koje kodiraju. Primjerice, na osnovi djelomi~no poznatog slijeda aminokiselina u nekom proteinu mogu}e je sintetizirati oligonukleotide duljine od 15 do 20 baza. Ovim je sondama sad mogu}e izolirati cDNA klonove koje je (kao {to smo ve} prikazali) puno lak{e sekvencirati i karakterizirati nego sam protein. Na ovaj je na~in mogu}e eksperimentalno do}i do izoliranoga i kloniranoga gena po~ev{i od svega djelomi~no poznatog slijeda aminokiselina u proteinu. Alternativni pristup izolaciji gena po~ev{i od njihova proteinskog produkta je pretraìvanje ekspresijskih knji`nica s pomo}u specifi~nih protutijela. U tom se slu~aju cDNA knji`nica pripravlja u ekspresijskom vektoru koji poti~e sintezu proteina u E. coli. Bakterijske se kolonije zatim prenose na membranu, a klonovi koji proizvode èljeni protein otkrivaju protutijelima (kao u Western blot metodi). Prikazane metode za identifikaciju molekularnih klonova i otkrivanje gena i genskih produkata u stanicama oslikavaju fleksibilnost tehnologije rekombinantne DNA. Po~ev{i s nekim kloniranim genom, mogu}e je ne samo odrediti slijed nukleotida u tom genu i koristiti ga kao sondu za ispitivanje organizacije i prepisivanja gena, ve} i eksprimirati protein {to ga taj gen kodira i na njega proizvesti specifi~na protutijela. S druge strane koriste}i se oligonukleotidnim sondama ili protutijelima mogu}e je klonirati gene na osnovi samo djelomi~no poznate strukture nekoga proteina. Tehnologijom rekombinantne DNA mogu}e je eksperimentalnu analizu razvijati ili od DNA prema proteinima, ili od proteina prema DNA {to omogu}uje veliku fleksibilnost strategija koje se danas primjenjuju za ispitivanje eukariotskih gena i proteina koje oni kodiraju.
Funkcija eukariotskih gena

Tehnologija rekombinantne DNA, prikazana u prethodnim odlomcima, mo}no je oru|e za detaljnu karakterizaciju gena eukariotskih genoma. Ipak, za razumijevanje funkcije gena nije dovoljna analiza molekularnih klonova u bakterijama, ve} je nu`na analiza gena unutar stanica ili cjelovitog organizma. U klasi~noj se genetici funkcija gena utvr|uje na temelju promijenjenog fenotipa mutiranih organizama. Razvoj rekombinantne DNA tehnologije otvorio je novu dimenziju u analizi funkcije gena na taj na~in {to je omogu}io izravnu analizu kloniranoga gena njegovim ponovnim uno{enjem u eukariotsku stanicu. Kod jednostavnijih eukariota, kao {to su primjerice kvasci, rekombinantna DNA tehnologija omogu}ila je izolaciju molekularnih klonova koji odgovaraju prakti~no svakom mutiranom genu. Postoje i tehnike koje omogu}uju uno{enje kloniranih gena u ìvotinjske i biljne stanice u kulturi, kao i u cjelovite organizme, te njihovu funkcionalnu analizu. Kombinacija ovakvog pristupa sa sposobno{}u uvo|enja mutacija u kloniranu DNA in vitro pro{iruje mogu}nosti tehnologije rekombinantne DNA u ispitivanju funkcije eukariotskih gena.
Geneti~ke analize u kvascima

Kvasci su posebice pogodni organizmi u istraìvanjima molekularne biologije eukariota (vidi 1. poglavlje). Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae sastoji se od pribli`no 1,2 107 parova baza i 200 je puta manji od genoma
124
Poglavlje 3
LEU2 (A) (B) LEU2 kva{~ev ori razli~iti umetci kva{~eve DNA transformacija izbor transformiranih kvasaca na osnovi sposobnosti rasta na mediju u kojem nedostaje leucin E. coli ori kvasac osjetljiv na temperaturu plazmidna knji`nica kvasca
Ampr
umetak kva{~eve DNA
Slika 3-32. Kloniranje gena kvasca.

(A) Kva{~ev vektor. Vektor sadràva bakterijsko ishodi{te replikacije (ori) i gen za rezistenciju na ampicilin (Ampr) potrebne za njegovu propagaciju u bakteriji E. coli. Osim toga, vektor sadràva kva{~evo ishodi{te replikacije i gen biljeg (LEU2) koji omogu}uje selekciju transformiranih kvasaca. Gen LEU2 kodira enzim potreban za sintezu aminokiseline leucina, te je transformante soja kvasca kojemu nedostaje ovaj gen mogu}e izabrati na osnovi stjecanja sposobnosti rasta na podlozi u kojoj nedostaje leucin. (B) Izolacija gena kvasca. Traèni gen identificiran je mutacijom osjetljivom na temperaturu koja omogu}uje kvascu da raste na 25 C, ali ne i na 37 C. Radi izolacije klona èljenoga gena, kvasci osjetljivi na temperaturu transformirani su knji`nicom plazmida koja sadràva gene cjelokupnog kva{~eva genoma. Svi kvasci transformirani plazmidnom DNA rastu na mediju kojem nedostaje leucin na temperaturi od 25 C, no samo oni kvasci transformirani plazmidom koji nosi normalnu kopiju traènoga gena imaju sposobnost rasta na temperaturi od 37 C. @eljeni plazmid mogu}e je izolirati iz kvasaca koji tvore kolonije na nepermisivnoj temperaturi.
rastu sve bakterijske stanice koje sadràvaju plazmide 25 C 37 C izolacija plazmida koji nosi traèni gen rastu samo one bakterijske stanice koje sadràvaju plazmid s normalnom kopijom gena osjetljivog na temperaturu
~ovjeka. Kvasce je lagano uzgajati u kulturi gdje se udvostru~uju pribli`no svaka 2 sata, te nam stoga kvasci pruàju neke od temeljnih prednosti koje pruàju i bakterije (mali genom i brzo razmnoàvanje). Mutacije je u kvascima jednako lako otkriti kao i u E. coli. Primjerice, lako je izolirati mutante kvasaca koje zahtijevaju odre|enu aminokiselinu ili neki drugi hranidbeni nadomjestak u podlozi na kojoj rastu. Osim toga, kvasce s pogrje{kama u genima potrebnim za temeljne stani~ne procese (za razliku od metaboli~kih pogrje{aka) mogu}e je izolirati kao mutante osjetljive na temperaturu. Takve mutante kodiraju proteine koji su funkcionalni na jednoj temperaturi (permisivna temperatura), ali ne i na nekoj drugoj temperaturi (nepermisivna temperatura), dok normalni kvasci proizvode normalne proteine koji su funkcionalni i na jednoj i na drugoj temperaturi. Kvasac s mutacijom osjetljivom na temperaturu u nekom klju~nom genu mogu}e je otkriti zahvaljuju}i selektivnom rastu na odre|enoj temperaturi. Sposobnost izolacije mutacija osjetljivih na temperaturu omogu}ila je otkrivanje kva{~evih gena koji kontroliraju brojne temeljne stani~ne procese, kao {to je primjerice sinteza i dorada RNA, napredovanje kroz stani~ni ciklus ili transport proteina izme|u stani~nih odjeljaka. Razmjerno jednostavna genetika kvasca omogu}uje kloniranje gena koji odgovara bilo kojoj mutaciji na osnovi njezine funkcionalne aktivnosti (slika 3-32). U prvom se koraku pripravlja genomska knji`nica normalne DNA kvasca u vektorima koji se umnaàju kao plazmidi i u kvascu i u E. coli. Zbog razmjerno maloga genoma kvasca cjelokupna se knji`nica sastoji od
125
svega nekoliko tisu}a plazmida. Mutante kvasca osjetljive na temperaturu zatim se transformiraju smjesom takvih plazmida i izabiru se transformirani kvasci koji su stekli sposobnost rasta na nepermisivnoj temperaturi. Transformirani kvasci sadràvaju normalnu kopiju traènoga gena na plazmidnoj DNA koju je zatim jednostavno izolirati u svrhu daljnje karakterizacije. Na ovaj su na~in izolirani geni koji kodiraju razne klju~ne proteine kvasaca. U mnogim su slu~ajevima tako izolirani geni kvasca omogu}ili identifikaciju i kloniranje srodnih gena iz stanica sisavaca. Dakle, osim {to je pruìla vaàn modelni sustav za ispitivanje eukariotskih stanica, jednostavna genetika kvasca omogu}ila je i kloniranje srodnih gena sloènijih eukariota.
Prijenos gena u biljke i ìvotinje

Za razliku od stanica kvasca, stanicama vi{ih eukariota nije mogu}e geneti~ki manipulirati na jednostavan na~in, no i u njima je mogu}e ispitivati funkcije gena uno{enjem klonirane DNA. Takvi su se eksperimenti (op}enito ih nazivamo prijenosom gena) pokazali klju~nim za ispitivanje brojnih va`nih procesa, kao {to su primjerice mehanizmi koji reguliraju ekspresiju gena ili dorada proteina. Kao {to }e biti prikazano kasnije u ovoj knjizi, prijenos gena omogu}io je otkrivanje i karakterizaciju gena koji kontroliraju rast i diferencijaciju ìvotinjskih stanica, uklju~uju}i brojne gene odgovorne za nenormalni rast tumorskih stanica. Metodologija unosa DNA u ìvotinjske stanice prvo je razvijena za unos infektivne virusne DNA i stoga se ~esto naziva transfekcija (rije~ izvedena iz pojmova transformacija + infekcija) (slika 3-33). DNA je u ìvotinjsku stanicu u kulturi mogu}e unijeti na vi{e na~ina. Primjerice, izravnim mikroSlika 3-33. Uno{enje DNA u ìvotinjske stanice.
Eukariotski gen klonira se u plazmid koji mora imati i odgovaraju}i gen za selekciju. Takav gen nosi rezistenciju na odre|eni inhibitor rasta {to omogu}uje selekciju ìvotinjskih stanica u kulturi. Plazmidna DNA unosi se i eksprimira nekoliko dana u velikom broju stanica (prolazna ekspresija). Stabilno transformirane stanice, kod kojih je plazmidna DNA ugra|ena u kromosomsku DNA, mogu}e je izdvojiti na osnovi sposobnosti rasta u mediju koji sadràva inhibitor rasta.
gen koji nas zanima
Ampr
plazmidna DNA
unos DNA u stanice u kulturi gen odgovoran za rezistenciju stanica na inhibitor rasta
ori
velik broj stanica unosi i prolazno eksprimira plazmidnu DNA samo stabilno transformirane stanice tvore kolonije
selekcija u mediju koji sadràva inhibitor rasta
plazmidna DNA stabilno transformirane stanice sadràvaju plazmidnu DNA ugra|enu u kromosomsku DNA
126
Poglavlje 3
mjesto kloniranja plazmidna DNA retrovirusni sljedovi
Slika 3-34. Retrovirusni vektori.

Vektor se sastoji od retrovirusnih sljedova kloniranih u plazmid koji se moè umnaàti u E. coli. Strane DNA ume}u se unutar virusnih sljedova te se takvi rekombinantni plazmidi izoliraju u bakterijama. Rekombinantnom DNA transfektiraju se ìvotinjske stanice u kulturi. Samo u mali broj transfektiranih stanica u}i }e rekombinantna DNA i proizvesti rekombinantne retrovirusne ~estice. Takvim se rekombinantnim virusima mogu u~inkovito transfektirati nove stanice u kojima }e se virusni genom, nositelj èljenih gena, ugraditi u kromosomsku DNA kao provirus.
Ampr
ori umetanje fragmenata DNA izolacija rekombinantnoga plazmida u E. coli umetak DNA
uno{enje fragmenata DNA u stanice sisavaca transfekcijom
nekoliko stanica unosi DNA i proizvodi rekombinantne virusne ~estice
stanice u koje je u{la rekombinantna DNA nose èljene fragmente DNA u~inkovita infekcija i ekspresija gena u novim stanicama
rekombinantni provirus
ubrizgavanjem u jezgru stanice, koprecipitacijom DNA s kalcijevim fosfatom u sitne ~estice koje spontano ulaze u stanice, ugradnjom DNA u lipidne vezikule (liposome) koji se spajaju sa stani~nom membranom, ili izlaganjem stanica kratkim elektri~nim pulsevima koji privremeno otvaraju pore u stani~noj membrani (elektroporacija). Strana DNA se na taj na~in moè unijeti u velik broj stanica i prenijeti u jezgru gdje }e se prepisivati tijekom sljede}ih nekoliko dana fenomen koji nazivamo prolazna ekspresija. U manjem broju stanica (obi~no 1% ili manje) strana DNA se stabilno ugra|uje u stani~ni genom i pri diobi stanica prenosi se na stanice k}eri ba{ kao i bilo koji drugi stani~ni gen. Stabilno transformirane stanice mogu}e je odabrati ako transfektirana DNA sadràva biljeg za selekciju, primjerice gen za rezistenciju na inhibitor rasta normalnih stanica. Zajedno s genom za rezistenciju na inhibitor, u stanice je mogu}e unijeti bilo koji klonirani gen te analizirati njegov u~inak na pona{anje stanica, primjerice na rast ili diferencijaciju. Kao vektore za unos klonirane DNA u stanice mogu}e je koristiti i ìvotinjske viruse. Posebice su pogodni retrovirusi jer njihov normalni ìvotni ciklus uklju~uje stabilnu integraciju virusnoga genoma u genom inficiranih stanica (slika 3-34). Retrovirusi se mogu koristiti za u~inkovit unos kloniranih gena u razli~ite tipove stanica, {to ih ~ini zna~ajnim vektorom sa {irokim rasponom primjene. Klonirane je gene mogu}e unijeti i u mati~ne linije vi{estani~nih organizama {to omogu}uje njihovo ispitivanje in vivo, a ne samo u kulturi stanica. Jedna od metoda je izravno mikroubrizgavanje klonirane DNA u pronukleus oplo|ene jajne stanice, a koristi se za stvaranje mi{eva koji nose strane gene (transgeni~nih mi{eva) (slika 3-35). Jajna stanica u koju se ubrizgava DNA prenosi se u surogat-majku gdje se razvija sve do okota. U oko 10% oko}enih mi{eva strana }e se DNA ugraditi u genom oplo|ene jajne stanice i stoga }e biti prisutna u svim stanicama u organizmu. Budu}i da je strana DNA prisutna i u spolnim stanicama tih ìvotinja, daljnjim razmnoàvanjem prenijet }e se na potomstvo ba{ kao i svaki drugi gen.
RNA
protein
Slika 3-35. Proizvodnja transgeni~nih mi{eva.

Strana se DNA mikroubrizgava u pronukleus oplo|ene mi{je jajne stanice (oplo|ena jajna stanica sadràva dva pronukleusa; jedan iz jajne stanice i jedan iz spermija). Takva se jajna stanica zatim prenosi u surogat majke gdje se razvija. Dio potomstva imat }e stranu DNA ugra|enu u svoj genom (transgeni~no potomstvo).
mikroubrizgavanje plazmidne DNA u pronukleus oplo|ene jajne stanice plazmidna DNA embriji pronukleusi transgeni~ni mi{evi
prijenos embrija u surogat majke
potomstvo
127
Karakteristike embrionalnih mati~nih (EM) stanica omogu}uju alternativni pristup uno{enja kloniranih gena u mi{a (slika 3-36). EM stanice mogu}e je uvesti u kulturu iz ranih mi{jih embrija, a zatim ih ponovo vratiti u rani mi{ji embrio gdje }e normalno sudjelovati u razvoju i diferencirati se u stanice bilo kojeg tkiva mi{a, uklju~uju}i i spolne stanice. Ovaj pristup omogu}uje da u EM stanice u kulturi unesemo kloniranu DNA, te izaberemo one stanice koje su se stabilno transformirale i unesemo ih u mi{je embrije. Takvi embriji razvit }e se u kimerne ìvotinje u kojima }e neke stanice potjecati od normalnih embrionalnih stanica, a neke od transfektiranih EM stanica. U nekim od tih mi{eva transfektirane EM stanice razvit }e se u spolne stanice, pa }e se njihovim daljnjim razmnoàvanjem transfektirani gen izravno prenositi na potomstvo. Kloniranu DNA mogu}e je unijeti i u biljne stanice na razli~ite na~ine. Jedan pristup je uno{enje DNA u protoplaste elektroporacijom na isti na~in kako je opisano za ìvotinjske stanice. Me|utim, pri tome je neophodno prvo ukloniti stani~nu stijenku kako bismo dobili stanicu obavijenu samo stani~nom membranom (protoplast). Alternativno, DNA moè biti izravno unesena u intaktne biljne stanice bombardiranjem stanica mikroprojektilima oko kojih je omotana DNA, primjerice malim ~esticama tungstena. Neke od tih stanica umiru, no ostale preìvljavaju i postaju stabilno transformirane. Biljni virusi iskori{teni su kao vektori za u~inkovit unos rekombinantne DNA u razli~ite biljke i biljne stanice. Najpoznatiji takav vektor izveden je iz plazmida prisutnog u bakteriji Agrobacterium tumefaciens (Ti-plazmid) (slika 3-37). U prirodi se Agrobacterium pri~vr{}uje za li{}e biljaka, a Ti-plazmid se prenosi u biljne stanice gdje se ugra|uje u kromosomsku DNA, {to vektore izvedene iz Tiplazmida ~ini jako u~inkovitim za uno{enje rekombinantne DNA u osjetljive biljne stanice. Kako je mnoge biljke mogu}e regenerirati iz pojedina~nih
Slika 3-36. Uno{enje gena u mi{a putem embrionalnih mati~nih stanica.
Embrionalne mati~ne (EM) stanice su kulture stanica izvedene iz ranih mi{jih embrija (blastocista). U kulturi in vitro, u EM stanice mogu}e je unijeti stranu DNA i izolirati stabilno transfektirane stanice. Takve transformirane EM stanice se zatim unrizgavaju u blastocistu primatelja gdje sudjeluju u normalnom razvoju embrija. Neki od mi{eva koji }e se razviti nakon prijenosa embrija, kojima su ubrizgane EM stanice, u surogat majke sadràvat }e osim normalnih stanica i stanice koje su se razvile iz transformiranih EM stanica. Kako su ti mi{evi mje{avina dvaju razli~itih tipova stanica, kaèmo da su kimerni. Kriànjem kimernih mi{eva, u kojima su transformirane EM stanice ugra|ene u spolne stanice, nastat }e potomstvo koje nosi transfektirane gene.
biljeg rezistencije na inhibitor rasta
blastocista plazmidna DNA uno{enje u embrionalne mati~ne (EM) stanice u kulturi gen koji nas zanima
EM stanice koje nose plazmidne sljedove ugra|ene u kromosomsku DNA ubrizgavanje transformiranih EM stanica u mi{ju blastocistu
EM stanice blastocista
prijenos u surogat majku
kimerno potomstvo
kriànje kimernoga s normalnim mi{em
nastanak potomstva koje je naslijedilo transfektirani gen od EM stanica
128
Poglavlje 3
T regija
mjesto za kloniranje
Slika 3-37. Uno{enje gena u biljne stanice s pomo}u Ti plazmida.

Ti-plazmid sadràva T regiju na molekuli DNA koja se prenosi u inficirane biljne stanice te gene virulencije (vir) koji sudjeluju u prijenosu T DNA. U Ti-plazmidnim vektorima strana se DNA ume}e u T regiju. Rekombinantni se plazmid zatim unosi u bakteriju Agrobacterium tumefaciens kojom se inficiraju stanice u kulturi. T regija plazmida (koja nosi umetnutu stranu DNA) prenosi se u biljne stanice i ugra|uje u kromosomsku DNA. Na taj na~in iz transformiranih stanica moèmo uzgojiti transgeni~nu biljku.
vir
Ti-plazmid
umetanje strane DNA u T regiju

umetak DNA
stanica u kulturi (vidi 1. poglavlje), transgeni~ne je biljke mogu}e izravno razviti iz stanica u koje je rekombinantna DNA unesena u kulturi {to je daleko jednostavnije od proizvodnje transgeni~nih ìvotinja.
Mutageneza klonirane DNA

U klasi~nim je geneti~kim ispitivanjima, koja koriste bakterije ili kvasce kao modele, promatranje promijenjenog fenotipa mutiranih organizama klju~ za otkrivanje gena i razumijevanje njihove uloge. Naime, mutirani geni otkrivaju se jer za posljedicu imaju vidljivu promjenu fenotipa, primjerice rast osjetljiv na temperaturu ili odre|ene hranidbene potrebe. Mogu}nost izolacije gena tehnologijom rekombinantne DNA otvorila je novi pristup mutagenezi. Danas je mogu}e unijeti bilo koju promjenu u klonirani gen i ispitati u~inke te mutacije na funkciju gena. Takav je postupak nazvan obrnutom genetikom jer se prvo odre|ena mutacija unosi u gen, a zatim se promatraju promjene fenotipa. Mogu}nost uno{enja specifi~nih mutacija u kloniranu DNA (in vitro mutageneza) pokazala se zna~ajnim oru|em za ispitivanje ekspresije i funkcije eukariotskih gena. Klonirane gene mogu}e je promijeniti razli~itim postupcima in vitro mutageneze, a rezultat su delecije, insercije ili zamjene pojedinih nukleotida. Uobi~ajena metoda mutageneze je kori{tenje sinteti~kih oligonukleotida za uvo|enje promjena u molekulu DNA (slika 3-38). U ovoj se metodi sinteti~ki oligonukleotidi koji nose mutiranu bazu koriste kao po~etnice za sintezu DNA. Novosintetiziranu DNA koja sadràva mutaciju mogu}e je zatim izolirati i karakterizirati. Primjerice, mogu}e je promijeniti pojedine aminokiseline u proteinu kako bi se ispitala njihova uloga u funkciji proteina. S pomo}u opisane metode i njezinih varijacija, te zahvaljuju}i tehnologiji rekombinantne DNA mogu}e je unijeti prakti~no bilo kakvu promjenu u klonirani gen. U~inke mutacija na ekspresiju i funkciju gena mogu}e je zatim analizirati uno{enjem promijenjenoga gena u odgovaraju}e stanice. In vitro mutageneza omogu}ila je detaljno ispitivanje funkcije kodiraju}ih, ali i regulatornih podru~ja kloniranih gena.
vir
rekombinantni plazmid
uno{enje rekombinantnoga plazmida u bakteriju Agrobacterium tumefaciens
infekcija biljnih stanica
integracija T DNA u kromosomsku DNA
regeneracija transgeni~ne biljke
Uno{enje mutacija u stani~ne gene

Iako je prijenos kloniranih gena u stanice (posebice u kombinaciji s in vitro mutagenezom) mo}no oru|e za ispitivanje strukture i funkcije gena, takvim eksperimentalnim pristupom nije mogu}e odrediti ulogu nepoznatoga gena u stanici ili odre|enom organizmu. Stanica s unesenim kloniranim genom naj~e{}e jo{ uvijek sadràva i normalnu kopiju toga gena u svojoj kromosomskoj DNA, koja nastavlja obavljati svoju normalnu ulogu u stanici. Zbog toga je potrebno prvo ukloniti aktivnost normalne stani~ne kopije odre|enoga gena da bismo shvatili biolo{ku ulogu kloniranoga mutiranoga gena. Kao {to je prikazano u sljede}em odlomku, ovaj je postupak razmjerno jednostavno provesti u kvascima. Iako zna~ajno kompliciranije, danas je mogu}e na nekoliko na~ina i u ìvotinjskim stanicama inaktivirati
129
TAT G C ATA G plazmid koji sadràva nepravilno sparene baze na mjestu mutacije
T
GC CG
gen koji nas zanima
po~etni plazmid
po~etni plazmid denaturacija i hibridizacija s mutiranim oligonukleotidom sinteza DNA i ligacija transformacija E. coli izolacija plazmida nakon replikacije
C G GGT A
mutant
kromosomske kopije kloniranoga gena, ili onemogu}iti njihovo normalno funkcioniranje. Uno{enje mutacija u gene kvasca razmjerno je jednostavno jer se unesena molekula DNA ~esto zamjenjuje s normalnom kromosomskom kopijom mehanizmom homologne rekombinacije (slika 3-39). Na taj se na~in klonirani gen, u koji smo in vitro unijeli odre|enu mutaciju, ugra|uje u kromosom na mjesto normalnog alela te postaje dio normalne kromosomske kopije gena kvasca. U najjednostavnijem slu~aju klonirani gen inaktiviramo mutacijom tako da onemogu}imo njegovu normalnu funkciju, te ga unosimo
stanica koja nosi normalnu kopiju gena
Slika 3-38. Mutageneza pomo}u sinteti~kih oligonukleotida.

Oligonukleotid koji sadràva èljenu promjenu baze koristi se za sintezu plazmidne DNA, a novosintetizirana molekula cirkularizira se s pomo}u DNAligaze. Ovim postupkom nastaje plazmid koji u jednom lancu sadràva normalnu, a u drugom mutiranu bazu. Replikacijom plazmidne DNA unutar transformiranih bakterija E. coli nastaje smjesa normalnoga i mutiranoga plazmida.
unos mutirane kopije gena u stanice
klonirana mutirana kopija gena
mutirana DNA rekombinira se s normalnom kromosomskom kopijom gena
homologna rekombinacija
stanice koje nose mutirani gen na mjestu normalne kopije
Slika 3-39. Inaktivacija gena homolognom rekombinacijom.

Mutirana kopija kloniranoga gena unosi se u stanicu. Normalna kopija gena tada se moè zamijeniti mutiranom kopijom mehanizmom homologne rekombinacije ~ime nastaje stanica koja nosi èljenu mutaciju u kromosomskoj DNA.
130
Poglavlje 3
uno{enje protusmislene RNA ili DNA mRNA protein
Protusmislena RNA ili DNA hibridizira s normalnom mRNA. Sinteza proteina je zaustavljena.
Slika 3-40. Inhibicija ekspresije gena protusmislenom RNA ili DNA.

Protusmislena RNA ili jednolan~ana DNA komplementarna je s molekulom mRNA gena koji nas zanima, te ona stoga tvori hibride s ciljnom mRNA {to blokira prepisivanje mRNA u protein i rezultira razgradnjom mRNA.
na mjesto normalnoga gena u kromosom kvasca kako bismo utvrdili njegovu ulogu u stani~nim procesima. Na ovaj na~in mogu}e je inaktivirati i ispitivati ~ak i one gene koji su nu`ni za rast stanica, jer se kva{~ev ìvotni ciklus sastoji od haploidnog i diploidnog stadija. Naime, neaktivna kopija gena unosi se u diploidne stanice koje onda imaju jednu funkcionalnu i jednu neaktivnu kopiju ciljnog gena. Stanice se tad potaknu na mejoti~ku diobu, a u~inci inaktivacije toga gena promatraju se na haploidnom potomstvu. Rekombinacija izme|u strane DNA i homolognoga kromosomskoga gena vrlo je rijetka u stanicama sisavaca, te je inaktivacija gena ovim pristupom daleko teà nego u kvascima. Ve}ina transfektirane DNA ugradi se u genom stanica primateljica nasumi~nom rekombinacijom s nesrodnim sljedovima. Ovaj se problem pojavljuje vjerojatno zbog toga {to su genomi stanica sisavaca daleko ve}i od genoma kvasca. Danas su razvijene razli~ite metode koje pove}avaju u~estalost homologne rekombinacije u genomima sisavaca, te uspje{nost selekcije i izolacije stanica u kojima je do{lo do homologne rekombinacije. Va`no je da je gene mogu}e inaktivirati ne samo u somatskim, ve} i u linijama embrionalnih mati~nih stanica u kulturi. S pomo}u EM stanica mogu}e je proizvesti transgeni~ne mi{eve, pa se u tom slu~aju u~inak inaktivacije gena ispituje u kontekstu organizma, a ne samo pojedina~nih stanica. Na taj su na~in ispitane funkcije stotina mi{jih gena, {to je bilo posebice zna~ajno za razumijevanje uloge specifi~nih gena tijekom razvoja mi{a. Alternativni pristup inaktivaciji gena homolognom rekombinacijom je blokiranje ekspresije gena protusmislenim (engl. antisense) nukleinskim kiselinama (slika 3-40). Ovim pristupom protusmislena RNA ili jednolan~ana DNA koja je komplementarna molekuli mRNA gena koji nas zanima (protusmislena) unosi se u stanicu. Protusmislena RNA ili DNA hibridizira s mRNA i blokira njezino prevo|enje u proteine. [tovi{e, RNA-DNA hibridi koji nastaju zbog uno{enja protusmislene DNA molekule naj~e{}e se brzo razgra|uju u stanici. Protusmislene RNA mogu se mikroubrizgavanjem izravno unijeti u stanicu. Jo{ jedan od na~ina je da stanice transfektiramo vektorima koji su dizajnirani da eksprimiraju protusmislenu RNA. Protusmislena DNA obi~no je u obliku kratkih oligonukleotida (duljine oko 20 baza) koji se mikroubrizguju u stanice. Budu}i da stanice i spontano unose sli~ne oligonukleotide iz stani~nog medija, protusmislene je oligonukleotide mogu}e jednostavno dodati u kulturu stanica. RNA interferencija (RNAi) je dodatan vrlo u~inkovit na~in za ometanje ekspresije gena na razini mRNA (slika 3-41). Tijekom RNA interferencije kratke dvolan~ane molekule RNA (21 do 23 oligonukleotida) poti~u razgradnju komplementarne mRNA. Iako mehanizam na koji dvolan~ana
131
Slika 3-41. RNA interferencija.

kratka dvolan~ana RNA
povezivanje s nukleazom
Kratke dvolan~ane molekule RNA povezuju se s ribonukleazom. Razmotavanje dvolan~ane RNA i hibridizacija s homolognom mRNA usmjerava nukleazu na mRNA {to dovodi do njezine razgradnje.
razmotavanje
hibridizacija s ciljnom mRNA
razgradnja
RNA poti~e razgradnju ciljne mRNA jo{ uvijek nije potpuno razja{njen, pretpostavlja se da uklju~uje djelovanje ribonukleaze koja se povezuje s dvolan~anom RNA te se zatim na osnovi komplementarnog sparivanja baza usmjerava na ciljnu mRNA. RNAi je prvo uvedena za u~inkovito poticanje razgradnje mRNA u obli}u Caenorhabditis elegans. Kasnije je njezina primjena pro{irena na vinsku mu{icu (Drosophila melanogaster) i uro~njak (Arabidopsis thaliana), a nedavno i na stanice sisavaca. Osim inaktiviranja gena ili poticanja razgradnje mRNA, ponekad je mogu}e izravno ometati funkciju proteina u stanicama (slika 3-42). Jedan od na~ina je mikroubrizgavanje protutijela koja specifi~no blokiraju aktivnost odre|enog proteina. Alternativno, odre|eni mutirani proteini mogu ometa-
132
Poglavlje 3
Slika 3-42. Izravna inhibicija funkcije proteina.

Mikroubrizgana protutijela veù se na proteine u stanicama i inhibiraju njihovu normalnu funkciju. Osim toga, neki mutirani proteini ometaju funkciju normalnih kopija proteina, primjerice, kompetiraju}i s njima za vezanje na ciljne molekule
protutijelo koje prepoznaje protein koji nas zanima mRNA protein Protein se veè s ciljnom molekulom u stanici i obavlja svoju normalnu funkciju.
inhibitorni mutirani protein
mRNA mRNA Vezanje protutijela blokira normalnu funkciju proteina.
protein
Mutirani protein blokira djelovanje normalnoga proteina time {to tvori neaktivne komplekse s ciljnom molekulom.
ti funkciju normalnih kopija ukoliko su eksprimirani u istoj stanici, primjerice kompeticijom s normalnim proteinom za vezanje na ciljnu molekulu. Kloniranu DNA, koja kodira takve mutirane proteine (nazivamo ih dominantni inhibiraju}i mutanti), mogu}e je unijeti u stanice prijenosom gena u svrhu ispitivanja u~inka blokiranja funkcije normalnoga gena.
KLJU^NI POJMOVI
S A @ E TA K NASLJE\IVANJE, GENI I DNA
gen, alel, dominantan, recesivan, genotip, fenotip, kromosom, diploidan, mejoza, haploidan, mutacija
Geni i kromosomi: Kromosomi su nositelji gena.
hipoteza jedan gen jedan enzim transformacija
Geni i enzimi: Gen odre|uje slijed aminokiselina u polipeptidnom lancu. Identifikacija DNA kao geneti~kog materijala: DNA je identificirana kao geneti~ki materijal eksperimentima s transformacijom bakterija. Struktura DNA: DNA je dvostruka uzvojnica u kojoj se stvaraju vodikove veze izme|u purina i pirimidina u nasuprotnim lancima. Zbog specifi~nog sparivanja baza (A T, G C) dva su lanca molekule DNA komplementarna u slijedu nukleotida.
semikonzervativna replikacija, DNA-polimeraza
Replikacija DNA: DNA se udvostru~uje semikonzervativnom replikacijom u kojoj se dva lanca razdvajaju i svaki sluì kao kalup za sintezu novoga lanca.
133
EKSPRESIJA GENETI^KE INFORMACIJE

Kolinearnost gena i proteina: Slijedom nukleotida u DNA odre|en je slijed aminokiselina u proteinu. Uloga glasni~ke RNA: Glasni~ka RNA djeluje kao posrednik koji prenosi informaciju s DNA na ribosome gdje sluì kao kalup za sintezu proteina. Geneti~ki kod: Transportna RNA sluì kao adaptor izme|u aminokiselina i mRNA tijekom prevo|enja. Svaka je aminokiselina odre|ena kodonom koji se sastoji od tri nukleotida. RNA virusi i obr nuto prepisivanje: DNA je mogu}e sintetizirati na osnovi RNA-kalupa {to je prvo otkriveno kod retrovirusa.
sredi{nja dogma, prepisivanje, prevo|enje, glasni~ka RNA (mRNA), RNA-polimeraza, ribosomna RNA (rRNA), transportna RNA (tRNA) geneti~ki kod, prevo|enje in vitro, kodon
retrovirus, obrnuto prepisivanje, reverzna transkriptaza
REKOMBINANTNA DNA
Restrikcijske endonukleaze: Restrikcijske endonukleaze kidaju DNA na odre|enim sljedovima ~ime nastaju fragmenti DNA definirane veli~ine. Proizvodnja rekombinantnih molekula DNA: Rekombinantna molekula DNA sastoji se od èljenoga fragmenta DNA ugra|enog u vektor koji se moè neovisno umnaàti u odgovaraju}oj stanici doma}inu. Vektori za rekombinantnu DNA: Za kloniranje fragmenata DNA razli~ite veli~ine koriste se razli~iti vektori.
restrikcijske endonukleaze, gel-elektroforeza, restrikcijska karta molekularno kloniranje, vektor, rekombinantna molekula, molekularni klon, DNA-ligaza, cDNA plazmid, ishodi{te replikacije, kozmid, P1 umjetni kromosom (PAC), bakterijski umjetni kromosom (BAC), umjetni kromosom kvasca (YAC) dideoksinukleotid, autoradiografija ekspresijski vektor, bakulovirus
Sekvenciranje DNA: U kloniranom fragmentu DNA mogu}e je odrediti slijed nukleotida. Ekspresija kloniranih gena: Proteine koje kodiraju klonirani geni mogu}e je sintetizirati u velikim koli~inama u bakterijama ili eukariotskim stanicama. Umnoàvanje DNA lan~anom reakcijom polimeraze: PCR omogu}uje in vitro umnaànje i izolaciju specifi~nih fragmenata DNA.
lan~ana reakcija polimeraze (PCR)
DETEKCIJA NUKLEINSKIH KISELINA I PROTEINA

Hibridizacija nukleinskih kiselina: Hibridizacija nukleinskih kiselina omogu}uje detekciju specifi~nih molekula DNA ili RNA.
hibridizacija nukleinskih kiselina, sonda, Southern blot, Northern blot, DNA-mikro~ip, hibridizacija in situ
Detekcija malih koli~ina DNA ili RNA lan~anom reakcijom polimeraze: PCR je osjetljiva metoda za detekciju malih koli~ina specifi~nih molekula DNA ili RNA. Protutijela kao sonde za proteine: Protutijela koristimo za detekciju specifi~nih proteina u stanicama ili stani~nim ekstraktima.
protutijelo, antigen, monoklonsko protutijelo, imunoblot, Western blot, imunopecipitacija, SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza (SDS-PAGE)
134
Poglavlje 3
knji`nica rekombinantne DNA, genomska knji`nica, knji`nica cDNA
Sonde za pretraìvanje knji`nica rekombinantne DNA: Specifi~ne rekombinantne molekule DNA pronalazimo u knji`nicama rekombinantne DNA uz pomo} hibridizacije nukleinskih kiselina ili protutijela.
FUNKCIJA EUKARIOTSKIH GENA

mutanta osjetljiva na temperaturu prijenos gena, transfekcija, prolazna ekspresija, liposom, elektroporacija, transgeni~ni mi{, embrionalne mati~ne (EM) stanice, Ti-plazmid obrnuta genetika, in vitro mutageneza homologna rekombinacija, protusmislene nukleinske kiseline, RNA interferencija (RNAi), dominantni inhibitorni mutant
Geneti~ke analize u kvascima: Jednostavna genetika i brzo razmnoàvanje kvasca omogu}uju molekularno kloniranje gena koji odgovaraju bilo kojoj mutaciji u kvascu. Prijenos gena u biljke i ìvotinje: Klonirane gene mogu}e je unijeti u stanice vi{ih eukariota i vi{estani~ne organizme radi funkcionalne analize.
Mutageneza klonirane DNA: In vitro mutagenezu klonirane DNA koristimo za ispitivanje u~inka odre|enih mutacija na funkciju gena. Uno{enje mutacija u stani~ne gene: Mutacije je mogu}e unijeti u kromosomske gene homolognom rekombinacijom s kloniranom DNA. Osim toga, ekspresiju ili funkciju specifi~nih genskih produkata mogu}e je blokirati protusmislenim nukleinskim kiselinama, RNA interferencijom ili dominantnim inhibitornim mutantama.
Pitanja
1. Definirajte pojam prevo|enje (translacija) u kontekstu molekularne biologije. 2. [to je sve potrebno za provo|enje sinteze proteina in vitro? 3. Kako je provedeno prvo povezivanje nekog kodona s aminokiselinom koju taj protein ozna~uje? 4. Na {to mislimo kada kaèmo da je geneti~ki kod degeneriran? 5. Objasnite za{to adicija ili delecija jednoga ili dvaju nukleotida u kodiraju}em dijelu gena rezultira nefunkcionalnim proteinom, a adicija ili delecija triju nukleotida ~esto rezultira proteinom koji zadràva normalnu funkciju. 6. Objasnite koja svojstva mora imati umjetni kva{~ev kromosom da bismo s pomo}u njega u kvascu mogli klonirati dio humane DNA izrezane s pomo}u EcoRI. 7. Za{to je lan~ana reakcija polimeraze (PCR) vrlo korisna tehnika u molekularnoj biologiji? 8. Kakva je razlika izme|u genomske i cDNA knji`nice? 9. Ispitujete enzim u kojem je cistein u aktivnom mjestu kodiran tripletom UGU. Kakav }e utjecaj na enzimsku aktivnost imati mutacija tre}e baze u C, a kakav mutacija iste te baze u A? 10. Razgradnja molekule DNA velike 4 kB s EcoRI daje dva fragmenta; jedan od 1 kb i jedan od 3 kb. Razgradnja iste molekule s HindIII daje fragmente od 1,5 i 2,5 kb. Razgradnja s kombinacijom enzima EcoRI i HindIII daje fragmente od 0,5 kb, 1 kb i 2,5 kb. Nacrtajte restrikcijsku kartu toga fragmenta (molekule DNA) i unesite poloàje mjesta prepoznavanja za EcoRI i HindIII. 11. Koliko }e kopija nekoga gena nastati nakon 10 i 30 ciklusa umnoàvanja lan~anom reakcijom polimeraze ako reakciju zapo~nemo s molekulom DNA iz jednog jedinog spermija? 12. Klonirali ste cDNA nepoznate funkcije. Na koji na~in moète eksperimentalno utvrditi unutarstani~ni smje{taj proteina {to ga kodira ta cDNA? 13. @elite odrediti koje su aminokiseline va`ne za kataliti~ku aktivnost nekog enzima. Pretpostaviv{i da vam je na raspolaganju cDNA klon, predloìte eksperimentalnu strategiju koju biste primijenili.
135
Literatura
Op}a literatura
Lewin, B. 2000. Genes VII. Oxford: Oxford Univ. Press. Weaver, R. F. 2002. Molecular Biology. 2nd ed. New York: McGraw-Hill. Rous sarcoma virus. Nature 226: 12111213. I Yanofsky, C., B. C. Carlton, J. R. Guest, D. R. Helinski and U. Henning. 1964. On the colinearity of gene structure and protein structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51: 266272. I Caruthers, M. H. 1985. Gene synthesis machines: DNA chemistry and its uses. Science 230: 281285. P Gerhold, D., T. Rushmore and C. T. Caskey. 1999. DNA chips: promising toys have become powerful tools. Trends Biochem. Sci. 24: 168173. P Grunstein, M. and D. S. Hogness. 1975. Colony hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 39613965. I Harlow, E. and D. Lane. 1999. Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Kohler, G. and C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495497. I Maniatis, T., R. C. Hardison, E. Lacy, J. Lauer, C. OConnell, D. Quon, G. K. Sim and A. Efstratiadis. 1978. The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA. Cell 15: 687701. I Sambrook, J., and D. Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schildkraut, C. L., J. Marmur and P Doty. . 1961. The formation of hybrid DNA molecules, and their use in studies of DNA homologies. J. Mol. Biol. 3: 595617. I Southern, E. M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503 517. I
Naslje|ivanje, geni i DNA

Avery, O. T., C. M. MacLeod and M. McCarty. 1944. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J. Exp. Med. 79: 137 158. I Franklin, R. E. and R. G. Gosling. 1953. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature 171: 740741. I Kornberg, A. 1960. Biologic synthesis of deoxyribonucleic acid. Science 131: 15031508. P Meselson, M. and F. W. Stahl. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44: 671682. I Watson, J.D. and F. H. C. Crick. 1953. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171: 964967. I Watson, J.D. and F. H. C. Crick. 1953. Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737 738. I Wilkins, M. H. F., A. R. Stokes and H. R. Wilson. 1953. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature 171: 738740. I
Rekombinantna DNA
Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl. eds. 1989. Current Protocols in Molecular Biology. New York: Greene Publishing and Wiley Interscience. P Burke, D. T., G. F. Carle and M. V. Olson. 1987. Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science 236: 806812. I Cohen, S. N., A. C. Y. Chang, H. W. Boyer and R. B. Helling. 1973. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 32403244. I Nathans, D. and H. O. Smith. 1975. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. Ann. Rev. Biochem. 44: 273293. P Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487491. I Sambrook, J., and D. Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sanger, F., S. Nicklen and A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 54635467. I
Ekspresija geneti~ke informacije

Baltimore, D. 1970. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226: 12091211. I Brenner, S., F. Jacob and M. Meselson. 1961. An unstable intermediate carrying information from genes to ribosomes for protein synthesis. Nature 190: 576581. I Crick, F. H. C., L. Barnett, S. Brenner and R. J. Watts-Tobin. 1961. General nature of the genetic code for proteins. Nature 192: 12271232. I Ingram, V. M. 1957. Gene mutations in human hemoglobin: The chemical difference between normal and sickle cell hemoglobin. Nature 180: 326328. I Nirenberg, M. and P Leder. 1964. RNA code. words and protein synthesis. Science 145: 13991407. I Nirenberg, M. W. and J. H. Matthaei. 1961. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 47: 15881602. I Temin, H. M. and S. Mizutani. 1970. RNAdependent DNA polymerase in virions of
Funkcija eukariotskih gena

Botstein, D. and D. Shortle. 1985. Strategies and applications of in vitro mutagenesis. Science 229: 11931201. P Bronson, S. K. and O. Smithies. 1994. Altering mice by homologous recombination using embryonic stem cells. J. Biol. Chem. 269: 2715527158. P Capecchi, M. R. 1989. Altering the genome by homologous recombination. Science 244: 12881292. P Gasser, C. S. and R. T. Fraley. 1989. Genetically engineering plants for crop improvement. Science 244: 12931299. P Gordon, J. W., G. A. Scangos, D. J. Plotkin, J. A. Barbosa and F. H. Ruddle. 1980. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 73807384. I Herskowitz, I. 1987. Functional inactivation of genes by dominant negative mutations. Nature 329: 219222. P
Detekcija nukleinskih kiselina i proteina

Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl. eds. 1989. Current Protocols in Molecular Biology. New York: Greene Publishing and Wiley Interscience. Benton, W. D. and R. W. Davis. 1977. Screening gt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ. Science 196: 180182. I Broome, S. and W. Gilbert. 1978. Immunological screening method to detect specific translation products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 27462749. I Brown, P O. and D. Botstein. 1999. Exploring . the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics 21: 33-37. P
136
Poglavlje 3
Smith, M. 1985. In vitro mutagenesis. Ann. Rev. Genet. 19: 423462. P Struhl, K. 1983. The new yeast genetics. Nature 305: 391397. P Thomas, K. R. and M. R. Capecchi, 1987. Sitedirected mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell 51: 503512. I Wagner, R. W. 1994. Gene inhibition using antisense oligonucleotides. Nature 372: 333 335. P Wigler, M., R. Sweet, G. K. Sim, B. Wold, A. Pellicer, E. Lacy, T. Maniatis, S. Silverstein and R. Axel. 1979. Transformation of mammalian cells with genes from prokaryotes and eukaryotes. Cell 16: 777785. I
Horsch, R. B., J. E. Fry, N. L. Hoffmann, D. Eichholtz, S. G. Rogers and R. T. Fraley. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 12291231. I Hutvagner, G. and P D. Zamore. 2002. RNAi: . nature abhors a double-strand. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232. P Izant, J. G. and H. Weintraub. 1984. Inhibition of thymidine kinase gene expression by antisense RNA: A molecular approach to genetic analysis. Cell 36: 10071015. I Jaenisch, R. 1988. Transgenic animals. Science 240: 14681474. P Joyner, A. L., ed. 1993. Gene Targeting. A Practical Approach. Oxford, England: IRL Press. Kuhn, R., F. Schwenk, M. Aguet and K. Rajewsky. 1995. Inducible gene targeting in mice. Science 269: 14271429. I
Maliga, P D. F. Klessig, A. R. Cashmore, W. ., Gruissem and J. E. Varner, eds. 1994. Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Palmiter, R. D. and R. L. Brinster. 1986. Germline transformation of mice. Ann. Rev. Genet. 20: 465499. P Robertson, E., A. Bradley, M. Kuehn and M. Evans. 1986. Germline transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature 323: 445448. I Sedivy, J. M. 1999. Gene targeting and somatic cell genetics: A rebirth or a coming of age? Trends Genet. 15: 8890. P Sharp, P A. 2001. RNA interference 2001. . Genes Dev. 15: 485490. P
Dio
II
Protok geneti~kih informacija
4 Organizacija i redosljed stani~nih genoma 5 Replikacija, odràvanje i preslagivanje genomske DNA 6 Sinteza i dorada (sazrijevanje) RNA 7 Sinteza, dorada i regulacija proteina
Poglavlje
Organizacija i redosljedi stani~nih genoma
Sloènost eukariotskih genoma 139 Kromosomi i kromatin 150 Redosljedi ~itavih genoma 158
KLJU^NI POKUS: Otkri}e
introna 142 genom 170
KLJU^NI POKUS: Humani
DNA DAJE NACRT ZA USMJERAVANJE svih stani~nih aktivnosti kao i za odre|ivanje plana razvoja vi{estani~nih organizama. Razumijevanje strukture i funkcije gena prema tome je od fundamentalne va`nosti za razumijevanje molekularne biologije stanice. Razvoj metoda kloniranja gena predstavljao je najva`niji korak prema ovom cilju jer je omogu}io znanstvenicima seciranje sloènih eukariotskih genoma kao i prou~avanje funkcije eukariotskih gena. Kontinuirano napredovanje tehnologije rekombinantne DNA dovelo nas je sada do uzbudljivog trenutka odre|ivanja redoslijeda parova baza ~itavih genoma {to omogu}uje novi pristup de{ifriranju geneti~ke osnove pona{anja stanice. Kao {to je izloèno u 3. poglavlju, po~etna primjena tehnologije rekombinantne DNA bila je usmjerene na izolaciju i analizu pojedinih gena. Unutar posljednjih nekoliko godina, globalniji pristup sekvenciranja ~itavih genoma doveo je do sekvenciranja kompletnih genomskih redoslijeda mnogih bakterija, kvasca, nekolicine biljnih i ìvotinjskih vrsta te ~ovjeka. Potpuni redosljedi stani~nih genoma dali su bogatu ètvu informacija, me|u kojima su i otkri}a mnogih do sada nepoznatih gena. Od rezultata projekata sekvenciranja genoma o~ekuje se da }e ~itav niz godina stimulirati budu}a istraìvanja u molekularnoj i stani~noj biologiji te da }e imati zna~ajan utjecaj na na{e razumijevanje i terapiju bolesti u ~ovjeka.
AO GENETI^KI MATERIJAL,
Sloènost eukariotskih genoma

Genomi ve}ine eukariota ve}i su i sloèniji od prokariotskih (slika 4-1.). Veli~ina eukariotskih genoma nije sama po sebi iznena|uju}a, budu}i da bi se i o~ekivalo da se u sloènijim organizmima nalazi vi{e gena. Ipak, izgleda da veli~ina genoma nije u razmjeru sa geneti~kom sloèno{}u. Primjerice, genomi da`devnjaka i ljiljana sadràvaju vi{e od deset puta ve}u koli~inu DNA od ljudskoga genoma, pa ipak, posve je jasno da ovi organizmi nisu deset puta sloèniji od ljudskog. Ovaj prividni paradoks tuma~i se otkri}em da genomi ve}ine eukariotskih stanica ne sadràvaju samo funkcionalne gene ve} i velike koli~ine DNA sljedova koji ne kodiraju proteine. Razlika u veli~ini izme|u genoma da`devnjaka i ~ovjeka dakle vi{e odraàva razliku u ve}oj koli~ini nekodiraju}ih sljedova negoli u ve}em broju gena u da`devnjaka. Prisutnost velike koli~ine nekodiraju}ih slje-
140
Poglavlje 4
Slika 4-1. Veli~ina genoma.

Raspon veli~ine genoma reprezentativnih skupina organizama prikazan je na logaritamskoj skali.
Haemophilus influenzae
mikoplazma bakterije
E. coli
kvasac gljive
Arabidopsis biljke
ljiljan
vo}na mu{ica kukci
àba vodozemci
da`devnjak
pile ptice
~ovjek sisavci 105 106 107 108 109 1010 parova baza po haploidnom genomu 1011 1012
dova jest op}e svojstvo genoma sloènih eukariota. Iz toga slijedi da tisu}u puta ve}a duljina ljudskoga genoma u usporedbi s onim u E. coli nije uzrokovana samo ve}im brojem ljudskih gena. Za ljudski genom se pretpostavlja da sadràva 30.000 40.000 gena, samo 10 puta vi{e negoli onaj E. coli.
141
Prema tome, veliki dio sloènosti eukariotskih genoma rezultat je velike koli~ine nekoliko razli~itih tipova nekodiraju}ih sljedova koji ~ine ve}inu DNA u stanicama vi{ih eukariota.
Introni i egzoni
Prema molekularnoj terminologiji gen se moè definirati kao dio DNA koji se eksprimira u vidu funkcionalnog produkta i to bilo u obliku RNA (primjerice ribosomne i transportne RNA) bilo u obliku polipeptida. Neke od nekodiraju}ih DNA u eukariota ubrajaju se u duge DNA sljedove koji leè u prostorima izme|u gena (razdvojni sljedovi, engl. spacer). Me|utim, unutar ve}ine eukariotskih gena tako|er se nalaze velike koli~ine nekodiraju}ih sljedova DNA. Takvi geni imaju podijeljenu strukturu u kojima su segmenti kodiraju}ih sljedova (egzoni) razdvojeni s pomo}u nekodiraju}ih sljedova (introni) (slika 4-2). îtav gen se prepisuje u duga~ku RNA molekulu, a onda se introni uklanjaju procesom prekrajanja (engl. splicing) tako da samo egzoni ostaju uklju~eni u molekulu RNA. Iako introni nemaju nikakvu poznatu ulogu, oni predstavljaju zna~ajan dio DNA u genomima vi{ih eukariota. Introni su po prvi put neovisno otkriveni 1977. godine u laboratorijima Phillipa Sharpa i Richarda Robertsa prilikom istraìvanja replikacije adenovirusa u kultiviranim humanim stanicama. Adenovirus predstavlja koristan model za prou~avanje genske ekspresije zato {to genom ovog virusa sadràva samo oko 3,5 104 parova, baza kao i zato {to se u zaraènim stanicama proizvode velike koli~ine mRNA adenovirusa. Jedan od pristupa kori{tenih za karakterizaciju adenovirusne mRNA i{ao je preko odre|ivanja smje{taja odgovaraju}ih virusnih gena promatranjem RNA-DNA hibrida elektronskim mikroskopom. Budu}i da se RNA-DNA hibridi mogu razlikovati od jednolan~ane DNA, mogu se odrediti poloàji RNA-prijepisa na molekuli DNA. Za~udo, ovakvi eksperimenti otkrili su da se adenovirusne mRNA ne hibridiziraju samo s jednim podru~jem virusne DNA (slika 4-3). Umjesto toga, pojedina molekula mRNA hibridizira se s nekoliko odvojenih podru~ja virusnoga genoma. Iz toga slijedi da adenovirusna mRNA ne odgovara neprekidnom prijepisu DNA kalupa; zapravo, mRNA se sklapa iz nekolicine razli~itih blokova sljedova koji potje~u iz razli~itih dijelova virusne DNA. Kasnije se pokazalo da se to odvija uz pomo} prekrajanja RNA (engl. RNA splicing) {to ~emu detaljno prikazati u 6. poglavlju. Ubrzo nakon otkri}a introna u adenovirusa, primije}ena je sli~na pojava u kloniranim genima eukariotskih stanica. Primjerice, elektronskomikroskopska analiza RNA-DNA hibrida i naknadno sekvenciranje kloniranih genomskih DNA i cDNA pokazali su da je kodiraju}a regija mi{jeg b-globinskoga gena (koji kodira b podjedinicu hemoglobina) prekinuta dvama introni-
kromosomska DNA razdvojni slijed 5' 3' egzon 1 egzon 2 transkripcija primarni transkript RNA 5' prekrajanje mRNA 5' 3' 3' egzon 3 intron 1 intron 2 razdvojni slijed 3' 5'
Slika 4-2. Struktura eukariotskih gena.

Ve}ina eukariotskih gena sadràva segmente kodiraju}ih sljedova (egzoni) koji su isprekidani nekodiraju}im sljedovima (introni). Introni i egzoni zajedno se prepisuju u duga~ki primarni transkript RNA. Nakon toga se prilikom for miranja zrele mRNA prekrajanjem uklanjaju introni.
142
Poglavlje 4
Otkri}e introna
Spliced Segments at the 5' Terminus of Adenovirus 2 Late mRNA Susan M. Berget, Claire Moore, and Phillip A. Sharp
Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts Proceedings of the National Academy of Sciences USA, Volume 74, 1977, pages 31713175
Kontekst
Prije negoli se razvilo molekularno kloniranje malo se znalo o sintezi mRNA u eukariotskoj stanici. Ipak, bilo je jasno da je ovaj proces puno sloèniji u eukariota nego u bakterija. Izgledalo je da sinteza eukariotskih mRNA treba osim transkripcije tako|er i reakcije dorade koje modificiraju strukturu primar nih transkripata. Ono {to je tu bilo najzna~ajnije jest da se ~inilo kao da se eukariotske mRNA sintetiziraju u obliku duga~kih primar nih transkripata u jezgri, a onda kidaju da se stvore puno kra}e molekule mRNA koje prelaze u citoplazmu. Op}enito se smatralo da stupnjevi ovakve dorade uklju~uju uklanjanje sljedova s 5' i 3' krajeva primar noga transkripta. Prema ovome modelu, mRNA uklopljene u duga~ke primarne transkripte bile bi kodirane neprekinutim sljedovima DNA. Ovakav pogled na eukariotsku mRNA radikalno je promijenilo otkri}e prekrajanja do ~ega su neovisno do{li Berget, Moore i Sharp te Louise Chow, Richard Gelinas, Tom Broker i Richard Roberts (An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA, Cell 12: 1-8, 1977).
Moore i Sharp usmjerili su svoj pokus na mRNA koja se stvara u velikoj koli~ini, a kodira virusni struktur ni polipeptid poznat pod imenom hekson. U svrhu kartiranja heksonske mRNA u virusnom genomu, pro~i{}ena mRNA hibridizirana je s adenovirusnom DNA, a hibridne su molekule pregledane elektronskom mikroskopijom. Kao {to se i o~ekivalo glavni dio heksonske mRNA stvarao je hibride s restrikcijskim fragmentima adenovirusne DNA za koje se prethodno saznalo da sadràvaju heksonski gen. Ipak, na op}e iznena|enje, sljedovi na 5' kraju heksonske mRNA nisu se hibridizirali sa sljedovima DNA u blizini onih koji kodiraju glavni dio poruke, {to je upozorilo na to da 5' kraj mRNA molekule potje~e od sljedova koji su smje{teni na nekom drugom mjestu virusnoga genoma. Ova mogu}nost provjerena je hibridizacijom heksonske mRNA s restrikcijskim fragmentom koji se proteè uzvodno od heksonskoga gena. Hibridi izme|u mRNA i DNA koji su
Phillip Sharp
Richard Roberts
se stvarali u ovom pokusu pokazali su sloènu strukturu u obliku petlji (vidi sliku). Glavnina mRNA stvorila je duga~ku hibridnu regiju s prethodno identificiranim heksonskim sljedovima DNA. Iznena|uju}e je bilo da se 5' kraj heksonske mRNA hibridizirao s tri kratke uzvodne regije DNA koje su bile odvojene jedna od druge i od glavnine transkripta velikim jednolan~anim petljama DNA. Pokazalo se da se sljedovi na 5' kraju heksonske
Eksperimenti
Obje istraìva~ke skupine koje su otkrile prekrajanje koristile su adenovirus 2 za istraìvanje sinteze mRNA hibrid A u ljudskim stanicama. Najve}a prednost virusa jest u tome da predstavlja model koji je puno jednostavniji od stanice doma}ina. Virusna DNA moè B 3' se izravno izolirati iz virusnih ~estica, a mRNA molekule koje kodiraju virusne strukturne proteine prisutne su u tako velikoj koli~ini da se mogu izravno Elektronskomikroskopska slika i pra}enje heksonske mRNA koja se hibridizirala s adenovirusnom DNA. Jednolan~ane petlje ozna~ene A, B i C odgovaraju intronima. pro~istiti iz zaraènih stanica. Berget,
143
mRNA prepisuju iz triju odvojenih regija virusnoga genoma koje su se prekrajanjem povezale s glavnim dijelom mRNA za vrijeme dorade duga~kog primarnog transkripta.
Utjecaj
Nakon otkri}a prekrajanja adenovirusne mRNA, brzo su uslijedili sli~ni pokusi sa stani~nim mRNA koji su pokazali da eukariotski geni imaju prethodno posve nepredvi|enu strukturu. Njihovi kodiraju}i sljedovi nisu bili kontinuirani nego su ih prekidali
introni koji su se odstranjivali prekrajanjem primarnoga prijepisa. Za introne se danas znade da ~ine veliki dio DNA eukariotskih genoma, a uloga introna u evoluciji i regulaciji genske ekspresije predstavlja podru~je koje se i dalje aktivno prou~ava. Otkri}e prekrajanja tako|er je potaklo veliko zanimanje za mehanizam ove neo~ekivane reakcije dorade mRNA. Kao {to je prikazano u 6. poglavlju, ove studije nisu samo rasvijetlile nove mehanizme regulacije genske ekspresije; one su tako|er otkrile nove kataliti~ke aktivnosti
RNA i podastrle va`ne podatke koji podupiru hipotezu po kojoj je rana evolucija bila bazirana na samoumnaàju}im RNA molekulama. Tako se pokazalo da je neo~ekivana struktura adenovirusne mRNA imala golem utjecaj na razli~ita podru~ja stani~ne i molekularne biologije.
ma koji se uklanjaju prekrajanjem (slika 4-4). Intronsko-egzonska struktura mnogih eukariotskih gena prili~no je komplicirana, a koli~ina DNA u intronskim sljedovima ~esto je ve}a od one u egzonima. Slijed ljudskoga genoma upu}uje na to da prosje~an humani gen sadràva otprilike 9 egzona, da je
heksonski gen (A) egzoni 1 adenovirusna DNA 1 2 introni 3 2 3 4
(B) jednolan~ana DNA
intron 3
5' kraj RNA egzon 2 egzon 1 intron 1 egzon 3 egzon 4 intron 2 3' kraj RNA RNA-DNA hibrid
Slika 4-3. Identifikacija introna u adenovirusnoj mRNA.

Gen za kodiranje adenovirusnoga heksona (glavni strukturni protein virusne ~estice) sastoji se od ~etiriju egzona koji su isprekidani trima intronima. (B) Prikaz elektronskomikroskopske fotografije hipoteti~koga hibrida izme|u heksonske mRNA i dijela adenovirusne DNA. Egzoni su prikazani kao podru~ja RNA-DNA hibrida koja su razdvojena jednolan~anim petljama DNA koje odgovaraju intronima.
144
Poglavlje 4
Slika 4-4. Mi{ji b-globinski gen

Ovaj gen sadràva dva introna koji dijele kodiraju}u regiju na tri egzona. Egzon 1 kodira aminokiseline 1 do 30, egzon 2 kodira aminokiseline 31 do 104, a egzon 3 kodira aminokiseline 105 do 146. Egzoni 1 i 3 tako|er sadràvaju regije koje se ne prevode (UTR) prvi na na 5', a drugi na 3' kraju mRNA.
egzon 1 DNA 5' 3'
intron 1
egzon 2
intron 2
egzon 3 3' 5'
transkripcija prekrajanje egzon 1 mRNA 5' 5' UTR translacija 3' UTR egzon 2 egzon 3 3'
protein 1 30 104 146
isprekidan s 8 introna i raspore|en na oko 30.000 parova baza (30 kilobaza ili kb) genomske DNA. Op}enito egzoni ~ine samo oko 2 kb, pa prema tome vi{e od 90% prosje~noga humanoga gena ~ine introni. Introni su prisutni u ve}ini gena sloènih eukariota, iako ne predstavljaju univerzalnu pojavu. Primjerice, introni nedostaju u gotovo svim histonskim genima, pa je prema tome jasno da introni nisu potrebni za funkcioniranje gena u eukariotskim stanicama. Tako|er treba dodati da introni nisu na|eni ni u ve}ini gena jednostavnih eukariota kao {to kvasci. Nasuprot tome, introni jesu prisutni u nekim rijetkim genima prokariota. Prisutnost ili odsutnost introna prema tome ne predstavlja apsolutnu razliku izme|u prokariotskih i eukariotskih gena iako su introni daleko ~e{}i u vi{ih eukariota (biljaka i ìvotinja) gdje na njih otpada znatan dio cjelokupne genomske DNA. Ve}ina introna ne odre|uje sintezu nekoga stani~nog proizvoda, iako postoji mali broj introna koji kodiraju funkcionalne RNA ili proteine. Ipak, introni igraju va`nu ulogu u kontroli genske ekspresije. Primjerice, prisutnost introna omogu}uje da se egzoni nekoga gena mogu spajati u razli~ite kombinacije {to rezultira sintezom razli~itih proteina na temelju jednog te istoga gena. Ovaj se proces naziva alternativno prekrajanje (engl. alternative splicing) (slika 4-5.), a budu}i da se zbiva ~esto u genima sloènih eukariota, smatra se va`nim za pove}anje repertoara funkcija 30.000 40.000 gena ljudskoga genoma. Za introne se tako|er misli da su odigrali va`nu ulogu u evoluciji olak{avaju}i rekombinaciju izme|u regija za kodiranje proteina (egzona) razli~itih gena procesom koji je poznat pod imenom mije{anje egzona (engl. exon shuffling). Egzoni ~esto kodiraju funkcionalno razli~ite proteinske domene, pa bi rekombinacija me|u intronima razli~itih gena rezultirala novim genima koji sadràvaju nove kombinacije sljedova za kodiranje proteina. U skladu s ovom hipotezom, prou~avanja posve}ena sekvenciranju pokazala su da su neki geni egzonske kimere izvedene od nekolicine gena, a to predstavlja direktni dokaz da novi geni mogu nastati rekombinacijom izme|u intronskih sljedova. O evolucijskom podrijetlu introna postoje kontroverzna stajali{ta. Postoji mogu}nost da su introni bili prisutni rano u evoluciji, prije odvajanja prokariotskih i eukariotskih stanica. Prema ovoj hipotezi, introni su igrali va`nu ulogu u po~etnom sklapanju sljedova za kodiranje proteina u drevnih predaka dana{njih stanica. Nakon toga, introni su se postupno gubili iz ve}ine gena prokariota i jednostavnijih eukariota (primjerice kvasaca) kao odgovor na evolucijsku selekciju koja je davala prednost brzoj replikaciji, pa je to dovelo do bolje proto~nosti u genomima tih organizama. Me|utim, kako
145
kromosomska DNA
5' 3'
egzon 1
egzon 2
egzon 3
egzon 4
egzon 5
egzon 6
3' 5'
transkripcija primarni RNA-prijepis 5' 1 2 3 4 alternativno prekrajanje molekule mRNA 1 2 4 5 translacija 6 1 3 5 6 1 3 4 5 translacija 6 5 6 3'
translacija
4 protein 1 1 2
5 protein 2 6 1 3
5 protein 3 6
4 1
5 6 3
Slika 4-5. Alternativno prekrajanje

Gen prikazan na slici sadràva {est egzona koji su razdvojeni s pomo}u pet introna. Alternativno izrezivanje omogu}uje ovim egzonima da se poveù na razli~ite na~ine, pa se stvaraju tri razli~ite mRNA molekule i tri razli~ita proteina iz jednoga primarnoga transkripta..
brza dioba ne predstavlja prednost u vi{ih organizama, introni su se zadràli u njihovim genomima. S druge strane, introni su mo`da nastali kasnije tijekom evolucije kao rezultat ugradnje sljedova DNA u gene koji su se prethodno formirali kao kontinuirani sljedovi za kodiranje proteina. Mije{anje gena je onda vjerojatno moralo igrati va`nu ulogu u daljnjoj evoluciji gena u vi{ih eukariota iako nije bilo va`no za po~etno sklapanje kodiraju}ih sljedova prije evolucijskog odvajanja prokariotskih i eukariotskih stanica.
Ponavljaju}i (repetitivni) sljedovi DNA

Introni daju svoj veliki prinos veli~ini genoma vi{ih eukariota. U ljudi, primjerice, introni iznose otprilike 25% ukupne genomske DNA. Ipak, jedan jo{ ve}i dio sloènih eukariotskih genoma sastoji se od visoko ponovljenih nekodiraju}ih sljedova DNA. Ovi sljedovi, koji su ponekad zastupljeni stotinama tisu}a kopija po genomu, prvi su prona{li Roy Britten i David Kohne za vrijeme prou~avanja brzine reasocijacije denaturiranih fragmenata stani~ne DNA (slika 4-6). Denaturirani lanci DNA hibridiziraju se jedan s drugim (reasociraju) ponovno stvaraju}i dvostruku uzvojnicu (vidi sliku 3.25). Budu}i da je reasocijacija DNA uzvojnice bimolekularna reakcija (dva razdvojena lanca moraju se sudariti jedan s drugim ne bi li se hibridizirali), brzina reasocijacije ovisi o koncentraciji lanaca DNA. Kad se pustilo denaturirane fragmente DNA E. coli da se me|usobno hibridiziraju, sva DNA jednoliko se reasocirala kao {to bi se i o~ekivalo da je u genomu svaki sljed DNA prisutan samo jednom. Ipak, reasocijacija fragmenata DNA izdvojenih iz stanica sisavaca pokazala je posve druga~iju sliku. Otprilike 50% DNA fragmenata reasociralo se brzinom predvi|enom za sljedove koji su prisutni samo jednom u genomu, a ostatak se reasocirao puno brè nego {to bi se o~ekivalo. Ovi rezultati protuma~eni su time da u genomu neki sljedovi postoje u vi{e kopija pa se zbog toga reasociraju puno brè od sljedova koji su prisutni samo jednom. Ovi su pokusi posebno uputili na to da se pribli`no 50% DNA sisavaca sastoji od visokorepetitivnih sljedova, od kojih su neki ponovljeni ~ak 105 do 106 puta.
146
Poglavlje 4
Slika 4-6. Identifikacija repetitivnih sljedova pomo}u reasocijacije DNA.

Kinetika reasocijacije fragmenata DNA E. coli i goveda prikazana je kao funkcija C0t {to predstavlja po~etnu koncentraciju DNA pomnoènu s vremenom inkubacije. DNA E. coli reasocira se jednoliko {to je u skladu s ~injenicom da je svaki fragment DNA prisutan sa samo jednom kopijom u genomu od 4,7 106 parova baza. Za razliku od toga fragmenti DNA goveda pokazuju dva razli~ita na~ina reasocijacije. Oko 60% DNA fragmenata (neponovljeni sljedovi) reasociraju se sporije nego DNA E. coli kao {to se i o~ekuje za sljedove koji su prisutni u jednoj kopiji u ve}em genomu goveda (3 109 parova baza). Ipak, ostalih 40% fragmenata DNA goveda (ponovljeni sljedovi) reasociraju se brè od DNA E. coli {to upu}uje na to da postoje vi{estruke kopije pojedinih sljedova.
frakcija preostale jednolan~ane DNA
1,0
g govedski ponovljeni sljedov dski sljedovi E. coli DNA A neponovljeni p sljedovi e u goveda
0,5
103
102
101
10 C0t ( s)
102
103
104
Daljnje analize, koje su svoj vrhunac doìvjele sekvenciranjem ~itavih genoma, identificirale su nekoliko vrsta ovakvih visoko ponovljenih sljedova (tablica 4-1). Jedna od tih vrsti, koja spada me|u repetitivne sljedove nazvane ponavljanja jednostavnih sljedova (engl. simple-sequence repeats), sastoji se od uzastopno ponovljenih nizova nekoliko tisu}a kopija kratkih sljedova duljine od 1 do 500 nukleotida. Primjerice, jedan tip ponavljanja jednostavnih sljedova u vinske mu{ice sastoji se od uzastopnih ponavljanja jedinice od sedam nukleotida ACAAACT. Zbog njihova jedinstvenog sastava, mnoge ponovljene jednostavne DNA mogu se izdvojiti iz ostatka genomske DNA ravnote`nim centrifugiranjem u gradijentima gusto}e CsCl. Gusto}a DNA odre|ena je sastavom baza, pa sljedovi bogati AT bazama posjeduju manju gusto}u negoli sljedovi bogati GC bazama. Zbog toga, jednostavni slijed bogat AT bazama smje{ta se u gradijentima CsCl u podru~ju manje gusto}e od velike ve}ine genomske DNA vinske mu{ice (slika 4-7). Budu}i da ovakvi ponovljeni sljedovi ~ine prugu u obliku satelita odvojenih od glavne pruge DNA, ~esto se o njima govori kao o satelitnim DNA. Ovi sljedovi ponavljaju se na milijune puta u genomu pa ~ine oko 10% DNA u ve}ine vi{ih eukariota. Ponavljanja jednostavnih sljedova ne prepisuju se i ne predstavljaju funkcionalnu geneti~ku informaciju. Neka ipak igraju va`nu ulogu u strukturiranju kromosoma, o ~emu }emo raspravljati u sljede}em odlomku ovoga poglavlja.
Tablica 4-1. Repetitivni sljedovi u humanom genu

Vrsta slijeda
Ponavljanje jednostavnih sljedovaa Retrotranspozoni LINE SINE Elementi sli~ni retrovirusu DNA transpozoni
a
Broj kopija
>1.000.000 850.000 1.500.000 450.000 300.000
Dio genoma
10% 21% 13% 8% 3%
Koli~ina ponavljanja jednostavnih sljedova procijenjena je prema udjelu heterokromatina u ljudskom genomu.
147
Ostali ponovljeni sljedovi DNA prije su ra{trkani po genomu negoli nakupljeni u obliku uzastopnih ponavljanja. Ovi razbacani ponovljeni elementi najvi{e pridonose veli~ini genoma ~ine}i otprilike 45% ljudske genomske DNA. Dvije naj~e{}e vrste takvih sljedova zovu se SINE (engl. short interspersed elements) kratki razbacani elementi i LINE (engl. long interspersed elements) dugi raspr{eni elementi. SINE sadràvaju 100 300 parova baza. Oko 1,5 milijun ovakvih sljedova pro{ireno je po genomu, te ~ine otprilike 13% ukupne ljudske DNA. Iako se SINE prepisuju u RNA, ne kodiraju nikakve proteine i nepoznata im je funkcija. Najve}i ljudski LINE su duljine 6 8 kb iako su mnogi ponovljeni sljedovi izvedeni iz LINE kra}i, s prosje~nom veli~inom od oko 1 kb. U genomu postoji oko 850.000 LINE ponavljanja {to ~ini oko 21% ljudske DNA. LINE se prepisuju i barem neki kodiraju proteine, ali kao i za SINE nepoznata im je uloga u stani~noj fiziologiji. I SINE i LINE su primjeri pokretnih elemenata koji se mogu pomicati na razli~ita mjesta u genomskoj DNA. Kao {to se detaljno raspravlja u 5. poglavlju, i SINE i LINE su retrotranspozoni, pa se njihova transpozicija odvija preko reverzne transkripcije. RNA kopija SINE ili LINE u stanici se pretvara u DNA uz pomo} reverzne transkriptaze, pa se ugra|uje na drugom mjestu u genomu. Raspr{eni repetitivni sljedovi tre}e vrste tako|er se pomi~u unutar genoma uz pomo} reverzne transkriptaze, jako su nalik na retroviruse, pa se stoga i zovu retrovirusu-sli~ni elementi (engl. retrovirus-like elements). Humani retrovirusu-sli~ni elementi imaju raspon duljine od otprilike 2 10 kb. U ljudskom genomu prisutno je oko 450.000 retrovirusu-sli~nih elemenata {to iznosi oko 8% ljudske DNA. Za razliku od toga, retrovirusu--sli~ni elementi ~etvrte vrste (DNA transpozoni) pomi~u se kroz genom kopiranjem i ugradnjom u obliku sljedova DNA radije negoli pokretanjem uz pomo} reverzne transkripcije. U ljudskom genomu prisutno je oko 300.000 kopija DNA-transpozona veli~ine od 80 3.000 parova baza, a ~ine oko 3% ljudske DNA. Prema tome, blizu polovine ljudskoga genoma sastoji se od raspr{enih repetitivnih elemenata koji su se replicirali i putovali kroz genom bilo preko RNA- bilo preko DNA-posrednika, pa je tako reverzna transkripcija bila odgovorna za oblikovanje preko 40% humanoga genoma. Neki od ovih sljedova mogu regulirati gensku ekspresiju, ali ve}ina ponovljenih sljedova, po svemu sude}i, ne daje nikakav korisni prinos stanici. Umjesto toga, one su
1,701 (glavna pruga)
koli~ina DNA
(IV) 1,705
(II + III) 1,687 (I) 1,672
gusto}a (g/cm3)
Slika 4-7. Satelitna DNA.

Ravnote`nim centrifugiranjem DNA vinske mu{ice u gradijentu gusto}e CsCl razdvaja se satelitna DNA (ozna~ena brojevima I IV) s gusto}ama od 1,672, 1,687 i 1,705 g/cm3, od glavne pruge genomske DNA ~ija je gusto}a 1,701 g/cm3.
retrotranspozon kromosomska DNA transkripcija RNA reverzna transkripcija
retrotranspozonska DNA integracija u kromosomsku DNA novo kromosomsko mjesto retrotranspozon
Slika 4-8. Pokretanje retrotranspozona.

Retrotranspozon smje{ten na jednom mjestu u kromosomskoj DNA prepisuje se u RNA, a zatim se pretvara u DNA uz pomo} reverzne transkriptaze. Retrotranspozonska DNA moè se tada ugraditi u neko drugo kromosomsko mjesto.
148
Poglavlje 4
izgleda, predstavnici sebi~nih DNA elemenata koji su selekcionirani zbog vlastite sposobnosti da se umnaàju u genomu, a ne zbog neke selektivne prednosti va`ne za njihovog doma}ina. U nekim slu~ajevima, pokretni su elementi, izgleda, igrali va`ne evolucijske uloge jer su potakli pregradnju gena i pridonosili stvaranju geneti~ke raznolikosti.
Duplikacija gena i pseudogeni

Sljede}i faktor koji pridonosi veli~ini eukariotskih genoma jest ~injenica da mnogi geni postoje u vi{e kopija od kojih su neke ~esto nefunkcionalne. Vi{estruke kopije nekih gena koriste se za slu~ajeve proizvodnje RNA ili proteina potrebnih u velikim koli~inama poput ribosomnih RNA ili histona. S druge strane, odre|eni ~lanovi skupine srodnih gena (porodice gena) mogu se prepisivati u razli~itim tkivima ili u razli~itim stadijima razvoja. Primjerice, a i b podjedinice hemoglobina u humanom su genomu kodirane dvjema porodicama gena, a razli~iti ~lanovi ovih porodica eksprimiraju se u embrionalnim, fetalnim ili odraslim tkivima (slika 4-9). ^lanovi mnogih genskih porodica (primjerice globinski geni) sakupljeni su u jednom podru~ju DNA; ~lanovi ostalih genskih porodica raspr{eni su u razli~itim kromosomima. Smatra se da su porodice gena nastale duplikacijom izvornoga pradjedovskoga gena, a razli~iti ~lanovi porodice zatim su se odvajali kao posljedica mutacija nastalih tijekom evolucije. Ovakva divergencija moè voditi evoluciji srodnih proteina koji optimalno funkcioniraju u razli~itim tkivima ili u razli~itim fazama razvoja. Primjerice, fetalni globini posjeduju vi{i afinitet za O2 negoli globini odraslog razlika koja omogu}uje fetusu da dobije O2 iz maj~inske cirkulacije. Ipak, kao {to bi se i moglo o~ekivati, sve mutacije ipak ne pove}avaju funkciju gena. Neke kopije gena umjesto toga imaju odràne mutacije koje rezultiraju gubitkom sposobnosti za proizvodnju funkcionalnoga genskog produkta. Primjerice, svaka od ljudskih a i b-globinskih genskih porodica sadràva dva gena koji su bili inaktivirani mutacijom. Ovakve nefunkcionalne kopije gena (zvane pseudogeni) predstavljaju evolucijske relikte koji pove}avaju veli~inu eukariotskih genoma, a ne daju nikakav funkcionalni geneti~ki doprinos. Duplikacije gena mogu nastati preko dvaju razli~itih mehanizama. Prvi predstavlja duplikaciju dijela DNA koja moè rezultirati prijenosom bloka sljedova DNA na novu lokaciju u genomu. Za ovakve duplikacije DNA seg-
a-globinski lokus kromosom 16
razdvojni slijed
yz
ya1
a2
a1
embrijski
pseudogeni razdvojni slijed
fetalni i odrasli Ag yb1 d b
b-globinski lokus kromosom 11
yb2
Gg
pseudogen embrijski
fetalni
pseudogen
odrasli
Slika 4-9. Porodice globinskih gena
^lanovi ljudskih - i -globinskih genskih porodica grupirani su na kromosomima 16 i 11. Svaka porodica sadrì gene koji se specifi~no eksprimiraju ili u tkivima embrija, fetusa ili odrasloga organizma, kao i nefunkcionalne kopije gena (pseudogeni).
149
egzon 1 gen 5' 3'
intron 1
egzon 2
intron 2
egzon 3 3 3' 5'
Slika 4-10. Formiranje dora|enoga pseudogena.

Gen se prepi{e i prekroji da bi se stvorila mRNA bez introna. Tada se mRNA kopira s pomo}u reverzne transkriptaze, pa nastaje cDNA bez introna. Integracija u kromosomsku DNA rezultira for miranjem dora|enoga pseudogena.
transkripcija prekrajanje mRNA reverzna transkripcija integracija u novo kromosomsko mjesto dora|eni pseudogen
menata duljine od 1 kb do vi{e od 50 kb procjenjuje se da iznose oko 5% ljudskoga genoma. Za razliku od toga, geni se mogu duplicirati obrnutim prepisivanjem mRNA, nakon ~ega slijedi ugradnja cDNA-kopije na neko novo kromosomsko mjesto (slika 4-10). Ovaj na~in duplikacije gena, analogan transpoziciji ponovljenih elemenata koji se pokre}u preko RNA-posrednika, rezultira stvaranjem genskih kopija kojima nedostaju introni, pa nemaju ni normalne kromosomske sljedove za regulacija prepisivanja gena u mRNA. Kao rezultat toga, duplikacija gena reverznom transkripcijom obi~no proizvodi jednu inaktivnu kopiju gena koja se zove dora|eni pseudogen. Procjenjuje se da u ljudskom genomu postoji nekoliko tisu}a ovakvih pseudogena.
Sastav genoma vi{ih eukariota

Budu}i da se raspravljalo o nekoliko vrsta nekodiraju}ih DNA koje pridonose genomskoj sloènosti u vi{ih eukariota, zanimljivo bi bilo dati pregled sastava stani~nih genoma. U bakterijskih genoma, ve}ina DNA kodira proteine. Primjerice, genom E. coli dug je oko 4,6 106 parova baza i sadràva oko 4.000 gena, a blizu 90% DNA koristi se za kodiranje proteina. Genom kvasca koji se sastoji od 12 106 parova baza, otprilike je 2,5 puta ve}i od genoma E. coli, ali je jo{ uvijek dosta kompaktan. Samo 4% gena Saccharomyces cerevisiae sadràva introne, a oni onda obi~no imaju samo jedan mali intron blizu starta kodiraju}ega slijeda. Otprilike 70% kva{~eva genoma koristi se za kodiranje proteina, {to ukupno odre|uje oko 6.000 proteina. Relativno jednostavni ìvotinjski genomi C. elegans i vinske mu{ice oko 10 puta su ve}i od kva{~eva genoma, ali sadràvaju samo 23 puta vi{e gena. Umjesto toga, ovi jednostavni ìvotinjski genomi imaju vi{e introna i vi{e ponovljenih sljedova tako da sljedovi za kodiranje proteina predstavljaju samo otprilike 25% genoma C. elegans i oko 13% genoma vinske mu{ice. Genom biljnoga modela Arabidopsis sadràva sli~an broj gena, a otprilike 26% genoma predstavlja sljedove za kodiranje proteina. Genomi vi{ih ìvotinja (kao i ljudi) otprilike su 2030 puta ve}i od onih C. elegans i vinske mu{ice. Ipak, najve}e iznena|enje nakon de{ifriranja sljeda humanoga genoma bilo je otkri}e da ljudski genom ima samo oko 30.00040.000 gena to~no dvostruki broj gena od onoga u genomima C. elegans i vinske mu{ice. Izgleda da samo 11,5% humanog genoma sadràva sljedove koje kodiranju proteine. Otprilike 25% genoma sastoji se od introna, vi{e od 60% sastavljeno je od razli~itih tipova repetitivne i duplicirane DNA, dok ostatak odgovara pseudogenima, neponovljenim sljedovima koji razmi~u gene i egzonskim sljedovima koji su prisutni na 5' i 3' kraju mRNA,
150
Poglavlje 4
ali se ne prevode u protein. Pove}anje genoma vi{ih eukariota, prema tome, daleko je vi{e posljedica prisutnosti velikih koli~ina ponovljenih sljedova i introna nego pove}anoga broja gena.
Kromosomi i kromatin
Ne samo da su genomi ve}ine eukariota daleko sloèniji negoli oni u prokariota, nego je tako|er DNA eukarotskih stanica organizirana druga~ije negoli ona prokariotskih. Genom prokariota sadràn je u jednom kromosomu koji je obi~no kru`na molekula DNA. Za razliku od toga, genom eukariota sastavljen je od vi{e kromosoma od kojih svaki sadràva linearnu molekulu DNA. Iako broj i veli~ina kromosoma zna~ajno varira me|u vrstama (tablica 4-2), osnovna im je struktura jednaka u svih eukariota. DNA eukariotskih stanica ~vrsto je vezana na male bazi~ne proteine (histone) koji u stani~noj jezgri pravilno pakiraju DNA. To je poprili~na zada}a s obzirom na to da ukupna duljina rastegnute DNA u ljudskoj stanici iznosi skoro 2 m, a mora se uklopiti u jezgru ~iji je promjer svega 5 do 10 mm.
Kromatin
Kompleks izme|u eukariotske DNA i proteina zove se kromatin, a tipi~no sadràva dvostruko vi{e proteina nego DNA. Glavni proteini kromatina su histoni, mali proteini koji proporcionalno imaju puno vi{e bazi~nih aminokiselina (arginin i lizin) koje olak{avaju vezanje na negativno nabijenu molekulu DNA. Postoji pet velikih tipova histona koji se zovu H1, H2A, H2B, H3 i H4, a vrlo su sli~ni u razli~itih eukariotskih vrsta (tablica 4-3). Histona ima neobi~no mnogo u eukariotskoj stanici; njihova zajedni~ka ukupna masa otprilike je jednaka masi stani~ne DNA. Osim toga, kromatin ima pribli`no jednaku masu velikog broja razli~itih nehistonskih kromosomskih proteina.
Tablica 4-2. Broj kromosoma u eukariotskim stanicama

Organizam
Kvasac (Saccharomyces cerevisiae) Sluzava plijesan (Dictyostelium) Arabidopsis thaliana Kukuruz Crveni luk Ljiljan Nematoda (Caenorhabditis elegans) Vinska mu{ica (Drosophila) @aba (Xenopus laevis) Slatkovodna riba dvodihalica Pile Mi{ Krava Pas ôvjek
Veli~ina genoma (Mb)a

12 70 125 5.000 15.000 50.000 97 180 3.000 50.000 1.200 3.000 3.000 3.000 3.000
Broj kromosomaa
16 7 5 10 8 12 6 4 18 17 39 20 30 39 23
a Veli~ina genoma i broj kromosoma odnose se na haploidne stanice. Mb = milijun parova baza.
151
Tablica 4-3. Glavni histonski proteini

Histona
H1 H2A H2B H3 H4
Molekularna teìna
22.500 13.960 13.774 15.273 11.236
Broj aminokiselina
244 129 125 135 102
Postotak lizina + arginina

30,8 20,2 22,4 22,9 24,5
a Podatci se odnose na kuni}je i govedsko meso.
Ima vi{e od tisu}u razli~itih tipova ovih proteina koji su uklju~eni u cijeli niz aktivnosti uklju~iv{i replikaciju DNA i gensku ekspresiju. Osnovnu strukturnu jedinicu kromatina, nukleosom, opisao je, 1974. godine, Roger Kornberg (slika 4-11). Dva tipa pokusa dovela su Kornberga do predlaganja nukleosomskog modela. Prvo, djelomi~na razgradnja kromatina s pomo}u mikrokokalne nukleaze (enzim koji razgra|uje DNA) proizvela je fragmente DNA duge oko 200 parova baza. Za razliku od toga, sli~na razgradnja gole DNA (koja nije bila vezana s proteinima) dala je jednoli~ni razmaz slu~ajno razgra|enih fragmenata razli~itih veli~ina. Ovi rezultati dali su naslutiti da vezanje proteina na DNA {titi odre|ena podru~ja DNA od
(A) ~estica nukleosomske srì p
Slika 4-11. Organizacija kromatina u nukleosomima.

(B) intervali od 200 parova baza (C) 800 600 400 smjer putovanja
200 50 nm
DNA se omota oko histona u ~esticama nukleosomske srì i zape~ati H1 histonom. Nehistonski proteini veù se na nit DNA koja povezuje ~estice s nukleosomskom srì. (B) Gel-elektroforeza DNA fragmenata dobivena djelomi~nom razgradnjom kromatina mikrokokalnom nukleazom. Vezna DNA izme|u ~estica nukleosomske srì pokazuje posebnu osjetljivost, tako da ograni~ena razgradnja kromatina daje fragmente koji odgovaraju vi{estrukim umno{cima jedinice od 200 parova baza. (C) Elektronskomikroskopska slika izduènoga kromatinskoga vlakna koja prikazuje njegov zrnati izgled. (B, ljubazno{}u Rogera Kornberga, Univerzitet Stanford; C, ljubazno{}u Ade L. Olins i Donalda E. Olins, Nacionalni laboratorij Oak Ridge.)
parovi baza
152
(A)
Poglavlje 4
po dvije molekule H2A, H2B, H3 i H4
Slika 4-12. Struktura kromatosoma.

êstica nukleosomske srì sastoji se od 146 parova baza DNA omotanih 1,65 puta oko histonskog oktamera koji sadràva po dvije molekule H2A, H2B, H3 i H4. Kromatosom sadràva dva puna okreta DNA (166 parova baza) koje drì na mjestu jedna molekula H1. (B) Model ~estice nukleosomske srì. DNA osi prikazane su sme|om i tirkiznom bojom. Histoni su prikazani plavom (H3), zelenom (H4), ùtom (H2A) i crvenom (H2B) bojom (B, iz K. Luger i sur., 1997. Nature 389:251.)
DNA
H1
11 nm (B)
razgradnje nukleazom tako da enzimi mogu napasti DNA samo na mjestima koja su udaljena oko 200 parova baza. U skladu s time, elektronska mikroskopija otkrila je da kromatinska vlakna imaju zrnca koja su smje{tena u razmacima od otprilike 200 parova baza. Tako su obje metode, razgradnja nukleazom i elektronska mikroskopija dovele do pretpostavke da je kromatin sastavljen od ponavljaju}ih jedinica veli~ine 200 parova baza pod imenom nukleosomi. Sna`nija razgradnja kromatina mikrokokalnom nukleazom davala je ~estice (nazvane ~estice nukleosomske srì) koje odgovaraju zrncima vidljivima pod elektronskim mikroskopom. Detaljnom analizom ovih ~estica pokazalo se da one sadràvaju 146 parova baza DNA omotanih 1,65 puta oko histonske srì koja se sastoji od po dviju molekula H2A, H2B, H3 i H4 histona (slika 4-12). Po jedna molekula petoga histona H1 ulazi u svaku ~esticu histonske srì veù}i se na DNA. Ovo ~ini kromatinsku podjedinicu poznatu kao kromatosom koja se sastoji od 166 parova baza DNA omotanih oko histonske srì koje zajedno drì H1 (vezni histon). Pakiranje DNA s pomo}u histona daje kromatinsko vlakno promjera od oko 10 nm, a koje je sastavljeno od kromatosoma odvojenih veznom (engl. linker) DNA koja je duga oko 80 parova baza (slika 4-13). Pod elektronskim
Slika 4-13. Kromatinska vlakna.

Pakiranje DNA u nukleosome daje kromatinsko vlakno promjera otprilike 10 nm. Kromatin se dalje kondenzira savijanjem u vlakno debljine 30 nm koje sadràva oko {est nukleosoma po navoju. (fotografije ljubazno{}u Ade L. Olins i Donalda E. Olinsa, Nacionalni laboratorij Oak Ridge.)
~estica nukleosomske srì
30 nm DNA 10 nm
10-nm vlakno
30-nm vlakno
100 nm
100 nm
153
Slika 4-14. Interfazni kromatin.

Elektronskomikroskopska slika interfazne jezgre. Eukromatin je rasprostranjen po ~itavoj jezgri. Heterokromatin je ozna~en vrhovima strjelica, a nukleolus strjelicom. (Ljubazno{}u Ade. L. Olins i Donalda E. Olinsa, Nacionalni laboratorij Oak Ridge).
1 mm
mikroskopom ovo vlakno debljine 10 nm ima izgled zrnate ogrlice {to je i upozorilo na nukleosomski model. Pakiranje DNA u ovakva kromatinska vlakna debljine 10 nm skra}uje njegovu duljinu za oko {est puta. Kromatin se dalje moè kondenzirati namatanjem u vlakna debljine 30 nm ~ija struktura se tek mora otkriti. Izgleda da u tom stadiju kondenzacije kromatina va`nu ulogu igraju interakcije izme|u molekula H1 histona. Stupanj kondenzacije kromatina mijenja se tijekom ìvotnog ciklusa stanice. U interfaznim stanicama (stanicama koje se ne dijele) ve}ina kromatina (nazvanog eukromatin) relativno je dekondenzirana i pro{irena kroz cijelu jezgru (slika 4-14). Tijekom ove faze stani~noga ciklusa, geni se prepisuju, a DNA se udvostru~uje u sklopu pripreme za diobu stanice. Ve}ina kromatina interfazne jezgre prisutna je, izgleda, u obliku vlakana debljine 30 nm te je organizirana u velike petlje koje sadràvaju oko 50 do 100 kb DNA. Geni koji se aktivno prepisuju dekondenziraniji su, {to ~ini DNA pristupa~nijom sustavu za transkripciju. Prema tome struktura kromatina blisko je vezana za kontrolu genske ekspresije u eukariota o ~emu }emo raspravljati u 6. poglavlju. Za razliku od eukromatina, otprilike 10% interfaznog kromatina (nazvanog heterokromatin) nalazi se u posebno kondenziranom stanju nalik na ono u kojem se nalazi kromatin tijekom mitoze stanice. Heterokromatin je transkripcijski neaktivan i sadràva visoko ponovljene sljedove DNA poput onih koje su prisutne u centromerama i telomerama. Kako stanica ulazi u mitozu, njezini kromosomi postaju visoko kondenzirani da bi se mogli prenositi u stanice-k}eri. Smatra se da se petlje kromatin-
Slika 4-15. Kondenzacija kromatina za vrijeme mitoze.

Pretra`na elektronskomikroskopska slika metafaznog kromosoma. Dodano je umjetno obojenje (Biophoto Associates/Photo Researches Inc.)
10 mm
154
Poglavlje 4
Slika 4-16. Struktura metafaznih kromosoma.

Elektronskomikroskopska slika om~i DNA koje se hvataju na proteinski kostur metafaznih kromosoma iz kojih su uklonjeni histoni (Iz: J. R. Paulson i U. K. Lemmli, 1977. Cell 12:817.)
proteinski kostur
om~e DNA
skog vlakna debljine 30 nm dalje presavijaju kako bi oblikovale zgusnute metafazne kromosome mitoti~kih stanica u kojima se DNA kondenzira skoro 10.000 puta (slika 4-15). Ovako zgusnuti kromatin vi{e ne moè posluìti kao kalup za sintezu RNA, pa transkripcija prestaje za vrijeme mitoze. Elektronskomikroskopske slike upu}uju na to da je DNA metafaznih kromosoma organizirana u velike om~e koje su pri~vr{}ene za proteinski kostur (slika 4-16), ali trenuta~no ne razumijemo ni detaljnu strukturu ovakvog visoko kondenziranog kromatina, niti mehanizam kondenzacije kromatina. Metafazni kromosomi su toliko visoko kondenzirani da se njihova struktura moè prou~avati svjetlosnom mikroskopijom (slika 4-17). Nekoliko tehnika bojenja daju karakteristi~ne obrasce svijetlih i tamnih pruga koje se izmjenjuju, a rezultat su razlike u vezanju obi~nih ili fluorescentnih boja na sljedove DNA bogatije AT ili GC bazama. Ove su pruge specifi~ne za svaki kromosom i predstavljaju, izgleda, odre|ene kromosomske regije. Geni se mogu lokalizirati unutar specifi~nih kromosomskih pruga in situ hibridizacijom {to upu}uje na to da je pakiranje DNA u kromosome jako uredan i reproducibilan proces.
Centromere
Centromera je specijalizirana regija kromosoma koja igra glavnu ulogu u osiguranju pravilne raspodjele udvostru~enih kromosoma stanicama-k}eri-
Slika 4-17. Ljudski metafazni kromosomi.

Mikroskopska slika ljudskih kromosoma dobivenih iz metafazne stanice. (Leonard Lessin/Peter Arnold, Inc.)
155
profaza U prvoj fazi mitoze (profazi) kromosomi se kondenziraju i kre}u u sredi{te stanice.
U metafazi, visoko kondenzirani kromosomi sastoje se od dviju jednakih kopija (sestrinske kromatide) koje su povezane centromerom. Niti diobenoga vretena veù se na centromeru. metafaza sestrinske kromatide centromera niti diobenoga vretena centrosom U anafazi, sestrinske kromatide odvajaju se i kre}u na suprotne polove stanice.
Slika 4-18. Kromosomi za vrijeme mitoze.

Budu}i da se DNA replicira za vrijeme interfaze, stanica sadràva dvije jednake udvostru~ene kopije svakoga kromosoma prije nego u|e u mitozu.
interfaza
dekondenzirani kromatin
anafaza
telofaza
Stani~nom diobom nastaju dvije stanice-k}eri.
Za vrijeme zadnje faze mitoze (telofaza), jezgrina ovojnica ponovo se formira, a kromosomi se dekondenziraju.
kromatida
ma tijekom mitoze (slika 4-18). Stani~na se DNA replicira za vrijeme interfaze {to rezultira stvaranjem dviju kopija svakog kromosoma prije po~etka mitoze. Kad stanica u|e u mitozu, kondenzacijom kromatina stvaraju se metafazni kromosomi koji se sastoje od dviju identi~nih sestrinskih kromatida. Te sestrinske kromatide drè se zajedno na centromeri koja ima oblik konstrikcije na kromosomu. Kako mitoza napreduje, mikrotubuli mitoti~koga vretena prihva}aju se na centromere, a zatim se dvije sestrinske kromatide razdvoje i kre}u na suprotne polove vretena. Na kraju mitoze jezgrine membrane se ponovo formiraju, kromosomi se dekondenziraju, a kao rezultat toga stvaraju se dvije jezgre k}eri od kojih svaka sadràva po jednu kopiju roditeljskoga kromosoma. Centromere zapravo imaju dvostruku ulogu, prvo kao mjesta udruìvanja sestrinskih kromatida i drugo kao mjesta na koja se prihva}aju mikrotubuli diobenoga vretena. Sastoje se od specifi~nih sljedova DNA na koje se veè odre|eni broj centromeri pridruènih proteina koji formiraju specijaliziranu strukturu koja se zove kinetohora (slika 4-19). Vezanje mikrotubula na kinetohorne proteine posreduje vezanju kromosoma na mitoti~ko vreteno. Proteini vezani na kinetohore tada djeluju kao molekularni motori koji upravljaju kretanjem kromosoma du` vlakna vretena razdvajaju}i tako kromosome u jezgre k}eri. Centromerni sljedovi DNA prvo su definirani u kvasca gdje se njihova funkcija moè prou~avati pra}enjem segregacije plazmida u mitozi (slika 420). Plazmidi koji sadrè funkcionalne centromere razdvajaju se na isti na~in
niti diobenoga vretena
kinetohora
Slika 4-19. Centromera metafaznoga kromosoma.

Centromera je podru~je na kojemu su dvije sestrinske kromatide spojene za vrijeme metafaze. Na centromer nu DNA veù se specifi~ni proteini te tvore kinetohoru koja sluì kao mjesto vezanja niti diobenoga vretena.
156
Poglavlje 4
ARS LEU2 LEU2
ARS
II
CEN transformacija kvasca
mitoza plazmidi se nepravilno segregiraju plazmidi se pravilno segregiraju
neke stanice-k}eri gube plazmid pa im je za rast potreban leucin
sve stanice-k}eri naslje|uju plazmid i mogu rasti u mediju bez leucina
Slika 4-20. Centromerni test u kvascu.

Oba prikazana plazmida sadràvaju selektivni biljeg (LEU2) i slijed DNA koji sluè kvascu kao izvori replikacije (ARS, autonomni replikacijski slijed). Budu}i da plazmidu I nedostaje centromera (CEN) ~esto se gubi iz stanice za vrijeme mitoze zbog nepravilne segregacije. Za razliku od toga, prisutnost centromere (CEN) u plazmidu II osigurava njegov redoviti prijenos u stanice-k}eri.
kao i kromosomi i jednoliko se raspore|uju u stanice-k}eri nakon mitoze. U odsutnosti funkcionalne centromere ne razdvajaju se pravilno, pa mnoge stanice k}eri ne naslijede plazmidnu DNA. Prou~avanja ovog tipa omogu}ila su da se odrede sljedovi potrebni za funkciju centromere. Ovakvi pokusi prvo su pokazali da su centromerni sljedovi dobro poznatog kvasca Saccharomyces cerevisiae sadràni u otprilike 125 parova baza koji se sastoje od triju elemenata: dva kratka sljeda od 8 i 25 parova baza odvojena me|usobno sa 78 do 86 parova baza DNA koja je jako bogata AT bazama (slika 4-21A). Izgleda da kratki centromerni sljedovi definirani u S. cerevisiae ipak ne odraàvaju situaciju u drugih eukariota. Sli~nim funkcionalnim pristupom, novije su studije definirale centromere cijepaju}ega kvasca Schizosaccharomyces pombe. Iako su i S. cerevisiae i S. pombe kvasci, izgleda da su me|usobno udaljeni podjednako kao {to je svaki od njih udaljen od ~ovjeka, pa su mnoge zna~ajke njihove stani~ne biologije prili~no razli~ite. Tako ove dvije vrste kvasca ~ine komplementarne modele za jednostavno i lagano prou~avanje eukariotske stanice. Centromere S. pombe proteù se na 40 do 100 kb DNA; oni su pribli`no tisu}u puta duì od onih S. cerevisiae. Sastoje se od centralne srì od 4 do 7 kb jedne kopije DNA kojoj se na bokovima nalaze ponovljeni sljedovi (slika 4-21B). Ne samo centralna sr` nego tako|er i bo~ni pono-
157
(A) S. cerevisiae CDE I Pu T C A C Pu T G 7886 bp >90% A/T 125 bp (B) S. pombe CDE II CDE III T G T x T x T G y y T T C C G A A y y y y y A A A
L 65 kb
CC
(C) Drosophila melanogaster
420 kb transpozoni AATAT satelit AAGAG satelit neponovljena DNA
Slika 4-21. Centromere S. cerevisiae, S. pombe i vinske mu{ice.

(A) Centromer ni sljedovi S. cerevisiae (CEN) sastoje se od dvaju kratkih konzer viranih sljedova (CDE I i CDE III) koji su razdvojeni s pomo}u sljedova DNA bogatih AT-bazama duljine od 78 do 86 parova baza (CDE II). Prikazani sljedovi su konsenzus sljedovi izvedeni analizom centromernih sljedova pojedinih kva{~evih kromosoma. Pu = A ili G; x = A ili T; y = bilo koja baza. (B) Prikazan je ustroj centromernih sljedova kromosoma II S. pombe. Centromera se sastoji od centralne srì (CC engl. central core) jedinstvenog sljeda DNA, na ~ijem se boku nalaze ponovljeni sljedovi triju repetitivnih elemenata (B, K i L). (C) Centromera vinske mu{ice sastoji se od dviju satelitnih sljedova , transponiraju}ih elemenata i neponovljene DNA.
vljeni sljedovi potrebni su za funkciju centromere, pa izgleda da su centromere S. pombe daleko sloènije nego one S. cerevisiae. Prou~avanjem kromosoma vinske mu{ice napravljena je prva karakterizacija centromera u vi{ih eukariota (slika 4-21 C). Centromere vinske mu{ice proteù se na preko 420 kb od kojih se ve}ina (vi{e od 85%) sastoji od dvaju visoko ponovljenih satelitnih DNA sa slijedom AATAT i AAGAG. Ostatak centromera sastoji se od raspr{enih transponiraju}ih elemenata, koji se tako|er nalaze i na drugim mjestima genoma vinske mu{ice, kao dodatak neponovljenoj regiji DNA bogatoj AT bazama. Delecija satelitnih sljedova i transponiraju}ih elemenata, kao i neponovljene DNA, smanjila je aktivnost centromera u funkcionalnim ispitivanjima. Prema tome, obje vrste sljedova i ponovljene i neponovljene izgleda da pridonose stvaranju kinetohore i funkciji centromera. Centromere biljke Arabidopsis tako|er se izgleda proteù preko 500 do 1.000 kb i sastoje se velikim dijelom od visoko ponovljenih sljedova. Centromere sisavaca karakterizirane su pro{irenim regijama heterokromatina koji se sastoji od visoko ponovljenih satelitnih sljedova DNA. U ljudi i ostalih primata glavni centomerni slijed jest a-satelitna DNA. Njezini osnovni slijed sadràva 171 par baza koji se uzastopno ponavljaju u regijama i po milijun parova baza. a-satelitna DNA vezana je na proteine pridruène centromeri, a nedavno su pokusi pokazali da je a-satelitni niz ljudskoga X kromosoma dovoljan da posluì kao funkcionalna centromera. Ipak, opisani su i abnormalni ljudski kromosomi s funkcionalnom centromerom kojima nedostaje a-satelitna DNA, pa ostaje i dalje nejasno {to je zapravo potrebno za funkciju centromere u vi{ih eukariota.
Telomere
Sljedovi na krajevima eukariotskih kromosoma, nazvani telomere, igraju zna~ajnu ulogu u replikaciji i odrànju kromosoma. Telomere su rano prepoznane kao posebne strukture jer su u eukariotskim stanicama nakon lomljenja kromosomi vrlo nestabilne, pa se pretpostavilo da su neki specifi~ni sljedovi potrebni na normalnim krajevima kromosoma. Ovo je zatim poka-
158
Poglavlje 4
Slika 4-22. Struktura telomera.

Telomerna DNA izbo~i se i vra}a sama na sebe pa se tako stvori kru`na struktura na koju se veè odre|eni broj proteina koji ~uvaju krajeve kromosoma.
3'
Tablica 4-4. Telomerna DNA

Telomerni ponovljeni slijed
G13T G25TTAC GGGGTT G18A AGGGTTT AGGGTT
Organizam
Kvasci Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Protozoa Tetrahymena Dictyostelium Biljka Arabidopsis Sisavac ôvjek
zano pokusima u kojima su telomere praìvotinje Tetrahymena dodane krajevima linearnih molekula DNA plazmida kvasca. Telomerne DNA omogu}ile su ovim plazmidima da se repliciraju u kvascu kao linearne molekule nalik na kromosome, pa je to bio izravan dokaz da su telomere potrebne za replikaciju linearnih molekula DNA. Telomerni sljedovi DNA razli~itih eukariota sli~ni su i sadràvaju ponovljene jednostavne sljedove DNA s nakupinama G ostataka u jednom lancu (tablica 4-4). Primjerice, slijed telomernih ponavljanja u ~ovjeka i ostalih sisavaca je AGGGTT, a telomerno ponavljanje u praìvotinji Tetrahymena je GGGGTT. Ovi su sljedovi ponovljeni stotinama ili tisu}ama puta, pa zauzimaju nekoliko kilobaza i zavr{avaju s jednim jednolan~anim repom. Ponovljeni sljedovi telomerne DNA ~ine om~e na krajevima kromosoma te ujedno veù odre|eni broj proteina koji ~uvaju kromosomske krajeve od razgradnje ili me|usobnog spajanja (slika 4-22). Telomere igraju glavnu ulogu u replikaciji krajeva linearne DNA molekule (vidi poglavlje 5). DNA-polimeraza moè produìti rastu}i DNA lanac, ali ne moè zapo~eti sintezu novoga lanca na kraju linearne DNA molekule. Prema tome, krajevi linearnih kromosoma ne mogu se replicirati normalnom akcijom DNA-polimeraze. Taj problem rije{en je evolucijom posebnog mehanizma koji uklju~uje aktivnost reverzne transkriptaze za replikaciju telomernih sljedova DNA. Odrànje telomera je, izgleda, vaàn faktor u odre|ivanju trajanja ìvota i reproduktivne sposobnosti stanice, pa prou~avanje telomera i telomeraze obe}ava nove uvide u procese starenja i nastanka raka.
Sljedovi ~itavih genoma

Neka od najuzbudljivijih novih otkri}a u molekularnoj biologiji predstavljaju rezultate analize kompletnog nukleotidnog sljeda humanoga genoma i genoma nekolicine modelnih organizama me|u kojima su E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana i mi{ (tablica 4-5). Rezultati sekvenciranja ~itavih genoma odveli su nas dalje od karakterizacije pojedinih gena sve do globalnog pogleda na organi-
159
Tablica 4-5. Sekvencirani genomi (saètak)

Organizam
Bakterije Mycoplasma genitalium H. influenzae E. coli Kvasci S. cerevisiae S. pombe Beskralje`njaci C. elegans Drosophila Biljke Arabidopsis thaliana Rià Sisavci ôvjek
a
Veli~ina genoma (Mb)a

0,58 1,8 4,6 12 12 97 180 125 440 3.200
Broj gena
470 1.743 4.288 6.000 4.800 19.000 13.600
Sljedovi koji kodiraju proteine

88% 89% 88% 70% 60% 25% 13% 25% 10% 11.5%
26.000 30.00050.000 30.00040.000
Mb = milijuni parova baza
zaciju i genski sadràj ~itavih genoma. Ovakav pristup potencijalno vodi do identifikacije svih gena nekog organizma koji tada postaju pristupa~ni istraìvanju njihove strukture i funkcije. Pri tomu je zanimljivo da se, kako u~imo obja{njavati golemu koli~inu podataka koju je generiralo sekvenciranje ~itavih genoma, pojavljuju novi izazovi i novo podru~je nazvano bioinformatikom koje leì na granici izme|u biologije i kompjuterske znanosti, a usmjereno je na razvoj ra~unalnih metoda potrebnih za analizu i izdvajanje korisnih biolo{kih podataka iz sljedova milijardi baza koje tvore genom veli~ine humanog. Iako je jo{ puno toga potrebno nau~iti, genomski redoslijedi koji su ve} dostupni opskrbili su znanstvenike s jedinstvenom bazom podataka koja se sastoji od sljedova nukleotida ~itavog kompleta gena. Budu}i da mnogi od tih gena nisu prije bili prepoznani, odre|ivanje njihove funkcije stvorit }e osnovu za mnoga budu}a istraìvanja u stani~noj biologiji.
Prokariotski genomi
Sada poznajemo potpuni genomski redoslijed vi{e od {ezdeset razli~itih bakterija, a jo{ vi{e takvih redoslijeda je upravo u procesu odre|ivanja. Prvi potpuni slijed stani~noga genoma objavila je, 1995. godine, skupina istraìva~a pod vodstvom Craiga Ventera, a radilo se o bakteriji Haemophilus influenzae koja je ~esti stanovnik di{noga sustava. Genom H. influenzae sadràva oko 1,8 106 parova baza (1,8 megabaza ili Mb) {to je malo manje od polovine veli~ine genoma E. coli. Potpuni nukleotidni slijed pokazao je da je genom H. influenzae kru`na molekula koja sadràva 1.830,137 parova baza DNA. Slijed je tada analiziran na gene koji kodiraju rRNA, tRNA i proteine. Potencijalna podru~ja za kodiranje proteina identificirana su kompjuterskom analizom sljedova DNA kako bi se otkrili otvoreni okviri ~itanja (engl. open-reading frames), dugi nizovi nukleotida i koji mogu kodirati polipeptide jer ne sadràvaju ni jedan od stop kodona (UAA, UAG i UGA). Budu}i da se ovi kodoni koji zaustavljaju prevo|enje polipeptidnog lanca nasumce pojavljuju jednom na svaki 21 kodon (3 stop kodona od ukupno 64
160
Poglavlje 4
Slika 4-23. Genom Haemophilus influenzae.

Predvi|ene regije koje kodiraju proteine ozna~ene su obojenim crtama. Brojevi ozna~uju parove baza u DNA. (Iz Fleischmann et al., 1995. Science 269: 496.)
1
1.800.000
100 000
.000 1.500.00
400.000 1.400.000
500.000 1.300.000 0.000 1.200
1.000.000
900.000
kodona), otvoreni okviri ~itanja koji se proteù na vi{e od stotinu kodona obi~no predstavljaju funkcionalne gene. Ovakvom analizom u genomu H. influenzae otkriveno je {est kopija gena za rRNA, 54 razli~itih tRNA gena i 1.743 potencijalnih regija za kodiranje proteina (slika 4-23). Na temelju njihove podudarnosti s poznatim proteinskim sljedovima, vi{e od tisu}u ovih regija povezano je odre|enom biolo{kom ulogom (kao primjerice enzimi ciklusa limunske kiseline), ali ostali predstavljaju gene nepoznate funkcije. Pretpostavljeni kodiraju}i sljedovi imaju prosje~nu veli~inu od oko 900 parova baza, pa pokrivaju oko 1,6 Mb DNA {to ~ini blizu 90% genoma H. influenzae. Kompletan slijed genoma Mycoplasma genitalium posebno je zanimljiv jer su mikoplazme najmanje dana{nje bakterije i od svih poznatih stanica sadràvaju najmanje genome. Genom M. genitalium duljine je samo 580 kb (0,58 Mb) te vjerojatno predstavlja minimalni komplet gena potreban za odrànje organizma koji se sam razmnoàva. Analiza sljeda DNA M. genitalium pokazala je da on sadrì samo 470 sljedova za kodiranje proteina, a to ~ini otprilike 88% genomske DNA. Mnogi od tih sljedova identificirani su kao geni koji kodiraju proteine uklju~ene u replikaciju DNA, transkripciju, translaciju, membranski transport i energetski metabolizam. Ipak, M. genitalium sadràva mnogo manje gena za enzime metabolizma od H. influenzae {to predstavlja odraz njezina ograni~enijeg metabolizma. Primjerice, mnogi geni za koje se zna da kodiraju komponente biosinteti~kih puteva nedostaju u genomu M. genitalium, a to je u skladu s njezinom potrebom da uzima aminokiseline i prekursore nukleotida iz doma}ina. Zanimljivo je da genom mikoplazme tako|er sadràva otprilike 150 gena, ~ija je funkcija trenutno nepoznata. Tako ~ak i u najjednostavnijoj stanici tek preostaje da se odredi biolo{ka funkcija mnogih gena. Genomski redoslijed arhebakterije Methanococcus janaschii, objavljen 1996. godine, omogu}io je zna~ajan uvid u evolucijske odnose izme|u arhe-
161
bakterija, eubakterija i eukariota. Genom M. jannaschii veli~ine je 1,7 Mb i predvi|a se da sadràva 1.738 sljedova za kodiranje proteina sli~ne je veli~ine kao i genom H. influenzae. Ipak, samo oko tre}ine sljedova za kodiranje proteina koje su otkrivene u M. janaschii srodne su poznatim genima eubakterija ili eukariota {to upu}uje na posebnost genskoga sastava arhebakterija. Geni za kodiranje proteina M. janaschii uklju~eni u proizvodnju energije i biosintezu stani~nih sastojaka srodni su onima u eubakterija {to name}e pretpostavku da su se osnovni metaboli~ki procesi razvili u zajedni~kom pretku arhebakterija i eubakterija. Zna~ajno je da su geni za kodiranje proteina potrebnih za udvostru~ivanje, prepisivanje i prevo|enje DNA u blièm srodstvu s genima u eukariota negoli s onima u eubakterija. Genomsko sekvenciranje ove arhebakterije, dakle, pokazuje da arhebakterije i eukarioti dijele zajedni~ku evolucijsku liniju i u blièm su srodstvu nego {to je bilo koji od njih s eubakterijama (vidi sliku 1-8). Iako su relativna jednostavnost i lako}a genetike E. coli od nje napravili omiljeni organizam molekularnih biologa, genom E. coli od 4,6 Mb nije bio potpuno sekvenciran sve do 1997. godine. Analiza sljeda nukleotida E. coli otkrila je ukupno 4.288 gena, a sljedovi za kodiranje proteina ~ine 88% njezina genoma. Od 4.288 gena otkrivenih sekvenciranjem, 1.835 gena bilo je ve} prethodno identificirano, a funkcija dodatnih 821 mogla se izvu}i iz usporedbi sa sljedovima gena karakteriziranih u drugim organizmima. Ipak, funkcija 1.632 gena E. coli (oko 40% genoma) nije se mogla odrediti. Tako nam genomsko sekvenciranje pokazuje da se jo{ mnogo toga mora nau~iti o stani~noj biologiji prokariota, pa ~ak i u jednoga tako iscrpno istraìvanog organizma poput E. coli.
Kva{~ev genom
Kao {to je ve} napomenuto, najjednostavniji eukariotski genom (1,2 107 parova baza DNA) prona|en je u kvasca Saccharomyes cerevisiae. [tovi{e, kvasci rastu brzo i mogu se podvrgnuti jednostavnim geneti~kim manipulacijama. Zbog toga kvasci na vi{e na~ina predstavljaju model eukariotskih stanica koji se moè puno lak{e prou~avati negoli stanice sisavaca i ostalih vi{ih eukariota. U skladu s time, potpuno sekvenciranje jednoga cijeloga kva{~evoga kromosoma, 1992. godine, (slika 4-24) te zatim odre|ivanje slijeda cijeloga kva{~eva genoma 1996. godine, predstavljalo je najva`nije korake u razumijevanju molekularne biologije eukariotskih stanica. Genom S. cerevisiae sadràva oko 6.000 gena, me|u kojima se, kako se predvi|a, nalazi 5.885 sljedova za kodiranje proteina, 140 gena za ribosomnu RNA, 275 gena za transportnu RNA i 40 gena koji kodiraju male jezgrine RNA (snRNA) uklju~enih u doradu RNA (vidi 6. poglavlje). Prema tome, kvasci imaju veliku gusto}u sljedova koji kodiraju proteine {to je sli~no bakterijskim genomima, a ti sljedovi ~ine oko 70% ukupne kva{~eve DNA. U skladu s time, samo 4% kva{~evih gena sadràvaju introne. [tovi{e, geni S. cerevisiae koji sadràvaju introne obi~no imaju samo jedan mali intron blizu po~etka gena. Kompjuterskom analizom, temeljenom na sli~nostima sa sljedovima poznatih gena, predvi|ene su u S. cerevisiae funkcije za oko 3.000 sljedova za kodiranje proteina. Temeljeno na analizi ovih gena, izgleda da oko 11% proteina kvasca djeluju u metabolizmu, 3% u proizvodnji i pohrani metaboli~ke energije, 3% u replikaciji DNA, popravku i rekombinaciji, 7% u prepisivanju, 6% u prevo|enju, a 14% u sortiranju proteina i transportu. Ipak, funkcije mnogih od ovih gena opisuju se samo op}im terminima (kao {to je transkripcijski faktor), pa tek treba odrediti njihovu to~nu ulogu u stanici. [tovi{e, budu}i da polovina proteina kodiranih kva{~evim genomom nije bila ni u kakvoj vezi s prethodno opisanim genima, preostaje da se funkcija
162
Poglavlje 4
10
20
30
40
40
50
60
70
80
80
90
100
110
120
120
130
140
150
160
160
170
180
190
200
200
210
220
230
240
240
250
260
270
280
280
290
300
310
320
Slika 4-24. Kva{~ev kromosom III.

Gor nje plave linije ozna~uju klonove kori{tene prilikom sekvenciranja DNA. Otvoreni okviri ~itanja ozna~eni su strjelicama. (Iz S.G. Oliver i sur., 1992. Nature 357:38.)
dodatnih 3.000 nepoznatih proteina rasvijetli geneti~kim i biokemijskim analizama. Redoslijed genoma S. cerevisiae nedavno je slijedio redoslijed genoma kidaju}eg kvasca S. pombe. Prema prethodnoj raspravi u ovom poglavlju, S. cerevisiae i S. pombe prili~no su divergentni i njihova se biologija razlikuje po mnogo ~emu, uklju~iv{i i strukturu centromera (vidi sliku 4-21). Zanimljivo je da i njihovi genomi pokazuju prili~ne razlike. Iako i S. cerevisiae i S. pombe posjeduju otprilike istu koli~inu jedinstvenih sljedova DNA (12,5 Mb), izgleda da S. pombe sadrì samo oko 4.800 gena. Introna ima mnogo vi{e u S. pombe negoli u S. cerevisiae. Otprilike 43% gena S. pombe sadràva introne, a introni S. pombe ve}i su od onih u S. cerevisiae, pa sljedovi za kodiranje proteina ~ine samo oko 60% genoma S. pombe. Ve}ina gena S. pombe ima homologe u genomu S. cerevisiae, ali oko 700 gena jedinstveno je za S. pombe. Sada, kad su upotpunjeni genomski sljedovi kvasca, glavni cilj postaje odre|ivanje funkcije mnogih novih gena S. cerevisiae i S. pombe. Na svu sre}u, kvasci su osobito pristupa~ni funkcionalnoj analizi nepoznatih gena zbog lako}e s kojom se normalni kromosomi mogu inaktivirati homolognom rekombinacijom s kloniranim sljedovima (vidi sliku 3-39). Prema tomu,
163
moè se sistematski provoditi izravna funkcionalna analiza kva{~evih gena koji su u po~etku bili otkriveni samo na bazi svog slijeda nukleotida. Tako je sekvenciranje kva{~evih genoma otvorilo vrata prou~avanju mnogih novih podru~ja biologije jednostavnih eukariotskih stanica. O~ekuje se od ovakvih studija da otkriju funkcije mnogih novih gena, koje ne bi bile ograni~ene samo na kvasce, nego zajedni~ke svim eukariotima uklju~iv{i i ~ovjeka.
Genomi Caenorhabditis elegans i vinske mu{ice

Genomi C. elegans i vinske mu{ice relativno su jednostavni animalni genomi, a po veli~ini i sloènosti dolaze izme|u kva{~eva i ljudskoga genoma. Posebne karakteristike svakog od ovih organizama ~ine ih va`nim modelima za analizu genoma: C. elegans na veliko se koristi za prou~avanje animalnog razvoja, a vinska je mu{ica posebno dobro istraèna {to se ti~e genetike. Genomi su ovih organizama, ipak, oko deset puta ve}i od onih kva{~evih {to predstavlja faktor koji unosi novi red veli~ine u teìnu kartiranja i sekvenciranja genoma. Prema tome, sekvenciranje C. elegans, 1998. godine, predstavljalo je vaàn putokaz za analizu genoma jer je pro{irilo sekvenciranje genoma s jednostani~nih organizama (bakterija i kvasaca) na vi{estani~ne organizme koji su prihva}eni kao vaàn model animalnog razvoja. U po~etnoj fazi analize genoma C. elegans koristili su se DNA ulomci klonirani u kozmidima koji mogu prihvatiti DNA umetke od oko 40 kb (vidi tablicu 3-3). Ovim se pristupom, ipak, nije mogao pokriti ~itavi genom, pa je to postignuto kloniranjem puno ve}ih komada DNA sa kva{~evim umjetnim kromosomima (YAC engl. yeast artificial chromosome) kao vektorima. Kao {to je napomenuto u 3. poglavlju, jedinstveno svojstvo YAC jest da sadràvaju centromere i telomere {to im omogu}uje replikaciju u kvascu u obliku linearnih molekula nalik na kromosome. Prema tomu, mogu se koristiti za kloniranje fragmenata DNA veli~ine kva{~eve kromosomske DNA, sve do tisu}a kilobaza duljine. Veliki umetci DNA koji se mogu klonirati s YACovima i ostalim vektorima velikog kapaciteta od presudne su va`nosti za analizu sloènih genoma. Genom C. elegans dug je 97 106 parova baza, a prema predvi|anjima sadràva oko 19.000 kodiraju}ih sljedova za proteine {to je po prilici tri puta
II
III
IV
VI
10
sljedovi 20 predvi|eni geni sli~nosti u kvascu
Slika 4-25. Genom C. elegans.

Crvenim linijama ozna~ena je pozicija gena predvi|enih na svim kromosomima C. elegans. Oni koji su sli~ni kva{~evim genima ozna~eni su ljubi~asto. (Iz Konzorcija za sekvenciranje C. elegans, 1998. Science 282:2012.)
164
Poglavlje 4
ve}i broj od broja gena u kvasca (slika 4-25). Za razliku od kompaktnoga genoma u kvasca, geni C. elegans proteù se na oko 5 kb i sadràva prosje~no pet introna. Sljedovi za kodiranje proteina tako iznose samo oko 25% genoma C. elegans u usporedbi sa 60 70% u S. pombe i S. cerevisiae te blizu 90% u bakterijskom genomu. Otprilike 40% proteina predvi|enih u C. elegans pokazalo je zna~ajnu sli~nost s poznatim proteinima drugih organizama. Kao {to se i o~ekivalo, postoje zna~ajno ve}e sli~nosti izme|u proteina C. elegans i ~ovjeka nego izme|u proteina C. elegans i bilo kojeg od kvasaca ili bakterija. Proteini koji su zajedni~ki C. elegans i kvascu mo`da djeluju u osnovnim stani~nim procesima koje ti organizmi dijele poput metabolizma, udvostru~ivanja DNA, prepisivanja, prevo|enja i razvrstavanja proteina. Sama se sr` biolo{kih procesa, izgleda, odvija s pomo}u sli~nog broja gena u oba organizma, a mogu}e je da ove gene dijele sve eukariotske stanice. Za razliku od toga, ve}ina gena C. elegans nije prona|ena u kvasca, pa mo`da djeluje u suptilnijim regulatornim aktivnostima koje su potrebne za razvoj vi{estani~nih organizama. Vjerojatno je da }e rasvjetljivanje djelovanja ovih gena biti posebno uzbudljivo s obzirom na razumijevanje animalnog razvoja. Iako odrasla C. elegans sadràva samo 959 somatskih stanica u ~itavom svom tijelu, ona posjeduje sve specijalizirane stani~ne tipove kao i sloènije ìvotinje. [tovi{e, opisan je kompletni uzorak odvijanja stani~nih dioba pri razvoju C. elegans kao i analiza uspostavljanja veza svih 302 neurona u odrasloj ìvotinji. Ve} se prona{lo da su mnogi od ovih gena uklju~enih u razvoj i diferencijaciju C. elegans srodni genima koji su uklju~eni u kontrolu proliferacije i diferencijacije stanica sisavaca {to daje pravi dokaz vrijednosti C. elegans kao modela za sloènije ìvotinje. Nema sumnje da }e se preko prou~avanja genomskoga sljeda C. elegans razotkriti jo{ mnogo vi{e gena presudnih za kontrolu razvoja. Vinska mu{ica predstavlja drugi klju~ni model animalnog razvoja koji je osobito dobro geneti~ki okarakteriziran. Prednosti vinske mu{ice za geneti~ku analizu uklju~uju njezin relativno jednostavan genom kao i ~injenicu da se moè lako uzgajati i kriàti u laboratoriju. Uz to u vinskoj mu{ici postoji posebno oru|e za geneti~ku analizu u vidu gorostasnih politenih kromosoma koji se nalaze u nekim tkivima poput `lijezda slinovnica larve. Ovi kromosomi nastaju u stanicama koje se ne dijele kao posljedica ponovljenih replikacija DNA lanaca {to se ne odvajaju jedan od drugoga. Tako svaki od
Slika 4-26. Politeni kromosomi vinske mu{ice.

Svjetlosno-mikroskopska slika obojenih kromosoma iz `lijezde slinovnice. êtiri kromosoma (X, 2, 3 i 4) povezana su svojim centromerama. (Peter J. Bryant/ Biological Photo Service)
165
politenih kromosoma sadràva na stotine identi~nih paralelnih molekula DNA. Zbog svoje veli~ine politeni kromosomi vidljivi su pod svjetlosnim mikroskopom, a odre|enim bojenjem otkrivaju se posebni uzorci pruganja (slika 4-26). Pruganje politenih kromosoma postiè daleko ve}i stupanj rezolucije od onoga koji se postiè u metafaznim kromosomima (primjerice vidi sliku 4-17). Politeni kromosomi su dekondenzirani interfazni kromosomi koji sadràvaju gene koji se aktivno prepisuju. Vidljivo je vi{e od 5.000 pruga od kojih svaka odgovara srednjoj duljini od otprilike 20 kb DNA. Za razliku od toga pruge identificirane u ljudskim metafaznim kromosomima sadràvaju nekoliko megabaza DNA. Uzorak pruganja politenih kromosoma predstavlja fizi~ku kartu genoma vinske mu{ice visoke rezolucije. Delecije gena ~esto se mogu povezati s gubitkom specifi~ne kromosomske pruge, pa se na taj na~in odre|uje posebno fizi~ko mjesto gena na kromosomu. Dodatno se mogu in situ hibridizacijom kartirati klonirane DNA na politene kromosome {to ~esto daje dostatnu rezoluciju za lokalizaciju kloniranih gena na specifi~nim prugama (slika 4-27). Tim na~inom mogu se lako odrediti pozicije kozmidnih ili YAC klonova (koji se proteù preko vi{e pruga) na karti, te se tako dobije osnova za analizu genomskoga slijeda. Zbog velikih mogu}nosti geneti~kih istraìvanja koje pruà vinska mu{ica, sekvenciranje njezinog genoma, po~etkom 2000. godine, predstavljalo je vaàn napredak za genomsku analizu. Genom vinske mu{ice sastoji se od otprilike 180 106 parova baza, a od toga je po prilici jedna tre}ina u obliku heterokromatina. Heterokromatin se sastoji uglavnom od ponavljanja jednostavnih satelitnih sljedova te razbacanih transponiraju}ih elemenata {to sve nije bilo uklju~eno u genomski slijed. Ostatak od 120 106 parova baza eukromatina sekvencirano je uporabom kombinacije klonova bakterijskog umjetnog kromosoma (BAC- engl. bacterial artificial chromosome) koji nose velike umetke DNA te metodom sa~marice (engl. shotgun) u kojoj su mali fragmenti DNA nasumi~no klonirani i sekvencirani u plazmidnim vektorima. Slijedovi ovakvih malih fragmenata DNA zatim su sastavljeni u velike kontinuirane sljedove odre|ivanjem preklapanja me|u tim fragmentima te su im odre|eni smjerovi s pomo}u BAC klonova kako bi se dobio potpuni slijed eukromatinskog dijela genoma vinske mu{ice. Genom vinske mu{ice sadràva oko 13.600 gena {to je ne{to manje od broja gena u C. elegans. Kao i u C. elegans i u vinskoj mu{ici geni sadràvaju prosje~no 4 introna, a ukupna koli~ina intronskih sljedova sli~na je koli~ini egzonskih sljedova. Ukupno 13% genoma vinske mu{ice sastoji se od slijedova za kodiranje proteina. Iako vinska mu{ica ima manje gena od C. elegans, va`no je napomenuti da su mnogi geni duplicirani u oba ova organizma. Kad se uzmu u obzir duplikacije, izgleda da je broj jedinstvenih gena sli~an u vinske mu{ice i C. elegans izme|u 8.000 i 9.000 gena. Otprilike 20% gena vinske mu{ice srodno je genima prisutnima i u kvascu i u C. elegans proteini kodirani ovim genima mo`da posjeduju funkcije koje su zajedni~ke svim eukariotskim stanicama. Ostali geni vinske mu{ice srodni su genima koji su prona|eni u C. elegans, ali ne i u kvascu ili su jedinstveni za vinsku mu{icu. Ono {to posebice upada u o~i jest da sloèna ìvotinja poput vinske mu{ice posjeduje samo dvostruko ve}i broj jedinstvenih gena nego kvasac koji po svemu sude}i spada u mnogo jednostavnije organizme. O~ito je da sloènost vi{estani~nih organizama nije na jednostavan na~in povezana s ve}im brojem gena. Dio ve}e biolo{ke sloènosti vinske mu{ice i C. elegans mo`da proizlazi iz ~injenice da su njihovi proteini op}enito ve}i te sadràvaju vi{e funkcionalnih domena nego proteini kvasca. Daljnja prou~avanja i funkcionalna analiza gena koji su otkriveni sekvenciranjem genoma vinske mu{ice
Slika 4-27. In situ hibridizacija na politenom kromosomu vinske mu{ice.

Prikazana je hibridizacija YAC klona na politeni kromosom. Podru~je hibridizacije ozna~eno je strjelicom (Ljubazno{}u Daniela L. Hartla, Univerzitet Harvard.)
166
Poglavlje 4
i C. elegans bez svake }e sumnje igrati odlu~nu ulogu u razumijevaju na~ina na koje ovi geni djeluju pri usmjerivanju sloènoga procesa animalnog razvoja.
Biljni genomi
Zavr{etak sekvenciranja genoma Arabidopsis thaliana, godine 2000., pro{irio je sekvenciranje genoma sa ìvotinja na biljke, pa je tako do{lo do najva`nijeg doga|aja u biljnoj biologiji. Arabidopsis thaliana je jednostavna cvjetnica koja je na veliko kori{tena kao model za prou~avanje molekularne biologije i razvoja biljke. Ovaj organizam ima tu prednost da kao model za prou~avanje molekularne biologije i genetike ima relativno mali genom od otprilike 15 106 parova baza, {to je po veli~ini sli~no genomima C. elegans i vinske mu{ice. Kao i genom vinske mu{ice, i genom A. thaliana uglavnom je sekvenciran kori{tenjem BAC vektora za prihvat velikih fragmenata DNA. Iznena|uju}e je bilo kad je analiza genoma A. thaliana pokazala da on sadràva 26.000 gena za kodiranje proteina {to je zna~ajno vi{e gena nego {to je prona|eno bilo u C. elegans bilo u vinske mu{ice. Ipak, ovaj neo~ekivano velik broj gena ne odraàva ve}u raznolikost proteina kodiranih genomom A. thaliana. Umjesto toga, izgleda da je veliki broj gena u A. thaliana rezultat duplikacija velikih dijelova genoma. Te duplikacije uklju~uju otprilike 60% genoma, pa je procijenjeno da je broj razli~itih gena koji kodiraju proteine oko 15.000 {to je sli~no broju gena u C. elegans i vinske mu{ice. Gusto}a gena u A. thaliana sli~na je onoj u C. elegans, pa sljedovi koji kodiraju proteine ~ine oko 25% genoma. Geni imaju oko 4 introna, a ukupna duljina intronskih sljedova pribli`no je jednaka ukupnoj duljini egzonskih sljedova. Pokretni elementi sudjeluju s oko 10% u genomu. Kao i u vinskoj mu{ici, ponavljaju}i pokretni elementi skupljeni su na centromerama zajedno sa satelitnim ponavljaju}im sljedovima. Komparativna analiza funkcije gena A. thaliana otkrila je zanimljive sli~nosti kao i razlike izme|u gena biljaka i ìvotinja. Geni koji su uklju~eni u osnovne stani~ne procese kao {to su udvostru~ivanje DNA, popravak, prepisivanje, prevo|enje i promet proteina sli~ni su onima u kvasca, C. elegans i vinske mu{ice {to odraàva zajedni~ko evolucijsko podrijetlo svih eukariotskih stanica. Za razliku od toga geni A. thaliana koji kodiraju proteine uklju~ene u procese poput stani~ne signalizacije i membranskog transporta prili~no su razli~iti od onih u ìvotinja {to je u skladu s velikim razlikama u fiziologiji i razvoju izme|u biljaka i ìvotinja. Oko tre}ine svih gena A. thaliana izgleda da su jedinstveni za biljke, budu}i da ih nema ni u kva{~evim, niti u ìvotinjskim genomima. Najve}a funkcionalna skupina gena, koja zauzima 22% genoma, kodira proteine uklju~ene u metabolizam i fotosintezu (slika 4-28). Druga velika skupina gena (12% genoma) kodira proteine uklju~ene u obranu biljke. Tako|er je va`no napomenuti da genom A. thaliana kodira vi{e od 3.000 proteina koji reguliraju transkripciju ({to iznosi 17% genoma). Broj proteina koji reguliraju gensku aktivnost (transkripcijski faktori) dva puta je ve}i od onoga koji je prona|en u vinske mu{ice ili tri puta ve}i od onoga koji je prona|en u C. elegans. Mnogi od transkripcijskih faktora A. thaliana jedinstveni su za biljke, {to je vjerojatno odraz posebnih oblika genske ekspresije tijekom razvoja biljke te odgovora biljke na okoli{. Redoslijed nukleotida A. thaliana, 2002. godine, slijedilo je objavljivanje dviju skica sljedova riìna genoma. Rià je neobi~no va`na jer predstavlja glavni prehrambeni proizvod za vi{e od polovine svjetskog stanovni{tva, pa }e sekvenciranje genoma riè mo`da dovesti do vrlo zna~ajnih primjena u poljodjelstvu i biotehnologiji. Dvije su skupine istraìva~a objavile skice slijeda genoma dviju podvrsta riè: podvrste indica koja je najrasprostranjenija podvrsta u Kini i ve}ini ostatka Azije; i podvrste japonica koja je omilje-
167
metabolizam i fotosinteza
transkripcija
stani~ni rast, stani~na dioba i sinteza DNA
Slika 4-28. Funkcija gena predvi|enih u Arabidopsis thaliana.

Ilustracija prikazuje proporciju gena A. thaliana u razli~itim funkcionalnim kategorijama. Iz A. thaliana, 2000. Nature 408: 796.)
spa{avanje stanica, obrana, stani~na smrt, starenje
stani~na komunikacija, prijenos signala
promet proteina neklasicifirano unutarstani~ni transport stani~na biogeneza transport energija sinteza proteina ionska homeostaza
na u Japanu. Iako oba ova genomska slijeda jo{ uvijek nisu posve kompletirana nego postoje samo u obliku skice s mnogo pukotina koje se tek moraju popuniti, oni daju veliku koli~inu korisnih podataka. Riìn genom sastoji se oko 440 106 parova baza DNA, pa je skoro 4 puta ve}i od genoma A. thaliana. Otprilike 45% riìna genoma sastoji se od ponovljenih sljedova uklju~iv{i i ponavljanja jednostavnih sljedova i pokretne elemente. Procjene broja gena u skici slijeda riìna genoma proteù se od 32.000 do 50.000. Ove procjene razlikuju se u razli~itim istraìva~kim skupinama pa preostaje da se pobolj{aju daljnjim analizama. Unato~ svemu, izgleda da riìn genom sadràva vi{e gena nego onaj A. thaliana, a mogu}e je da sadràva vi{e gena od ljudskoga genoma. Kao i A. thaliana, rià sadràva mnogo dupliciranih gena (vi{e od 70%) {to se mo`da dogodilo kao rezultat duplikacije velikih dijelova genoma. Zanimljivo je da je vi{e od 80% gena koji su prona|eni u A. thaliana tako|er prona|eno u riè. Mnogi od gena zajedni~kih A. thaliana i riì nisu na|eni ni u kva{~evim, niti u ìvotinjskim genomima, pa prema tome izgleda da su specifi~ni za biljke. Osim toga mnogi geni predvi|eni u riè nemaju odgovaraju}e gene u A. thaliana iako se tek mora otkriti da li ovi predvi|eni geni doista kodiraju proteine. Iako su mnoga pitanja jo{ otvorena, o~ekuje se da }e zavr{etak i kontinuirana analiza slijeda nukleotida riìna genoma pridonijeti na{em razumijevanju biljne biologije te tako|er razvoju proizvodnje koja }e pomo}i u borbi protiv gladi u svijetu.
Ljudski genom
Za mnoge znanstvenike krajnji cilj analize genoma bilo je odre|ivanje potpunog slijeda nukleotida ljudskoga genoma: otprilike 3 109 parova baza DNA. Da bi se razumjela veli~ina ovog poduhvata, treba se podsjetiti da je ljudski genom vi{e od deset puta ve}i od onoga u vinske mu{ice; da je najmanji kromosom ~ovjeka nekoliko puta ve}i od ~itava kva{~eva genoma; te da je rastegnuta DNA koja ~ini ljudski genom duga vi{e od 1 m. Iz takve per-
168
Poglavlje 4
1 279 Mb
2 251 Mb
3 221 Mb
4 197 Mb
5 198 Mb
6 176 Mb
7 163 Mb
8 148 Mb
9 140 Mb
10 143 Mb
11 148 Mb
12 142 Mb
13 118 Mb
14 107 Mb
15 100 Mb
16 104 Mb
17 88 Mb
18 86 Mb
Slika 4-29. Ljudski kromosomi.

Shematski prikaz pruganja kromosoma nakon citogeneti~koga bojenja.
19 72 Mb
20 66 Mb
21 45 Mb
22 48 Mb
X 163 Mb
Y 51 Mb
169
Slika 4-30. Fluorescentna in situ hibridizacija.

Fluorescentna sonda za gen koji kodira laminski B receptor hibridizirana je s obojenim ljudskim metafaznim kromosomom (plavo). Hibridizacijski signali na pojedina~nim genima detektiraju se s pomo}u crvene fluorescencije. (Ljubazno{}u L. L. Wydnera i J. B. Lawrence, Medicinski centar Univerziteta Massachusetts.)
identificirani geni
36,3 36,2 , 35 34,3 , 34,2 ,
spektive, odre|ivanje slijedova humanoga genoma predstavlja fenomenalan pothvat, pa je publiciranje njegove skice 2001. godine bilo najavljeno kao znanstveno dostignu}e od povijesnog zna~enja. Ljudski genom podijeljen je na 24 kromosoma (22 autosoma i 2 spolna kromosoma), od kojih svaki sadràva izme|u 45 i 280 Mb DNA (slika 4-29). Prije nego se odredio slijed genoma, nekoliko tisu}a humanih gena identificirano je i kartirano na humane kromosome. Metoda koja se obi~no koristi za lokalizaciju gena jest in situ hibridizacija sondi ozna~enih fluorescentnim bojama s kromosomima metoda koja se op}enito spominje kao fluorescentna in situ hibridizacija ili FISH (slika 4-30). Hibridizacija in situ s metafaznim kromosomima omogu}uje kartiranje kloniranoga gena na lokus definiran kromosomskom prugom. Budu}i da svaka pruga ljudskoga metafaznoga kromosoma sadràva na tisu}e kilobaza DNA, hibridizacija in situ s ljudskim metafaznim kromosomima ne daje tako detaljnu informaciju za kartiranje kao {to se dobiva hibridizacijom s politenim kromosomima vinske mu{ice koja omogu}uje lokalizaciju gena na prugama interfaznih kromosoma koje sadràvaju samo 10 do 20 kb DNA. Ipak, bolja rezolucija moè se dobiti hibridizacijom s dekondenziranijim ljudskim kromosomima iz stanica u prometafazi ili interfazi gdje se fluorescentnom in situ hibridizacijom mogu kartirati klonirani geni u regijama od otprilike 100 kb. Uz FISH, analiza vezanosti i fizi~ko kartiranje kloniranih sljedova genomske cDNA kori{teno je da se izrade fizi~ka karta i karta vezanih gena ljudskoga genoma. Do 1996. godine biljezi za oko 30.000 gena kartirani su na humane kromosome {to je stvorilo pozadinu za sekvenciranje genoma (slika 4-31). Skice sljedova humanoga genoma objavljene 2001. godine proizvele su dvije nezavisne istraìva~ke skupine koje su se koristile razli~itim pristupima. Jedna od njih, Internacionalni konzorcij za sekvenciranje humanoga genoma (International Human Genome Sequencing Consortium) koristila je kao podlogu za sekvenciranje BAC klonove koji su kartirani na kromosomska mjesta. Druga skupina, pod vodstvom Craiga Ventera iz Celera Genomics koristila je metodu sa~marice u kojoj su mali fragmenti klonirani i sekvencirani, a onda su za sastavljanje genoma kori{tena preklapanja u sljedovima me|u tim fragmentima. Oba ova slijeda bila su u po~etku nekompletne skice u kojima je po prilici 90% eukromatinskog dijela genoma bilo sekvencirano i sastavljeno. Kontinuranim naporima zatvorene su pukotine u slijedu
33 32
31
22 21 13
centromera
12 12 21 22 23 24 25 31
32 41 42 43 44
236 Mb kromosom 1
Slika 4-31. Transkripcijska karta kromosoma 1.

Prikazana je reprezentativna karta cDNA klonova na ljudskom kromosomu 1. Histogram na desnoj strani prikazuje raspodjelu gena du` kromosoma. (Iz: Genome Maps 7, 1966. Science 274: 547.)
170
Poglavlje 4
Ljudski genom
Initial Sequencing and Analysis of the Human Genome International Human Genome Sequencing Consortium
Nature, Volume 409, 2001, pages 860921
The Sequence of the Human Genome J. Craig Venter and 273 others
Science, Volume 291, 2001, pages 13041351 projekta genoma odgovorili su na taj izazov ubrzanjem svojih nastojanja, pa je to rezultiralo utrkom koja je napokon dovela do objavljivanja dviju skica ljudskoga genoma u velja~i 2001. godine.
Kontekst
Ideja o sekvenciranju cijeloga ljudskoga genoma za~eta je pr vi put sredinom osamdesetih godina pro{loga stolje}a. U po~etku je me|u biolozima do~ekana s velikom skepsom jer je ve}ina smatrala da je to jednostavno neostvariv pothvat. U to vrijeme, najve}i genom koji je u potpunosti sekvenciran bio je genom Epstein-Bar rova virusa koji je imao ukupno oko 180.000 parova baza. Iz te perspektive mnogima je bilo nezamislivo sekvenciranje ljudskoga genoma koji je oko 20.000 puta ve}i. Ipak ideja o takvom golemom projektu za biologiju o~arala je ostale, me|u kojima je bio i Charles DeLisi koji je tada vodio Ured za istraìvanje zdravlja i okoli{a u Odjelu za energetiku (Office of Health and Environmental Research, Department of Energy). Godine 1986., DeLisi je uspio lansirati Inicijativu za ljudski genom (Human Genome Initiative) kao projekt unutar Odjela za energetiku. Projekt je dobio {iru podr{ku 1988. godine, kada ga je podupro odbor Nacionalnoga savjeta za istraìvanja. Taj je odbor preporu~io pro{irenje nastojanja na tom podru~ju, uklju~iv{i sekvenciranje genoma nekoliko modela organizama i usporedni razvoj detaljne karte vezanih gena i fizi~ke karte ljudskih kromosoma. Projekt je bio objedinjen u Nacionalnim institutima za zdravlje (National Institutes of Health), a u po~etku ga je vodio James Watson (suotkriva~ strukture DNA) kojega je kasnije naslijedio Frances Collins. Pr vo potpuno sekvenciranje genoma provedeno je u bakteriji Haemophilus influenzae, a objavio ga je Craig Venter sa suradnicima, 1995. godine. Venter
je sudjelovao u projektu sekvenciranja genoma u Nacionalnim institutima za zdravlje, ali je taj posao napustio 1991. godine da bi postao direktor neprofitne organizacije, Instituta za genomska istraìvanja. U me|uvremenu, zna~ajan je progres postignut u kartiranju ljudskoga genoma, a iza po~etnog slijeda H. influenzae uslijedili su 1998. godine, sljedovi drugih bakterija, kvasca i C. elegans. Godine 1998. Venter je osnovao novu kompaniju, Celera Genomics, i objavio plan primjene naprednih tehnologija sekvenciranja koji }e mu omogu}iti izradu cjelovitog slijeda ljudskoga genoma u roku od 3 godine. Collins i ostali voditelji javno financiranog
Eksperimenti
Dvije su skupine znanstvenika koristile razli~ite pristupe u izradi slijeda ljudskoga genoma. Javno financirana grupa Internacionalni konzorcij za sekvenciranje humanoga genoma, pod vodstvom Erica Landera, sekvencirala je fragmente DNA izvedene iz BAC klonova koji su prethodno kartirani na humane kromosome {to je bilo sli~no pristupu koji je kori{ten za odre|ivanje slijeda genoma kvasca i C. elegans (vidi sliku). Za razliku od toga, skupina iz Celera genomics koristila je za sekvenciranje
genomska DNA
Ciljni genom je fragmentiran i kloniran
BAC biblioteka organizirano kartiranje velikih klonova klonovi proizvedeni metodom sa~marice slijed klona proizvedenog metodom sa~marice zdruìvanje
pa je proizveden vektor za kloniranje koji nosi velike fragmente (BAC). Fragmenti genomske DNA poredaju se na fizi~koj karti i pojedini BAC klonovi se odaberu i sekvenciraju nasumi~nom metodom sa~marice.
ACCGTAAATGGGCTGATCATGCTTAAA TGATCATGCTTAAACCCTGTGCATCCTACTG
odsekvenciran BAC
ACCGTAAATGGGCTGATCATGCTTAAACCCTGTGCATCCTACTG
Sljedovi klonova se zatim udruè u svrhu rekonstrukcije slijedova genoma.
Strategija sekvenciranja genoma u kojoj se koriste BAC klonovi koji se organiziraju u preklapaju}e skupine i kartiraju na humane kromosome.
171
na ~itavom genomu metodu sa~marice koju su Venter i suradnici prvi put upotrijebili za sekvenciranje genoma H. influenzae. U ovom pristupu, DNA fragmenti su nasumce sekvencirani, a preklapanja me|u fragmentima tada su kori{tena za ponovno sastavljanje slijeda ~itavoga genoma. Obja slijeda pokrivaju samo eukromatinski dio humanoga genoma, otprilike 2.900 Mb DNA, a heterokromatinski dio genoma bogat ponavljaju}im sljedovima ostao je nesekvenciran. Va`no je shvatiti da obje od ovih dviju prvih verzija predstavljaju samo
skice, a ne potpune sljedove. Postoje rupe u sljedovima, tako da objavljene skice pokrivaju pribli`no 90% slijeda eukromatinskog dijela genoma. Osim toga, postoji mogu}nost da su neki blokovi sljedova u skicama krivo sastavljeni. Unato~ tomu, sljedovi {to su ih ove skice prikazale smatraju se vrlo to~nima pa predstavljaju vaàn izvor podataka za biologiju i medicinu.
Utjecaj
Nekoliko va`nih zaklju~aka odmah je proizi{lo iz slijeda ljudskoga genoma. Pr vo, broj ljudskih gena kre}e se, izgleda, izme|u 30.000 i 40.000 {to je znatno manje od {iroko prihva}ene prvotne pretpostavke koja je govorila o 100.000 gena. Ipak, zanimljivo je da je alter nativno prekrajanje po svoj prilici uobi~ajeno u ljudskom genomu, pa svaki gen moè kodirati prosje~no tri proteina. Introni ~ine oko 25% humanoga genoma, a repeti-
tivne sekvence oko 60%. Va`no je primijetiti da je vi{e od 40% ljudske DNA sloèno od sljedova koji su izvedeni reverznom transkripcijom {to stavlja naglasak na va`nost ovog na~ina prijenosa informacija u oblikovanju na{ega genoma. Osim ovih neposrednih zaklju~aka, slijed ljudskoga genoma, zajedno sa sljedovima drugih organizama, dat }e novu osnovu za biologiju i medicinu u nastupaju}em razdoblju. Utjecaj genomskoga slijeda osjetit }e se prilikom otkrivanja novih gena i njihove funkcije, u razumijevanju genske regulacije, rasvjetljavanju osnove ljudskih bolesti i u razvoju novih strategija u prevenciji i lije~enju zasnovanom na genskoj gra|i pojedinca. Poznavanje ljudskoga genoma moè u kona~nici pridonijeti otkrivanju onoga, o ~emu Venter i suradnici kaù Pravi izazov humane biologije jest objasniti kako je na{ um uspio tako dobro organizirati svoje misli da se mogao posvetiti istraìvanju svoga vlastitog postojanja.
Craig Venter
Eric Lander
pa je to 2003. godine dovelo do kompletiranja visokokvalitetnoga slijeda humanoga genoma. Sekvencirani eukromatinski dio genoma obuhva}a otprilike 2,9 106 kb DNA (slika 4-32). Ukupna veli~ina genoma je oko 3,2 106 kb, a ostatak od 10% genoma otpada na visoko ponovljene sljedove heterokromatina. Prema prethodnoj raspravi u ovom poglavlju, razbacane ponovljene sljedove ~ija su ve}ina pokretni elementi koji su se kretali po genomu s pomo}u reverzne transkripcije RNA posrednika, ~ine oko 45% slijeda ljudskog eukromatina. Ostalih 5% genoma sastoji se od dupliciranih dijelova DNA, pa se oko 60% ljudskoga genoma sastoji od ponovljenih sljedova DNA. Najve}e iznena|enje proiza{lo iz genomskih sekvenci bio je neo~ekivano mali broj ljudskih gena. Ljudski genom, ~ini se, ima samo 30.000 40.000 gena {to je znatno manje od prethodnih procjena od otprilike 100.000 gena u ljudskom genomu. Umjesto toga, izgleda da ljudi imaju samo dvostruko ve}i broj gena nego jednostavnije ìvotinje poput C. elegans i vinske mu{ice. U stvari, ljudi mo`da imaju manje gena od riè, {to nagla{uje jedan od najzna~ajnijih zaklju~aka koji je proizi{ao iz rezultata sekvenciranja genoma: biolo{ka sloènost organizma jednostavno nije funkcija broja gena u njegovom genomu. S druge strane, ~ini se, postoji velika koli~ina alternativnog prekrajanja u ljudskim genima, {to omogu}uje jednom genu da odredi vi{e od jednoga proteina (vidi sliku 4-5). Analize do dana{njega dana pokazale su da alternativno prekrajanje moè rezultirati stvaranjem triju ili vi{e razli~itih mRNA iz prosje~noga ljudskoga gena. Kao rezultat toga, procjenjuje se da 30.000 40.000 ljudskih gena moè kodirati 100.000 ili vi{e razli~itih proteina. Alternativno prekrajanje tako|er se pojavljuje i u C. elegans i vinskoj
172
Poglavlje 4
kromosom 1
285 Mb
geni 50 80 Mb
Slika 4-32. Slijed ljudskoga kromosoma 1.

Prikazane su pozicije gena identificiranih u skici slijeda ljudskoga kromosoma 1. (Iz: International Human Genome Sequencing Consortium, 2001. Nature 409: 860.)
mu{ici, ali mnogo je rje|e nego u ljudi. U~estalost alternativnog prekrajanja u ljudi prema tome moè voditi formiranju po prilici 5 puta ve}eg broja razli~itih proteina u ljudi negoli u C. elegans i vinskoj mu{ici. Ljudski geni pro{ireni su preko puno ve}ih udaljenosti i sadràvaju vi{e intronskih sljedova nego geni C. elegans i vinske mu{ice. Prosje~an slijed za kodiranje proteina u humanim genima iznosi oko 1.400 parova baza {to je sli~no onome u C. elegans i vinske mu{ice. Ipak, prosje~ni ljudski gen zauzima 30% kb DNA pri ~emu vi{e od 90% gena odgovara intronima. Prema tome oko 25% genoma sastoji se od introna, a samo 1 do 1,5% ljudskoga genoma odgovara sljedovima koje kodiraju proteine. Preko 40% pretpostavljenih ljudskih proteina srodno je proteinima u ostalim sekvenciranim organizmima {to uklju~uje vinske mu{ice i C.elegans. Mnogi od ovih konzerviranih proteina djeluju u osnovnim stani~nim procesima kao {to je metabolizam, udvostru~ivanje i popravak DNA, prepisivanje, prevo|enje i prometovanje proteina. Ve}ina proteina koji su jedinstveni za ljude napravljeni su od proteinskih domena koje su tako|er prona|ene u drugim organizmima, ali te su domene postavljene u nove, odnose pa daju specifi~ne proteine u ljudi. U usporedbi s vinskom mu{icom i C. elegans ljudski genom sadràva pove}ani broj gena uklju~enih u funkcije povezane s ve}om sloèno{}u kralje`njaka kao {to je imunoodgovor, ìv~ani sustav i zgru{avanje krvi kao i pove}ani broj gena uklju~enih u razvoj, stani~nu signalizaciju i regulaciju transkripcije. Slijed ljudskoga genoma zajedno sa sljedovima drugih genoma osigurava bogatstvo informacija koje formiraju novi okvir za prou~avanje stani~ne i molekularne biologije. Kao {to }e biti vidljivo iz sljede}ih poglavlja novi geni uklju~eni u mnoge stani~ne procese mogu se identificirati analizom genomskoga slijeda i usporedbom sa sljedovima drugih organizama. Istraìvanje funkcije tih gena kao i mnogih novih gena otkrivenih sekvenciranjem genoma stvorit }e bazu za mnoge studije stani~ne funkcije u nastupaju}em razdoblju. Pristupa~nost slijeda ljudskoga genoma tako|er }e imati va`nu primjenu u omogu}ivanju otkrivanja novih gena uklju~enih u mnoge bolesti koje poga|aju ~ovje~anstvo, uklju~iv{i rak, sr~anu bolest i degenerativne bolesti ìv~anoga sustava kao {to je Parkinsonova i Alzheimerova bolest. De{ifriranje slijeda humanoga genoma razotkrit }e ne samo sljedove gena koji kodiraju proteine nego tako|er i regulatorne sljedove koji nadziru ekspresiju gena. Kao {to slijedi iz rasprave u sljede}im poglavljima, regulacija genske ekspresije presudna je za mnoge aspekte stani~ne funkcije uklju~iv{i i razvoj sloènih vi{estani~nih organizama. Razumijevanje mehanizama koji kontroliraju gensku ekspresiju predstavlja najve}i izazov suvremene stani~ne i molekularne biologije, pa se o~ekuje da }e pristupa~nost genomskih sljedova zna~ajno pridonijeti ovoj zada}i. Na àlost, sada je puno
173
teè identificirati regulatorne sljedove gena nego {to je otkriti sljedove za kodiranje proteina, osobito u velikim genomima kao {to je ljudski. Mogu}e je da }e ovakva prou~avanja biti olak{ana usporedbom s genomskim sljedovima srodnih organizama, primjerice nedavno dovr{eni slijed mi{jega genoma, kao {to se i o~ekivalo, upozorio je na veliku konzerviranost izme|u ljudskih i mi{jih sljedova za kodiranje proteina. Sli~na o~uvanost sljedova za regulaciju gena mogla bi pomo}i u to~nom otkrivanju takvih sekvenci i razumijevanju njihove funkcije. Postojanje dodatnih genomskih sljedova blisko srodnih vrsta tako|er }e nam omogu}iti da prou~avamo osnovu razlika me|u vrstama, primjerice uskoro }emo mo}i uspore|ivati genome ljudi ne samo s beskralje`njacima kao {to su vinska mu{ica i C. elegans nego i s ostalim sisavcima kao {to je mi{ i s ostalim primatima kao {to je ~impanza. Osim toga mo}i }emo uspore|ivati sljedove razli~itih pojedinaca jedan s drugim. Genomi pojedinih ljudi razlikuju se otprilike u jednoj od svakih tisu}u baza. Analiza ovakvih varijacija me|u pojedincima omogu}it }e povezivanje specifi~nih gena s podlo`no{}u prema razli~itim bolestima te }e omogu}iti lije~nicima izradu strategije za prevenciju i lije~enje bolesti koja }e odgovarati geneti~kom ustroju pojedinih pacijenata. Usporedbe izme|u genoma razli~itih pojedinaca mogle bi tako|er pomo}i u razja{njavanju priloga koje na{i geni daju drugim jedinstvenim karakteristikama kao {to su atletska gra|a ili inteligencija i boljem razumijevanju intrakcije izme|u gena i okoli{a koji vodi sloènosti ljudskoga pona{anja.
S A @ E TA K SLO@ENOST EUKARIOTSKIH GENOMA

Introni i egzoni: Ve}ina eukariotskih genoma ima rascijepljenu strukturu u kojoj su dijelovi kodiraju}ih sljedova (egzoni) prekinuti nekodiraju}im sljedovima (introni). U sloènih eukariota introni zauzimaju vi{e od deset puta toliko DNA koliko zauzimaju egzoni. Ponavljaju}i (repetitivni) sljedovi DNA: Vi{e od 50% DNA sisavaca sastoji se od visoko ponavljaju}ih sljedova DNA od kojih su neki prisutni u 105 do 106 kopija po genomu. Me|u tim sljedovima su ponavljanja jednostavnih sljedova kao i ponovljeni elementi koji su se kretali genomom, bilo preko RNA bilo preko DNA posrednika. Duplikacije gena i psudogeni: Mnogi eukariotski geni prisutni su u vi{estrukim kopijama koje se zovu porodice gena, a nastale su duplikacijom predaka tih gena. Neki ~lanovi genske porodice djeluju u razli~itim tkivima ili razli~itim stadijima razvoja. Ostali ~lanovi genskih porodica (pseudogeni) inaktivirani su mutacijama pa vi{e ne predstavljaju funkcionalne gene. Duplikacije gena mogu nastati bilo duplikacijom DNA segmenta bilo reverznom transkripcijom mRNA kojom nastaje dora|eni pseudogen. Oko 5% ljudskoga genoma sastoji se od dupliciranih segmenata DNA. Procjenjuje se da u ljudskom genomu postoji nekoliko tisu}a dora|enih pseudogena.
KLJU^NI POJMOVI
gen, razdvojni sljedovi, egzon, intron, prekrajanje RNA, kilobaza (kb), alternativno prekrajanje
ponavljanje jednostavnoga slijeda, satelitna DNA, SINE, LINE, retrotranspozon, DNA transpozon
porodica gena, pseudogeni, dora|eni pseudogeni
174
Poglavlje 4
Sastav genoma vi{ih eukariota: Samo mali dio genoma sloènih eukariota odgovara sljedovima koji kodiraju proteine. Procjenjuje se da ljudski genom sadràva 30.00040.000 gena, a sljedovi koji kodiraju proteine predstavljaju samo 11,5% DNA. Oko 25% ljudskoga genoma sastoji se od introna, a vi{e od 60% sastavljeno je od repetitivnih i dupliciranih sljedova DNA.
KROMOSOMI I KROMATIN
kromatin, histoni, nukleosom, ~estica nukleosomne srì, kromatosom, eukromatin, heterokromatin centromere, kinetohore
Kromatin: DNA eukariotskih stanica omotana je oko histona te se tako formiraju nukleosomi. Kromatin se dalje moè zgusnuti namatanjem nukleosoma u strukture vi{ega reda me|u koje spadaju i visoko kondenzirani metafazni kromosomi stanica koji prolaze kroz mitozu. Centromera: Centromere su specijalizirane regije eukariotskih kromosoma koje sluè kao mjesta povezivanja dviju sestrinskih kromatida i mjesta prihva}anja niti diobenoga vretena za vrijeme mitoze. Telomera: Telomere su specijalizirani sljedovi potrebni za odràvanje krajeva eukariotskih kromosoma.
telomere
bioinformatika megabaze (Mb), otvoreni okvir ~itanja
SLJEDOVI ÎTAVIH GENOMA

Prokariotski genomi: Potpuno su sekvencirani genomi vi{e od {ezdeset razli~itih bakterija me|u kojima i onaj E. coli. Genom E. coli sadràva 4.288 gena, a sljedovi koji kodiraju proteine zauzimaju blizu 90% DNA. Kva{~ev genom: Prvi sekvencirani eukariotski genom bio je onaj kvasca S. cerevisiae. Genom S. cerevisiae sadràva oko 6.000 gena, a sljedovi koji kodiraju proteine zauzimaju oko 70% genoma. Genom kidaju}eg kvasca S. pombe sadràva manje gena (oko 5.000) i vi{e introna nego S. cerevisiae, a sljedovi koji kodiraju proteine zauzimaju oko 60% genoma S. pombe.
kva{~ev umjetni kromosom (YAC), politeni kromosomi, bakterijski umjetni kromosom (BAC)
Genomi C. elegans i vinske mu{ice: Genom C. elegans bio je prvi sekvencirani genom nekog vi{estani~nog organizma. Genom C. elegans sadràva oko 19.000 sljedova koji kodiraju proteine i zauzimaju oko 25% genoma. Genom vinske mu{ice sadràva otprilike 13.600 gena, a sljedovi koji kodiraju proteine zauzimaju oko 13% genoma. Iako vinska mu{ica ima manje gena od C. elegans, mnogi geni u obje vrste su duplicirani, pa izgleda da obje vrste imaju 8.000 do 9.000 jedinstvenih gena. Neki od tih gena jednaki su u vinske mu{ice, C. elegans i kvasca ovi geni mo`da kodiraju proteine koji imaju zajedni~ku funkciju u svim eukariotskim stanicama. Ipak, ve}ina gena vinske mu{ice i C. elegans ne nalazi se u kvascu, pa ti geni vjerojatno sudjeluju u regulaciji i razvoju vi{estani~nih ìvotinja. Biljni genomi: Genom male cvjetnice Arabidopsis thaliana sadràva oko 26.000 gena neo~ekivano ve}i broj od onoga prona|enog bilo u vinske mu{ice, bilo u C. elegans. Ipak, mnogi od tih gena rezultat su duplikacije velikih segmenata genoma, tako da je broj jedinstvenih gena u A. thaliana oko 15.000. Mnogi od tih gena jedinstveni su za biljke, a tu se nalaze geni uklju~eni u biljnu fiziologiju, razvoj i obranu. Slijed riìna genoma od posebnog je zna~enja za poljoprivredu jer rià hrani vi{e od polovine svjetskoga stanovni{tva. Prema skici slijeda riìna genoma procjenjuje se da taj genom sadràva 30.00050.000 gena od kojih su mnogi duplicirani pa su mo`da nastali kao posljedica duplikacije velikih segmenata genoma.
175
Ljudski genom: Ljudski genom, ~ini se, sadràva 30.00040.000 gena, samo dvostruko ve}i broj gena od onog prona|enog u jednostavnih ìvotinja poput vinske mu{ice i C. elegans. Ipak, budu}i da izgleda kako je alternativno prekrajanje ~esta pojava u ~ovjeka, prosje~an gen moè proizvesti tri ili vi{e mRNA (i proteina). Vi{e od 40% predvi|enih ljudskih proteina srodno je proteinima koji su prona|eni u ostalim sekvenciranim organizmima me|u kojima su i vinska mu{ica i C. elegans. Osim toga, ljudski genom sadràva pove}ani broj gena uklju~enih u ìv~ani sustav, imunosustav, zgru{avanje krvi, razvoj, stani~nu signalizaciju i regulaciju genske ekspresije.
fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)
Pitanja
1. Mnogi eukariotski genomi mnogo su ve}i nego {to bi se pretpostavilo s obzirom na njihovu sloènost. Objasni ovaj paradoks. 2. Na koji su na~in otkriveni introni i egzoni za vrijeme prou~avanja adenovirusnih mRNA? 3. Koje je zna~enje alternativnog prekrajanja? 4. Kako se moè izdvojiti DNA s ponavljanjima jednostavnih sljedova iz ukupne jezgrine DNA? 5. Koja je razlika izme|u centromere i kinetohore? 6. Kva{~eve centromere oblikuju kinetohoru koja se veè na jedan mikrotubul, dok ve}ina ìvotinja posjeduje kinetohore koje se veù na oko 20 mikrotubula diobenoga vretena. Na koji na~in struktura njihovih centromera odraàva ovu razliku? 7. Koje su dvije najva`nije uloge telomera na kromosomima? 8. Kad se kru`ni plazmid opskrbi centromernim slijedom i ugradi u stanice kvasca, njihovi se geni normalno umnoàvaju i segregiraju pri svakoj stani~noj diobi; ali kad se izreù na jednom mjestu pomo}u restrikcijske endonukleaze tako da se stvori linear ni kromosom, plazmidni se geni brzo izgube iz kvasca. Objasni. Koji biste dodatni pokus napravili da potvrdite svoju hipotezu? 9. [to je to otvoreni okvir ~itanja i koje je njegov zna~enje za analizu genoma? 10. Koliko se razlikuju genomski slijedovi pojedinih ljudi? 11. Ponavljaju}i slijedovi DNA pr votno su otkriveni prilikom prou~avanja brzine reasocijacije DNA molekule. Koje se relativne brzine reasocijacije o~ekuju za sljedove koji se u genomu ponavljaju 1.000 puta u usporedbi s genima koji imaju samo jednu kopiju? 12. Oko 30.000 cDNA lokalizirano je na ljudskoj genomskoj karti. Koja je prosje~na udaljenost izme|u ovih biljega?
Literatura
Sloènost eukariotskih genoma
Berget, S. M., C. Moore and P A. Sharp. 1977. . Spliced segments at the 5 terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 31713175. I Breathnach, R., J. L. Mandel and P Chambon. . 1977. Ovalbumin gene is split in chicken DNA. Nature 270: 314319. I Britten, R. J. and D. E. Kohne. 1968. Repeated sequences in DNA. Science 161: 529540. I Charlesworth, B., P Sniegowski and W. . Stephan. 1994. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature 371: 215220. P Chow, L. T., R. E. Gelinas, T. R. Broker and R. J. Roberts. 1977. An amazing sequence arrangement at the 5 ends of adenovirus 2 messenger RNA. Cell 12: 18. I Fritsch, E. F., R. M. Lawn and T. Maniatis. 1980. Molecular cloning and characterization of the human b-like globin gene cluster. Cell 19: 959972. I Gilbert, W. 1985. Genes-in-pieces revisited. Science 228: 823824. P Gilbert, W., S. J. de Souza and M. Long. 1997. Origin of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 76987703. P
176
Poglavlje 4
Henikoff, S., E. A. Greene, S. Pietrokovski, P . Bork, T. K. Attwood and L. Hood. 1997. Gene families: The taxonomy of protein paralogs and chimeras. Science 278: 609614. P Hentschel, C. C. and M. L. Birnsteil. 1981. The organization and expression of histone gene families. Cell 25: 301313. P International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860921. I Kazazian, H. H., Jr. 2000. L1 retrotransposons shape the mammalian genome. Science 289: 11521153. P Kidwell, M. G. and D. Lisch. 1997. Transposable elements as sources of variation in animals and plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 77047711. P Little, P F. R. 1982. Globin pseudogenes. Cell . 28: 68368 P Moran, J. V., R. J. DeBerardinis and H. H. Kazazian Jr. 1999. Exon shuffling by L1 retrotransposition. Science 283: 1530 1534. I Schmid, C. W. and W. R. Jelinek. 1982. The Alu family of dispersed repetitive sequences. Science 216: 10651070. P Stoltzfus, A., D. F. Spencer, M. Zuker, J. M. Logsdon, Jr. and W. F. Doolittle. 1994. Testing the exon theory of genes: The evidence from protein structure. Science 265: 202207. P Tilghman, S. M., P J. Curtis, D. C. Tiemeier, . P Leder and C. Weissmann. 1978. The in. tervening sequence of a mouse b-globin gene is transcribed within the 15S b-globin mRNA precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 13091313. I Venter, J. C. and 273 others. 2001. The sequence of the human genome. Science 291: 13041351. I
Henikoff, S., K. Ahmad and H. S. Malik. 2001. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA. Science 293: 10981102. P Kornberg, R. D. 1974. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science 184: 868871. I Koshland, D. and A. Strunnikov. 1996. Mitotic chromosome condensation. Ann. Rev. Cell Biol. 12: 305333. P Luger, K., A. W. Mader, R. K. Richmond, D. F. Sargent and T. J. Richmond. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 resolution. Nature 389: 251260. I Murphy, T. D. and G. H. Karpen. 1998. Centromeres take flight: Alpha satellite and the quest for the human centromere. Cell 93: 317320. P Pardue, M. L. and J. G. Gall. 1970. Chromosomal localization of mouse satellite DNA. Science 168: 13561358. I Paulson, J. R. and U. K. Laemmli. 1977. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes. Cell 12: 817828. I Pluta, A. F., A. M. MacKay, A. M. Ainsztein, A. G. Goldberg and W. C. Earnshaw. 1995. The centromere: Hub of chromosomal activities. Science 270: 15911594. P Richmond, T. J., J. T. Finch, B. Rushton, D. Rhodes and A. Klug. 1984. Structure of the nucleosome core particle at 7 resolution. Nature 311: 532537. P Saitoh, Y. and U. K. Laemmli. 1994. Metaphase chromosome structure: Bands arise from a differential folding path of the highly ATrich scaffold. Cell 76: 609622. I Schueler, M. G., A. W. Higgins, M. Katharine Rudd, K. Gustashaw and H. F. Willard. 2001. Genomic and genetic definition of a functional human centromere. Science 294: 109115. I Sun, X., J. Wahlstrom and G. Karpen. 1997. Molecular structure of a functional Drosophila centromere. Cell 91: 10071019. I Szostak, J. W. and E. H. Blackburn. 1982. Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors. Cell 29: 245255. I The Arabidopsis Genome Initiative. 2000. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796815. I Tyler-Smith, C. and G. Floridia. 2000. Many paths to the top of the mountain: diverse evolutionary solutions to centromere structure. Cell 102: 58. P Van Holde, K. E. and J. Zlatanovai. 1995. Chromatin higher order structure: Chasing a mirage. J. Biol. Chem. 270: 83738376. P Wiens, G. R. and P K. Sorger. 1998. Centro. meric chromatin and epigenetic effects in kinetochore assembly. Cell 93: 313 316. P
Zakian, V. A. 1995 Telomeres: Beginning to understand the end. Science 270: 16011607. P
Sljedovi ~itavih genoma

Adams, M. D. and 194 others. 2000. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287: 21852195. I Baltimore, D. 2001. Our genome unveiled. Nature 409: 814-816. P Bennetzen, J. 2002. Opening the door to comparative plant biology. Science 296: 6063. P Blattner, F.R., G. Plunkett III., C. A. Bloch, N. T. Perna, V. Burland, M. Riley, J. Collado-Vides, J. D. Glasner, C. K. Rode, G. F. Mayhew, J. Gregor, N. W. Davis, H. A. Kirkpatrick, M. A. Goeden, D. J. Rose, B. Mau and Y. Shao. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 14531462. I Bult, C. J. and 39 others. 1996. Complete genome sequence of the methanogenic Archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 273: 10581073. I Chakravarti, A. 2001. Single nucleotide polymorphisms: to a future of genetic medicine. Nature 409: 822823. P Chervitz, S. A., L. Aravind, G. Sherlock, C. A. Ball, E. V. Koonin, S. S. Dwight, M. A. Harris, K. Dolinski, S. Mohr, T. Smith, S. Weng, J. M. Cherry and D. Botstein. 1998. Comparison of the complete protein sets of worm and yeast: Orthology and divergence. Science 282: 20222028. P Fleischmann, R. D., and 39 others. 1995. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269: 496512. I Fraser, C. M. and 28 others. 1995. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science 270: 397403. I Garza, D., J. W. Ajioka, D. T. Burke and D. L. Hartl. 1989. Mapping the Drosophila genome with yeast artificial chromosomes. Science 246: 641646. P Goff, S. A. and 54 others. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Japonica). Science 296: 92100. I Goffeau, A. and 15 others. 1996. Life with 6000 genes. Science 274: 546567. I International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860921. I Martienssen, R. and W. R. McCombie. 2001. The first plant genome. Cell 105: 571574. P Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002. Initial sequence and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520562. I
Kromosomi i kromatin
Blackburn, E. H. 2001. Switching and signaling at the telomere. Cell 106: 661673. P Carbon, J. 1984. Yeast centromeres: Structure and function. Cell 37: 351353. P Clarke, L. 1990. Centromeres of budding and fission yeasts. Trends Genet. 6: 150154. P Clarke, L. and J. Carbon. 1980. Isolation of a yeast centromere and construction of functional small circular chromosomes. Nature 287: 504509. I Greider, C. W. 1999. Telomeres do D-loop-Tloop. Cell 97: 419422. P Grunstein, M. 1992. Histones as regulators of genes. Sci. Am. 267(4): 6874B. P Heck, M. M. S. 1997. Condensins, cohesins, and chromosome architecture: How to make and break a mitotic chromosome. Cell 91: 58. P
177
Oliver, S. G. and 146 others. 1992. The complete DNA sequence of yeast chromosome III. Nature 357: 3846. I Peltonen, L. and V. A. McKusick. 2001. Dissecting human disease in the postgenomic era. Science 291: 12241229. P Rubin, G. M. 2001. The draft sequences: comparing species. Nature 409: 820821. P Rubin, G. M. and 54 others. 2000. Comparative genomics of the eukaryotes. Science 287: 22042215. P
The Arabidopsis Genome Initiative. 2000. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796815. I The C. elegans Sequencing Consortium. 1998. Genome sequence of the nematode C. elegans: A platform for investigating biology. Science 282: 20122018. I Venter, J. C. and 273 others. 2001. The sequence of the human genome. Science 291: 13041351. I
Walbot, V. 2000. A green chapter in the book of life. Nature 408: 794795. P Wood, V. and 132 others. 2002. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe. Nature 415: 871880. I Yu, J. and 99 others. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. Indica). Science 296: 7992. I
Poglavlje
Replikacija, odràvanje i preslagivanje genomske DNA
Replikacija DNA 179 Popravak DNA 192 Rekombinacija izme|u homolognih sljedova DNA 204 Preslagivanje DNA 211
KLJU^NI POKUS:Preslagivanje MOLEKULARNA MEDICINA:
imunoglobulinskih gena 218
Karcinom debeloga crijeva i popravak DNA 203
zahtijeva vjerni prijenos geneti~ke informacije s roditelja na potomstvo. Zbog toga je to~na replikacija genomske DNA klju~na za ìvot svih stanica i organizama. Svaki puta kad se stanica dijeli, njezin cjelokupni genom mora biti udvostru~en, pri ~emu je za kopiranje velikih molekula DNA koje izgra|uju prokariotske i eukariotske kromosome potrebna prisutnost cijelog niza enzima. Uz to, stanice su razvile mehanizme za popravljanje pogrje{aka koje se ponekad doga|aju za vrijeme umnaànja DNA te za popravak o{te}enja koja nastaju kao rezultat djelovanja ~imbenika okoli{a kao {to je zra~enje. Nepravilnosti u ovim procesima rezultiraju nemogu}no{}u to~ne replikacije i odràvanja genomske DNA pogrje{kom koja moè imati katastrofalne posljedice kao {to je razvoj karcinoma. Unato~ va`nosti precizne replikacije i odràvanja DNA, stani~ni genomi su ipak podlo`ni promjenama. Da bi se vrste evolucijski razvijale, potrebna je prisutnost mutacija i preslagivanja gena kako bi se odràla geneti~ka varijabilnost izme|u jedinki. Rekombinacija homolognih kromosoma za vrijeme mejoze igra va`nu ulogu u ovom procesu omogu}uju}i roditeljskim genima da preslagivanjem (rearan`manom) stvaraju nove kombinacije u budu}im generacijama. Smatra se da preslagivanje sljedova DNA unutar genoma stvaranjem novih kombinacija geneti~kih informacija tako|er pridonosi evolucijskom napretku. Uz to su neki oblici preslagivanja DNA programirani za regulaciju ekspresije gena tijekom diferencijacije i razvoja individualnih stanica i organizama. Karakteristi~an primjer toga procesa kod ljudi predstavlja preslagivanje imunoglobulinskih gena tijekom razvoja imunolo{kog sustava. Stoga je za razvoj pojedina~nih organizama kao i za evoluciju vrsta potrebna suptilna ravnoteà izme|u odràvanja i varijabilnosti nasljednih informacija.
SNOVNI BIOLO[KI PROCES RAZMNO@AVANJA
Replikacija DNA
Kao {to je navedeno u tre}em poglavlju, replikacija DNA je semikonzervativan proces u kojem svaki roditeljski lanac sluì kao kalup za sintezu novih, komplementarnih lanaca k}eri. Glavni enzim uklju~en u ovaj proces je DNA-polimeraza koja katalizira spajanje deoksiribonukleozid-5'-trifosfata (dNTP) rastu}eg lanca DNA. Ipak, replikacija DNA znatno je kompleksnija i zahtijeva vi{e od jedne enzimske reakcije. U cjelokupan proces uklju~eni su brojni drugi proteini, a nu`na je i prisutnost korigiraju}ih mehanizama kako bi se osiguralo da to~nost
180
Poglavlje 5
replikacije bude kompatibilna s malom u~estalo{}u pogrje{aka {to je potrebno za normalno odvijanje stani~ne reprodukcije. Dodatni proteini, kao i specifi~ni sljedovi DNA, potrebni su i za inicijaciju replikacije i kopiranje krajeva eukariotskih kromosoma.
DNA-polimeraze
DNA-polimerazu prvi je otkrio Arhtur Kornberg, 1956. godine u lizatima bakterije E. coli. Sposobnost ovog enzima da to~no kopira DNA-kalup pruìla je biokemijsku podlogu za model replikacije molekule DNA koji su prvotno predloìli Watson i Crick, tako da njezina izolacija predstavlja jedno od temeljnih otkri}a molekularne biologije. Ironi~no, prva identificirana DNA-polimeraza (danas je zovemo DNA-polimeraza I) nije glavni enzim odgovoran za replikaciju DNA E. coli. Umjesto toga danas znamo da i prokariotske i eukariotske stanice sadràvaju nekoliko DNA-polimeraza koje imaju razli~ite uloge u replikaciji i popravku DNA. Vi{estrukost DNA-polimeraza prvi je put otkrivena izolacijom mutantnog soja E. coli s nedostatkom DNA-polimeraze I (slika 5-1). Kulture E. coli tretirane su kemijskom tvari (mutagenom) koja inducira veliku u~estalost mutacija, nakon ~ega su izolirane i ispitane pojedina~ne bakterijske kolonije kako bi se identificirao mutirani soj s nedostatkom polimeraze I. Analiza nekoliko tisu}a kolonija dovela je do izolacije èljenog mutanta kojemu je gotovo u potpunosti nedostajala aktivnost polimeraze I. Za~udo, mutirana bakterija rasla je normalno iz ~ega je proizi{ao zaklju~ak da DNA-polimeraza I nije nu`na za replikaciju DNA. S druge strane, mutirane bakterije bile su iznimno osjetljive na ~imbenike koji o{te}uju DNA (primjerice UV-zra~enje) upu}uju}i na to da je polimeraza I uklju~ena poglavito u popravak DNA o{te}enja, a ne u replikaciju DNA per se. Zaklju~ak da polimeraza I nije potrebna za replikaciju implicirao je da E. coli mora sadràvati druge DNA-polimeraze te su naknadni eksperimenti doveli do identifikacije dvaju enzima, danas poznatih kao DNA-polimeraza II i III. Potencijalna uloga ovih enzima ispitana je izolacijom odgovaraju}ih mutanata. Pokazalo se da sojevi E. coli s mutacijom polimeraze II rastu normalno, a uloga ovoga enzima u posebnom obliku popravka DNA sklonom pogrje{kama (prikazanom u odjeljku Popravak DNA) tek je nedavno utvr|ena. Nasuprot tomu, temperaturno osjetljivi mutanti s nedostatkom polimeraze III nisu bili u mogu}nosti replicirati svoju DNA pri visokoj temperaturi, a daljnje su studije potvrdile da je polimeraza III glavni replikacijski enzim E. coli. Danas je poznato da je za replikaciju DNA E. coli uz polimerazu III potrebna i prisutnost polimeraze I. U prvotno opisanom mutantu za DNA-polimerazu I, taj enzim nije bio potpuno nedostatan, a daljnji eksperimenti pokazali su da prisutna aktivnost DNA-polimeraze I u tom soju igra klju~nu ulogu u replikaciji. Replikacija DNA E. coli prema tome uklju~uje dvije razli~ite DNA-polimeraze ~ije su specifi~ne uloge prikazane u daljnjem tekstu. Eukariotske stanice sadràvaju pet tipi~nih DNA-polimeraza:a, b, g, d i e. Polimeraza g nalazi se u mitohondrijima i odgovorna je za replikaciju mitohondrijske DNA. Preostala ~etiri enzima smje{tena su u jezgri i stoga je bilo opravdano vjerovati da su uklju~eni u replikaciju jezgrine DNA. Polimeraze a, b i e najaktivnije su u stanicama koje se dijele, {to sugerira njihovu ulogu za vrijeme replikacije. Nasuprot tomu, polimeraza a i b podjednako su aktivne i u stanicama koje se dijele i u onima koje se ne dijele, {to je u skladu s njihovom funkcijom u popravku o{te}enja DNA. Dva tipa eksperimenata pruìla su daljnje dokaze koji upu}uju na uloge polimeraza a, b i e u procesu replikacije DNA. Prvo, replikacija DNA nekih
kultura stanice E. coli tretiranje mutagenom kolonije nastale iz jedne bakterije tretirane mutagenim ~imbenikom rast na polu~vrstom mediju u Petrijevoj posudi
kulture pojedina~nih kolonija
pra}enje aktivnosti DNA polimeraze I kako bi se identificirao mutant s nedostatkom enzima
Slika 5-1. Izolacija mutanata s nedostatkom DNA-polimeraze I.
Kultura stanica E. coli tretirana je kemijskim mutagenom, nakon ~ega su uzgojem na polu~vrstom mediju izolirane pojedina~ne bakterijske kolonije. Nekoliko tisu}a kolonija nasa|eno je zatim na zasebne kulture i pretraèno kako bi se identificirali mutanti s nedostatkom polimeraze I.
181
ìvotinjskih virusa poput SV40 moè se prou~avati u bezstani~nim (engl. cell-free) ekstraktima. Prou~avanje replikacije in vitro omogu}ilo je izravnu identifikaciju odgovornih enzima, a analiza takvih bezstani~nih sustava pokazala je da su polimeraze a i d nu`ne za replikaciju DNA virusa SV40. Drugo, polimeraze a, d i e na|ene su u kvascima kao i u stanicama sisavaca {to je omogu}ilo izravno ispitivanje njihovih biolo{kih uloga na modelu kvasaca (vidi 3. poglavlje). Studije genetike kvasaca pokazuju da su mutanti kvasaca s nedostatkom bilo kojeg od tri navedena enzima nesposobni za proliferaciju impliciraju}i kriti~nu ulogu polimeraze kao i polimeraze a i d u replikaciji DNA. Ipak, daljnje su studije pokazale da esencijalna funkcija polimeraze e u kvascima ne zahtijeva njezino enzimsko djelovanje u svojstvu DNA-polimeraze. Stoga, uloga polimeraze e u replikaciji DNA ostaje nejasna iako je mogu}e da funkcionira sli~no kao i polimeraza d koja moè katalizirati replikaciju DNA u odsutnosti polimeraze e, kako u bezstani~nim sustavima tako i u intaktnim kvascima. Sve poznate DNA-polimeraze dijele dva osnovna svojstva koja su od presudne va`nosti za replikaciju DNA (slika 5-2). Prvo, sve polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5' 3' smjeru dodaju}i dNTP na 3' hidroksilnu skupinu rastu}eg lanca. Drugo, DNA-polimeraze mogu dodati nove dNTP samo na prethodno formirani lanac po~etnice koji je vodikovim vezama spojen s kalupom one nisu u mogu}nosti zapo~eti sintezu DNA de novo kataliziraju}i polimerizaciju slobodnih dNTP Po tome se DNA-polimeraze razli. kuju od RNA-polimeraza koje mogu zapo~eti sintezu novog lanca RNA u odsutnosti po~etnice. Kao {to je opisano dalje u ovom poglavlju, navedene
lanac po~etnice 5' P A P A P T P G HO P P P C HO 3' T G C A T T
lanac kalupa 3' OH
lanac po~etnice 5' P A T
lanac kalupa 3' OH
P A T
P T A
P G C
P P Pi
P C HO 3' G
P T P C smjer rasta lanca
P C smjer rasta lanca P A P T P 5'
P A P T P 5'
Slika 5-2. Enzimska reakcija katalizirana DNA-polimerazom I.

Sve poznate DNA-polimeraze dodaju deoksiribonukleotid-5'- trifosfat na 3' hidroksilnu skupinu rastu}ega lanca DNA (lanac po~etnice).
182
Poglavlje 5
karakteristike DNA-polimeraza ~ine se klju~nima za odràvanje visoke vjernosti replikacije DNA potrebne za umnoàvanje stanica.
Replikacijske ra{lje
Molekule DNA u procesu replikacije prvi je analizirao John Cairns u eksperimentima u kojima je E. coli uzgajana u prisutnosti radioaktivnog timidina {to omogu}uje naknadnu vizualizaciju novoreplicirane DNA s pomo}u autoradiografije (slika 5-3). U nekim slu~ajevima mogu}e je opaziti kompletne kru`ne molekule u procesu replikacije. Ove molekule DNA sadràvaju dvije replikacijske ra{lje koje predstavljaju podru~ja sinteze DNA. U svakim ra{ljama roditeljski lanci molekule DNA su razdvojeni i sintetiziraju se dva nova lanca k}eri. Proces sinteze novih lanaca DNA komplementarnih lancima roditeljske molekule DNA predstavlja zna~ajan problem za razumijevanje biokemijskih procesa uklju~enih u replikaciju DNA. Budu}i da lanci dvolan~ane DNA uzvojnice teku u suprotnim (antiparalelnim) smjerovima, kontinuirana sinteza dvaju novih lanaca u replikacijskim ra{ljama zahtijevala bi da jedan lanac bude sintetiziran u 5' 3' smjeru, dok se drugi sintetizira u suprotnom (3' 5') smjeru. No, DNA-polimeraza katalizira polimerizaciju dNTP samo u 5' 3' smjeru. Kako se onda vr{i sinteza drugog DNA lanca? Ova enigma rije{ena je eksperimentima koji su pokazali da se samo jedan lanac molekule DNA sintetizira kontinuirano u smjeru sveukupne replikacije DNA dok se drugi formira iz kratkih diskontinuiranih fragmenata DNA (1 3 kb) koji se sintetiziraju unatrag u odnosu na smjer kretanja replikacijskih ra{lji (slika 5-4). Ovi mali fragmenti novosintetizirane DNA (prema njihovom otkriva~u, nazvani Okazakijevi fragmenti) spajaju se djelovanjem DNA-ligaze stvaraju}i cjeloviti novi lanac DNA. Kontinuirano sintetizirani lanac naziva se vode}i lanac jer njegovo produljenje u smjeru kretanja replikacijskih ra{lji izlaè kalup koji se koristi za sintezu Okazakijevih fragmenata drugoga novog lanca koji nazivamo zaostaju}i ili tromi lanac. Otkri}e diskontinuirane sinteze tromoga lanca objasnilo je mehanizam produljenja oba lanca DNA u replikacijskim ra{ljama, no istovremeno je i
(A)
(B) lanac k}eri
replikacijske ra{lje
Slika 5-3. Replikacija DNA E. coli.

(A) Autoradiografija s prikazom bakterija koje su uzgajane u [3H] timidinu kroz dvije generacije kako bi se obiljeìla DNA, koja je zatim izolirana i vizualizirana ekspozicijom fotografskog filma. (B) Ovaj shematski prikaz ilustrira dvije replikacijske ra{lje prikazane pod (A). (Iz J. Cairns, 1963., Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 28: 43.)
replikacijske ra{lje
roditeljski lanac 100 mm
183
5' 3' roditeljski lanci sinteza Okazakijeva fragmenta
5' 3'
5' 3'
5' 3'
spajanje Okazakijeva fragmenta s tromim lancem
sinteza novoga Okazakijeva fragmenta
5' replikacijske ra{lje 5' sveukupni smjer replikacije 5 5' 3 3'5' 3 3' 5'
3' 5' vode}i lanac
3' 5' zaostaju}i lanac
3' 5'
Okazakijev fragment
3' 5'
3'
5'
3' 5'
3'
5'
3'
Slika 5-4. Sinteza vode}ega i tromoga lanca DNA.

Vode}i lanac sintetizira se kontinuirano u smjeru kretanja replikacijskih ra{lji. Zaostaju}i lanac sintetizira se u kratkim ulomcima (Okazakijevi fragmenti), unatrag u odnosu na sveukupni smjer replikacije. Okazakijevi fragmenti se nakon toga spajaju djelovanjem DNA-ligaze.
postavilo pitanje kako DNA-polimeraza koja zahtijeva po~etnicu i ne moè zapo~eti sintezu de novo, zapo~inje sintezu Okazakijevih fragmenata? Odgovor je da kratki fragmenti RNA sluè kao po~etnice za replikaciju DNA (slika 5-5). Za razliku od sinteze DNA, sinteza RNA moè zapo~eti de novo, a enzim nazvan primaza sintetizira kratke fragmente RNA (primjerice duga~ke 3 10 nukleotida) komplementarne kalupu tromoga lanca u replikacijskim ra{ljama. Okazakijevi se fragmenti zatim sintetiziraju produljenjem ovih RNA-po~etnica djelovanjem DNA-polimeraze. Otkri}e RNA-DNA spojeva u novosintetiziranim Okazakijevim fragmentima pruìlo je klju~ni dokaz za ulogu RNA-po~etnica u replikaciji DNA.
Slika 5-5. Inicijacija Okazakijeva fragmenta RNA-po~etnicama.

Kratki fragmenti RNA sluè kao po~etnice koje se mogu produljiti djelovanjem DNA-polimeraze.
ekstenzija RNA po~etnice DNA-polimerazom 3'
lanac DNA kalupa 3' C G A G A T T G A C T G A G C T 5'
inicijacija sinteze RNA 3' C G A G A T T G A C T G A G C T 5' primaza C P P P 5'
sinteza RNA-po~etnice 3' 5 C C A G A T T G A C T G A G C T 5' DNA polimeraza U C U 3' P P P
C C A G A T T G A T G A G C T 5' U C U A A C T A
P P P 5'
RNA
DNA
3'
184
Poglavlje 5
Slika 5-6. Uklanjanje RNA po~etnica i spajanje Okazakijevih fragmenata.
Zahvaljuju}i svojoj 5'3' egzonukleaznoj aktivnosti, DNA-polimeraza I uklanja RNA-po~etnice i popunjava pukotine izme|u Okazakijevih fragmenata s DNA. Nastali fragmenti DNA mogu se zatim spojiti DNA-ligazom.
pukotina izme|u Okazakijevih fragmenata RNA-po~etnica 3' 5' 5' C G A G A G C 3' polimeraza I uklanjanje RNA 5' 3' egzonukleazom T C T T A T A G A C C G A G U G C G A C A C G C T A T T A C A G C 5' 3'
T G C T
G T
popunjavanje pukotine s DNA 3' 5' 3'
5' C G A G A G C 3' DNA-ligaza 5' C G A G A G C 3' T C T T A T A G A C C G A G T C A G C C G A G C T A T T A C A G C spajanje fragmenata DNA T C T T A T A G A C C G A G T C A G C C G A G C T A T T A C A G C
T G C T
G T
5'
3'
T G C T
G T
5'
Da bi se formirao kontinuirani zaostaju}i (tromi) lanac DNA, RNA-po~etnice moraju se na kraju ukloniti iz Okazakijevih fragmenata i zamijeniti s sljedovima DNA. Kod E. coli RNA po~etnice se uklanjaju kombiniranim djelovanjem RNaze H, enzima koji degradira RNA lanac RNA-DNA hibrida, i polimeraze I. Ovo je aspekt replikacije DNA u E. coli u kojem DNA-polimeraza I igra klju~nu ulogu. Uz njezinu DNA-polimeraznu aktivnost, polimeraza I djeluje kao egzonukleaza koja moè hidrolizirati DNA (ili RNA) ili u 3' 5' ili u 5' 3' smjeru. 5' 3' egzonukleazna aktivnost polimeraze I uklanja ribonukleotide s 5' kraja Okazakijevih fragmenata te se oni zamjenjuju deoksiribonukleotidima kako bi se stvorili fragmenti u potpunosti gra|eni od sljedova DNA (slika 5-6). U eukariotskim stanicama umjesto polimeraze I po~etnice uklanja druga egzonukleaza, a pukotine izme|u Okazakijevih fragmenata popunjavaju se djelovanjem polimeraze . Kao i kod prokariota ovi fragmenti DNA spajaju se zatim djelovanjem DNA-ligaze. Razli~ite DNA-polimeraze igraju zasebne uloge u replikacijskim ra{ljama (slika 5-7). U prokariotskim stanicama, glavna replikacijska polimeraza je polimeraza III koja obavlja sintezu i vode}eg lanca DNA i Okazakijevih fragmenata produljenjem RNA-po~etnica. Polimeraza I zatim uklanja RNA- -po~etnice i ispunjava pukotine izme|u Okazakijevih fragmenata. U eukariotskim stanicama, polimeraza a prona|ena je u kompleksu s primazom te se ~ini da zajedno s njom sudjeluje u sintezi kratkih RNA-DNA fragmenata tijekom sinteze tromoga lanca. Polimeraza d moè zatim obaviti sintezu i vode}ega i tromoga lanca produljivanjem DNA-po~etnica prvotno sintetiziranih djelovanjem kompleksa polimeraza a-primaza. Uz to, polimeraza d moè nakon uklanjanja po~etnica zauzeti mjesto polimeraze I E. coli u popunjavanju pukotina izme|u Okazakijevih fragmenata. Premda uloga polimeraze e nije jo{ u potpunosti shva}ena, njezino je djelovanje, ~ini se, sli~no djelovanju polimeraze d.
185
E. coli sinteza vode}ega lanca pol III
sisavci pol d/e
Slika 5-7. Uloge DNA-polimeraza u E. coli i stanicama sisavaca.
sinteza tromoga lanca primaza pol a/primaza
pol III
pol d/e
Vode}i lanac sintetizira se u E. coli djelovanjem polimeraze III (pol III) i djelovanjem polimeraza d i e (pol d/e) u stanicama sisavaca. U E. coli sinteza tromoga lanca inicira se primazom, a RNA-po~etnice produljuju se djelovanjem polimeraze III. U stanicama sisavaca inicijacija sinteze tromoga lanca odvija se s pomo}u kompleksa primaze i polimeraze a (pol a). Kratki hibridni fragmenti (sastoje se od RNA i DNA) sintetizirani ovim kompleksom produljuju se zatim polimerazom d i e.
Uz polimeraze i primaze, u replikacijskim je ra{ljama aktivan ~itav niz drugih proteina. Ti dodatni proteini identificirani su podjednako analizom mutanata E. coli defektnih za replikaciju DNA kao i pro~i{}avanjem proteina iz sisavaca, potrebnih za in vitro replikaciju SV40 DNA. Jedna skupina tih proteina potrebnih za replikaciju veè se za DNA-polimeraze poja~avaju}i njihovu aktivnost i zadràvaju}i ih vezanima uz DNA-kalup kako bi nastavile sintezu novoga lanca DNA. Polimeraza III E. coli i eukariotske polimeraze d i e zdruène su s dvije vrste pomo}nih proteina (proteinima kliù(A) RFC
Slika 5-8. Pomo}ni proteini polimeraze.

(A) Proteini za stavljanje stezaljke (RFC u stanicama sisavaca) veù se za DNA na mjestu spajanja po~etnice i kalupa. Proteini kliù}e stezaljke (PCNA u stanicama sisavaca) veù se uz RFC nakon ~ega se DNA-polimeraza veè za PCNA. (B) Model PCNA vezanog za DNA. (B, iz T. S. Krishna, X. P Kong, . S. Gary, P M. Burgers i J. Kuriyan, 1994. . Cell 79: 1233.)
RFC PCNA (B)
RFC
polimeraza
186
Poglavlje 5
}e stezaljke, engl. sliding-clamp proteins, i proteinima za stavljanje stezaljke, engl. clamp-loading proteins) koji postavljaju polimerazu na po~etnicu i odràvaju njezinu stabilnu povezanost s kalupom (slika 5-8). Proteini za stavljanje smjer kretanja replikacijskih ra{lji stezaljke (u E. coli nazvani g-kompleks, a u eukariotima helikaza replikacijski faktor C, RFC) specifi~no prepoznaju i veù proteini koji se veù DNA na mjestu spajanja po~etnice i kalupa. Proteini kliùza jednolan~anu DNA }e stezaljke (b protein E. coli i jezgreni antigen proliferiraju}ih stanica, PCNA, engl. proliferating cell nuclear antigen) veù se na protein za stavljanje stezaljke i stvaraju prsten oko DNA-kalupa. Proteini kliù}e stezaljke smje{taju zatromi vode}i tim DNA-polimerazu na DNA na mjesto spajanja po~etnilanac lanac ce i kalupa. Prsten stvoren proteinima kliù}e stezaljke odràva zdruènost polimeraze s njezinim kalupom tijekom procesa replikacije i tako omogu}uje neometanu ugradnju vi{e tisu}a nukleotida u novosintetizirani lanac DNA. Drugi proteini razmotavaju DNA-kalup i stabiliziraju jednolan~ana podru~ja (slika 5-9). Helikaze su enzimi koji kataliziraju razmotavanje roditeljske DNA ispred replikacijskih ra{lji {to je povezano s hidrolizom ATP Proteini ko. ji veù jednolan~anu DNA (engl. single stranded DNA-binding proteins, primjerice eukariotski replikacijski faktor A, RFA) nakon toga stabiliziraju razmoSlika 5-9. Djelovanje helikaze i tani DNA-kalup odràvaju}i ga u ispruènom jednolan~anom stanju kako proteina koji veè jednolan~anu DNA. bi se mogao kopirati djelovanjem polimeraze. Helikaze odmotavaju dva lanca rodiDok se lanci roditeljske DNA razmataju, DNA ispred replikacijskih ra{lji teljske DNA ispred replikacijskih ra{lji. prisiljena je na rotaciju. Nekontrolirana rotacija dovela bi do toga da se kruOdmotani lanci DNA stabiliziraju se `ne molekule DNA (poput SV40 DNA i kromosoma E. coli) omotaju same proteinima koji veù jednolan~anu oko sebe {to bi na kraju blokiralo proces replikacije (slika 5-10). Ovaj proDNA kako bi mogli sluìti kao kalupi za sintezu nove DNA. blem rije{en je djelovanjem topoizomeraza, enzima koji kataliziraju reverzibilno kidanje i ponovno spajanje lanaca DNA. Postoje dvije vrste ovih enzima: topoizomeraze tipa I kidaju samo jedan lanac DNA, dok topoizomeraze tipa II istovremeno kidaju oba lanca. Prekidi nastali djelovanjem topoizomeraza sluè kao osi koje omogu}uju da se dva lanaca DNA kalupa slobodno rotiraju jedan oko drugoga tako da se replikacija moè nastaviti bez uvijanja DNA ispred replikacijskih ra{lji (slika 5-10). Premda su eukariotski
(A) odmotavanje roditeljske DNA
Slika 5-10. Djelovanje topoizomeraza za vrijeme replikacije DNA.

(A) Dok se dva lanca roditeljske DNA odmotavaju, DNA ispred replikacijskih ra{lji prisiljena je na rotaciju u suprotnom smjeru uzrokuju}i me|usobno uvijanje kru`nih molekula. (B) Ovaj problem rije{en je djelovanjem topoizomeraza koje kataliziraju reverzibilno kidanje i spajanje lanaca DNA. Privremeni prekidi nastali djelovanjem ovih enzima sluè kao osi koje omogu}uju da se dva lanaca DNA slobodno rotiraju jedan oko drugoga.
uvijanje lanca DNA ispred replikacijskih ra{lji
(B)
topoizomeraza
privremeni prekid sluì kao os kako bi se omogu}ila slobodna rotacija lanca DNA
187
kromosomi gra|eni od linearnih, a ne kru`nih molekula DNA, njihova replikacija tako|er zahtijeva djelovanje topoizomeraza jer bi se u suprotnom kompletni kromosomi morali kontinuirano rotirati za vrijeme sinteze DNA. Topoizomeraza tipa II potrebna je ne samo za razmotavanje DNA ve} i za razmotavanje novorepliciranih kru`nih DNA molekula koje su postale me|usobno isprepletene. îni se da je topoizomeraza tipa II u eukariotskim stanicama tako|er uklju~ena u kondenzaciju mitoti~kih kromosoma. Ispitivanja mutanata kvasaca, kao i eksperimenti na vinskoj mu{ici te stanicama sisavaca, pokazali su da je topoizomeraza II potrebna za razdvajanje kromatida k}eri u mitozi sugeriraju}i njezinu ulogu u razmotavanju novorepliciranih petlji DNA eukariotskih kromosoma. Enzimi uklju~eni u replikaciju DNA djeluju na koordiniran na~in sintetiziraju}i istovremeno vode}i i zaostaju}i lanac DNA u replikacijskim ra{ljama (slika 5-11). Ovaj zadatak postiè se stvaranjem dimera replikativnih DNA-polimeraza (polimeraza III kod E. coli ili polimeraze d/e kod eukariota) od kojih svaka sadràva i odgovaraju}e prate}e proteine. Jedna molekula polimeraze tada sintetizira vode}i lanac dok druga djeluje u sintezi tromoga lanca. Smatra se da zaostaju}i lanac stvara petlju u replikacijskim ra{ljama tako da se podjedinica polimeraze uklju~ena u sintezu tromoga lanca kre}e u istom sveukupnom smjeru kao druga podjedinica koja sintetizira vode}i lanac.
topoizomeraza
smjer kretanja replikacijskih ra{lji helikaza primaza RNA-po~etnica protein za stavljanje stezaljke proteini koji se veù na jednolan~anu DNA
RNA-po~etnica
Okazakijev fragment
vode}i lanac
kliù}a stezaljka
dimer polimeraze III polimeraza I zaostaju}i lanac
Slika 5-11. Model replikacijskih ra{lji E. coli.

Helikaza, primaza i dvije molekule DNA-polimeraze III provode koordiniranu sintezu vode}eg i zaostaju}eg lanca DNA. Kalup tromoga lanca je uvijen tako da se polimeraza odgovor na za sintezu tromoga lanca kre}e u istom smjeru kao i sveukupno kretanje replikacijskih ra{lji. Topoizomeraza djeluje kao os okretanja ispred replikacijskih ra{lji, a DNA-polimeraza I i ligaza uklanjaju RNA-po~etnice i spajaju Okazakijeve fragmente iza replikacijskih ra{lji.
ligaza
188
Poglavlje 5
5' G A C T 3' ugradnja G umjesto A A T T
3'
Vjernost replikacije
Preciznost umnaànja DNA kriti~na je za stani~no razmnoàvanje, a procjena mutacijskih stopa za razli~ite gene pokazuje da u~estalost pogrje{aka tijekom replikacije odgovara samo jednoj pogrje{no ugra|enoj bazi na svakih 109 do 1010 ugra|enih nukleotida. Ova u~estalost pogrje{aka znatno je manja od one koja bi se mogla predvidjeti samo na osnovi komplementarnosti sparivanja baza. Konkretno, razlika u slobodnoj energiji koja proistje~e iz promjena u sparivanju vodikovim vezama izme|u korektno i nekorektno sparenih baza je tek tolika da favorizira stvaranje komplementarnoga baznog para za svega tisu}u puta. Zbog toga bi izbor baza reguliran samo sparivanjem vodikovim vezama na temelju komplementarnosti rezultirao u~estalo{}u pogrje{aka koja odgovara ugradnji otprilike jedne pogrje{ne baze na svakih 103 nukleotida. Mnogo ve}i stupanj vjernosti replikacije koji se u stvari postiè proistje~e uglavnom iz aktivnosti DNA-polimeraze. Jedan od mehanizama kojim DNA-polimeraza pove}ava vjernost replikacije jest taj da pomaè u izboru odgovaraju}e baze za ugradnju u novosintetizirani lanac. Polimeraza ne katalizira ugradnju bilo kojeg nukleotida koji je vodikovim vezama povezan s lancem kalupa. Umjesto toga, ona aktivno diskriminira ugradnju pogrje{ne baze prilago|uju}i se konformaciji komplementarnoga para baza. Nedavna ispitivanja strukture nekoliko DNA-polimeraza upu}uju na to da vezanje korektno sparenih dNTP inducira konformacijske promjene u DNA-polimerazi koje dovode do ugradnje nukleotida u DNA. Izgleda da sposobnost DNA-polimeraze da favorizira ugradnju pravilno sparenih nukleotida pove}ava preciznost replikacije za oko tisu}u puta smanjuju}i time o~ekivanu u~estalost pogrje{aka sa 103 na oko 106. Drugi glavni mehanizam odgovoran za preciznost DNA replikacije je korektivna (engl. proofreading) aktivnost DNA-polimeraze. Kao {to je ve} spomenuto, polimeraza I iz E. coli posjeduje 3'5' kao i 5'3' egzonukleaznu aktivnost. 5'3' egzonukleaza djeluje u smjeru DNA sinteze i pomaè u uklanjanju RNA-po~etnica iz Okazakijevih fragmenata. 3'5' egzonukleaza djeluje u suprotnom smjeru od smjera sinteze DNA i sudjeluje u provjeravanju to~nosti novosintetiziranoga lanca (slika 5-12). Svi novougra|eni nukleotidi podlijeù ovakvom provjeravanju jer DNA-polimeraza nije u stanju zapo~eti sintezu de novo, ve} samo produljuje ve} postoje}e po~etnice koje su vodikovim vezama povezane s kalupom. Kada do|e do ugradnje pogrje{ne baze vrlo je vjerojatno da se ona ne }e iskoristiti za nastavak sinteze, ve} }e se ukloniti 3'5' egzonukleaznom aktivno{}u DNA-polimeraze. 3'5' egzonukleazna aktivnost DNA-polimeraze I srodna je s 3'5' egzonukleaznom aktivno{}u polimeraze III iz E. coli i eukariotskih polimeraza d i e koje selektivno uklanjaju nepravilno sparene baze ugra|ene na kraj rastu}eg lanca DNA i time pove}avaju vjernost replikacije za oko sto do tisu}u puta. Va`nost korektivnog od~itavanja novosintetiziranog lanca mogla bi objasniti za{to DNA-polimeraze zahtijevaju prisutnost po~etnica i kataliziraju sintezu lanaca DNA samo u 5'3' smjeru. Kad se DNA sintetizira u 5'3' smjeru energija potrebna za polimerizaciju proistje~e iz hidrolize 5' trifosfatne skupine slobodnog dNTP do koje dolazi kad se isti dodaje na 3' hidroksilnu skupinu rastu}ega lanca (vidi sliku 5-2). Nasuprot tomu, kad bi se DNA produljivala u 3'5' smjeru, energija polimerizacije morala bi potjecati iz hidrolize 5' trifosfatne skupine terminalnih nukleotida ve} ugra|enih u DNA. To bi onemogu}ilo korektivno od~itavanje zbog toga {to bi pri takvoj sintezi uklanjanje nepravilno sparenoga terminalnog nukleotida istovremeno uklonilo 5' trifosfatnu skupinu potrebnu kao izvor energije za daljnje
G A 5'
3' 5' G A C T 3' polimeraza izrezuje krivo spareni G s pomo}u 3' 5' egzonukleaze 5' G A C T 3' A T T G A 5' sinteza se nastavlja ugradnjom odgovaraju}e baze (A) 5' G A C T 3' T A T G A 5' 3' 3' T T
G A 5'
Slika 5-12. Korektivna aktivnost DNA-polimeraze.

G je ugra|en umjesto A kao rezultat krivog sparivanja s T na lancu kalupa. Zbog toga {to je krivo sparen G na 3' kraju novosintetiziranoga lanca nije vezan vodikovom vezom s lancem kalupa. Ovo pogrje{no sparivanje na 3' kraju rastu}eg lanca prepoznano je i izrezano 3'5' egzonukleaznom aktivno{}u DNA-polimeraze koja, da bi nastavila sintezu, zahtijeva po~etnicu spojenu vodikovim vezama s lancem kalupa. Nakon izrezivanja krivo sparenog G, sinteza DNA moè se nastaviti ugradnjom odgovaraju}ega nukleotida (A).
189
produljenje lanca. Prema tome, iako sposobnost DNA-polimeraze da produljuje po~etnice samo u 5'3' smjeru ~ini replikaciju na izgled kompliciranom, ona je nu`na da bi osigurala precizno umnaànje geneti~kog materijala. Uz sposobnost da razlikuje ugradnju pogrje{no sparene baze, korektivna aktivnost DNA-polimeraze dovoljna je da smanji u~estalost pogrje{aka pri replikaciji na otprilike jednu pogrje{no sparenu bazu na svakih 109 ugra|enih nukleotida. Kako bi se uklonile pogre{no sparene baze ugra|ene u novosintetiziranu DNA, djeluju dodatni mehanizmi (prikazani u odjeljku Popravak DNA), osiguravaju}i time jo{ ve}u vjernost umnaànja geneti~ke informacije.
Ishodi{te i inicijacija replikacije

Umnaànje prokariotskih i eukariotskih DNA zapo~inje na jedinstvenom mjestu zvanom ishodi{te replikacije koje sluì kao specifi~no vezno mjesto za proteine koji iniciraju proces replikacije. Prvo ishodi{te replikacije opisano je u E. coli. Prvo je otkriveno da umnaànje uvijek zapo~inje na jedinstvenom mjestu bakterijskog kromosoma, a detaljnije su analize pokazale da je ishodi{te replikacije gra|eno od 245 parova baza ~iji dijelovi sluè kao vezna mjesta za proteine potrebne za inicijaciju replikacije DNA (slika 5-13). Klju~ni korak predstavlja vezanje inicijacijskog proteina za specifi~ni slijed nukleotida unutar ishodi{ta ~ime zapo~inje razmatanje dvostruke uzvojnice. Osim toga, inicijacijski protein regrutira i druge proteine uklju~ene u sintezu DNA. Nakon toga helikaza i proteini koji veù jednolan~anu DNA djeluju u daljnjem razmotavanju DNA-kalupa, a primaza zapo~inje sintezu vode}eg lanca. Formiraju se dvije replikacijske ra{lje u kojima sinteza te~e u suprotnim smjerovima uzdu` kru`noga kromosoma E. coli. Prou~avanje ishodi{ta replikacije nekoliko animalnih virusa kao {to je SV40 posluìlo je kao model za istraìvanje inicijacije DNA sinteze u eukariota. Ovaj virus posjeduje jedno ishodi{te replikacije (gra|eno od 64 parova baza) koje funkcionira i u inficiranim stanicama i u bezstani~nim sustavima. Replikaciju zapo~inje T antigen protein kodiran virusnim genomom koji se veè za ishodi{te replikacije i istodobno djeluje kao helikaza. Za stabilizaciju razmotanoga kalupa potrebna je prisutnost proteina koji se veè za jednolan~anu DNA, a zatim kompleks DNA-polimeraza i primaze zapo~inje sintezu DNA. Premda su jednostruka ishodi{ta dovoljna za replikaciju bakterijskih i virusnih genoma, za replikaciju mnogo ve}ih genoma eukariotskih stanica unutar prihvatljivog vremenskog perioda potrebna je prisutnost vi{estrukih ishodi{ta replikacije. Tako se primjerice sveukupni genom E. coli (4 106 parova baza) replicira iz jednostrukog ishodi{ta za otprilike 30 minuta. Kad bi se genom sisavaca (3 109 parova baza) replicirao istom brzinom iz jed-
Slika 5-13. Ishodi{te replikacije E. coli.

Replikacija zapo~inje u jedinstvenom ishodi{tu na kromosomu E. coli ozna~enom s ori (engl. origin). Prvi korak je vezanje inicijacijskog proteina za ori slijed u molekuli DNA {to dovodi do djelomi~nog odmotavanja kalupne DNA. Odmotavanje DNA se nastavlja djelovanjem helikaze i proteina koji veù jednolan~anu DNA, a primaza sintetizira RNA-po~etnice. Dvije replikacijske ra{lje stvorene u ishodi{tu kre}u se zatim u suprotnim smjerovima uzdu` kru`ne molekule DNA.
ori
ori
inicijator sinteza RNA-po~etnice
RNA-po~etnica helikaza
proteini koji se veù za jednolan~anu DNA
ori
ori formiranje dviju replikacijskih ra{lji
vezanje inicijacijskog proteina
odmotavanje DNA djelovanja helikaze i proteina koji se veù za jednolan~anu DNA
190
Poglavlje 5
Slika 5-14. Ishodi{ta replikacije u eukariotskim kromosomima.

Replikacija zapo~inje u vi{estrukim ishodi{tima (ori) od kojih svako stvara dvije replikacijske ra{lje.
ori
ori
ori
inicijacija replikacije
novosintetizirana DNA ( )
pomicanje replikacijskih ra{lji u suprotnim smjerovima
nog ishodi{ta za replikaciju DNA bilo bi potrebno oko 3 tjedna (30.000 minuta). Tako|er je poznato da je brzina replikacije DNA u stanicama sisavaca u stvari oko deset puta manja nego u E. coli, vjerojatno radi pakiranja eukariotske DNA u kromatin. Unato~ tomu, genomi stanica sisavaca uglavnom se repliciraju unutar nekoliko sati, {to zahtijeva kori{tenje vi{e tisu}a ishodi{ta replikacije. Prisutnost vi{estrukih ishodi{ta replikacije u eukariotskim stanicama prvi je put pokazana izlaganjem kulture stanica sisavaca radioaktivnom timidinu unutar razli~itih vremenskih intervala {to je pra}eno autoradiografijom kako bi se detektirala novosintetizirana DNA. Rezultati takvih ispitivanja pokazali su da sinteza DNA zapo~inje na vi{e mjesta iz kojih se zatim nastavlja u oba smjera uzdu` kromosoma (slika 5-14). Ishodi{ta replikacije u stanicama sisavaca me|usobno su udaljena za otprilike 50 do 300 kb prema tome humani genom ima oko 30.000 ishodi{ta replikacije. Genomi jednostavnijih eukariota tako|er posjeduju vi{estruka ishodi{ta; tako primjerice replikacija u kvascima zapo~inje u ishodi{tima me|usobno udaljenim oko 40 kb. Ishodi{ta replikacije eukariotskih kromosoma prvi put su prou~avana u kvascu S. cerevisiae u kojem su identificirani kao sljedovi koji podupiru replikaciju plazmida u transformiranim stanicama (slika 5-15). To je ujedno bio funkcionalni test za ove sljedove i do sada je izolirano nekoliko takvih elemenata (nazvani autonomno repliciraju}i sljedovi ili ARS). Njihova uloga kao ishodi{ta replikacije potvr|ena je izravnom biokemijskom analizom, ne samo u plazmidima ve} i u kromosomskoj DNA kvasaca. Funkcionalni ARS elementi obuhva}aju oko 100 parova baza, uklju~uju}i slijed dug 11 parova baza koji je prisutan u mnogim razli~itim ARS elementima (slika 5-16). Ovaj sredi{nji slijed nuàn je za funkciju ARS elemenata te predstavlja vezno mjesto za proteinski kompleks (nazvan kompleks ishodi{ta replikacije ili ORC; engl. origin replication complex) koji je potreban za inicijaciju replikacije DNA u ishodi{tima S. cerevisiae. îni se da ORC kompleks regrutira druge proteine prema ishodi{tu (uklju~uju}i DNA-helikazu), {to dovodi do inicijacije replikacije. Mehanizam zapo~injanja replikacije DNA u S. cerevisiae prema tome je izgleda sli~an onome u prokariotskim i eukariotskim virusima inicijacijski protein se specifi~no veè za slijed nukleotida u ishodi{tu replikacije. Daljnja ispitivanja pokazala su da je uloga ORC proteina kao inicijatora replikacije konzervirana u svim eukariotima od kvasaca do sisavaca. Ipak, ishodi{ta replikacije drugih eukariota znatno su manje definirana od ARS elemenata S. cerevisiae. Ishodi{ta replikacije u genomu S. pombe nalaze se
191
LEU2
LEU2
ARS
plazmid I
plazmid II
transformirane stanice kvasca
transformirane stanice kvasca
uzgoj u mediju bez leucina
uzgoj u mediju bez leucina
transformirane kolonije kvasca
dobivene su samo rijetke transformirane stanice kvasca u kojima je plazmid integriran u kromosomsku DNA
dobiveno mnogo transformiranih stanica jer se plazmid moè replicirati bez integriranja u kromosom
unutar slijeda nukleotida dugog 1 kb. Ona nemaju jasno definiranih ORC veznih mjesta kao {to su ARS elementi S. cerevisiae, ali sadràvaju ponavljaju}e sljedove bogate AT bazama koji vjerojatno sluè kao vezno mjesto za ORC kompleks. Otkriveno je da ishodi{te replikacije vinske mu{ice obuhva}a preko 2 kb dugi slijed nukleotida te da sadràva nekoliko ORC veznih mjesta ~iji sljedovi jo{ nisu poznati. Kod sisavaca je lokalizirano nekoliko ishodi{ta u podru~jima genoma koja obuhva}aju nekoliko kilobaza. U drugim slu~ajevima, replikacija moè zapo~eti u vi{estrukim ishodi{tima s velikom inicijacijskom zonom koja obuhva}a 10 50 kb. Stoga se ~ini da sljedovi koji definiraju ishodi{te replikacije znatno variraju unutar eukariota iako je uloga ORC proteina kao inicijatora replikacije vrlo konzervirana.
Slika 5-15. Identifikacija ishodi{ta replikacije u kvascu.

Oba plazmida, plazmid I i plazmid II sadràvaju selektivni biljeg, gen (LEU2) koji omogu}uje transformiranim stanicama rast u mediju bez leucina. Ipak, samo plazmid II sadràva ishodi{te replikacije (ARS). Transfor macija stanica kvasca s plazmidom I daje samo rijetke transformante u kojima je plazmid integriran u kromosomsku DNA. Plazmid II je, me|utim, sposoban replicirati se bez integracije u kromosomom kvasca (autonomna replikacija) tako da njegov unos u stanice kvasca rezultira znatno ve}im brojem transformiranih stanica.
Telomere i telomeraze: umnaànje krajeva kromosoma

Budu}i da DNA-polimeraze produljuju po~etnice samo u 5' 3' smjeru, one ne mogu kopirati krajnje 5' dijelove linearnih molekula DNA. Zbog toga su za replikaciju krajnjih sljedova linearnih eukariotskih kromosoma
192
Poglavlje 5
ORC
DNA B3 B2 B1 ACS (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)
Slika 5-16. ARS element kvasca.
Element sadràva 11 parova baza dug ARS konsenzus slijed (ACS engl. ARS consensus sequence) koji predstavlja specifi~no vezno mjesto ORC kompleksa (kompleks ishodi{ta replikacije). Tri dodatna elementa (B1, B2 i B3) pojedina~no nisu esencijalni, ali zajedno pridonose funkciji ARS elementa.
potrebni posebni mehanizmi. Terminalni dijelovi kromosoma (telomere) sastoje se od uzastopnih ponavljanja jednostavnih sljedova DNA (vidi 4. poglavlje). Telomere se odràvaju djelovanjem posebnog enzima, nazvanog telomeraza, koji je sposoban replicirati krajnje sljedove DNA u odsutnosti DNA-kalupa. Telomeraza je reverzna transkriptaza, tip DNA-polimeraze koji sintetizira DNA na osnovi RNA-kalupa, a prvi je put otkrivena u retrovirusima (vidi 3. poglavlje). Va`no je napomenuti da je telomeraza enzimski kompleks koji sadràva svoj vlastiti RNA-kalup komplementaran s ponavljaju}im telomernim sljedovima kromosoma. Kori{tenje RNA-kalupa omogu}uje telomerazi da stvori vi{estruke kopije ponavljaju}ih sljedova telomera odràvaju}i ih na taj na~in i u odsutnosti konvencionalnoga DNA-kalupa. Mehanizam telomerazne aktivnosti objasnili su 1985. godine Carol Greider i Elizabeth Blackburn prou~avaju}i protozou Tetrahymena (slika 5-17). Telomeraza Tetrahymena nalazi se u kompleksu sa 159 nukleotida dugom RNA koja sadràva slijed 3'-AACCCCAAC-5'. Ovaj je slijed komplementaran s telomernim ponavljanjem Tetrahymena (5'-TTGGGG-3') i sluì kao kalup za sintezu telomerne DNA. Kori{tenje ove RNA kao kalupa omogu}uje telomerazi da produlji 3' kraj kromosomske DNA za jednu ponavljaju}u jedinicu vi{e od originalne duljine. Komplementarni se lanac tada moè sintetizirati djelovanjem kompleksa polimeraze i primaze kori{tenjem konvencionalne RNA po~etnice. Uklanjanje RNA po~etnice ostavlja jednolan~ani 3' kraj kromosomske DNA koji moè stvarati petlje na kraju eukariotskih kromosoma (vidi sliku 4-22). Telomeraze su otkrivene u razli~itim eukariotima, a geni koji kodiraju telomerazne RNA klonirani su iz Tetrahymena, kvasaca, mi{a i ~ovjeka. Telomerazna RNA uvijek sadràva sljedove komplementarne s ponavljaju}im slijedom telomere organizma iz kojega je izolirana (vidi tablicu 4-4). Uloga telomeraze u odràvanju krajeva eukariotskih kromosoma dokazana je i uno{enjem mutiranih gena za telomeraznu RNA u kvasce {to je rezultiralo odgovaraju}im promjenama ponavljaju}ih sljedova na krajevima kromosoma.
Popravak DNA
DNA, kao i svaka druga molekula, moè biti izloèna razli~itim kemijskim reakcijama. Budu}i da DNA sluì kao jedinstvena, trajna kopija stani~noga genoma, promjene njezine strukture imaju znatno ve}e posljedice nego promjene drugih stani~nih komponenti, poput RNA, ili proteina. Mutacije
193
5' telomerna DNA s jednolan~anim 3' krajem 3' T A T G G G A C C C C G G G G T C 5' T G
3'
Slika 5-17. Djelovanje telomeraze.

Telomerna DNA jednostavni je ponavljaju}i slijed s jednolan~anim 3' krajem na novosintetiziranom vode}em lancu. Telomeraza, kao dio enzimskog kompleksa, sadràva svoju vlastitu molekulu RNA komplementar nu telomer noj DNA. Jednolan~ani 3' kraj telomer ne DNA veè se za RNA telomeraze koja zatim sluì kao kalup za produljenje vode}ega lanca za jednu ponavljaju}u jedinicu. Zaostaju}i lanac telomer ne DNA moè se nakon toga sintetizirati s pomo}u konvencionalne RNA-po~etnice djelovanjem DNA-polimeraze.
novosintetizirani tromi lanci vezanje za telomeraznu RNA
5' T A 3' T G A C C C G G G G T C 5' 3' A T G
3'
A C C C C
A C 5'
telomerazna RNA
telomeraza
telomeraza djeluje kao reverzna-transkriptaza 5' T A 3' T G G A C C C G G G G T C 5' T G G G G T T G 3'
3' kraj vode}ega lanca produljen za jednu ponavljaju}u jedinicu produljavanje tromoga lanca primazom i polimerazom
5' T A 3' uklanjanje RNA-po~etnice 5' T A 3' T G G A C C C G G G T C C C A T G G G G T A C 5' T G T G G G G T A C C C T G G G G T C C C A T G G G G T A C C C T G C
3'
5'
3'
telomerna DNA produljena za jednu ponavljaju}u jedinicu
mogu proiza}i iz ugradnje pogrje{ne baze za vrijeme umnaànja DNA. Uz to, u molekuli DNA doga|aju se razli~ite kemijske promjene, bilo spontano (slika 5-18) bilo kao posljedica izloènosti kemikalijama ili zra~enju (slika 519). Takva o{te}enja DNA mogu blokirati replikaciju ili transkripciju, a mo-
194
Poglavlje 5
gu i rezultirati visokom u~estalo{}u mutacija ~ije su posljedice neprihvatljive s gledi{ta stani~ne reprodukcije. Da bi odràle integritet svojega genoma stanice su morale razviti mehanizme za popravak o{te}enja DNA. Mehanizmi popravka DNA mogu se podijeliti u dvije op}e skupine: (1) izravni obrat kemijske reakcije odgovorne za o{te}enje DNA i (2) uklanjanje o{te}enih baza nakon ~ega slijedi njihova zamjena s novosintetiziranom DNA. U slu~ajevima kad zataje oba mehanizma popravka DNA, evolucija je razvila dodatne mehanizme koji stanici pomaù da se nosi s o{te}enjima.
Izravni obrat o{te}enja DNA

Ve}ina o{te}enja DNA popravlja se uklanjanjem o{te}ene baze nakon ~ega slijedi ponovna sinteza uklonjenog podru~ja. Neka se o{te}enja ipak mogu popraviti izravnim obratom o{te}enja {to moè biti znatno u~inkovitiji na~in borbe sa specifi~nim tipovima o{te}enja DNA koji se u~estalo doga|aju. Samo nekoliko tipova o{te}enja DNA popravlja se na ovaj na~in pirimidinski dimeri nastali kao rezultat izlaganja ultraljubi~astom (UV) svjetlu i
(A) deaminacija NH2 C N O C N citozin NH2 C N HC N adenin (B) depurinacija O C HN H2N C N C C N CH N C C N CH N HC N C N HN CH CH O HN C N uracil O C C N CH O C CH CH
hipoksantin
Slika 5-18. Spontano o{te}enje DNA.

Dvije su glavne vrste spontanih o{te}enja DNA: (A) deaminacija adenina, citozina i gvanina i (B) depurinacija (gubitak purinskog mjesta) koja nastaje zbog kidanja veze izme|u purinske baze i deoksiriboze, ostavljaju}i apurinsko (AP) mjesto u DNA. dGMP = deoksigvanozin-monofosfat.
P
CH2 H H O
O H H H
CH2 H H O
OH H H H
dGMP
AP mjesto
195
(A) izlaganje UV-svjetlu O P O N1 C H O P O N C H susjedni timin u DNA (B) alkiliranje CH3 O C HN 1 H2N C
2 3 6 5 4 6 5
H C
2 3
O P
4
H C N C C C CH3 H C N C C CH3 N C O ciklobutanski prsten O
N C O
O N H
C CH3 H
O P C O O
C CH3 timinski dimer
O C C
7
N
8
C N CH H2N C N O6-metilgvanin C C
N CH N
N gvanin (C) reakcija s karcinogenom O C HN H2N C N gvanin C C
O C N CH N HN OH HN C N C C N C CH N
OH OH adicija ve}e kemijske skupine
alkilirani gvaninski ostatci, modificirani dodatkom metilne ili etilne skupine na O6 poziciju purinskog prstena. UV-svjetlo jedan je od zna~ajnijih izvora o{te}enja DNA, a tako|er je najvi{e prou~eni tip o{te}enja u smislu mehanizama popravka. Na njegovu va`nost upu}uje ~injenica da izlaganje Sun~evu UV-zra~enju predstavlja uzrok gotovo svih karcinoma koè u ljudi. Glavni tip o{te}enja induciran UV-svjetlom jest formiranje pirimidinskih dimera u kojem su susjedni pirimidini na istom lancu DNA spojeni ciklobutanskim prstenom nastalim zasi}enjem dvostruke veze izme|u petoga i {estoga atoma ugljika (vidi sliku 5-19A). Stvaranje ovakvih dimera naru{ava strukturu DNA i blokira transkripciju ili replikaciju nizvodno od mjesta o{te}enja pa je njihov popravak usko povezan sa sposobno{}u stanica da preìve UV-zra~enje. Jedan od me-
Slika 5-19. Primjeri o{te}enja DNA induciranih zra~enjem i kemijskim ~imbenicima.

(A) UV-svjetlo inducira nastajanje pirimidinskih dimera u kojima su dva susjedna pirimidina (primjerice timina) spojena strukturom ciklobutanskog prstena. (B) Alkiliranje je adicija metilne ili etilne skupine na razli~ite poloàje DNA baza. U ovom primjeru alkiliranje O6 poloàja gvanina rezultira stvaranjem O6 metilgvanina. (C) Mnogi karcinogeni (primjerice benzapiren) reagiraju s bazama u DNA {to rezultira adicijom velikih kemijskih skupina na molekulu DNA.
196
Poglavlje 5
timinski dimer
svjetlo fotoreaktivacijski enzim
Slika 5-20. Izravni popravak timinskih dimera.

UV-svjetlom inducirani timinski dimeri mogu se popraviti fotoreaktivacijom, pri ~emu energija vidljive svjetlosti sluì za kidanje veza koje tvore ciklobutanski prsten.
hanizama za popravljanje UV induciranih pirimidinskih dimera jest izravni obrat dimerizacijske reakcije. Proces se naziva fotoreaktivacija jer se za kidanje strukture ciklobutanskog prstena koristi energija vidljive svjetlosti (slika 5-20). Fotoreaktivacijom se izvorne pirimidinske baze vra}aju u normalno stanje i one ostaju u molekuli DNA. Kako je Sun~evo UV-zra~enje glavni izvor o{te}enja molekule DNA u razli~itim tipovima stanica, logi~no je o~ekivati da je popravak pirimidinskih dimera fotoreaktivacijom zajedni~ko razli~itim prokariotskim i eukariotskim stanicama, uklju~uju}i E. coli, kvasce i neke vrste biljaka i ìvotinja. Zanimljivo je, ipak, da fotoreaktivacija nije univerzalna; mnoge vrste (uklju~uju}i ~ovjeka) nemaju ovaj mehanizam popravka DNA. Drugi oblik direktnog popravka odnosi se na o{te}enja proiza{la iz reakcije izme|u alkiliraju}ih ~imbenika i DNA. Alkiliraju}i ~imbenici su reaktivne komponente koje mogu prenijeti metilnu ili etilnu skupinu na bazu DNA i time je kemijski modificirati (vidi sliku 5-19B). Osobito vaàn tip o{te}enja je metilacija O6 pozicije gvanina stoga {to nastali produkt, O6-metilgvanin, stvara komplementarne bazne parove s timinom umjesto s citozinom. Ova lezija moè biti popravljena djelovanjem enzima nazvanog O6-metilgvaninmetiltransferaza, koji prenosi metilnu skupinu s O6-metilgvanina na cisteinski ostatak u svom aktivnom mjestu (slika 5-21). Time je uklonjena potencijalna mutagena kemijska modifikacija i restauriran izvorni gvanin. Enzimi koji kataliziraju ovu direktnu reakciju popravka zastupljeni su u znatnom broju prokariotskih i eukariotskih organizama, uklju~uju}i i ~ovjeka.
CH3 O C N H2N C N C C N CH H N cistein
CH2 H H HO
O H H H
HS
CH2
O6-metilgvanin O C HN H2N C N C C N CH CH N
O6-metilgvaninmetiltransferaza
metilcistein
+
P CH2 H H HO gvanin O H H H H3C S CH2
Slika 5-21. Popravak O6-metilgvanina.

O -metilgvanin-metiltransferaza prenosi metilnu skupinu s O6-metilgvanina na cisteinski ostatak u aktivnom mjestu enzima.
6
197
Popravak izrezivanjem (ekscizijski popravak)

Premda je izravni popravak u~inkovit na~in no{enja s odre|enim tipovima o{te}enja DNA, popravak izrezivanjem je op}enitiji na~in popravka {iroke skupine kemijskih promjena molekule DNA. Prema tome, razli~iti tipovi popravka izrezivanjem predstavljaju najva`nije mehanizme popravka DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. U popravku izrezivanjem, o{te}ena DNA biva prepoznana i uklonjena bilo u obliku slobodnih baza ili nukleotida. Nastala pukotina se zatim popunjava sintezom novog lanca DNA kori{tenjem neo{te}enoga komplementarnog lanca kao kalupa. Tri tipa popravka izrezivanjem izrezivanje baza, izrezivanje nukleotida i popravak krivo sparenih baza (engl. mismatch repair) omogu}uju stanicama da se bore sa {irokim spektrom razli~itih o{te}enja DNA. Popravak molekule DNA koja sadràva uracil predstavlja dobar primjer popravka izrezivanjem baza, u kojem jedna o{te}ena baza biva prepoznana i uklonjena iz molekule DNA (slika 5-22). Uracil se moè pojaviti u DNA na dva na~ina: (1) Uracil (kao dUTP deoksiuridin-trifosfat) povremeno se ugra|uje na mjestu timina za vrijeme sinteze DNA; i (2) uracil se moè pojaviti u DNA deaminacijom citozina (vidi sliku 5-18A). Drugi mehanizam ima mnogo ve}i biolo{ki zna~aj budu}i da mijenja normalni obrazac komplementarnog sparivanja baza i time predstavlja mutageni doga|aj. Izrezivanje uracila katalizirano je djelovanjem DNA-glikozilaze, enzima koji kida vezu izme|u baze (uracila) i deoksiriboze u okosnici DNA. Ova reakcija stvara slobodni uracil i apirimidinsko mjesto {e}er bez pridruène baze. DNA-glikozilaze tako|er prepoznaju i uklanjaju druge nepravilne baze uklju~uju}i hipoksantin stvoren deaminacijom adenina, pirimidinske dimere, alkilirane purine (osim O6-alkil gvanina) i baze o{te}ene oksidacijom ili ioniziraju}im zra~enjem. Rezultat aktivnosti DNA-glikozilaze jest formiranje apirimidinskog ili apurinskog mjesta (uobi~ajeno zvanim AP mjestom) u DNA. Sli~na AP mjesta nastaju kao rezultat spontanoga gubitka purinskih baza (vidi sliku 5-18B), {to se doga|a sa zna~ajnom u~estalo{}u u normalnim stani~nim uvjetima. Procjenjuje se da na taj na~in svaka stanica u ljudskom tijelu dnevno gubi nekoliko tisu}a purinskih baza. Ta se mjesta popravljaju djelovanjem AP-endonukleaze koja kida lanac DNA uz AP mjesto (vidi sliku 522). Preostali se deoksiribozni ostatak zatim ukloni, a nastala pukotina od jedne baze popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze. Dok DNA-glikozilaze prepoznaju samo specifi~ne oblike o{te}enih baza, drugi sustavi popravka izrezivanjem prepoznaju {iroku skupinu o{te}enih baza koje naru{avaju strukturu DNA molekule, uklju~uju}i pirimidinske dimere inducirane UV zra~enjem i velike skupine dodane bazama DNA kao rezultat interakcije razli~itih kancerogena s DNA (vidi sliku 5-19C). Ovaj {iroko rasprostranjeni oblik popravka DNA poznat je kao popravak izrezivanjem nukleotida jer se o{te}ene baze (primjerice dimeri timina) uklanjaju kao dio oligonukleotida u kojem je do{lo o{te}enja (slika 5-23).
DNA sadràva U stvoren deaminacijom C U
DNA-glikozilaza AP mjesto
AP-endonukleaza
deoksiriboza-fosfodiesteraza
DNA-polimeraza
Slika 5-22. Popravak izrezivanjem baza.

U ovom je primjeru uracil (U) stvoren deaminacijom citozina (C) i zbog toga se nalazi nasuprot gvaninu (G) u komplementarnom lancu DNA. Veza izme|u uracila i deoksiriboze prekinuta je djelovanjem DNA-glikozilaze ostavljaju}i u DNA {e}er bez pridruène baze (AP mjesto). Ovo mjesto prepoznaje AP-endonukleaza koja kida lanac DNA. Preostala deoksiriboza uklanja se djelovanjem deoksiriboza-fosfodiesteraze. Nastala pukotina popunjava se nakon toga DNA-polimerazom i ligazom {to dovodi do ugradnje odgovaraju}e baze (C) nasuprot G.
ligaza
C G
198
Poglavlje 5 Kod E. coli popravak izrezivanjem nukleotida kataliziran je djelovanjem produkata triju gena (uvrA, B i C) koji su otkriveni zahvaljuju}i ~injenici da mutacije ovih lokusa rezultiraju ekstremnom osjetljivo{}u na UV-svjetlo. Protein UvrA prepoznaje o{te}enu DNA i regrutira UvrB i UvrC k mjestu lezije. UvrB i UvrC zatim kidaju lanac na 3' i 5' strani o{te}enog mjesta odvajaju}i oligonukleotid gra|en od 12 ili 13 baza. UvrABC kompleks se ~esto naziva ekscinukleaza, imenom koje odraàva njegovu sposobnost da izravno izrezuje (engl. excise) odre|eni oligonukleotid. Nakon toga je potrebna aktivnost helikaze kako bi se iz dvolan~ane molekule DNA uklonio oligonukleotid u kojem se nalazi o{te}enje, a nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze. Sustav popravka izrezivanjem nukleotida tako|er je intenzivno prou~avan u eukariotskim organizmima, uklju~uju}i kvasce, glodavce i ~ovjeka. U kvascima, kao i u E. coli, otkriveno je nekoliko gena uklju~enih u popravak DNA (nazvanih RAD geni engl. radiation sensitivity) izolacijom mutanata s pove}anom osjetljivo{}u na UV-svjetlo. U ~ovjeka su geni popravka DNA otkriveni uglavnom prou~avanjem osoba koje pate od nasljednih bolesti
T T
prepoznavanje o{te}enja kidanje nukleazom
T T
helikaza
izrezani oligonukleotid T T
Slika 5-23. Popravak timinskih dimera izrezivanjem nukleotida.

O{te}ena DNA prepoznana je i pokidana na oba kraja timinskog dimera djelovanjem 3'5'-nukleaze. Odmotavanje DNA-helikazom rezultira izrezivanjem oligonukleotida koji sadràva o{te}ene baze. Nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i zatvara ligazom.
DNA-polimeraza ligaza
199
uzrokovanih nemogu}no{}u popravka o{te}enja DNA. Najintenzivnije prou~avana od ovih bolesti je Xeroderma pigmentosum (XP), rijedak geneti~ki poreme}aj koji poga|a otprilike jednu od 25.000 osoba. Pojedinci s ovom bole{}u ekstremno su osjetljivi na UV-zra~enje i razvijaju multiple karcinome koè na podru~jima tijela izloènima Sun~evu svjetlu. James Cleaver je 1968. godine do{ao do klju~nog otkri}a da kultivirane stanice izolirane iz bolesnika koji pate od Xeroderma pigmentosum ne mogu provoditi popravka izrezivanjem nukleotida. Ovo opaànje ne samo da je pruìlo prvu vezu izme|u popravka DNA i karcinoma, ve} je tako|er predloìlo kori{tenje XP stanica kao eksperimentalnih sustava za identifikaciju ljudskih gena uklju~enih u popravak DNA. Ljudski geni uklju~eni u popravak DNA otkriveni su osim toga i prou~avanjem druge dvije bolesti ljudi koje nastaju kao posljedica defekata u popravku DNA (Cockayneov sindrom i trihotiodistrofija), te prou~avanjem stani~nih linija osjetljivih na UV-zra~enje. Vrata eksperimentalne analize popravka izrezivanjem nukleotida u sustavima sisavaca otvorilo je kloniranje gena zaduènih za popravak o{te}enja DNA. Tome su pridonijeli eksperimenti prijenosa gena provedeni u stanicama sisavaca s defektima u popravku DNA, a koji se zasnivaju na sposobnosti alela divljeg tipa da osjetljivost mutiranih stanica na UV-zra~enje vrate na normalnu razinu. Molekularnim kloniranjem otkriveno je sedam razli~itih gena popravka (ozna~enih XPA do XPG) koji su mutirani kod osoba oboljelih od Xeroderma pigmentosum, a otkriveni su i geni mutirani u osoba koje pate od Cockayneova sindroma i trihotiodistrofije, te geni u stani~nim linijama osjetljivim na UV-zra~enje. Proteini kodirani ovim genima popravka o{te}enja DNA u sisavaca usko su srodni proteinskim produktima RAD gena kvasaca, {to ukazuje na visoku konzerviranost mehanizma popravka izrezivanjem nukleotida u eukariotskim organizmima. Kada su klonirani geni popravka u kvasaca i sisavaca bilo je mogu}e dobiti i proteine koje oni kodiraju u ~istom obliku te razviti in vitro sustave za ispitivanje njihove uloge u mehanizmima popravka (slika 5-24). Po~etni korak popravka izrezivanjem nukleotida u stanicama sisavaca uklju~uje prepoznavanje krivo sparenih baza s pomo}u kompleksa gra|enog od XPC proteina i proteina pod imenom hHR23B, homolognog kva{~evom Rad23 proteinu. Nakon toga slijedi usmjerivanje XPB, XPD i XPG proteina ka mjestu o{te}enja DNA. XPB i XPD proteini su komponente transkripcijskog faktora TFIIH, koji se sastoji od vi{e podjedinica, a potreban je za inicijaciju transkripcije eukariotskih gena (vidi 6. poglavlje) oni djeluju kao helikaze, odmataju}i otprilike 30 parova baza DNA oko mjesta o{te}enja. XPA protein zatim potvr|uje o{te}enje i usmjeruje heterodimer XPF i ERCC1 protein (protein popravka identificiran u stani~nim linijama glodavaca osjetljivim na UV-zra~enje) ka mjestu o{te}enja. XPF/ERCC1 i XPG su endonukleaze koje kidaju DNA u 5'3' smjeru od o{te}enog mjesta. Tim se kidanjem izrezuje oligonukleotid duljine od otprilike 30 baza. Nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze d ili e (uz suradnju RFC i PCNA) i ligaze. Dok XPC/hHR23B kompleks moè prepoznati o{te}enja DNA bilo gdje u genomu, alternativni oblik popravka izrezivanjem nukleotida, zvan poSlika 5-24. Popravak izrezivanjem nukleotida u stanicama sisavaca.
XPC/hHR23B kompleks prepoznaje DNA o{te}enje (primjerice timinski dimer). Nakon toga se transkripcijski faktor TFIIH, koji sadràva XPB i XPD helikaze kao i XPG, usmjeruje k mjestu o{te}ene DNA. Nakon odmotavanja DNA djelovanjem XPB i XPD, XPA potvr|uje prisutnost o{te}enja i mobilizira XPF/ERCC1 kompleks. XPF/ERCC1 i XPG-endonukleaze kidaju DNA i uklanjanju o{te}eni oligonukleotid. Nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i zatvara ligazom.
XPC hHR23B prepoznavanje o{te}enja hHR23B
XPC
TFIIH (XPB and XPD) XPG helikaza
XPA XPF/ERCC 1 XPF ERCCI

T
XPA kidanje i izrezivanje oligonukleotida
DNA-polimeraza ligaza
200
Poglavlje 5
RNA-polimeraza zaustavljena na mjestu o{te}enja
Slika 5-25. Popravak povezan s transkripcijom u stanicama sisavaca.

RNA-polimeraza zaustavljena je na mjestu lezije u DNA lancu koji se prepisuje. Zaustavljenu RNA-polimerazu prepoznaju proteini povezani s transkripcijskim popravkom, CSA i CSB, koji usmjeruju TF II i XPG k mjestu o{te}enja DNA. Popravak se dalje odvija uobi~ajenim mehanizmom popravka izrezivanjem nukleotida (vidi sliku 5-24).
CSB
C CSB
T
CSA TFIIH (XPB i XPD) XPG
XPA XPF/ERCCI XPF

T T
XPA izrezivanje oligonukleotida sinteza DNA ligacija
pravak udruèn s transkripcijom, specifi~an je za popravak o{te}enja unutar gena koji se prepisuju. Veza izme|u transkripcije i popravka gena prvi puta je dokazana eksperimentima koji su pokazali da se lanac DNA koji se prepisuje popravlja znatno brè od lanca koji se ne prepisuje, kako u E. coli tako i u stanicama sisavaca. Budu}i da o{te}enje DNA blokira transkripciju, stanica favorizira popravak za vrijeme transkripcije jer joj omogu}uje da poglavito popravi o{te}enja onih gena koji su eksprimirani. Kod E. coli mehanizam povezanosti transkripcije i popravka uklju~uje prepoznavanje RNA-polimeraze zako~ene pri o{te}enju lanca DNA koji se prepisuje. Zako~enu RNA- polimerazu prepoznaje protein, nazvan faktor povezan s transkripcijskim popravkom, koji uklanja RNA-polimerazu i usmjeruje UvrABC ekscinukleazu prema mjestu o{te}enja. U stanicama sisavaca, popravak udruèn s transkripcijom uklju~uje prepoznavanje zako~ene RNA-polimeraze djelovanjem CSA i CSB proteina koji su kodirani genima odgovornim za Cockayneov sindrom (slika 5-25). Za razliku od bolesnika koji pate od Xeroderma pigmentosum, bolesnici s Cockayneovim sindromom pokazuju specifi~an defekt popravka povezanog s transkripcijom {to je u skladu s ulogom CSA i CSB proteina kao faktora povezanih s transkripcijskim popravkom. CSA i CSB djeluju analogno XPC/ ERCC1 kompleksu usmjeruju}i XPB, XPD i XPG k mjestu o{te}enja. Nakon toga slijedi mobiliziranje XPA proteina i XPF/ERCC1 kompleksa te izrezivanje o{te}enog oligonukleotida. Popravak udruèn s transkripcijom se, prema tome, nastavlja sli~no uobi~ajenom popravku izrezivanjem nukleotida s izuzetkom po~etnog prepoznavanja zako~ene RNA polimeraze djelovanjem CSA i CSB proteina, a ne izravnim prepoznavanjem o{te}enja DNA s pomo}u XPC/hHR23B kompleksa. Tre}i mehanizam popravka izrezivanjem prepoznaje krivo sparene baze ugra|ene za vrijeme replikacije DNA. Mnoge od tih krivo sparenih baza uklanjaju se korektivnom aktivno{}u DNA-polimeraze. Preostale krivo sparene baze objekt su kasnijeg korektivnog mehanizma zvanog popravak krivo sparenih baza (engl. mismatch repair system) koji provjerava novorepliciranu DNA. Mehanizmi ovog popravka sposobni su otkriti i specifi~no izrezati krivo sparenu bazu iz novosintetiziranoga lanca DNA omogu}iv{i time popravak pogrje{ke i ponovno uspostavljanje izvornoga slijeda nukleotida. Kod E. coli, sposobnost sustava popravka krivo sparenih baza da razlikuje roditeljski od novosintetiziranoga lanca DNA zasniva se na ~injenici da je DNA ove bakterije modificirana metilacijom adeninskih ostataka unutar slijeda GATC ~ime se adenin pretvara u 6-metiladenozin (slika 5-26). Kako se metilacija odvija nakon replikacije, novosintetizirani lanci DNA nisu metilirani i mogu se specifi~no prepoznati enzimima popravka pogrje{no sparenih baza. Popravak pogrje{no sparenih baza zapo~inje djelovanjem proteina MutS koji prepoznaje krivo sparene baze te tvori kompleks s dva druga proteina zvana MutL i MutH. MutH-endonukleaza zatim kida nemetilirani lanac DNA unutar GATC slijeda. MutL i MutS djeluju nakon toga zajedno s egzonukleazom i helikazom isijecaju}i DNA izme|u prekida lanca i krivo sparenih baza, a nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNApolimeraze i ligaze.

Slika 5-26. Popravak pogrje{no sparenih baza u E. coli.
Sustav popravka pogrje{no sparenih baza otkriva i uklanja pogrje{no sparene baze u novorepliciranoj DNA koja se razlikuje od roditeljskog lanca jer jo{ nije metilirana. MutS se veè za pogrje{no sparenu bazu nakon ~ega se veè i MutL. Vezanje MutL aktivira MutH koji kida nemodificirani lanac nasuprot mjestu metilacije. MutS i MutL zajedno s helikazom i egzonukleazom nakon toga izrezuju dio nemodificiranog lanca koji sadràva pogrje{no sparenu bazu. Pukotina se popunjava djelovanjem DNA-polimeraze i zatvara ligazom.
201
CH3
CH3
stari lanac novi lanac
pogrje{no sparena baza
MutS, MutL, MutH
CH3 H L
CH3
Eukarioti imaju sli~an sustav popravka krivo sparenih baza premda se mehanizam kojim eukariotske stanice prepoznaju novorepliciranu DNA razlikuje od onog kori{tenog u E. coli. îni se da u stanicama sisavaca specifi~nost pogrje{no sparene baze u novosintetiziranom lancu nije odre|ena metilacijom DNA. Umjesto toga, prisutnost jednolan~anog loma (u ovom slu~aju u novosintetiziranom lancu DNA) ili pak povezivanje eukariotskih homologa proteina MutS i MutL s replikacijskim sustavom mogli bi odrediti koji je lanac potrebno popraviti. Homolozi MutS i MutL proteina veù se zatim za krivo sparenu bazu i upravljaju isijecanjem DNA izme|u loma lanca i krivo sparenih baza, kao i u slu~aju E coli. Va`nost ovog mehanizma popravka dramati~no je ilustrirana ~injenicom da su mutacije ljudskih homologa mutS i mutL gena odgovorne za uobi~ajeni tip nasljednog karcinoma debeloga crijeva (nasljedni nepolipozni kolorektalni karcinom ili HNPCC). HNPCC predstavlja jedno od najuobi~ajenijih nasljednih oboljenja s u~estalo{}u od jedne na 200 osoba, a odgovoran je za 15% svih kolorektalnih karcinoma u SAD-u. Povezanost izme|u HNPCC i poreme}aja u popravku krivo sparenih baza otkrivena je 1993. godine kad su dvije skupine znanstvenika klonirale ljudski homolog mutS gena i prona{le da je mutacija u ovom genu odgovorna za otprilike polovinu HNPCC slu~ajeva. Naknadna ispitivanja pokazala su da je ve}ina preostalih slu~ajeva HNPCC rezultat mutacije jednog od tri ljudska homologa mutL gena. îni se da defekti ovih gena rezultiraju visokom u~estalo{}u mutacija drugih stani~nih gena s odgovaraju}om visokom vjerojatno{}u da }e neke od njih na kraju dovesti do razvoja karcinoma.
MutS, MutL, helikaza, egzonukleaza CH3 L S CH3
DNA-polimeraza ligaza CH3 CH3
Popravak sklon pogrje{kama

Mehanizmi izravnog obrata o{te}enja DNA i popravka izrezivanjem popravljaju o{te}enje DNA prije replikacije tako da se DNA moè sintetizirati kori{tenjem neo{te}enog lanca DNA kao kalupa. U slu~aju da ovi mehanizmi zakaù, stanica ipak ima alternativne mehanizme za popravak o{te}enja DNA u replikacijskim ra{ljama. Pirimidinski dimeri i mnogi drugi tipovi lezija ne mogu se kopirati normalnom aktivno{}u DNA-polimeraza pa je replikacija na mjestima tih o{te}enja blokirana. No, stanice tako|er posjeduju nekoliko specijaliziranih DNA-polimeraza koje su u stanju izvr{iti replikaciju i preko mjesta s o{te}enjem DNA. Replikacija o{te}ene DNA djelovanjem takvih specijaliziranih polimeraza moè dovesti do u~estalog ugra|ivanja neodgovaraju}ih baza pa se ovaj oblik borbe s o{te}enjima DNA naziva popravak sklon pogrje{kama (engl. error prone repair). Prva DNA-polimeraza sklona pogrje{kama otkrivena je 1999. godine u E. coli. Ovaj enzim, nazvan polimeraza V, induciran je u odgovoru na ekstenzivno UV-zra~enje. Polimeraza V moè sintetizirati novi lanac molekule DNA preko mjesta s timinskim dimerima (slika 5-27). Druge dvije DNA-polimeraze u E. coli, polimeraza II i IV, na sli~an su na~in inducirane o{te}enjem DNA i djeluju u mehanizmu popravka sklonom pogrje{kama. Euka-
202
Poglavlje 5
normalna replikacija
T T
DNA-polimeraza sklona pogrje{kama usmjerena ka mjestu lezije
T T
sinteza DNA preko mjesta o{te}enja djelovanjem DNA polimeraze sklone pogrje{kama
riotske stanice tako|er sadràvaju vi{e DNA-polimeraza sklonih pogrje{kama. Do sada je otkriveno devet takvih enzima u stanicama ~ovjeka. Sve DNA-polimeraze sklone pogrje{kama iskazuju malu vjernost izvornom kalupu kad kopiraju neo{te}enu DNA, sa stopama pogrje{aka od 100 do 10.000 puta ve}im no {to su stope pogrje{aka normalnih replikacijskih DNA-polimeraza (primjerice polimeraze III u E. coli ili polimeraze d i u eukariota). Uz to, polimeraze sklone pogrje{kama nemaju 3'5' korektivnu aktivnost svojstvenu normalnim replikacijskim DNA-polimerazama (vidi sliku 5-12). Va`no je ipak da su polimeraze sklone pogrje{kama specijalizirane za ugradnju odgovaraju}ih baza smje{tenih nasuprot specifi~nim lezijama u o{te}enoj DNA i stoga su u mogu}nosti to~no sintetizirati novi lanac koriste}i neke oblike o{te}enoga lanca kao kalupa. Tako primjerice polimeraza V u E. coli specifi~no prepoznaje timinske dimere i korektno ugra|uje AA na nasuprotnom mjestu novosintetiziranoga lanaca. Dakle, ovi enzimi sposobni su specifi~no ugraditi odgovaraju}u bazu smje{tenu nasuprot nekim oblicima o{te}enja DNA, premda su sklone pogrje{kama u ugra|ivanju baza smje{tenih nasuprot drugih oblika o{te}ene DNA ili u sintezi DNA kori{tenjem normalnoga neo{te}enog kalupa.
Rekombinacijski popravak
T T
nastavljanje normalne replikacije
T T
popravak lezije izrezivanjem
Slika 5-27. Popravak sklon pogre{kama

Normalna replikacija blokirana je timinskim dimerom, ali DNA-polimeraza sklona pogre{kama, kao {to je primjerice polimeraza V (pol V), prepoznaje i nastavlja sintezu DNA i preko o{te}enog mjesta. Replikacija se tada moè nastaviti regular nom replikacijskom DNA-polimerazom, a timinski dimer se na kraju uklanja popravkom ekscizijom nukleotida. Sinteza DNA pomo}u polimeraze sklone pogre{kama dovodi do u~estale ugradnje pogre{nih baza.
Jo{ jedan na~in popravka DNA, rekombinacijski popravak, zasniva se na zamjeni o{te}ene DNA rekombinacijom s neo{te}enom molekulom. Ovaj mehanizam se u~estalo koristi za popravak o{te}enja na koja se nailazi za vrijeme replikacije DNA kada prisutnost timinskih dimera ili drugih lezija, koje ne mogu biti kopirane djelovanjem normalne replikacijske DNA-polimeraze, blokira napredovanje replikacijskih ra{lji. Rekombinacijski popravak ovisi o ~injenici da je jedan lanac roditeljske DNA ostao neo{te}en, i da je replikacijom dao normalnu sestrinsku molekulu, koja sada moè biti iskori{tena za popravak o{te}enoga lanca. Premda molekularni mehanizmi rekombinacijskoga popravka nisu u potpunosti poznati i mogu varirati me|u razli~itim tipovima stanica op}i ilustrativni model prikazan je na slici 5-28. U ovom primjeru normalna replikacija blokirana je prisutno{}u timinskog dimera u jednom lancu molekule DNA. Ipak, nizvodno od mjesta o{te}enja replikacija moè opet biti zapo~eta sintezom Okazakijeva fragmenta i moè se nastaviti uzdu` o{te}enog lanca kalupa. Rezultat toga je sestrinski lanac koji sadràva pukotinu nasuprot mjestu o{te}enja roditeljskoga lanca. Neo{te}eni roditeljski lanac, koji je replikacijom dao normalni sestrinski lanac, moè zatim biti upotrijebljen za popunjavanje pukotine nasuprot mjestu o{te}enja s pomo}u rekombinacije homolognih sljedova DNA (vidi daljnji tekst). Budu}i da je tako nastala pukotina u prethodno intaktnom roditeljskom lancu smje{tena nasuprot neo{te}enom lancu ona moè biti popunjena djelovanjem DNApolimeraze. Iako druga roditeljska molekula i dalje sadràva izvorno o{te}enje (timinski dimer), ono sada leì nasuprot normalnom lancu i moè se kasnije popraviti popravkom izrezivanjem. Rekombinacijski popravak tako|er pruà glavni mehanizam za popravljanje dvolan~anih lomova koji se mogu pojaviti u molekuli DNA kao posljedica ioniziraju}eg zra~enja (primjerice X zrake) ili djelovanja nekih kemijskih ~imbenika (slika 5-29). Kako ovaj tip o{te}enja poga|a oba lanca DNA osobito je nezgodan za popravak. Rekombinacija s homolognim slijedom DNA u neo{te}enom kromosomu osigurava mehanizam za popravljanje ovakvih o{te}enja i restauriranje normalnog slijeda DNA. Alternativno, dvolan~ani lomovi mogu se popraviti jednostavno spajanjem prekinutih krajeva zahva}ene molekule DNA, no to bi rezultiralo visokom u~estalosti
203
Karcinom debelog crijeva i popravak DNA

Bolest
Karcinomi kolona i rektuma (kolonorektalni karcinomi) neki su od naj~e{}ih karcinoma u zapadnom svijetu. Na njih otpada oko 140.000 sveukupnih karcinoma koji su godi{nje zabiljeèni u SAD-u (otprilike oko 10% incidencije karcinoma). Ve}ina karcinoma kolona (kao i drugih vrsta karcinoma) nisu nasljedne bolesti {to zna~i da se ne prenose izravno s roditelja na potomstvo. No ipak, opisana su dva nasljedna oblika karcinoma. U oba slu~aja naslje|ivanje gena za predispoziciju pojave karcinoma rezultira vrlo velikom vjerojatno{}u razvoja bolesti. Jedan od oblika nasljednog karcinoma debeloga crijeva (familijarna adenomatozna polipoza) iznimno je rijedak i ~ini manje od 1% slu~ajeva karcinoma debeloga crijeva. Drugi nasljedni oblik karcinoma debeloga crijeva (nasljedni nepolipozni kolorektalni karcinom ili HNPCC, engl. hereditary nonpolyposis colorectal cancer) znatno je u~estaliji i ~ini do 15% svih slu~ajeva karcinoma debeloga crijeva. HNPCC je jedna od naju~estalijih nasljednih bolesti i poga|a pribli`no jednu od svakih 200 osoba. Premda su karcinomi debeloga crijeva naj~e{}a manifestacija ovog oboljenja, pogo|ene osobe tako|er pate od pove}ane incidencije drugih tipova karcinoma, uklju~uju}i karcinom jajnika i endometrija. skim stanicama. Za razliku od toga, kod nasljednih karcinoma mutacije u stanicama germinativne linije (spolnim stanicama) predisponiraju osobu za razvoj bolesti. Zna~ajan napredak u istraìvanju ove vrste karcinoma dogodio se 1993. godine kada je otkriveno da gen odgovoran za oko 50% HNPCC slu~ajeva kodira enzim uklju~en u popravak krivo sparenih baza ovaj gen u ~ovjeka homolog je MutS gena u E. coli. Naknadna istraìvanja pokazala su da su jo{ tri gena, odgovor na za ve}inu preostalih slu~ajeva HNPCC, homolozi MutL gena te su tako|er uklju~eni u popravak krivo sparenih baza. Mutacije u ovim genima rezultiraju visokom u~estalo{}u mutacija drugih stani~nih gena. Velika je vjerojatnost da }e neke od tih mutacija na kraju dovesti do razvoja karcinoma u slu~aju da pogode gene koji reguliraju proliferaciju stanica. u razdoblju od nekoliko godina. Rano dijagnosticiranje oboljenja znatno pove}ava {anse preìvljenja bolesnika. Po~etni stadij karcinoma debeloga crijeva predstavlja rast malih benignih polipa koji s vremenom postaju maligni i napadaju okolno vezivno tkivo. Prije maligne transfor macije polipe je mogu}e lako ukloniti kirur{kim putem {to je vrlo efikasno u prevenciji razvoja tumora. Polipi i rani stadiji karcinoma debeloga crijeva mogu se otkriti ispitivanjem debeloga crijeva s tankom osvijetljenom sondom (kolonoskopom), tako da u~estale kolonoskopije bolesnika s HNPCC mogu omogu}iti uklanjanje polipa prije razvoja karcinoma. Osim toga, otkriveno je nekoliko lijekova potencijalnih inhibitora razvoja karcinoma debeloga crijeva koji mogu donijeti znatnu korist bolesnicima s HNPCC. Pravodobna primjena preventivnih mjera, u smislu otkrivanja mutacija odgovornih za HNPCC, moè znatno pridonijeti smanjenju broja oboljelih od ove zlo}udne bolesti.
Kao i kod drugih nasljednih bolesti, otkri}e gena odgovor nih za HNPCC omogu}uje da se geneti~kim testiranjem identificiraju osobe izloène riziku za razvoj ovog oblika nasljednog karcinoma. Nadalje, prenatalna geneti~ka dijagnoza moè biti veoma va`na nosiocima HNPCC mutacija u planiranju obitelji. Potencijalne pogodnosti otkrivanja ovih mutacija nisu ograni~ene samo na prevenciju preno{enja mutiranoga gena na sljede}u generaciju njihovo otkri}e moè tako|er pridonijeti prevenciji razvoja bolesti kod nosioca mutacija. Klju~na zna~ajka karcinoma debeloga crijeva jest njegov postupni razvoj

Poput drugih karcinoma, kolorektalni se karcinom razvija zbog mutacije gena koji reguliraju stani~nu proliferaciju {to dovodi do nekontroliranoga rasta stanica karcinoma. U ve}ini slu~ajeva te mutacije nastaju sporadi~no u somat-
Polip debeloga crijeva vizualiziran kolonoskopijom. (David M. Martin, M.D./SPL/Photo Researches, Inc..)
pogrje{aka koje nastaju zbog delecije baza oko mjesta o{te}enja. Treba napomenuti da geni odgovorni za nasljedni karcinom dojke (BRCA1 i BRCA2) kodiraju proteine koji su uklju~eni u popravak dvolan~anih lomova posredovanjem homologne rekombinacije, {to sugerira da defekti ovog tipa popravka DNA mogu imati za posljedicu nastanak jednog od naju~estalijih karcinoma u èna.
204
Poglavlje 5
Slika 5-28. Rekombinacijski popravak.

Prisutnost timinskih dimera blokira replikaciju, ali DNA-polimeraza moè zaobi}i leziju i ponovo zapo~eti replikaciju na novom mjestu nizvodno od dimera. Kao rezultat toga nasuprot dimera u novosintetiziranom lancu nastaje pukotina. Ona se popunjava rekombinacijom s neo{te}enim roditeljskim lancem. Premda to ostavlja pukotinu u prethodno intaktnom roditeljskom lancu, ta pukotina moè se popuniti aktivno{}u polimeraze i ligaze, kori{tenjem intaktnog lanca k}eri kao kalupa. Prema tome stvaraju se dvije cjelovite molekule DNA, a preostali timinski dimer moè se na kraju ukloniti ekscizijskim popravkom.
TT
blokiranje replikacije timinskim djelovanjem
polimeraza nastavlja sintezu nizvodno od o{te}enja

TT
pukotina u lancu k}eri nasuprot dimeru u roditeljskom lancu
neo{te}eni roditeljski lanac rekombinira se u pukotinu

TT
rekombinacija ostavlja pukotinu u prethodno intaktnom roditeljskom lancu pukotina se popunjava djelovanjem polimeraze i ligaze
TT
Rekombinacija izme|u homolognih sljedova DNA

Precizna replikacija DNA i popravak o{te}enja DNA nu`ni su za odrànje geneti~ke informacije i osiguranje njezina to~nog prijenosa s roditelja na potomstvo. Kao {to je prikazano u prethodnom tekstu, rekombinacija je vaàn mehanizam za popravak o{te}enja DNA. Uz to, rekombinacija je klju~na za stvaranje geneti~ke raznolikosti, osobito va`ne s evolucijskog gledi{ta. Geneti~ka razli~itost me|u jedinkama pruà osnovni startni materijal prirodne selekcije koji omogu}uje vrstama da evoluiraju i prilagode se promjenjivim uvjetima okoli{a. Rekombinacija ima sredi{nju ulogu u tom procesu jer omogu}uje genima da se presloè u razli~ite kombinacije. Tako primjerice rekombinacija rezultira izmjenom gena u sparenim homolognim kromosomima za vrijeme mejoze. Uz to, rekombinacija je uklju~ena u preslagivanje specifi~nih sljedova DNA koji mijenjaju ekspresiju i funkciju nekih gena tijekom razvoja i diferencijacije. Stoga, rekombinacija igra va`nu ulogu u ìvotu pojedina~nih stanica i organizama, a istovremeno pridonosi geneti~koj raznolikosti vrsta.
205
ioniziraju}e zra}enje
Slika 5-29. Popravak dvolan~anih lomova.

3' 5' spajanje krajeva
5' 3' homologna rekombinacija 5' 3' normalna homologna DNA 5' 3' 3 5
Ioniziraju}e zra~enje i neke kemikalije induciraju dvolan~ane lomove u DNA. Ovi lomovi se mogu popraviti homolognom rekombinacijom s nor malnim kromosomom dovode}i do restauracije izvor noga slijeda DNA. Alter nativno, krajevi dvolan~anih lomova mogu se izravno spojiti, no to je ~esto povezano s gubitkom baza uz mjesto o{te}enja.
3' 5'
+
3' 5'
5' 3'
+
popravak bez pogrje{aka
izgubljene baze
gubitak baza na krajevima
U ovom dijelu poglavlja prikazani su mehanizmi rekombinacije izme|u molekula DNA ~iji su sljedovi izrazito homologni. Primjeri uklju~uju homolognu rekombinaciju za vrijeme popravka DNA kao i rekombinaciju izme|u sparenih eukariotskih kromosoma tijekom mejoze te rekombinaciju izme|u bakterijskih kromosoma za vrijeme seksualnog razmnoàvanja. Budu}i da ovaj tip rekombinacije podrazumijeva izmjenu geneti~ke informacije izme|u dviju homolognih molekula DNA, on ne dovodi do promjene u sveukupnom ustroju gena na kromosomu. Drugi tipovi rekombinacije ne zahtijevaju izrazitu homologiju sljedova DNA i stoga se mogu odvijati i izme|u nesrodnih dijelova DNA molekule. Rekombinacijski doga|aji toga tipa dovode do preslagivanja gena o ~emu }e biti govora dalje u ovom poglavlju.
Slika 5-30. Modeli rekombinacije.

U modelu izbora kopije, rekombinacija se odvija za vrijeme sinteze molekula DNA k}eri. Replikacija DNA zapo~inje s jednim roditeljskim DNA-kalupom a zatim se prebacuje na drugu roditeljsku molekulu {to rezultira sintezom rekombinantnih DNA k}eri koje sadràvaju slijedove homologne obama roditeljima. U modelu loma i ponovnog spajanja rekombinacija nastaje kao rezultat loma i ukriènoga prespajanja roditeljskih molekula DNA.
Molekule DNA rekombiniraju se lomljenjem i ponovnim spajanjem

Geneti~ka rekombinacija prvi je put definirana kad je primije}eno da se geni na razli~itim kopijama homolognih kromosoma vinske mu{ice mogu presloìti tijekom mejoze. Nedugo zatim, otkri}e DNA kao materijala od
model izbora kopije sinteza novih DNA k}eri
prebacivanje na kopiranje drugoga roditeljskog kalupa
rekombinantne DNA k}eri
model loma i ponovnoga spajanja roditeljske DNA lom i unakrsno prespajanje rekombinantne DNA molekule
206
Poglavlje 5
Slika 5-31. Eksperimentalni prikaz rekombinacije mehanizmom loma i ponovnoga spajanja.

Geneti~ki razli~iti roditeljski virusi uzgajani su u mediju s ili lakim ili te{kim izotopima ugljika (12C ili 14C) i du{ika (14N ili 15N) kako bi se obiljeìle njihove DNA molekule s obzirom na gusto}u. E. coli je inficirana pod uvjetima koji inhibiraju replikaciju, a nastale virusne ~estice prikupljene su i analizirane ravnote`nim centrifugiranjem u gradijentu CsCl kako bi se odredila gusto}a genskih rekombinanata. Na|eno je da rekombinantni virusi imaju intermedijar nu gusto}u {to indicira da su stekli DNA obaju roditelja mehanizmom loma i ponovnoga spajanja.
roditeljski virusi
A B
a b
uzgoj u 12C, 14N mediju
uzgoj u 13C, 15N mediju
infekcija E. coli
rekombinacija izme|u nekih virusnih molekula DNA
odre|ivanje distribucije te{kih i lakih molekula DNA separacijom virusa u gradijentu gusto}e CsCl
laki roditeljski virusi
rekombinantni virusi intermedijarne gusto}e roditeljske molekule DNA A B 5' 3' a 5' 3' b
te{ki roditeljski virusi 3' 5' 3' 5'
roditeljske molekule DNA s lomom u mjestu s preklapaju}im (ljepljivim) jednolan~anim krajevima 5' 3' 5' 3' kri`no prespajanje komplementarnim sparivanjem baza rekombinanti A 5' 3' A 5' 3' a a b B B b c c C C 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5'
kojega su gra|eni geni dalo je dva alternativna modela za obja{njenje rekombinacije na molekularnoj razini (slika 5-30). Model izbora kopije (engl. copy choice model) pretpostavlja da rekombinantna molekula DNA nastaje za vrijeme sinteze DNA na taj na~in da DNA-polimeraza prvo zapo~ne kopiranje jednoga roditeljskog lanca, a zatim se prebaci na kopiranje drugoga roditeljskog lanca. Alternativni je model predlagao da do rekombinacije dolazi lomom i ponovnim spajanjem dviju roditeljskih molekula DNA, a ne sintezom nove molekule DNA. Ova dva modela prvi su put predloèna 1961. godine, na temelju zapaànja prilikom analize rekombinacije izme|u genoma bakterijskih virusa (slika 5-31). Poznato je da infekcija E. coli virusima koji nose razli~ite geneti~ke biljege dovodi do nastanka rekombinantnih potomaka. Da bi se odgovorilo na pitanje uklju~uje li ova rekombinacija lom i ponovno spajanje roditeljSlika 5-32. Homologna rekombinacija komplementarnim sparivanjem baza.
Roditeljske molekule DNA pokidane su u mjestima s preklapaju}im jednolan~anim krajevima (ljepljivim krajevima) koji su izmijenjeni putem sparivanja baza s homolognim slijedovima. Rezultat toga je heterodupleksno podru~je u kojem dva DNA lanca potje~u iz razli~itih roditeljskih molekula.
podru~je heterodupleksa
207
5' 3' 3' 5'
Slika 5-33. Hollidayev model homologne rekombinacije.

Jednolan~ani zarezi uvedeni su u na istim pozicijama obiju roditeljskih molekula. Nakon toga dolazi do izmjene zarezanih lanaca komplementarnim sparivanjem baza, a ligacija stvara ukrièni me|uprodukt zvan Hollidayeva veza.
3' 5' 5' 3'
skih molekula DNA, jedan od roditeljskih virusa uzgajan je u mediju koji sadràva te{ki izotop ugljika (13C) i du{ika (15N) dok je drugi uzgajan u mediju koji sadràva normalne lake izotope (12C i 14N). Time su dobiveni roditeljski virusi razli~ite gusto}e koji se mogu razdvojiti centrifugiranjem u gradijentu gusto}e CsCl. Nakon toga je E. coli inficirana razli~ito obiljeènim roditeljskim virusima u uvjetima koji inhibiraju replikaciju, a novostvorene virusne ~estice analizirane su prema njihovoj gusto}i i geneti~kim karakteristikama. Dobiveni su geneti~ki rekombinirani virusi intermedijarne gusto}e {to upu}uje na to da nose molekule DNA obaju roditelja kao {to je predvi|eno modelom loma i ponovnog spajanja, a ne modelom izbora kopije.
zarezivanje roditeljskih DNA-molekula 3' 5' 5' 3' izmjena lanaca 3' 5' 5' 3' ligacija Hollidayeva veza 3' 5' 5' 3' podru~je heterodupleksa 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5'
Modeli homologne rekombinacije

Otkri}e da se rekombinacija odvija lomom i ponovnim spajanjem postavilo je novo klju~no pitanje: kako dvije roditeljske molekule DNA mogu biti prekinute to~no na istom mjestu tako da se mogu ponovo spojiti, a da pri tome ne nastanu mutacije zbog delecija odnosno adicija nukleotida u mjestu loma? Za vrijeme rekombinacije izme|u homolognih molekula DNA (op}i tip homologne rekombinacije) takvo poravnavanje omogu}eno je sparivanjem baza komplementarnih lanaca DNA (slika 5-32). Preklapaju}i jednolan~ani krajevi izmjenjuju se izme|u homolognih molekula DNA dovode}i do stvaranja heterodupleksa u kojem dva lanca rekombinantne dvolan~ane uzvojnice potje~u od razli~itih roditelja. Kad se molekule DNA heterodupleksa geneti~ki razlikuju, molekula DNA koja nastaje sadràva dva razli~ita geneti~ka biljega. U nekim slu~ajevima krivo sparene baze u heterodupleksu mogu biti prepoznane i ispravljene mehanizmom popravka krivo sparenih baza na na~in koji je opisan ranije u ovom poglavlju. Molekularni model rekombinacije predloèn je 1964. godine na temelju ispitivanja rekombinacije u gljivicama i bakterijama kad su dobiveni prvi geneti~ki dokazi za stvaranje i popravak heterodupleksa. Ovaj model, poznat kao Hollidayev model (nazvan prema istraìva~u Robinu Hollidayu), premda modificiran stjecanjem novih podataka i danas pruà osnovu poimanja rekombinacijskih mehanizama. Izvorna verzija Hollidayeva modela predlaè da rekombinacija zapo~inje uvo|enjem ureza (engl. nick) u istom mjestu obiju roditeljskih molekula (slika 5-33). Lanci DNA s urezom djelomi~no se razmotaju i svaki izvr{i nukleofilni napad na drugu molekulu na taj na~in da se spari s komplementarnim neprekinutim lancem. Ligacija prekinutih lanaca stvara zatim ukriènje poznato kao Hollidayeva veza koja predstavlja glavni me|uprodukt u rekombinaciji. Izravni prikaz Hollidayeve veze dobiven uz pomo} elektronskog mikroskopa dao je jasnu potporu za ovaj model rekombinacije (slika 5-34).
Slika 5-34. Identifikacija Hollidayeve veze pomo}u elektronske mikroskopije.
Elektronskomikroskopska fotografija Hollidayeve veze otkrivene za vrijeme rekombinacije plazmidnih molekula DNA u E. coli. U donjem dijelu slike prikazan je interpretacijski crte` strukture. Prikazana molekula ilustrira Hollidayevu vezu otvorene konfiguracije koja rezultira iz rotacije me|uprodukta s ukriènim lancima (vidi sliku 5- 33) (Ljubazno{}u Huntington Potter, University of South Florida i David Dressler, University of Oxford)
208
Poglavlje 5
po~etna Hollidayeva veza
izomer Hollidayeve veze
A rotacija donjega dijela strukture za 180
A rotacija desnoga dijela strukture za 180
b a b zarezivanje i prespajanje ukriènih lanaca
zarezivanje i prespajanje ukriènih lanaca
b a b
+
nerekombinantni heterodupleks
+
rekombinantni heterodupleks
Slika 5-35. Izomerizacija i razrje{avanje Hollidayeve veze.

Hollidayeva veza razrje{uje se kidanjem i prespajanjem ukriènih lanaca. Ako se Hollidayeva veza stvorena inicijalnom izmjenom lanaca razrje{i nastaju heterodupleksni potomci koji nisu rekombinantni za genske biljege izvan heterodupleksnog podru~ja. Ipak, dvije rotacije molekule s ukriènim lancima stvaraju izomer u kojem su ukrièni neprekinuti roditeljski lanci, a ne inicijalno zarezani lanci. Kidanje i prespajanje ukriènih lanaca tih izomera daje potomke koji su rekombinantni heterodupleksi.
Jednom stvorena Hollidayeva veza moè biti razrije{ena kidanjem i ponovnim spajanjem ukriènih lanaca {to dovodi do stvaranja rekombinantne molekule (slika 5-35). To se moè dogoditi na dva razli~ita na~ina ovisno o orijentaciji Hollidayeve veze koja zapravo odre|uje dva razli~ita izomera. U izomeru koji nastaje iz po~etne izmjene lanaca ukrièni su oni lanci koji su zarezani na po~etku rekombinacijskog procesa. No, jednostavna rotacija ove strukture daje druga~iji izomer u kojem su ukrièni neprekinuti roditeljski lanci. Razrje{enje razli~itih izomera ima razli~ite geneti~ke posljedice. U prvom slu~aju nastale molekule imaju heterodupleksna podru~ja, ali DNA koja ome|uje ta podru~ja nije rekombinirana. Ako do|e do izomerizacije, kidanje i spajanje ukriènih lanaca rezultirat }e molekulama ~ija su podru~ja koja ome|uju heterodupleks rekombinirana. Stvaranje rekombiniranih i nerekombiniranih heterodupleksa odre|eno je upravo Hollidaye-
209
vom vezom {to je u skladu s geneti~kim podatcima na kojima je zasnovan Hollidayev model. Kao {to je u po~etku re~eno, Hollidayev model nije u stanju objasniti kako dolazi do inicijacije rekombinacije istovremenim zarezivanjem obiju roditeljskih molekula na istovjetnom poloàju. îni se da rekombinacija op}enito po~inje dvolan~anim lomom kako za vrijeme popravka DNA tako i za vrijeme rekombinacije izme|u homolognih kromosoma tijekom mejoze (slika 5-36). Oba lanca DNA na mjestu dvolan~anog loma prvo se razgrade djelovanjem nukleaze koja razgra|uje DNA u 5'3' smjeru stvaraju}i jednolan~ane krajeve. Ti jednolan~ani krajevi izvr{e nukleofilni napad na drugu roditeljsku molekulu pri ~emu se spare komplementarne baze. Pukotine se zatim popunjavaju sintezom kao pri popravku DNA, a lanci spajaju ligacijom stvaraju}i molekulu s dvostrukom Hollidayevom vezom koja moè biti razrije{ena daju}i ili rekombinantne ili nerekombinantne heterodupleksne molekule kao {to je to ranije opisano.
Enzimi uklju~eni u homolognu rekombinaciju

Ve}ina enzima za koje se danas zna da su uklju~eni u rekombinaciju prvotno je identificirana analizom rekombinacijski defektnih mutanata E. coli. Takve geneti~ke analize utvrdile su da rekombinacija zahtijeva specifi~ne enzime, zajedno s proteinima (kao {to su DNA-polimeraza, ligaza i proteini koji veù jednolan~anu DNA) koji imaju vi{estruke uloge u metabolizmu DNA. Otkri}e gena potrebnih za u~inkovitu rekombinaciju u E. coli omogu}ilo je izolaciju njima kodiranih proteina ~ije su karakteristike ispitane bio-
5' 3' dvolan~ani lom 5' 3' razgradnja nukleazom 5' 3' 3' 5' neo{te}ena roditeljska DNA invazija lanaca 5' 3' 3' 5' sinteza DNA ligacija 5' 3' 3' 5' dvostruka Hollidayeva veza
3' 5'
3' 5'
3' 5' 5' 3'
3' 5' 5' 3'
Slika 5-36. Inicijacija rekombinacije dvolan~anim lomom.

Oba lanca DNA na mjestu dvolan~anog loma razgra|ena su nukleazom u 5' 3' smjeru. Jednolan~ani krajevi zatim zalaze u drugu roditeljsku molekulu s pomo}u homolognoga sparivanja baza. Pukotine se nakon toga popunjavaju sintezom DNA i zatvaraju ligacijom stvaraju}i dvostruku Hollidayevu vezu.
3' 5' 5' 3'
210
Poglavlje 5
Slika 5-37. Funkcija RecA proteina.

RecA se inicijalno veè za jednolan~anu DNA stvaraju}i nit koja se sastoji od proteina i DNA. RecA protein koji obavija jednolan~anu DNA se zatim veè za drugu, dvolan~anu molekulu DNA stvaraju}i kompleks u kojem ne dolazi do sparivanja baza. Nakon toga slijedi komplementarno sparivanje baza i izmjena lanaca pri ~emu nastaju heterodupleksna podru~ja.
jednolan~ana DNA
vezanje RecA DNA obavijena s RecA
vezanje za dvolan~anu DNA kompleks bez sparenih baza
sparivanje homolognih podru~ja izmjena lanaca
kemijskom analizom u bezstani~nim sustavima. Ta ispitivanja razjasnila su djelovanje nekoliko enzima koji kataliziraju stvaranje i razrje{enje Hollidayevih struktura. Sredi{nji protein uklju~en u homolognu rekombinaciju je RecA koji promovira izmjenu lanaca izme|u homolognih DNA molekula {to rezultira stvaranjem heterodupleksa (slika 5-37). Aktivnost RecA proteina moè se opisati u tri koraka. RecA protein se prvo veè za jednolan~anu DNA stvaraju}i pri tome nit sa~injenu od proteina i DNA. Budu}i da sadràva dva vezna mjesta za DNA, RecA protein vezan za jednolan~anu DNA moè vezati i drugu, dvolan~anu molekulu DNA, stvaraju}i tako kompleks izme|u dvije molekule DNA. Ovo nespecifi~no povezivanje, posredovano RecA proteinom, popra}eno je specifi~nim sparivanjem baza izme|u jednolan~ane DNA i njoj komplementarnog podru~ja dvolan~ane DNA. Zatim jedno-
211
lan~ani kraj molekule DNA, obavijen RecA proteinom, zamijeni homologni lanac dvolan~ane molekule DNA formiraju}i pri tome heterodupleks. Ovaj proces kataliziran je samim RecA proteinom te je stoga RecA protein sposoban da sam katalizira reakcije izmjene lanaca koje imaju sredi{nju ulogu u stvaranju Hollidayevih veza. Za geneti~ku rekombinaciju kao i za popravak dvolan~anih lomova kod kvasaca potreban je RecA proteinu srodan protein nazvan RAD51. Osim {to je strukturno sli~an RecA proteinu RAD51 je tako|er sposoban katalizirati izmjenu lanaca in vitro. Proteini srodni proteinu RAD51 otkriveni su i u sloènijim eukariotskim organizmima, uklju~uju}i ~ovjeka, {to je pokazalo da proteini srodni RecA proteinu imaju klju~ne uloge u homolognoj rekombinaciji kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. Kad se Hollidayeva veza formira, u rekombinaciju se uklju~uje kompleks sastavljen od sljede}a tri proteina bakterije E. coli, a to su RuvA, RuvB i RuvC (slika 5-38). RuvA prepoznaje Hollidayevu vezu i regrutira RuvB. Ruv B djeluje kao motor koji upravlja migracijom mjesta u kojem su ukrièni DNA lanci mijenjaju}i na taj na~in veli~inu heterodupleksa i poloàj na kojem }e ukrièni lanci biti pokidani i ponovno spojeni. RuvC razrje{uje Hollidayevu vezu kidaju}i ukriène lance DNA. Proces zavr{ava ponovnim spajanjem prekinutih lanaca ligacijom na taj na~in da se stvore dvije rekombinantne molekule. Eukariotske stanice ne posjeduju homologe proteina RuvA, RuvB i Ruv C koje nalazimo u E. coli. Umjesto toga, razrje{avanje Hollidayeve veze u eukariotskim stanicama posredovano je nekim drugim proteinima koji jo{ nisu u potpunosti poznati.
Hollidayeva veza
migracija mjesta ukriènja
RuvA RuvB
cijepanje ukriènih lanaca
RuvC
rekombinantne molekule
ligacija
Preslagivanje DNA
Homologna rekombinacija rezultira preraspodjelom gena izme|u homolognih kromosoma pri ~emu se ne mijenja sadràj genoma. Nasuprot tomu, druge vrste rekombinacijskih doga|aja dovode do preslagivanja genomske DNA. Neki od tih preslagivanja DNA va`ni su u kontroli ekspresije gena u specifi~nim tipovima stanica, dok drugi pridonose geneti~koj raznolikosti pri ~emu mogu biti va`ni za evoluciju. Otkri}e da se geni mogu premje{tati na razli~ita mjesta u kromosomima potje~e iz istraìvanja kukuruza koje je ~etrdesetih godina pro{loga stolje}a provela Barbara McClintock. Ona je samo na osnovi geneti~ke analize opisala nove geneti~ke elemente koji se mogu pomicati na razli~ita podru~ja u genomu kukuruza te mijenjati ekspresiju susjednih gena. No, pro{lo je skoro tri desetlje}a prije no {to je fizi~ka osnova njezina zapaànja rasvijetljena otkri}em pokretnih elemenata u bakterijama ~ime je ideja o pokretnim geneti~kim elementima postala {iroko prihva}ena od strane znanstvene javnosti. Danas je poznato nekoliko tipova preslagivanja DNA koji se zbivaju u eukariotskim i prokariotskim genomima, uklju~uju}i i premje{tanje elemenata koje je prva opisala Barbara McClintock. Nadalje, danas znamo da pokretni geneti~ki elementi ~ine veliki dio genoma biljaka i ìvotinja, uklju~uju}i i ljudski genom gdje je njihov udio gotovo 50%.
Slika 5-38. Migracija ukriènja i razrje{enje Hollidayeve veze.

RuvA prepoznaje Hollidayevu vezu i mobilizira RuvB koji katalizira pomicanje mjesta u kojem su lanci ukrièni (migracija ukriènja). RuvC razrje{ava Hollidayevu vezu kidaju}i ukriène lance koji se zatim spajaju djelovanjem ligaze.
Mjesno-specifi~na rekombinacija (engl. site-specific recombination)

Za razliku od uobi~ajene homologne rekombinacije, koja se doga|a na svakom ve}em podru~ju homologije nukleotidnih sljedova, mjesno-specifi~na rekombinacija odvija se izme|u specifi~nih sljedova u podru~jima DNA manje homolognosti. Glavna interakcija u ovom procesu nije posredovana komplementarnim sparivanjem baza ve} aktivno{}u proteina koji prepoznaju specifi~ni ciljni slijed nukleotida.
212
Poglavlje 5
Prototip rekombinacije u specifi~nom mjestu dobiven je istraìvanjem bakteriofaga l. Kad bakteriofag l inficira E. coli, on se moè ili replicirati uzrokuju}i lizu stanica ili integrirati u bakterijski kromosom formiraju}i profag koji se tada odràva kao dio genoma E. coli (lizogeni ciklus) (slika 5-39). U povoljnim okolnostima integracija DNA moè biti reverzna, {to kao rezultat ima izrezivanje DNA bakterofaga l i inicijaciju liti~ke virusne replikacije. I integracija i ekscizija DNA bakteriofaga l uklju~uje mjesno-specifi~nu rekombinaciju izme|u sljedova DNA virusa i stanice doma}ina.
bakteriofag l
E. coli DNA
l DNA ubrizguje se u stanicu doma}ina i formira kru`nu molekulu
replikacija l DNA i sinteza virusnih proteina
rekombinacija l DNA s kromosomom E. coli
pakiranje DNA u nove virusne ~estice
profag
liza stanice osloba|anje virusnih ~estica
stanica sa profagom normalno se dijeli
Infekcija E. coli zapo~inje injektiranjem l DNA koja zatim zadobija kru`ni oblik unutar stanice doma}ina. U liti~koj infekciji l DNA replicira se i upravlja sintezom virusnih proteina. Virusna DNA se zatim pakira u virusne ~estice koje se osloba|aju lizom stanice. U lizogenoj infekciji l DNA se rekombinira s genomom doma}ina formiraju}i profag koji je integriran u kromosom E. coli. Integrirana l DNA ne upravlja sintezom virusnih ~estica ve} se umjesto toga replicira zajedno s ostatkom bakterijskoga genoma.
Slika 5-39. Liti~ki i lizogeni ciklus bakteriofaga l.
liti~ki ciklus
lizogeni ciklus
Replikacija, odràvanje i preslagivanje genomske DNA DNA E. coli i DNA bakteriofaga l rekombiniraju se u specifi~nom mjestu zvanom mjesto pri~vr{}ivanja (engl. attachment site, att). Stoga, integracija DNA bakteriofaga l uklju~uje rekombinaciju izme|u att mjesta faga (attP) dugog otprilike 240 nukleotida i att mjesta bakterije (attB) dugog otprilike 25 nukleotida (slika 5-40). Proces je posredovan proteinom bakteriofaga l zvanim integraza (Int) koji se specifi~no veè i za attP i za attB slijed. Int se po~etno veè za attP stvaraju}i kompleks u kojem je DNA att mjesta faga omotana oko vi{estrukih kopija Int proteina. Int-attP kompleks se zatim veè za attB poravnavaju}i att mjesta bakteriofaga l i bakterije. Nakon toga
213
l DNA
attP attB
E. coli DNA Int 5' G C attP C G A 3' Int 5' G C attB C G A 3' Int integraza stvara lomove s jednolan~anim (ljepljivim) krajevima u specifi~nim mjestima unutar jezgrenoga podru~ja homologne regije A A A A T G A T T 5' T T T T T A C T A A Int 3'
1 1
3' T T A T A T A T T A T A A T C T A A integraza G A T T 5'
l profag u kromosomu E. coli
G C G A
T A
T A
T A A A T
T A
A T
C G
T A T
A T
Slika 5-40. Integracija l DNA putem mjesno-specifi~ne rekombinacije.

Integracija nastaje kao rezultat rekombinacije izme|u specifi~nih slijedova u bakteriofagu l i genomu E. coli, nazvanih attP i attB. Proces je kataliziran proteinom (integraza) kodiranim virusnim genomom, koji prepoznaje i attP i attB slijed.
G C
T A
T A
T A
A T
C G
A T
izmjena lanaca i ligacija
G C
T A
T A
T A attP A A T
T A
A T
C T G A
A A T attB T
C G A
Slika 5-41. Mehanizam mjesno-specifi~ne rekombinacije bakteriofaga l.

Mjesno specifi~na rekombinacija odvija se unutar 15 nukleotida dugoga homolognoga jezgrenoga slijeda zajedni~kog i attP i attB slijedu. Integraza (Int) kida u specifi~nom mjestu unutar tog slijeda stvaraju}i (ljepljive) jednolan~ane DNA repove. Ona zatim katalizira izmjenu lanaca i ligaciju, {to rezultira rekombinacijom izme|u attP i attB slijeda i integracijom l DNA.
G C
T A
T A
T A attB
T A
T A
A T
T A
A T
C T G A
A A T attP T
C G A
214
Poglavlje 5
N N
varijabilno podru~je N konstantno podru~je N
S
SS SS
laki lanac te{ki lanac C C
Slika 5-42. Struktura imunoglobulina.

Imunoglobulini su gra|eni od dvaju te{kih i dvaju lakih lanaca spojena disulfidnim vezama. I te{ki i laki lanci imaju varijabilna i konstantna podru~ja.
fag i bakterija izmjenjuju lance DNA ova se izmjena doga|a izme|u 15 nukleotida zajedni~kih za attP i attB mjesto (slika 5-41). Int protein reè unutar ovog slijeda od 15 nukleotida u attB i attP mjestu na taj na~in da ostavlja nazubljene (ljepljive) krajeve, zatim katalizira izmjenu lanaca i povezuje prekinute lance ~ime se DNA bakteriofaga integrira u kromosom E. coli. Protein Int tako|er sudjeluje u izrezivanju profaga l, {to je u osnovi obrnuto od procesa integracije. Mjesno-specifi~na rekombinacija va`na je ne samo u interakciji virusa, poput bakteriofaga l, sa stanicama doma}ina, ve} i u programiranim preslagivanjima gena unutar stani~nih genoma. Kod kralje{njaka je mjesno-specifi~na rekombinacija kriti~na za razvoj imunosustava koji prepoznaje strane tvari koje u|u u tijelo (antigene) i {titi od infekcija. Dvije su glavne skupine imunoodgovora posredovane B odnosno T limfocitima. B limfociti izlu~uju protutijela (imunoglobulini) koja reagiraju s topljivim antigenima dok T limfociti izlu~uju proteine stani~ne povr{ine (receptori T stanica) koji reagiraju s antigenima prisutnim na povr{ini drugih stanica. Klju~na osobina imunoglobulina i receptora T stanica jest njihova iznimno velika raznolikost koja omogu}uje prepoznavanje {irokoga spektra stranih antigena. Tako je primjerice svaka osoba sposobna stvoriti vi{e od 1011 razli~itih protutijela, {to je znatno vi{e od ukupnog broja gena u humanom genomu (30.000 40.000). Ta razli~ita imunoglobulinska protutijela (kao i receptori T stanica) nisu kodirana jezgrinim genima germinativnih stanica, ve} jedinstvenim limfocitnim genima koji se formiraju tijekom razvoja imunolo{kog sustava kao rezultat mjesno-specifi~ne rekombinacije izme|u razli~itih segmenata imunoglobulina i gena za receptore T stanica. Ulogu mjesno-specifi~ne rekombinacije u stvaranju imunoglobulinskih gena prvi je put, 1976. godine, prikazao Susumu Tonegawa. Imunoglobulini su gra|eni od dvaju identi~nih parova te{kog i lakog polipeptidnog lanca (slika 5-42). Oba lanca sadràvaju konstantno podru~je na C kraju te varijabilno podru~je na N kraju. Varijabilno podru~je, koje ima razli~it slijed aminokiselina u razli~itim imunoglobulinskim molekulama, odgovorno je za vezanje antigena i upravo ta raznolikost aminokiselinskoga slijeda varijabilnog podru~ja omogu}uje razli~itim protutijelima da prepoznaju specifi~ne antigene. Premda je svaka osoba u stanju stvoriti {irok spektar razli~itih protutijela, svaki B limfocit stvara samo jedan tip protutijela. S. Tonegawa otkrio je da je svako protutijelo kodirano jedinstvenim genom stvorenim mjesno-specifi~nom rekombinacijom tijekom razvoja B limfocita. Preslagivanje gena stvara razli~ite imunoglobulinske gene u razli~itim B limfocitima tako da je populacija od otprilike 1012 B limfocita ~ovje~jega tijela sposobna stvoriti protutijela protiv {irokog spektra stranih antigena. Geni koji kodiraju lake lance imunoglobulina gra|eni su od tri podru~ja: V podru~ja koje kodira 9596 N-terminalnih aminokiselina varijabilnog podru~ja polipeptida, J podru~je (engl. joining region) koje kodira 1214 C terminalnih aminokiselina varijabilnog podru~ja proteina, i C podru~je koje kodira konstantnu regiju polipeptida (slika 5-43). Glavna skupina gena lakoga lanca u mi{eva formira se kombinacijom otprilike 250 V podru~ja i 4 J podru~ja s jednim C podru~jem. Tijekom razvoja limfocita mjesno-specifi~na rekombinacija dovodi do preslagivanja gena jedno V podru~je rekombinira s jednim J podru~jem stvaraju}i funkcionalni gen lakoga lanca. Razli~ita V i J podru~ja rekombiniraju u razli~itim B limfocitima tako da mogu}e kombiniranje 250 V podru~ja s 4 J podru~ja moè stvoriti otprilike 1.000 (4 250) jedinstvenih lakih lanaca. Geni te{koga lanca sadràvaju ~etvrto podru~je poznato kao D podru~je (engl. diversity) koje kodira aminokiseline smje{tene izme|u V i J podru~ja
215
DNA germinativne linije V1 V2 V3 V250 20 kb J1 J2 J3 J4 C
mjesno-specifi~na rekombinacija
preslagivanje gena
presloèna DNA u B limfocitima
V1
V2
V3
J3
J4
transkripcija primarni transkript V3 J3 prekrajanje imunoglobulinska mRNA V3 J3 C J4 C
Slika 5-43. Preslagivanje imunoglobulinskih gena za lake lance.

Svaki gen za laki lanac (prikazan je mi{ji laki lanac) sastoji se od konstantnoga podru~ja (C), spajaju}ega podru~ja (J) i varijabilnoga podru~ja (V). Postoji otprilike 250 razli~itih varijabilnih podru~ja koja su u ger minativnim stanicama odvojena od J i C sa otprilike 20 kb. Tijekom razvoja B limfocita mjesno specifi~na rekombinacija spaja jedno od V podru~ja s jednim od ~etiri J podru~ja. Ovo preslagivanje aktivira transkripciju {to rezultira stvaranjem primar nog transkripta koji sadràva presloèno VJ podru~je zajedno s preostalim J podru~jima i C podru~jem. Preostala neuporabljena J podru~ja i introni izme|u J i C se nakon toga uklanjaju prekrajanjem stvaraju}i funkcionalnu mRNA.
(slika 5-44). Stvaranje funkcionalnoga gena te{koga lanca zahtijeva dva rekombinacijska doga|aja. D podru~je se prvo rekombinira s J podru~jem, a zatim se V podru~je rekombinira s presloènim DJ podru~jem. Kod mi{eva postoji oko 500 V podru~ja te{kih lanaca, 12 D podru~ja i 4 J podru~ja, tako da ukupni broj te{kih lanaca koji moè biti stvoren rekombinacijskim doga|ajima iznosi 24.000 (500 12 4). Kombiniranje otprilike 1.000 razli~itih lakih lanaca i 24.000 te{kih lanaca stvorenih mjesno-specifi~nom rekombinacijom moè proizvesti oko 2 107 razli~itih imunoglobulinskih molekula. Raznolikost je nadalje pove}ana stoga {to spajanje segmenata imunoglobulinskih gena ~esto uklju~uje gubitak
DNA germinativne linije V1 V500 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9
D10 D11
D12 J1 J2 J3 J4 C
spajanje D i J podru~ja
V1
V500
D1 D2 D3 D4 D5 J2
J3
J4
spajanje V i DJ segmenta
presloèna DNA u B limfocitima V1 V25 D5 J2 J3 J4 transkripcija primarni transkript C
Slika 5-44. Preslagivanje gena za te{ke lance imunoglobulina.

Geni te{kih lanaca uz V, J i C sadràvaju i D podru~ja. Prvo se spajaju D i J podru~je. Zatim se V podru~je spaja s presloènim DJ segmentom. Introni izme|u J i C uklanjaju se prekrajanjem i nastaje mRNA te{koga lanca.
V25 D5 J2
J3
J4 prekrajanje
mRNA
V25 D5 J2
216
Poglavlje 5
Slika 5-45. Struktura receptora T stanica.

a-lanac b-lanac
Receptori T stanica gra|eni su od dvaju polipeptidnih lanaca (a i b) koji se proteù kroz citoplazmatsku membranu, a me|usobno su spojeni disulfidnom vezom. I a i b lanci gra|eni su od varijabilnih i konstantnih podru~ja.
varijabilno podru~je
konstantno podru~je
citosol
citoplazmatska membrana
ili dodatak od jednoga do nekoliko nukleotida. Mutacije proiza{le zbog tih delecija i insercija pove}avaju raznolikost varijabilnih podru~ja imunoglobulina za oko 100 puta, {to odgovara formiranju otprilike 105 razli~itih lakih lanaca i 2 106 te{kih lanaca koji se zatim mogu kombinirati stvaraju}i vi{e od 1011 razli~itih protutijela. Nakon formiranja presloènih imunoglobulinskih gena moè se posti}i jo{ ve}a raznolikost protutijela procesom somatske hipermutacije {to rezultira u~estalim mutacijama u varijabilnim podru~jima gena za laki i te{ki lanac. Sli~no tome, receptori T limfocita gra|eni su od dvaju lanaca (nazvanih a i b), a svaki od njih sadràva varijabilna i konstantna podru~ja (slika 545). Geni koji kodiraju ove polipeptide stvaraju se rekombinacijom izme|u V i J podru~ja (a-lanac) ili izme|u V, D i J podru~ja (b-lanac), analogno stvaranju imunoglobulinskih gena. Mjesno-specifi~na rekombinacija izme|u tih razli~itih podru~ja DNA, a tako|er i mutacije koje su se dogodile tijekom rekombinacije, stvaraju stupanj raznolikosti receptora T stanica sli~an onome imunoglobulina. No, receptori T stanica razlikuju se od imunoglobulina u tome {to nisu podvrgnuti uno{enju daljnje raznolikosti somatskom hipermutacijom. VDJ rekombinacija posredovana je kompleksom koji ~ine dva proteina, RAG1 i RAG2, specifi~no eksprimirana u limfocitima. RAG proteini prepoznaju takozvane sljedove rekombinacijskog signala (RS) smje{tene uz kodiraju}e sljedove svakoga genskog podru~ja i poti~u preslagivanje DNA uvo|enjem dvolan~anog loma izme|u RS slijeda i kodiraju}eg slijeda (slika 546). Kodiraju}i krajevi genskih podru~ja zatim se spajaju stvaraju}i presloène imunoglobuline ili gene za receptore T stanica, pri ~emu se vrlo ~esto doga|aju delecije ili adicije nukleotida. Zanimljivo je da je RAG1 usko srodan enzimima koji kataliziraju transpoziciju DNA i integraciju retrovirusa {to }e biti obja{njeno dalje u ovom poglavlju.
Transpozicija posredovana DNA intermedijarima

Mjesno-specifi~na rekombinacija odvija se izme|u dva specifi~na slijeda koji posjeduju barem malo homologije. Za razliku od toga, transpozicija uklju~uje premje{tanje sljedova unutar genoma i ne zahtijeva homologiju nukleotidnih sljedova. Elementi koji se premje{taju transpozicijom, poput onih koje je prva opisala McClintock, zovu se pokretni elementi (engl. transposable elements) ili transpozoni. Oni se dijele u dvije op}e skupine ovisno o tome premje{taju li se putem DNA ili RNA intermedijara. Prvi detaljno opisani transpozoni koji se premje{taju putem DNA intermedijara na|eni su u bakterijama (slika 5-47). Najjednostavniji od tih elemenata su insercijski sljedovi ~ija se veli~ina kre}e u rasponu od oko 800 do 2.000 nukleotida. Insercijski sljedovi sadràvaju samo gen za enzim uklju~en u transpoziciju (transpozaza) ome|en kratkim obrnutim ponavljanjima koja predstavljaju mjesta aktivnosti same transpozaze. Kompleksni transpozoni gra|eni su od dvaju insercijskih sljedova koji ome|uju druge gene i premje{taju se kao jedna cjelina. Insercijski sljedovi premje{taju se s jednog na drugo mjesto na kromosomu a da se pri tome ne repliciraju (slika 5-48). Transpozaza kida ciljnu DNA tako da napravi nazubljene krajeve, te kida na krajevima obrnutih ponavljaju}ih sljedova transpozona. Dok je aktivnost transpozaze specifi~na na
217
RS
RS
Slika 5-46. VDJ rekombinacija.

Kodiraju}i dijelovi imunoglobulinskih gena i gena za receptore T stanica (primjerice V i D podru~je) ome|eni su kratkim sljedovima rekombinacijskih signala (RS) koji se nalaze u suprotnim orijentacijama na 5' i 3' krajevima kodiraju}ih sljedova. RS sljedove prepoznaje kompleks rekombinacijskih proteina specifi~nih za limfocite, RAG1 i RAG2, koji kidaju DNA izme|u kodiraju}ih i RS sljedova. Prekinuti kodni lanci se zatim spajaju i tvore presloèni segment gena.
vezanje RAG1/RAG2
RAG2 RA
RS
RS
D kidanje
spajanje prekinutih kodnih lanaca
insercijski slijed (IS) abcd IR transpozaza kompleksni transpozon IS IS dcba IR
Slika 5-47. Bakterijski transpozoni.

Insercijski sljedovi (IS) dugi su od 800 do 2.000 nukleotida i sadràvaju gene za transpozazu ome|enu obrnutim ponavljanjima (IR) dugim oko 20 nukleotida. Kompleksni transpozoni gra|eni su od dvaju insercijskih sljedova koji ome|uju druge gene i obi~no su dugi 5 do 20 kb.
IR
IR
bakterijski gen
IR
IR
transpozaza
transpozaza
218
Poglavlje 5
Preslagivanje imunoglobulinskih gena

Evidence for Somatic Rearrangement of Immunoglobulin Genes Coding for Variable and Constant Regions Nobumichi Hozumi and Susumu Tonegawa
Basel Institute for Immunology, Basel, Switzerland Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Volume 73, 1976, pages 36283632 stanica plazmocitoma. Uporabljene su dvije sonde koje odgovaraju kompletnoj imunoglobulinskoj mRNA molekuli ili 3' kraju mRNA gra|enom samo od slijeda za konstantno podru~je. Zna~ajan rezultat bilo je otkri}e u potpunosti razli~itih obrazaca za sljedove varijabilnog i konstantnog podru~ja izme|u embrionalne DNA i DNA izolirane iz plazmocitoma (vidi sliku). U embrionalnoj DNA kompletna sonda hibridizira s dva BamHI ulomka od 8,6 i 5,6 kb. Samo 8,6 kb ulomak hibridizira s 3' sondom, {to sugerira da taj ulomak sadràva slijed konstantnog podru~ja, a da ulomak od 5,6 kb sadràva slijed varijabilnog podru~ja. U potpunosti suprotno tomu, obje sonde hibridizirale
Kontekst
Sposobnost imunolo{kog sustava kralje`njaka da prepoznaju beskona~no mno{tvo stranih molekula (antigena) upu}uje na to da limfociti mogu stvoriti odgovaraju}i {iroki spektar protutijela. Kako je raznolikost protutijela osnova imunolo{kog prepoznavanja, razumijevanje mehanizma s pomo}u kojega je na izgled neograni~en broj imunoglobulina kodiran genomskom DNA predstavlja sredi{nju temu imunologije. Prije eksperimenata koje su proveli Hozumi i Tonegawa, odre|ivanje aminokiselinskog slijeda velikog broja imunoglobulinskih molekula pokazalo je da su laki i te{ki laki lanac gra|eni od zasebnih varijabilnih i konstantnih podru~ja. Geneti~ka su ispitivanja nadalje pokazala da mi{evi naslje|uju samo jednu kopiju gena za konstantno podru~je. Ovo je opaànje sugeriralo da su imunoglobulini kodirani vi{estrukim genima za varijabilno podru~je koji se mogu zdruìti s jednim genom konstantnog podru~ja. Hozumijevo i Tonegawino otkri}e preslagivanja imunoglobulinskih gena pruìlo je pr vu izravnu eksperimentalnu potporu ove hipoteze i poloìlo temelje za razumijevanje molekular ne osnove razli~itosti protutijela.
temelju uzorka kidanja DNA s restrikcijskim endonukleazama. DNA embrija i plazmocitoma razgra|ena je restrikcijskom endonukleazom BamHI, a ulomci DNA razli~itih veli~ina razdvojeni su elektroforezom u agaroznom gelu. Zatim su iz gela izrezana podru~ja s odgovaraju}im fragmentima, a iz njih izolirana DNA hibridizirana je s radioaktivno obiljeènim sondama koje su dobivene iz imunoglobulinskih mRNA molekula izoliranih iz
250 odbrojavanje po minuti (CPM-engl. counts per minute)
DNA embrij embrij plazmocitom plazmocitom 8,6 kb
RNA cijela 3'-polovica cijela 3'-polovica
3,4 kb
200
150
5,6 kb
100
50
Eksperimenti
Hozumi i Tonegawa eksperimentalno su ispitali mogu}nost da se geni koji kodiraju varijabilno i konstantno podru~je imunoglobulina spajaju na razini DNA tijekom razvoja limfocita. Usporedili su organizaciju sljedova varijabilnih i konstantnih podru~ja u DNA izoliranoj iz mi{jih embrija i stanica mi{jeg plazmocitoma (tumor B limfocita koji stvara jednu vrstu imunoglobulina) na
0 5 gornji dio 10 migracija (cm) smjer elektroforoze 15 donji dio
Gel-elektroforeza DNA izolirane iz embrija i plazmocitoma te razgra|ene s BamHI i hibridizirane sa sondama koje odgovaraju ili cijeloj ili 3' podru~ju plazmocitomske mRNA. Podatci su prikazani kao radioaktivnost detektirana u hibridnim molekulama s DNA izoliranom iz izrezanih podru~ja gela s odgovaraju}im fragmentima.
219
Utjecaj
Rezultati koje su dobili Hozumi i Tonegawa, zasnovani na relativno indirektnom pristupu mapiranja restrikcijskim endonukleazama potvr|eni su i pro{ireni molekular nim kloniranjem i sekvenciranjem imunoglobulinskih gena. Takva istraìvanja su danas nedvosmisleno utvrdila da se ovi geni stvaraju mjesno-specifi~nom rekom-
Susumu Tonegawa
osnovu za razumijevanje na koji na~in imunolo{ki sustav moè prepoznati i odgovoriti na doslovno neograni~en raspon stranih supstanci.
obrnutim ponavljanjima transpozona, njezina specifi~nost za sljedove unutar genoma (ciljne sljedove) puno je manja tako da katalizira premje{tanje transpozona nasumce unutar cjelokupnoga genoma. Nakon kidanja transpozona i ciljne DNA, transpozaza spaja ljepljive krajeve ciljane DNA s pokretnim elementom. Pukotina koja nastaje u ciljanoj DNA popravlja se sin-
transpozon integriran u donorsko mjesto IR IR
ciljno mjesto
A CG T A T GCA T
transpozaza kida na krajevima invertnih ponavljanja transpozona uvode}i u ciljnu DNA rezove s jednolan~anim (ljepljivim) krajevima
A CG T A T GCA T
Slika 5-48. Transpozicija insercijskih sljedova.

Jednostavna transpozicija ne uklju~uje replikaciju transpozonske DNA. Transpozaza kida na oba kraja transpozona i uvodi rezove s jednolan~anim (ljepljivim) krajevima u ciljnu DNA. Jednolan~ani krajevi ciljne DNA se zatim spajaju s transpozonom, a pukotine u ciljnoj DNA nastale djelovanjem transpozaze se popravljaju. Rezultat toga je stvaranje kratkih izravnih ponavljanja ciljnog mjesta zahva}ene DNA (dugih 5 do 10 nukleotida) koja ome|uju integrirani transpozon.
jednolan~ani krajevi ciljne DNA pridruèni transpozonu

ACG TA
T GCA T
popravljanje pukotina sintezom DNA

A C G TA T GCA T A C G TA T GCA T
direktna ponavljanja slijeda ciljne DNA
Donna Coveney/MIT
su sa samo jednim 3,4 kb dugim fragmentom plazmocitomske DNA. Interpretacija ovih rezultata bila je da su se sljedovi varijabilnog i konstantnog podru~ja koji su u embrionalnoj DNA odvojeni presloìli tijekom razvoja limfocita daju}i jedan imunoglobulinski gen.
binacijom zasebnih sljedova DNA B limfocita. Sli~no preslagivanje DNA u T limfocitima odgovorno je za stvaranje gena koji kodiraju receptore T stanica. Stoga su mjesno-specifi~na rekombinacija i programirano preslagivanje gena osnova za razvoj imunolo{kog sustava. Daljnja istraìvanja pokazala su da varijabilna podru~ja imunoglobulina i receptora T stanica nastaju preslagivanjem dvaju od tri razli~ita segmenta DNA. Sposobnost rekombinacije ovih segmenata, zajedno s visokom u~estalo{}u mutacija na mjestu rekombinacije, ve}im su dijelom odgovor ni za razli~itost imunoglobulina i receptora T stanica. Otkri}e preslagivanja imunoglobulinskih gena zbog toga predstavlja
220
Poglavlje 5
tezom DNA nakon ~ega slijedi ligacija s drugim lancem transpozona. Rezultat ovog procesa je kratko izravno ponavljanje ciljnoga slijeda s obiju strana integriranoga pokretnog elementa {to je karakteristi~no za integraciju transpozona. Ovaj mehanizam dovodi do premje{tanja transpozona s jednog na drugo mjesto kromosoma. Drugi tipovi transpozona premje{taju se znatno sloènijim mehanizmima kojima se istodobno s premje{tanjem na novo mjesto unutar genoma i repliciraju. Kao rezultat takvoga premje{tanja jedna kopija transpozona bit }e integrirana na novo mjesto u genomu, dok }e druga kopija ostati na svom izvornom poloàju. Transpozoni koji se premje{taju putem DNA intermedijara prisutni su u eukariotskim genomima kao i u bakterijskim. Tako primjerice ljudski genom sadràva otprilike 300.000 DNA transpozona koji ~ine oko 3% ukupne ljudske DNA. Pokretni elementi koje je McClintock opisala u kukuruzu premje{taju se nereplikativnim mehanizmom kao {to to ~ini ve}ina pokretnih elemenata i u drugim biljkama i ìvotinjama. Poput bakterijskih transpozona, ovi se elementi premje{taju na razli~ita ciljna mjesta uzdu` genoma. Takvo premje{tanje na nespecifi~na mjesta u genomu najvjerojatnije nije korisno za stanice u kojima se odvija, ali zbog preslagivanja DNA sigurno igra veliku ulogu u evoluciji. Nasuprot tomu, u genomima kvasaca i protozoa transpozicija s pomo}u replikativnog mehanizma odgovorna je za programirana preslagivanja DNA koja reguliraju ekspresiju gena. U tom slu~aju transpozicija zapo~inje djelovanjem nukleaze koja kida specifi~no ciljano mjesto u koje se zatim ubacuje kopija pokretnog elementa. Prema tome, pokretni se elementi ne premje{taju samo na nespecifi~na mjesta uzdu` genoma, ve} mogu sudjelovati i u specifi~nim preslagivanjima gena koja rezultiraju programiranom promjenom ekspresije.
Transpozicija posredovana RNA intermedijarima

Ve}ina pokretnih elemenata u eukariotskim stanicama su retrotranspozoni koji se premje{taju reverznom transkripcijom RNA intermedijara. U ~ovjeka postoji oko 3 milijuna kopija retrotranspozona koji ~ine oko 40% ukupnoga genoma (vidi tablicu 4.l). Mehanizam transpozicije ovih elemenata sli~an je replikaciji retrovirusa. Stoga je mehanizam replikacije retrovirusa uzet kao prototip za prou~avanje ove skupine pokretnih DNA sljedova. Retrovirusi sadràvaju RNA-genome u svojim virusnim ~esticama, ali se repliciraju sintezom DNA-provirusa koji se integrira u kromosomsku DNA inficirane stanice (vidi sliku 3-13). DNA kopija virusne RNA sintetizira se virusnim enzimom zvanim reverzna transkriptaza. Reverznom transkripcijom nastaje molekula DNA koja ima izravna ponavljanja od nekoliko stotina nukleotida na oba svoja kraja (slika 5-49). Ovi ponavljaju}i sljedovi, nazvani duga terminalna ponavljanja (engl. long terminal repeats) ili LTR nastaju duplikacijom onih mjesta virusne RNA za koja se veù po~etnice kako bi inicirale sintezu DNA. LTR sljedovi imaju prema tome sredi{nju ulogu u reverznoj transkripciji, a uz to su uklju~eni u integraciju i naknadnu transkripciju provirusne DNA.
Slika 5-49. Organizacija DNA retrovirusa.

Integrirana DNA provirusa ome|ena je dugim ter minalnim ponavljanjima (LTR) koja predstavljaju direktna ponavljanja gra|ena od nekoliko stotina nukleotida. Virusni geni, uklju~uju}i gene za reverznu transkriptazu, integrazu i struktur ne proteine virusnih ~estica, smje{teni su izme|u LTR. Integrirani provirus ome|en je kratkim direktnim ponavljanjima DNA doma}ina.
LTR
LTR
DNA doma}ina
virusni geni 9 kb provirus
DNA doma}ina
221
tRNA po~etnica virusna RNA 5' R U5 PBS U3 reverzna transkriptaza vr{i produljenje po~etnice ka 5' kraju RNA-kalupa R U5 PBS U3 R RNaza H razgra|uje RNA lanac RNA-DNA dupleksa R 3'
Slika 5-50. Stvaranje LTRa za vrijeme reverzne transkripcije.

LTR se sastoje od tri elementa: kratkog ponavljaju}eg slijeda (R engl. repeat) od oko 20 nukleotida koji je prisutan na oba kraja virusne RNA; slijeda jedinstvenog za 5' kraj virusne RNA (U5); i slijeda jedinstvenog za 3' kraj virusne RNA (U3). Ponavljanja ovih sljedova nastaju za vrijeme sinteze DNA jer reverzna transkriptaza ska~e dva puta izme|u krajeva svog kalupa. Sinteza se inicira kori{tenjem tRNA po~etnice vezane za mjesto vezanja po~etnice (PBS engl. primer binding site) smje{teno uz U5 na 5' kraju virusne DNA. Polimeraza kopira R, a RNA lanac RNA-DNA hibrida tada se razgradi RNazom H. Polimeraza zatim ska~e na 3' kraj virusne RNA kako bi sintetizirala kompletni lanac DNA komplementaran RNA kalupu. Polimeraza ska~e opet tijekom sinteze drugoga lanca DNA koji se tako|er inicira po~etnicom vezanom uz 5' kraj njegovog kalupa. Rezultat tih skokova je stvaranje LTR koji sadràvaju U3-R-U5 sljedove.
R U5 PBS reverzna transkriptaza ska~e putem hibridizacije U3 DNA s R slijedom na 3' kraju RNA R
R U5
PBS
U3 R reverzna transkriptaza produljuje po~etnicu RNA-DNA dupleks razgra|en RNazom H U3 R U5
PBS
RNA ulomak sluì kao po~etnica za sintezu drugoga lanca DNA U3 R U5
PBS
U3 lanci DNA produljeni RNA molekule su razgra|ene U3 U3
U5
PBS
RNaza H razgra|uje tRNA
R R
U5 U5 PBS
PBS
U3 U3 drugi skok hibridizacijom PBS slijeda
R R
U5 U5 PBS
PBS U3 R U5 PBS zavr{etak sinteze DNA
U3
U5
U3
R LTR
U5 PBS
U3
R LTR
U5
Kao sve DNA-polimeraze, reverzna transkriptaza zahtijeva prisutnost po~etnica, a to su u slu~aju retrovirusa molekule tRNA vezane za specifi~na mjesta (mjesta vezanja po~etnica) blizu 5' kraja virusne RNA (slika 5-50). Budu}i da se sinteza DNA odvija u 5'3' smjeru, samo se mali dio DNA sin-
222
Poglavlje 5
tetizira prije nego {to reverzna transkriptaza do|e do kraja svog kalupa. Nastavak sinteze DNA nakon toga ovisi o sposobnosti reverzne transkriptaze da se premjesti na 3' kraj RNA-kalupa. To se postiè putem RNaza H aktivnosti reverzne transkriptaze koja razgra|uje RNA-lanac DNA-RNA hibrida. Kao rezultat toga novosintetizirana DNA prevodi se u jednolan~anu molekulu koja moè hibridizirati s kratkim ponavljaju}im slijedom prisutnim i na 5' i na 3' kraju virusne RNA. Sinteza DNA se nakon toga moè nastaviti, a kao produkt dobit }e se jednolan~ana DNA komplementarna virusnoj RNA. Sinteza suprotnog lanca DNA zapo~ne fragmentom virusne RNA koji djeluje kao po~etnica na mjestu uz 3' kraj DNA-kalupa. To opet rezultira kratkim fragmentom DNA koji uklju~uje mjesto vezanja po~etnice kopirano s tRNA koja je kori{tena kao inicijalna po~etnica za reverznu transkripciju. Nukleotidni slijed tRNA koji veè po~etnicu zatim se degradira djelovanjem RNaze H ostavljaju}i ljepljivi lanac DNA koji se opet premje{ta i spari s komplementarnim slijedom na drugom kraju kalupa. Nakon toga sinteza DNA moè se nastaviti pri ~emu na kraju nastaje linearna DNA koja sadràva LTR sljedove na oba kraja. Linearna virusna DNA integrira se u kromosom stanice doma}ina mehanizmom koji podsje}a na integraciju pokretnih elemenata DNA. Integracija je katalizirana virusnom integrazom i odvija se u mnogo razli~itih ciljnih sljedova unutar stani~ne DNA. Integraza kida dvije baze na krajevima virusne DNA i stvara nazubljene krajeve u ciljnom mjestu stani~ne DNA. Ljepljivi krajevi stani~ne DNA zatim se spajaju s krajevima virusne DNA, a nastala pukotina popunjava se sintezom DNA. Integrirani provirus je prema tome ome|en izravnim ponavljanjima sljedova stani~ne DNA, sli~no ponavljanjima koja ome|uju integrirane DNA-transpozone. @ivotni ciklus virusa nastavlja se transkripcijom integriranog provirusa ~ime se stvara virusna genomska RNA te molekule mRNA koje upravljaju sintezom virusnih proteina (uklju~uju}i reverznu transkriptazu i integrazu). Genomska RNA zatim se pakira u virusne ~estice koje se osloba|aju iz stanice doma}ina. Tako nastale virusne ~estice mogu inficirati nove stanice zapo~inju}i novi krug sinteze DNA i integracije. Sveukupni efekt moè se promatrati kao premje{tanje provirusa s jednoga na drugo mjesto u kromosomu putem sinteze i reverzne transkripcije RNA intermedijara. Drugi retrotranspozoni razlikuju se od retrovirusa po tome {to se ne pakiraju u infektivne ~estice i zato se ne mogu {iriti s jedne stanice na drugu. Ipak, ti se retrotranspozoni mogu premje{tati na nova mjesta u kromosomima unutar jedne stanice mehanizmom u osnovi sli~nim onom kojim se rep liciraju retrovirusi. Neki retrotranspozoni (zvani retrovirusima-sli~ni elementi ili LTR retrotranspozoni) strukturno su sli~ni retrovirusima (slika 5-51). Retrotranspozoni ovog tipa ~ine oko 8% ljudskoga genoma. Oni sadràvaju LTR sljedove
Ty1 kvasac 330 bp sljedovi za kodiranje proteina 5,9 kb 330 bp
Slika 5-51. Struktura LTR retrotranspozona.

Pokretni element Ty1 kvasca ima istu organizaciju kao i retrovirusi. Sljedovi za kodiranje proteina, uklju~uju}i gene za reverznu transkriptazu i integrazu, ome|eni su LTR slijedovima (nazvanim d elementi) dugim oko 330 parova baza. Integrirani transpozon ome|en je kratkim izravnim ponavljanjima ciljane DNA.
223
na oba kraja; kodiraju reverznu transkriptazu i integrazu i premje{taju se (poput retrovirusa) transkripcijom u molekulu RNA, sintezom nove DNA kopije s RNA-kalupa djelovanjem reverzne transkriptaze i integracijom u stani~nu DNA. Retrotranspozoni bez LTR sljedova razlikuju se od retrovirusa po tome {to ne sadràvaju LTR sljedove, premda kodiraju svoju vlastitu reverznu transkriptazu. Glavnu skupinu ovih retrotranspozona u sisavaca ~ine visokoponavljaju}i dugi raspr{eni elementi (engl. highly repetitive long interspersed elements LINE) koji se ponavljaju oko 850.000 puta i ~ine oko 21% genomske DNA (vidi 4. poglavlje). Cijeli LINE element dug je 6 do 7 kb, iako je ve}ina ~lanova ove obitelji skra}ena na 5' kraju (slika 5-52). Na svom 3' kraju LINE imaju slijed bogat adeninom za koji se smatra da je nastao reverznom transkripcijom poli A repova koji su dodani mRNA molekulama nakon transkripcije (vidi 6. poglavlje). Kao i drugi pokretni elementi, LINE su ome|eni kratkim direktnim ponavljanjima ciljnih DNA mjesta, {to pokazuje da integracija uklju~uje stvaranje nazubljenih krajeva i popravak sintezom. Kako LINE ne sadràvaju LTR sljedove, mehanizam njihove reverzne transkripcije i naknadne integracije u kromosomsku DNA razlikuje se od onog koji koriste retrovirusi i retrotranspozoni koji sadràvaju LTR sljedove. Konkretno, reverzna transkripcija kao po~etnicu koristi prekinute krajeve kromosomske DNA koju je pokidala nukleaza (kodirana retrotranspozonom) na ciljnim mjestima za integraciju retrotranspozona (slika 5-53). Reverzna transkripcija tada zapo~inje unutar poli A slijeda na 3' kraju transpozonske RNA i nastavlja se du` molekule. Suprotni lanac DNA sintetizira se kori{tenjem drugoga prekinutog kraja ciljne DNA kao po~etnice, {to rezultira istovremenom sintezom i integracijom retrotranspozonske DNA. Drugi sljedovi koji ne kodiraju svoju vlastitu reverznu transkriptazu tako|er se premje{taju putem RNA-intermedijara. Ovi elementi uklju~uju visokoponavljaju}e kratke raspr{ene elemente (engl. short interspersed elements SINE) koji dolaze u otprilike 1,5 milijuna kopija u genomu sisavaca (vidi 4. poglavlje). Glavna porodica ovih elemenata kod ljudi sastavljena je od Alu sljedova dugih otprilike 300 baza. Ovi su sljedovi na svom 3' kraju bogati adeninom i ome|eni su kratkim duplikacijama nukleotidnog slijeda ciljne DNA, pa su po tome strukturno sli~ni retrotranspozonima bez LTR sljedova (primjerice LINE). SINE nastaju reverznom transkripcijom malih molekula RNA uklju~uju}i molekule tRNA i male citoplazmatske molekule RNA uklju~ene u transport proteina. Kako SINE elementi vi{e ne kodiraju funkcionalne RNA produkte oni predstavljaju pseudogene koji nastaju RNA-posredovanom transpozicijom. Pseudogeni mnogih gena koji kodiraju proteine (nazvani dora|eni pseudogeni) tako|er nastaju na sli~an na~in reverznom transkripcijom glasni~kih molekula RNA (slika 5-54). Takvi doraLINE reverzna transkriptaza 6 kb
An
Slika 5-52. Struktura ljudskih LINE elemenata.

LINE elementi nemaju LTR sljedove ali tako|er kodiraju reverznu transkriptazu. Oni sadràvaju sljedove bogate s A (ozna~eni s An) na svom 3' kraju, za koje se smatra da nastaju reverznom transkripcijom poli-A repova dodanih na 3' kraj mRNA molekula. Poput drugih pokretnih elemenata, LINE elementi su ome|eni kratkim direktnim ponavljanjima ciljne DNA.
224
Poglavlje 5
Slika 5-53. Model reverzne transkripcije i integracije LINE elemenata.

Ciljna DNA pokidana je nukleazom kodiranom retrotranspozonom. Reverzna transkripcija, kori{tenjem prekinutih krajeva ciljne DNA kao po~etnica, zapo~inje sa poli-A repom na 3' kraju RNA retrotranspozona. Sinteza suprotnog lanca DNA retrotranspozona tako|er kao po~etnicu koristi drugi lanac DNA ciljnog mjesta.
5' 3' kidanje ciljane DNA ciljna DNA sa zarezima s jednolan~anim (ljepljivim) krajevima 5' 3' retrotranspozon 5' RNA
AAAAA
3' 5'
3' 5' 3'
ciljna DNA koristi se kao po~etnica za reverznu transkiptazu
5' 3'
TTTT AAAA A
3' 5'
sinteza lanca komplementarnoga RNA retrotranspozona razgradnja RNA RNazom H 3' 5'
TTTT
5' 3'
sinteza suprotnog lanca DNA
3' 5'
AAAA TTTT
5' 3'
|eni pseudogeni lako se prepoznaju ne samo zbog toga {to zavr{avaju slijedom nukleotida bogatim adeninom, ve} i stoga {to su introni prisutni u njihovim funkcionalno odgovaraju}im genima ovdje uklonjeni tijekom procesiranja glasni~kih molekula RNA. Smatra se da se transpozicija SINE elemenata i drugih dora|enih pseudogena odvija sli~no transpoziciji LINE elemenata. No, kako ovi elementi ne posjeduju gene za reverznu transkriptazu ili nukleazu, njihovo premje{tanje vjerojatno uklju~uje djelovanje reverzne transkriptaze i nukleaze kodiranih genima koji se nalaze negdje drugdje u genomu najvjerojatnije u drugim retrotranspozonima kao {to su LINE elementi. Premda visokoponavljaju}i SINE i LINE elementi ~ine zna~ajan udio genomske DNA, njihova transpozicija na nasumi~na mjesta u genomu po svemu sude}i nije od koristi za stanicu u kojoj su smje{teni. Kad se integriraju na nova ciljna mjesta ovi transpozoni induciraju mutacije koje su i poput onih izazvanih drugim ~imbenicima najvjerojatnije {tetne za stanicu. I zaista, mutacije nastale transpozicijom LINE i SINE elemenata dovedene su u vezu s nekim slu~ajevima hemofilije, mi{i}ne distrofije, karcinoma dojke i karcinoma debeloga crijeva. S druge strane, neke mutacije nastale premje{tanjem pokretnih elemenata mogu biti korisne na taj na~in {to pridonose evolucijskom razvoju vrste. Tako se primjerice prona{lo da neki retrotranspozoni u genomu sisavaca sadràvaju regulatorne sljedove koji kontroliraju ekspresiju susjednih gena. Osim {to imaju mutageni u~inak, retrotranspozoni su odigrali veliku ulogu u oblikovanju genoma stimuliranjem preslagivanja DNA. Tako primjerice preslagivanje kromosomske DNA moè nastati zbog rekombinacija LINE elemenata integriranih na razli~ita mjesta u genomu. Nadalje, sljedovi stani~ne DNA susjednih LINE elemenata u~estalo se prenose tijekom
225
egzon 1 gen 5' 3'
intron 1
egzon 2
intron 2
egzon 3 3 3' 5'
Slika 5-54. Stvaranje dora|enoga pseudogena.

Prikazani gen sadràva tri egzona razdvojena s dvama intronima. Introni su prekrajanjem uklonjeni iz primar nog transkripta i dodan je poli-A rep na 3' kraj mRNA. Reverzna transkripcija i integracija nakon toga stvaraju dora|eni pseudogen koji ne sadràva introne i ima slijed bogat adeninom na svom 3' kraju. Dora|eni pseudogen ome|en je kratkim direktnim ponavljanjima ciljne DNA stvorenim tijekom integracije.
transkripcija primarni transkript prekrajanje dodatak poli-A repa

AAAA
reverzna transkripcija integracija na novo kromosomsko mjesto dora|eni pseudogen

AAAA TTTT
transpozicije {to ima za posljedicu njihovo premje{tanje na nova mjesta u genomu. Kako se LINE elementi mogu integrirati u aktivne gene, s njima povezana transpozicija stani~nih sljedova DNA moè dovesti do stvaranja novih regulatornih i/ili kodiraju}ih sljedova {to direktno pridonosi evolucijskom razvoju novih gena. Velika ve}ina pokretnih elemenata u ljudskom genomu nije aktivna i svega je oko 100 kopija LINE elemenata koji jo{ uvijek sadràvaju sljedove koji kodiraju proteine potrebne za njihovu transpoziciju. Prema tome, svi ljudski DNA transpozoni i ve}ina retrotranspozona predstavlja evolucijske relikte, a ne trenutno funkcionalne elemente. Ipak, to nije slu~aj kod drugih vrsta uklju~uju}i Arabidopsis, C. elegans, vinsku mu{icu i mi{a koji imaju mnogo ve}u razinu postoje}e transpozonske aktivnosti. Tako su u genomu mi{a svi LTR retrotranspozoni, LINE i SINE elementi aktivni. Procjenjuje se da oko 10% svih mutacija u genomu mi{a nastaje aktivno{}u transpozona dok je svega 1 od 600 mutacija u genomu ~ovjeka uzrokovano transpozicijom. Ovakva dramati~na razlika u aktivnosti transpozona u genomu mi{a odnosno ~ovjeka intrigira i tek }e se razjasniti novim istraìvanjima.
Amplifikacija gena
Preslagivanja DNA o kojima se do sada govorilo mijenjaju poloàj sljedova DNA unutar genoma. Amplifikacija gena ili vi{estruko umnaànje gena moè se promatrati kao druga~iji tip izmjena strukture genoma ona, naime, pove}ava broj genskih kopija unutar stanice. Amplifikacija podrazumijeva opetovanu replikaciju DNA ~ime se proizvode vi{estruke kopije odre|enih podru~ja (slika 5-55). Vi{estruko umnoèni DNA slijed moè se na}i ili kao slobodna ekstrakromosomska molekula ili kao niz uzastopno ponavljaju}ih sljedova unutar kromosoma. U oba slu~aja dolazi do pove}ane ekspresije amplificiranoga gena zahvaljuju}i jednostavnoj ~injenici da je prisutno vi{e kopija dostupnih za transkripciju. U nekim slu~ajevima amplifikacija gena odgovorna je za razvojno programirana pove}anja ekspresije gena. Tipi~an je primjer amplifikacija ribosomnih RNA (rRNA) gena u oocitama vodozemaca. Oocite su iznimno velike stanice koje zahtijevaju pove}anu sintezu proteina. S obzirom na volumen, oocite vodozemaca su oko milijun puta ve}e od tipi~nih somatskih stanica pa moraju imati velike koli~ine proteina tijekom ranog razvoja. To zahtijeva pove}anu sintezu molekula rRNA {to se jednim dijelom postiè
226
Poglavlje 5
Slika 5-55. Amplifikacija DNA.

Ponavljaju}i koraci replikacije DNA stvaraju vi{estruke kopije odre|ene regije kromosoma.
DNA
amplifikacijom rRNA-gena. Kao {to je spomenuto u 4. poglavlju, u somatskim stanicama rRNA-geni dolaze u nekoliko stotina kopija {to je potrebno za sintezu dovoljne koli~ine molekula rRNA nu`nih da se zadovolje metaboli~ke potrebe stanica. U oocitama vodozemaca ovi su geni amplificirani dodatnih 2.000 puta na otprilike 1 milijun kopija po oociti. Drugi primjer programirane genske amplifikacije odvija se u genomu vinske mu{ice. Naime, geni u stanicama jajnika ènki vinske mu{ice, koji kodiraju proteine jajne ovojnice (korionski geni), amplificirani su zato da bi se zadovoljila potreba za velikom koli~inom ovih proteina. Poput drugih programiranih preslagivanja gena i amplifikacija gena relativno je rijedak doga|aj koji se odvija u visoko specijaliziranim tipovima stanica i ne moè se smatrati uobi~ajenim mehanizmom regulacije gena. Amplifikacija gena odvija se i kao nenormalni proces u zlo}udnim tumorskim stanicama gdje dovodi do povi{ene ekspresije gena koji pridonose nekontroliranom rastu stanica. Ovaj tip amplifikacije gena prvi je put uo~en u stanicama karcinoma koje su postale otporne na metotreksat, lijek koji se uobi~ajeno koristi u kemoterapiji karcinoma. Metotreksat inhibira enzim dihidrofolat-reduktazu koji je uklju~en u sintezu dTTP i stoga je potreban za sintezu DNA. Otpornost na metotreksat razvija se amplifikacijom gena za dihidrofolat-reduktazu na taj na~in {to metotreksat ne moè vi{e inhibirati djelovanje pove}ane koli~ine enzima dihidrofolat-reduktaze. Osim toga, amplifikacija gena u stanicama karcinoma u~estalo rezultira pove}anom ekspresijom gena koji upravljaju proliferacijom stanica (onkogeni) te tako direktno pridonose razvoju tumora (vidi 15. poglavlje). Tako se primjerice amplifikacija onkogena erbB-2 u~estalo odvija u karcinomu dojke. Prema tome, kao i kod drugih tipova preslagivanja DNA, posljedice amplifikacije gena mogu biti korisne, ali i katastrofalne za stanicu ili organizam.
227
S A @ E TA K REPLIKACIJA DNA
DNA-polimeraze: Razli~ite DNA-polimeraze igraju specifi~ne uloge u replikaciji i popravku DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. Sve poznate DNA-polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5' 3' smjeru dodaju}i dNTP na prethodno sintetizirane po~etnice. Replikacijske ra{lje: Roditeljski lanci molekule DNA se razdvoje i sluè kao kalupi za sintezu dvaju novih lanaca u replikacijskim ra{ljama. Jedan novosintetizirani lanac (vode}i lanac) sintetizira se kontinuirano dok se drugi lanac (zaostaju}i lanac) formira spajanjem kratkih ulomaka DNA koji se sintetiziraju u obrnutom smjeru u odnosu na sveukupni smjer replikacije. DNA-polimeraze i razli~iti drugi proteini djeluju koordinirano sintetiziraju}i i vode}i i zaostaju}i lanac DNA. Vjer nost replikacije: DNA-polimeraze pove}avaju to~nost replikacije odabirom odgovaraju}e baze za unos u novosintetizirani lanac i korigiranjem novosintetizirane DNA na taj na~in da eliminiraju krivo sparene baze. Ishodi{te i inicijacija replikacije: replikacija DNA zapo~inje u specifi~nom ishodi{tu replikacije koje sadràva vezna mjesta za proteine zaslu`ne za po~etak procesa replikacije. Telomere i telomeraze replikacija krajeva kromosoma: Ponavljaju}i sljedovi nukleotida na krajevima kromosoma (telomere) repliciraju se djelovanjem reverzne transkriptaze (telomeraze) koja sadràva svoj vlastiti RNA kalup.
KLJU^NI POJMOVI
DNA-polimeraza, mutagen
replikacijske ra{lje, Okazakijevi fragmenti, DNA-ligaza, vode}i lanac, zaostaju}i lanac, primaza, RNaza H, egzonukleaza, helikaza, proteini koji veù jednolan~anu DNA, topoizomeraza
korektivna sposobnost DNApolimeraze
ishodi{te replikacije, autonomno repliciraju}i sljedovi (ARS), kompleks ishodi{ta replikacije (ORC) telomere, telomeraza, reverzna transkriptaza
POPRAVAK DNA
Izravni obrat o{te}enja DNA: Nekoliko tipova ~estih o{te}enja DNA, poput pirimidinskih dimera i alkiliranih gvaninskih ostataka, popravljaju se izravnim obratom o{te}enja. Popravak izrezivanjem: Ve}ina o{te}enja DNA popravlja se izrezivanjem o{te}ene DNA. Nastale pukotine popunjavaju se novosintetiziranom DNA kori{tenjem neo{te}enoga komplementarnog lanca kao kalupa. U popravku izrezivanjem baza specifi~ni tipovi pojedina~nih o{te}enih baza uklanjaju se iz molekule DNA. Nasuprot tomu, popravak izrezivanjem nukleotida prepoznaje {irok spektar lezija koje naru{avaju strukturu DNA i uklanja o{te}ene baze kao dio izrezanog oligonukleotida. Tre}i mehanizam popravka izrezivanjem specifi~no uklanja krivo sparene baze iz novosintetiziranih lanaca DNA. Popravak sklon pogrje{kama (engl. error-prone repair): Specijalizirane DNA-polimeraze sposobne su replicirati DNA uzdu` mjesta o{te}enja, premda aktivnost ovih polimeraza rezultira visokom u~estalo{}u ugradnje pogrje{nih baza. Rekombinacijski popravak: O{te}ena DNA moè se zamijeniti rekombinacijom s neo{te}enom molekulom. Ovaj mehanizam igra va`nu ulogu u popravku o{te}enja na koja se nailazi tijekom replikacije DNA kao i u popravku dvolan~anih lomova.
pirimidinski dimeri, fotoreaktivacija
popravak izrezivanjem baza, DNA-glikozilaza, APendonukleaza, popravak izrezivanjem nukleotida, ekscinukleaza, popravak udruèn s transkripcijom, popravak krivo sparenih baza
popravak sklon pogrje{kama
228
Poglavlje 5
REKOMBINACIJA IZME\U HOMOLOGNIH DNA SLJEDOVA

Molekule DNA rekombiniraju se lomom i ponovnim spajanjem: Molekularni mehanizam rekombinacije uklju~uje lom i ponovno spajanje roditeljskih molekula DNA.
op}a homologna rekombinacija, Hollidayev model, Hollidayeva struktura
Modeli homologne rekombinacije: Sparivanje homolognih molekula DNA omogu}eno je komplementarnim sparivanjem baza. Zarezani lanci roditeljske DNA ~ine nukleofilni napad na drugu roditeljsku molekulu daju}i me|uprodukt s ukriènim lancima poznat kao Hollidayeva veza. Rekombinantne molekule se nakon toga formiraju kidanjem i ponovnim spajanjem ukriènih lanaca. Enzimi uklju~eni u homolognu rekombinaciju: Sredi{nji enzim homologne rekombinacije je RecA koji katalizira izmjenu lanaca homolognih molekula DNA. Drugi enzimi zarezuju i razmotavaju roditeljske molekule DNA te razrje{avaju Hollidayevu strukturu.
RecA
PRESLAGIVANJE DNA
rekombinacija u specifi~nom mjestu, lizogeni ciklus, antigen, imunoglobulin, receptor T stanica
Rekombinacija u specifi~nom mjestu odvija se izme|u specifi~nih sljedova DNA koje prepoznaju proteini uklju~eni u ovaj proces. Kod kralje`njaka rekombinacija u specifi~nom mjestu igra vrlo va`nu ulogu u stvaranju imunoglobulinskih gena i gena receptora T stanica tijekom razvoja imunosustava. Transpozicija posredovana DNA inter medijarima: Ve}ina DNA transpozona premje{ta se uzdu` genoma bez potrebe za specifi~nim slijedom DNA na mjestu insercije. Ipak, u protozoa i kvasaca transpozicija nekih sljedova DNA u specifi~na ciljna mjesta rezultira programiranim preslagivanjima DNA koja reguliraju ekspresiju gena. Transpozicija posredovana RNA inter medijarima: Ve}ina transpozona u eukariotskim stanicama premje{ta se reverznom transkripcijom RNA intermedijara sli~no replikaciji retrovirusa. Ovi retrotranspozoni uklju~uju visokoponavljaju}e LINE i SINE sljedove genoma sisavaca. Amplifikacija gena: Amplifikacija gena rezultat je uzastopnih replikacija odre|enoga kromosomskog podru~ja. U nekim slu~ajevima amplifikacija gena zapravo je mehanizam za pove}anje ekspresije toga gena tijekom razvoja organizma. Amplifikacija gena tako|er se u~estalo doga|a u stanicama karcinoma gdje moè rezultirati pove}anom ekspresijom gena koji pridonose nekontroliranoj proliferaciji stanica.
transpozicija, pokretni elementi, transpozon
retrotranspozon, retrovirus, reverzna transkriptaza, duga terminalna ponavljanja (LTR), LINE, SINE, dora|eni pseudogeni amplifikacija gena
Pitanja
1. Opi{ite uloge razli~itih DNA-polimeraza u E. coli. 2. [to su Okazakijevi fragmenti? Kako oni zapo~inju sintezu zaostaju}eg lanca? Kako oni postanu kontinuirani lanac? 3. Usporedi djelovanje topoizomeraze I i II. 4. Na koji biste na~in testirali slijed DNA u stanicama kvasaca da biste saznali sadràva li on ishodi{te replikacije ili pak autonomne replikacijske sljedove (ARS)? 5. Za{to ljudski genom sadràva na tisu}e ishodi{ta replikacije dok genom E. coli sadràva samo jedno? 6. Kako zapo~inje sinteza DNA u ishodi{tu replikacije? 7. Na koji na~in telomeraza produljuje krajeve kromosoma kompenziraju}i nemogu}nost DNA-polimeraze da kompletira replikaciju DNA kromosomskih krajeva?
229
8. Objasnite proces popravka izrezivanjem nukleotida. 9. Kako stanica moè popraviti dvolan~ani lom svoje DNA? 10. Na koji je na~in karcinom dojke povezan s mehanizmima popravka DNA? 11. Pacijenti koji pate od bolesti Xeroderma pigmentosum imaju iznimno visoku
incidenciju karcinoma koè, ali nije na|eno da imaju odgovaraju}e visoku incidenciju karcinoma unutra{njih organa (primjerice karcinom debeloga crijeva). [to nam ova ~injenica moè sugerirati o vrstama o{te}enja DNA odgovor nih za ve}inu unutarnjih karcinoma? 12. Koji fenotip biste predvidjeli za mutiranoga mi{a s nedostatkom gena po-
trebnih za rekombinaciju u specifi~nom mjestu koja se doga|a u limfocitima? 13. Mnogi od lijekova u klini~koj uporabi, kao i oni podvrgnuti istraìvanjima, u lije~enju od AIDS inhibitori su reverzne e HIV. Koja reverzna transkriptaza u ljudskim stanicama moè tako|er biti inhibirana ovim lijekovima? [to moè biti posljedica inhibicije tih enzima?
Literatura
Replikacija DNA
Baker, T. A. and S. P Bell. 1998. Polymerases . and the replisome: Machines within machines. Cell 92: 296305. P Bell, S. P 2002. The origin replication complex: . from simple origins to complex functions. Genes Dev. 16: 659672. P Bell, S. P and A. Dutta. 2002. DNA replication . in eukaryotic cells. Ann. Rev. Biochem. 71: 333374. P Benkovic, S. J., A. M. Valentine and F. Salinas. 2001. Replisome-mediated DNA replication. Ann. Rev. Biochem. 70: 181208. P Blackburn, E. H. 1992. Telomerases. Ann. Rev. Biochem. 61: 113129. P Cairns, J. 1963. The chromosome of Escherichia coli. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28: 4346. I Champoux, J. J. 2001. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Ann. Rev. Biochem. 70: 369413. P Ellison, V. and B. Stillman. 2001. Opening of the clamp: an intimate view of an ATP-driven biological machine. Cell 106: 655660. P Frick, D. N. and C. C. Richardson. 2001. DNA primases. Ann. Rev. Biochem. 70: 3980. P Gilbert, D. M. 2001. Making sense of eukaryotic DNA replication origins. Science 294: 96100. P Goodman, M. F. 1997. Hydrogen bonding revisited: geometric selection as a principal determinant of DNA replication fidelity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1049310495. P Huberman, J. A. and A. D. Riggs. 1968. On the mechanism of DNA replication in mammalian chromosomes. J. Mol. Biol. 32: 327341. I Hubscher, U., G. Maga and S. Spadari. 2002. Eukaryotic DNA polymerases. Ann. Rev. Biochem. 71: 133163. P Kornberg, A., I. R. Lehman, M. J. Bessman and E. S. Simms. 1956. Enzymic synthesis of deoxyribonucleic acid. Biochim. Biophys. Acta 21: 197198. I Kunkel, T. A. and K. Bebenek. 2000. DNA replication fidelity. Ann. Rev. Biochem. 69: 497529. P Lohman, T. M. and K. P Bjornson. 1996. Mech. anisms of helicase-catalyzed DNA unwinding. Ann. Rev. Biochem. 65: 169214. P McEachern, M. J., A Krauskopf and E. H. Blackburn. 2000. Telomeres and their control. Ann. Rev. Genet. 34: 331358. P Ogawa, T. and T. Okazaki. 1980. Discontinuous DNA replication. Ann. Rev. Biochem. 49: 421457. P Stinthcomb, D. T., K. Struhl and R. W. Davis. 1979. Isolation and characterization of a yeast chromosomal replicator. Nature 282: 3943. I Waga, S. and B. Stillman. 1994. Anatomy of a DNA replication fork revealed by reconstitution of SV40 DNA replication in vitro. Nature 369: 207212. I Waga, S. and B. Stillman. 1998. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Ann. Rev. Biochem. 67: 721751. P West, S. C. 1996. DNA helicases: New breeds of translocating motors and molecular pumps. Cell 86: 177180. P Wold, M. S. 1997. Replication protein A: A heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Ann. Rev. Biochem. 66: 6192. P Zakian, V. A. 1995. Telomeres: Beginning to understand the end. Science 270: 16011607. P De Laat, W. L., N. G. J. Jaspers and J. H. J. Hoeijmakers. 1999. Molecular mechanism of nucleotide excision repair. Genes Dev. 13: 768785. P Fishel, R., M. K. Lescoe, M. R. S. Rao, N. G. Copeland, N. A. Jenkins, J. Garber, M. Kane and R. Kolodner. 1993. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell 75: 10271038. I Friedberg, E. C., R. Wagner and M. Radman. 2002. Specialized DNA polymerases, cellular survival, and the genesis of mutations. Science 296: 16271630. P Friedberg, E. C., G. C. Walker and W. Siede. 1995. DNA Repair and Mutagenesis. Washington, D.C.: ASM Press. Goodman, M. F. 2002. Error-prone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryotes. Ann. Rev. Biochem. 71: 1750. P Harfe, B. D. and S. Jinks-Robertson. 2000. DNA mismatch repair and genetic instability. Ann. Rev. Genet. 34: 359399. P Hoeijmakers, J. H. J. 2001. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature 411: 366374. P Khanna, K. K. and S. P Jackson. 2001. DNA . double strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics 27: 247254. P Leach, F. S. and 34 others. 1993. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cell 75: 12151225. I Livneh, Z. 2001. DNA damage control by novel DNA polymerases: translesion replication and mutagenesis. J. Biol. Chem. 276: 2563925642. P Modrich, P 1997. Strand-specific mismatch re. pair in mammalian cells. J. Biol. Chem. 272: 2472724730. P Sancar, A. 1996. DNA excision repair. Ann. Rev. Biochem. 65: 4381. P Seeberg, E., L. Eide and M. Bjoras. 1995. The base excision repair pathway. Trends Biochem. Sci. 20: 391397. P
Popravak DNA
Batty, D. P and R. D. Wood. 2000. Damage . recognition in nucleotide excision repair of DNA. Gene 241: 193204. P Cleaver, J. E. 1968. Defective repair replication of DNA in xeroderma pigmentosum. Nature 218: 652656. I Cox, M. M. 2001. Recombinational DNA repair of damaged replication forks in Escherichia coli: questions. Ann. Rev. Genet. 35: 5382. P
230
Poglavlje 5
Svejstrup, J. Q. 2002. Mechanisms of transcription-coupled DNA repair. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 3: 2129. P Wood, R. D. 1997. Nucleotide excision repair in mammalian cells. J. Biol. Chem. 272: 2346523468. P
Stahl, F. 1996. Meiotic recombination in yeast: Coronation of the double-strand-break repair model. Cell 87: 965968. P Szostak, J. W., T. L. Orr-Weaver, R. J. Rothstein and F. W. Stahl. 1983. The double-strandbreak repair model for recombination. Cell 33: 2535. I Taylor, A. F. 1992. Movement and resolution of Holliday junctions by enzymes from E. coli. Cell 69: 10631065. P West, S. C. 1992. Enzymes and molecular mechanisms of genetic recombination. Ann. Rev. Biochem. 61: 603640. P West, S. C. 1997. Processing of recombination intermediates by the RuvABC proteins. Ann. Rev. Genet. 31: 213244. P
Haren, L., B. Ton-Hoang and M. Chandler. 1999. Integrating DNA: transposases and retroviral integrases. Ann. Rev. Microbiol. 53: 245281. P Hozumi, N. and S. Tonegawa. 1976. Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 36283632. I International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860921. I Kidwell, M. G. and D. Lisch. 1997. Transposable elements as sources of variation in animals and plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 77047711. P Landy, A. 1989. Dynamic, structural, and regulatory aspects of l site-specific recombination. Ann. Rev. Biochem. 58: 913949. P Lewis, S. and M. Gellert. 1989. The mechanism of antigen receptor gene assembly. Cell 59: 585588. P McClintock, B. 1956. Controlling elements and the gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 21: 197216. I Moran, J. V., R. J. DeBerardinis and H. H. Kazazian Jr. 1999. Exon shuffling by L1 retrotransposition. Science 283: 1530 1534. I Ostertag, E. M. and H. H. Kazazian Jr. 2001. Biology of mammalian L1 retrotransposons. Ann. Rev. Genet. 35: 501538. P Stark, G. R., M. Debatisse, E. Giulotto and G. M. Wahl. 1989. Recent progress in understanding mechanisms of mammalian DNA amplification. Cell 57: 901908. P Stark, G. R. and G. M. Wahl. 1984. Gene amplification. Ann. Rev. Biochem. 53: 447491. P Tonegawa, S. 1983. Somatic generation of antibody diversity. Nature 302: 575581. P Venter, J. C. and 273 others. 2001. The sequence of the human genome. Science 291: 13041351. I Weiner, A. M., P L. Deininger and A. . Efstratiadis. 1986. Nonviral retroposons: Genes, pseudogenes, and transposable elements generated by the reverse flow of genetic information. Ann. Rev. Biochem. 55: 631661. P
Rekombinacija izme|u homolognih sljedova DNA

Baumann, P and S. C. West. 1998. Role of the . human RAD51 protein in homologous recombination and double-stranded-break repair. Trends Biochem. Sci. 23: 247251. P DasGupta, C., A. M. Wu, R. Kahn, R. P Cun. ningham and C. M. Radding. 1981. Concerted strand exchange and formation of Holliday structures by E. coli RecA protein. Cell 25: 507516. I Haber, J. E. and W.-D. Heyer. 2001. The fuss about Mus81. Cell 107: 551554. P Holliday, R. 1964. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5: 282304. I Kowalczykowski, S. C. and A. K. Eggleston. 1994. Homologous pairing and DNA strand-exchange proteins. Ann. Rev. Biochem. 63: 9911043. P Meselson, M. and J. J. Weigle. 1961. Chromosome breakage accompanying genetic recombination in bacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 47: 857868. I Potter, H. and D. Dressler. 1976. On the mechanism of genetic recombination: Electron microscopic observation of recombination intermediates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 30003004. I Radding, C. M. 1991. Helical interactions in homologous pairing and strand exchange driven by RecA protein. J. Biol. Chem. 266: 53555358. P Shinohara, A. and T. Ogawa. 1995. Homologous recombination and the roles of double strand breaks. Trends Biochem. Sci. 20: 387391. P Smith, G. R. 2001. Homologous recombination near and far from DNA breaks: alternative roles and contrasting views. Ann. Rev. Genet. 35: 243274. P
Preslagivanje DNA
Bassing, C. H., W. Swat and F. W. Alt. 2002. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell 109: S45S55. P Boeke, J. D., D. J. Garfinkel, C. A. Styles and G. R. Fink. 1985. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell 40: 491500. I Craig, N. L. 1995. Unity in transposition reactions. Science 270: 253254. P Craig, N. L. 1997. Target site selection in transposition. Ann. Rev. Biochem. 66: 437474. P Davis, M. M. 1990. T cell receptor gene diversity and selection. Ann. Rev. Biochem. 59: 475496. P Fedoroff, N. V. 2000. Transposons and genome evolution in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 70027007. P Fedoroff, N. and D. Botstein. 1992. The Dynamic Genome: Barbara McClintocks Ideas in the Century of Genetics. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Finnegan, D. J. 1989. Eukaryotic transposable elements and genome evolution. Trends Genet. 5: 103107. P Gilboa, E., S. W. Mitra, S. Goff and D. Baltimore. 1979. A detailed model of reverse transcription and tests of crucial aspects. Cell 18: 93100. I
Poglavlje
Sinteza i dorada RNA
Transkripcija u prokariota 231 Eukariotske RNA-polimeraze i transkripcijski faktori 239 Regulacija transkripcije u eukariota 244 Dorada i promet RNA 261
KLJU^NI POKUS: Izolacija
eukariotskoga transkripcijskoga faktora 251 snRNP 268
4. I 5. POGLAVLJU RAZMATRANA JE ORGANIZACIJA i odràvanje genomske DNA, koja bi se mogla promatrati kao skup geneti~kih instrukcija {to upravljaju svim stani~nim aktivnostima. Instrukcije se prenose na RNA koja potom upravlja procesom sinteze proteina. Va`no je napomenuti da pona{anje stanice nije odre|eno isklju~ivo naslije|enim genima nego i koji je od tih gena izraèn u neko odre|eno vrijeme. Regulacija genske ekspresije omogu}uje stanicama prilagodbu na promjene njihova okoli{a, a odgovorna je i za specifi~ne aktivnosti brojnih diferenciranih stani~nih vrsta koje izgra|uju vi{e biljke i ìvotinje. Mi{i}ne i jetrene stanice, primjerice, sadràvaju iste gene; funkcije tih stanica nisu odre|ene razlikama u njihovim genomima, nego reguliranim na~inom ekspresije gena koji upravljaju razvojem i diferencijacijom. Prvi korak u ekspresiji gena, transkripcija DNA u RNA, primarna je razina na kojoj se regulira genska ekspresija i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama. Molekule RNA u eukariotskim stanicama naknadno se mijenjaju na razli~ite na~ine primjerice, introni se uklanjaju prekrajanjem ~ime se primarni prijepis prevodi u svoj funkcionalni oblik. Razli~ite vrste RNA imaju razli~ite uloge u stanicama. Glasni~ke RNA (mRNA) sluè kao kalupi za sintezu proteina; ribosomne RNA (rRNA) i transportne RNA (tRNA) djelatne su u procesu translacije mRNA. Druge male molekule RNA sluè regulaciji gena, prekrajanju mRNA dora|ivanju tRNA te razvrstavanju proteina u eukariota. U ovom poglavlju razmatramo transkripciju i doradu (engl. processing) RNA. Krajnji korak u ekspresiji gena, prevo|enje glasni~ke RNA u protein, razmatramo u 7. poglavlju.
Transkripcija u prokariota
Kao u ve}ini podru~ja molekularne biologije, studije na E. coli osigurale su model za kasnija istraìvanja transkripcije u eukariotskim stanicama. Kako je re~eno u 3. poglavlju, mRNA je prvotno otkrivena u E. coli. Tako|er, E. coli je prvi organizam iz kojega je izolirana i prou~avana RNA-polimeraza. Osnovni mehanizmi s pomo}u kojih je transkripcija regulirana rasvijetljeni su na sli~an na~in pionirskim pokusima na E. coli. U tim je pokusima pokazano da regulirana genska ekspresija omogu}uje stanici da odgovori na promjene u okolini, primjerice na nedostatak hranjivog sastojka. Razumijevanje transkripcije u E. coli omogu}i-
232
Poglavlje 6
a ' s
a b
lo je prou~avanje mnogo sloènijih mehanizama koji reguliraju transkripciju u eukariotskim stanicama.
RNA-polimeraza i transkripcija
Enzim odgovoran za sintezu RNA jest RNA-polimeraza koja katalizira polimerizaciju ribonukleozid-5'-trifosfata (NTP) usmjerenu kalupom DNA. Sinteza je RNA sli~na sintezi DNA; sli~no DNA-polimerazi, RNA-polimeraza katalizira rast lanca RNA uvijek u smjeru 5' prema 3'. Me|utim, za razliku od DNA-polimeraze, RNA-polimeraza ne treba pripremljenu klicu za zapo~injanje (inicijaciju) sinteze RNA. Umjesto toga, transkripcija zapo~inje de novo na specifi~nim mjestima na po~etku gena. Proces zapo~injanja posebice je vaàn jer je to zna~ajna razina na kojoj se regulira transkripcija. RNA-polimeraza, sli~no kao i DNA-polimeraza, sloèn je enzim koji se sastoji od vi{e polipeptidnih lanaca. Bakterijski enzim sastavljen je iz pet razli~itih podjedinica, nazvanih a, b, b', w i s (slika 6-1.). s podjedinica je relativno slabo vezana i moè se razdvojiti od ostalih pet podjedinica, daju}i sr` enzima na~injenu od dvije a, jedne b, jedne b' i jedne w podjedinice. Sr` polimeraze potpuno je sposobna katalizirati polimerizaciju NTP u RNA, {to upu}uje na to da s podjedinica nije potrebna za osnovnu kataliti~ku aktivnost enzima. Me|utim, sr` enzima ne moè se specifi~no vezati na sljedove DNA, {to je pokazatelj normalne inicijacije transkripcije, stoga je s podjedinica potrebna za utvr|ivanje ispravnih mjesta za zapo~injanje transkripcije. Izbor je tih mjesta kriti~ni dio transkripcije, jer sinteza funkcionalne RNA mora zapo~eti na po~etku gena. Slijed DNA na koji se veè RNA-polimeraza kako bi zapo~ela transkripciju gena naziva se promotor. Sljedovi DNA uklju~eni u promotorsku funkciju najprije su utvr|eni usporedbom nukleotidnih sljedova niza razli~itih gena izoliranih iz E. coli. Usporedbe su pokazale da podru~ja uzvodno od mjesta zapo~injanja transkripcije sadràvaju dvije skupine sljedova koje su sli~ne u mnogim genima. Svaki od tih zajedni~kih sljedova sastoji se od {est nukleotida i smje{ten je oko 10 i 35 baznih parova uzvodno od po~etnog transkripcijskog mjesta (slika 6-2). Oni se nazivaju 10 i 35 dijelovi, ozna~uju}i njihovu poziciju u odnosu na po~etno transkripcijsko mjesto koje je definirano kao +1. Sljedovi na 10 i 35 poziciji u razli~itim promotorima nisu jednaki, ali su svi dovoljno sli~ni da se postavi usugla{eni slijed naj~e{}e na|ene baze na svakoj poziciji. Nekoliko vrsta eksperimentalnih dokaza potvr|uju funkcionalnu va`nost 10 i 35 promotorskih dijelova. Prvo, geni s promotorima koji se razlikuju od usugla{enih sljedova prepisuju se manje u~inkovito od gena ~iji se promotori mnogo bolje podudaraju s usugla{enim sljedovima. Drugo, mutacije uvedene bilo u 10 bilo u 35 usugla{ene sljedove imaju jake u~inke na promotorsku funkciju. Tre}e, mjesta na kojima se RNA-polimeraza veè na promotore izravno su utvr|ena pokusima otiska stopala (engl. footprint), koji se uobi~ajeno koriste za utvr|ivanje mjesta na kojima se proteini
T T G ACA AA C TGT T A T A AT A T A T TA
Slika 6-1. RNA-polimeraza iz E. coli.

Enzim se sastoji iz 6 podjedinica: dvije , jedne , jedne , jedne i jedne . Podjedinica relativno je slabo vezana i moè disocirati od ostalih pet podjedinica koje ~ine sr` polimeraze.
35
10
+1 mjesto zapo~injanja transkripcije
Slika 6-2. Promotorski sljedovi E. coli.
Zna~ajku E. coli promotora predstavljaju dva niza sljedova smje{tenih 10 i 35 parova baza uzvodno od po~etnog mjesta za transkripciju (+1). Usugla{eni sljedovi pokazuju da su u skladu s naj~e{}e na|enim bazama u razli~itim promotorima.
233
fragment DNA razdioba uzorka protein inkubacija s proteinom
radioaktivno ozna~ivanje
Slika 6-3. DNA otisak stopala.

Uzorak koji sadràva fragmente DNA radioaktivno ozna~ene na jednom kraju podijeljen je u dva dijela, a jedna polovina uzorka inkubirana je s proteinima koji se veù na specifi~ne sljedove unutar fragmenta DNA. Oba se uzorka potom razgra|uju DNazom pod takvim uvjetima da DNaza uvodi prosje~no jedan rez po molekuli. Dio DNA vezan na protein za{ti}en je od razgradnje DNazom. Kompleksi DNA-protein se denaturiraju, a veli~ina radioaktivnoozna~enih fragmenata nastalih djelovanjem DNaze analizirana je elektroforezom. Fragmenti DNA nastali kidanjem DNazom unutar podru~ja za{ti}enog vezanjem proteina na DNA nedostaju u uzorku DNA koji je inkubiran s proteinom.
inkubacija bez proteina
protein vezan na specifi~ni slijed DNA razgradnja DNazom razgradnja DNazom
denaturacija
elektroforeza autoradiografija
podru~je DNA za{ti}eno vezanjem proteina
veù na DNA (slika 6-3). U pokusima te vrste, ulomak DNA radioaktivno je ozna~en na jednom kraju. Ozna~ena DNA inkubira se s proteinima koji se ispituju (primjerice RNA-polimeraza) i naknadno djelomi~no razgra|uje DNazom. Na~elo je metode da su podru~ja DNA na koja se vezao protein za{ti}ena od razgradnje DNazom. Stoga se ta podru~ja mogu utvrditi usporedbom razgradnih produkata DNA na koju su se vezali proteini, s identi~nim paralelnim uzorkom DNA koja nije bila inkubirana s proteinima. Varijacije ove osnovne metode, koja koristi kemijske reagense za modifikaciju i razgradnju DNA na odre|enim nukleotidima, mogu se koristiti za utvr|ivanje specifi~nih baza na DNA koje su u kontaktu s proteinom. Analiza otiska stopala pokazala je da se RNA-polimeraza op}enito veè na promoto-
234
Poglavlje 6
polimeraza nespecifi~no vezana na DNA
35
10 +1 promotor
specifi~no vezanje s podjedinice na 35 i 10 promotorske sljedove
razmotavanje DNA oko inicijacijskoga mjesta
otvoreni promotorski kompleks
10 +1 inicijacija transkripcije
+1 1 otpu{tanje s podjedinice
+1
produljenje lanca RNA
+1
+1
Slika 6-4. Transkripcija polimerazom iz E. coli.

U po~etku se polimeraza veè nespecifi~no na DNA i kre}e po molekuli sve dok se podjedinica ne veè na 35 i 10 promotorske elemente, stvaraju}i zatvoreni promotorski kompleks. Polimeraza potom razmata DNA oko inicijacijskog mjesta, a transkripcija zapo~inje polimerizacijom slobodnih NTP podjedinica . potom disocira od srì polimeraze, koja se kre}e du` DNA i produljuje rastu}i lanac RNA.
re u podru~ju od oko 60 parova baza koji se proteù od 40 do + 20 (od 40 nukleotida uzvodno do 20 nukleotida nizvodno od po~etnoga transkripcijskoga mjesta). Podjedinica specifi~no se veè na sljedove u oba 35 i 10 promotorska podru~ja, potkrjepljuju}i va`nost tih sljedova u promotorskoj funkciji. Dodatno, neki E. coli promotori imaju tre}i slijed smje{ten uzvodno od 35 podru~ja koji sluì kao specifi~no vezno mjesto za a-podjedinicu RNA-polimeraze.
Sinteza i dorada RNA U odsutnosti podjedinice, RNA-polimeraza veè se nespecifi~no i s niskim afinitetom na DNA. Uloga podjedinice sastoji se u usmjeravanju polimeraze k promotorima specifi~nim vezivanjem na oba slijeda, 35 i 10, dovode}i do zapo~injanja transkripcije na po~etcima gena (slika 6-4). Po~etno vezivanje izme|u polimeraze i promotora nazvano je zatvorenim promotorskim kompleksom budu}i da DNA nije odmotana. Polimeraza potom odmotava 14 baza DNA, od 12 do +2, stvaraju}i otvoreni promotorski kompleks u kojemu jednolan~ana DNA sluì kao kalup za transkripciju. Transkripcija zapo~inje povezivanjem dvaju slobodnih NTP Nakon ugra. dnje prvih deset nukleotida, s podjedinica osloba|a se s polimeraze koja ostavlja promotor i kre}e se du` kalupa DNA da bi nastavila produljenje (elongaciju) rastu}ega lanca RNA. Tijekom produljenja, polimeraza ostaje zdruèna s kalupom nastavljaju}i sintezu mRNA. Kako se ona kre}e du` kalupa DNA, polimeraza odmotava kalup ispred sebe, a smotava ga iza sebe, odràvaju}i odmotano podru~je od oko 15 parova baza u dijelu koji se prepisuje. Visoko-razlu~uju}a strukturna analiza bakterijske RNA-polimeraze ukazuje da b i b' podjedinice tvore strukturu sli~nu rakovim {tipaljkama koja ~vrsto drì DNA kalup (slika 6-5). Unutarnji `lijeb izme|u b i b' podjedinica moè primiti 20 parova baza DNA i sadràva aktivno mjesto polimeraze. Sinteza RNA nastavlja se sve dok polimeraza ne nai|e na terminacijski znak, na tom se mjestu zaustavlja transkripcija, RNA se osloba|a s polimeraze, a enzim disocira s DNA kalupa. Najjednostavniji i naj~e{}i terminacijski signal u E. coli sastoji se od simetri~no obrnutog ponavljanja slijeda bogatog GC bazama iza kojega slijedi ~etiri ili vi{e A baza (slika 6-6). Transkripcija GC-bogatog obrnuto-simetri~nog ponavljanja dovodi do stvaranja segmenta RNA koji moè tvoriti stabilne strukture peteljka-om~a komplementarnim sparivanjem baza. Nastanak takvih struktura u RNA, koje su same sebi komplementarne, raskida asocijaciju RNA s DNA-kalupom i zaustavlja transkripciju. S obzirom na to da su vodikovi mostovi izme|u A i U slabiji nego izme|u G i C, prisutnost A baza nizvodno od obrnuto-ponavljaju}ega slijeda promi~e disocijaciju RNA s DNA-kalupa. Druge vrste terminacijskih signala, i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama, prije ovise o vezivanju proteina koji zaustavljaju transkripciju na specifi~nim sljedovima DNA, nego o nastanku strukture peteljka-om~a u RNA.
235
Slika 6-5. Struktura bakterijske RNA-polimeraze.
podjedinice polimeraze obojene su tamnozeleno i svijetlozeleno, plavo, ' ruì~asto i ùto. (Ljubazno{}u Setha Darsta, Sveu~ili{te Rockefeller)
236
Poglavlje 6
Slika 6-6. Terminacija transkripcije.

Ter minacija transkripcije signalizirana je obrnutim ponavljanjima bogatim GC iza kojih slijede ~etiri A ostatka. Obrnuta ponavljanja stvaraju stabilne peteljka-om~a strukture u RNA, uzrokuju}i disocijaciju RNA s kalupa DNA.
DNA 5'
G C C G C C G C T
C G C G G C G G C T
G C T
C A
G A
C T
C G
3' 5'
G C T
C
A T
A U C G C G G C G G C U U U U T A G C G C C G C C G A A A A C G A G T
G A
C T G A
3' RNA 5'
C G G C G G C G A
G
C
stvaranje peteljka-om~a disocijacija RNA s kalupa DNA
C G C C G C C G
G C G G C G G C U U U U
5'
OH 3'
DNA 5' 3'
G C C G C C G C T C G G C G G C G A
A T
A T
T A
C G C G G C G G C T G C G C C G C C G A
T A
T A
T A
G C T C G A
C A
C T
G A
C T
C G
3' 5'
G T G A
C T G A
Represori i negativna kontrola transkripcije

Pedesetih godina pro{loga stolje}a Franois Jacob i Jacques Monod izveli su pionirska istraìvanja regulacije gena u E. coli. Ovi istraìva~i zajedno sa svojim suradnicima analizirali su ekspresiju enzima djelatnih u metabolizmu laktoze ~iji se razgradni produkti, glukoza i galaktoza, mogu koristiti kao izvor ugljika i energije (slika 6-7). Enzim koji katalizira razgradnju laktoze (b-galaktozidaza), kao i ostali enzimi djelatni u metabolizmu laktoze, eksprimirani su samo ako je laktoza na raspolaganju bakterijama. Ina~e, stanica je sposobna racionalno gospodariti ne ulaù}i energiju u sintezu RNA i proteina koji joj nisu potrebni. Tako laktoza inducira sintezu enzima koji sudjeluju u njezinom vlastitom metabolizmu. Osim b-galaktozidaze, za metabolizam laktoze potrebni su produkti dvaju drugih gena koji su usko povezani: permeaza, koja transportira laktozu u stanicu i transacetilaza, ~ija je zada}a inaktivirati toksi~ne tiogalaktozide koji se skupa s laktozom transportiraju u stanicu s pomo}u permeaze. Na osnovi ~isto geneti~kih pokusa, Jacob i Monod deducirali su mehanizam kojim je regulirana ekspresija ovih gena, postavljaju}i model fundamentalan za razumijevanje regulacije transkripcije. Prvi korak u analizi bila je izolacija mutanti s defektnom regulacijom gena va`nih za metabolizam laktoze. Izolirane su dvije vrste mutanti: konstitutivne mutante koje eksprimiraju sva tri gena i u odsutnosti laktoze i neinducibilne mutante koje ne eksprimiraju ove gene ni u prisutnosti laktoze. Geneti~kim mapiranjem ovih mutanti lokalizirana su dva odvojena mjesta, nazvana o i i, a o je smje{ten neposredno uzvodno od strukturnoga gena za b-galaktozidazu. Genske promjene (mutacije) koje poga|aju o dovode do konstitutivne ekspresije, a mutacije vezane uz i ili do konstitutivne ili do neinducibilne ekspresije. Funkcije ovih regulatornih gena ispitane su pokusima s dva bakterijska soja, koji me|usobnim spajanjem daju diploidne stanice {to sadràvaju gene obaju roditelja (slika 6-8). Analiza ekspresije gena u takvim diploidnim
HO
CH2OH O H OH
CH2OH O H OH O OH laktoza
OH
OH b-galaktozidaza CH2OH O H OH OH galaktoza
HO
OH
+
HO
CH2OH O H OH OH glukoza
OH
Slika 6-7. Metabolizam laktoze.
-galaktozidaza katalizira hidrolizu laktoze na glukozu i galaktozu.
237
roditeljske bakterije i + o+ z1 i o+ z2 i + o+ z1 i + oc z2
Slika 6-8. Regulacija b-galaktozidaze u diploidnim E. coli.

Sparivanjem dvaju bakterijskih rodova nastaju diploidne stanice koje sadràvaju gene obaju roditelja. U tim primjerima pretpostavljeno je da se geni koji kodiraju b-galaktozidazu (z geni) mogu razlikovati na osnovi struktur nih genskih mutacija, ozna~enih z1 i z2. U i/i+ diploidu (lijevo), oba su strukturna gena inducibilna; stoga, i+ je dominantna naspram i i utje~e na ekspresiju z gena na oba kromosoma. Suprotno tome, u oc/o+ diploidu (desno), z gen vezan na oc konstitutivno je eksprimiran, dok je z gen vezan na o+ inducibilan. Tako, o utje~e na ekspresiju samo susjednoga z gena na istom kromosomu.
inducibilne
konstitutivne
inducibilne
konstitutivne
i + o+ i o
z1 z2
diploidi
i + o+ i + oc
z1 z2
2 Oboje, inducibilne
konstitutivno
bakterijama dala je kriti~ki uvid i definirala koji je alel regulatornih gena dominantan, a koji recesivan. Primjerice, ako se bakterije s normalnim i genom (i+) spare s bakterijama nositeljima mutacije u i genu koja ima za posljedicu konstitutivnu ekspresiju (i mutacija) nastale diploidne bakterije pokazuju normalnu inducibilnost. Stoga je normalni i+ gen dominantan nad mutiranim i. Nasuprot tomu, sparivanje normalnih bakterija s bakterijama nositeljima oc mutacije (konstitutivna ekspresija) daje diploide s konstitutivnom ekspresijom, {to upu}uje na to da je oc dominantan nad o+. Dodatni pokusi u kojima su mutirani o i i kombinirani s razli~itim mutacijama u strukturnim genima pokazali su da o utje~e na ekspresiju samo onih gena s kojima je fizi~ki povezan, dok i utje~e na ekspresiju gena na objema kromosomskim kopijama u diploidnim bakterijama. Tako su u oc/o+ stanici samo oni strukturni geni koji su povezani s oc konstitutivno eksprimirani. Nasuprot tomu, u i+/ i stanici, strukturni geni na oba kromosoma normalno su regulirani. Ti su rezultati doveli do zaklju~ka da o predstavlja podru~je DNA koje kontrolira transkripciju susjednih gena, a i gen kodira regulatorni faktor (protein) koji moè difundirati kroz cijelu stanicu i kontrolirati gene na oba kromosoma. Model genske regulacije postavljen na temelju ovih pokusa ilustrira slika 6-9. Geni za b-galaktozidazu, permeazu i transacetilazu eksprimirani su kao jedna jedinica nazvana operon. Transkripcija operona kontrolirana je genom o (operator) smje{tenim u neposrednom susjedstvu mjesta po~etka transkripcije. Gen i kodira protein koji vezivanjem na operator kontrolira transkripciju. S obzirom na to da su i mutante (koje dovode do konstitutivne ekspresije) recesivne, zaklju~eno je da te mutante ne mogu stvarati funkcionalni genski produkt. Taj rezultat pokazuje da je normalni produkt i gena represor koji sprje~ava transkripciju vezanjem na o. Prisutnost laktoze izaziva indukciju operona jer se laktoza veè na represor, sprje~avaju}i tako njegovo vezivanje na operatorsku DNA. U neinducibilnih i mutanti (koje su dominantne nad i+), represor se ne moè vezati na laktozu, pa se ni operon ne moè inducirati. Model dostatno odgovara rezultatima geneti~kih pokusa iz kojih je postavljen. U i stanicama, represor se ne stvara, tako da je lac operon konstitutivno eksprimiran. Diploidne i+/ i stanice normalno su inducibilne, s obzirom na to da je funkcionalni represor kodiran i+ alelom. Kona~no, u oc mutanti ne postoji funkcionalni operator te stoga represor ne moè biti vezan. Sukladno tome, oc mutante su dominantne, ali utje~u na ekspresiju samo onih strukturnih gena koji su s njima fizi~ki povezani.
238
Poglavlje 6
Slika 6-9. Negativna kontrola lac operona.
y a
3' 5'
Pol
sprije~ena transkripcija o z
i
5' 3'
represor i
5' 3'
i gen kodira represor koji se, u odsutnosti laktoze (vrh), veè na operator (o) i interferira s vezivanjem RNA-polimeraze na promotor, blokiraju}i transkripciju tri strukturna gena (z, b-galaktozidaze; y, permeaze; a, transacetilaze). Laktoza inducira ekspresiju operona vezivanjem na represor (dno slike) {to sprje~ava represor da se veè na operator. P promotor; Pol polimeraza.
lac mRNA o Pol P z y a

3' 5'
laktoza
neaktivni represor
Mnogi pokusi potvrdili su ovaj temeljni model, uklju~uju}i i pokuse izolacije lac represora i analize njegova vezanja na operatorsku DNA, koje je proveo Walter Gilbert {ezdesetih godina pro{loga stolje}a. Molekularnom analizom definirana je operatorska DNA kao dvadesetak parova baza smje{tenih nekoliko baza ispred inicijacijskoga mjesta transkripcije. Analizom otiska stopala identificirano je to podru~je kao mjesto na koje se veè represor sprje~avaju}i transkripciju time {to onemogu}ava s vezanjem RNA-polimeraze na promotor. Kao {to je predvi|eno, laktoza se veè na represor koji se tada vi{e ne moè vezati na operatorsku DNA. Tako|er, kao {to je predvi|eno, oc mutacije mjenjaju slijed nukleotida u operatoru i tako onemogu}uju vezanje represora {to rezultira konstitutivnom ekspresijom gena. Sredi{nji je princip regulacije gena, protuma~en na primjeru laktoza operona, da je kontrola transkripcije posredovana interakcijom regulatornih proteina sa specifi~nim sljedovima DNA. Ovaj op}i na~in regulacije {iroko je primjenjiv i kod prokariotskih i kod eukariotskih stanica. Regulatorni sljedovi poput operatora nazivaju se cis-djeluju}i kontrolni elementi, s obzirom na to da utje~u na ekspresiju samo onih gena koji su vezani na istu molekulu DNA. S druge strane, proteini poput represora, nazivaju se transdjeluju}i faktori, jer mogu utjecati na ekspresiju gena smje{tenih na drugim kromosomima u stanici. Lac operon je primjer negativne kontrole, jer vezanje represora sprje~ava transkripciju. Me|utim, to nije uvijek slu~aj; mnogi trans-djeluju}i faktori prije su aktivatori nego inhibitori transkripcije.
Pozitivna kontrola transkripcije

Najbolje istraèn primjer pozitivne kontrole u E. coli jest utjecaj glukoze na ekspresiju gena koji kodiraju enzime djelatne u razgradnji (katabolizmu) drugih {e}era (uklju~uju}i laktozu), koji predstavljaju alternativni izvor ugljika i energije. Prioritetno se koristi glukoza, tako da dok je glukoza na raspolaganju, enzimi djelatni u katabolizmu alternativnih izvora energije nisu eksprimirani. Primjerice, ako E. coli raste u mediju koji sadràva i glukozu i laktozu, lac operon se ne inducira, a bakterije koriste samo glukozu. Tako glukoza gu{i lac operon ~ak i u prisutnosti normalnog induktora (laktoze). Danas je poznato da je represija glukozom (op}enito nazvano represija katabolitom) posredovana pozitivnim kontrolnim sustavom, koji je pove-

Slika 6-10. Pozitivna kontrola lac operona glukozom.
Niska razina glukoze aktivira adenilil-ciklazu koja prevodi ATP u cikli~ki AMP (cAMP). Cikli~ki AMP veè se potom na kataboli~ki aktivatorski protein (CAP) ~ime stimulira njegovo vezanje na regulatorne sljedove mnogih operona povezanih s metabolizmom alternativnih {e}era, kao {to je laktoza. CAP stupa u interakciju s podjedinicom RNA-polimeraze olak{avaju}i tako vezanje polimeraze za promotor.
239
niska razina glukoze
adenil-ciklaza
zan s razinom cikli~kog AMP (cAMP) (slika 6-10). Enzim adenil-ciklaza, koji prevodi ATP u cAMP u bakterijama je reguliran tako da pad razine glukoze , izaziva porast cAMP cAMP se potom veè na protein koji regulira transkrip. ciju, nazvan kataboli~ki aktivatorski protein (CAP). Vezivanje cAMP stimulira vezivanje CAP na ciljni slijed DNA u lac operonu smje{ten oko 60 baza uzvodno od po~etnog mjesta transkripcije. CAP zatim stupa u interakciju s podjedinicom RNA-polimeraze, promi~u}i vezivanje polimeraze na promotor i aktiviraju}i transkripciju.
cAMP
P Pi
cAMP CAP
Eukariotske RNA-polimeraze i transkripcijski faktori

Iako se transkripcija u svim stanicama odvija po istom temeljnom mehanizmu, u eukariotskim je stanicama taj proces znatno sloèniji nego u bakterijama. Dvije su izrazite razlike izme|u prokariotskog i eukariotskoga sustava. Prvo, dok se u bakterijama svi geni prepisuju pomo}u jedne RNA-polimeraze, eukariotske stanice imaju nekoliko razli~itih RNA-polimeraza koje prepisuju odre|ene skupine gena. Drugo, eukariotske RNA-polimeraze ne veù se izravno na promotorske sljedove nego trebaju interakciju s nizom dodatnih proteina da bi specifi~no zapo~ele transkripciju. Pretpostavlja se da to pove}ava sloènost eukariotske transkripcije, olak{ava sofisticiranu regulaciju genske ekspresije potrebne za usmjeravanje aktivnosti velikoga broja razli~itih stanica u vi{estani~nom organizmu.
cAMP CAP
o Pol z P
Eukariotske RNA-polimeraze
Eukariotske stanice imaju tri razli~ite RNA-polimeraze, smje{tene u jezgri, koje prepisuju razli~ite skupine gena (tablica 6-1). Geni koji kodiraju proteine prepisuju se s pomo}u RNA-polimeraze II daju}i mRNA, a ribosomne (rRNA) i transportne RNA (tRNA) prepisuju se RNA-polimerazama I i III. RNA-polimeraza I specifi~no je odre|ena za transkripciju triju najve}ih vrsta rRNA ozna~enih kao 28S, 18S i 5,8S, u skladu s brzinom njihove sedimentacije. RNA-polimeraza III prepisuje gene za tRNA i za najmanju ribosomnu RNA (5S rRNA). Neke od malih RNA djelatnih u prekrajanju RNA i prijenosu proteina (snRNA i scRNA) tako|er se prepisuju s pomo}u RNA-polimeraze III, dok su ostali transkripti nastali djelovanjem polimeraze II. Uz to, posebne RNA-polimeraze (sli~ne bakterijskim RNA-polimerazama) nalaze se u kloroplastima i mitohondrijima, gdje specifi~no prepisuju DNA tih organela. Sve su tri jezgrine RNA-polimeraze sloèni enzimi koji se sastoje od 12 do 17 razli~itih podjedinica. Premda prepoznaju razli~ite promotore i prepisuju razli~ite skupine gena, po nekim su svojstvima me|usobno sli~ne pa ~ak i s bakterijskom RNA-polimerazom. Posebice, sve tri RNA-polimeraze sadràvaju devet konzerviranih podjedinica, od kojih su pet sli~ne a, b, b' i w podjedinicama bakterijske RNA-polimeraze. Nedavno kristalografsko odre|ivanje strukture kva{~eve RNA-polimeraze II ponovno je pokazalo kaTablica 6-1. Skupine gena prepisanih eukariotskim RNApolimerazama
Vrsta sintetizirane RNA
nuklearni geni mRNA tRNA rRNA 5,8S, 18S, 28S 5S snRNA i scRNA mitohondrijski geni kloroplastni geni
RNApolimeraza
II III I III II i IIIa mitohondrijskab kloroplastnab
a Neke male nuklearne (sn) i male citoplazmatske (sc) RNA prepisuju se polimerazom II, a druge polimerazom III. b Mitohondrijske i kloroplastne RNA-polimeraze sli~ne su bakterijskim enzimima.
240
Poglavlje 6
Slika 6-11. Struktura kva{~eve RNA-polimeraze II.

Podjedinice su prikazane u razli~itim bojama. (Od P . D. Kramer i sur., 2001. Science 292: 1863.)
ko je arhitektura ove eukariotske RNA-polimeraze vrlo sli~na bakterijskom enzimu (slika 6-11), sugeriraju}i da sve RNA-polimeraze rabe temeljni konzervirani mehanizam za transkripciju DNA.
Transkripcijski faktori i zapo~injanje transkripcije s pomo}u RNA-polimeraze II

U àri{tu ve}ine studija transkripcije nalazi se RNA-polimeraza II s obzirom na to da je odgovorna za sintezu mRNA gena koji kodiraju proteine. Rani poku{aji prou~avanja tog enzima pokazali su da je njegova aktivnost razli~ita od prokariotske RNA-polimeraze. To~no prepisivanje bakterijskih gena, {to se moè savr{eno izvesti in vitro jednostavnim dodatkom pro~i{}ene RNA-polimeraze molekuli DNA koja sadràva promotor, nije mogu}e u eukariotskom sustavu. Osnova ove razlike utvr|ena je 1979. godine kada je Robert Roeder sa suradnicima otkrio da je RNA-polimeraza sposobna zapo~eti transkripciju samo ako su u reakciji prisutni dodatni proteini. Tako se ~ini kako su za transkripciju u eukariotskom sustavu potrebni razli~iti inicijacijski faktori, koji (za razliku od bakterijskih s faktora) nisu zdruèni s polimerazom. Biokemijskim frakcioniranjem jezgrinog ekstrakta identificirani su specifi~ni proteini (nazvani transkripcijski faktori) koji su potrebni RNA-polimerazi za zapo~injanje transkripcije. Identifikacija i karakterizacija ovih faktora predstavlja najve}i dio nastojanja za razumijevanjem transkripcije u eukariotskim stanicama. Utvr|ene su dvije osnovne skupine transkripcijskih faktora. Op}i transkripcijski faktori djelatni su u transkripciji svih promotora polimeraze II i ~ine dio bazne transkripcijske ma{inerije. Transkripcijski faktori specifi~ni za gene (razmatrani dalje u ovom poglavlju) veù se na sljedove DNA koji kontroliraju ekspresiju individualnih gena pa su tako odgovorni za gensku ekspresiju. Procijenjeno je kako oko 5% gena ljudskoga genoma kodira transkripcijske faktore, nagla{uju}i zna~enje ovih proteina. Za zapo~injanje transkripcije RNA-polimerazom II u uspostavljenom (rekonstituiranom) in vitro sustavu (slika 6-12) potrebno je pet op}ih transkripcijskih faktora. Promotori mnogih gena koji se prepisuju RNA-polimerazom II uklju~uju slijed sli~an TATAA 25 do 30 nukleotida uzvodno od po~et-
241
Slika 6-12. Stvaranje transkripcijskoga kompleksa polimeraze II.

Mnogi promotori polimeraze II imaju TATA-slog (usugla{eni slijed TATAA) 25 do 30 nukleotida uzvodno od po~etnoga mjesta za transkripciju. Taj slijed prepoznaje transkripcijski faktor TFIID koji se sastoji od TATA-veznoga proteina (TBP) i faktora zdruènih s TBP (TAF). TFIIB se potom veè na TBP nakon ~ega , slijedi vezanje polimeraze u asocijaciji s TFIIF. Na kraju se TFIIE i TFIIH pridruùju kompleksu.
TATAA TAF TAF TAF vezanje TFIID
TBP
noga transkripcijskog mjesta. Taj slijed (nazvan TATA-slog) nalikuje 10 slijedu u bakterijskim promotorima, a rezultati uvo|enja mutacija u TATA-slog upozorili su na njegovu ulogu u zapo~injanju transkripcije. Prvi je korak u nastanku transkripcijskoga kompleksa vezanje op}ega transkripcijskog faktora nazvanog TFIID na TATA-slog (TF ozna~uje transkripcijski faktor; II ozna~uje polimerazu II). TFIID je i sam sloèn od vi{e podjedinica, kao {to su TBP protein koji se specifi~no veè na TATA, slog i oko 10 polipeptida nazvanih faktori zdruèni s TBP (TAF). Nakon vezivanja TFIID slijedi pridruìvanje drugog op}eg transkripcijskog faktora (TFIIB) koji se veè na TBP kao i na sljedove DNA prisutne uzvodno od TATA-sloga u nekim promotorima (slika 6-13). TFIIB sluì kao most za RNA-polimerazu II koja se veè na kompleks TBP-TFIIB zdruèn s tre}im faktorom, TFIIF. Slijede}i pridruìvanje RNA-polimeraze II na promotor, za inicijaciju transkripcije potrebno je vezanje dvaju dodatnih faktora (TFIIE i TFIIH). TFIIH se sastoji iz vi{e podjedinica, a ima dvije va`ne uloge. Prvo, dvije su podjedinice TFIIH helikaze koje odmotavaju DNA oko inicijacijskog mjesta. (Te podjedinice TFIH jesu XPB i XPD proteini, potrebni za popravak izrezivanjem nukleotida, koji je opisan u 5. poglavlju) Druga je podjedinica TFIIH proteinkinaza koja fosforilira ponavljane sljedove prisutne u podru~ju C-kraja najve}e podjedinice RNA-polimeraze II. C-terminalni dio polimeraze II (ili CTD) sastoji se iz uzastopnih ponavljanja (27 ponavljanja u kvasca, a 52 u ~ovjeka) od 7 aminokiselina s usugla{enim slijedom Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Fosforilacija ovih aminokiselina osloba|a polimerazu iz njezina zdruènja s preinicijacijskim kompleksom i vodi do pridruìvanja drugih proteina koji dopu{taju polimerazi da zapo~ne transkripciju te dalje sintetizira rastu}i lanac mRNA.
vezanje TFIIB TAF TAF TAF
TBP B vezanje polimeraze i TFIIF TAF TAF TAF F TBP B polimeraza
CTD
vezanje TFIIE i TFIIH TAF TAF TAF
TBP
polimeraza E H RNA
+1
242
Poglavlje 6
Slika 6-13. Model kompleksa TBP-TFIIB vezanoga na DNA.

DNA je prikazana kao {tapi}asta struktura koja se sastoji se od ùtoga i zelenoga lanca s po~etnim mjestom za transkripciju ozna~enim +1. TBP se sastoji od dvaju ponavljanja obojena svijetloplavo i tamnoplavo. TFIIB ponavljanja obojena su naran~asto i grimizno. Va`no je zamijetiti da vezanje TBP savija DNA za oko 110. ( Od D. B. Nikolov i sur., 1995. Nature 377: 119.)
+1
43
Uz TATA-slog promotori mnogih gena koji se prepisuju RNA-polimerazom II imaju jo{ jedan vaàn element (inicijator, ili Inr slijed) koji se proteè unutar po~etnoga mjesta za transkripciju. [tovi{e, neki promotori RNA-polimeraze II sastoje se samo od Inr elementa, bez TATA-sloga. Mnogi promotori koji ne sadràvaju TATA-slog, a sadràvaju Inr element, tako|er imaju jo{ jedan nizvodni promotorski element (DPE) smje{ten oko 30 parova baza nizvodno od po~etnoga mjesta za transkripciju koji kooperativno funkcionira s Inr slijedom. Inicijacija tih promotora zahtijeva TFIID (i TBP), premda TBP o~ito ne prepoznaje takve promotore izravnim vezivanjem na TATA-slog. Umjesto toga ~ini se da se podjedinice TFIID (TAF) veù na Inr i DPE. Vezanje TAF na ove elemente pridruùje TBP TFIIB i polimerazu II , promotoru, nakon ~ega se zdruùju ostali transkripcijski faktori kako je ve} opisano. TBP tako igra sredi{nju ulogu u inicijaciji transkripcije polimerazom II, ~ak i ako promotori ne posjeduju TATA-slog. Premda ovdje opisano sekvencijsko pridruìvanje pet op}ih transkripcijskih faktora i RNA-polimeraze II predstavlja minimalni sustav potreban za transkripciju in vitro, u stanici su potrebni dodatni faktori. Oni obuhva}aju posredni~ki proteinski kompleks koji omogu}uje da polimeraza odgovori na transkripcijske faktore specifi~ne za gene koji reguliraju gensku ekspresiju. Najmanje je jedan dio RNA-polimeraze II u kvasca i u stanicama sisavaca prisutan u obliku velikog kompleksa (nazvan RNA-polimeraza II holoenzim) u kojem je polimeraza zdruèna s posredni~kim proteinima, kao i sa skupinom op}ih transkripcijskih faktora uklju~uju}i TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH. Posredni~ki su proteini zdruèni s domenom na C-kraju (CTD) polimeraze II, a osloba|aju se s polimeraze prate}i zdruìvanje preinicijacijskoga kompleksa i fosforiliranje polimerazne domene na C-kraju (slika 6-14). Fosforilirana CTD potom veè ostale proteine koji promi~u elongaciju transkripcije i djeluju u procesu dorade mRNA, {to }emo prikazati dalje u ovom poglavlju.
243
Slika 6-14. RNA-polimeraza II/ posredni~ki kompleks.

TAF TAF F E H fosforiliranje CTD inicijacija transkripcije polimeraza
posrednik
TBP B CTD
RNA-polimeraza II zdruèna je s posredni~kim proteinima, kao i s op}im transkripcijskim faktorima na promotoru. Posredni~ki se kompleks veè na nefosforilirani CTD polimeraze II, a osloba|a se nakon fosforiliranja CTD kad je zapo~eta transkripcija. Fosforilirani CTD potom veè elongacijske i doradbene faktore koji olak{avaju sintezu i doradu mRNA.
TAF TAF posrednik F B P H E CTD P P P elongacijski i doradbeni faktori RNA polimeraza
TBP
Transkripcija polimerazom I i III

Kako je ranije razmatrano, razli~ite RNA-polimeraze odgovorne su za transkripciju gena koji kodiraju ribosomne i transportne RNA u eukariotskim stanicama. Me|utim, sve tri RNA-polimeraze trebaju dodatne transkripcijske faktore zdruène s odgovaraju}im promotorskim sljedovima. Nadalje, premda tri razli~ite polimeraze u eukariotskim stanicama prepoznaju razli~ite vrste promotora, ~ini se da je transkripcijski faktor koji se veè na TATAslog (TBP) potreban za inicijaciju transkripcije bilo kojim od tri enzima. RNA-polimeraza I posve}ena je isklju~ivo transkripciji gena za ribosomne RNA, prisutnih u uzastopnim ponavljanjima. Transkripcijom tih gena nastaje velika 45S pre-rRNA koja doradom daje 28S, 18S i 5,8S rRNA (slika 6-15). Promotor gena za ribosomne RNA obuhva}a oko 150 parova baza neposredno uzvodno od inicijacijskoga mjesta transkripcije. Te promotor-
promotor rDNA 150 +1
18S
5,8S
28S
transkripcija 45S pre-rRNA dorada 18S 5,8S 28S
Slika 6-15. Geni za ribosomnu RNA.

Ribosomna se DNA prepisuje daju}i velike molekule RNA (45S pre-rRNA koje se naknadno kidaju na 28S, 18S i 5,8S rRNA.
rRNAs
244
Poglavlje 6
Slika 6-16. Inicijacija transkripcije rDNA.

Dva transkripcijska faktora, UBF i SL1, kooperativno se veù na promotor rDNA i pridruùju RNA-polimerazu I stvaraju}i tako inicijacijski kompleks. Jedna podjedinica SL1 je TBP protein , koji se veè na TATA-slog.
SL1
TBP UBF polimeraza I
promotor rDNA
+1
ske sljedove prepoznaju dva transkripcijska faktora, UBF (faktor koji se veè uzvodno, engl. upstream binding factor) i SL1 (faktor selekcije 1, engl. selectivity factor 1), koji se kooperativno veù na promotor a potom im se pridruùje polimeraza I te time nastaje inicijacijski kompleks (slika 6-16). SL1 transkripcijski faktor sastoji se od ~etiri podjedinice, a jedna od njih je TBP . Uloga TBP izravno je pokazana nalazom da su kvasci nositelji mutacije u TBP defektni ne samo u transkripciji gena polimerazom II, nego i u transkripciji gena polimerazama I i III. Tako je TBP zajedni~ki transkripcijski faktor potreban za sve tri vrste eukariotskih RNA-polimeraza. S obzirom na to da geni koji kodiraju ribosomne RNA nemaju TATA-slog, TBP se ne veè na specifi~ni promotorski slijed. Umjesto toga, zdruènje TBP s genima za ribosomne RNA posredovano je vezanjem drugih proteina iz SL1 kompleksa na promotor {to je sli~no zdruìvanju TBP s Inr sljedovima gena koje prepisuje polimeraza II, a koji nemaju TATA-slog. Geni za tRNA, 5S rRNA i neke male molekule RNA djelatne u prekrajanju RNA i prijenosu proteina prepisuju se polimerazom III. Ti se geni prepisuju od tri razli~ite skupine promotora, od kojih su dva smje{tena unutar, a ne uzvodno od sljeda koji se prepisuje (slika 6-17). Najvi{e prou~avani geni od svih koji se prepisuju polimerazom III jesu geni za 5S rRNA àbe roda Xenopus. TFIIIA (prvi pro~i{}eni transkripcijski faktor) inicira zdruìvanje transkripcijskoga kompleksa vezanjem na specifi~ne sljedove DNA u 5S rRNA promotoru. To je vezanje pra}eno sekvencijskim vezanjem TFIIIC, TFIIIB i polimeraze. Promotori gena za tRNA razlikuju se od 5S rRNA promotora time {to ne posjeduju slijed DNA koji prepoznaje TFIIIA. Umjesto toga TFIIIC se izravno veè na promotore gena za tRNA, {to uzrokuje pridruìvanje TFIIIB i polimeraze i nastanak transkripcijskoga kompleksa. Promotori tre}e skupine gena prepisivanih polimerazom III, uklju~uju}i i gene za male jezgrine RNA djelatne u prekrajanju RNA, smje{teni su uzvodno od po~etnoga transkripcijskog mjesta. Ti promotori imaju TATA-slog (sli~no promotorima za polimerazu II) kao i vezna mjesta za druge faktore nazvane SNAP SNAP i TFIIIB veù se kooperativno na promotore, s tim da . se TFIIIB izravno veè na TATA-slog. Vezanje je posredovano proteinom koji se veè na TATA-slog, TBP podjedinicom TFIIIB. Kao i u slu~aju promo, tora za ostale gene prepisivane polimerazom III, TFIIIB potom pridruùje polimerazu u transkripcijski kompleks.
Regulacija transkripcije u eukariota

Premda je kontrola ekspresije gena puno sloènija u eukariotima nego u bakterijama, vrijede isti temeljni principi. Ekspresija eukariotskih gena primarno je kontrolirana na razini inicijacije transkripcije, a u mnogim slu~ajevima i tijekom elongacije. Kao i kod bakterija, transkripcija u eukariotskim stanicama kontrolirana je proteinima koji se specifi~no veù za regulatorne sljedove i moduliraju aktivnost RNA-polimeraze. Me|utim, va`na razlika
245
5S rRNA
TFIIIB TFIIIC polimeraza III TBP TFIIIA
Slika 6-17. Transkripcija gena polimerazom III.

Geni koje prepisuje polimeraza III eksprimiraju se s pomo}u dvije vrste promotora. Promotori gena za 5S rRNA i tRNA nalaze se nizvodno od mjesta inicijacije transkripcije. Transkripcija gena za 5S rRNA je inicirana vezanjem TFIIIA nakon ~ega slijedi vezanje TFIIIC, TFIIIB i polimeraze. Promotori za tRNA ne sadràvaju vezno mjesto za TFIIIA, a on nije ni potreban za njihovu transkripciju. Umjesto toga, TFIIIC inicira transkripciju tRNA gena vezanjem na promotorski slijed, a potom se zdruùju TFIIIB i polimeraza. Promotor gena za U6 snRNA je uzvodno od po~etnog mjesta za transkripciju i sadràva TATA-slog koji prepoznaje TBP koja , veè TATA-slog podjedinica transkripcijskoga faktora TFIIIB u kooperaciji s drugim faktorom nazvanim SNAP .
+1 tRNA
promotor TFIIIB TFIIIC polimeraza III TBP
+1 U6 snRNA
promotor TFIIIB
SNAP TBP TATA promotor
polimeraza III
+1
izme|u regulacije transkripcije u prokariotskim i eukariotskim stanicama, rezultat je pakiranja eukariotske DNA u kromatin koji ograni~ava raspoloìvost DNA kao kalupa za transkripciju. Stoga, modifikacija kromatinske strukture igra klju~nu ulogu u kontroli transkripcije u eukariotskim stanicama.
cis-Djeluju}i regulatorni sljedovi: promotori i poja~iva~i

Kako je upravo obrazloèno, transkripcija je u bakterijama regulirana vezanjem proteina na cis-djeluju}e sljedove (primjerice lac operator) koji kontroliraju transkripciju susjednih gena. Sli~ni cis-djeluju}i sljedovi reguliraju ekspresiju eukariotskih gena. Ti su sljedovi identificirani u stanicama sisavaca primjenom testa prijenosa gena za ispitivanje vjerojatnih regulatornih podru~ja kloniranih gena (slika 6-18). Eukariotski regulatorni sljedovi obi~no su vezani na reporterski gen koji kodira enzim jednostavan za detekciju. Ekspresija reporterskog gena nakon prijenosa u kultivirane stanice omogu}uje osjetljivo ispitivanje sposobnosti kloniranih regulatornih sljedova da upravljaju transkripcijom. Biolo{ki aktivna regulatorna podru~ja mogu se tako utvrditi, a in vivo mutageneza primjenjuje se za utvr|ivanje uloge specifi~nih sljedova unutar odre|enog podru~ja. Geni koji se prepisuju RNA-polimerazom II imaju sr`ne promotorske elemente, zajedno s TATA-slogom i Inr slijedom koji sluè kao vezna mjesta
246
Poglavlje 6
regulatorni slijed reporterski gen plazmidna DNA
Slika 6-18. Identificiranje eukariotskih regulatornih sljedova.

Regulatorni slijed kloniranoga eukariotskoga gena spojen je s reporterskim genom. Reporterski gen kodira enzim ~iju je aktivnost lako detektirati. Nastali plazmid potom se uvodi u kulturu stanica primatelja transfekcijom. Aktivni regulatorni slijed upravlja transkripcijom reporterskoga gena, a njegova se ekspresija detektira u transficiranim stanicama.
transfekcija stanica primatelja
ekspresija reporterskoga gena
za op}e transkripcijske faktore. Drugi cis-djeluju}i sljedovi sluè kao vezna mjesta za {iroku lepezu regulatornih faktora koji kontroliraju ekspresiju individualnih gena. Cis-djeluju}i regulatorni sljedovi su ~esto, ali ne uvijek, smje{teni uzvodno od TATA-sloga. Primjerice, dva regulatorna slijeda, na|ena u mnogim eukariotskim genima, identificirana su istraìvanjem promotora gena koji kodira timidin-kinazu u virusu Herpes simplex (slika 6-19). Oba slijeda smje{tena su unutar 100 parova baza uzvodno od TATA-sloga: usugla{eni su njihovi sljedovi CCAAT i GGGCGG (nazvan GC-slog). Specifi~ni proteini koji se veù na te sljedove i stimuliraju transkripciju tako|er su identificirani. Nasuprot relativno jednostavnoj organizaciji CCAAT i GC-slogova u promotoru gena za timidin-kinazu kod herpes-virusa, mnoge gene u stanicama sisavaca kontroliraju regulatorni sljedovi smje{teni vrlo daleko (ponekad vi{e od 10 kilobaza) od po~etnoga transkripcijskog mjesta. Ti sljedovi, nazvani poja~iva~i (engl. enhancer), prvotno su identificirani tijekom istraìvanja promotora jednoga drugog virusa, SV40 (slika 6-20). Za u~inkovitu transkripciju kontroliranu tim promotorom, osim TATA-sloga potrebni su i {est GC-slogova te dva ponavljanja od 72 para baza smje{tena dalje uzvodno. Utvr|eno je da ti sljedovi stimuliraju transkripciju od drugih promotora kao i od SV40 te da, iznena|uju}e, njihova aktivnost ne ovisi ni o udaljenosti niti o orijentaciji u odnosu na mjestro zapo~injanja transkripcije mjesto (slika 6-21). Oni mogu stimulirati transkripciju bez obzira na to jesu li smje{teni uzvodno ili nizvodno od promotora, ili u orijentaciji naprijed ili nazad. Sposobnost poja~iva~a da djeluju i kad su vrlo udaljeni od inicijacijskog mjesta za transkripciju sugerirala je u prvi mah da oni funkcioniraju po drugom principu od promotora. Me|utim, ta je pretpostavka odba~ena: poja~iva~i, sli~no promotorima, funkcioniraju vezanjem transkripcijskih faktora koji potom mogu regulirati RNA-polimerazu. To je mogu}e s obzirom na postojanje om~i DNA {to omogu}uje transkripcijskim faktorima vezanim na udaljene poja~iva~e da stupaju u interakciju s proteinima zdruènim s RNA-polimerazom na promotoru (slika 6-22). Tako transkripcijski faktori vezani na udaljene poja~iva~e djeluju na isti na~in kao i oni vezani na susjedne promotore, {to zna~i da nema fundamentalne razlike izme|u djelovanja poja~iva~a i cis-djeluju}ih regulatornih sljedova u susjedstvu po-
mRNA
GGGCGG CCAAT GGGCGG TATAA
100
75
50
25
+1
Slika 6-19. Eukariotski promotor.

Promotor gena za timidin-kinazu virusa Herpes simplex sadrì tri sljedna elementa uzvodno od TATA-sloga koji su potrebni za u~inkovitu transkripciju: CCAAT-slog i dva GC-sloga (usugla{eni slijed GGGCGG).
247
poja~iva~
promotor
TATAA
mRNA
Slika 6-20. SV40 poja~iva~.

SV40 promotor za ranu ekspresiju gena sadràva TATA-slog i {est GC-slogova aranìranih u tri niza ponavljaju}ih sljedova. Osim toga, za u~inkovitu transkripciju, potreban je uzvodni poja~iva~ koji se sastoji od dva ponavljanja od po 72 para baza (pb).
ponavljanja od po 72 pb
GC slog
+1
~etnog mjesta za transkripciju. Zanimljivo je da su poja~iva~i prvo identificirani u stanicama sisavaca, a potom na|eni i u bakterijama neobi~an slu~aj da istraìvanja eukariota sluè kao model za jednostavnije prokariotske sustave. Vezanje specifi~nih transkripcijskih regulatornih proteina na poja~iva~e odgovorno je za kontrolu ekspresije gena tijekom razvoja i diferencijacije, kao i za odgovor stanica na hormone i faktore rasta. Jedan od najbolje istraènih poja~iva~a sisavaca kontrolira transkripciju gena za imunoglobulin u B limfocitima. Pokusima prijenosa gena utvr|eno je da je imunoglobulinski poja~iva~ aktivan samo u limfocitima, a ne i u drugim vrstama stanica. Tako je ovaj regulatorni slijed djelomi~no odgovoran za specifi~nu tkivnu eks-
(A) osnovna transkripcija P (B) gen
stimulirana transkripcija E (C) gen
stimulirana transkripcija E (D) gen
stimulirana transkripcija j gen (E) E
Slika 6-21. Djelovanje poja~iva~a.

Bez poja~iva~a gen se prepisuje na niskoj osnovnoj razini (A). Dodatkom poja~iva~a E, primjerice, SV40 72 pb ponavljanja, stimulira transkripciju. Poja~iva~ je aktivan ne samo kad je smje{ten neposredno uzvodno od promotora (B), nego i kad je uba~en nekoliko kilobaza uzvodno ili nizvodno od startnoga transkripcijskoga mjesta (C i D). Osim toga, poja~iva~ je aktivan u obje orijentacije, naprijed i nazad (E).
stimulirana transkripcija E gen
248
Poglavlje 6
Slika 6-22. Stvaranje om~e DNA.

Transkripcijski faktori vezani na udaljene poja~iva~e u stanju su stupati u interakciju s kompleksom RNA-polimeraza/posrednik ili op}im transkripcijskim faktorima na promotoru. Razlog tomu su om~e {to ih moè stvarati DNA. Nema temeljne razlike izme|u djelovanja transkripcijskih faktora vezanih na DNA neposredno uzvodno od promotora i udaljenog poja~iva~a.
om~a DNA
inicijacijski kompleks
presiju imunoglobulinskih gena u odgovaraju}i diferenciranim vrstama stanica. Vaàn je aspekt poja~iva~a to {to oni sadràvaju vi{e funkcionalnih elemenata koji veù razli~ite regulatorne proteine. Kada djeluju zajedno, ti proteini reguliraju ekspresiju gena. Poja~iva~ te{koga lanca imunoglobulina, primjerice, obuhva}a oko 200 baznih parova i sadràva najmanje devet razli~itih elemenata koji sluè kao vezna mjesta za proteine (slika 6-23). Mutacija bilo kojeg od sljedova smanjuje, ali ne uni{tava poja~iva~ku aktivnost, upu}uju}i na to da su funkcije individualnih proteina koji se veù na poja~iva~ barem dijelomi~no suvi{ne. Mnogi od pojedina~nih sljedova imunoglobulinskog poja~iva~a sami po sebi stimuliraju transkripciju u nelimfoidnim stanicama. Stoga ograni~ena aktivnost cijelog poja~iva~a u B limfocitima nije rezultat specifi~ne tkivne funkcije svake od njegovih komponenti. Umjesto toga, specifi~na tkivna ekspresija posljedica je kombinacije individualnih sljednih elemenata koji upotpunjuju cijeli poja~iva~. Ti elementi obuhva}aju neke cis-djeluju}e regulatorne sljedove koji veù transkripcijske aktivatore, specifi~no eksprimirane u B limfocitima, kao i druge regulatorne sljedove koji veù represore u nelimfoidnim stanicama. Prema tome, imunoglobulinski poja~iva~ ima negativne regulatorne elemente koji inhibiraju transkripciju u neodgovaraju}oj vrsti stanica, ali i pozitivne regulatorne elemente koji aktiviraju transkripciju u B limfocitima. Ukupna aktivnost poja~iva~a ve}a je od zbroja pojedina~nih aktivnosti, odraàvaju}i kombinirano djelovanje proteina zdruènih sa svakim individualnim slijedom. Premda stvaranje om~i u molekuli DNA omogu}uje poja~iva~ima da djeluju sa znatne udaljenosti od promotora, aktivnost bilo kojeg poja~iva~a
200 parova baza
mE1
mE5
mE2
mE3
mB
mE4
OCT
Slika 6-23. Imunoglobulinski poja~iva~.

Poja~iva~ imunoglobulinskoga te{kog lanca premo{}uje oko 200 baza i sadràva devet funkcionalnih sljednih elemenata (E, E1-5, , mB i OCT), koji zajedno stimuliraju transkripciju u B limfocitima.
249
specifi~na je za promotor odre|enoga ciljanoga gena. Ta se specifi~nost odràva s pomo}u izolatora koji dijele kromosome u neovisna podru~ja i sprje~avaju poja~iva~e da djeluju na promotore smje{tene u susjednom podru~ju. Izolatori tako|er sprje~avaju {irenje kromatinske strukture jedne domene na susjedstvo, ~ime odràvaju neovisno regulirana podru~ja genoma.
Transkripcijski regulatorni proteini

Izoliranje velikoga broja razli~itih transkripcijskih regulatornih proteina utemeljeno je na njihovom specifi~nom vezanju na promotorske ili poja~iva~ke sljedove. Vezivanje proteina na sljedove DNA analizirano je na dva na~ina. Prvi na~in, otisak stopala opisan je prije u svezi s vezivanjem RNA-polimeraze na prokariotske promotore (vidi sliku 6-3). Drugi je na~in test pomaka u elektroforeti~koj pokretljivosti, u kojem se radioaktivno ozna~eni fragment DNA inkubira s proteinima, a potom podvrgne elektroforeti~kom razdvajanju na nedenaturiraju}em gelu (slika 6-24). Vezanje proteina detektira se kao smanjenje elektroforeti~ke pokretljivosti fragmenta DNA, s obzirom na to da je njegovo kretanje kroz gel usporeno vezanim proteinom. Kombinirana primjena otiska stopala i pomaka u elektroforeti~koj pokretljivosti omogu}ila je usporedbu veznih mjesta za proteine s regulatornim elementima poja~iva~a i promotora te pokazala da su ti sljedovi op}enito mjesta prepoznavanja specifi~nih proteina koji se veù na DNA. Robert Tjian i suradnici prvi su identificirali jedan od prototipova eukariotskoga transkripcijskog faktora istraùju}i transkripciju SV40 DNA. Utvr|eno je da taj faktor (nazvan Sp1, od engl. specificity protein 1) stimulira transkripciju od SV40 promotora, ali ne od nekoliko drugih promotora u bezstani~nim ekstraktima (engl. cell-free extracts). Tako|er je utvr|eno da stimulacija transkripcije Sp1 ovisi o prisutnosti GC-slogova u SV40 promotoru: ako su ti sljedovi uklonjeni sprije~ena je stimulacija s pomo}u Sp1. [tovi{e, pokusima otiska stopala utvr|eno je da se Sp1 specifi~no veè na GC-slogove. Uzev{i sve u obzir, rezultati upu}uju na to da GC-slog predstavlja specifi~no vezno mjesto za aktivator transkripcije Sp1. Sli~ni pokusi pokazali su da mnogi drugi transkripcijski regulatorni sljedovi, zajedno s
fragment DNA dioba uzorka protein inkubacija s proteinom protein vezan na DNA inkubacija bez proteina
Slika 6-24. Test pomaka u elektroforeti~koj pokretljivosti.

elektroforeza autoradiografija
kompleks DNA-protein
slobodna DNA
Uzorak koji sadràva radioaktivno ozna~eni fragment DNA podijeli se u dva dijela te se jedna polovica inkubira s proteinom koji se veè na specifi~ni slijed DNA. Uzorci se potom analiziraju elektroforezom u nedenaturiraju}em gelu (protein ostaje vezan na DNA). Vezanje proteina utvr|uje se usporedbom usporene migracije kompleksa DNA-protein u odnosu na slobodnu DNA. Samo je dio DNA u uzorku vezan na protein pa se mogu detektirati i kompleks DNAprotein i slobodna DNA u uzorku inkubiranom s proteinom.
250
Poglavlje 6
Tablica 6-2. Primjeri transkripcijskih faktora i njihovih veznih mjesta za DNA

Transkripcijski faktor
Specifi~ni protein 1 (Sp1) CCAAT/Protein koji se veè na poja~iva~ (C/EBP) Aktivatorski protein 1 (AP1) Protein koji se veè na oktamere (OCT-1 i OCT-2) Proteini koji se veù na E-slog (E12, E47, E2-2)
a
Usugla{eno vezno mjesto

GGGCGG CCAAT TGACTCA ATGCAAAT CANNTGa
N ozna~ava bilo koji nukleotid.
CCAAT-slogom i razli~itim drugim elementima imunoglobulinskog poja~iva~a, tako|er predstavljaju mjesta prepoznavanja za proteine koji se veù na specifi~ne sljedove DNA. Specifi~no vezanje Sp1 na GC-slog ne predstavlja samo djelovanje Sp1 kao transkripcijskoga faktora, nego i op}i pristup pro~i{}avanju transkripcijskih faktora. Izolacija tih proteina prvotno je bila golem izazov s obzirom na to da su prisutni u vrlo malim koli~inama (primjerice svega 0,001% ukupnih stani~nih proteina) koje je te{ko pro~istiti konvencionalnim biokemijskim tehnikama. Problem je otklonjen pro~i{}avanjem Sp1 DNA-afinitetnom kromatografijom (slika 6-25). Mnogobrojne kopije oligonukleotida,
kuglica agaroze
GC-slog DNA Sp1 smjesa stani~nih proteina pufer s visokom koncentracijom soli
Sp1 vezan na kolonu
Slika 6-25. Pro~i{}avanje Sp1 s pomo}u DNA-afinitetne kromatografije.

Dvolan~ani oligonukleotid koji sadràva ponavljane GC-slogove veè se na agarozne kuglice smje{tene u kolonu. Smjesa stani~nih proteina, koja sadràva Sp1, nanese se na kolonu; s obzirom na specifi~no vezanje Sp1 na GC-slog oligonukleotida, Sp1 zadràva se na koloni dok drugi proteini prolaze kroz nju. Ispiranje kolone puferom s visokom koncentracijom soli izaziva disocijaciju Sp1 od GC-sloga DNA, daju}i pro~i{}eni Sp1.
GC-slog DNA kolona pro~i{}eni Sp1 drugi proteini prolaze kroz kolonu
251
Izolacija eukariotskoga transkripcijskoga faktora

Affinity purification of Sequence-Specific DNA-Binding Proteins James T. Kadonaga and Robert Tjian
University of California, Berkeley Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1986, Volume 83, pages 58895893
Kontekst
S istraìvanjima lac operona Jacoba i Monoda postalo je jasno da je transkripcija regulirana proteinima koji se veù na specifi~ne sljedove DNA. Jedan od prototipnih sustava za studiranje genske ekspresije u eukariotskim stanicama jest majmunski virus SV 40, u kojem je identificirano nekoliko regulator nih sljedova DNA jo{ ranih 80-ih godina pro{loga stolje}a. William Dynan i Robert Tjian pokazali su 1983. da je jedan od tih sljednih elemenata (GC-slog) specifi~no vezno mjesto za protein koji 205,0 se moè detektirati u nuklear nom ekstraktu humanih stanica. Pro116,0 tein (nazvan Sp1 za specifi~ni protein 1) 97,4 ne veè se samo za GC-slog, on tako|er stimulira transkripciju 66,0 in vitro, pokazuju}i da je transkripcijski aktivator. Da bi se mogao prou~avati mehanizam djelovanja Sp1, 45,0 bilo je potrebno imati transkripcijski faktor u ~istom obliku i eventualno klonirati Sp1 gen. Izolacija ~istog 29,0 Sp1 bila je nu`na, ali
1 2
istodobno je to bio zastra{uju}i tehni~ki izazov. Sp1 i drugi transkripcijski faktori predstavljaju samo oko 0,001% ukupnih stani~nih proteina, tako da se oni ne mogu pro~istiti konvencionalnim biokemijskim tehnikama. James Kadonaga i Robert Tjian rije{ili su taj problem razvitkom metode DNA-afinitetne kromatografije, metode kojom su pro~i{}eni Sp1 i mnogi drugi eukariotski transkripcijski faktori, otvaraju}i tako vrata za molekularnu analizu regulacije transkripcije u eukariotskim stanicama.
Robert Tjian
ekstrakt dodan na po~etku na kolonu sloèna mje{avina proteina (vidi sliku). Suprotno tome, oko 90% proteina ponovno dobivenih nakon dvaju ciklusa DNA-afinitetne kromatografije predstavljaju dva polipeptida, koji su identificirani kao Sp1 na osnovi vezanja na DNA i djelovanja na transkripciju u in vitro testovima. Tako je Sp1 uspje{no pro~i{}en DNA-afinitetnom kromatografijom.
Eksperiment
Metoda DNA-afinitetne kromatografije Kadonage i Tjiana koristila je specifi~no visoko-afinitetno vezanje Sp1 na GC-slog, GGGCGG. Sinteti~ki oligonukleotidi koji sadràvaju mnogobrojne kopije tog slijeda vezani su na ~vrste kuglice, a grubi nuklearni ekstrakt prolazio je kroz kolonu koja je sadràvala kuglice na kojima je vezan GC-slog. Kuglice su potom oprane da bi se isprali proteini koji se nisu specifi~no vezali na oligonukleotide. Kona~no su kuglice oprane u puferu s visokom koncentracijom soli (0,5 M KCl) {to raskida vezu Sp1 i DNA, osloba|aju}i tako Sp1 s kolone. Gel-elektroforeza pokazala je da je grubi nuklearni
Utjecaj
U ~lanku iz 1986. godine, Kadonaga i Tjian tvrdili su kako se tehnika DNA-afinitetne kromatografije moè op}enito primijeniti u pro~i{}avanju drugih proteina koji se specifi~no veù sljedove DNA. Pretpostavka je potvr|ena pro~i{}avanjem brojnih eukariotskih transkripcijskih faktora upravo tom metodom. Geni koji kodiraju druge transkripcijske faktore izolirani su alternativnim postupkom (neovisno razvijenim 1988. godine u laboratoriju Phillipa Sharpa i Stevena McKnighta) u kojem se cDNA ekspresijska knji`nica prosijava s oligonukleotidnom sondom da bi se detektirali proteini koji se specifi~no veù na odre|ene sljedove. Mogu}nost izolacije proteina koji se specifi~no veù na odre|ene sljedove DNA ovim metodama dovelo je do detaljne karakterizacije strukture i funkcije velikog broja transkripcijskih regulator nih proteina, osiguravaju}i temelj za na{e dana{nje razumijevanje genske ekspresije u eukariotskim stanicama.
Pro~i{}avanje Sp1. Gel-elektroforeza proteina po~etno prisutnih u grubom nuklearnom ekstraktu (kolona 1) i proteina dobivenih nakon jednoga (kolona 2) ili dva ciklusa DNA-afinitetne kromatografije (kolona 3). Veli~ina proteina markera (u kilodaltonima) ozna~ena je na lijevoj strani gela, a Sp1 polipeptida strjelicama.
252
Poglavlje 6
koji odgovaraju slijedu GC-sloga, vezane su na ~vrsti nosa~, a stani~ni ekstrakt prolazi kroz oligonukleotidnu kolonu. Po{to je Sp1 vezan na GC-slog jakim afinitetom, specifi~no je zadràn na koloni, dok ostali proteini nisu. Pro~i{}eni Sp1 mogao se tako ponovno dobiti i iskoristiti za daljnja istraìvanja poput odre|ivanja njegova aminokiselinskog slijeda i kloniranja Sp1 gena. Metoda DNA-afinitetne kromatografije, prvotno optimirana za pro~i{}avanje Sp1, uspje{no je kori{tena za izolaciju velikog broja proteina koji se veù na specifi~ne sljedove DNA iz eukariotskih stanica. Geni koji kodiraju druge transkripcijske faktore izolirani su pretraìvanjem cDNA ekspresijskih knji`nica na rekombinantni protein koji se veè na specifi~ne sljedove. Kloniranje i sekvenciranje cDNA za transkripcijske faktore omogu}ilo je brojne informacije o strukturi i funkciji ovih va`nih regulatornih proteina.
Struktura i funkcija transkripcijskih aktivatora

S obzirom na to da transkripcijski faktori imaju sredi{nju ulogu u regulaciji ekspresije gena, u razumijevanje mehanizama njihova djelovanja uloèni su znatni istraìva~ki napori. Najvi{e su istraèni transkripcijski aktivatori, koji se, sli~no Sp1, veù na regulatorne sljedove DNA i stimuliraju transkripciju. Op}enito, ti se faktori sastoje od dviju domena: jedna se domena specifi~no veè na DNA, a druga stimulira transkripciju stupanjem u interakciju s drugim proteinima, uklju~uju}i komponente transkripcijskog sustava (slika 6-26). Transkripcijski su faktori modularni proteini, u smislu da se DNA vezuju}a i aktiviraju}a domena razli~itih faktora moè me|usobno zamjenjivati s pomo}u tehnika rekombinantne DNA. Takvim manipulacijama nastaju hibridni transkripcijski faktori koji aktiviraju transkripciju vezanjem na promotorske ili poja~iva~ke sljedove kako je odre|eno njihovom veznom domenom. Iz toga proizlazi da je osnovna funkcija domene za vezanje na DNA sidrenje transkripcijskoga faktora na prikladno mjesto na DNA; aktivacijska domena potom neovisno stimulira transkripciju interakcijom protein-protein. Mnogi razli~iti transkripcijski faktori identificirani su u eukariotskim stanicama i, kako se o~ekivalo, pokazali su svu kompleksnost tkivno-specifi~ne i inducibilne genske ekspresije u sloènim vi{estani~nim organizmima. Molekularna je karakterizacija pak rasvijetlila sli~nost domena za vezanje na DNA u mnogih takvih proteina (slika 6-27). Domene cinkova prsta sadr-
Slika 6-26. Struktura transkripcijskih aktivatora.

Transkripcijski aktivatori sastoje se od dviju neovisnih domena. Domena koja se veè na DNA prepoznaje specifi~ni slijed DNA, a aktivacijska domena stupa u interakciju s drugim ~imbenicima transkripcijskoga sustava.
aktivacijska domena
domena koja se veè na DNA
posrednik
TATAA
253
(A) cinkovi prsti cinkov ion n a b-nabrana plo~a
(B) uzvojnica-okret-uzvojnica
2 1 3
(D) Uzvojnica-om~a-uzvojnica (C) leucinski zatvara~ uzvojnica postrani~ni lanac leucina
domena leucinskoga zatvara~a
om~a
uzvojnica koja veè DNA
uzvojnica koja veè DNA
Slika 6-27. Porodica domena koje se veù na DNA.
è ponavljanja cisteinskih i histidinskih ostataka koji veù cinkove ione i smotani su u om~e (prsti) {to se veù na DNA. Prvotno su te domene identificirane u transkripcijskom faktoru polimeraze III, TFIIIA, ali su prisutne i u transkripcijskim faktorima koji reguliraju promotore polimeraze II, kao i Sph1. Drugi primjeri transkripcijskih faktora {to sadràvaju domenu cinkova prsta jesu receptori za steroidne hormone, regulatori transkripcije gena u odgovoru na steroidne hormone, kao {to su estrogen i testosteron. Uzvojnica-okret-uzvojnica (engl. helix-turn-helix) motiv prvi je put prepoznat kod prokariotskih proteina koji se veù na DNA, kao {to je E. coli protein aktivator katabolizma (CAP). U tih proteina jedna uzvojnica ostvaruje ve}inu dodira s DNA, dok druga uzvojnica premo{}uje kompleks da bi stabilizirala interakciju. U eukariotskim stanicama proteini uzvojnicaokret-uzvojnica uklju~uju homeodomenske proteine koji su va`ni u regulaciji ekspresije gena tijekom embrionalnoga razvoja. Geni koji kodiraju te proteine najprije su otkriveni u razvojnim mutantama vinske mu{ice. Neke od najranije prepoznanih mutanti vinske mu{ice (nazvane, 1984. godine, homeotskim mutantama) dovode do razvoja mu{ica kod kojih je jedan dio tijela transformiran u drugi. Primjerice, u homeotskoj mutanti nazvanoj Antennapedia, noge, a ne antene, rastu iz glave mu{ice (slika 6-28). Pionirskim radom Eda Lewisa u ~etrdesetim godinama pro{loga stolje}a, napravljena je geneti~ka analiza te mu{ice i pokazalo se da ima devet homeotskih gena,
(A) Domena cinkova prsta sastoji se od nekoliko om~i u kojima jedna uzvojnica i -nabrana plo~a koordinativno veù cinkov ion. (B) Uzvojnica-okretuzvojnica domene sastoje se iz triju (ili u nekim slu~ajevima ~etiriju) uzvojitih podru~ja. Jedna uzvojnica (uzvojnica 3) ostvaruje ve}inu kontakata s DNA, dok uzvojnice 1 i 2 leè na vrhu i stabiliziraju interakciju. (C) Domene proteina s leucinskim zatvara~em koje se veù na DNA nastaju iz dvaju udaljenih polipeptidnih lanaca. Interakcije izme|u hidrofobnih postrani~nih lanaca leucinskih ostataka koji su izloèni na jednoj strani uzvojitog podru~ja (leucinski zatvara~) odgovorne su za dimerizaciju. Odmah nakon podru~ja leucinskoga zatvara~a slijedi uzvojnica koja veè DNA, a bogata je bazi~nim aminokiselinama. (D) Uzvojnica-om~a-uzvojnica domene sli~ne su leucinskom zatvara~u, osim {to se svaka dimerizacijska domena tih proteina sastoji od dvaju uzvojitih podru~ja razdvojenih om~om.
254
Poglavlje 6
Slika 6-28. Mutacija Antennapedia.
(A)
(B)
Antennapedia mutantne mu{ice imaju noge koje rastu iz njihovih glava na mjestu antene. (A) Glava normalne mu{ice. (B) Glava Antennapedia mutante. (Ljubazno{}u F. Rudolfa Turnera, Indiana University).
domena koja se veè na DNA
aktivacijska domena
interakcija s posrednikom i op}im transkripcijskim faktorima
modificiranje kromatinske strukture
Slika 6-29. Djelovanje transkripcijskih aktivatora

Eukariotski aktivatori stimuliraju transkripciju na dva na~ina. Oni stupaju u interakciju s posredni~kim proteinima i op}im transkripcijskim faktorima olak{avaju}i zdruìvanje transkripcijskoga kompleksa. Osim toga, oni mogu stupiti i u interakciju s koaktivatorima koji olak{avaju transkripciju modificiraju}i kromatinsku strukturu.
a svaki je od njih odgovoran za identitet odre|enoga dijela tijela. Molekularno kloniranje i analiza tih gena pokazali su da oni sadràvaju konzervirane sljedove od 180 parova baza (nazvane homeoslogovima) koji kodiraju domene transkripcijskih faktora {to se veù na DNA (homeodomene). Mnogo homeodomenskih proteina na|eno je u gljivama, biljkama i ìvotinjama, kao i kod ~ovjeka. Geni s homeoslogovima u kralje`njaka vrlo su sli~ni, strukturno i funkcionalno, takvim genima vinske mu{ice, {to govori o evolucijski vrlo o~uvanim ulogama tih transkripcijskih faktora u ìvotinjskom razvoju. Druge dvije porodice proteina koji se veù na DNA, proteini s leucinskim zatvara~em i uzvojnica-om~a-uzvojnica proteini, imaju vezne domene nastale dimerizacijom dvaju polipeptidnih lanaca. Leucinski zatvara~ sadràva ~etiri ili pet leucinskih ostataka razmaknutih u intervalima od po sedam aminokiselina, ~ime su njihovi hidrofobni postrani~ni lanci izloèni na jednoj strani uzvojnice. Taj dio uzvojnice sluì kao dimerizacijska domena za dvije proteinske podjedinice koje se drè zajedno hidrofobnim interakcijama postrani~nih lanaca leucina. Odmah nakon domene s leucinskim zatvara~em nalazi se domena bogata pozitivno nabijenim aminokiselinama (lizin i arginin) koja se veè na DNA. Proteini uzvojnica-om~a-uzvojnica sli~ne su strukture, osim {to je svaka njihova dimerizacijska domena izgra|ena od dviju uzvojnica razdvojenih om~om. Va`no je svojstvo transkripcijskih faktora tipa leucinskih zatvara~a ili uzvojnica-om~a-uzvojnica {to razli~iti ~lanovi ovih porodica mogu dimerizirati me|usobno. Tako kombinacija razli~itih proteinskih podjedinica moè stvarati veliki broj faktora koji se razlikuju, kako u prepoznavanju slijeda DNA na koji se veù, tako i u stimulaciji transkripcije. Proteini s leucinskim zatvara~em i proteini uzvojnica-om~a-uzvojnica va`ni su u regulaciji specifi~ne tkivne i inducibilne genske ekspresije, a nastanak dimera izme|u razli~itih ~lanova tih porodica vaàn je aspekt kontrole njihove funkcije. Aktiviraju}a domena nije tako dobro karakterizirana kao vezna domena. Neke, nazvane kiselim aktiviraju}im domenama, bogate su negativno nabijenim ostatcima (aspartat i glutamat), druge su pak bogate prolinima i glutaminima. Aktiviraju}e domene eukariotskih transkripcijskih faktora stimuliraju transkripciju na dva razli~ita na~ina (slika 6-29). Prema prvom mehanizmu, one reagiraju s posredni~kim proteinima i op}im transkripcijskim faktorima, kao {to su TFIIB ili TFIID, da bi pridruìli RNA-polimerazu i olak{ali zdruìvanje transkripcijskoga kompleksa na promotoru, sli~no transkripcijskim aktivatorima u bakterijama (vidi sliku 6-10). Nadalje, eukariotski transkripcijski faktori stupaju u interakciju s mnogim koaktivatori-
255
(A)
aktivator
Represor se natje~e s aktivatorom za vezanje na DNA. represor
TATAA (B) represorska domena domena koja veè DNA
Represor se veè na DNA i sprje~ava transkripciju interakcijom protein-protein.
posrednik
TATAA
Slika 6-30. Djelovanje eukariotskih represora.

(A) Neki represori sprje~avaju vezanje aktivatora na regulatorne sljedove. (B) Drugi represori posjeduju represijske domene koje inhibiraju transkripciju svojom interakcijom ili s posredni~kim proteinima ili s op}im transkripcijskim faktorima, ili, pak, s korepresorima koji modificiraju kromatinsku strukturu.
ma koji stimuliraju transkripciju modificiranjem strukture kromatina, kako }e biti prikazano dalje u ovom poglavlju.
Eukariotski represori
Ekspresija gena u eukariotskim stanicama regulirana je, kako represorima, tako i transkripcijskim aktivatorima. Sli~no prokariotskim represorima, eukariotski se represori veù na specifi~an slijed DNA i inhibiraju transkripciju. U nekim slu~ajevima eukariotski represori jednostavno interferiraju s vezanjem drugih transkripcijskih faktora na DNA (slika 6-30). Primjerice, vezanje represora u blizini po~etnoga mjesta za transkripciju moè sprije~iti interakciju RNA-polimeraze ili op}ih transkripcijskih faktora s promotorom, {to je sli~no djelovanju represora u bakterijama. Drugi se represori natje~u s aktivatorima za vezanje na specifi~an regulatorni slijed. Tako neki represori sadràvaju istu domenu za vezanje na DNA kao i aktivatori, ali nemaju njihovu aktivacijsku domenu. Posljedica je toga da njihovo vezanje na promotor ili poja~iva~ sprje~ava vezanje aktivatora na to mjesto ~ime je inhibirana transkripcija.
256
Poglavlje 6
U oprjeci spram receptora koji jednostavno interferiraju s vezanjem aktivatora, drugi represori (nazvani aktivnim represorima) imaju specifi~ne funkcionalne domene koje inhibiraju transkripciju protein-protein interakcijama (slika 6-30B). Prvi takav aktivni represor opisan je 1990. godine pri istraìvanju gena nazvanog Krppel, djelatnog u embrionalnom razvoju vinske mu{ice. Molekularna analiza Krppel proteina pokazala je da on sadràva odvojenu represijsku domenu povezanu s domenom cinkova prsta koja se veè na DNA. Krppelova represijska domena moè se izmjenjivati s odre|enim domenama transkripcijskih faktora koje se veù na DNA. Takve hibridne molekule, tako|er, djeluju represijski na transkripciju, {to pokazuje da Krppelova represijska domena inhibira transkripciju preko protein-protein interakcija, neovisno o mjestu njezina vezanja na DNA. Utvr|eno je da mnogi aktivni represori imaju klju~nu ulogu u regulaciji transkripcije u ìvotinjskim stanicama, u mnogim slu~ajevima oni su kriti~ni regulatori stani~noga rasta i diferencijacije. Kao i kod transkripcijskih aktivatora, identificirano je nekoliko razli~itih vrsta represijskih domena. Primjerice, represijska domena Krppelova proteina bogata je alaninskim ostatcima, dok su druge represijske domene bogate prolinom ili kiselim ostatcima. Funkcionalni su ciljevi represora tako|er razli~iti; represori mogu inhibirati transkripciju interakcijom sa specifi~nim aktivatorskim ili posredni~kim proteinima ili s op}im transkripcijskim faktorima ili pak, s korepresorima koji modificiraju kromatinsku strukturu. Regulacija transkripcije represorima, kao i aktivatorima, zna~ajno {iri niz mehanizama koji kontroliraju ekspresiju eukariotskih gena. Zna~ajna uloga represora mogla bi biti inhibicija ekspresije gena u odre|enim tkivima. Primjerice, kako je napomenuto ranije, mjesto za vezanje represora u imunoglobulinskom poja~iva~u pridonosi specifi~noj tkivnoj ekspresiji, sprje~avaju}i transkripciju u nelimfoidnim stanicama. Drugi represori igraju klju~ne uloge u kontroli proliferacije i diferencijacije stanica izloènih djelovanju hormona i faktora rasta (vidi 13. i 14. poglavlje).
Povezanost kromatinske strukture i transkripcije

Kako je napomenuto u prethodnom odjeljku, aktivatori i represori reguliraju transkripciju u eukariotima, ne samo interakcijom s drugim ~imbenicima transkripcijskog sustava, nego i izazivanjem promjena u kromatinskoj strukturi. DNA svih eukariotskih stanica vezana je na histone. Osnovna strukturna jedinica kromatina jest nukleosom koji se sastoji od 146 parova baza DNA omotanih oko dviju molekula svakoga histonskog proteina, H2A, H2B, H3 i H4, te jedne molekule histona H1 vezanoga na DNA pri ulasku u sr` nukleosomske ~estice (vidi sliku 4-12). Kromatin je potom kondenziran smotavanjem u obliku spirale u strukturu vi{eg reda organiziranu u velike om~e DNA. Ovakvo pakiranje eukariotske DNA u kromatin sigurno ima va`ne posljedice na raspoloìvost DNA kao kalupa za transkripciju. Tako kromatinska struktura predstavlja kriti~an apekt genske ekspresije u eukariotskim stanicama. Geni koji se aktivno prepisuju smje{teni su u relativno dekondenziranom kromatinu, koji se vjerojatno podudara s 30-nm kromatinskim vlaknom razmatranim u 4. poglavlju (vidi sliku 4-13). Primjerice, mikroskopska vizualizacija politenskog kromosoma vinske mu{ice pokazuje da se podru~ja genoma koja aktivno sintetiziraju RNA podudaraju s dekondenziranim kromosomskim dijelom (slika 6-31). Unato~ tomu, aktivno prepisivani geni ostaju vezani na histone i pakirani u nukleosome tako da se transkripcijski faktori i RNA-polimeraza vi{e susre}u s problemom interakcije s kromatinom nego s golom DNA. Gusto namotana DNA oko srì nukleosomne ~estice najve}a je prepreka transkripciji, {to utje~e kako na sposob-
257
Slika 6-31. Dekondenzirana podru~ja kromosoma u vinske mu{ice.

Svjetlosna mikrografija pokazuje dekondenzirana podru~ja politenskog kromosoma (strjelice), aktivnoga u sintezi RNA. (Ljubazno{}u Josepha Galla, Institut Carnegie)
10 mm
Slika 6-32. Acetiliranje histona.

(A) Histoni srì imaju domenu smatanja histona. Ona str{i izvan nukleosoma, a u interakciji je s drugim histonima i DNA. Repovi na N-kraju histona srì (npr. H3) modificiraju se dodatkom acetilnih skupina (Ac) na postrani~ni lanac lizinskih ostataka. (B) Transkripcijski aktivatori i represori zdruèni su s koaktivatorima i korepresorima, koji su zapravo histonske acetil-transferaze (HAT) i deacetilaze (HDAC). Acetiliranje histona svojstvo je aktivno prepisivanoga kromatina i moè oslabiti vezanje histona na DNA ili, pak, promijeniti njihove interakcije s drugim proteinima.
nost transkripcijskih faktora da se veù na DNA, tako i na sposobnost RNA-polimeraze da prepisuje kroz kromatinski kalup. Nekoliko modifikacija je karakteristi~no za transkripcijski aktivan kromatin: modifikacije histona, preure|enje nukleosoma te zdruìvanje dva nehistonska kromosomna proteina, nazvana HMGN proteinima, s nukleosomima aktivno prepisivanih gena. Vezna mjesta za HMGN na nukleosomi-
(A)
rep na N-kraju
domena smatanja histona
Ac Ac Ac Ac A R T K Q T A R K S T GG K A P R K Q A L T K A A
4 9 14 18 23
40135
(B) H O N H C C Ac HAT HDAC

+
H O N H C C
koaktivator aktivator HAT
korepresor
CH2 CH2 CH2 CH2 NH3
CH2 CH2 CH2 CH2 NH C O CH3
HDAC represor
Ac acetilna skupina (Ac)
lizin (K)
acetilirani histoni aktivni kromatin
deacetilirani histoni neaktivni kromatin
258
Poglavlje 6
ma preklapaju se s veznim mjestima za histon H1 i ~ini se da HMGN proteini stimuliraju transkripciju, mijenjaju}i interakciju histona H1 s nukleosomima da bi odràli dekondenziranu kromatinsku strukturu. Acetiliranje histona povezivalo se s transkripcijski aktivnim kromatinom u vrlo velikom broju stani~nih vrsta (slika 6-32). Sr`ni histoni (H2A, H2B, H3 i H4) imaju dvije domene: domena histonskog namatanja, uklju~ena u interakcije s drugim histonima i smotavanje DNA oko srì nukleosomske ~estice, te domena repa na amino-kraju koja se pruà izvan nukleosoma. Repna domena na amino-kraju bogata je lizinom i moè se modificirati acetiliranjem na specifi~nim lizinskim ostatcima. Acetiliranje smanjuje ukupni pozitivni naboj histona, a moè i oslabiti njihovo vezanje na DNA kao i promijeniti njihove interakcije s drugim proteinima. [tovi{e, pokazano je da acetiliranje histona olak{ava vezanje transkripcijskih faktora na nukleosomnu DNA, {to pokazuje da acetiliranje histona pove}ava pristupa~nost kromatina proteinima koji se veù na DNA. Istraìvanja dviju skupina znanstvenika su 1996. godine pruìla dokaze o izravnoj vezi izme|u acetiliranja histona i reguliranja transkripcije te pokazala da su transkripcijski aktivatori i represori zdruèni s acetil-transferazom i deacetilazom. Ta je asocijacija prvi put otkrivena pri kloniranju gena koji kodira histonsku acetil-transferazu u praìvotinji Tetrahymena. Neo~ekivano, slijed aminokiselina histonske acetil-transferaze u bliskoj je svezi s prethodno poznatim transkripcijskim koaktivatorom u kvascima, nazvanim Gcn5p, koji stimulira transkripciju u povezanosti s nekoliko razli~itih specifi~nih transkripcijskih aktivatora. Daljnji su pokusi otkrili da sam Gcn5p djeluje kao acetil-transferaza, sugeriraju}i da je aktiviranje transkripcije izravna posljedica acetiliranja histona. Rezultati su pro{ireni spoznajama o tome da je acetil-transferaza zdruèna s brojnim transkripcijskim koaktivatorima sisavaca, kao i s op}im transkripcijskim faktorom TFIID. Naprotiv, mnogi transkripcijski korepresori kako u stanicama kvasca tako i u stanicama sisavaca djeluju kao histonske deacetilaze, uklanjaju}i acetilnu skupinu s histonskog repa. Acetiliranje histona tako je izravna meta i transkripcijskih aktivatora i represora, pokazuju}i da acetiliranje ima klju~nu ulogu u regulaciji genske ekspresije u eukariotima. Histoni se ne modificiraju samo acetiliranjem, nego i fosforiliranjem serinskih ostataka, metiliranjem lizinskih i argininskih ostataka te dodatkom ubikvitina (mali peptid o kojem }e biti govora u 7. poglavlju) na lizinske ostatke. Sli~no acetiliranju, ove se modifikacije doga|aju na specifi~nim aminokiselinskim ostatcima u histonskom repu, a povezane su s promjenama transkripcijske aktivnosti (slika 6-33). Osim {to utje~u na kromatinsku strukturu, pretpostavljeno je da histonske modifikacije utje~u i na gensku ekspresiju priskrbom veznih mjesta za druge proteine koji reguliraju transkripciju. U skladu s tom hipotezom, kombinacija specifi~nih histonskih modifikacija tvori histonski kod koji regulira gensku ekspresiju pridruìvaSlika 6-33. Metiliranje i fosforiliranje histona.
Metiliranje i fosforiliranje specifi~nih aminokiselinskih ostataka u histonskom repu, kao i acetiliranje, utje~u na transkripcijsku aktivnost kromatina. Primjerice, metiliranje H3 lizina-4, fosforiliranje serina-10 i acetiliranje lizina-9 i lizina-14 svojstva su transkripcijski aktivnoga kromatina. Nasuprot tomu, za neaktivni kromatin karakteristi~no je metiliranje H3 lizina-9.
rep na N-kraju H3 Me aktivni kromatin N A R T
1 4
Q T
Ac P R K S T
9 10
Ac G K A P
14
metiliranje acetiliranje fosforiliranje
neaktivni kromatin
Me A R T K Q T A R K S T GG K A P
1 9
259
njem drugih regulatornih proteina na kromatinski kalup. Primjerice, transkripcijski faktor transkripcijski aktivan kromatin u svezi je s nekoliko specifi~nih modifikacija histona H3, uklju~uju}i metiliranje lizina-4, fosforiliranje serinaDNA omotana oko nukleosoma 10 te acetiliranje lizina-9 i lizina-14. Nasuprot tome, metiliranje lizina-9 povezano je s represijom, a enzim koji katalizira metiliranje H3 lizina-9 pridruùje se ciljnim genima s pomo}u korepresora. Metilirani lizinski ostatak na poziciji 9 u H3 histonu sluì, kako je naknadno pokazano, kao vezno mjesto za proteine koji induciraju kondenzaciju kromatina, izranukleosomni vno povezuju}i ovu histonsku modifikaciju s represijom transkripcije. promijenjeno mjesto remoduliraju}i Treba imati na umu da modifikacije histonskog repa reguliraju jedna nukleosoma da bi se faktor drugu te tako tvore razli~ite uzorke histonskih modifikacija koje koreliraomogu}ilo vezanje transkripcijskih faktora ju s transkripcijskom aktivno{}u. Primjerice, fosforiliranje H3 serina-10 promovira acetiliranje lizina-14, ali inhibira metiliranje lizina-9, dovode}i do postavke uzorka H3 modifikacije koji je karakteristi~an za transkripcijski aktivan kromatin. Metiliranje lizina-4 tako|er inhibira metiliranje lizina-9 i obrnuto, {to je u skladu s obrnutim djelovanjem metiliranja ovih dvaju lizinskih ostataka na transkripcijsku aktivaciju odnosno reSlika 6-34. Nukleosomni remodulipresiju. Me|usobni utjecaji modifikacija razli~itih ostataka daju tako uzorraju}i faktori. ke histonske modifikacije koji osiguravaju stabilni regulatorni kod za transFaktori koji remodeliraju nukleosome kripcijsku aktivnost kromatina. mijenjaju aran`man ili strukturu nukleoNasuprot enzimima koji reguliraju kromatinsku strukturu modificirasoma. Primjerice, faktor koji remodelira njem histona, nukleosomni remodeliraju}i faktori jesu proteinski komnukleosome moè olak{ati vezanje transkripcijskih faktora na kromatin repozipleksi koji mijenjaju aran`man ili strukturu nukleosoma bez uklanjanja ili cioniranjem nukleosoma na DNA. kovalentne modifikacije histona (slika 6-34). Jedan mehanizam kojim djeluju nukleosomni remodeliraju}i faktori jest taj da kataliziraju pomicanje histonskih oktamera du` DNA. Tako se repozicioniraju nukleosomi da bi se promijenila izloènost specifi~nog slijeda DNA transkripcijskim faktorima. Osim toga, nukleosomni remodeliraju}i faktori mogu djelovati tako da izazivaju promjene u konformaciji nukleosoma, {to opet utje~e na sposobnost specifi~nih sljedova DNA da stupaju u interakciju s regulatornim transkripcijskim proteinima. Sli~no enzimima koji modificiraju histone, nukleosomni remodeliraju}i faktori mogu se pridruìti DNA u asocijaciji s drugim transkripcijskim aktivatorima ili represorima te promijeniti aran`man nukleosoma stimulira ili inhibira transkripciju. Pridruìvanje enzima koji modificiraju histone i nukleosomnih remodeliraju}ih faktora djelovanjem transkripcijskih aktivatora stimulira zapo~injanje transkripcije mijenjanjem kromatinske strukture u podru~jima poja~iva~a ili promotora. Me|utim, nakon zapo~injanja transkripcije, RNA-polimeraza i dalje je suo~ena s problemom elongacije kromatinskoga kalupa. Mo`da je iznena|uju}e, ali pakiranje DNA u nukleosome ne predstavlja nepremostivu zapreku RNA-polimerazi. Ona je sposobna prepisivati kroz sr` nukleosoma kidaju}i kontakte histona i DNA. Sposobnost RNA-polimeraze da prepisuje kromatinski kalup olak{ana je zdruìvanjem HMGN proteina s nukleosomima aktivno prepisivanih gena, kao i s elongacijskim faktorima koji su zdruèni s fosforiliranom domenom na C-kraju RNA-polimeraze II nakon zapo~injanja transkripcije (vidi sliku 6-14). Elongacijski faktori pridruùju histonsku acetil-transferazu, a djeluju i izravno na kidanju nukleosomne strukture tijekom transkripcije.
Reguliranje transkripcije nekodiraju}im RNA

Najnovije spoznaje upu}uju na to da se ekspresija gena moè regulirati, osim transkripcijskim regulatornim proteinima, o kojima je ve} bilo govora, i nekodiraju}im regulatornim molekulama RNA. Jedan od na~ina djelovanja nekodiraju}ih regulatornih RNA je inhibicija translacije RNA interferen-
260
Poglavlje 6
Slika 6-35. Inaktivacija X kromosoma.

Inaktivirani X kromosoma (plavo) obloèn je s Xist RNA (crveno). (Od B. Panning i R. Jaenisch, 1988. Cell 93: 305.)
NH2 N3
2 4 5 6 1
citozin O
cijom; pojavom kad kratke dvolan~ane RNA izazivaju degradaciju homologne mRNA (vidi sliku 3-41). Osim toga, nekodiraju}e RNA, ~ini se, imaju va`nu ulogu u represiji transkripcije na nekim mjestima na kromosomima, induciraju}i modifikacije histona koje dovode do kondenzacije kromatina i nastanka heterokromatina. Premda ostaje mnogo toga za u~enje u svezi s mehanizmom njihova djelovanja, nekodiraju}e RNA nesumnjivo igraju va`ne uloge u reguliranju kromatinske strukture i funkcije u eukariotskim stanicama. Fenomen inaktiviranja X kromosoma primjer je uloge nekodiraju}ih RNA u regulaciji genske ekspresije u sisavaca. U mnogih ìvotinja (kao i u ~ovjeka) ènke imaju dva X kromosoma, a mu`jaci jedan X i jedan Y kromosom. X kromosom sadràva stotine gena koji nisu prisutni na mnogo manjem Y kromosomu (vidi sliku 4-29). Tako ènke imaju dvaput vi{e kopija ve}ine gena smje{tenih na X kromosomu u odnosu na mu`jake. Unato~ toj razlici i mu`jaci i ènke imaju istu koli~inu proteina kodiranih ve}inom gena na X kromosomu. Rezultat je to kompenzacijskoga mehanizma za doziranje kojim se ve}ina gena s jednog od dva X kromosoma u stanicama ènke rano u razvoju inaktivira konverzijom u heterokromatin. Slijedom toga, samo jedna kopija ve}ine gena smje{tenih na X kromosomu na raspolaganju je za transkripciju u stanicama kako ènki, tako i mu`jaka. Premda mehanizam inaktivacije X kromosoma nije potpuno razja{njen, ~ini se da je klju~ni element nekodiraju}a RNA nastala transkripcijom regulatornoga gena, nazvanog Xist, koji se nalazi na inaktivnom X kromosomu. Xist RNA ostaje na inaktivnom X kromosomu, veè se na njega i prekriva ga (slika 6-35). Nadalje, Xist RNA pridruùje regulatorne proteine koji uti{avaju transkripciju ve}ine gena na inaktivnom X kromosomu. Premda ti proteini nisu jo{ identificirani, na~elno je djelovanje Xist RNA indukcija metiliranja lizinskog ostatka-9 na histonu H3, {to izaziva kondenziranje kromatina i prevo|enje inaktivnog X kromosoma u heterokromatin. Nekodiraju}e RNA, kako je nedavno pokazano, igraju va`nu ulogu u ga{enju transkripcije i nastanku heterokromatina u podru~ju centromera kod cijepaju}eg kvasca Schizosaccharomyces pombe. U tom slu~aju molekule RNA homologne ponavljaju}im centromernim sljedovima DNA djeluju na na~in da sti{avaju transkripciju i izazivaju nastanak heterokromatina na centromeri. Kao i inaktivacija X kromosoma, metiliranje lizina-9 na histonu H3 rani je doga|aj u nastanku heterokromatina na centromeri kvasca. Zanimljivo je da djelovanje regulatornih centromernih RNA u S. pombe zahtijevanjihovo prevo|enje u male dvolan~ane molekule RNA stani~nom ma{inerijom odgovornom za stvaranje interferiraju}ih RNA koje zaprje~uju ekspresiju gena upu}ivanjem mRNA za razgradnju.
metiliranje
Metiliranje DNA
Metiliranje DNA sljede}i je op}i mehanizam kojim je kontrola transkripcije u kralje`njaka povezana sa strukturom kromatina. Citozinski ostatci u DNA kralje`njaka mogu se modificirati dodatkom metilne skupine na ugljikov atom na poloàju 5 (slika 6-36). DNA se metilira specifi~no na citozinskim ostatcima koji prethode gvaninima u lancu DNA (CpG dinukleotidi). Metiliranje je povezano sa smanjenom transkripcijskom aktivno{}u gena koji sadràvaju velik broj CpG dinukleotida u blizini promotora. Metiliranje inhibira transkripciju tih gena tako da interferira s vezanjem nekih transkripcijskih aktivatora, kao i da pridruùje represore koji se specifi~no veù na metiliranu DNA. Represori koji se veù na metiliranu DNA djeluju kao kompleksi s histonskom deacetilazom, povezuju}i metiliranje DNA s mijenjanjem acetiliranja histona i nukleosomne strukture.
NH2 N3 5-metil-citozin O
2 1 4 5 6
CH3
Slika 6-36. Metiliranje DNA.

Metilna skupina dodaje se na C-5 u citozinskom prstenu u DNA.
261
Premda metiliranje DNA moè inhibirati transkripciju, op}enito se ~ini da su metilirani samo oni geni koji su ve} suprimirani. Metiliranje DNA na~elno prije sluì stabiliziranju i odràvanju inaktivacije tijekom razvoja, nego {to je zapravo primarni uzrok inaktiviranja transkripcije. Primjerice, geni na inaktivnom X kromosomu metiliraju se nakon represije transkripcije s pomo}u Xist RNA i metiliranja lizina-9 na histonu H3, {to moè sluìti za usmjerivanje enzima odgovornih za indukciju metiliranja DNA na inaktivne gene. U biljkama je tako|er sugerirano da nekodiraju}e RNA usmjeruju metiliranje DNA suprimiranih gena. Va`na regulatorna uloga metiliranja DNA predstavljena je pojavom znanom kao genomski utisak (engl. genomic imprinting), koja kontrolira ekspresiju nekih gena djelatnih u embrionalnom razvoju sisavaca. U ve}ini slu~ajeva, oba alela, i maj~in i o~ev, bivaju eksprimirani u diploidnim stanicama. Me|utim, postoji mali broj utisnutih gena (vi{e od dvadeset opisanih u mi{a i ~ovjeka) ~ija ekspresija ovisi o tome jesu li naslije|eni od majke ili od oca. U nekim je slu~ajevima eksprimiran samo o~ev alel utisnutog gena, a maj~in je alel transkripcijski inaktivan. Za druge utisnute gene maj~in je alel aktivan, a o~ev inaktivan. îni se da metiliranje DNA igra klju~nu ulogu u razlikovanju izme|u maj~inih i o~evih alela utisnutih gena. Dobar je primjer gen H19, koji se prepisuje samo s maj~ine kopije (slika 6-37). H19 gen je specifi~no metiliran tijekom razvoja mu{kih, ali ne i ènskih spolnih stanica. Spajanje spermatozoida s jajnom stanicom u trenutku oplodnje daje embrij koji sadràva metilirane o~eve i nemetilirane maj~ine alele toga gena. Ta se razlika u metilaciji zadràva i nakon replikacije DNA te specifi~nog metiliranja o~evog lanca (slika 6-38). O~ev H19 alel stoga ostaje metiliran i transkripcijski inaktivan u embrionalnim stanicama i somatskim tkivima. Me|utim, o~ev H19 alel demetilira se u germinativnoj liniji, omogu}uju}i uspostavu novog uzorka metilacije u sljede}oj generaciji.
jajna stanica
spermij
CH3 H19
oplodnja
maj~in aktivni alel CH3
o~ev neaktivni alel
Slika 6-37. Genomski utisak

H19 gen specifi~no se metilira tijekom razvoja mu{kih spolnih stanica. Stoga, spermiji imaju metilirani H19 alel, a jajne stanice nemetilirani alel. Nakon oplodnje, metilirani roditeljski alel ostaje transkripcijski inaktivan, a nemetilirani alel od majke eksprimira se u embriju.
Dorada i promet RNA

Premda je transkripcija prvi i vrlo ure|eni korak u genskoj ekspresiji, obi~no predstavlja po~etak niza doga|anja potrebnih za nastanak funkcionalne RNA. Ve}ina novosintetiziranih RNA mora se modificirati na razli~ite
CH 5' metilirana roditeljska DNA 3'

3
3' 5'
replikacija DNA CH 5' 3' 3' 5' 5' 3' metiliranje CH3 5' 3'
CG C
3
3 5
Slika 6-38. Odràvanje uzorka metiliranja.

U roditeljskoj DNA oba se lanca metiliraju na komplementar nim CpG sljedovima. Nakon replikacije, samo roditeljski lanac svake molekule k}eri je metiliran. Novosintetizirani lanci potom se metiliraju specifi~nim enzimom koji prepoznaje CpG sljedove nasuprot mjestu metiliranja.
CH3 3' 5' 5' 3'

3
3 5
CH3 metilirana DNA
262
Poglavlje 6
na~ine da bi bila prevedena u funkcionalni oblik. Bakterijske su mRNA iznimke; one se odmah koriste kao kalupi za sintezu proteina, dok se jo{ prepisuju. Me|utim, primarni transkripti rRNA i tRNA moraju pro}i niz koraka dorade (engl. processing), kako u prokariotskim, tako i u eukariotskim stanicama. Sli~no, primarni transkripti eukariotskih mRNA prolaze intenzivne modifikacije, kao uklanjanje introna prekrajanjem, prije nego se transportiraju iz jezgre u citoplazmu, gdje sluè kao kalup za sintezu proteina. Regulacija koraka dorade osigurava dodatni stupanj kontrole genske ekspresije, kao i regulacija brzine kojom razli~ite mRNA bivaju razgra|ene u stanici.
Dorada ribosomnih i transportnih RNA

Osnovna dorada ribosomnih i transportnih RNA sli~na je u prokariotskim i u eukariotskim stanicama, {to se moglo i o~ekivati s obzirom na fundamentalnu ulogu tih RNA u sintezi proteina. Kako je ve} razmatrano eukarioti imaju ~etiri vrste ribosomne RNA (vidi tablicu 6-1), tri su od njih (28S, 18S i 5,8 rRNA) derivati kidanja jednoga dugoga prekursorskog transkripta, nazvanoga pre-rRNA (slika 6-39). Prokarioti imaju tri ribosomne RNA (23S, 16S i 5S), ekvivalentne 28S, 18S i 5S rRNA eukariotskih stanica i tako|er su nastale doradom jednog pre-rRNA transkripta. Jedina rRNA koja se ne dora|uje sveobuhvatno jest 5S rRNA u eukariotima, koja se prepisuje s odvojenoga gena. Prokariotske i eukariotske pre-rRNA dora|uju se u nekoliko koraka. Inicijalno kidanje bakterijske pre-rRNA daje odvojene prekursore za tri individualne rRNA; one se dalje dora|uju sekundarnim kidanjem u kona~ne produkte. U eukariotskim stanicama, pre-rRNA prvo se kida na mjestu koje je u blizini 5,8S rRNA na njenoj 5' strani, daju}i dva odvojena prekursora koji sadràvaju 18S i 28S + 5,8S rRNA. Daljnje kidanje prevodi ih u kona~ne produkte, s time da je 5,8S rRNA vezana vodikovim vezama na 28S molekulu. Osim ovih kidanja, dorada rRNA uklju~uje dodatak metilne skupine na bazu i {e}erni dio specifi~nih nukleotida. Dorada rRNA doga|a se u jezgrici eukariotskih stanica, o ~emu }e biti govora u 8. poglavlju.
Prokarioti pre-rRNA (5,5 kb)
16S
23S
5S
16S
23S
5S 5S (0,12 kb)
16S (1,5 kb) zrela rRNA Eukarioti pre-rRNA (13 kb) 18S 18S
23S (2,9 kb)
Slika 6-39. Proces dorade ribosomnih RNA.

Prokariotske stanice sadràvaju tri rRNA (16S, 23S i 5S) koje nastaju kidanjem pre-rRNA transkripta. Eukariotske stanice (primjerice humane stanice) sadràvaju ~etiri rRNA. Jedna od njih (5S rRNA) prepisuje se odvojeno, dok su ostale tri (18S, 28S i 5,8S) derivati zajedni~ke pre-rRNA. Nakon kidanja, 5,8S rRNA (jedinstvena u eukariota) veè se vodikovim vezama na 28S rRNA.
5,8S
28S
5,8S
28S
18S (1,9 kb) zrela rRNA
5,8S (0,16 kb) 28S (5 kb)

(A) RNaza P ribozim 5'
G G G A C G U A G G A U U DHU C U G C G mG G C G G C G C G A U DHU mG G C U C C C U U I G G C C U G C U C
263
Sli~no rRNA, tRNA u bakterijama i eukariotima sintetiziraju se kao duge prekursorske molekule (pre-tRNA), od kojih neke sadràvaju nekoliko individualnih tRNA sljedova (slika 6-40). U bakterijama se neke tRNA nalaze u pre-rRNA transkriptima. Dorada 5' kraja pre-tRNA uklju~uje kidanje enzimom nazvanim RNaza P, koje je posebno zanimljivo s obzirom na to da predstavlja prototipni model reakcije katalizirane RNA-enzimom. RNaza P sastoji se od RNA i proteinske molekule, a obje su potrebne za maksimalnu aktivnost. Godine 1983. Sidney Altman i suradnici pokazali su da je izolirana RNA komponenta RNaze P sposobna katalizirati kidanje pre-tRNA. Prema tim je pokusima RNaza P ribozim enzim u kojem je RNA, a ne protein odgovorna za kataliti~ku aktivnost. 3' kraj tRNA nastaje djelovanjem konvencionalnoga proteina RNaze, ali dorada tog kraja tRNA molekule tako|er uklju~uje neobi~nu aktivnost: dodatak CCA kraja. Sve tRNA imaju CCA slijed na 3' krajevima. Taj je slijed mjesto privezivanja aminokiseline, potrebno za funkciju tRNA tijekom sinteze proteina. CCA kraj nekih tRNA kodiran je slijedom DNA, ali kod drugih nije, stoga se dodaje kao korak dorade RNA enzimom koji prepoznaje i nadodaje CCA na 3' kraj svih tRNA koje nemaju taj slijed. Drugi je neobi~an aspekt dorade tRNA sveobuhvatna modifikacija baza u molekuli tRNA. Oko 10% svih baza u molekuli tRNA promijenjeno je i daje tako razli~ite modificirane nukleotide na specifi~nim poloàjima u tRNA molekulama (vidi sliku 6-40). Funkcije su ve}ine tih modificiranih baza nepoznate, ali neke su va`ne u sintezi proteina jer mijenjaju svojstva tRNA, s obzirom na sparivanje komplementarnih baza (vidi 7. poglavlje).
3'
U U A A G G C C G C U C C G G U T U C U G G A G A G G G U I G C
pre-tRNA
kidanje 5'
G G G A C G U A G G A U U DHU C U G C G mG G C G G C G C G U DHU A mG G C U C C C U U I G G
3'
C C U G C U C
U U A G C U C C G G U T U C U G G A G A G G G U I G C A G G C C
Slika 6-40. Proces dorade transportnih RNA.

(A) Transportne RNA derivati su pre-tRNA, od kojih neke sadràvaju nekoliko individualnih molekula tRNA. Kidanje na 5'-kraju tRNA katalizirano je ribozimom RNaza P; a kidanje na 3'-kraju katalizirano konvencionalnim proteinom RNazom. CCA kraj se potom dodaje na 3'-kraj mnogih tRNA u procesu posttranskripcijske dorade. Kona~no, neke se baze modificiraju na karakteristi~nim pozicijama u tRNA molekuli. U ovom primjeru, modificirani nukleozidi obuhva}aju dihidrouridin (DHU), metilgvanozin (mG), inozin (I), ribotimidin (T) i pseudouridin (). (B) Struktura modificiranih baza. Ribotimidin, dihidrouridin i pseudouridin nastaju modificiranjem uridina u tRNA. Inozin i metilgvanozin nastaju modificiranjem gvanozina.
(B) Modificirane baze O HN O H H H H HN O O CH3 HN O O NH 5'
G G G A C G U A G G A U U DHU C U G C G mG G C G G C G C G U DHU A mG G C U C C C U U I G G
dodatak CCA na 3'-kraj 3'

A C C A C C U G C U C
U U A G C U C C G G U T U C U G G A G A G G G U I G C A G G C C
modificiranje baze 3'

A C C C C U G C U C
N riboza
N riboza
C riboza
5'
G G A G C G A G U C U G C G mG G C G C
mG
dihidrouridin (DHU) O HN N
ribotimidin (T) O HN H N CH3
pseudouridin ()
DHU C G G G A
DHU A
N inozin (I)
N riboza
N riboza (mG)
C U C C C U U I
2N-metilgvanozin
U U A A G G C C G C U C C G G T C DHU G G A G A G G G I C
264
Poglavlje 6
Neke pre-tRNA, kao i pre-rRNA u malom broju organizama, sadràvaju introne koji se uklanjanju prekrajanjem. U oprjeci spram drugih reakcija prekrajanja, koje (kako }e biti razmatrano u sljede}em odjeljku) obuhva}aju djelovanje kataliti~kih RNA, prekrajanje tRNA posredovano je konvencionalnim proteinskim enzimima. Endonukleaza kida pre-tRNA na mjestu prekrajanja da bi izrezala intron, nakon ~ega slijedi spajanje egzona i nastanak zrele molekule tRNA.
Dorada mRNA u eukariotima

Nasuprot doradi ribosomnih i transportnih RNA, dorada glasni~kih RNA predstavlja najve}u razliku izme|u prokariotskih i eukariotskih stanica. U bakterijama, ribosomi imaju izravan pristup molekuli mRNA u nastajanju i translacija zapravo zapo~inje na nastaju}em lancu mRNA dok jo{ traje transkripcija. U eukariotima, mRNA sintetizirana u jezgri mora se prvo transportirati u citoplazmu, prije nego {to se moè uporabiti kao kalup za sintezu proteina. [tovi{e, po~etni produkti transkripcije u eukariotskim stanicama (pre-mRNA) sveobuhvatno se modificiraju prije izlaska iz jezgre. Dorada mRNA obuhva}a modifikaciju obaju krajeva primarnoga transkripta, kao i uklanjanje introna (slika 6-41). Reakcije dorade prije su povezane s transkripcijom, nego {to su neovisni doga|aji koji slijede nakon sinteze pre-mRNA. Tako su sinteza mRNA i njezina dorada tijesno koordinirani koraci u ekspresiji gena. Domena na C-kraju (CTD) RNA-polimeraze II igra
7-metilgvanozin O C NH 1 H2N C
2 3 6 5 4
CH3 C C
7 9
5' mjesto za prekrajanje DNA
3' mjesto za prekrajanje
mjesto za poliadenilaciju
N+
8
CH H
intron transkripcija pre-mRNA
N 5'
CH2 C C
O C C OH m7G m7G
dodavanje kape na 5'-kraju
5'-5' veza P P P 5' CH2 C C P C O O
OH
3'-poliadenilacija AAAAA.... prekrajanje mRNA m7G AAAAA.....
baza 1 C 5'-kraj mRNA
CH3 baza 2
Slika 6-41. Proces dorade eukariotskih glasni~kih RNA.

Proces dorade mRNA obuhva}a modificiranje 5'-kraja dodavanjem kape s 7-metilgvanozinom (m7G), modificiranje 3'-kraja poliadenilacijom i uklanjanje introna prekrajanjem. 5'-kapa nastaje dodatkom GTP u obr nutoj orijentaciji naspram 5'kraja mRNA, stvaraju}i 5'-5' vezu. Dodani G potom se metilira na poloàju N-7, a metilne se skupine dodaju i na riboze koje pripadaju prvom ili prva dva nukleotida u mRNA.
5'
CH2 C C
O C C O CH3
265
klju~nu ulogu u koordiniranju tih procesa, sluè}i kao vezno mjesto za enzimske komplekse uklju~ene u doradu mRNA. Zdruìvanje tih enzima za doradu RNA s CTD polimeraze II pridonose njihovoj specifi~nosti u procesu dorade mRNA; polimeraze I i III nemaju CTD, tako se njihovi transkripti ne dora|uju istim enzimskim kompleksima. Prvi je korak u procesu dorade mRNA modificiranje 5' kraja transkripta dodavanjem strukture nazvane 7-metilgvanozinska kapa. Enzimi odgovorni za dodavanje kape pridruùju se fosforiliranoj CTD, slijede}i zapo~injanje transkripcije, a kapa se dodaje nakon transkripcije prvih 20 30 nukleotida RNA. Dodavanje kape inicirano je dodatkom GTP u obrnutoj orijentaciji na 5' krajnji nukleotid RNA. Nakon toga dodaje se metilna skupina na G bazu i na ribozu jednoga ili dva nukleotida na 5' kraju RNA lanca. 5' kapa stabilizira RNA i poravnava eukariotske mRNA s ribosomima tijekom translacije (vidi 7. poglavlje). 3' kraj ve}ine eukariotskih mRNA nije definiran zaustavljanjem transkripcije, nego kidanjem primarnog transkripta i dodavanjem poli-A-repa reakcijom dorade nazvanom poliadenilacija (slika 6-42). Signali za poliadenilaciju obuhva}aju visoko konzervirane heksanukleotide (AAUAAA u stanicama sisavaca), smje{tene 10 do 30 nukleotida uzvodno od mjesta poliadenilacije, i G-U bogati nizvodni sljedni element. Osim toga, neki geni imaju U-bogate sljedne elemente uzvodno od AAUAAA. Te sljedove prepoznaje proteinski kompleks koji obuhva}a endonukleaze {to kidaju lanac RNA i odvojenu poli-A-polimerazu koja dodaje poli-A rep od oko 200 nukleotida na transkript. Enzimi djelatni u procesu dorade povezani su s fosforiliranom CTD RNA-polimeraze II i mogu putovati s polimerazom skroz od mjesta zapo~injanja transkripcije. Kidanje i poliadenilacija signaliziraju zaustavljanje transkripcije do kojeg obi~no dolazi nekoliko stotina nukleotida nizvodno od mjesta dodavanja poli-A. Gotovo su sve mRNA u eukariotima poliadenilirane, a poli-A rep, pokazano je, regulira i translaciju i stabilnost mRNA. Osim toga, poliadenilacija igra va`nu regulatornu ulogu u ranom razvoju, gdje promjene duljine poli-A repova kontroliraju translaciju mRNA. Primjerice, mnoge mRNA uskladi{tene su u neoplo|enim jajima u obliku neprimjerenom za translaciju s kratkim poli-A repovima (obi~no 30 do 50 nukleotida dugom). Oplodnja stimulira produljivanje poli-A repova uskladi{tenih mRNA, {to potom aktivira njihovu translaciju i sintezu proteina potrebnih za rani embrionalni razvoj.
G-U bogat DNA uzvodni element transkripcija pre-mRNA 5' uzvodni element kidanje endonukleazom 5' uzvodni element poli-A-polimeraza mRNA 5' uzvodni element
AAUAAA CA A A A A (200) 3' AAUAAA CA 3' AATAAA CA
nizvodni element G-U bogat

AAUAAA CA
3' nizvodni element
Slika 6-42. Nastanak 3'-krajeva na eukariotskim mRNA.

Poliadenilacijski signali u stanicama sisavaca sastoje se od {est nukleotida AAUAAA uz uzvodne i nizvodne elemente (bogate G-U). Endonukleaza kida pre-mRNA 10 do 30 nukleotida nizvodno od AAUAAA, obi~no na CA sljedu. Poli-A-polimeraza nakon toga dodaje poli-A rep koji se sastoji od oko 200 A na 3'-kraju RNA.
266
Poglavlje 6
Slika 6-43. In vitro prekrajanje.

Gen koji sadràva intron kloniran je nizvodno od promotora (P) koji prepoznaje bakteriofagna RNA-polimeraza. Plazmid je razgra|en restrikcijskim enzimom koji kida na 3'-kraju kloniranoga gena daju}i linearnu molekulu DNA. Ta se DNA prepisuje in vitro bakteriofagnom polimerazom daju}i RNA. Reakcije prekrajanja mogu se ispitivati in vitro dodatkom nastalih pre-mRNA nuklearnom ekstraktu stanica sisavaca.
egzon 1 promotor za bakteriofagnu RNA-polimerazu
intron 1 egzon 2 mjesto za restrikcijski enzim
razgradnja restrikcijskim enzimom P egzon 1 intron 1 egzon 2
in vitro transkripcija egzon 1 pre-mRNA dodatak nuklearnom ekstraktu intron 1 egzon 2
nuklearni ekstrakt
in vitro prekrajanje egzon 1 prekrojena mRNA egzon 2
Najdojmljivija je modifikacija pre-mRNA uklanjanje introna prekrajanjem. Kao {to je ve} prikazano u 4. poglavlju, kodiraju}i su sljedovi ve}ine eukariotskih gena isprekidani nekodiraju}im sljedovima (intronima) koji se precizno izrezuju iz zrele mRNA. U sisavaca, ve}ina gena sadràva vi{estruke introne, koji pridonose veli~ini pre-mRNA od oko deset puta ve}oj nego kad bi sadràvala samo egzone. Neo~ekivano otkri}e introna 1977. godine usmjerilo je istraìva~ke napore u smjeru razumijevanja mehanizma prekrajanja, vrlo specifi~nog za stvaranje funkcionalne mRNA. Daljnja istraìvanja prekrajanja nisu samo rasvijetlila nove mehanizme regulacije gena, nego su razotkrila neobi~ne kataliti~ke aktivnosti molekula RNA.
Mehanizam prekrajanja
Klju~ je razumijevanja prekrajanja pre-mRNA razvoj in vitro sustava koji efikasno izvodi reakciju prekrajanja (slika 6-43). Pre-mRNA sintetiziraju se in vitro kloniranjem strukturnih gena (s njihovim intronima) u blizinu promotora za bakteriofagne RNA-polimeraze koje se mogu izolirati u velikim koli~inama. Transkripcija tih plazmida moè se potom koristiti za pripravu
267
5' SS egzon 1
GU
to~ka grananja
A
3' SS egzon 2
AG
kidanje na 5'-mjestu prekrajanja nastanak poluproizvoda sli~nog lasu
egzon 1
U G A
egzon 2
AG
kidanje na 3'-mjestu za prekrajanje spajanje egzona
egzon 1
egzon 2
U G A
AG
Slika 6-44. Prekrajanje pre-mRNA.

Reakcija prekrajanja odvija se u dva koraka. Prvi korak obuhva}a kidanje na 5'-mjestu prekrajanja (engl. splice site, SS) i spajanje 5'-kraja introna na A unutar introna (engl. branch point, to~ka grananja). Tom reakcijom nastaje poluproizvod sli~an lasu (engl. lariat-like). Drugi je korak kidanje i simultano spajanje egzona, ~ime dolazi do izrezivanja strukture introna sli~ne lasu.
velikih koli~ina mRNA, koje, kad se dodaju nuklearnom ekstraktu stanica sisavaca, bivaju korektno prekrojene. Kao kod transkripcije, primjena ovakvih in vitro sustava omogu}uje detaljnije istraìvanje prekrajanja nego bi to bilo mogu}e u cjelovitim stanicama. Analiza reakcijskih produkata i intermedijara nastalih in vitro razotkrila je da se prekrajanje mRNA odvija u dva koraka (slika 6-44). Prvo, mRNA se kida na 5' mjestu za prekrajanje, i 5' kraj introna spaja se s adeninskim nukleotidom unutar introna (blizu 3' kraja). U ovom koraku nastaje neobi~na veza izme|u 5' kraja introna i 2' hidroksilne skupine adeninskoga nukleotida. Nastali intermedijar sli~an je lasu u kojem intron pravi om~u. Drugi korak u prekrajanju odvija se istodobnim kidanjem na 3' mjestu za prekrajanje i sljepljivanjem (ligacijom) dvaju egzona. Intron je tako isje~en u obliku lasa, biva potom lineariziran i razgra|en u jezgri cjelovite stanice. Ove reakcije definiraju tri kriti~na sljedna elementa u mRNA: slijed na 5' mjestu za prekrajanje, slijed na 3' mjestu za prekrajanje i slijed unutar introna na to~ki grananja (mjesto gdje se 5' kraj introna povezuje da bi nastala struktura sli~na lasu) (vidi sliku 6-44). Pre-mRNA sadràva sli~ne usugla{ene sljedove na svakoj od navedenih pozicija, omogu}uju}i ma{ineriji za prekrajanje da prepozna pre-mRNA i izvede reakcije kidanja i sljepljivanja obuhva}ene procesom prekrajanja. Biokemijska analiza nuklearnih ekstrakata otkrila je da se prekrajanje odvija u velikim kompleksima nazvanim tjele{ca za prekrajanje (engl. spliceosomes) koji se sastoje od proteina i RNA. RNA komponente tjele{aca za prekrajanje svrstane su u pet skupina malih nuklearnih RNA (snRNA) nazvanim U1, U2, U4, U5 i U6. Te snRNA, veli~ine od oko 50 do 200 nukleotida,
268
Poglavlje 6
Otkri}e snRNP
Antibodies to small nuclear RNAs complexed with proteins are produced by patients with systemic lupus erythematosus Michael R. Lerner and Joan A. Steitz
Yale University, New Haven, Connecticut Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1979, Volume 76, pages 5495-5499
Kontekst
Otkri}e introna 1977. godine dalo je naslutiti da su potpuno nepredvi|ene reakcije dorade potrebne da bi nastala mRNA u eukariotskim stanicama. Introni se moraju precizno izrezati iz pre-mRNA nakon ~ega slijedi spajanje egzona i nastanak zrele molekule mRNA. Neo~ekivana priroda prekrajanja pre-mRNA i njezino razumijevanje zaokupilo je pa`nju mnogih molekularnih biologa. Jedan od najva`nijih koraka u razumijevanju mehanizma prekrajanja bilo je otkri}e snRNP i njihova djelovanja u prekrajanju. Male jezgrine RNA identificirane su pr vi put u eukariotskim stanicama kasnih 60-ih godina pro{loga stolje}a. Me|utim, funkcija snRNA bila je nepoznata. U ~lanku objavljenom 1979. godine Michael Ler ner i Joan Steitz pokazali su kako je ve}ina snRNA prisutna kao kompleks RNA i proteina nazvan snRNP Osim toga, oni su pr vi . predloìli da bi ti kompleksi RNA i proteina mogli biti aktivni u prekrajanju pre-mRNA. Nakon identifikacije snRNP uslijedili su razli~iti pokusi koji su utvrdili njihovu ulogu i rasvijetlili mehanizam kojim se odvija prekrajanje pre-mRNA.
}aju}i DNA, RNA i histone. Otkri}e snRNP proisteklo je iz istraìvanja kojima su Lerner i Steitz nastojali okarakterizirati dva antigena, nazvana ribonukleinski protein (RNP) i Sm, koji su bili prepoznani protutijelima dobivenim od bolesnika s eritematoznim lupusom. Neizravni su podatci sugerirali da se RNP sastoji i iz proteina i iz RNA, na {to upu}uje samo ime, ali ni jedno ni drugo nije bilo utvr|eno na molekularnoj razini.
Joan Steitz
U2 U1b U1a U4 U5 U6 Imunoprecipitacija snRNA antiserumima bolesnika oboljelih od eritematoznoga lupusa. Kolona 1, anti-Sm; kolona 2, normalni kontrolni serum; kolona 3, antiserum koji primarno prepoznaje RNP antigen; kolona 4, anti-RNP Obrati pa`nju na to da je nespe. cifi~na RNA ozna~ena s X prisutna u svim imunoprecipitatima uklju~uju}i i kontrolu.
Eksperiment
Identifikacija snRNP temeljila se na uporabi antiseruma dobivenih od bolesnika oboljelih od sistemnog eritematoznog lupusa, autoimune bolesti kod koje bolesnici stvaraju protutijela naspram vlastitih, nor malnih stani~nih sastojaka. Mnoga protutijela kod eritematoznoga lupusa stvorena su naspram komponenti jezgre, obuhva-
Da bi identificirali mogu}e faktore RNP i Sm antigena, jezgrine RNA izolirane iz mi{jih stanica radioaktivno su ozna~ene s 32P i potom imunoprecipitirane antiserumima bolesnika oboljelih od razli~itih oblika eritematoznoga lupusa (vidi sliku 3-30). Prona|eno je {est razli~itih vrsta snRNA koje su selektivno imunoprecipitirane antiserumima od razli~itih bolesnika, ali ne i serumom zdrave, kontrolne, osobe (vidi sliku). Anti-Sm serum imunoprecipitirao je svih tih {est snRNA koje su ozna~ene U1a, U1b, U2, U4, U5 i U6. Anti-RNP serum imunoprecipitirao je samo U1a i U1b, a serum tre}ega bolesnika (koji je okarakteriziran kao ve}inom anti-RNP) imunoprecipitirao je U1a, U1b i U6. Imunoprecipitirane snRNA naknadno su okarakterizirane sekvenciranjem, koje je pokazalo da su U1a, U1b i U2 identi~ni naj~e{}im snRNA ve} poznatim u jezgrama sisavaca, a U1a i U1b predstavljaju ina~ice iste vrste U1 snRNA prisutne u humanim stanicama. Nasuprot tomu, U4, U5 i U6 snRNA jesu novootkrivene snRNA u ovom pokusu Michaela Lernera i Joan Steitza. Va`no je istaknuti kako imunoprecipitacija ovih snRNA pokazuje da su one bile komponente kompleksa RNA i proteina. Anti-Sm serum, koji je imunoprecipitirao svih {est snRNA, prepoznaje proteinski antigen. Sli~no tomu, otprije je poznato kako je protein potreban za prepoznavanje antigena antiRNP serumom. [tovi{e, Lerner i Steitz pokazali su da se nijedna snRNA ne
269
bi mogla imunoprecipirati ako se pr vo ukloni protein ekstrakcijom RNA fenolom. Daljnja analiza stanica u kojima su proteini radioaktivno ozna~eni 35 S-metioninom identificirala je sedam zna~ajnih nuklear nih proteina koji su imunoprecipitirani skupa sa snRNA s pomo}u anti-Sm i anti-RNP serumima. Ti podatci stoga pokazuju da je svaka od {est snRNA prisutna u snRNP kompleksu sa specifi~nim nuklear nim proteinima.
Utjecaj
Otkri}e da su snRNA komponente snRNP otvorilo je novi pristup u istraìvanju funkcije snRNA. Lerner i Steitz zamijetili su da bi najintrigantnija
mogu}a uloga snRNA bila u prekrajanju pre-mRNA te su naglasili da su sljedovi u blizini 5' kraja U1 snRNA komplementarni mjestu prekrajanja. Steitz i njezini suradnici i{li su dalje s nizom pokusa kojima su pokazali kako su snRNP kriti~ni faktori u prekrajanju. Ta su istraìvanja obuhvatila i dalekose`niju analizu sljeda od one koja je upozorila na komplementarnost 5' konzer viranih sljedova U1 snRNA s usugla{enim sljedovima na mjestima prekrajanja, sugeriraju}i da U1 ima ulogu u prepoznavanju 5' mjesta za prekrajanje. Osim toga, antiserumi naspram snRNP upotrijebljeni su za pokazivanje da je U1 potrebna za premRNA prekrajanje kako u izoliranim
jezgrama tako i u in vitro ekstraktima. Daljnja su istraìvanja pokazala na va`nost snRNA ne samo u identificiranju mjesta za prekrajanje, nego i kao katalizatora reakcije prekrajanja. Otkri}e da su snRNA ~imbenici snRNP te da ih , mogu prepoznati specifi~ni antiserumi, omogu}ilo je razumijevanje mehanizma prekrajanja pre-mRNA.
nalaze se u kompleksu sa {est do deset proteinskih molekula tvore}i male nuklearne ribonukleoproteinske ~estice (snRNP) koje igraju sredi{nju ulogu u procesu prekrajanja. U1, U2 i U5 snRNP svaka sadràva jednu snRNA molekulu, dok su U4 i U6 snRNA me|usobno zdruène u jednu snRNP . Prvi je korak u zdruìvanju tjele{ca za prekrajanje vezanje U1 snRNP na 5' mjesto za prekrajanje pre-mRNA (slika 6-45). Prepoznavanje 5' mjesta za prekrajanje obuhva}a sparivanje baza izme|u 5' usugla{enog slijeda za prekrajanje i komplementarnog slijeda na 5 kraju U1 snRNA (slika 6-46). Potom se U2 snRNP veè na to~ku grananja sli~nim komplementarnim sparivanjem izme|u U2 snRNA i slijeda to~ke grananja. Ve} nastali kompleks sastavljen od U4/U6 i U5 snRNP ugra|uje se u tjele{ce za prekrajanje, s vezanjem U5 na slijed uzvodno od 5' mjesta za prekrajanje. Reakcija prekrajanja povezana je s preslagivanjem snRNA. Disocijacija U6 od U4 i premje{tanje U1 na 5' mjesto za prekrajanje prethode prvom koraku u procesu prekrajanja (nastanak intermedijara strukturno sli~noga lasu). U5 se nakon toga veè na sljedove na 3' mjestu za prekrajanje, nakon ~ega slijedi izrezivanje introna i sljepljivanje egzona. snRNA ne samo da prepoznaju usugla{ene sljedove na to~ki grananja i mjestima prekrajanja, one tako|er izravno kataliziraju reakciju prekrajanja. Kataliti~ka uloga RNA u procesu prekrajanja pokazana je otkri}em nekih RNA sposobnih za samoprekrajanje; one mogu katalizirati uklanjanje vlastitih introna u odsutnosti drugih proteina ili RNA faktora. Samoprekrajanje prvi put je opisao Tom Cech i suradnici prou~avaju}i 28S rRNA u praìvotinji Tetrahymena. Ta RNA sadràva intron veli~ine od oko 400 baza koji se precizno uklanja nakon inkubacije pre-rRNA u odsutnosti dodanih proteina. Daljnje su studije objelodanile da je prekrajanje katalizirano intronom, koji djeluje kao ribozim upravljaju}i izrezivanjem samoga sebe iz pre-rRNA. Otkri}e samoprekrajaju}ih rRNA praìvotinje Tetrahymena zajedno s ispitivanjem RNaze P o ~emu je bilo rije~i, prvi je put pokazalo kataliti~ku , aktivnost RNA.
270
Poglavlje 6
Slika 6-45. Nastanak tjele{ca za prekrajanje.

Prvi je korak u nastanku tjele{ca za pre- 5' krajanje vezanje U1 snRNP na 5'-mjesto za prekrajanje (SS), nakon ~ega slijedi vezanje U2 snRNP na to~ku grananja. Prethodno nastali kompleks sastavljen od U4/U6 i U5 snRNP ulazi u tjele{ce za 5' prekrajanje. U5 se veè na sljedove uzvodno od 5'-mjesta za prekrajanje, a U6 disocira od U4 i pomi~e U1 prije nego nastane poluproizvod u obliku lasa. U5 se potom veè na 3'-mjesto za prekraja- 5' nje nakon ~ega slijedi izrezivanje introna i spajanje egzona.
5 SS
GU
to~ka grananja
A
3' SS egzon 2
AG
3'
U1
GU A AG
3'
U1
GU
U2
A AG
3'
U4/U6
U5
U1
U4
UG
5'
U6 U2
A
U5
AG
3'
nastanak poluproizvoda u obliku lasa
U6 5' U5
A AG
U2
3'
izrezivanje introna spajanje egzona
U G A
AG
+ 5'
3'
Daljnjim ispitivanjima otkrivene su samoprekrajaju}e RNA u mitohondrijima, kloroplastima i bakterijama. Samoprekrajaju}e RNA svrstane su u dvije skupine na osnovi reakcijskog mehanizma samoprekrajanja (slika 647). Prvi korak u prekrajanju skupine I introna (primjerice, Tetrahymena
271
5' SS egzon 1 pre-mRNA 5'

GU
3' SS intron
AG
egzon 2 3'
Slika 6-46. Vezanje U1 snRNA na 5'-mjesto za prekrajanje.

5'-kraj U1 snRNA veè se na usugla{ene sljedove na 5'-mjestu za prekrajanje komplementarnim sparivanjem.
U1 snRNA
AGGUAAGUA GUCCAUUCAUA 5'
Slika 6-47. Samoprekrajaju}i introni.

Skupina I i skupina II samoprekrajaju}ih introna razlikuje se po reakcijskim mehanizmima prekrajanja. U skupini I introna, prvi korak u prekrajanju jest kidanje 5'-mjesta za prekrajanje reakcijom s gvanozinskim kofaktorom. Tako nastaje linear ni poluproizvod s G dodanim na 5'-kraj introna. U skupini II introna (kao kod pre-mRNA prekrajanja) pr vi je korak kidanje 5'-mjesta za prekrajanje reakcijom s A unutar introna, stvaraju}i poluproizvod u obliku lasa. U oba slu~aja, drugi je korak simultano kidanje 3'-mjesta za prekrajanje i spajanje egzona.
3'
A
pre-rRNA) je kidanje na 5' mjestu za prekrajanje posredovano gvanozinskim kofaktorom. 3' kraj slobodnog egzona potom reagira s 3' mjestom za prekrajanje da bi se izrezao intron kao linearna RNA. Nasuprot tome, samoprekrajaju}e reakcije skupine II introna (primjerice, neke mitohondrijske pre-mRNA) jako nalikuju nuklearnom prekrajanju mRNA kod ~ega do
egzon 1
5'
3'
egzon 2
egzon 1
3'
egzon 2
gvanozinski kofaktor napada 5'-mjesto za prekrajanje
adenozin u intronu napada 5'-mjesto za prekrajanje
5'
G
egzon 1
3'
egzon 2
egzon 1
A
egzon 2
kidanje 3'-mjesta za prekrajanje spajanje egzona egzon 1 egzon 2
kidanje 3'-mjesta za prekrajanje spajanje egzona
+G
egzon 1
egzon 2
+
A
272
Poglavlje 6
kidanja 5' mjesta za prekrajanje dolazi zbog napada adenozinskog nukleotida u intronu. Kao i kod pre-mRNA prekrajanja nastaje poluproizvod sli~an lasu koji se izrezuje. Sli~nost izme|u prekrajanja pre-mRNA posredovanog tjele{cima za prekrajanje i samoprekrajanja skupine II introna sugerira da su aktivne kataliti~ke komponente tjele{ca za prekrajanje prije RNA nego proteini. Precizno, sli~nosti pokazuju da je prekrajanje pre-mRNA katalizirano snRNA u tjele{cu za prekrajanje. Nastavak istraìvanja prekrajanja pre-mRNA potkrijepilo je taj stav time {to je pokazano da U2 i U6 snRNA u odsutnosti proteina mogu katalizirati prvi korak u prekrajanju pre-mRNA. Smatra se da proces prekrajanja pre-mRNA jest reakcija utemeljena na RNA; snRNA u tjele{cu za prekrajanje djeluje analogno skupini II samoprekrajaju}ih introna. Unutar stanice, proteinske komponente snRNP tako|er su potrebne i participiraju, kako u zdruìvanju tjele{ca za prekrajanje tako i u samoj reakciji prekrajanja. Brojni proteinski faktori prekrajanja, koji nisu snRNP tako|er igraju va, `nu ulogu u zdruìvanju tjele{aca za prekrajanje, posebice u identifikaciji korektnog mjesta za prekrajanje u pre-mRNA (slika 6-48). Pre-mRNA sisavaca uobi~ajeno sadràva kratke egzone (prosje~no oko 150 nukleotida u ljudi) razdvojene mnogo ve}im intronima (prosje~no 3.500 nukleotida). Introni ~esto sadràvaju vi{e sljedova koji odgovaraju mjestu prekrajanja, tako sustav za prekrajanje mora biti sposoban identificirati odgovaraju}a 5 i 3 prekrajaju}a mjesta u grani~nom podru~ju introna/egzona da bi nastale funkcionalne mRNA. Prekrajaju}i faktori sluè za usmjeravanje tjele{ca za prekrajanje na korektno mjesto prekrajanja vezanjem na specifi~ne RNA sljedove unutar egzona, pridruùju}i potom U1 i U2 snRNP na odgovaraju}a mjesta na pre-mRNA interakcijama protein-protein. Osim toga, prekrajaju}i faktori povezuju prekrajanje s transkripcijom, zdruùju}i se s fosforiliranom CTD RNA-polimeraze II. To sidri sustav za prekrajanje na RNA-polimerazu {to je va`no za jam~enje da }e se egzoni slijepiti korektnim redoslijedom kako je pre-mRNA sintetizirana.
Alternativno prekrajanje
Sredi{nja uloga prekrajanja u procesu dorade pre-mRNA otvara mogu}nosti regulacije genske ekspresije kontrolom sustava za prekrajanje. Budu}i da ve}ina pre-mRNA sadràva brojne introne, razli~ite mRNA mogu nastati iz istoga gena razli~itim kombinacijama 5' i 3' mjesta za prekrajanje. Mogu}nost da se egzoni spoje me|usobno u raznim kombinacijama baca novo svjetlo na kontrolu genske ekspresije, jer se brojne mRNA (i stoga brojni proteini) mogu generirati iz iste pre-mRNA. Taj proces, nazvan alternativno prekrajanje, doga|a se ~esto u genima sloènih eukariota. Primjerice, procijenjeno je da alternativnim prekrajanjem mogu nastati tri ili vi{e mRNA od prosje~noga gena sisavaca, zna~ajno pove}avaju}i raznolikost proteina koji su kodirani s 30 do 40 tisu}a gena u genomu sisavaca. S obzi-
Slika 6-48. Uloga faktora za prekrajanje u zdruìvanju tjele{ca za prekrajanje.

Faktori za prekrajanje, SR proteini veù se na specifi~ne sljedove unutar egzona. SR proteini pridruùju U1 snRNP na 5'mjesto za prekrajanje, a dodatni faktor za prekrajanje (U2AF) na 3'-mjesto za prekrajanje. U2AF potom pridruùje U2 snRNP na to~ku grananja.
SR 5' egzon 1 5' SS U1 5' to~ka grananja U2 3' 3' SS egzon 2 3'
273
mu`jaci U2AF tra pre-mRNA prekrajanje UAG UAG SXL
ènke UAG
Slika 6-49. Alternativno prekrajanje u odre|ivanju spola u vinske mu{ice.

Alternativno prekrajanje transformiraju}e (engl. transformer, tra) mRNA regulirano je SXL proteinom, eksprimiranim samo u ènskim mu{icama. U mu{kih mu{ica pr vi egzon tra mRNA spajaju se na 3'-mjesto za prekrajanje 5' i tvore drugi egzon koji sadràva kodon za terminaciju translacije, tako da tra protein ne nastaje. U ènkama vezanje SXL proteina sprje~ava vezanje U2AF na 3'-mjesto za prekrajanje, {to dovodi do uporabe alter nativnog mjesta dalje nizvodno u egzonu 2. To je alternativno 3'-mjesto za prekrajanje nizvodno od ter minacijskoga mjesta za translaciju, tako da mRNA eksprimirana u ènkama upravlja sintezom funkcionalnoga tra proteina.
prekrajanje
translacija prerana terminacija nema funkcionalnoga proteina
translacija funkcionalni tra protein
rom na to da alternativno prekrajanje moè biti razli~ito u razli~itim tkivima, ono osigurava vaàn mehanizam za specifi~nu tkivnu i razvojno reguliranu ekspresiju gena. Dobro istraèn primjer alternativnog prekrajanja specifi~nog za odre|eno tkivo predstavlja odre|ivanje spola u vinske mu{ice, gdje alternativno prekrajanje iste pre-mRNA odre|uje je li mu{ica ènka ili mu`jak (slika 649). Alternativno prekrajanje pre-mRNA gena nazvanog transformiraju}i (engl. transformer) kontrolirano je proteinom (SXL) koji je eksprimiran samo u ènkama. Transformiraju}a pre-mRNA ima tri egzona, ali je razli~iti drugi egzon ugra|en u pre-mRNA kao rezultat upotrebe alternativnog 3' mjesta za prekrajanje u dva razli~ita spola. U mu`jaka egzon 1 spaja se uzvodno od 3' mjesta, odabranog vezanjem U2AF faktora prekrajanja na slijed u egzonu 2. U ènkama se SXL protein veè na to mjesto u egzonu 2, sprje~avaju}i vezanje U2AF. Dosljedno tome, uzvodno 3' mjesto prekrajanja presko~eno je u ènkama, a egzon 1 se umjesto toga spaja na alternativno mjesto prekrajanja dalje nizvodno. Sljedovi u egzonu 2 u mu`jaka sadràvaju kodon za terminaciju translacije, tako da ne nastaje protein. Terminacijski kodon ne nalazi se u mRNA ènki, tako da ènke eksprimiraju funkcionalni transformiraju}i protein, koji djeluje kao klju~ni regulator spolnog odre|ivanja. Alternativno prekrajanje transformiraju}ega gena ilustrira djelovanje represora (SXL protein) koji djeluje sprje~avaju}i vezanje faktora prekrajanja (U2AF). U drugim slu~ajevima, alternativno se prekrajanje kontrolira aktivatorima. Aktivatori pridruùju faktore prekrajanja mjestu prekrajanja, koje na drugi na~in ne bi bilo prepoznano. Brojni mehanizmi mogu tako regulirati alternativno prekrajanje, a varijacije u alternativnom prekrajanju najvi{e pridonose raznolikosti proteina eksprimiranih tijekom razvoja i diferencijacije.
Ure|ivanje RNA
Ure|ivanje RNA odnosi se na doga|aje u procesu dorade RNA (koji nisu prekrajanje) {to mijenjaju kodiraju}e sljedove nekih mRNA. Taj neo~ekivani oblik procesa dorade RNA otkriven je u mitohondrijskim mRNA praìvotinje roda Trypanosoma, gdje se U ostatci dodaju i bri{u na vi{e mjesta u molekuli. Mnogo kasnije opisano je ure|ivanje mitohondrijskih mRNA drugih organizama, mRNA iz kloroplasta vi{ih biljaka te nuklearnih mRNA nekih gena sisavaca. Ure|ivanje nuklearnih mRNA sisavaca, kao i mitohondrijskih i kloroplastnih RNA vi{ih biljaka, obuhva}a promjene jedne baze kao posljedice
274
Poglavlje 6
Slika 6-50. Ure|ivanje mRNA za apolipoprotein B.

U ljudskoj se jetri, neure|ena mRNA prevodi daju}i protein od 4.536-aminokiselinskih ostataka nazvan ApoB100. Me|utim, u ljudskim crijevima mRNA se ure|uje modificiranjem baza {to mijenja specifi~ni C u U. Ta modifikacija mijenja kodon za glutamin (CAA) u ter minacijski kodon (UAA), {to ima za posljedicu sintezu kra}ega proteina (Apo-B48, sastoji se iz 2152 aminokiseline).
pre-mRNA
CAA
UAA
ure|ivanje RNA C U
neure|ena RNA
CAA UAA
ure|ena RNA
UAA UAA
translacija
translacija
Apo-B100 jetra
Apo-B48 crijeva
modifikacijskih reakcija, sli~nih onima djelatnim u procesu dorade tRNA. U stanicama sisavaca reakcije ure|ivanja RNA obuhva}aju deaminiranje citozina u uridin i adenozina u inozin. Jedan od najbolje istraènih primjera jest ure|ivanje mRNA za apolipoprotein B, lipoprotein koji sudjeluje u transportu lipida u krvi. U tom slu~aju, ure|ivanje RNA specifi~no za odre|eno tkivo ima za posljedicu dva oblika apolipoproteina B (slika 6-50). Kod ljudi, Apo-B100 (4.536 aminokiselina) sintetizira se u jetri translacijom neure|ene mRNA. Me|utim, kra}i protein (Apo-B48, 2.152 aminokiseline) nastaje sintezom u crijevima kao rezultat translacije ure|ene mRNA u kojoj je C promijenjen u U deaminiranjem. Te alternativne promjene kodona za glutamin (CAA) u neure|enoj mRNA u kodon za terminaciju translacije (UAA) u ure|enoj mRNA imaju za posljedicu sintezu kra}eg Apo-B proteina. Ekspresija strukturno i funkcionalno razli~itih proteina u jetri i crijevima proizlazi iz ure|ivanja Apo-B mRNA specifi~nog za tkivo. Protein pune duljine, Apo-B100 nastao u jetri, transportira lipide u cirkulaciji; Apo-B48 aktivan je u apsorpciji lipida iz hrane u crijevu. Ure|ivanje RNA deaminiranjem adenozina u inozin najuobi~ajeniji je oblik ure|ivanja nuklearne RNA u sisavaca. Taj oblik ure|ivanja igra va`nu ulogu u ìv~anom sustavu, gdje A-u-I ure|ivanje ima za posljedicu izmjene jedne aminokiseline u receptorima za neke signalne molekule na povr{ini neurona. Va`nost reakcije ure|ivanja jasno je pokazana uporabom homologne rekombinacije za inaktiviranje gena koji kodira mi{ji enzim odgovoran za deaminaciju adenozina u inozin (vidi 3. poglavlje). Mi{evi koji nemaju taj enzim umiru u mladoj dobi nakon ponavljanih epilepti~nih napadaja kao posljedice disfunkcije neprikladno ure|enih receptora.
Razgradnja RNA
Iz koraka u procesu dorade prikazanih u prethodnom odjeljku, proizlaze zrele mRNA koje se prenose u citoplazmu da bi upravljale sintezom proteina. No ve}ina se sljedova prepisanih u mRNA razgra|uje u jezgri. Vi{e od 90% pre-mRNA predstavljaju intronski sljedovi koji se razgra|uju u jezgri, nakon izrezivanja u procesu prekrajanja. Razgradnju provodi enzim koji prepoznaje jedinstvenu 2'-5' vezu koja nastaje u to~ki grananja, kao i enzim koji prepoznaje ili 5' ili 3' krajeve molekula RNA i katalizira degradaciju RNA u oba smjera. 5' i 3' krajevi mRNA za{ti}eni su od djelovanja degradacijskog sustava 5' kapom i poli-A repom, dok neza{ti}eni krajevi introna bivaju prepoznani i razgra|eni. Osim za razgradnju introna, stanice imaju i sustav za kontrolu kvalitete (nazvan nesmislenim-posredovana razgradnja mRNA) koji vodi u raz-
275
gradnju mRNA bez cjelovitog okvira ~itanja. To eliminira defektne mRNA molekule i sprje~ava sintezu nenormalno skra}enih proteina. Nesmislenoposredovana razgradnja mRNA u kvasaca doga|a se u citoplazmi, a izazvana je onda kad se ribosom sretne s preranim terminacijskim kodonom tijekom sinteze proteina. U sisavaca, me|utim, doga|a se najmanje nekoliko nesmisleno-posredovanih razgradnji mRNA u jezgri. Mehanizam kojim se prepoznaju terminacijski kodoni unutar jezgre stanica sisavaca nije rasvijetljen, premda istraìvanja u posljednje vrijeme pokazuju da bi ribosomi unutar jezgre mogli biti aktivni u prepoznavanju i, {tovi{e, translaciji nuklearnih mRNA. Krajnji aspekt procesa dorade RNA molekule jest njezina eventualna degradacija u citoplazmi. S obzirom na to da je unutarstani~na razina bilo koje RNA odre|ena ravnoteòm izme|u sinteze i razgradnje, brzina kojom se individualne RNA razgra|uju jest druga razina na kojoj se moè kontrolirati ekspresija gena. Ribosomna i transportna RNA su stabilne, a ta stabilnost uvelike pridonosi visokoj razini tih RNA (vi{e od 90% svih RNA) i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama. Suprotno tome, bakterijske se mRNA brzo razgra|uju i obi~no imaju poluvijek od 2 do 3 minute. Taj brzi promet bakterijskih mRNA omogu}uje stanici da brzo odgovori na promjene u okoli{u, kao {to su primjerice promjene u hranjivim tvarima potrebnima za rast. U eukariotskim stanicama, me|utim, razli~ite mRNA razgra|uju se razli~itim brzinama, {to predstavlja dodatni ~imbenik u regulaciji ekspresije gena u eukariotima. Citoplazmatska razgradnja ve}ine eukariotskih mRNA inicirana je skra}ivanjem njihovih poli-A repova. Nakon toga slijedi uklanjanje 5' kape i razgradnja RNA nukleazama djelatnima na oba kraja. Poluvijek mRNA u stanicama sisavaca kre}e se od 30 minuta do oko 20 sati. Nestabilne mRNA ~esto kodiraju regulatorne proteine, {to obuhva}a i neke transkripcijske faktore ~ija se stani~na razina brzo mijenja u skladu s poticajima iz okoli{a. Te mRNA ~esto sadràvaju specifi~ne AU-bogate sljedove blizu svojih 3' krajeva koje, kako se ~ini, signaliziraju brzu degradaciju promi~u}i deadenilaciju. Stabilnost nekih mRNA moè se regulirati u skladu s izvanstani~nim signalima. Dobar je primjer mRNA koja kodira transferinski receptor protein smje{ten na povr{ini stanice aktivan u procesu uno{enja èljeza u stanicu sisavaca. Koli~ina transferinskih receptora regulirana je dostupno{}u èljeza, najvi{e kao rezultat moduliranja stabilnosti njihovih mRNA (slika 6-51). U prisutnosti odgovaraju}e koli~ine èljeza mRNA za transferinske receptore brzo se razgra|uje kao posljedica nukleaznog kidanja na sljedovima u blizini 3 kraja. Ako je koli~ina èljeza neodgovaraju}a, onda je mRNA stabilizirana, iz ~ega proizlazi pove}ana sinteza transferinskih receptora i ve}e uno{enje èljeza u stanicu. Ova je regulacija posredovana proteinom koji se veè na specifi~ne sljedove (element odgovoran za èljezo, engl. iron
Slika 6-51. Regulacija stabilnosti mRNA za transferinski receptor.

Koli~ine mRNA za transferinski receptor regulirane su raspoloìvo{}u èljeza. Ako je dostatan, unos èljeza mRNA se brzo razgra|uje kao rezultat nukleaznog kidanja u blizini 3'-kraja. Me|utim, ako je èljezo nedostatno, regulatorni se protein (nazvan vezni protein za element odgovoran za èljezo ili IRE-BP) veè na slijed u blizini 3'-kraja mRNA elementa odgovornog za èljezo (IRE) za{ti}uju}i tako mRNA od kidanja nukleazom.
3'
mRNA 5' podru~je koje kodira protein dostatno èljezo IRE
AAAA
nedostatnost èljeza nukleaza
nukleaza
AAAA
IRE- B
AAAA
brzo razgra|ivanje mRNA
IRE
stabilizirana mRNA
IRE
276
Poglavlje 6
response element, IRE) u blizini 3 kraja mRNA za transferinski receptor i tako {titi mRNA od razgradnje. Vezanje je regulatornog proteina na IRE kontrolirano pak razinom èljeza unutar stanice: ako stanica oskudijeva u èljezu, protein se veè na IRE ~ime za{ti}uje mRNA za transferinski receptor od razgradnje. Sli~ne promjene stabilnosti drugih mRNA uklju~ene su u reguliranje genske ekspresije nekim hormonima. Premda transkripcija ostaje primarna razina na kojoj se regulira ekspresija gena, varijacije u brzini razgradnje mRNA tako|er imaju va`nu ulogu u kontroli ustaljenog stanja mRNA u stanici.
KLJU^NI POJMOVI
S A @ E TA K TRANSKRIPCIJA U PROKARIOTA
RNA-polimeraza, promotor, otisak stopala
RNA-polimeraza i transkripcija: E. coli RNA-polimeraza sastoji se od a, b, b', w i s podjedinica. Transkripcija zapo~inje vezanjem s na promotorski slijed. Nakon sinteze prvih 10-tak nukleotida RNA, sr` enzima disocira od s i putuje du` kalupa DNA kako produljuje novosintetizirani RNA lanac. Transkripcija se nastavlja dok ne nai|e na terminacijski signal. Represori i negativna kontrola transkripcije: Prototipni je model za gensku regulaciju u bakterijama lac operon, reguliran vezanjem represora na specifi~ni slijed u DNA unutar promotora. Pozitivna kontrola transkripcije: Neki bakterijski geni regulirani su prije transkripcijskim aktivatorima nego represorima.
operon, operator, represor, cisdjeluju}i kontrolni elementi, trans-djeluju}i faktori
EUKARIOTSKE RNA-POLIMERAZE I TRANSKRIPCIJSKI FAKTORI

Eukariotske RNA-polimeraze: Eukariotske stanice sadràvaju tri razli~ite nuklearne RNA-polimeraze {to prepisuju gene koji kodiraju mRNA (polimeraza II), rRNA (polimeraza I i III) te tRNA (polimeraza III).
transkripcijski faktori, op}i transkripcijski faktori, TATA-slog, TATA-vezuju}i protein (TBP), TBPzdruèni faktor (TAF), posrednik
Op}i transkripcijski faktori i zapo~injanje transkripcije RNA-polimerazom II: Eukariotske RNA-polimeraze ne veù se izravno za promotorske sljedove; one trebaju dodatne proteine (op}e transkripcijske faktore) za zapo~injanje transkripcije. Promotorske sljedove mnogih gena koje prepisuje polimeraza II prepoznaju proteini koji se veù na TATA-slog, oni pridruùju dodatne transkripcijske faktore i RNA-polimerazu do promotora. Transkripcija RNA-polimerazom I i III: RNA-polimeraze I i III tako|er trebaju dodatne transkripcijske faktore da bi se vezale na promotore gena koji kodiraju rRNA, tRNA i neke snRNA.
REGULACIJA TRANSKRIPCIJE U EUKARIOTA

poja~iva~i, izolatori
cis-djeluju}i regulator ni sljedovi: promotori i poja~iva~i: Transkripcija eukariotskih gena kontrolirana je proteinima koji se veù na regulatorne sljedove udaljene do nekoliko kilobaza od mjesta zapo~injanja transkripcije. Poja~iva~i tipi~no sadrè vezna mjesta za vi{e proteina koji zajedni~kim djelovanjem reguliraju gensku ekspresiju.
277
Proteini koji reguliraju transkripciju: Mnogi eukariotski transkripcijski faktori izolirani su na temelju vezanja na specifi~ne DNA sljedove. Struktura i funkcija transkripcijskih aktivatora: Transkripcijski su aktivatori modularni proteini koji se sastoje iz razli~itih domena, jedne se veù na DNA, a druge su aktivacijske domene. Domene koje se veù na DNA posreduju zdruìvanje sa specifi~nim regulatornim sljedovima; aktivacijske domene stimuliraju transkripciju stupaju}i u interakciju s posredni~kim proteinima i op}im transkripcijskim faktorima, kao i koaktivatorima koji modificiraju kromatinsku strukturu. Eukariotski represori: Genska ekspresija u eukariotskim stanicama regulirana je kako represorima tako i aktivatorima. Neki represori interferiraju s vezanjem aktivatora ili op}ih transkripcijskih faktora na DNA. Drugi pak represori sadrè diskretne represijske domene koje inhibiraju transkripciju stupaju}i u interakciju s op}im ili transkripcijskim faktorima, transkripcijskim aktivatorima ili korepresorima koji djeluju na kromatinsku strukturu. Veza kromatinske strukture s transkripcijom: Pakiranje DNA u nukleosome predstavlja prepreku za transkripciju u eukariotskim stanicama. Modificiranje histona acetiliranjem pove}ava pristupa~nost nukleosomne DNA transkripcijskim faktorima i ta je modifikacija kromatina usko vezana na regulaciju transkripcije. Enzimi koji kataliziraju acetiliranje histona zdruèni su s transkripcijskim aktivatorima, dok su histonske deacetilaze zdruène s represorima. Histoni se tako|er modificiraju fosforiliranjem i metiliranjem, a specifi~ne modifikacije histona djeluju na gensku ekspresiju, sluè}i kao vezna mjesta za druge regulatorne proteine. Osim toga, faktori koji remodeliraju nukleosome olak{avaju vezanje transkripcijskih faktora na DNA mijenjanjem aran`mana ili strukture nukleosoma. RNA-polimeraze potom su sposobne prepisivati kroz nukleosom raskidanjem kontakata histona i DNA. Elongacija transkripcije olak{ana je nehistonskim HMGN kromosomnim proteinima i elongacijskim faktorima koji pridruùju histonske acetil-transferaze ili djeluju izravno na kidanju nukleosomne strukture. Regulacija transkripcije nekodiraju}im RNA: Transkripcija moè biti regulirana nekodiraju}im RNA kao i regulatornim proteinima. Inaktivacija X kromosoma predstavlja primjer genske regulacije nekodiraju}im RNA u sisavcima. Metiliranje DNA: Metiliranje citozinskog ostatka moè sprije~iti transkripciju gena kralje`njaka. Regulacija genske ekspresije metiliranjem igra va`nu ulogu u genomskom utisku koji kontrolira transkripciju nekih gena djelatnih u razvoju sisavaca.
test pomaka elektroforeti~ke pokretljivosti, DNA-afinitetna kromatografija transkripcijski aktivator, domena cinkova prsta, receptor za steroidni hormon, uzvojnicaokret-uzvojnica, homeodomena, homeoslog, leucinski zatvara~, uzvojnica-om~a-uzvojnica, koaktivator korepresor
HMGN proteini, acetiliranje histona, histonski kod, faktori koji remodeliraju nukleosome, elongacijski faktori
inaktivacija X kromosoma
genomski utisak
DORADA I PROMET RNA

Dorada ribosomne i transportne RNA: Ribosomne i transportne RNA derivati su kidanja dugih primarnih transkripata i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama. Metilne se skupine dodaju na rRNA, a razli~ite se baze modificiraju u tRNA. Dorada mRNA u eukariotima: Eukariotske pre-mRNA se, osim uklanjanja introna prekrajanjem, modificiraju dodavanjem 7-metilgvanozinske kape i 3' poli-A repa.
pre-rRNA, pre-tRNA, RNaza P, ribozim
pre-mRNA, 7-metilgvanozinska kapa, poli-A rep, poliadenilacija
278
Poglavlje 6
tjele{ce za prekrajanje, male nuklearne RNA (snRNA), snRNP, samo-prekrajanje
Mehanizam prekrajanja: Prekrajanje nuklearnih pre-mRNA doga|a se u velikim kompleksima, nazvanim tjele{ca za prekrajanje, sastavljenim od proteina i malih nuklearnih RNA (snRNA). snRNA prepoznaju sljedove na mjestima za prekrajanje u pre-mRNA i kataliziraju samu reakciju. Neke mitohondrijske, kloroplastne i bakterijske RNA prolaze samo-prekrajanje u kome je reakcija prekrajanja katalizirana intronskim slijedom. Alter nativno prekrajanje: Egzoni se mogu povezati u razli~itim kombinacijama kao posljedica alternativnog prekrajanja koje predstavlja vaàn mehanizam za kontrolu genske ekspresije specifi~nu za odre|eno tkivo u sloènim eukariotima. Ure|ivanje RNA: Neke se mRNA modificiraju u procesu dorade tako da se mijenja slijed aminokiselina u proteinu koji je njima kodiran. Ure|ivanje mitohondrijskih mRNA u nekim praìvotinjama obuhva}a dodavanje i brisanje uridinskih ostataka na vi{e mjesta u molekuli. Drugi oblici ure|ivanja mRNA u biljkama i stanicama sisavaca obuhva}aju modifikacije specifi~ne baze. Razgradnja RNA: introni se razgra|uju u jezgri, a nenormalne mRNA, kojima nedostaje potpun otvoreni okvir ~itanja, eliminiraju se raspadom posredovnim nesmislenim mRNA. Funkcionalne mRNA u eukariotskim stanicama razgra|uju se na vi{e na~ina, osiguravaju}i tako dodatne mehanizme za kontrolu genske ekspresije. U nekim slu~ajevima, brzina razgradnje mRNA regulirana je signalima izvan stanice.
alternativno prekrajanje
ure|ivanje RNA
mRNA razgradnja posredovana nesmislenim slijedom
Pitanja
1. Kako laktoza inducira ekspresiju proteina koji su potrebni E. coli da uzme i metabolizira laktozu? 2. Usugla{eni slijed E. coli 10 promotorskog elementa je TATAAT. Usporedite dva promotora koji imaju 10 sljedove TATGAT i CATGAT. Koji }e se slijed efikasnije transkribirati prema Va{em o~ekivanju? 3. Radite s dva soja E. coli. Jedan sadràva divlji tip gena za b-galaktozidazu i jednu i mutaciju; drugi sadràva gen za b-galaktozidazu koji je temperaturno osjetljiv i oc mutaciju. Nakon spajanja tih sojeva, testirate produkciju b-galaktozidaze kod dopu{tene i nedopu{tene temperature u odsutnosti laktoze. [to o~ekujete da }ete na}i? 4. Kako DNA otiska stopala pokazuje gdje se protein veè na specifi~ni slijed DNA? 5. Koja je uloga sigma (s) faktora u sintezi RNA u bakterijama? 6. Objasnite terminaciju transkripcije u E. coli. 7. Eukariotske stanice imaju tri razli~ite RNA-polimeraze. Koje RNA nastaju transkripcijom svake od njih? 8. Uspore|ujete {to je potrebno za in vitro bazalnu transkripciju dvaju gena koji se prepisuju polimerazom II, od kojih jedan sadràva TATA-slog a drugi sadràva samo Inr slijed. Jesu li za transkripciju od tih promotora potrebni TBP ili TFIID? 9. Kako se poja~iva~i, kao cis-djeluju}i regulatorni sljedovi, razlikuju od promotora u eukariotima? 10. Istraùjete poja~iva~ gena koji se normalno eksprimira samo u neuronima. Konstrukt u kojemu je taj poja~iva~ povezan na reporterski gen eksprimiran je u neuronima, ali ne u fibroblastima. Me|utim, ako mutirate specifi~ni element sljeda unutar poja~iva~a, dobit }ete ekspresiju i u fibroblastima i u neuronima. Koja bi se vrsta regulatornog proteina prema Va{em o~ekivanju vezala na poja~iva~ki element? 11. Transkripcijski faktor aktivira transkripciju vezanjem na razli~ite sljedove DNA u mi{i}nim i jetrenim stanicama. Kako bi alternativno prekrajanje moglo biti obuhva}eno u odre|ivanju te tkivne specifi~nosti aktivatora? 12. Koja je funkcija izolatora? 13. Objasnite mehanizam inaktivacije X kromosoma u èna?
279
Literatura
Transkripcija prokariota
Busby, S. and R. H. Ebright. 1994. Promoter structure, promoter recognition, and transcription activation in prokaryotes. Cell 79: 743746. R Darst, S. A. 2001. Bacterial RNA polymerase. Curr. Opin. Struc. Biol. 11: 155162. R Gilbert, W. and B. Muller-Hill. 1966. Isolation of the lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56: 18911899. I Hochschild, A. and S. L. Dove. 1998. Proteinprotein contacts that activate and repress prokaryotic transcription. Cell 92: 597600. R Jacob, F. and J. Monod. 1961. Genetic and regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3: 318356. I Lewis, M., G. Chang, N. C. Horton, M. A. Kirchner, H. C. Pace, M. A. Schumacher, R. G. Brennan and P Lu. 1996. Crystal struc. ture of the lactose operon repressor and its complexes with DNA and inducer. Science 271: 12471254. I Murakami, K. S., S. Masuda and S. A. Darst. 2002. Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 resolution. Science 296: 12801284. I Ptashne, M. and A. Gann. 2002. Genes and Signals. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Uptain, S. M., C. M. Kane and M. J. Chamberlin. 1997. Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation. Ann. Rev. Biochem. 66: 117172. R Vassylyev, D. G., S. Sekine, O. Laptenko, J. Lee, M. N. Vassylyeva, S. Borukhov and S. Yokoyama. 2002. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 resolution. Nature 417: 712719. I Zhang, G., E. A. Campbell, E. A., L. Minakhin, C. Richter, K. Severinov and S. A. Darst. 1999. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 resolution. Cell 98: 811824. I the transcription mechanism. Science 288: 640649. I Cramer, P D. A. Bushnell and R. D. Kornberg. ., 2001. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 resolution. Science 292: 18631876. I Ebright, R. H. 2000. RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II. J. Mol. Biol. 304: 687698. R Lee, T. I. and R. A. Young. 2000. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Ann. Rev. Genet. 34: 77137. R Matsui, T., J. Segall, P A. Weil and R. G. Ro. eder. 1980. Multiple factors are required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase II. J. Biol. Chem. 255: 1199211996. I Myers, L. C. and R. D. Kornberg. 2000. Mediator of transcriptional regulation. Ann. Rev.Biochem. 69: 729749. R Naar, A. M., B. D. Lemon and R. Tjian. 2001. Transcriptional coactivator complexes. Ann. Rev. Biochem. 70: 475501. R Nikolov, D. B., H. Chen, E. D. Halay, A. A. Usheva, K. Hisatake, D. K. Lee, R. G. Roeder and S. K. Burley. 1995. Crystal structure of a TFIIB-TBP-TATA-element ternary complex. Nature 377: 119128. I Orphanides, G. and D. Reinberg. 2002. A unified theory of gene expression. Cell 108: 439451. R Schramm, L. and N. Hernandez. 2002. Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters. Genes Dev. 16: 25932620. R Weil, P A., D. S. Luse, J. Segall and R. G. . Roeder. 1979. Selective and accurate transcription at the Ad2 major late promoter in a soluble system dependent on purified RNA polymerase II and DNA. Cell 18: 469484. I Woychik, N. A. and M. Hampsey. 2002. The RNA polymerase II machinery: structure illuminates function. Cell 108: 453463. R Brent, R. and M. Ptashne. 1985. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Cell 43: 729736. I Brownell, J. E., J. Zhou, T. Ranalli, R. Kobayashi, D. G. Edmondson, S. Y. Roth and C. D. Allis. 1996. Tetrahymena histone acetyltransferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843851. I Bustin, M. 2001. Chromatin unfolding and activation by HMGN chromosomal proteins. Trends Biochem. Sci. 26: 431437. R Cohen, D. E. and J. T. Lee. 2002. X-chromosome inactivation and the search for chromosome-wide silencers. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 219224. R Conaway, J. W., A. Shilatifard, A. Dvir and R. C. Conaway. 2000. Control of elongation by RNA polymerase II. Trends Biochem. Sci. 25: 375380. R Courey, A. J. and S. Jia. 2001. Transcriptional repression: the long and the short of it. Genes Dev. 15: 27862796. R Dynan, W. S. and R. Tjian. 1983. The promoter-specific transcription factor Sp1 binds to upstream sequences in the SV40 early promoter. Cell 35: 7987. I Ferguson-Smith, A. C. and M. A. Surani. 2001. Imprinting and the epigenetic asymmetry between parental genomes. Science 293: 10861089. R Hanna-Rose, W. and U. Hansen. 1996. Active repression mechanisms of eukaryotic transcription repressors. Trends Genet. 12: 229234. R Horn, P J. and C. L. Peterson. 2002. Chromatin . higher order folding: wrapping up transcription. Science 297: 18241827. R Jenuwein, T. and C. D. Allis. 2001. Translating the histone code. Science 293: 10741080. R Kadonaga, J. T. 1998. Eukaryotic transcription: An interlaced network of transcription factors and chromatin-modifying machines. Cell 92: 307313. R Kadonaga, J. T. and R. Tjian. 1986. Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 58895893. I Lee, T. I. and R. A. Young. 2000. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Ann. Rev. Genet. 34: 77137. R Licht, J. D., M. J. Grossel, J. Figge and U. M. Hansen. 1990. Drosophila Krppel protein is a transcriptional repressor. Nature 346: 7679. I Matzke, M., A. J. M. Matzke and J. M. Kooter. 2001. RNA: guiding gene silencing. Science 293: 10801083. R
Eukariotske RNA-polimeraze i op}i transkripcijski faktori

Butler, J. E. F. and J. T. Kadonaga. 2002. The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16: 25832592. R Conaway, J. W., A. Shilatifard, A. Dvir and R. C. Conaway. 2000. Control of elongation by RNA polymerase II. Trends Biochem. Sci. 25: 375380. R Cramer, P D. A. Bushnell, J. Fu, A. L. Gnatt, ., B. Maier-Davis, N. E. Thompson, R. R. Burgess, A. M. Edwards, P R. David and . R. D. Kornberg. 2000. Architecture of RNA polymerase II and implications for
Regulacija transkripcije u eukariota

Atchison, M. L. 1988. Enhancers: Mechanisms of action and cell specificity. Ann. Rev. Cell. Biol. 4: 127153. R Banerji, J., S. Rusconi and W. Schaffner. 1981. Expression of a b-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell 27: 299308. I Berger, S. L. 2002. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 142148. R Bird, A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16: 621. R
280
Poglavlje 6
McKenna, N. J. and B. W. OMalley. 2002. Combinatorial control of gene expression by nuclear receptors and coregulators. Cell 108: 465474. P McKnight, S. L. and R. Kingsbury. 1982. Transcriptional control signals of a eukaryotic protein-coding gene. Science 217: 316324. I Naar, A. M., B. D. Lemon and R. Tjian. 2001. Transcriptional coactivator complexes. Ann. Rev. Biochem. 70: 475501. P Narlikar, G. J., H.-Y. Fan and R. E. Kingston. 2002. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell 108: 475487. P Orphanides, G. and D. Reinberg. 2000. RNA polymerase II elongation through chromatin. Nature 407: 471475. P Pabo, C. O. and R. T. Sauer. 1992. Transcription factors: Structural families and principles of DNA recognition. Ann. Rev. Biochem. 61: 10531095. P Panning, B. and R. Jaenisch. 1998. RNA and the epigenetic regulation of X chromosome inactivation. Cell 93: 305308. P Ptashne, M. and A. Gann. 2002. Genes and Signals. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Richards, E. J. and S. C. R. Elgin. 2002. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell 108: 489500. P Schreiber, S. L. and B. E. Bernstein. 2002. Signaling network model of chromatin. Cell 111: 771778. P Staudt, L. M. and M. J. Lenardo. 1991. Immunoglobulin gene transcription. Ann. Rev. Immunol. 9: 373398. P Taunton, J., C. A. Hassig and S. L. Schreiber. 1996. A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p. Science 272: 408411. I Tilghman, S. M. 1999. The sins of the fathers and mothers: Genomic imprinting in mammalian development. Cell 96: 185193. P Turner, B. M. 2002. Cellular memory and the histone code. Cell 111: 285291. P Volpe, T. A., C. Kidner, I. M. Hall, G. Teng, S. I. S. Grewal and R. A. Martienssen. 2002.
Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 18331837. I West, A. G., M. Gaszner and G. Felsenfeld. 2002. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev. 16: 271288. P Wolffe, A. 1998. Chromatin: Structure and Function. 3rd. ed. New York: Academic Press.
Maas, S., A. Rich and K. Nishikura. 2003. Ato-I RNA editing: recent news and residual mysteries. J. Biol. Chem. 278: 13911394. P Madison-Antenucci, S., J. Grams and S. L. Hajduk. 2002. Editing machines: the complexities of trypanosome RNA editing. Cell 108: 435438. P Maniatis, T. and R. Reed. 2002. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature 416: 499506. P Maniatis, T. and B. Tasic. 2002. Alternative premRNA splicing and proteome expansion in metazoans. Nature 418: 236243. P Moore, M. J. 2002. Nuclear RNA turnover. Cell 108: 431434. P Padgett, R. A., M. M. Konarska, P J. Grabows. ki, S. F. Hardy and P A. Sharp. 1984. Lariat . RNAs as intermediates and products in the splicing of messenger RNA precursors. Science 225: 898903. I Padgett, R. A., S. M. Mount, J. A. Steitz and P A. Sharp. 1983. Splicing of messenger . RNA precursors is inhibited by antisera to small nuclear ribonucleoprotein. Cell 35: 101107. I Proudfoot, N. J., A Furger and M. J. Dye. 2002. Integrating mRNA processing with transcription. Cell 108: 501512. P Ruskin, B., A. R. Krainer, T. Maniatis and M. R. Green. 1984. Excision of an intact intron as a novel lariat structure during pre-mRNA splicing in vitro. Cell 38: 317331. I Smith, C. W. J. and J. Valcarcel. 2000. Alternative pre-mRNA splicing: the logic of combinatorial control. Trends Biochem. Sci. 25: 381388. P Valadkhan, S. and J. L. Manley. 2001. Splicingrelated catalysis by protein-free snRNAs. Nature 413: 7017078. I Van Hoof, A. and R. Parker. 2002. Messenger RNA degradation: beginning at the end. Curr. Biol. 12: R285R287. P Villa, T., J. A. Pleiss and C. Guthrie. 2002. Spliceosomal snRNAs: Mg2+-dependent chemistry at the catalytic core? Cell 109: 149152. P
Dorada i promet RNA

Abelson, J., C. R. Trotta and H. Li. 1998. tRNA splicing. J. Biol. Chem. 273:1268512688. P Baker, B. S. 1989. Sex in flies: the splice of life. Nature 340: 521524. P Blanc, V. and N. O. Davidson. 2003. C-to-U RNA editing: mechanisms leading to genetic diversity. J. Biol. Chem. 278: 13951398. P Cech, T. R. 1990. Self-splicing of group I introns. Ann. Rev. Biochem. 59: 543568. P Dodson, R. E. and D. J. Shapiro. 2002. Regulation of pathways of mRNA destabilization and stabilization. Prog. Nucl. Acid Res. 72: 129164. P Frank, D. N. and N. R. Pace. 1998. Ribonuclease P: Unity and diversity in a tRNA processing ribozyme. Ann. Rev. Biochem. 67: 153180. P Guerrier-Takada, C., K. Gardiner, T. Marsh, N. Pace and S. Altman. 1983. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849857. I Hirose, Y. and J. L. Manley. 2000. RNA polymerase II and the integration of nuclear events. Genes Dev. 14: 14151429. P Hopper, A. K. and E. M. Phizicky. 2003. tRNA transfers to the limelight. Genes Dev. 17: 162180. P Klausner, R. D., T. A. Rouault and J. B. Harford. 1993. Regulating the fate of mRNA: The control of cellular iron metabolism. Cell 72: 1928. P Kruger, K., P J. Grabowski, A. Zaug, A. J. . Sands, D. E. Gottschling and T. R. Cech. 1982. Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell 31: 147157. I
Poglavlje
Sinteza, dorada i regulacija proteina
Translacija mRNA 281 Smatanje i dorada proteina 298 Regulacija funkcije proteina 309 Razgradnja proteina 313
KLJU^NI POKUS: Kataliti~ka MOLEKULARNA MEDICINA:
uloga ribosomne RNA 288
Antibiotici i sinteza proteina 292
RNA SLIJEDI TRANSLACIJA, odnosno sinteza proteinfa koja se odvija prema kalupu mRNA. Proteini aktivno sudjeluju u ve}ini stani~nih procesa obavljaju}i mnogobrojne zada}e, koje su odre|ene informacijama pohranjenim u genomskoj DNA. Sintezu proteina, mogu}e je smatrati krajnjim korakom genske ekspresije, dok je translacija, odnosno prevo|enje mRNA, tek prvi korak nastanka funkcionalnog proteina. Nakon sinteze, polipeptidni se lanac treba smotati u odgovaraju}u trodimenzionalnu konformaciju, a uz to, ~esto podlijeè razli~itim oblicima dorade prije zauzimanja aktivnog oblika. Dorada (engl. processing) proteina, posebice kod eukariota, usko je povezano s razvrstavanjem i transportom proteina do njihovih odgovaraju}ih odredi{ta unutar stanice. Premda je ekspresija ve}ine gena primarno regulirana na razini transkripcije (vidi poglavlje 6), kontrola se moè odvijati i na razini translacije, {to je vaàn element genske regulacije kako u prokariotskih tako i u eukariotskih stanica. Vrlo su zna~ajni mehanizmi koji kontroliraju aktivnosti proteina u stanici. Jednom sintetizirani, mnogi proteini u odgovoru na izvanstani~ne signale mogu biti regulirani kako kovalentnim modifikacijama tako i povezivanjem s drugim molekulama. Uz to, razine proteina u stanici mogu biti regulirane razli~itom brzinom razgradnje proteina. Ove vi{estruke kontrole koli~ine i aktivnosti unutarstani~nih proteina, u kona~nici, reguliraju sve aspekte pona{anja stanice.
AKON TRANSKRIPCIJE I DORADE
Translacija mRNA
Sinteza proteina odvija se prema kalupu mRNA procesom koji je tijekom evolucije ostao visokoo~uvan (pregled u 3. poglavlju). Sve se mRNA ~itaju u smjeru 5' prema 3', a polipeptidni se lanac sintetizira od amino-kraja prema karboksi--kraju. U mRNA svaka je aminokiselina odre|ena s tri baze (kodon), prema gotovo univerzalnom geneti~kom kodu. Temeljni mehanizam proteinske sinteze tako|er je istovjetan u svim stanicama: translacija se odvija na ribosomima uz tRNA koje sluè kao posrednici izme|u kalupa mRNA i aminokiselina koje se ugra|uju u protein. Time sinteza proteina obuhva}a interakciju triju tipova molekula RNA (kalup mRNA, tRNA i rRNA) kao i razli~ite proteine potrebne za translaciju.
282
Poglavlje 7
Transportne RNA
Tijekom translacije, svaka od 20 aminokiselina mora biti pridruèna odgovaraju}im kodonima na kalupu mRNA. Sve stanice sadràvaju mno{tvo tRNA koje sluè kao posrednici ovog procesa. Kao {to se moè o~ekivati, zbog istovjetne funkcije u procesu sinteze proteina, razli~ite tRNA imaju zajedni~ke strukturne osobine. Uz to, posjeduju jedinstvene identificiraju}e sljedove koji omogu}uju vezanje odgovaraju}e aminokiseline i njezino pridruìvanje svom pripadaju}em kodonu u mRNA. Transportne RNA izgra|ene su od pribli`no 70 do 80 nukleotida i imaju karakteristi~nu strukturu lista djeteline koja je posljedica sparivanja komplementarnih baza iz razli~itih regija molekule (slika 7-1). Kristalografske analize X-zrakama dodatno su potvrdile da se sve tRNA smataju u sli~ne kompaktne L-oblike koji su nu`ni za uklapanje tRNA u ribosome za vrijeme procesa translacije. Posredni~ka funkcija tRNA temelji se na dvije odvojene regije molekule. Sve tRNA na 3' kraju sadràvaju slijed CCA, a aminokiseline se kovalentno veù na ribozu krajnjeg adenozina iz toga slijeda. Antikodonska petlja, smje{tena na drugom kraju smotane tRNA, putem komplementarnog sparivanja baza prepoznaje i veè odgovaraju}i kodon u kalupu mRNA. Pravilna ugradnja kodirane aminokiseline u proteine ovisi o njezinom povezivanju s odgovaraju}om tRNA kao i o specifi~nom kodon-antikodon sparivanju baza. Reakcije u kojima se aminokiseline povezuju sa specifi~nim tRNA posredovane su enzimima, nazvanim aminoacil-tRNA-sintetaze, koje su 1957. godine otkrili Paul Zamecnik i Mahlon Hoagland. Svaki od tih enzima prepoznaje jednu aminokiselinu i odgovaraju}u tRNA (ili vi{e njih) za koju aminokiselina treba biti vezana. Reakcija se odvija u dva koraka (slika 7-2). Prvo se aminokiselina aktivira reakcijom s ATP kako bi nastao aminoacil-AMP-sintetazni me|uprodukt. Aktivirana se aminokiselina, zatim povezuje s 3' krajem tRNA. Aminoacil-tRNA-sintetaze moraju biti visoko-selektivni enzimi koji prepoznaju i pojedina~ne aminokiseline i specifi~ne sljedove baza koji su svojstveni odgovaraju}oj akceptorskoj tRNA. U nekim slu~ajevima visoka pouzdanost prepoznavanja aminokiselina potje~e dijelom i od procesa provjere ~itanja (korektivne funkcije), u kojem se neispravni aminoacil-AMP kompleksi hidroliziraju, umjesto da budu pridruèni transportnim RNA tijekom drugoga koraka reakcije. Prepoznavanje ispravne tRNA i aminoacil-tRNA-sintetaze tako|er je visoko-selektivno: sintetaza prepozna-
Slika 7-1. Struktura tRNA.

Struktura fenilalanil-tRNA prikazana je u otvorenoj for mi lista djeteline (A) kako bi komplementar no sparivanje baza bilo vidljivo. Modificirane baze obiljeène su kao mG metilgvanozin; mC metilcitozin; DHU dihidrouridin; T ribotimidin; Y modificirani purin (naj~e{}e adenozin); y pseudouridin. Smotana for ma molekule prikazana je pod (B), a prostorni model pod (C) (C, susretljivo{}u Dana Richardsona).
(A) 3'
A C C A C G C U U A A
mjesto vezanja aminokiseline
5'
G C
(B) 5' 3'

C U
(C)
U U DHU G G C G C
G A C A
mC
mjesto vezanja aminokiseline PHOTO
G C
mG
G C U G U G T U
C A A U
mG
mG G A G G U
Y A A
antikodon
antikodon
283
Slika 7-2. Vezanje aminokiseline na tRNA.

U prvom reakcijskom koraku aminokiselini se pridruùje AMP ~ime nastaje me|u, produkt aminoacil-AMP U drugom se koraku aminokiselina prenosi na 3' CCA kraj . akceptorske tRNA, a AMP se otpu{ta. Oba reakcijska koraka kataliziraju aminoaciltRNA sintetaze.
O C
O
H C R
+ NH3
je specifi~an nukleotidni slijed (koji u ve}ini slu~ajeva obuhva}a i antikodon) koji jedinstveno identificira svaku pojedinu vrstu tRNA. Nakon {to se aminokiselina povezala s tRNA, nastali se kompleks smje{ta na kalup mRNA, {to je posredovano komplementarnim sparivanjem baza kodona mRNA i antikodona tRNA. Sparivanje baza iz kodona i antikodona ne{to je manje strogo od standardnog sparivanja baza A-U i G-C o kojem je bilo govora u prethodnim poglavljima. Zna~enje ovog neuobi~ajenog sparivanja baza u prepoznavanju kodon-antikodon povezano je sa redundancijom geneti~kog koda. Od 64 mogu}a kodona, tri su stop-kodoni koji signaliziraju zavr{etak translacije, dok ostalih 61 kodiraju aminokiseline (vidi tablicu 3-1). Sukladno tomu, ve}ina aminokiselina odre|ena je i vi{e nego jednim kodonom. Ova redundancija dijelom proizlazi iz ~injenice da se mnoge aminokiseline mogu vezati s nekoliko vrsta tRNA. E. coli, primjerice, posjeduje oko 40 razli~itih tRNA koje sluè kao akceptori za 20 razli~itih aminokiselina. Uz to, neke tRNA mogu prepoznati vi{e od jednog kodona u mRNA, {to je posljedica nestandardnog sparivanja baza (nazvanog kolebanje) izme|u antikodona tRNA i baze na tre}em poloàju nekih komplementarnih kodona (slika 7-3). Slobodnije sparivanje baza na tom poloàju dijelom potje~e od stvaranja parova baza G-U, a dijelom od modifikacije gvanozina u inozin u antikodonima nekolicine tRNA tijekom dorade (vidi sliku 6-40). Inozin moè stvoriti par baza bilo s C, U ili A na tre}em poloàju, tako da prisutnost ove baze u antikodonu omogu}uje jednoj tRNA prepoznavanje triju razli~itih kodona u kalupu mRNA.
P Pi
O C AMP O
H C
+ NH3
R aminoacil-AMP
CC
tRNA
AMP
O C
CC A
H C R
+ NH3
Ribosom
Mjesta na kojima se odvija sinteza proteina, kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama, jesu ribosomi. Prvotno su opisani kao ~estice detektirane ultracentrifugiranjem stani~nog lizata, pa ih se stoga, ~esto imenuje na temelju njihove brzine sedimentacije: oznaka 70S koristi se za bakterijske ribosome, a oznaka 80S za ne{to ve}e ribosome eukariotskih stanica. Ribosomi i prokariotskih i eukariotskih stanica izgra|eni su od dviju razli~itih podjedinica, koje obje sadrè karakteristi~ne proteine i molekule rRNA. înjenica da stanice uobi~ajeno sadràvaju mnogo ribosoma odraàva sredi{nju va`nost sinteze proteina u stani~nom metabolizmu. E. coli, primjerice, sadràva oko 20.000 ribosoma, {to predstavlja pribli`no 25% suhe mase stanice, dok brzorastu}e stanice sisavaca sadràvaju oko 10 milijuna ribosoma. Premda se u nekim detaljima razlikuju, osnovna je struktura prokariotskih i eukariotskih ribosoma sli~na (slika 7-4). Mala se podjedinica (obiljeèna kao 30S) ribosoma E. coli, sastoji od 16S rRNA i 21 proteina, a velika je podjedinica (50S) izgra|ena od 23S i 5S rRNA i 34 proteina. Svaki ribosom sadràva jednu kopiju rRNA i jednu kopiju svakog ribosomnog proteina, uz jednu iznimku: jedan je protein 50S podjedinice prisutan u ~etiri kopije. Podjedinice eukariotskih ribosoma su ve}e i sadràvaju vi{e proteina u odnosu na odgovaraju}e podjedinice prokariotskih ribosoma. Mala je podjedinica (40S) eukariotskih ribosoma izgra|ena od 18S rRNA i pribli`no 30 proteina, dok velika podjedinica sadràva 28S, 5,8S i 5S rRNA te oko 45 proteina. Zbog svoje veli~ine i kompleksnosti, visoko-rezolucijska strukturna
aminoacil-tRNA
284
Poglavlje 7
Slika 7-3. Nestandardno sparivanje baza kodon-antikodon.

Sparivanje baze na tre}em poloàju kodona nije strogo, ~ime je gvaninu (G) omogu}eno sparivanje s uridinom (U), a inozinu (I) iz antikodona sparivanje s uridinom (U), citozinom (C) i adeninom (A). Prikazana su dva primjera neuobi~ajenoga sparivanja, na temelju kojeg je fenilalanil (Phe) tRNA omogu}eno prepoznavanje kodona UUC i UUU te alanil (Ala) tRNA prepoznavanje kodona GCU, GCC i GCA.
sparivanje fenilalanil tRNA Phe H N tRNA 5'

G U C
H O H N N O H
riboza N
N H N H
C
N
3' mRNA
H gvanozin kodon ili antikodon
riboza uridin kodon ili antikodon
Phe H tRNA 5'

A U G
O N N riboza N N H gvanozin kodon ili antikodon H O H N O
U
N
N H
riboza
3' mRNA
U U
uridin kodon ili antikodon
sparivanje alanil tRNA Ala H tRNA 5'

C G G I C U
O N N riboza N inozin antikodon H O H N O
U
N
N H
riboza uridin kodon
3' mRNA
Ala
H N riboza
H O H N N O citozin kodon H
tRNA 5'
C G G I C C
I
N
N H
C
N
3' mRNA
inozin antikodon
riboza
Ala H tRNA 5'

C G G I
N N
H O H N N
H N riboza
riboza 3' mRNA N
N H
A
N
H inozin antikodon adenin kodon
C A
285
(A) prokariotski 70S ribosom 50 50S 23S i 5S rRNAs 34 proteina
Slika 7-4. Struktura ribosoma.

(A) Komponente prokariotskih i eukariotskih ribosoma. Na temelju brzine sedimentacije prilikom ultracentrifugiranja, intaktni se prokariotski ribosomi ozna~uju oznakom 70S, a eukariotski oznakom 80S. Izgra|eni su od velike i male podjedinice koje sadràvaju i ribosomne proteine i rRNA. (B-C) Visokorezolucijska kristalna struktura (dobivena X-zrakama) ribosomne podjedinice 30S (B) i 50S (C). (B, iz B. T. Wimberly, D. E. Brodersen, W. M. Clemons, R. J. Morgan-Warrner, A. P Carter, C. Vonrhein, . T. Hartrsch and V. Ramakrishnan, 2000. Nature 407:327. C, iz N. Ban, P Nissen, . J. Hansen, P B. Moore and T. A. Steitz, . 2000. Science 289:905.)
30S
16S rRNA 21 protein
eukariotski 80S ribosom 60 60S 28S, 5.8S, i 5S rRNAs (45 proteina)
40S
18S rRNA (30 proteina)
(C)
analiza ribosoma X-zrakama nije uspje{no izvedena sve do 2000. godine kad je prvi put objavljena struktura i 50S i 30S podjedinice. Kao {to }e u daljnjem tekstu biti dodatno potvr|eno, poznavanje strukture ribosoma na atomskoj razini bilo je klju~no za razumijevanje funkcije ribosoma. Va`no je svojstvo ribosoma da mogu nastati in vitro, samoudruìvanjem pripadaju}ih RNA i proteina. Kao {to je Masayasu Nomura prvotno opisao 1968. godine, pro~i{}eni }e ribosomni proteini i molekule rRNA kad se pomije{aju zajedno, pod odgovaraju}im uvjetima, ponovo stvoriti funkcionalne ribosome. Premda je udruìvanje ribosoma in vivo (posebice u eukariotskim stanicama) zna~ajno sloènije, spoznaja da se ribosomi mogu samoudruìvati in vitro, osigurala je vaàn eksperimentalni pristup, omogu}iv{i na taj na~in ispitivanje uloge svakog pojedinog proteina i molekule rRNA.
286
Poglavlje 7
Slika 7-5. Struktura 16S RNA

Komplementarno sparivanje baza rezultira stvaranjem specifi~ne sekundar ne strukture. (Iz M. M. Yusupov, G. Z. Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, T. N. H. Earnest, J. H. D. Cate and H. F. Noller. 2001. Science 292:883.)
Kao i transportne RNA, i ribosomne RNA putem komplementarnog sparivanja baza stvaraju karakteristi~ne sekundarne strukture (slika 7-5). Povezuju}i se s ribosomnim proteinima ribosomne se RNA dodatno smataju u posebne trodimenzionalne strukture. Prvotno se smatralo da ribosomne RNA imaju strukturnu ulogu, odnosno da osiguravaju kostur koji sjedinjuje ribosomne proteine. Otkri}em kataliti~kih osobina drugih vrsta RNA, primjerice, RNaze P i samoprekrajaju}ih introna o kojima je bilo govora u 6. poglavlju, uvelike se po~ela razmatrati mogu}a kataliti~ka uloga rRNA. U skladu s tom pretpostavkom, utvr|eno je da je rRNA nu`na za udruìvanje funkcionalnih ribosoma in vitro. S druge strane, izostavljanje mnogih ribosomnih proteina rezultiralo je smanjenjem, ali ne i potpunim gubitkom ribosomne aktivnosti.
287
Slika 7-6. Struktura 50S ribosomne podjedinice.

Visokorezolucijski model 50S ribosomne podjedinice s tri molekule tRNA vezane na mjesta A, P i E na ribosomu (vidi sliku 7-12). Ribosomni su proteini prikazani ruì~astom, a rRNA plavom bojom. (Iz P Nissen, J. . Hansen, N. Ban, P B. Moore and T. A. Steitz. 2000. . Science 289:920.)
Prvi izravni dokaz o kataliti~koj aktivnosti rRNA proiza{ao je iz eksperimenata Harry Nollera i njegovih suradnika 1992. godine. Ovi su znanstvenici pokazali da velika ribosomna podjedinica moè katalizirati nastajanje peptidne veze (reakcija peptidil-transferaze) ~ak i kad je 90% ribosomnih proteina uklonjeno standardnim postupcima ekstrakcije proteina. Suprotno tomu, nakon primjene RNaze, stvaranje peptidne veze u potpunosti je dokinuto, ~ime je sna`no poduprta hipoteza da ovu reakciju katalizira RNA. No, kako je prisutnost nekih ribosomnih proteina bila nu`na za odràvanje intaktnosti RNA, jo{ uvijek nije bilo mogu}e u potpunosti isklju~iti mogu}nost da stvaranje peptidne veze kataliziraju proteini. Nedvojbeni dokaz o tome da rRNA katalizira reakciju stvaranja peptidne veze proizi{ao je iz prvih strukturnih analiza 50S ribosomne podjedinice pri visokom razlu~ivanju, koje su 2000. godine objavili Peter Moore, Thomas Seitz i njihovi suradnici. Uvid u strukturu ribosoma na atomskoj razini otkrio je da ribosomni proteini nisu prisutni na mjestu u kojem se odvija reakcija peptidil-transferaze, ~ime je potvr|eno da rRNA katalizira reakciju stvaranja peptidne veze. Na temelju strukturne analize predloèn je i mogu}i mehanizam ove reakcije: smatra se da rRNA ostatci u aktivnom mjestu kataliziraju stvaranje peptidne veze reakcijom prijenosa protona koja odgovara reakciji suprotnoj od hidrolize peptidne veze koju kataliziraju serinske proteaze (vidi sliku 2-26). Premda predloèni mehanizam treba dodatno potvrditi novim studijama, za sad je ~vrsto prihva}eno da temeljnu reakciju sinteze proteina katalizira ribosomna RNA. Iako su smatrani primarnim kataliti~kim dijelovima ribosoma, danas se smatra da proteini imaju uglavnom strukturnu ulogu. Izravna uklju~enost rRNA u reakciju peptidil-transferaze ima va`ne posljedice i za evoluciju. RNA su smatrane prvim samorepliciraju}im makromolekulama (vidi 1. poglavlje). Ovu pretpostavku sna`no podupire ~injenica da ribozimi, kao {to su RNaza P i samoprekrajaju}i introni, mogu katali-
288
Poglavlje 7
Kataliti~ka uloga ribosomne RNA

Unusual Resistance of Peptidyl Transferase to Protein Extraction Procedures Harry F. Noller, Vernita Hoffarth, and Ludwika Zimniak
University of California at Santa Cruz Science, Volume 256, 1992, pages 14161419
Kontekst
Uloga ribosoma u sintezi proteina otkrivena je {ezdesetih godina 20. stolje}a. U tom su razdoblju ribosomi opisivani kao ~estice koje se sastoje od proteina i RNA, te je uspje{no obavljen eksperiment uspostavljanja funkcionalnih ribosoma iz pro~i{}enih gradbenih komponenti. Tada se smatralo da stvaranje peptidne veze (reakciju peptidiltransferaze) kataliziraju ribosomni proteini, a da rRNA uglavnom pridonosi odrànju strukture ribosoma. U ranim sedamdesetima, dokazi su ipak po~eli sugerirati da bi molekule ribosomne RNA mogle izravnije sudjelovati u proteinskoj sintezi. Primjerice, utvr|eno je da mnogi ribosomni proteini nisu esencijalni za funkciju ribosoma. Suprotno tomu, pokazano je da su sljedovi nekih dijelova rRNA dobro o~uvani tijekom evolucije, {to je upu}ivalo na klju~nu funkcionalnu ulogu ovih dijelova molekule rRNA. U ranim osamdesetima, na temelju studija Toma Cecha provedenih na ribozimu iz praìvotinje Tetrahymena i studija Sidneya Altmana provedenih na RNazi P, utvr|ena je kataliti~ka aktivnost molekula RNA. Ova su otkri}a stvorila temelje za pretpostavku da je rRNA izravno uklju~ena u katalizu stvaranja peptidne veze. Nepobitni dokaz, koji je potvrdio predloènu ulogu rRNA pruìli su u svom ~lanku Har ry Noller i njegovi suradnici, 1992. godine.
Eksperimenti
U studijama kataliti~ke aktivnosti rRNA, Noller i suradnici koristili su Harry F. Noller pojednostavnjenu modelnu reakciju za odre|ivanje peptidil-transferazne aktivnosti. U reakciji je mjeren prijenos ljenih ekstrakcija, kojima je uklonjeno radioaktivno obiljeènog N-for milme- 90% ribosomnih proteina. Suprotno tionina s fragmenta tRNA na amino tomu, peptidil-transferazna je aktivskupinu puromicina, antibiotika koji nost, bilo intaktnih, bilo ekstrahiranih sli~i aminoacil-tRNA i moè stvoriti ribosoma bila iznimno osjetljiva ~ak i peptidnu vezu s rastu}im polipeptidna kratko izlaganje djelovanju RNaze. nim lancem. Prednost ove modelne Premda na temelju ovih pokusa nije reakcije peptidil transferaze jest da se bilo mogu}e isklju~iti potencijalnu moè provesti s izoliranom ribosom- ulogu ribosomnih proteina zaostalih nom podjedinicom 50S; mala ribo- nakon ekstrakcije, dobiveni su rezultati somna podjedinica, drugi proteinski pruìli sna`nu potporu pretpostavci faktori, kao ni mRNA nisu potrebni za odvijanje ove reakcije. Istraìva~i su zatim ispitali ulogu rRNA mjerenjem peptidil-transferazne aktivnosti podjedinice 50S iz koje su ribosomni proteini uklonjeni standardnim postupcima ekstrakcije proteina. Vaàn detalj ovih pokusa bila je uporaba ribosoma iz bakterije Thermus aquaticus. S obzirom na to da ove bakterije ìve pri visokim temperaturama, smatf-Metralo se da je struktura njihove rRNA ekstrakcija puro + + proteina stabilnija od strukture rRNA iz E. coli. RNaza + + Klju~an je bio rezultat da je peptidiltransferazna aktivnost ribosoma iz T. aquaticus bila u potpunosti otpor na na Peptidil-transferazna aktivnost mjerena sna`ne ekstrakcijske postupke, primje pra}enjem nastalog radioaktivnog Njenu detergenata, proteaza i fenola formilmetionin-puromicina (f-Met-puro), (vidi sliku). [to je jo{ zna~ajnije, pep- primjenom elektroforeze i autoradiografije. Ribosomi iz T. aquaticus izloèni su ekstraktidil-transferazna aktivnost bila je u ciji proteina ili djelovanju RNaze, kao {to je potpunosti o~uvana ~ak i nakon ponovpokazano na slici.
zirati reakcije s RNA-supstratima. Uloga rRNA u stvaranju peptidne veze pro{iruje kataliti~ku aktivnost RNA izvan samoreplikacije, sve do izravne uklju~enosti u sintezu proteina. Dodatne studije, koje su pokazale da ribozimska rRNA iz praìvotinje Tetrahymena moè katalizirati vezanje aminoki-
289
o izravnom sudjelovanju ribosomne RNA 23S u peptidil transferaznoj reakciji.
Utjecaj
Rezultati Nollerovih pokusa kona~no su potvr|eni analizom 50S ribosomne podjedinice pri visokom razlu~ivanju koju su 2000. godine objavili Peter Moore, Thomas Steitz i njihovi suradnici. Pokazano je da mjesto na ribosomu u kojem se odvija peptidil-transferazna reakcija sadràva samo rRNA, a da
ribosomni proteini nisu prisutni. Ovi su rezultati uklonili svaku sumnju o kataliti~koj ulozi rRNA u ovoj reakciji te su pokazali da temeljnu reakciju sinteze proteina katalizira ribosomna RNA. Ova otkri}a ne samo da su imala snaàn utjecaj na na{e razumijevanje funkcije ribosoma, ve} su uvelike pro{irila spoznaje o prethodno opisanim kataliti~kim aktivnostima molekula RNA te su osigurala nove vrijedne dokaze koji govore u prilog hipotezi prema kojoj je rani period evolucije bio svijet RNA
napu~en samorepliciraju}im molekulama RNA. Ova je hipoteza prethodno temeljena na sposobnosti molekula RNA da kataliziraju reakcije potrebne za njihovu vlastitu replikaciju. Otkri}e da RNA moè katalizirati reakcije koje sudjeluju u sintezi proteina, pruìlo je dokaz o izravnoj vezi izme|u svijeta RNA i protoka geneti~ke informacije u danas postoje}im stanicama, u kojima rRNA sudjeluje u klju~nim reakcijama stvaranja peptidne veze.
selina na RNA, otvorile su mogu}nost da su izvorne aminoacil-tRNA-sintetaze vjerojatno bile ribonukleinske kiseline, a ne proteini. înjenica da molekule RNA mogu katalizirati reakcije potrebne za sintezu proteina kao i reakcije samoreplikacije, moè predstavljati va`nu sponu za razumijevanje rane evolucije stanica.
Organizacija mRNA i inicijacija translacije

Premda su mehanizmi sinteze proteina u prokariotskim i eukariotskim stanicama sli~ni, postoje i neke razlike, posebice u signalima koji odre|uju mjesto po~etka sinteze proteina na kalupu mRNA (slika 7-7). Translacija ne zapo~inje na 5' kraju mRNA, ve} na specifi~nom inicijacijskom mjestu. Stoga su i kod prokariotskih i kod eukariotskih mRNA dijelovi na 5' kraju nekodiraju}i sljedovi, nazvani 5' podru~je koje se ne prevodi. Eukariotska mRNA uglavnom kodira samo jedan polipeptidni lanac, ali mnoge prokariotske mRNA kodiraju vi{e polipeptida koji se sintetiziraju neovisno, s tim da sinteza zapo~inje na zasebnim inicijacijskim mjestima. Primjerice, lac operon iz E. coli sadràva tri gena koji se prevode s iste mRNA (vidi sliku 6-9). Glasni~ke RNA koje kodiraju vi{e polipeptida nazvane su policistron-
prokariotska mRNA vi{estruka mjesta po~etka translacije UTR 5' protein 1 protein 2 protein 3 UTR 3'
Slika 7-7. Prokariotske i eukariotske mRNA.

eukariotska mRNA jedino mjesto po~etka translacije UTR 5' m7G protein 1 UTR AAAA(n) 3'
I prokariotske i eukariotske mRNA sadrè regije koje se ne prevode (UTR) na svojim 5' i 3' krajevima. Eukariotske mRNA sadràvaju tako|er 5' 7-metilgvanozinske (m7G) kape i 3' poli-A repove. Prokariotske su mRNA ~esto policistronske: kodiraju vi{e proteina, od kojih se svaki prevodi s neovisnog mjesta po~etka translacije. Eukariotske mRNA naj~e{}e su monocistronske, odnosno, kodiraju samo jedan protein.
290
Poglavlje 7
Slika 7-8. Signali za inicijaciju translacije.

Inicijacijska mjesta na prokariotskim mRNA obiljeèna su slijedom ShineDelgar no koji prethodi inicijacijskom kodonu AUG. Sparivanje baza iz slijeda Shine-Delgar no i komplementar nog slijeda blizu 3' kraja 16S rRNA smje{ta mRNA na ribosom. Suprotno tomu, eukariotske su mRNA na 40S ribosomnu podjedinicu vezane preko svojih 5' 7-metilgvanozinskih kapa. Ribosom zatim pretraùje uzdu` mRNA sve dok ne nai|e na inicijacijski kodon AUG.
prokariotska mRNA 5'
slijed Shine-Delgarno
AGGAGGUU U UUGACCUA A AUG UCCUCCA
3'
16S rRNA 3' eukariotska mRNA 5' kapa m7G 40S ribosomska podjedinica 5' kapa m7G
5'
AUG
3'
pretraìvanje ribosoma
AUG
3'
ske, dok monocistronske mRNA kodiraju jedan polipeptidni lanac. Kona~no, i prokariotske i eukariotske mRNA zavr{avaju 3' podru~jem koje se ne prevodi. I u prokariotskim i u eukariotskim stanicama, translacija uvijek zapo~inje aminokiselinom metioninom, koja je naj~e{}e kodirana kodonom AUG. Alternativni inicijacijski kodoni, kao {to je primjerice kodon GUG, povremeno se koriste kod bakterija, ali kad se na|u na mjestu po~etka polipeptidnog lanca ti kodoni odre|uju ugradnju metionina, a ne aminokiseline koju normalno kodiraju (GUG je kodon za valin). Kod ve}ine bakterija, sinteza proteina zapo~inje modificiranim metioninskim ostatkom (N-formilmetioninom), dok kod eukariota sinteza zapo~inje nemodificiranim metioninom (osim u mitohondrijima i kloroplastima, ~iji ribosomi sli~e bakterijskima). Signali koji odre|uju inicijacijske kodone razli~iti su kod prokariotskih i eukariotskih stanica, {to je u suglasju s razli~itim funkcijama policistronskih i monocistronskih mRNA (slika 7-8). Inicijacijskim kodonima u bakterijskim mRNA prethodi specifi~an slijed (nazvan slijed Shine-Delgarno, prema njegovim otkriva~ima) koji sparuju}i se s bazama komplementarnog slijeda na 3' kraju 16S rRNA smje{ta mRNA na ribosom za translaciju. Ovo sparivanje baza omogu}uje bakterijskim ribosomima zapo~injanje translacije ne samo na 5' kraju mRNA ve} i na unutra{njim inicijacijskim mjestima policistronske mRNA. Suprotno tomu, kod eukariota ribosomi ve}inu mRNA prepoznaju vezanjem na 7-metilgvanozinsku kapu smje{tenu na 5' kraju mRNA (vidi sliku 6-41). Ribosomi, zatim, pretraùju mRNA nizvodno od 5' kraja sve dok ne nai|u na inicijacijski kodon AUG. Sljedovi oko kodona AUG utje~u na u~inkovitost inicijacije, pa se u nekim slu~ajevima doga|a da prvi AUG kodon u mRNA bude presko~en te da translacija zapo~ne na sljede}em AUG kodonu koji se nalazi nizvodno. Tako|er treba spomenuti da nekoliko virusnih i neke stani~ne mRNA imaju unutra{nja mjesta ulaza ribosoma, pa na njima translacija moè zapo~eti vezanjem ribosoma na unutra{nji poloàj na mRNA. Ipak, translacija ve}ine eukariotskih mRNA zapo~inje na mjestu odre|enom pretraìvanjem od 5' kraja {to je u skladu s njihovom monocistronskom porukom koja kodira samo jedan polipeptid.
Proces translacije
Proces translacije ili prevo|enja mogu}e je op}enito podijeliti u tri stupnja: inicijaciju, elongaciju i terminaciju (slika 7-9). I kod prokariota i kod eukario-
291
inicijacija
elongacija
terminacija
5' smjer kretanja ribosoma ribosom veè mRNA na start kodonu polipeptid se produljuje stupnjevitim dodavanjem aminokiselina
3'
kad je stop kodon prona|en, polipeptid se otpu{ta, a ribosom disocira
Slika 7-9. Pregled translacije.
ta prvi je korak inicijacijskog stupnja vezanje specifi~ne inicijatorske metionil-tRNA i mRNA za malu ribosomnu podjedinicu. Zatim se ovom kompleksu pridruùje velika ribosomna podjedinica, ~ime je stvoren funkcionalni ribosom na kojem se dalje nastavlja proces elongacije polipeptidnog lanca. Za odvijanje pojedinih stupnjeva procesa translacije nu`na je prisutnost brojnih specifi~nih neribosomnih proteina (tablica 7-1). Kod bakterija prvi translacijski korak predstavlja vezanje tri inicijacijska faktora (IF-1, IF-2 i IF-3) na 30S ribosomnu podjedinicu (slika 7-10). Kompleksu se zatim pridruùju mRNA i inicijatorska N-formilmetionil-tRNA, koju specifi~no prepoznaje IF-2 (na koji je vezan GTP). Potom se otpu{ta IF-3, ~ime je omogu}eno pridruìvanje ribosomne podjedinice 50S. Ovo pridruìvanje poti~e hidrolizu GTP vezanog za IF-2, {to zatim dovodi do otpu{tanja i IF-1 i IF-2 (na koji je sad vezan GDP). Time nastaje inicijacijski kompleks 70S (s mRNA i inicijatorskom tRNA koje su vezane na ribosom) koji je spreman zapo~eti stvaranje peptidne veze tijekom elongacijskog stupnja translacije. Inicijacija je kod eukariota mnogo sloènija i zahtijeva barem deset proteina (svaki se sastoji od vi{e polipeptidnih lanaca), nazvanih eIF (eukariotski inicijacijski faktori; vidi tablicu 7-1). Faktori eIF-1, eIF-1A, eIF-3 i eIF-5 veù se za 40S ribosomnu podjedinicu, a eIF-2 (koji je prisutan u kompleksu s GTP) se veè na inicijatorsku metionil-tRNA (slika 7-11). Glasni~ku RNA prepoznaju i na ribosom donose faktori skupine eIF-4. Elongacijski faktor eIF-4E prepoznaje 5' kapu glasni~ke mRNA, dok se eIF-4G veè i na eIF-4E i na protein (protein koji veè poli-A ili PABP) povezan s poli-A repom na 3' kraju mRNA. Na taj na~in, eukariotski inicijacijski faktori prepo-
Tablica 7-1. Translacijski faktori

Uloga
Inicijacija
Prokarioti
IF-1, IF-2, IF-3
Eukarioti
eIF-1, eIF-1A, eIF-2, eIF-2B, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4E, eIF-4G, eIF-5 eEF-1a, eEF-1bg, eEF-2 eRF-1, eRF-3
Elongacija Terminacija
EF-Tu, EF-Ts, EF-G RF-1, RF-2, RF-3
292
Poglavlje 7
Antibiotici i sinteza proteina

Bolest
Bakterije su odgovor ne za {irok spektar potencijalno smrtonosnih zaraznih bolesti, kao {to su tuberkuloza, bakterijska upala plu}a, meningitis dje~je dobi, infekcije rana i opeklina, sifilis i gonoreja. Prije ~etrdesetih godina 20. stolje}a, lije~nici nisu imali u~inkovitu terapiju za ove bakterijske infekcije. Upravo su tih godina pr vi antibiotici postali dostupni za klini~ku uporabu. Mogu}nost izlje~enja infekcija za koje prethodno nije bilo terapije te zna~ajno produljenje prosje~noga ljudskog ìvota bilo je izravna posljedica uvo|enja antibiotika u klini~ku praksu. Danas je u uporabi vi{e od stotinu antibiotika koji osiguravaju u~inkovitu terapiju bakterijskih infekcija. njihov rast, a pri tome ne smije biti toksi~an za ~ovjeka. Stoga je djelovanje ve}ine antibiotika, koji su klini~ki primjenjivi, usmjereno na ciljeve koji su prisutni u bakterijskim, ali ne i u ljudskim stanicama. Penicilin, primjerice, inhibira sintezu stani~ne stijenke bakterije (vidi 12. poglavlje). Mnogi, uobi~ajeno kori{teni antibiotici inhibiraju pojedine korake sinteze proteina (vidi tablicu). Neki od ovih antibiotika, primjerice streptomicin, tetraciklin, kloramfenikol i eritromicin, specifi~no djeluju na prokariotske ribosome te su stoga u~inkoviti agensi za lije~enje bakterijskih infekcija. Djelovanje drugih antibiotika, inhibitora proteinske sinteze, usmjereno je i na eukariote i na prokariote (primjerice, puromicin) ili samo na eukariote (primjerice, cikloheksimid). Premda ovi antibiotici o~igledno nisu prihvatljivi za klini~ku primjenu, upravo su se oni pokazali kao va`ne eksperimentalne alatke za studije sinteze proteina i kod prokariotskih i kod eukariotskih stanica.
Uporaba antibiotika imala je snaàn utjecaj na moder nu medicinu omogu}iv{i lije~nicima lije~enje za ìvot pogubnih bakterijskih infekcija. Na àlost, mutacije ipak mogu dovesti do razvoja bakterijskih sojeva koji su rezistentni na antibiotike. Mnogo je bakterijskih sojeva danas rezistentno na jedan ili vi{e antibiotika, tako da lije~nici ponekad moraju isprobati nekoliko razli~itih antibiotika prije no {to na|u jedan koji je u~inkovit. [tovi{e, {irenje bakterijske rezistencije stavilo je neke antibiotike izvan uporabe. Mnogo je ozbiljnija ~injenica da su nastali bakterijski sojevi koji su rezistentni na vi{e antibiotika, a neki od njih, koji su ~esto prisutni u bolnicama, otporni su na sve, osim mo`da na jedan ili tek nekoliko poznatih antibiotika. Nastanak ovakvih sojeva s vi{estrukom rezistencijom {iri spektar neizlje~ivih infekcija uzrokovanih {irenjem bakterija otpor nih na antibiotike to je scenarij koji najavljuje povratak u pre-antibioti~ko vrijeme infektivnih bolesti. Svladavanje bakterija otpornih na antibiotike, kako optimiranjem uporabe trenutno dostupnih antibiotika, tako i razvojem novih antibiotika, predstavlja va`nu brigu u suvremenoj medicinskoj praksi.

Da bi antibiotik bio klini~ki u~inkovit, mora ili ubiti bakterije ili inhibirati
Antibiotici inhibitori sinteze proteina

Antibiotik
Streptomicin Tetraciklin Kloramfenikol Eritromicin Puromicin Cikloheksimid
Ciljna stanica
prokariotska prokariotska prokariotska prokariotska prokariotska i eukariotska eukariotska
U~inak
inhibira inicijaciju i uzrokuje pogrje{no ~itanje inhibira vezanje aminoacil-tRNA inhibira peptidil-transferaznu aktivnost inhibira translokaciju uzrokuje prerani zavr{etak sinteze lanca inhibira peptidil-transferaznu aktivnost
znaju i 5' i 3' kraj mRNA, {to obja{njava stimulatorni u~inak poliadenilacije na translaciju. Inicijacijski faktori eIF-4E i eIF-4G, zajedno s faktorima eIF4A i eIF-4B zatim donose mRNA na ribosomnu podjedinicu 40S, pri ~emu faktor eIF-4G stupa u interakciju s faktorom eIF-3. Ribosomna podjedinica 40S zajedno s vezanom metionil-tRNA i elongacijskim faktorima pretraùje mRNA kako bi otkrila inicijacijski AUG kodon. Kad je kodon AUG prona|en, faktor eIF-5 poti~e hidrolizu GTP vezanog na faktor eIF-2. Inicijacijski se faktori (uklju~uju}i eIF-2 na koji je sada vezan GDP) zatim otpu{taju, a podjedinica 60S veè se na podjedinicu 40S te nastaje inicijacijski kompleks 80S eukariotskih stanica. Nakon nastanka inicijacijskog kompleksa, slijedi elongacija polipeptidnog lanca. Mehanizam elongacije je kod prokariota i eukariota vrlo sli~an
293
30S podjedinica vezanje inicijacijskih faktora
Slika 7-10. Inicijacija translacije kod bakterija.

Prvo se tri inicijacijska faktora (IF-1, IF-2, IF-3) veù za 30S ribosomnu podjedinicu. Zatim se ovom kompleksu pridruùju mRNA i inicijatorska N-formilmetionin (fMet) tRNA, koju prepoznaje faktor IF-2, vezan s GTP IF-3 se zatim otpu{ta, a 50S podje. dinica se veè za kompleks poti~u}i hidrolizu GTP vezanog na IF-2, nakon ~ega se faktori IF-1 i IF-2, na koji je sada vezan GDP otpu{taju. ,
IF-2 IF-1
IF-3
tRNA mRNA 5' 3'

UAC
fMe
IF-3
fMet
UAC
5'
IF-2 AUG IF-1
3'
Pi 50S podjedinica IF-1 fMet GDP IF-2
5'
UAC AUG
3'
(slika 7-12). Na ribosomu postoje tri mjesta za vezanje tRNA, nazvana mjesto P (peptidil), mjesto A (aminoacil) i mjesto E (izlazno, engl. exit). Inicijatorska metionil tRNA vezana je na mjesto P Prvi je korak elongacije veza. nje sljede}e aminoacil-tRNA na mjesto A, {to se odvija na temelju sparivanja baza antikodona s bazama drugog kodona na mRNA. Aminoacil-tRNA do ribosoma prati elongacijski faktor (EF-Tu kod prokariota, eEF-a kod eukariota) koji se nalazi u kompleksu s GTP Odabir ispravne aminoacil-tRNA . za ugradnju aminokiseline u rastu}i polipeptidni lanac klju~an je korak koji odre|uje to~nost sinteze proteina. Premda se ovaj odabir temelji na sparivanju baza kodona mRNA i baza antikodona na tRNA, samo sparivanje baza nije dovoljno da bi se osigurala to~nost sinteze proteina kojoj je u~estalost pogrje{ke manja od 103. Ovako veliku to~nost osigurava dekodiraju}i centar u maloj ribosomnoj podjedinici, koji prepoznaje pravilno spojene kodon-antikodon parove baza, odnosno razlikuje ih od nepravilno spojenih. Smje{tanje ispravne aminoacil-tRNA u mjesto A poti~e konformacijsku promjenu koja inducira hidrolizu GTP vezanog na EF-Tu te otpu{tanje
294
Poglavlje 7
Slika 7-11. Inicijacija translacije kod eukariotskih stanica.

Inicijacijski faktori eIF-3, eIF-1A i eIF-5 veù se na 40S ribosomnu podjedinicu. Inicijatorsku metionil-tRNA na ribosom donosi faktor eIF-2 (u kompleksu s GTP), mRNA donose faktori eIF-4E (koji se veè na 5' kapu), eIF-4G (koji se veè i na eIF-4 na 5' kapi i na PABP na 3' poliA repu), eIF-4A i eIF-4B. Ribosom zatim nizvodno pretraùje mRNA sve dok ne nai|e na prvi AUG inicijacijski kodon. Za pretraìvanje je potrebna energija, pa se ovaj proces stoga odvija uz hidrolizu ATP Kad je inicijacijski kodon AUG . otkriven, faktor eIF-5 poti~e hidrolizu GTP vezanog na faktor eIF-2 {to izaziva otpu{tanje eIF-2 (sada u kompleksu s GDP), kao i otpu{tanje ostalih faktora inicijacije. Zatim se 40S kompleksu pridruùje 60S ribosomna podjedinica.
40S podjedinica vezanje inicijacijskih faktora
eIF-3 eIF-5 eIF-1A eIF-1 3' AAAAAA PABP eIF-4G eIF-4E 5' m7G eIF-4A eIF-4B mRNA eIF-2
UAC
Met
Met eIF-4G eIF-4E eIF-4A eIF-2 eIF-4B UAC eIF-3 m7G eIF-1A eIF-1
5'
AUG
3'
pretraìvanje ADP
Pi
eIF-4E
GDP eIF-2 eIF-5 Met eIF-1A eIF-1 eIF-3
eIF-4G eIF-4A eIF-4B
60S podjedinica
5' m7G
UAC AUG
3'
ovog elongacijskog faktora na koji je sada vezan GDP Nedavne su struktur. ne studije ribosoma polu~ile zna~ajan rezultat prema kojem se prepoznavanje pravilnog kodon-antikodon para u dekodiraju}em centru, kao i peptidil-transferazna aktivnost, temelji poglavito na aktivnosti ribosomne RNA, a ne proteina. Jednom kad je EF-Tu (ili eEF-1a) napustio ribosom, izme|u inicijatorske metionil-tRNA smje{tene u mjestu P i druge aminoacil-tRNA smje{tene u mjestu A, moè nastati peptidna veza. U ovoj reakciji, koju katalizira velika ribosomna podjedinica, klju~nu ulogu ima RNA (kao {to je prethodno obja{njeno). Rezultat je prijenos metionina na aminoacil-tRNA, smje{tenu u mjestu A ribosoma, pri ~emu na tom mjestu nastaje peptidil-tRNA, a nenabijena inicijatorska tRNA napu{ta mjesto P Sljede}i korak elongacije je . translokacija, za koju je potreban drugi elongacijski faktor (EF-G kod proka-
295
Slika 7-12. Elongacijski stupanj translacije.

Na ribosomu postoje tri mjesta vezanja tRNA, ozna~ena kao mjesto P (peptidil), mjesto A (aminoacil) i E (izlazno, engl. exit). Inicijacijska N-formilmetionin-tRNA smje{ta se u mjesto P dok je mjesto A prazno. Drugu aminoacil-tRNA (primjerice, , alanil-tRNA) u mjesto A donosi faktor EF-Tu, vezan s GTP Nakon hidrolize GTP fak. , tor EF-Tu (sada vezan s GDP) napu{ta ribosom, u ~ijem je mjestu A sada smje{tena alanil-tRNA. Potom se stvara peptidna veza, pri ~emu se metionin prenosi na aminoacil-tRNA koja se nalazi u mjestu A. Ribosom se potom pomi~e za tri nukleotida uzdu` mRNA. Ovim se pomakom peptidil-(Met-Ala)-tRNA premje{ta u mjesto P a , nenabijena tRNA u mjesto E, ostavljaju}i prazno mjesto A spremno za prihvat sljede}e aminoacil-tRNA. Translokacija je posredovana faktorom EF-G, a pra}ena je hidrolizom GTP Na slici je shematski prikazano odvijanje ovog procesa kod prokariota, . koji je i kod eukariota veoma sli~an. (U tablici 7.1 navedena su imena eukariotskih elongacijskih faktora.)
P E 5'
fMet
A
GCC
3'
Ala
CGG
Pi GDP EF-Tu
riota, a eEF-2 kod eukariota). Ovaj je korak, kao i prethodni, pra}en hidrolizom GTP Za vrijeme translokacije, ribosom se pomi~e za tri nukleotida uz. du` mRNA, smje{taju}i sljede}i kodon u prazno mjesto A. Ovim se korakom peptidil-tRNA iz mjesta A premje{ta u mjesto P a nenabijena tRNA iz , mjesta P u mjesto E. Time ribosom ostaje s peptidil-tRNA smje{tenom u mjestu P i praznim mjestom A. Vezanje nove aminoacil-tRNA u mjesto A poti~e otpu{tanje nenabijene tRNA iz mjesta E, ~ime je ribosom spreman za ugradnju nove aminokiseline u rastu}i polipeptidni lanac. Kako se elongacija nastavlja, EF-Tu (ili eEF-1a) koji je s ribosoma otpu{ten u kompleksu s GDP mora biti vra}en u oblik EF-Tu/GTP (slika 7-13). Za ovu pretvorbu potreban je tre}i elongacijski faktor, EF-Ts (eEF-1bg kod eukariota) koji se veè na EF-Tu/GDP kompleks i poti~e zamjenu vezanog GDP s GTP Rezultat ove izmjene je obnavljanje kompleksa EF-Tu/GTP koji . , je sada spreman za pra}enje nove aminoacil-tRNA u mjesto A na ribosomu, ~ime zapo~inje novi ciklus elongacije. Regulacija EF-Tu vezanjem i hidrolizom GTP tipi~an je primjer regulacije proteinske aktivnosti. Sli~ni mehanizmi kontroliraju aktivnosti mno{tva proteina uklju~enih u regulaciju stani~nog rasta i regulacije, kao i transporta i sekrecije proteina.
Ala
5'
UAC AUG
CGG GCC
3'
stvaranje peptidne veze

fMe t Al a
5'
CGG GCC
3'
EF-G tRNA vezana na ribosom Ala 5 3 GDP

fMet
translokacija
Ala
Ala
fM
et
tRNA Ala
EF-Tu
5'
AUG
3'
CGG
Pi
Slika 7-13. Obnavljanje kompleksa EF-Tu/GTP.

GDP EF-Tu EF-Ts aktivan oblik EF-Tu inaktivan oblik
GDP
Faktor EF-Tu u kompleksu s GTP prati aminoacil-tRNA do ribosoma. Kad je ispravna tRNA smje{tena na ribosom, GTP se hidrolizira, a faktor EF-Tu, sada u kompleksu s GTP otpu{ta. , Kompleks EF-Tu/GDP je inaktivan i kao takav ne moè vezati novu tRNA. Kako bi se translacija mogla nastaviti, ovaj se kompleks mora obnoviti, odnosno prevesti u aktivan oblik ET-Tu/GTP Obnavljanje kompleksa EF-Tu katalizira drugi faktor, . EF-Ts, koji poti~e izmjenu GDP sa slobodnim GTP .
296
Poglavlje 7
Slika 7-14. Terminacija translacije.

Terminacijski kodon (primjerice UAA) prepoznaje faktor otpu{tanja, a ne specifi~na tRNA. Posljedica prepoznavanja stop kodona je otpu{tanje dovr{enoga polipeptidnoga lanca, nakon ~ega tRNA i mRNA disociraju sa ribosoma.
E 5'
P
UCU AGA
A
UAA
3'
faktor za otpu{tanje
E 5'
P
UCU AGA
A
UAA
3'
Elongacija polipeptidnog lanca nastavlja se sve dok u mjesto A na ribosomu ne do|e stop kodon (UAA, UAG ili UGA). Stanice ne sadràvaju transportne RNA s antikodonima koji su komplementarni ovim terminacijskim signalima; umjesto toga postoje faktori za otpu{tanje koji prepoznaju ove signale i zavr{avaju sintezu proteina (slika 7-14). Prokariotske stanice sadràvaju dva faktora za otpu{tanje koji prepoznaju terminacijske kodone: faktor RF-1 prepoznaje UAA ili UAG, a faktor RF-2 prepoznaje UAA ili UGA (vidi tablicu 7-1). U eukariotskim stanicama prisutan je samo jedan faktor za otpu{tanje (eRF-1) koji prepoznaje sva tri terminacijska kodona. I prokariotske i eukariotske stanice sadràvaju tako|er i tre}i faktor za otpu{tanje (RF-3 kod prokariota, a eRF-3 kod eukariota). On ne prepoznaje specifi~ni terminacijski kodon, ve} djeluje zajedno s RF-1 (ili eRF-1) i RF-2. Faktori za otpu{tanje se veù na terminacijski kodon u mjestu A i poti~u hidrolizu veze izme|u tRNA i polipeptidnog lanca u mjestu P {to rezultira otpu{tanjem , dovr{enog polipeptida s ribosoma. Zatim se otpu{ta tRNA, a ribosomne podjedinice i kalup mRNA disociraju. I kod prokariota i kod eukariota sinteza proteina iz glasni~ke RNA moè se odvijati istovremeno na nekoliko ribosoma. Jednom, kad se ribosom makne s inicijacijskog mjesta, drugi se ribosom moè vezati na mRNA i zapo~eti sintezu novog polipeptidnog lanca, tako da se mRNA uglavnom prevode serijom ribosoma koji su me|usobno udaljeni 100200 nukleotida (slika 7-15). Skupina ribosoma vezana na jednu molekulu RNA naziva se poliribosom ili polisom. Svaki ribosom unutar skupine funkcionira neovisno, {to rezultira nastajanjem zasebnih polipeptidnih lanaca.
Regulacija translacije
E 5' P
UCU AGA
A
UAA
3'
UCU
3' 5'
Premda je transkripcija primarna razina na kojoj se odvija kontrola ekspresije gena, translacija mRNA tako|er je regulirana, kako kod prokariotskih, tako i kod eukariotskih stanica. Jedan na~in regulacije translacije jest vezanje represorskih proteina koji sprje~avaju translaciju na specifi~ne sljedove mRNA. Dobro prou~en primjer ovog mehanizma kod eukariotskih stanica jest regulacija sinteze feritina, proteina koji pohranjuje èljezo unutar stanice. Translaciju feritina regulira dostupnost èljeza: vi{e se feritina sintetizira kad je èljezo prisutno (slika 7-16). Ova je regulacija posredovana proteinom koji se, kada èljezo nije prisutno, veè za slijed u 5' podru~ju koje se ne prevodi glasni~ke RNA za feritin (nazvan elementom odgovora na èljezo, engl. iron response element ili IRE) te na taj na~in blokira translaciju feritina. U prisutnosti èljeza, represor se ne veè na IRE, pa se translacija moè dalje odvijati. Zanimljivo je da je regulacija translacije mRNA za feritin s pomo}u èljeza sli~na regulaciji stabilnosti mRNA za transferinski receptor o ~emu je bilo govora u prethodnom poglavlju (vidi sliku 6-51). Naime, stabilnost mRNA za transferinski receptor regulirana je vezanjem proteina na IRE koji se nalazi u njezinom 3' podru~ju koje se ne prevodi. Isti se protein veè i na slijed IRE u mRNA za feritin i u mRNA za transferin. Me|utim, posljedice vezanja istog proteina na IRE sljedove su razli~ite. Vezanje proteina na IRE u mRNA za transferinski receptor {titi mRNA od razgradnje, a ne inhibira njezinu translaciju. Ovi razli~iti u~inci posljedica su razli~itog smje{taja IRE sljedova u ovim dvjema mRNA. Da bi djelovao kao mjesto za vezanje represora, IRE mora biti smje{ten unutar 70 nukleotida od 5' kraja mRNA
297
(A)
(B) polipeptidni lanac u nastajanju
5' smjer kretanja ribosoma 50 nm
3'
Slika 7-15. Polisomi.

Translacija se istodobno odvija na mno{tvu ribosoma nanizanih uzdu` mRNA (polisom). (A) Elektronska mikrografija eukariotskog polisoma. (B) Uop}eni shematski prikaz polisoma. Uo~ite da su na ribosomima koji su bliè 3 kraju mRNA, polipeptidni lanaci duì. (A, iz M. Boublik et al. 1990. The Ribosome, str. 117., susretljivo{}u Ameri~koga dru{tva za mikrobiologiju.)
za transferin, {to upu}uje na to da vezanje proteina na IRE blokira translaciju time {to interferira s prepoznavanjem kape (na 5' kraju mRNA) i s vezanjem na 40S ribosomnu podjedinicu. S druge pak strane, vezanje proteina na isti slijed smje{ten unutar 3' podru~ja koje se ne prevodi glasni~ke RNA za transferinski receptor {titi mRNA od razgradnje nukleazama. Na taj na~in, vezanje istog regulatornog proteina na razli~ita mjesta unutar molekule mRNA moè imati razli~ite u~inke na gensku ekspresiju; u jednom slu~aju inhibira translaciju, a u drugom stabilizira mRNA poja~avaju}i sintezu proteina. Regulacija translacije iznimno je va`na tijekom ranog razvoja organizma. Kao {to je bilo govora u 6. poglavlju u oocitama je mno{tvo mRNA pohranjeno u obliku koji se ne prevodi; translacija ovih pohranjenih mRNA aktivira se fertilizacijom ili u kasnijim fazama razvoja. Jedan od mehanizama ovakve regulacije translacije jest kontrolirana poliadenilacija oocitnih mRNA. U oocitama je pohranjeno mno{tvo mRNA s kratkim poli-A repovima (pribli`no 20 nukleotida) koje se ne prevode. U odgovaraju}em stadiju razvoja pohranjene se mRNA poti~u na translaciju produljenjem njihovih poli-A repova do nekoliko stotina nukleotida. Uz to, ~ini se da je translacija nekih mRNA tijekom razvoja regulirana represorskim proteinima koji se veù na specifi~ne sljedove u 3' podru~ju koje se ne prevodi. Proteini koji se veù na 3' podru~ja koja se ne prevode glasni~ke RNA odgovorni su i za smje{taj molekula mRNA u specifi~na podru~ja u stanici, ~ime je omogu}ena sinteza proteina u specifi~nim unutarstani~nim podru~jima. Smje{taj molekula mRNA vaàn je dio regulacije translacije u mnogim stani~nim tipovima, uklju~uju}i jaja{ca, embrije, ìv~ane stanice i pokretne fibroblaste. Primjerice, smje{taj molekula mRNA u specifi~nom podru~ju jaja{ca ili embrija igra va`nu ulogu u razvoju time {to osigurava odvijanje sinteze proteina u odgovaraju}em mjestu razvijaju}eg embrija (slika 7-17). Smje{taj molekula mRNA usko je povezan s regulacijom njihove
mRNA za feritin IRE 5' kapa m7G
regija koja kodira protein AAAA(n) 3'
Slika 7-16. Regulacija translacije feritina.

Glasni~ka RNA za feritin blizu svoje 5 kape sadràva element odgovora na èljezo (IRE). Kad je èljezo prisutno u dovoljnim koli~inama, translacija mRNA za feritin odvija se nor malno. Ako èljezo nedostaje, protein (nazvan proteinom koji veè element odgovora na èljezo ili IRE-BP) se veè na IRE i time sprje~ava translaciju mRNA.
zadovoljavaju}a koli~ina èljeza m7G IRE translacija se odvija AAAA(n) IRE- B m7G
nedostatnost èljeza AAAA(n)
IRE translacija je zaustavljena
298
Poglavlje 7
100 mm
Slika 7-17. Smje{taj mRNA u oocitama vrste Xenopus.

Hibridizacijom in situ prikazan je smje{taj mRNA za Xlerk u vegetativnoj kori oocita vrste Xenopus. (Susretljivo{}u Jamesa Deshlera, Sveu~ili{te u Bostonu.)
translacije, tako da se proteini koje te mRNA kodiraju, sintetiziraju tek kada se, u odgovaraju}em razvojnom stadiju, mRNA pravilno smjesti. Nedavne su studije pokazale da translacija mRNA, osim proteinima, moè biti regulirana i nekodiraju}im molekulama RNA koje su homologne dijelu slijeda mRNA. Ve}ina ovih nekodiraju}ih regulatornih RNA male su dvolan~ane molekule koje poti~u razgradnju svoje ciljne mRNA mehanizmom RNA-interferencije (vidi sliku 3-41). Uloga ovih nekodiraju}ih RNA molekula iznimno je dobro prou~ena kod biljaka: u biljci Arabidopsis thaliana identificirano je pribli`no pedesetak gena ~ija je translacija regulirana ovim mehanizmom. Drugi mehanizam regulacije translacije u eukariotskim stanicama, koji rezultira globalnim u~inkom na cjelokupnu translacijsku aktivnost vi{e nego na translaciju specifi~nih mRNA, uklju~uje modulaciju aktivnosti inicijacijskih faktora, posebice faktora eIF-2 i eIF-4E. Kao {to je ve} obja{njeno, faktor eIF-2 se (u kompleksu s GTP) veè s inicijatorskom metionil-tRNA i donosi je na ribosom. Zatim slijedi otpu{tanje faktora eIF-2, {to je pra}eno hidrolizom GTP a ~ime eIF-2, sada u kompleksu s GDP postaje neaktivan. , , Da bi sudjelovao u sljede}em ciklusu inicijacije, kompleks eIF-2/GTP mora se regenerirati izmjenom vezanog GDP za GTP (vidi sliku 7-18). Ova je izmjena posredovana faktorom eIF-2B. Kontrola aktivnosti eIF-2 putem vezanja/hidrolize GTP sli~na je stoga kontroli aktivnosti faktora EF-Tu (vidi sliku 7-13). Na taj na~in, regulacija aktivnosti faktora eIF-2 osigurava klju~nu kontrolnu to~ku u mnogim eukariotskim stanicama. [tovi{e, faktori eIF-2 i eIF-2B mogu biti fosforilirani regulatornim protein-kinazama. Ove fosforilacije inhibiraju izmjenu vezanog GDP s GTP te na taj na~in inhibiraju inicija, ciju translacije. Primjerice, ako stanicama sisavaca nedostaju faktori rasta, protein-kinaze koje fosforiliraju faktor eIF-2B postaju aktivne, inhibiraju}i nadalje sintezu proteina. Regulacija aktivnosti faktora eIF-4E, koji se veè na 5' kapu molekula mRNA, druga je klju~na to~ka kontrole sinteze proteina faktorima rasta. Primjerice, faktori rasta koji poti~u sintezu proteina u stanicama sisavaca aktiviraju protein-kinaze koje fosforiliraju regulatorne proteine koji veù faktor eIF-4E (nazvane proteinima koji veù eIF-4E ili 4E-BP). U odsutnosti odgovaraju}ih faktora rasta, nefosforilirani 4E-BP veù faktor eIF-4E te inhibiraju translaciju time {to ometaju interakciju faktora eIF-4E i faktora eIF4G (vidi sliku 7-11). Kad su faktori rasta prisutni u dovoljnoj koli~ini, fosforilacija faktora 4E-BP sprje~ava njihovu interakciju s faktorom eIF-4E, {to dovodi do poja~ane inicijacije translacije.
Smatanje i dorada proteina

Translacijom je zavr{en protok geneti~ke informacije unutar stanice. Slijed nukleotida u DNA sada je preveden u slijed aminokiselina u polipeptidnom lancu. Ipak, sinteza polipeptida ne odgovara u potpunosti stvaranju funkcionalnog proteina. Da bi bio uporabljiv, polipeptid se mora smotati u specifi~nu trodimenzionalnu konformaciju, a u mnogo slu~ajeva vi{e se polipeptidnih lanaca mora udruìti u funkcionalni kompleks. Uz to, mnogi proteini podlijeù daljnjim modifikacijama, izme|u ostalog kidanju te kovalentnom vezanju ugljikohidrata i lipida, {to je klju~no za njihovu funkciju i pravilan smje{taj unutar stanice.
[aperoni i smatanje proteina

Trodimenzionalna je konformacija proteina posljedica interakcija izme|u bo~nih ogranaka aminokiselina koje ih izgra|uju, kao {to je obja{njeno u 2. poglavlju. Prema klasi~noj postavci o smatanju proteina, sve informacije
299
(A) zadovoljavaju}a opskrba faktorima rasta Met Met eIF-2 UAC

UAC
Met P E 5'
UAC AUG
Slika 7-18. Regulacija translacije posredovana fosforilacijom faktora eIF-2 i eIF-2B.

Aktivni oblik faktora eIF-2 (u kompleksu s GTP) prati inicijacijsku metionil tRNA do ribosoma (vidi sliku 7-11). S ribosoma se faktor eIF-2 otpu{ta kao inaktivni oblik, u kompleksu s GDP Kako . bi se translacija nastavila, faktor eIF-2 mora biti reaktiviran faktorom eIF-2B, koji poti~e izmjenu vezanog GDP za GTP Translacija se moè inhibirati . (primjerice, ako stanici nedostaju faktori rasta) regulatornim protein-kinazama koje u tom slu~aju fosforiliraju ili faktor eIF-2 ili faktor eIF-2B. Fosforilacija ovih faktora sprje~ava zamjenu GDP za GTP , tako da se kompleks eIF-2/GTP ne moè regenerirati.
A
GCC
3'
translacija se odvija eIF-2 GDP GDP eIF-2
Pi
eIF-2B (B) nedostatnost faktora rasta
Met
Met P E 5'
UAC AUG
eIF-2 UAC
A
GCC
3'
translacija je zaustavljena GDP eIF-2
Pi
P zamjena GDP za GTP je sprije~ena eIF-2B P fosforilacija eIF-2 i eIF-2B
potrebne da bi protein zauzeo pravilnu trodimenzionalnu konformaciju sadràne su u njegovom aminokiselinskom slijedu. Ta postavka potje~e od eksperimenata Christiana Anfinsena koji su pokazali da se u uvjetima in vitro denaturirana RNaza ponovo spontano smata u svoju aktivnu konformaciju (vidi sliku 2-17). Na temelju tih podataka ~inilo se da je smatanje proteina samoudruùju}i proces za koji nisu potrebni dodatni stani~ni ~imbenici. No, nedavne su studije pokazale da ovaj opis ne odgovara u potpunosti smatanju proteina unutar stanice. Pravilno smatanje proteina unutar stanice posredovano je aktivacijom drugih proteina. Proteini koji olak{avaju smatanje drugih proteina nazvani su molekularnim {aperonima. Pojam chaperon prvi su upotrijebili Ron Laskey i suradnici da bi opisali protein (nukleoplazmin) koji je bio potreban za stvaranje nukleosoma iz histona i DNA. Nukleoplazmin se veè na histone i posreduje njihovo udruìvanje u nukleosome, ali se sam nukleoplazmin ne ugra|uje u kona~nu strukturu nukleosoma. [aperoni na taj na~in djeluju kao katalizatori koji olak{avaju udruìvanje, a da se pri tome ne ugra|uju u kompleks. Studije koje su slijedile pro{irile su koncept, pa se danas tim imenom
300
Poglavlje 7
Slika 7-19. Djelovanje {aperona tijekom translacije.

[aperoni se veù na amino (N) terminalni dio polipeptidnog lanca u nastajanju te ga stabiliziraju u njegovom nesmotanom obliku sve dok sinteza lanca nije u potpunosti zavr{ena. Dovr{eni se protein zatim otpu{ta s ribosoma, te se moè smotati u svoju pravilnu trodimenzionalnu konformaciju.
N N N dovr{eni polipeptid je otpu{ten C N
smotani protein
{aperon N
5'
3' mRNA
nazivaju proteini koji posreduju u mnogim drugim procesima udruìvanja, posebice u smatanju proteina. Va`no je uo~iti da {aperoni ne prenose dodatne informacije potrebne za smatanje polipeptida u njihove pravilne trodimenzionalne konformacije ve} da je krajnja konformacija proteina odre|ena isklju~ivo slijedom aminokiselina. Ipak, {aperoni kataliziraju smatanje proteina pomaù}i u procesu samosmatanja. Oni djeluju tako da veù i stabiliziraju nesmotane ili djelomi~no smotane polipeptide koji su me|uprodukti procesa koji vodi do kona~nog pravilno smotanog oblika. U odsutnosti {aperona, nesmotani ili djelomi~no smotani polipeptidni lanci bili bi nestabilni unutar stanice, pa bi se smatali nepravilno ili bi se agregirali u netopljive komplekse. Vezanje {aperona stabilizira ove nesmotane polipeptide ~ime se sprje~ava nepravilno smatanje i agregacija, te na taj na~in omogu}uje smatanje polipeptidnog lanca u njegovu pravilnu konformaciju. Dobar su primjer {aperoni koji se veù na polipeptidni lanac u nastajanju, koji se jo{ uvijek prevodi na ribosomu, te na taj na~in sprje~avaju nepravilno smatanje ili agregaciju amino-terminalnog dijela polipeptida prije nego {to je sinteza cijelog lanca zavr{ena (slika 7-19). Proteini se smataju u domene koje se sastoje od 50 do 300 aminokiselinskih ostataka, pa je nu`no da se lanac u nastajanju za{titi od nepravilnog smatanja ili agregacije s drugim proteinima sve dok sinteza ~itave domene nije zavr{ena i protein moè biti smotan u svoju pravilnu konformaciju. Vezanje {aperona stabilizira aminoterminalni dio u nesmotanoj konformaciji sve dok preostali dio polipeptidnog lanca ne bude sintetiziran, odnosno dok se dovr{eni protein ne bude mogao pravilno smotati. [aperoni tako|er stabiliziraju nesmotane polipeptidne lance za vrijeme njihovog transporta u stani~ne organele primjerice, za vrijeme transporta proteina iz citosola u mitohondrije (slika 7-20). Proteini se kroz mitohondrijsku membranu prenose u djelomi~no smotanoj konformaciji koja je stabilizirana {aperonima iz citosola. Zatim {aperoni unutar mitohondrija olak{avaju prjelazak polipeptidnog lanca kroz membranu te njegovo smatanje unutar organele. Uz to, {aperoni sudjeluju i u udruìvanju proteina koji su izgra|eni od vi{e polipeptidnih lanaca te njihovom udruìvanju u makromolekularne strukture (primjerice, nukleoplazmin). Mnogi proteini za koje je danas poznato da djeluju kao molekularni {aperoni (tablica 7-2) prvotno su otkriveni kao proteini toplinskoga {oka, skupina proteina koja se eksprimira u stanicama koje su bile izloène povi{enim temperaturama ili drugim oblicima stresa iz okoline. Smatra se da
301
polipeptidni lanac
Slika 7-20. Djelovanje {aperona za vrijeme prijenosa proteina.

Djelomi~no smotani polipeptid prenosi se iz citosola u mitohondrij. Citosolni {aperoni stabiliziraju nesmotanu konfiguraciju. Mitohondrijski {aperoni olak{avaju prijenos i smatanje polipeptidnog lanca unutar organela.
mitohondrijski {aperon smotani protein
citosolni {aperon
mitohondrij
proteini toplinskoga {oka (Hsp, od engl. heat-shock protein) koji su visokoo~uvani kod prokariotskih i eukariotskih stanica, stabiliziraju i olak{avaju ponovno smatanje proteina koji su bili djelomi~no denaturani zbog izlaganja povi{enoj temperaturi. Me|utim, mnogi su ~lanovi porodice proteina toplinskog {oka eksprimirani i imaju esencijalnu funkciju u stanici i pod normalnim uvjetima rasta. Ovi proteini sluè kao molekularni {aperoni koji su potrebni za smatanje proteina i njihov transport pod normalnim uvjetima jednako kao u stanicama izloènim stresu iz okoline. Porodice proteina toplinskoga {oka Hsp70 i Hsp60 iznimno su va`ne za cjelokupan proces smatanja proteina u prokariotskim i eukariotskim stanicama. Proteini obiju porodica djeluju tako da se veù na nesmotane dijelove polipeptidnih lanaca. ^lanovi porodice Hsp70 stabiliziraju nesmotane polipeptidne lance tijekom translacije (vidi za primjer sliku 7-19) kao i za vrijeme transporta polipeptida u razli~ite unutarstani~ne odjeljke, kao {to su mitohondriji i endoplazmatski retikul. Ovi se proteini veù za kratke
Tablica 7-2. Molekularni {aperoni

[aperonski proteini Porodica proteina
Hsp70
Prokarioti
DnaK BiP (endoplazmatski retikul) SSC1 (mitohondriji) ctHsp70 (kloroplasti) GroEL Hsp60 (mitohondriji) Cpn60 (kloroplasti) HtpG Grp94 (endoplazmatski retikul)
Eukarioti
Hsc73 (citosol)
Hsp60
TriC (citosol)
Hsp90
Hsp90 (citosol)
302
Poglavlje 7
hidrofobne dijelove (od pribli`no sedam aminokiselinskih ostataka) nesmotanog polipeptida, zadràvaju}i polipeptidni lanac u njegovoj nesmotanoj konformaciji i sprje~avaju}i agregaciju. ^lanovi porodice Hsp60 (nazvani {aperonini) olak{avaju smatanje proteina u njihove nativne konformacije. Svaki se {aperonin sastoji od 14 podjedinica, od kojih je svaka veli~ine pribli`no 60 kilodaltona (kd). Ure|ene su u dva nadsloèna prstena, ~ime stvaraju strukturu dvostrukoga prstena (slika 7-21). Nesmotani polipeptidni lanci za{ti}eni su od citosola tako {to se veù unutar sredi{nje {upljine {aperoninskog cilindra. U ovom izoliranom okruènju smatanje proteina moè se nastaviti, dok je agregacija nesmotanih dijelova polipeptidnog lanca sprije~ena njihovim vezanjem za {aperonin. Vezanje nesmotanih polipeptida reverzibilna je reakcija koja je povezana s hidrolizom ATP koji sluì kao izvor ener, gije. Time hidroliza ATP osigurava vi{estruko ponavljanje otpu{tanja i ponovnog vezanja nesmotanih regija polipeptida za {aperonin, ~ime se omogu}uje postupno Slika 7-21. Struktura {aperonina. smatanje polipeptida u pravilnu konformaciju. GroEL, ~lan porodice Hsp60, po svojem je obliku {uplji cilindar izgra|en od dva nadsloèna prstena. Svaki se prsten U nekim slu~ajevima, ~lanovi porodica Hsp70 i sastoji od sedam podjedinica. (Susretljivo{}u Paula B. Siglera, Hsp60 djeluju u slijedu jedni iza drugih. Primjerice, ~laSveu~ili{te Yale.) novi porodice Hsp70 i Hsp60 djeluju u slijedu tijekom transporta proteina u mitohondrij i za vrijeme smatanja novosintetiziranih proteina u E. coli (slika 7-22). Prvo {aperon Hsp70 stabilizira polipeptidni lanac u nastanku sve dok proteinska sinteza nije zavr{ena. Zatim se nesmotani polipeptidni lanac prenosi na {aperonin Hsp60, u kojem se odvija smatanje proteina, pri ~emu nastaje protein pravilno smotan u svoju funkcionalnu trodimenzionalnu konformaciju. ^lanovi porodice Hsp70 i Hsp60 na|eni su u citosolu i u stani~nim organelima (primjerice mitohondrijima) eukariotskih stanica kao i u bakterijama (vidi tablicu 7-2), tako da se ~ini da djelovanje Hsp70 i Hsp60 u slije-
5'
3'
Hsp60 ADP
Hsp70
prijenos na Hsp60
djelomi~no smotani me|uprodukt ADP
Slika 7-22. Djelovanje {aperona Hsp70 i Hsp60 u slijedu jedan iza drugoga.
Za vrijeme translacije nesmotane polipeptidne lance veù i stabiliziraju {aperoni porodice Hsp70. Nesmotani se proteini zatim prenose na {aperone porodice Hsp60, unutar kojih se odvija smatanje. Za otpu{tanje nesmotanih polipeptidnih lanaca sa Hsp70, kao i za njihovo smatanje unutar Hsp60 nu`na je hidroliza ATP .
smotani protein
303
PDI 1 3
S S SH S
1
S SH S
1
S
1 2
S S S S
2
S S
3
S S
3 SH
4 neispravne disulfidne veze
SH
4 ispravne disulfidne veze
du predstavlja op}i put smatanja proteina. Alternativni put smatanja nekih proteina u citosolu i endoplazmatskom retikulu uklju~uje djelovanje ~lanova porodica Hsp70 i Hsp90. Ve}ina supstrata za smatanje uz Hsp90 su proteini koji sudjeluju u prijenosu signala, uklju~uju}i receptore steroidnih hormona i razli~ite proteinske kinaze.
Slika 7-23. Djelovanje enzima protein-disulfid-izomeraze.

Protein-disulfid-izomeraza (PDI) katalizira kidanje i ponovno stvaranje disulfidnih veza, omogu}uju}i izmjenu sparenih disulfida u polipeptidnom lancu. Enzim stvara disulfidne veze izme|u cisteinskih ostataka polipeptida, a zatim izmjenjuje sparene disulfidne parove s drugim cisteinskim ostatcima. PDI, primjerice, katalizira pretvorbu dvaju parova neispravnih disulfidnih veza (1-2 i 3-4) u ispravne parove (1-3 i 2-4).
Enzimi i smatanje proteina

Osim {aperona, koji olak{avaju smatanje proteina vezanjem i stabilizacijom djelomi~no smotanih me|uprodukata, stanice sadràvaju najmanje dvije vrste enzima koji kataliziraju smatanje proteina. Stvaranje disulfidnih veza izme|u cisteinskih ostataka va`no je za stabilizaciju smotanih struktura mnogih proteina (vidi sliku 2-16). Protein-disulfid-izomeraze, koje je 1963. godine otkrio Christian Anfinsen, kataliziraju kidanje i ponovno stvaranje ovih veza (slika 7-23). Za proteine koji sadràvaju vi{e cisteinskih ostataka, protein-disulfid-izomeraze (PDI) imaju va`nu ulogu u poticanju brze izmjene izme|u sparenih disulfida, omogu}uju}i time proteinu zadràvanje obrasca disulfidnih veza koji je kompatibilan s njegovom stabilno smotanom konformacijom. Disulfidne su veze uglavnom prisutne kod sekretornih proteina i nekih membranskih proteina jer citosol sadràva reduciraju}e agense koji odràvaju cisteinske ostatke u reduciranom (SH) obliku, sprje~avaju}i na taj na~in stvaranje disulfidne (SS) veze. U eukariotskim stanicama disulfidne veze nastaju u endoplazmatskom retikulu, u kojem se odràvaju oksidativni uvjeti. U suglasju s ulogom disulfidnih veza u stabilizaciji sekretornih proteina, aktivnost PDI u endoplazmatskom je retikulu u korelaciji s razinom sekrecije proteina u razli~itim stani~nim tipovima. Drugi enzim koji sudjeluje u procesu smatanja proteina katalizira izomerizaciju peptidnih veza u kojima sudjeluje prolin (slika 7-24). Prolin je aminokiselina neobi~na po tome {to je u ravnoteì izme|u cis i trans konfiguracije peptidnih veza koje prethode prolinskom ostatku, trans oblik je tek blago favoriziran. Suprotno tomu, peptidne veze izme|u drugih aminokiselina gotovo su uvijek u trans obliku. Izomerizacija izme|u cis i trans konfiguracija peptidnih veza koje prethode prolinskom ostatku, koja moè s druge strane predstavljati ograni~avaju}i korak u proteinskom smatanju, katalizirana je enzimom peptidil-prolil-izomerazom. Ovaj enzim {iroko je rasprostranjen i kod prokariotskih i kod eukariotskih stanica i igra va`nu ulogu u smatanju nekih proteina.
O X C N H trans
peptidil-prolilizomeraza Pro X
O C
H N cis Pro
Kidanje proteina
Kidanje polipeptidnoga lanca (proteoliza) vaàn je korak u sazrijevanju nekih proteina. Jednostavan je primjer uklanjanje inicijatorskog metionina s amino-kraja mnogih polipeptida, koji se odvija neposredno nakon {to je amino-kraj rastu}eg polipeptidnog lanca izronio iz ribosoma. Dodatne kemijske skupine, kao {to su acetatna skupina ili lanci masnih kiselina (o ~emu }e se uskoro raspravljati) ~esto se dodaju na amino-terminalni ostatak.
Slika 7-24. Djelovanje peptidil-prolil-izomeraze.

Peptidil-prolil-izomeraza katalizira izomerizaciju cis i trans konformacije peptidne veze u kojoj sudjeluje prolin.
304
Poglavlje 7
kidanje signalnoga slijeda signalna
preneseni protein
membrana ER signalni slijed
mRNA 5'
3'
smjer kretanja ribosoma
Slika 7-25. Uloga signalnoga slijeda u prijenosu proteina kroz membrane.

Signalni slijed usmjerava prijenos polipeptidnog lanca kroz stani~nu membranu bakterija ili u endoplazmatski retikul eukariotskih stanica ({to je prikazano na slici). Signalni slijed, niz hidrofobnih aminokiselina koji se nalazi na amino-kraju polipeptidnog lanca, uranja polipeptidni lanac u membranski kanal ~im lanac izroni iz ribosoma. Zatim se ostatak lanca prenosi kroz kanal, a signalni slijed otkinut djelovanjem signalnih peptidaza, otpu{ta sa zreloga prenesenoga proteina.
Proteoliti~ke modifikacije amino-kraja va`ne su tako|er i za prijenos mnogih proteina kroz membrane, uklju~uju}i sekretorne proteine kod bakterija i eukariota, kao i proteina predodre|enih za ugradnju u stani~nu membranu, lizosome, mitohondrije i kloroplaste eukariotskih stanica. Ovi su proteini usmjereni za prijenos do svojih odredi{ta putem amino-terminalnog slijeda koji se uklanja proteoliti~kim kidanjem kad protein pro|e kroz membranu. Primjerice, amino-terminalni signalni slijed, dug naj~e{}e dvadesetak aminokiselina, usmjerava mnoge sekretorne proteine u stani~nu membranu bakterija ili u endoplazmatski retikul eukariotskih stanica dok je translacija jo{ uvijek u tijeku (slika 7-25). Signalni slijed, koji se uglavnom sastoji od hidrofobnih aminokiselina, uranja u membranski kanal neposredno nakon {to izroni iz ribosoma. Kako se translacija odvija, ostatak polipeptidnoga lanca prolazi kroz kanal u membrani. Zatim se signalni slijed uklanja kidanjem s pomo}u specifi~nih membranskih proteaza (signalne peptidaze), a zreli se protein otpu{ta. U eukariotskim stanicama, translokacija rastu}eg polipeptidnog lanca u endoplazmatski retikul predstavlja prvi korak u usmjeravanju proteina za sekreciju, ugradnju u stani~nu membranu ili ugradnju u lizosome. O mehanizmima koji usmjeravaju transport proteina na ova odredi{ta, kao i o ulozi drugih usmjeravaju}ih sljedova u prijenosu proteina u mitohondrije i kloroplaste bit }e vi{e govora u poglavljima 9 i 10. Drugi vaàn oblik proteoliti~ke dorade jest stvaranje aktivnih enzima ili hormona, kidanjem ve}ih prete~a. Dobar je primjer inzulin, koji se sintetizira kao dugi prekursorski polipeptid, a kona~ni oblik nastaje dvostrukim kidanjem. Po~etni prekursor (preproinzulin) sadràva amino-terminalni slijed koji usmjerava polipeptidni lanac u endoplazmatski retikul (slika 7-26). Uklanjanjem signalnog slijeda tijekom prijenosa u endoplazmatski retikul nastaje drugi prekursor, nazvan proinzulin. Ovaj se prekursor zatim prevodi u inzulin (koji se sastoji od dvaju lanaca povezanih disulfidnim vezama) proteoliti~kim uklanjanjem unutra{njeg dijela peptida. Drugi proteini aktivirani sli~nim procesima kidanja jesu probavni proteini i proteini uklju~eni u zgru{avanje krvi. Zanimljivo je uo~iti da proteini mnogih ìvotinjskih virusa nastaju kidanjem ve}ih prekursora. Jedan iznimno vaàn primjer uloge proteolize u replikaciji virusa na|en je u HIV. Tijekom replikacije HIV, proteaza koja je kodirana u virusu kida polipeptidni prekursor pri ~emu nastaje virusni
305
preproinzulin N signalni slijed
B povezuju}i polipeptid
A C
Slika 7-26. Proteoliti~ka dorada inzulina.

Zrela molekula inzulina izgra|ena je od dvaju polipeptidnih lanaca (A i B) koji su me|usobno povezani disulfidnim vezama. Inzulin se sintetizira kao prekursorski polipeptid preproinzulin. Amino-terminalni signalni slijed otkida se tijekom prijenosa rastu}eg polipeptidnog lanca u endoplazmatski retikul ~ime nastaje sljede}i prekursor (proinzulin). Daljnjom proteolizom, kojom se uklanja unutar nji povezuju}i polipeptid, proinzulin se prevodi u inzulin.
kidanje signalnoga slijeda stvaranje disulfidnih veza N

SS
uklanjanje povezuju}eg polipeptida
SS
A B
SS
B
SS
proinzulin
inzulin
strukturni protein. Zbog sredi{nje uloge u replikaciji virusa, proteaze iz HIV (uz reverznu transkriptazu) va`na su meta za razvoj lijekova za terapiju AIDS. Danas su, uistinu, inhibitori proteaza me|u naju~inkovitijim agensima dostupnim za borbu protiv ove bolesti.
Glikozilacija
Mnogi proteini, posebice u eukariotskim stanicama, modificirani su dodatkom ugljikohidrata, u procesu nazvanom glikozilacija. Proteini na koje je vezan ugljikohidratni lanac (nazvani glikoproteini) uglavnom se izlu~uju ili su smje{teni na stani~noj povr{ini, premda su mnogi jezgreni i citosolni proteini tako|er glikozilirani. Ugljikohidratni dijelovi glikoproteina imaju va`nu ulogu u smatanju proteina u endoplazmatskom retikulu, u usmjeravanju proteina u odgovaraju}e stani~ne odjeljke, te kao mjesta prepoznavanja u me|ustani~nim interakcijama. Ovisno o mjestu vezanja ugljikohidratnog bo~nog lanca, glikoproteini su podijeljeni na N-vezane ili O-vezane (slika 7-27). Kod N-vezanih glikoproteina, ugljikohidrat je vezan na du{ikov atom bo~nog ogranka asparagina. Kod O-vezanih glikoproteina, mjesto vezanja ugljikohidrata je kisikov atom bo~nog ogranka serina ili treonina. [e}eri izravno vezani na te poloàje su N-acetilglukozamin kod N-vezanih {e}era i N-acetilgalaktozamin kod O-vezanih {e}era. Ve}ina glikoproteina u eukariotskim stanicama predodre|ena je za sekreciju ili ugradnju u stani~nu membranu. Ovi se proteini naj~e{}e prenose u endoplazmatski retikul ({to obuhva}a kidanje signalnog slijeda) dok njihova translacija jo{ uvijek traje. Glikozilacija, tako|er, zapo~inje u endoplazmatskom retikulu prije nego {to je translacija u potpunosti zavr{ena. Prvi je korak prijenos osnovnog oligosaharida izgra|enog od 14 {e}ernih
Slika 7-27. Vezanje bo~nih ugljikohidratnih lanaca na glikoproteine.
Ugljikohidratni lanci N-vezanih glikoproteina vezani su na asparagin, dok su ugljikohidratni lanci O-vezanih glikoproteina vezani ili za serin ({to je prikazano na slici) ili treonin. [e}eri preko kojih su ugljikohidratni lanci povezani s proteinom jesu N-acetilglukozamin kod N-vezanih glikoproteina, odnosno N-acetilgalaktozamin kod O-vezanih glikoproteina.
(N-veza) asparagin CH2OH O OH HO NH O C CH3 N-acetilglukozamin vezan na asparagin H HN CH2 C C O
(O-veza) serin CH2OH O OH NH O C CH3 HN O CH2 CH C O
HO
N-acetilgalaktozamin vezan na serin
306
Poglavlje 7
Slika 7-28. Sinteza N-vezanih glikoproteina.

Pr vi korak glikozilacije, koji se odvija u endoplazmatskom retikulu, jest vezanje oligosaharida izgra|enog od 14 {e}ernih ostataka na polipeptid u nastajanju. Oligosaharid (izgra|en od dva N-acetilglukozamina, devet manoza i tri glukoze) vezan je na lipidni nosa~ (dolikol-fosfat) koji je uronjen u membranu ER. Oligosaharid se zatim u cijelosti prenosi na akceptorski asparaginski ostatak polipeptida.
ostataka (2 N-acetilglukozamina, 3 glukoze i 9 manoza) na asparagin rastu}eg polipeptidnog lanca (slika 7-28). Oligosaharid je s endoplazmatskim retikulom povezan putem lipidnog nosa~a (dolikol-fosfata). Oligosaharid se zatim prenosi na intaktnu jedinicu akceptorskog asparagina (Asn) smje{tenog unutar slijeda Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr (gdje je X bilo koja aminokiselina osim prolina). Tijekom daljnje dorade osnovni se N-vezani oligosaharid modificira. Dok se glikoprotein nalazi u endoplazmatskom retikulu, uklanjaju se tri glukozna ostatka i jedna manoza. Oligosaharid se dodatno modificira u Golgijevu aparatu u koji se glikoproteini prenose iz endoplazmatskog retikula. Ove modifikacije (o kojima }e vi{e rije~i biti u 9. poglavlju) obuhva}aju i uklanjanje i dodavanje ugljikohidratnih ostataka kako glikoprotein prolazi kroz odjeljke Golgijeva aparata (slika 7-29). N-vezani oligosaharidi razli~itih glikoproteina dora|uju se u razli~itoj mjeri, ovisno o enzimima koji su prisutni u razli~itim stanicama kao i o dostupnosti oligosaharida enzimima koji kataliziraju ove modifikacije. Glikoproteini s nedostupnim oligosaharidima ne dobivaju nove {e}ere u Golgijevu aparatu. Relativno jednostavni oligosaharidi ovih glikoproteina nazivaju se oligomanozni oligosaharidi jer sadràvaju velik udio manoznih ostataka, a sli~ni su osnovnom oligosaharidu prvotno dodanom u endoplazmatskom retikulu. Suprotno tomu, glikoproteini s dostupnim oligosaharidima intenzivno se procesiraju {to rezultira stvaranjem raznolikih kompleksnih oligosaharida. O-vezani oligosaharidi se na polipeptide tako|er dodaju u Golgijevu aparatu. Suprotno N-vezanim oligosaharidima, O-vezani oligosaharidi nastaju dodavanjem jednog po jednog {e}era i naj~e{}e se sastoje od samo
mRNA
membrana ER
P P Asn N manoza dolikol-fosfat N-acetilglukozamin Asn N
P P
glukoza

Slika 7-29. Tipovi N-vezanih oligosaharida.
307
Asn
manoza -acetilglukozamin galaktoza fukoza sijalinska kiselina
oligomanozni oligosaharid Asn
hibridni oligosaharid Asn
kompleksni oligosaharid Asn
Razli~iti oligosaharidi nastaju daljnjim modifikacijama osnovnog oligosaharida, izgra|enog od 14 {e}ernih jedinica, koji je dodan na protein u endoplazmatskom retikulu (vidi sliku 7-28). Oligomanozni tip oligosaharida nastaje iz osnovnog oligosaharida uklanjanjem glukoznih ostataka i nekih manoznih ostataka, bez dodatka drugih {e}era. Tijekom sinteze kompleksnih oligosaharida, mnogi se manozni ostatci uklanjanju, a dodaju se drugi {e}eri. Hibridni su oligosaharidi po svojoj strukturi inter medijari izme|u oligomanoznih i kompleksnih oligosaharida. Prikazane su strukture reprezentativni primjerci.
nekoliko ostataka (slika 7-30). Mnogi citoplazmatski i jezgreni proteini, uklju~uju}i mnoge transkripcijske faktore, modificirani su dodatkom jednog O-vezanog N-acetilglukozaminskog ostatka, {to je katalizirano drugim enzimskim sustavom. Me|utim, uloga ugljikohidrata u funkciji ovih citoplazmatskih i jezgrenih glikoproteina jo{ nije razja{njena.
Vezanje lipida
Neki proteini eukariotskih stanica modificirani su vezanjem lipida na polipeptidni lanac. Ove modifikacije naj~e{}e sluè za usmjeravanje i sidrenje proteina u stani~nu membranu, u koju se hidrofobni lipid moè uklopiti (vidi sliku 2-48). Uobi~ajena su tri tipa lipidnih modifikacija N-miristilacija, prenilacija i palmitacija, i to na eukariotskim proteinima koji su povezani s citosolnom stranom stani~ne membrane. êtvrti tip modifikacije, dodatak glikolipida, ima va`nu ulogu u sidrenju nekih povr{inskih proteina u vanjsku stranu stani~ne membrane. Na neke se proteine masna kiselina veè na amino-kraj rastu}eg polipeptidnog lanca za vrijeme translacije. U tom procesu, nazvanom N-miristilacija, miristinska kiselina (masna kiselina izgra|ena od 14 ugljikovih atoma) veè se na N-terminalni glicin (slika 7-31). Glicin je ~esto druga po redu aminokiselina ugra|ena u polipeptidni lanac, a inicijatorski se metionin uklanja proteolizom prije dodatka masne kiseline. Mnogi proteini koji su modificirani N-miristilacijom povezani su s unutra{njom stranom stani~ne membrane. Ulogu masne kiseline u tom povezivanju jasno su pokazale analize mutiranih proteina kod kojih je N-terminalni glicin zamijenjen alaninom. Ovom je zamjenom sprije~ena miristilacija te je blokirana funkcija mutiranih proteina time {to je onemogu}eno njihovo povezivanje s membranom.
Ser
Ser
N-acetilglukozamin galaktoza sijalinska kiselina
Slika 7-30. Primjeri O-vezanih oligosaharida.

O-vezani oligosaharidi naj~e{}e se sastoje od tek nekoliko ugljikohidratnih ostataka, koji se dodaju jedan po jedan.
308
Poglavlje 7
Slika 7-31. Dodatak masnih kiselina N-miristilacijom.

Uklanjanjem po~etnog metionina, na N-kraju polipeptidnog lanca ostaje glicin. Zatim se dodaje miristinska kiselina (masna kiselina izgra|ena od 14 ugljikovih atoma).
Met Gly
uklanjanje po~etnog metionina
Gly miristilacija N-terminalnog glicina miristat O C N CH3 H glicin O CH2 C
Lipidi na protein mogu biti vezani i preko bo~nih ogranaka cisteina, serina ili treonina. Vaàn primjer ovog tipa modifikacije je prenilacija, u kojoj su specifi~ni tipovi lipida (prenilne skupine) vezani na sumporne atome bo~nih ogranaka cisteina smje{tenih na C-kraju polipeptidnog lanca (slika 7-32). Mnogi proteini vezani na stani~nu membranu koji sudjeluju u kontroli stani~nog rasta i diferencijacije modificirani su na ovaj na~in, primjerice onkogeni proteini Ras koji su odgovorni za nekontroliran rast mnogih tumora kod ~ovjeka (vidi 15. poglavlje). Prenilacija se kod ovih proteina odvija u tri koraka. Prvo se prenilna skupina dodaje na cistein koji je od karboksilnog kraja polipeptidnog lanca udaljen tri aminokiseline. Prenilne skupine koje se dodaju u ovoj reakciji jesu ili farnezil (15 ugljikovih atoma, prikazan na slici 7-32) ili geranil-geranil (20 ugljikovih atoma). Zatim se ami-
Cys A farnezilacija SH
Cys A S
proteoliza
Slika 7-32. Prenilacija C-terminalnoga cisteinskog ostatka.

Ovaj tip prenilacije djeluje na proteine Ras i proteine jezgrine ovojnice (jezgreni lamini). Ovi proteini na C-kraju zavr{avaju cisteinskim ostatkom (Cys) iza kojeg slijede dvije alifatske aminokiseline (A) i jedna, bilo koja aminokiselina (X). Prvi korak modifikacije jest dodatak far nezilne skupine izgra|ene od 15 ugljikovih atoma na bo~ni ogranak cisteina (farnezilacija). Zatim slijedi proteoliti~ko uklanjanje tri C-terminalne aminokiseline te metilacija cisteina, koji se sada nalazi na C-kraju.
metilacija
Cys S
Cys S
CH3
309
Slika 7-33. Palmitacija.

Palmitat (masna kiselina izgra|ena od 16 ugljikovih atoma) dodaje se na bo~ne ogranke cisteina koji su smje{teni u unutra{njem dijelu polipeptidnoga lanca.
palmitacija
Cys SH
nokiseline iza cisteinskog ostatka uklanjaju, ~ime cistein ostaje posljednji na karboksilnom kraju. Kona~no se na karboksilnu skupinu C-terminalnog cisteina dodaje metilna skupina. Biolo{ki zna~aj prenilacije dokazuje ~injenica da mutacija klju~nog cisteina blokira povezivanje s membranom kao i funkciju onkogenog proteina Ras. S obzirom na to da je farnezilacija relativno rijetka modifikacija stani~nih proteina, mogu}nost da bi inhibitori klju~nog enzima (farnezil-transferaze) mogli biti korisni lijekovi za terapiju tumora koji uklju~uju proteine Ras potaknula je zanimanje za ovu reakciju. Eksperimenti provedeni na modelnim sustavima pokazali su da inhibitori farnezilacije interferiraju s rastom tumorskih stanica, pa su u tijeku klini~ke studije kojima se ispituje djelovanje ovih potencijalnih lijekova na inhibiciju rasta tumora kod ljudi. Tre}i tip modifikacije proteina masnim kiselinama je palmitacija. Palmitinska se kiselina (masna kiselina sa 16 ugljikovih atoma) dodaje na sumpor bo~nih ogranaka cisteina smje{tenih u unutra{njem dijelu polipeptidnog lanca (slika 7-33). Kao i miristilacija i prenilacija, palmitacija igra va`nu ulogu u povezivanju nekih proteina s citosolnom stranom stani~ne membrane. Kona~no, lipidi vezani na oligosaharide (glikolipidi) dodani na C-terminalne karboksilne skupine nekih proteina, sluè kao sidra za vezanje proteina na vanjsku stranu stani~ne membrane. S obzirom na to da glikolipidi vezani na ove proteine sadràvaju fosfatidil-inozitol, ~esto se nazivaju glikozilfosfatidil-inozitol ili GPI-sidra (slika 7-34). Oligosaharidni dijelovi GPIsidara vezani su na krajnju karboksilnu skupinu polipeptidnih lanaca. Inozitolna je skupina fosfatidilinozitola vezana na oligosaharid tako da ugljikohidrat sluì kao poveznica izme|u proteina i masne kiseline fosfolipida. GPI-sidra se sintetiziraju te kao ve} ustrojene strukture prenose na proteine unutar endoplazmatskog retikula. Njihovo dodavanje pra}eno je uklanjanjem polipeptida veli~ine 20 aminokiselina s C-kraja polipeptidnog lanca. Modificirani se protein zatim prenosi na povr{inu stanice, pri ~emu lanci masnih kiselina GPI-sidra posreduju u povezivanju proteina sa stani~nom membranom.
Cys S C O
CH3
protein (Thy-1)
Regulacija funkcije proteina

Klju~na funkcija proteina njihovo je enzimsko djelovanje, potrebno za katalizu gotovo svih biolo{kih reakcija. Regulacija enzimske aktivnosti time igra klju~nu ulogu u upravljanju stani~nim pona{anjem. To se jednim dijelom postiè na razini ekspresije gena, koja odre|uje koli~inu nekog enzima (proteina) koju stanica sintetizira. Druga razina kontrole postiè se regulacijom funkcije proteina, koja omogu}uje stanici da regulira ne samo koli~inu,
C kraj etanolamin
C NH CH2 CH2 P
N-acetilgalaktozamin
manoza
glukozamin + NH3 CH zitol
Slika 7-34. Struktura GPI-sidra.

GPI-sidro, vezano na C-kraj polipeptidnog lanca, usidruje proteine u stani~nu membranu. Sidro je C-terminalnom aminokiselinom povezano preko etanolamina, koji je vezan za oligosaharid izgra|en od manoznih, N-acetilgalaktozaminskih i glukozaminskih ostataka. Oligosaharid je nadalje povezan s inozitolnom skupinom fosfatidil-inozitola. Dva lanca masnih kiselina iz lipidnoga dijela uronjena su u stani~nu membranu. Na slici je prikazano GPI-sidro {takorskoga proteina, Thy-1.
310
Poglavlje 7
ve} i aktivnost svojih proteinskih komponenti. O regulaciji aktivnosti nekih proteina na razini transkripcije i translacije ve} je bilo govora u ovom i prethodnom poglavlju, dok }e mnogi dodatni primjeri regulacije proteinske funkcije u kontroli i stani~nom pona{anju biti obja{njeni u ostatku ove knjige. U ovom }e odjeljku biti govora o tri osnovna mehanizma kojima se regulira aktivnost stani~nih proteina.
Regulacija malim molekulama

Djelovanje ve}ine enzima kontrolirano je promjenom njihove konformacije, ~ime se mijenja i njihova kataliti~ka aktivnost. U mnogim su slu~ajevima konformacijske promjene posljedica vezanja malih molekula, kao {to su aminokiseline ili nukleotidi, ~ime se regulira i enzimska aktivnost. Ovaj tip regulacije ~esto je odgovoran za kontrolu metaboli~kih puteva putem povratne sprege. Primjerice, kona~ni produkti mnogih puteva biosinteze (primjerice aminokiseline) inhibiraju enzime koji kataliziraju prvi korak njihove sinteze, osiguravaju}i na taj na~in odgovaraju}e snabdijevanje produktom, ali i sprje~avaju}i sintezu prevelikih koli~ina istog (slika 7-35). Inhibicija povratnom spregom primjer je alosteri~ke regulacije, u kojoj se regulatorna molekula veè na mjesto na enzimu koje je razli~ito od kataliti~kog mjesta (gr~. lloj = drugi, sterej = mjesto). Vezanje takve regulatorne molekule mijenja konformaciju proteina, a time se mijenja i oblik kataliti~kog mjesta {to djeluje i na kataliti~ku aktivnost (vidi sliku 2-29). Mnogi transkripcijski faktori (o kojima je bilo govora u 6. poglavlju) tako|er su regulirani vezanjem malih molekula. Primjerice, vezanje laktoze na lac-represor u E. coli inducira konformacijsku promjenu koja sprje~ava vezanje represora na DNA. U eukariotskim stanicama steroidni hormoni na sli~an na~in kontroliraju gensku ekspresiju veù}i se na transkripcijske regulatorne proteine. Regulacija transkripcijskih faktora kao {to je regulacija EF-Tu vezanjem GTP (vidi sliku 7-3) ilustrira drugi uobi~ajeni mehanizam kojim se kontrolira aktivnost unutarstani~nih proteina. U ovom slu~aju, oblik proteina s vezanim GTP aktivna je konformacija, dok je oblik s vezanim GDP neaktivan. Mnogi stani~ni proteini regulirani su na sli~an na~in, vezanjem GTP ili GDP U ovu skupinu ubrajamo onkogene proteine Ras, koji su intenzivno . prou~avani zbog njihove uloge u kontroli stani~ne proliferacije i tumora kod ~ovjeka. Posebice zanimljivi podatci dobiveni kristalografskom analizom X-zrakama ovih proteina, otkrili su male, ali iznimno zna~ajne razlike izme|u neaktivnog oblika proteina s vezanim GDP i aktivnog oblika s vezanim GTP (slika 7-36). Ove fine razlike u proteinskoj konformaciji odre|uju moè li Ras (aktivni oblik s vezanim GTP) reagirati sa svojom ciljnom molekulom, {to je signal za stani~nu diobu. Va`nost ovih finih razlika u proteinskoj konformaciji ilustrira ~injenica da mutacije u ras genu pridonose razvoju oko 20% tumora kod ~ovjeka. Na taj na~in mutacije mijenjaju strukturu proteina Ras tako da su oni zarobljeni u svojoj aktivnoj konformaciji s vezanim GTP i kontinuirano signaliziraju stani~nu diobu, {to dovodi do nekontroliranog rasta tumorskih stanica. Suprotno tomu, normalni proteini Ras balansiraju izme|u GTP- ili GDP-konformacija, time {to postaju aktivni tek nakon stimulacije hormonima ili faktorima rasta koji normalno kontroliraju stani~nu proliferaciju u vi{estani~nim organizmima.
prete~a 1
alosteri~ka inhibicija prete~a 2
prete~a 3
kona~ni produkt
Slika 7-35. Inhibicija povratnom spregom.

Kona~ni produkt biokemijskog puta djeluje kao alosteri~ki inhibitor enzima koji katalizira prvi korak njegove sinteze.
311
Slika 7-36. Konformacijske razlike izme|u aktivnog i inaktivnog oblika proteina Ras.
Proteini Ras se izmjenjuju izme|u svojih aktivnih, GTP-vezanih i inaktivnih, GDP-vezanih oblika. Glavni u~inak vezanja GTP u odnosu na vezanje GDP je promjena konformacije dvaju podru~ja molekule, nazvanih regije prekida~a I i II. Na slici je kostur GTP kompleksa prikazan bijelom bojom; kostur regija prekida~a I GDP kompleksa plavom bojom, a kostur regija prekida~a II GDP kompleksa ùtom bojom. Gvaninski je nukleotid prikazan crvenom bojom, a ioni Mg2+ ùtom bojom. (Susretljivo{}u Sung-Hou Kima, Sveu~ili{te u Kaliforniji, Berkeley)
Fosforilacija proteina
Primjeri o kojima je bilo govora u prethodnom odjeljku odnose se na nekovalentno povezivanje proteina s malim molekulama inhibitorima ili aktivatorima. S obzirom na to da se ne stvaraju kovalentne veze, vezanje ovih regulatornih molekula na protein je reverzibilno, {to stanici omogu}uje brz odgovor na promjene u okolini. Me|utim, aktivnost mnogih proteina regulirana je kovalentnim modifikacijama. Jedan od primjera ovog tipa regulacije je aktivacija enzima proteoliti~kim kidanjem neaktivnih prete~a. Kao {to je prethodno spomenuto u ovom poglavlju, probavni enzimi i proteini koji sudjeluju u zgru{avanju krvi regulirani su ovim mehanizmom. S obzirom na to da je proteoliza ireverzibilan proces, ona je poglavito oblik kontrole aktivacije enzima, a ne uklju~ivanja i isklju~ivanja enzima u odgovoru na promjene u okolini. Suprotno tomu, druge su kovalentne modifikacije posebice fosforilacija, reverzibilni procesi unutar stanice i djeluju, kao primjerice i alosteri~ka regulacija, tako da reverzibilno aktiviraju ili inhibiraju mno{tvo razli~itih stani~nih proteina u odgovoru na signale iz okoline.
protein-serin/treonin-kinaza serin O H N C C H CH2 OH Pi

H2O
ADP O H N C C H CH2 O P
protein-serin/treonin-fosfataza
protein-tirozin-kinaza tirozin O H N C C H CH2 Pi

H2O
ADP O H N C C H CH2
Slika 7-37. Protein-kinaze i fosfataze.

Protein-kinaze kataliziraju prijenos fosfatne skupine s ATP na bo~ni ogranak serina ili treonina (protein-serin/treonin-kinaze) ili na tirozin (protein-tirozin-kinaze). Protein-fosfataze kataliziraju uklanjanje fosfatne skupine s istih aminokiselina hidrolizom.
protein-tirozin-fosfataza
OH
O P
312
Poglavlje 7
epinefrin, adrenalin
adenilil-ciklaza cAMP aktivacija protein-kinaze ovisne o cAMP cAMP
ADP aktivacija fosforilaza-kinaze P
ADP aktivacija gliko-gen-fosforilaze P

H2O
Fosforilaciju proteina kataliziraju protein-kinaze, od kojih ve}ina prenosi fosfatnu skupinu s ATP na hidroksilne skupine bo~nih ogranaka serina, treonina ili tirozina (slika 7-37). Protein-kinaze ~ine jednu od najve}ih proteinskih porodica kod eukariota, a pripada im i pribli`no 2% svih eukariotskih gena. Ve}ina protein-kinaza fosforilira ili serinski i treoninski ostatak ili tirozinski ostatak, pa se sukladno tome nazivaju protein-serin/treoninkinaze ili protein-tirozin-kinaze. Reakciju reverznu fosforilaciji, hidrolizu fosforiliranog aminokiselinskog ostatka kataliziraju protein-fosfataze. Kao i protein-kinaze, protein-fosfataze su specifi~ne za serinske ili treoninske ostatke, ili tirozinske ostatke, premda neke od njih prepoznaju sve tri fosfoaminokiseline. Zajedni~ko djelovanje protein-kinaza i protein-fosfataza posreduje u reverzibilnoj fosforilaciji mnogih stani~nih proteina. Protein-kinaze ~esto djeluju kao komponente puteva prijenosa signala u kojima jedna kinaza aktivira sljede}u kinazu, koja zatim moè djelovati na sljede}u kinazu u nizu. Djelovanje serije protein-kinaza moè prenijeti signal primljen na stani~noj povr{ini do ciljnog proteina unutar stanice, {to rezultira promjenama stani~nog pona{anja u odgovoru na poticaje iz okoline. Prototip djelovanja protein-kinaza proizi{ao je iz studija metabolizma glikogena, autora Eda Fishera i Eda Krebsa, iz 1955. godine. U mi{i}nim stanicama hormon adrenalin poti~e razgradnju glikogena do glukoza-1-fosfata, ~ime se osigurava izvor energije za poja~anu mi{i}nu aktivnost. Razgradnju glikogena katalizira enzim glikogen-fosforilaza, koju regulira protein-kinaza (slika 7-38). Adrenalin se veè na receptor na povr{ini stanice i poti~e pretvorbu ATP u cikli~ki AMP (cAMP), koji zatim veè i aktivira protein-kinazu, nazvanu protein-kinaza ovisna o cAMP Ova kinaza fosforilira te time . aktivira sljede}u protein-kinazu, nazvanu fosforilaza-kinaza. Fosforilaza-kinaza zatim fosforilira i aktivira glikogen-fosforilazu {to u kona~nici dovodi do stvaranja glukoze. Aktivacija fosforilaza-kinaze i glikogen-fosforilaze fosforilacijom je privremena, {to kataliziraju specifi~ne fosfataze, tako da uklanjanje po~etnog stimulansa (adrenalina) inhibira daljnju razgradnju glikogena. Signalni put koji dovodi do aktivacije glikogen-fosforilaze zapo~inje vezanjem malih molekula na stani~nu povr{inu vezanjem adrenalina na njegov receptor i vezanjem cAMP na protein-kinazu ovisnu o cAMP Signal . se zatim prenosi na unutarstani~ni cilj uzastopnim djelovanjem protein-kinaza. Sli~ni signalni putevi, u kojima protein-kinaze i fosfataze igraju klju~nu ulogu, sudjeluju u regulaciji gotovo svih oblika pona{anja eukariotskih stanica (vidi poglavlja 13 i 14). Odstupanja u ovim putevima, pri ~emu su ~esto promijenjene i aktivnosti protein-kinaza, odgovorna su za razvoj mnogih bolesti koje su pra}ene nepravilnom regulacijom stani~nog rasta i diferencijacije, posebice za razvoj tumora. Premda je fosforilacija naj~e{}i i najbolje prou~eni oblik kovalentnih modifikacija koje reguliraju aktivnost proteina, i neke druge proteinske modifikacije tako|er imaju va`ne uloge. To su metilacija i acetilacija lizinskih ostataka (o ~emu je bilo govora u 6. poglavlju), kao i dodatak NO skupine na
Pi
Slika 7-38. Regulacija razgradnje glikogena fosforilacijom proteina.

Vezanje adrenalina na receptor na povr{ini stanice poti~e stvaranje cikli~kog AMP (cAMP), koji aktivira protein-kinazu ovisnu o cAMP Protein-kinaza ovisna o cAMP . fosforilira i aktivira fosforilaza-kinazu, koja nadalje fosforilira i aktivira glikogen-fosforilazu. Glikogen-fosforilaza zatim katalizira razgradnju glikogena do glukoza-1fosfata.
glikogen
glukoza-1- P
313
bo~ne ogranke cisteinskih ostataka (nitrozilacija). Uz to, postoje dokazi o tome da O-glikozilacija jezgrenih i stani~nih proteina tako|er ima regulatornu ulogu.
Interakcije protein-protein
Mnogi se proteini sastoje od vi{e podjedinica, od kojih je svaka neovisan polipeptidni lanac. Kod nekih su proteina podjedinice istovrsne, dok su drugi izgra|eni od dvaju ili vi{e razli~itih polipeptida. U oba su slu~aja interakcije izme|u polipeptidnih lanaca va`ne za regulaciju proteinske aktivnosti. Va`nost ovih interakcija vidljiva je kod alosteri~kih enzima, kod kojih vezanje regulatorne molekule mijenja konformaciju proteina promjenom interakcija izme|u podjedinica. Mnogi drugi enzimi regulirani su na sli~an na~in, putem interakcija protein-protein. Dobar je primjer protein-kinaza ovisna o cAMP koja se sastoji , od dvije regulatorne i dvije kataliti~ke podjedinice (slika 7-39). U ovom stanju, enzim je neaktivan; regulatorne podjedinice inhibiraju enzimsko djelovanje kataliti~kih podjedinica. Enzim se aktivira s pomo}u cAMP koji se ve, è na regulatorne podjedinice i poti~e konformacijsku promjenu koja uzrokuje disocijaciju kompleksa uslijed ~ega se kataliti~ke podjedinice osloba|aju i postaju enzimski aktivne protein-kinaze. Na taj na~in cikli~ki AMP djeluje kao alosteri~ki regulator djeluju}i na interakcije protein-protein. Proteini koji sudjeluju u regulaciji transkripcije, o kojima je bilo govora u 6. poglavlju, pruàju drugi vaàn primjer interakcija protein-protein. Mnogi eukariotski transkripcijski faktori djeluju ili kao aktivatori ili kao represori upravo putem interakcija protein-protein s komponentama temeljnog transkripcijskog mehanizma. Kao {to }e biti govora u sljede}im poglavljima, sli~ne interakcije protein-protein, koje mogu biti regulirane vezanjem malih molekula ili fosforilacijom, igraju klju~nu ulogu u kontroli brojnih razli~itih oblika stani~nog pona{anja.
C cAMP cAMP cAMP cAMP
C inaktivno stanje
cAMP cAMP R
cAMP cAMP R
aktivno stanje
Razgradnja proteina
Razine proteina u stanici odre|ene su osim intenzitetom sinteze i udjelom njihove razgradnje. Poluvremena ìvota proteina u stanici jako su razli~ita, od nekoliko minuta do nekoliko dana, pa su razli~ite brzine proteinske razgradnje vaàn ~imbenik stani~ne regulacije. Mnogi proteini koji se brzo razgra|uju djeluju kao regulatorne molekule, primjerice transkripcijski faktori. Brz obrtaj ovih proteina potreban je kako bi njihovoj razini omogu}io brzu promjenu u odgovoru na signale iz okoline. Drugi se proteini u odgovoru na specifi~ne signale brzo razgra|uju, omogu}uju}i druga~iji mehanizam za regulaciju unutarstani~ne enzimske aktivnosti. Uz to, nefunkcionalni ili o{te}eni proteini bivaju prepoznani i brzo razgra|eni unutar stanice, ~ime se uklanjaju posljedice pogrje{ki koje su nastale tijekom sinteze proteina. U eukariotskim stanicama postoje dva glavna puta razgradnje proteina put ubikvitin-proteasom i lizosomalna proteoliza.
Slika 7-39. Regulacija protein-kinaze ovisne o cAMP.
U inaktivnom stanju, enzim se sastoji od dvije regulatorne (R) i dvije kataliti~ke (C) podjedinice. Cikli~ki se AMP veè na regulator ne podjedinice {to poti~e konfor macijsku promjenu koja dovodi do njihove disocijacije od kataliti~kih podjedinica. Time, slobodne kataliti~ke jedinice postaju enzimski aktivne.
Put ubikvitin-proteasom
Glavni put selektivne razgradnje proteina u eukariotskim stanicama kao biljeg za usmjeravanje citosolnih i jezgrenih proteina na brzu proteolizu koristi ubikvitin (slika 7-40). Ubikvitin je polipeptid izgra|en od 76 aminokiselina, koji je visokoo~uvan kod svih eukariota (kvasaca, ìvotinja i biljaka). Vezanjem ubikvitina na amino skupinu bo~nog ogranka lizina proteini postaju obiljeèni za razgradnju. Daljnjim nadodavanjem ubikvitina nastaje multiubikvitinski lanac. Takve poliubikvitinilirane proteine prepoznaje i
314
Poglavlje 7
razgra|uje veliki, vi{epodjedini~ni proteazni kompleks, nazvan proteasom. Ubikvitin se otpu{ta u tom procesu, pa se moè koristiti i u sljede}em ciklusu. I za vezanje ubikvitiE1 na, kao i za razgradnju obiljeènih proteina potrebna je energija koja E1 se dobiva iz ATP . poliubikvitinilacija Kako je vezanje ubikvitina biljeg E2 za brzu razgradnju, stabilnost brojE3 nih proteina ovisi o tome ho}e li biti ubikvitinilirani. Ubikvitinilacija se odvija u vi{e koraka. Prvo se ubikvitin aktivira vezanjem za enzim koji Slika 7-40. Put ubikvitin-proteasoma. aktivira ubikvitin, E1. Ubikvitin se Proteini se za brzu razgradnju obiljeàvaju zatim prenosi na drugi enzim, nakovalentnim vezanjem nekoliko molekula proteasom zvan enzimom koji konjugira ubiubikvitina. Prvo enzim E1 aktivira ubikvitin, ADP koji se zatim prenosi na jedan od nekoliko kvitin (E2). Kona~ni prijenos ubikvirazli~itih enzima koji konjugiraju ubikvitin tina na ciljni protein posredovan je (E2). Ubikvitin-ligaza zatim katalizira prijetre}im enzimom, nazvan ubikvitin nos ubikvitina na specifi~ni ciljni protein. ligaza ili E3, koji je odgovoran za seDodaje se nekoliko ubikvitina, a poliubikvilektivno prepoznavanje odgovaratinilirani protein zatim razgra|uje proteazni peptidi kompleks (proteasom). ju}eg supstratnog proteina. Ve}ina stanica posjeduje samo jednu vrstu E1, ali nekoliko vrsta E2 i velik broj E3 enzima. Razli~iti enzimi E3 prepoznaju razli~ite supstratne proteine, pa se selektivno usmjeravanje stani~nih proteina na razgradnju ubikvitin-proteaznim putem temelji upravo na specifi~nom djelovanju ovih enzima. Mnogi proteini koji kontroliraju temeljne procese u stanici, kao {to su ekspresija proteina i stani~na proliferacija, ciljevi su djelovanja za reguliranu ubikvitinilaciju i proteolizu. Zanimljiv primjer takve kontrolirane razgradnje pruàju ciklini, proteini koji reguliraju stani~ni rast kontroliraju}i diobeni ciklus eukariotskih stanica. Ulazak u mitozu kod eukariotskih stanica kontroliran je dijelom ciklinom B, koji je regulatorna podjedinica protein-kinaze, nazvane Cdc2 (vidi 14. poglavlje). Povezivanje s ciklinom B nu`no je za aktivaciju Cdc2, koja kad je aktivirana, time {to fosforilira razli~ite stani~ne proteine, zapo~inje procese mitoze ({to obuhva}a kondenzaciju kromatina i razgradnju jezgrine ovojnice). Protein-kinaza Cdc2 aktivira tako|er i sustav proteolize posredovane ubikvitinom kojim se razgra|uje ciklin B, {to vodi prema kraju mitoze. Razgradnja ciklina B inaktivira protein-kinazu Cdc2, omogu}uju}i stanici izlazak iz mitoze i nastavak prema interfazi sljede}eg stani~nog ciklusa. Ubikvitinilacija ciklina B je visoko-specifi~na reakcija, koju odre|uje slijed od 9 aminokiselina u ciklinu B, nazvan destrukcijska kutija. Mutacije u ovom slijedu sprje~avaju proteolizu ciklina B {to uzrokuje zastoj diobe stanice u mitozi. Ovaj primjer pokazuje va`nost regulacije razgradnje proteina u kontroli temeljnih procesa stani~ne diobe. Premda ubikvitinilacija uobi~ajeno usmjerava proteine na razgradnju, vezanje ubikvitina na neke proteine moè imati i druge funkcije. Primjerice, ubikvitinilacija nekih proteina sluì kao biljeg za endocitozu, a ubikvitinilacija histona predstavlja element histonskog koda, o ~emu je bilo govora u 6. poglavlju. Uz to, proteini mogu biti modificirani vezanjem drugih polipeptida sli~nih ubikvitinu, kao {to je SUMO (mali ubikvitinu sli~an modifikator), koji sluì kao biljeg za usmjeravanje proteina u jezgru i njihovo smje{tanje u podjezgrine domene (detaljno u poglavlju 8).
ubikvitin AMP
315
aktivni kompleks sinteza ciklina B profaza
Slika 7-41. Razgradnja ciklina tijekom stani~noga ciklusa.

Napredovanje eukariotskih stanica kroz diobeni ciklus kontrolirano je dijelom sintezom i razgradnjom ciklina B, koji je regulatorna podjedinica protein-kinaze Cdc2. Sinteza ciklina B za vrijeme inter faze dovodi do stvaranja aktivnog kompleksa ciklin B-protein-kinaza Cdc2, koji poti~e ulazak u mitozu. Brza razgradnja ciklina B zatim dovodi do inaktivacije protein-kinaze Cdc2, omogu}uju}i stanici izlazak iz mitoze i ulazak u interfazu sljede}ega stani~nog ciklusa.
metafaza
interfaza
ubikvitin
razgradnja ciklina B telofaza
inaktivni Cdc2
anafaza
Lizosomalna proteoliza
Drugi glavni put razgradnje proteina jest razgradnja proteina putem lizosoma. Lizosomi su membranom okruèni organeli koji sadràvaju brojne razgradne enzime, me|u kojima i nekoliko proteaza (vidi 9. poglavlje). Imaju nekoliko uloga u stani~nom metabolizmu, izme|u ostalog u razgradnji izvanstani~nih proteina unesenih endocitozom kao i u pretvorbi citoplazmatskih organela i citosolnih proteina. Zadràvanje proteaza i drugih razgradnih enzima unutar lizosoma sprje~ava nekontroliranu razgradnju stani~nog sadràja. Stoga, da bi bili razgra|eni lizosomalnom proteolizom, stani~ni proteini prvo moraju biti uneseni u lizosom. Temeljni princip unosa proteina je autofagija, tijekom koje nastaju vezikule (autofagosomi) kojima su s pomo}u membrana, nastalih od endoplazmatskog retikula, obuhva}ena mala podru~ja citoplazme ili citoplazmatskih organela (slika 7-42). Ove se vezikule zatim stapaju s lizosomima te razgradni lizosomalni enzimi prera|uju njihov sadràj. îni se da je unos proteina u autofagosom neselektivan proces, tako da u kona~nici rezultira sporom razgradnjom dugoìvu}ih citoplazmatskih proteina. Autofagija je regulirana dostupno{}u hranjivih tvari, ali i tijekom razvoja vi{estani~nih organizama. Ovaj se proces op}enito aktivira u uvjetima
316
Poglavlje 7
endoplazmatski retikul lizosom
mitohondrij
autofagosom
fagolizosom
Slika 7-42. Lizosomski sustav.

Lizosomi sadràvaju razli~ite razgradne enzime, uklju~uju}i i proteaze. Lizosomi preuzimaju stani~ne proteine stapanjem s autofagosomima, koji nastaju zatvaranjem odre|enog podru~ja citoplazme ili organela (primjerice, mitohondrija) u fragmente endoplazmatskog retikula. Stapanjem nastaju fagolizosomi, koji razgra|uju sadràj autofagosoma.
nedostatka hranjivih tvari, ~ime je stanici omogu}ena razgradnja neesencijalnih proteina i organela, te na taj na~in ponovo iskori{tavanje vlastitih komponenti. Uz to, autofagija ima va`nu ulogu u mnogim razvojnim procesima, kao {to je primjerice metamorfoza insekata, koji obuhva}aju intenzivno remodeliranje tkiva i razgradnju stani~nih komponenti.
KLJU^NI POJMOVI TRANSLACIJA mRNA

tRNA, antikodon, aminoaciltRNA-sintetaza
S A @ E TA K
Transportna RNA: Transportna RNA sluì kao posrednik koji smje{ta aminokiseline na kalup mRNA. Aminoacil-tRNA-sintetaze veù aminokiseline na odgovaraju}e tRNA, koje se zatim putem komplementarnog sparivanja baza veù na kodone mRNA. Ribosom: Ribosomi se sastoje od dviju podjedinica, koje su izgra|ene od proteina i ribosomnih RNA. Stvaranje peptidne veze primarno je katalizirano ribosomnom 23S RNA.
ribosom, rRNA
317
Ustrojstvo mRNA i inicijacija translacije: Translacija prokariotskih i eukariotskih mRNA zapo~inje metioninskim ostatkom. Kod bakterija, inicijacijskom kodonu prethodi slijed koji smje{ta mRNA na ribosom putem sparivanja baza sa 16S rRNA. Kod eukariota, inicijacijski kodon se pronalazi pretraìvanjem mRNA s 5' kraja, a prepoznaje se na temelju njegove 7-metilgvanozinske kape. Proces translacije: Translacija zapo~inje vezanjem metionil-tRNA i mRNA na malu ribosomnu podjedinicu. Zatim se kompleksu pridruùje velika ribosomna podjedinica, te se polipeptidni lanac produùje sve dok ribosom ne stigne do terminacijskog kodona na mRNA. Za odvijanje inicijacije, elongacije i terminacije translacije i kod prokariota i kod eukariota nu`na je prisutnost razli~itih neribosomnih faktora. Regulacija translacije: Regulacija specifi~nih mRNA moè se posti}i vezanjem represorskih proteina te proteinima koji usmjeravaju mRNA u specifi~no podru~je u stanici. Kontrolirana poliadenilacija mRNA tako|er je vaàn mehanizam regulacije translacije tijekom rane faze razvoja. Uz to, translacija nekih mRNA kontrolirana je nekodiraju}im RNA koje RNA interferencijom dovode do razgradnje homolognih mRNA. Kona~no, aktivnost translacije u stanici moè op}enito biti regulirana modifikacijom inicijacijskih faktora.
5' regija koja se ne prevodi, policistronska, monocistronska, 3' regija koja se ne prevodi, slijed Shine-Delgarno
faktor inicijacije, faktor elongacije,
SMATANJE I DORADA PROTEINA

[aperoni i smatanje proteina: Molekularni {aperoni olak{avaju unutarstani~no smatanje polipeptidnih lanaca u njihovu pravilnu trodimenzionalnu konformaciju time {to veù i stabiliziraju nesmotane ili djelomi~no smotane polipeptidne lance. Enzimi i smatanje proteina: Barem dvije vrste enzima, protein disulfidizomeraze i peptidil-prolil izomeraze, kataliziraju smatanje proteina. Kidanje proteina: Proteoliza je vaàn korak u doradi mnogih proteina: primjerice, sekretorni proteini i proteini ugra|eni u ve}inu eukariotskih organela usmjeravaju se do svojih odredi{ta s pomo}u aminokiselinskog slijeda koji se nakon prolaska proteina kroz membranu uklanja proteoliti~kim kidanjem. Glikozilacija: Mnogi su eukariotski proteini, posebice sekretorni i proteini stani~ne membrane, modificirani dodatkom ugljikohidrata u endoplazmatskom retikulu i Golgijevu aparatu. Vezanje lipida: Kovalentno vezani lipidi ~esto usmjeravaju i usidruju proteine u stani~nu membranu.
{aperon, proteini toplinskoga {oka, {aperonin
protein disulfid-izomeraze, peptidil-prolil-izomeraze proteoliza, signalni slijed, signalne-peptidaze
glikozilacija, glikoprotein, dolikol-fosfat N-miristilacija, prenilacija, palmitacija, glikolipid, glikozilfosfatidil-inozitolno (GPI) sidro
REGULACIJA FUNKCIJE PROTEINA

Regulacija malim molekulama: Mnogi su proteini regulirani vezanjem malih molekula, kao {to su aminokiseline i nukleotidi, koji poti~u promjene konformacije i aktivnosti proteina. Fosforilacija proteina: Reverzibilna fosforilacija, koja kontrolira aktivnost mno{tva razli~itih stani~nih proteina, posljedica je djelovanja protein-kinaza i fosfataza.
alosteri~ka regulacija
protein-kinaze, protein-serintreonin-kinaze, protein-tirozinkinaze, protein-fosfataze
318
Poglavlje 7
Interakcije protein-protein: Interakcije izme|u polipeptidnih lanaca va`ne su za regulaciju alosteri~kih enzima i drugih stani~nih proteina.
RAZGRADNJA PROTEINA
ubikvitin, proteasom
Put ubikvitin-proteasom: Glavni put selektivne razgradnje proteina u eukariotskim stanicama koristi ubikvitin kao biljeg koji usmjerava proteine na brzu proteolizu s pomo}u proteasoma. Lizosomska proteoliza: Lizosomske proteaze razgra|uju izvanstani~ne proteine unesene endocitozom, a odgovorne su i za razgradnju citoplazmatskih organela i dugoìvu}ih citosolnih proteina. Autofagija se aktivira kao odgovor na gladovanje stanice.
lizosom, autofagija
Pitanja
1. E. coli sadràva 64 razli~ita kodona u svojim mRNA, od kojih 61 za aminokiseline. Kako mogu sintetizirati proteine kad ima samo 40 razli~itih tRNA? 2. U kojem smjeru ribosom prevodi mRNA, a u kojem se smjeru sintetizira polipeptidni lanac? 3. @elite eksprimirati kloniranu eukariotsku cDNA u bakteriji. Koji je slijed potrebno dodati da bi se mRNA mogla prevesti na prokariotskim ribosomima? 4. Obrazloìte ~injenicu da je ribosomna RNA najzna~ajnija komponenta ribosoma. 5. Koji bi u~inak inhibitor poliadenilacije imao na sintezu proteina u oplo|enim jaja{cima? 6. [to su {aperoni? 7. Za{to je korisno da je sinteza proteina toplinskoga {oka poja~ana u stanicama izloènim povi{enim temperaturama? 8. Dok ste ispitivali biljni auksin, natrij fenilacetat, otkrili ste da inhibira sintezu farnezilnih skupina. Slu{aju}i kolegij Stani~ne biologije, uo~ili ste mogu}nost njegova kori{tenja u terapiji tumora koji uklju~uju nenormalno aktivne Ras proteine. [to mislite kakav bi u~inak fenilacetat imao na funkciju Ras i za{to bi imao nekoliko nuspojava? 9. Zanima vas ispitivanje ekspresije proteina na povr{ini jetrenih stanica. Kako bi vam tretman ovih stanica fosfolipazom pomogao da otkrijete je li va{ protein transmembranski protein ili je na stani~nu povr{inu vezan s pomo}u GPI-sidra? 10. [to je dokaz da je za ubikvitinilaciju i razgradnju specifi~nih proteina s pomo}u proteasoma nuàn specifi~an ciljni slijed na proteinu?
Literatura
Translacija mRNA
Arnez, J. G. and D. Moras. 1997. Structural and functional considerations of the aminoacetylation reaction. Trends Biochem. Sci. 22: 211216. P Ban, N., P Nissen, J. Hansen, P B. Moore and . . T. A. Steitz. 2000. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 resolution. Science 289: 905920. I Crick, F. H. C. 1966. Codon-anticodon pairing: The wobble hypothesis. J. Mol. Biol. 19: 548 555. I Dever, T. E. 2002. Gene-specific regulation by general translation factors. Cell 108: 545 556. P Gray, N. K. and M. Wickens. 1998. Control of translation initiation in animals. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 399458. P Green, R. and H. F. Noller. 1997. Ribosomes and translation. Ann. Rev. Biochem. 66: 679 716. P Hellen, C. U. T. and P Sarnow. 2001. Internal . ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev. 15: 15391612. P Illangeskare, M., G. Sanchez, T. Nickles and M. Yarus. 1995. Aminoacyl-RNA synthesis catalyzed by an RNA. Science 267: 643647. I Kisselev, L. L. and R. H. Buckingham. 2000. Translational termination comes of age. Trends Biochem. Sci. 25: 561566. P Klausner, R. D., T. A. Rouault and J. B. Harford. 1993. Regulating the fate of mRNA: The control of cellular iron metabolism. Cell 72: 1928. P Kloc, M., N. R. Zearfoss and L. D. Etkin. 2002. Mechanisms of subcellular mRNA localization. Cell 108: 533544. P Kozak, M. 1991. Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J. Biol. Chem. 266: 1986719870. P Moore, P B. and T. A. Steitz. 2002. The . involvement of RNA in ribosome function. Nature 418: 229235. P
319
Nissen, P J. Hansen, N. Ban, P B. Moore ., . and T. A. Steitz. 2000. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289: 920930. I Noller, H. F., V. Hoffarth and L. Zimniak. 1992. Unusual resistance of peptidyl transferase to protein extraction procedures. Science 256: 14161419. I Nomura, M. 1997. Reflections on the days of ribosome reconstitution research. Trends Biochem. Sci. 22: 275279. P Ramakrishnan, V. 2002. Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108: 557572. P Sachs, A. B., P Sarnow and M. W. Hentze. 1997. . Starting at the beginning, middle, and end: Translation initiation in eukaryotes. Cell 89: 831838. P Saks, M. E., J. R. Sampson and J. N. Abelson. 1994. The transfer RNA identity problem: A search for rules. Science 263: 191197. P Wilson, K. S. and H. F. Noller. 1998. Molecular movement inside the translational engine. Cell 92: 337349. P Wimberly, B. T., D. E. Brodersen, W. M. Clemons, R. J. Morgan-Warren, A. P Carter, C. . Vonrhein, T. Hartrsch and V. Ramakrishnan. 2000. Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: 327339. I Yusupov, M. M., G. Z. Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, T. NH. Earnest, J. H. D. Cate and H. F. Noller. 2001. Crystal structure of the ribosome at 5.5 resolution. Science 292: 883896. I Zamore, P D. 2002. Ancient pathways pro. grammed by small RNAs. Science 296: 12651269. P
Gething, M.-J. and J. Sambrook. 1992. Protein folding in the cell. Nature 355: 3345. P Hartl, F. U. and M. Hayer-Hartl. 2002. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science 295: 18521858. P Helenius, A. and A. Markus. 2001. Intracellular functions of N-linked glycans. Science 291: 23642369. P Hirschberg, C. B. and M. D. Snider. 1987. Topography of glycosylation in the rough endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Ann. Rev. Biochem. 56: 6387. P Kornfield, R. and S. Kornfield. 1985. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Ann. Rev. Biochem. 45: 631664. P Schiene, C. and G. Fischer. 2000. Enzymes that catalyse the restructuring of proteins. Curr. Opin. Struc. Biol. 10: 4045. P Sigler, P B., Z. Xu, H. S. Rye, S. G. Burston, W. A. . Fenton and A. L. Horwich. 1998. Structure and function in GroEL-mediated protein folding. Ann. Rev. Biochem. 67: 581608. P Udenfriend, S. and K. Kodukula. 1995. How glycosylphosphatidylinositol-anchored membrane proteins are made. Ann. Rev. Biochem. 64: 563591. P Wells, L., K. Vosseller and G. W. Hart. 2001. Glycosylation of nucleocytoplasmic proteins: signal transduction and O-GlcNAc. Science 291: 23762378. P Young, J. C., I. Moarefi and F. U. Hartl. 2001. Hsp90: a specialized but essential proteinfolding tool. J. Cell Biol. 154: 267273. P Zhang, F. L. and P J. Casey. 1996. Protein pre. nylation: Molecular mechanisms and functional consequences. Ann. Rev. Biochem. 65: 241269. P
Manning, G., G. D. Plowman, T. Hunter and S. Sudarsanam. 2002. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends Biochem. Sci. 27: 514520. P Milburn, M. V., L. Tong, A. M. DeVos, A. Brunger, Z. Yamaizumi, S. Nishimura and S.-H. Kim. 1990. Molecular switch for signal transduction: Structural differences between active and inactive forms of protooncogenic ras proteins. Science 247: 939945. I Monod, J., J.-P Changeux and F. Jacob. 1963. . Allosteric proteins and cellular control systems. J. Mol. Biol. 6: 306329. I Stamler, J. S., S. Lamas and F. C. Fang. 2001. Nitrosylation: the prototypic redox-based signaling mechanism. Cell 106: 675683. P Taylor, S. S., D. R. Knighton, J. Zheng, L. F. R. Eyck and J. M. Sowadski. 1992. Structural framework for the protein kinase family. Ann. Rev. Cell Biol. 8: 429462. P Vetter, I. R. and A. Wittinghofer. 2001. The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. Science 294: 12991304. P
Razgradnja proteina
Conaway, R. C., C. S. Brower and J. W. Conaway. 2002. Emerging roles of ubiquitin in transcriptional regulation. Science 296: 12541258. P Coux, O., K. Tanaka and A. L. Goldberg. 1996. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Ann. Rev. Biochem. 65: 801 847. P Glotzer, M., A. W. Murray and M. W. Kirschner. 1991. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature 349: 132138. I Hershko, A. and A. Ciechanover. 1998. The ubiquitin system. Ann. Rev. Biochem. 67: 425479. P Jackson, P K. 2001. A new RING for SUMO: , wrestling transcriptional responses into nuclear bodies with PIAS family E3 SUMO ligases. Genes Dev. 15: 30533058. P Jackson, P K., A. C. Eldridge, E. Freed, L. Fur. stenthal, J. Y. Hsu, B. K. Kaiser and J. D. R. Reimann. 2000. The lore of the RINGs: substrate recognition and catalysis by ubiquitin ligases. Trends Cell Biol. 10: 429439. P Klionsky, D. J. and S. D. Emr. 2000. Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation. Science 290: 17171721. P Laney, J. D. and M. Hochstrasser. 1999. Substrate targeting in the ubiquitin system. Cell 97: 427430. P Pickart, C. M. 2001. Mechanisms underlying ubiquitination. Ann. Rev. Biochem. 70: 503 533. P
Smatanje i dorada proteina

Braig, K., Z. Otwinowski, R. Hegde, D. C. Bolsvert, A. Joachimiak, A. L. Horwich and P B. Sigler. 1994. The crystal structure of the . bacterial chaperonin GroEL at 2.8 . Nature 371: 578586. I Dalbey, R. E. and G. von Heijne. 1992. Signal peptidases in prokaryotes and eukaryotes a new protease family. Trends Biochem. Sci. 17: 474478. P Englund, P T. 1993. The structure and bio. synthesis of glycosylphosphatidylinositol protein anchors. Ann. Rev. Biochem. 62: 121 138. P Farazi, T. A., G. Waksman and J. I. Gordon. 2001. The biology and enzymology of protein N-myristoylation. Ann. Rev. Biochem. 276: 3950139504. P Gahmberg, C. G. and M. Tolvanen. 1996. Why mammalian cell surface proteins are glycoproteins. Trends Biochem. Sci. 21: 308311. P
Regulacija funkcije proteina

Barford, D. 1996. Molecular mechanisms of the protein serine/threonine phosphatases. Trends Biochem. Sci. 21: 407412. P Fauman, E. B. and M. A. Saper. 1996. Structure and function of the protein tyrosine phosphatases. Trends Biochem. Sci. 21: 413417. P Fischer, E. H. and E. G. Krebs. 1989. Commentary on The phosphorylase b to a converting enzyme of rabbit skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta 1000: 297301. P Hanks, S. K., A. M. Quinn and T. Hunter. 1988. The protein kinase family: Conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science 241: 4252. P Hunter, T. 1995. Protein kinases and phosphatases: The yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell 80: 225236. P
Dio
III
Struktura i funkcija stanice
8 Jezgra 9 Razvrstavanje i prijenos proteina 10 Bioenergetika i metabolizam 11 Citoskelet i stani~no kretanje 12 Stani~na povr{ina
Poglavlje
Jezgra
Jezgrina ovojnica i promet izme|u jezgre i citoplazme 323 Unutarnja organizacija jezgre 335 Jezgrica (nucleolus) 339 Jezgra za vrijeme mitoze 345
KLJU^NI POKUS: Identifikacija
jezgrinih lokalizacijskih signala 330
Bolesti jezgrine lamine 340
koja ozna~uje razliku izme|u eukariotskih i prokariotskih stanica jest prisutnost jezgre u eukariota. S obzirom na to da pruà smje{taj stani~nom genomu, jezgra sluì i kao spremi{te geneti~ke informacije, ali i kao stani~ni kontrolni centar. Unutar jezgre odvija se replikacija DNA, transkripcija, dorada RNA, a samo se zavr{ni stadij ekspresije gena (translacija) doga|a u citoplazmi. Kako odvaja genom od citoplazme, jezgrina ovojnica omogu}uje odvijanje regulacije ekspresije gena mehanizmima koji su jedinstveni za eukariote. Dok se translacija prokariotske mRNA odvija u vrijeme kad transkripcija jo{ traje, eukariotska mRNA prolazi razli~ite oblike posttranskripcijske dorade prije nego bude transportirana iz jezgre u citoplazmu. Na taj na~in prisutnost jezgre omogu}uje da se ekspresija gena regulira posttranskripcijskim mehanizmima, kao {to je, primjerice, alternativno prekrajanje. Ograni~avaju}i pristup odre|enim proteinima do geneti~kog materijala, jezgrina ovojnica tako|er otvara nove mogu}nosti za kontrolu ekspresije gena na razini transkripcije. Primjerice, ekspresija nekih eukariotskih gena kontrolirana je uz pomo} regulacije transporta transkripcijskih faktora iz citoplazme u jezgru oblik regulacije transkripcije nedostupan prokariotima. Stoga odvajanje genoma od mjesta translacije mRNA igra klju~nu ulogu u ekspresiji gena eukariota.
LAVNA KARAKTERISTIKA
Jezgrina ovojnica i promet izme|u jezgre i citoplazme

Jezgrina ovojnica odvaja sadràj jezgre od citoplazme i ostvaruje strukturnu potporu jezgre. Dvije membrane ovojnice, djeluju}i kao barijere koje sprje~avaju slobodan prolaz molekula izme|u jezgre i citoplazme, odràvaju jezgru u obliku druga~ijega biokemijskog odjeljka stanice. Jedini kanali kroz koje je omogu}en prolazak jesu kompleksi jezgrinih pora, koji omogu}uju reguliranu izmjenu molekula izme|u jezgre i citoplazme. Selektivan promet proteina i razli~itih RNA molekula kroz komplekse jezgrinih pora ne ostvaruje samo karakteristi-
324
(A)
Poglavlje 8
(B) endoplazmatski retikul kompleks jezgrine pore
vanjska membrana
jezgrica unutarnja membrana
0,2 mm
vanjska membrana perinuklearni prostor (C) unutarnja membrana glatki endoplazmatski retikul
ribosomi
Slika 8-1. Jezgrina ovojnica.

(A) Elektronskomikroskopska slika jezgre. Unutarnja i vanjska jezgrina membrana povezane su na mjestima kompleksa jezgrinih pora (strjelice). (B) Elektronskomikroskopska slika prikazuje kontinuiranost jezgrine vanjske membrane s endoplazmatskim retikulom. (C) Shematski prikaz jezgrine ovojnice. Unutarnja jezgrina membrana ome|ena je jezgrinom laminom koja sluì kao mjesto prihva}anja kromatina. (A, David M. Phillips/Photo Researches, Inc.; B, ljubazno{}u dr. Wer nera W. Franka, Ger man Cancer Research Center, Heidelberg.)
kompleks jezgrine pore
jezgrina lamina
jezgrica
kromatin
~an unutarnji sastav jezgre, nego ima klju~nu ulogu u regulaciji ekspresije gena eukariota.
Struktura jezgrine ovojnice

Jezgrina ovojnica je kompleksne strukture, izgra|ena je od dviju jezgrinih membrana, prilijeù}e jezgrine lamine i kompleksa jezgrinih pora (slika 81). Jezgra je okruèna sustavom dviju koncentri~nih membrana, nazvanih unutarnja i vanjska jezgrina membrana. Vanjska jezgrina membrana nastavlja se na endoplazmatski retikul, tako da je prostor izme|u vanjske i unutarnje jezgrine membrane direktno povezan s lumenom endoplazmatskog retikula. Nadalje, vanjska jezgrina membrana funkcionalno je sli~na membranama endoplazmatskog retikula (vidi 9. poglavlje), pa na svom ci-
Jezgra
325
Slika 8-2. Elektronskomikroskopska slika jezgrinih pora.

Veliki broj jezgrinih pora (strjelice) vidljiv je na ovoj preparaciji jezgrine ovojnice metodom smrzavanja i lomljenja. (photo Researches, Inc).
0,5 mm
toplazmatskom licu nosi pri~vr{}ene ribosome. Nasuprot tomu, unutarnja jezgrina membrana sadràva proteine specifi~ne za jezgru, kao primjerice proteine koji se vezuju na matriks jezgrine lamine (opisano dalje u tekstu). Klju~na uloga jezgrinih membrana jest u tome da djeluju kao barijera koja odvaja sadràj jezgre od citoplazme. Poput ostalih stani~nih membrana, svaka jezgrina membrana je fosfolipidni dvosloj, propustan samo za male nepolarne molekule (vidi sliku 2-50). Ostale molekule nisu u mogu}nosti pro}i kroz dvosloj. Unutarnja i vanjska jezgrina membrana spajaju se na mjestima kompleksa jezgrinih pora, jedinih kanala kojima male polarne molekule i makromolekule mogu pro}i kroz jezgrinu ovojnicu (slika 8-2). Kao {to }e biti re~eno u sljede}em odjeljku, kompleks jezgrine pore sloèna je struktura odgovorna za selektivan promet proteina i razli~itih RNA molekula izme|u jezgre i citoplazme. Prilijeù}i uz unutarnju jezgrinu membranu, smje{tena je jezgrina lamina mreà koja ostvaruje strukturnu potporu jezgre (slika 8-3). Jezgrina la-
Slika 8-3. Elektronskomikroskopska slika jezgrine lamine.

Jezgrina lamina je mreà vlakana koja prilijeù uz unutarnju jezgrinu membranu i proteù se u unutra{njost jezgre. (Iz U. Aebi, J. Cohn, L. Buhle and L. Gerace, 1986. Nature 323:560)
0,5 mm
326
Poglavlje 8
polipeptid lamina
dimer povezivanje glave s repom dimera
polimer
postrani~no povezivanje polimera
filament (vlakno)
Slika 8-4 Model sastavljanja lamina.

Polipeptidi lamina for miraju dimere u kojima su sredi{nje regije a-uzvojnice dvaju polipeptidnih lanaca omotane jedna oko druge. Daljnje sastavljanje moè uklju~ivati povezivanje glave s repom dimera da bi se formirali linearni polimeri, i postrani~no povezivanje polimera da bi se for mirali filamenti (vlakna).
mina izgra|ena je od jednog ili vi{e srodnih proteina nazvanih lamini. Ve}ina stanica sisavaca sadràva ~etiri razli~ita lamina, ozna~ena kao A, B1, B2 i C. Svi lamini su vlaknasti proteini teìne 6080 kilodaltona (kd), srodni proteinima intermedijarnih filamenata, pa se tako i lamini povezuju jedan s drugim da bi formirali filamente (slika 8-4). Prva faza ovog povezivanja jest interakcija dvaju lamina da bi se formirao dimer u kojem su dijelovi a-uzvojnice dvaju polipeptidnih lanaca omotani jedan oko drugoga tvore}i strukturu nazvanu pletenica (engl. coiled coil). Ovi dimeri lamina udruùju se sada jedan s drugim i tvore filamente koji grade jezgrinu laminu. Povezivanje lamina s unutarnjom jezgrinom membranom olak{ano je zbog posttranslacijskog dodavanja lipida to~nije prenilacijom C-terminalnih cisteinskih ostataka (vidi sliku 7-32). Nadalje, lamini se veù na specifi~ne proteine unutarnje membrane jezgre, ostvaruju}i njihovo povezivanje s jezgrinom ovojnicom i lokaliziraju}i i organiziraju}i ih unutar jezgre. Matriks jezgrinih lamina, puno labavija struktura, proteè se i u unutra{njost jezgre. Ovi lamini sluè kao mjesta vezivanja kromatina. Kromatin je unutar jezgre organiziran u obliku velikih petlji DNA, a specifi~ne regije ovih petlji vezane su na matriks lamina. Normalna organizacija lamina klju~na je za replikaciju DNA, a vjerojatno igra ulogu i u regulaciji transkripcije.
Kompleks jezgrine pore

Kompleksi jezgrinih pora jedini su kanali kroz koje male polarne molekule, ioni i makromolekule (proteini i molekule RNA) mogu putovati izme|u jezgre i citoplazme. Kompleks jezgrine pore je izuzetno velika struktura promjera oko 120 nm i prosje~ne molekularne mase od oko 125 milijuna daltona oko 30 puta ve}a od ribosoma. Taj je kompleks u kralje`njaka sastavljen od 50 do 100 razli~itih proteina pora, od kojih je najve}i dio prisutan u velikom broju kopija. Zbog kontrole prometa molekula izme|u jezgre i citoplazme, kompleks jezgrine pore igra klju~nu ulogu u fiziologiji eukariotskih stanica. RNA molekule sintetizirane u jezgri moraju se efikasno
Jezgra
327
transportirati u citoplazmu gdje }e sluìti u procesu sinteze proteina. Nasuprot tomu, proteini potrebni za razli~ite funkcije jezgre (primjerice transkripcijski faktori) moraju se transportirati s mjesta njihove sinteze {to je citoplazma, u jezgru. Nadalje, mnogi se proteini neprekidno prebacuju izme|u jezgre i citoplazme. Ovisno o veli~ini, molekule mogu putovati kroz komplekse jezgrinih pora jednim od dvaju razli~itih mehanizama (slika 8-5). Male molekule i neki proteini molekularne mase manje od otprilike 20 kd prolaze slobodno kroz jezgrinu ovojnicu u oba smjera: iz citoplazme u jezgru ili iz jezgre u citoplazmu. Ove molekule pasivno difundiraju kroz otvorene vodene kanale, ~iji prosje~an promjer iznosi 9 nm, a nalazi se unutar kompleksa jezgrine pore. Ve}ina proteina i RNA molekula, naravno, ne moè pro}i kroz ove otvorene kanale. Umjesto toga, ove makromolekule prolaze kroz komplekse jezgrinih pora aktivnim procesom u kojem odre|eni proteini i RNA molekule bivaju prepoznani i selektivno transportirani u odre|enom pravcu (iz jezgre u citoplazmu ili iz citoplazme u jezgru). Snimka kompleksa jezgrine pore uz pomo} elektronskog mikroskopa otkriva strukturu s oktagonalnom simetrijom organiziranu oko velikoga sredi{njeg kanala (slika 8-6), {to predstavlja put kojim proteini i RNA molekule prolaze kroz jezgrinu ovojnicu. Detaljna istraìvanja strukture, uklju~uju}i analizu slike uz pomo} ra~unala, dovela su do razvitka trodimenzionalnog modela kompleksa jezgrine pore (slika 8-7). Ova istraìvanja pokazuju da se kompleks jezgrine pore sastoji od 8 pre~ki sloènih oko sredi{njeg kanala. Pre~ke su povezane s prstenom na jezgrinoj i citoplazmatskoj povr{ini, a ~itava struktura pre~ki i prstenova u~vr{}ena je za jezgrinu ovojnicu na mjestima gdje se spajaju unutarnja i vanjska jezgrina membrana. Iz jezgrina i citoplazmatskoga prstena proteù se proteinski filamenti, formiraju}i na taj na~in strukturu poput ko{a na strani jezgre. Promjene konformacije sredi{njeg kanala za vrijeme prolaska makromolekula uzrokuju promjenu otvora od 9 nm do ~ak 40 nm, {to je dovoljno za prolazak najve}ih ~estica kroz jezgrinu ovojnicu.
pasivna difuzija
transport uz utro{ak energije proteini

E
male molekule
E
jezgra
molekule RNA
Slika 8-5. Promet molekula kroz komplekse jezgrinih pora.

Male molekule prolaze brzo, pasivnom difuzijom kroz otvorene kanale unutar kompleksa jezgrine pore. Nasuprot tomu, makromolekule se prenose selektivno, mehanizmom u kojem se tro{i energija, a koji je uklju~en naj~e{}e u ulazak proteina u jezgru i izlazak RNA molekula u citoplazmu.
Slika 8-6. Elektronskomikroskopska slika kompleksa jezgrinih pora.

Gledani sprijeda, izolirani kompleksi jezgrinih pora izgledaju kao da su izgra|eni od osam struktur nih podjedinica koje okruùju sredi{nji kanal. (posredstvom dr. Rona Milligana, The Scripps Research Institute.)
0,2 mm
328
Poglavlje 8
Slika 8-7. Model kompleksa jezgrine pore.

Kompleks se sastoji od osam pre~ki pri~vr{}enih za prstenove na citoplazmatskoj i jezgrinoj strani jezgrine ovojnice. Kompleks pre~ki i prstenova okruùje sredi{nji kanal. Citoplazmatski filamenti pruàju se iz citoplazmatskoga prstena, a filamenti koji formiraju jezgrin ko{ str{e iz jezgrinoga prstena.
citoplazma citoplazmatski filament
citoplazmatski prsten vanjska jezgrina membrana
struktura pre~ki i prstenova
jezgrin prsten sredi{nji kanal jezgrin ko{ jezgra
unutarnja jezgrina membrana
Selektivni transport proteina u jezgru i iz jezgre

Temelj selektivnog transporta kroz jezgrinu ovojnicu najbolje je prou~en i shva}en za proteine koji ulaze u jezgru iz citoplazme. Ti su proteini odgovorni za sve aspekte strukture i funkcije genoma; tu su uklju~eni histoni, DNA-polimeraze, RNA-polimeraze, transkripcijski faktori, faktori prekrajanja, i mnogi drugi. Ovi su proteini usmjereni u jezgru uz pomo} specifi~noga sljeda aminokiselina nazvanog jezgrin lokalizacijski signal, koji prepoznaju transportni receptori, te usmjeravaju prijenos proteina kroz kompleks jezgrine pore. Prvi takav jezgrin lokalizacijski signal kartirali su i opisali Alan Smith i suradnici 1984. godine. Ovi su istraìva~i prou~avali T antigen majmunskog virusa 40 (SV40), tj. protein koji pokre}e replikaciju virusne DNA u inficiranim stanicama, a kodiran je virusom (vidi 5. poglavlje). Kao {to se moè o~ekivati za replikacijski protein, on se obi~no nalazi u jezgri. Signal odgovoran za njegovu lokalizaciju u jezgri prvi put je identificiran pronalaskom mutacije jednog jedinog lizina u proteinu, a ta je mutacija sprije~ila njegov prijenos u jezgru i rezultirala nakupljanjem T antigena u citoplazmi. Nastavak istraìvanja otkrio je da je jezgrin lokalizacijski signal T antigena slijed od sedam aminokiselina Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Ne samo da je taj slijed nuàn za prijenos T antigena u jezgru, nego dodatak istog na bilo koji normalni citoplazmatski protein uzrokuje akumulaciju toga proteina u jezgri. Od tada su identificirani jezgrini lokalizacijski signali i na mnogim drugim proteinima. Neki su od tih sljedova, ba{ kao onaj na T antigenu, kratki odsje~ci bogati bazi~nim aminokiselinama (lizin i arginin). êsto su, naravno, aminokiseline koje ~ine jezgrin lokalizacijski signal smje{tene jedna do druge, ali ponekad i nisu. Primjerice, jezgrin lokalizacijski signal nukleo-
Jezgra
329
Slika 8-8 Jezgrini lokalizacijski signali.

Jezgrin lokalizacijski signal T antigena jedan je lanac aminokiselina. Nasuprot tomu, jezgrin lokalizacijski signal nukleoplazmina je bipartit koji se sastoji od sljeda Lys-Arg i sljeda Lys-Lys-Lys-Lys locirane deset aminokiselina nizvodno.
T antigen
...
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val g
...
nukleoplazmin
...
Lys Arg g
Lys Lys Lys Lys
...
plazmina (protein uklju~en u uspostavu kromatina) sastoji se od dvaju dijelova: para Lys-Arg iza kojeg slijede ~etiri lizina smje{tena deset aminokiselina nizvodno (slika 8-8). I par Lys-Arg i slijed Lys-Lys-Lys-Lys potrebni su za usmjerivanje proteina u jezgru, no onih deset aminokiselina izme|u ovih sljedova moè biti mutirano bez utjecaja na lokalizaciju proteina u jezgru. S obzirom na to da se sastoji od dvaju odvojenih elementa, ovakav jezgrin lokalizacijski signal nazivamo bipartit. Sli~ni bipartitni signali izgleda funkcioniraju kao lokalizacijski signali za mnoge jezgrine proteine; stoga su, ~ini se, u~estaliji od jednostavnog lokalizacijskog signala T antigena. Dok je ve}ina jezgrinih lokalizacijskih signala izgra|ena od ovakvih bazi~nih aminokiselina, te se ~esto nazivaju bazi~nim ili klasi~nim jezgrinim lokalizacijskim signalima, struktura aminokiselina ostalih jezgrinih lokalizacijskih signala znatno varira. Klju~nu ulogu pri ulasku proteina u jezgru kroz kompleks jezgrine pore imaju dva tipa proteina: receptor za transport u jezgru i mali protein koji veè GTP nazvan Ran, srodan Ras proteinu. Postoje dva tipa receptora za transport u jezgru (karioferini): importini, koji prenose makromolekule iz citoplazme u jezgru, i eksportini, koji prenose makromolekule iz jezgre u citoplazmu (tablica 8-1) Neki importini (Kapb1) djeluju zdruèno u hetero-
Tablica 8-1. Karioferini s poznatim supstratima

Karioferin
Ulazak u jezgru Kapa/Kapb1 dimer
Organizam
~ovjek
Supstrat
proteini s jezgrinim lokalizacijskim signalom izgra|enim od bazi~nih aminokiselina (primjerice nukleoplazmin) snRNPs (U1, U2, U4, U5) Cdk/ciklin compleksi proteini vezani na mRNA ribosomni proteini histon H1 proteini s jezgrinim lokalizacijskim signalom bogatim leucinom Kapa tRNA elongacijski faktor 5A
snurportin Kapb1 sam Kapb2 (transportin) Kapb3 importin7/Kapb1 dimer Izlazak iz jezgre Crm1 CAS eksportin-t eksportin4
~ovjek ~ovjek ~ovjek ~ovjek ~ovjek kralje`njaci ~ovjek ~ovjek mi{
330
Poglavlje 8
Identifikacija jezgrinih lokalizacijskih signala

A Short Amino Acid Sequence Able to specify Nuclear Location Daniel Kalderon, Bruce L. Roberts, William D. Richardson and Alan E. Smith
National Institute for Medical Research, Mill Hill, London Cell, Volume 39, 1984, pages 499509
Kontekst
u jezgri stanica inficiranih sa SV40. Odràvanje jezgre kao druga~ijeg bio- Ranija istraìvanja u laboratoriju Alana kemijskog odjeljka stanice zahtijeva Smitha, kao i u laboratoriju Janet Butel mehanizam kojim se ostvaruju razlike (Lanford i Butel, 1984, Cell 37: 801-813), izme|u proteina jezgre i citoplazme. pokazala su da mutacija Lys-128 u treoAlan Smith Istraìvanja provedena 1970-ih godina nin ili asparagin sprje~ava nor malnu utvrdila su da male molekule brzo akumulaciju T antigena u jezgrama difundiraju kroz jezgrinu ovojnicu, ali stanica glodavaca i majmuna. Umjesto ve}ina proteina nema takve sposob- da se transportiraju u jezgru, ovi muti- T antigena. Mutirani T antigeni s delecinosti. Stoga se ~inilo da jezgrini pro- rani T antigeni ostaju u citoplazmi, {to jom koja uklanja aminokiseline izme|u teini moraju biti specifi~no prepoznani govori da je lizin 128 dio jezgrinog loka- broja 1 i 126 ili izme|u broja 136 i C i selektivno transportirani od mjesta lizacijskog signala. Kalderon i suradnici ter minalnog kraja lanca nor malno se njihove sinteze, tj. s ribosoma u citop- testirali su ovu hipotezu primijeniv{i nakupljaju u jezgri. Nasuprot tomu, dva razli~ita eksperimentalna pristupa. mutirani protein s delecijom aminokiselazmi do jezgre. Prvo, odredili su posljedice razli~itih lina izme|u broja 127 i 132 zadràvao Raniji eksperimenti Gnthera Blobela i suradnika utvrdili su da su delecija na unutarstani~nu lokalizaciju se u citoplazmi. proteini usmjereni na endoplazmatski retikul uz pomo} signalnoga slijeda (A) (B) izgra|enog od kratkih odsje~aka aminokiselina (vidi 9. poglavlje). U ~lanku iz 1984. godine Alan Smith i suradnici pro{irili su ovakav pristup na usmjerivanje jezgrinih proteina prema jezgri i identificirali kratke sljedove aminokiselina koji sluè kao jezgrin lokalizacijski signal.
Eksperimenti
Kao model za prou~avanje jezgrinog lokalizacijskog signala u ìvotinjskoj stanici posluìo je T antigen, protein virusa SV40. T antigen je protein teìne 94 kd koji je potreban za replikaciju DNA virusa i obi~no se nalazi
U stanice je mikroubrizgavanjem uba~ena plazmidna DNA koja kodira kimerni protein u kojem su aminokiseline SV40 fuzionirane s piruvat-kinazom. Stani~na lokalizacija fuzioniranih proteina odre|ena je imunofluorescentnom mikroskopijom. (A) Fuzionirani protein sadràva funkcionalni SV40 jezgrin lokalizacijski signal (aminokiseline od 126132). (B) Jezgrin lokalizacijski signal inaktiviran delecijom aminokiselina 131 i 132.
dimeru s adapterom karioferinom (Kapa) da bi usmjerili u jezgru proteine koji sadràvaju bazi~ne jezgrine lokalizacijske signale. Za vrijeme ulaska proteina u jezgru, specifi~ni importin prepoznaje jezgrin lokalizacijski slijed na proteinu koji treba prenijeti. Sposobnost da to u~ini potpomognuta je interakcijom s Ran proteinom. Konformacija i aktivnost Ran proteina regulirana je vezanjem GTP i njegovom hidrolizom, kao i kod Ras proteina (vidi sliku 7-36) ili kod razli~itih faktora translacije uklju-
Jezgra
331
Da bi utvrdili je li upravo taj slijed aminokiselina sposoban usmjeriti proteine u jezgru, istraìva~i su konstruirali kimere u kojima je slijed aminokiselina T antigena fuzioniran s proteinima koji su nor malno citoplazmatski. Ovi su eksperimenti utvrdili da je dodavanje slijeda aminokiselina T antigena od broja 126 do 132 na b-galaktozidazu ili piruvat-kinazu dovoljan da ove ina~e citoplazmatske proteine usmjeri u jezgru (vidi sliku). Ovaj kratak slijed
aminokiselina T antigena SV40 virusa funkcionira kao jezgrin lokalizacijski signal, koji je nuàn i dostatan da usmjeri proteine na ulazak u jezgru.
Utjecaj
Kalderon i suradnici u svom su ~lanku iz 1984. godine pretpostavili da jezgrin lokalizacijski signal T antigena virusa SV40 predstavlja prototip sli~nih sljedova ostalih jezgrinih proteina. Usmjeruju}i proteine na ulazak u jezgru, ovi
signali su klju~ uspostave biokemijskog integriteta jezgre i odràvanja osnovne podjele eukariotske stanice na jezgrin i citoplazmatski odjeljak. Danas se zna da jezgrine lokalizacijske signale prepoznaju citoplazmatski receptori koji transportiraju svoje supstrate-proteine kroz komplekse jezgrinih pora. Identifikacija jezgrinih lokalizacijskih signala predstavlja klju~ni napredak u razumijevanju ulaska proteina u jezgru.
~enih u sintezu proteina (vidi sliku 7-13). Enzimi koji kataliziraju izmjenu GDP za GTP na Ran proteinu lokalizirani su na unutra{njoj strani jezgrine ovojnice, dok se enzimi koji kataliziraju hidrolizu GTP u GDP nalaze na njezinoj citoplazmatskoj strani. Kao posljedica toga pojavljuje se gradijent Ran/GTP kroz jezgrinu poru, s ve}om koncentracijom Ran/GTP unutar jezgre i ve}om koncentracijom Ran/GDP u citoplazmi. Gradijent Ran/GTP je taj za koji se smatra da odre|uje smjer jezgrinog transporta. Ulazak proteina u jezgru kroz komplekse jezgrinih pora jest ciklus od pet koraka (slika 8-9). U prvom koraku, kompleks sastavljen od importina i Ran/GDP vezuje protein koji sadràva jezgrin lokalizacijski signal. U sljede}em koraku ovaj kompleks receptora i proteina koji se prenosi veè se na proteine citoplazmatskih filamenata kompleksa jezgrine pore. Transport se sada nastavlja postupnim vezivanjem na specifi~ne proteine kompleksa jezgrine pore koji se nalaze sve dalje i dalje prema jezgrinoj strani kompleksa pore. Tre}i korak u prolasku proteina doga|a se u jezgri, gdje se GDP vezan za Ran mijenja u GTP To dovodi do promjene konformacije importina, . {to uzrokuje odvajanje proteina koji se prenosi i njegovo otpu{tanje u unutra{njost jezgre. U ~etvrtom koraku, kompleks importin-Ran/GTP vra}a se natrag kroz kompleks jezgrine pore. Zadnji se korak odvija u citoplazmi, gdje se GTP hidrolizira u GDP da bi se obnovio kompleks Ran/GDP potreban za novi transport. Neki proteini ostaju nakon svog dolaska iz citoplazme u jezgri, ali mnogi drugi se stalno prebacuju izme|u jezgre i citoplazme. Neki od tih proteina djeluju kao nosa~i u transportu ostalih molekula kao {to su primjerice molekule RNA; ostali koordiniraju funkcije jezgre i citoplazme (reguliraju}i primjerice aktivnosti transkripcijskih faktora). Proteini su usmjereni na izlazak iz jezgre specifi~nim slijedom aminokiselina nazvanim jezgrin izlazni signal. Kao i jezgrine lokalizacijske signale, tako i jezgrine izlazne signale prepoznaju receptori unutar jezgre, eksportini, koji usmjeruju transport proteina kroz kompleks jezgrine pore u citoplazmu. Mnogi su eksportini ~lanovi karioferinske obitelji proteina (vidi tablicu 8-1). Poput importina, eksportini se veù na Ran koji je potreban kako za izlazak proteina tako i za njegov ulazak u jezgru (slika 8-10). Me|utim, kompleks Ran/GTP poti~e formiranje stabilnih kompleksa izme|u eksportina i proteina koje prenose, dok razdvaja komplekse importina i proteina koje oni prenose. Efekt veza-
332
Poglavlje 8
Slika 8-9. Ulazak proteina u jezgru kroz kompleks jezgrine pore.

Proteini ulaze u jezgru kroz kompleks jezgrine pore u pet koraka ciklusa. U prvom koraku protein s jezgrinim lokalizacijskim sljedom (NLS nuclear localization sequence) prepoznaje importin koji je u kompleksu s malim proteinom koji veè GTP nazvanim Ran. U drugom , koraku kompleks sastavljen od tereta (protein s jezgrinom lokalizacijskom sekvencijom), importina i Ran/GDP veè se na specifi~ni protein citoplazmatskih filamenata unutar kompleksa jezgrine pore. U tre}em koraku, kompleks se prebacuje kroz jezgrinu poru postupnim vezanjem na proteine pore. U ~etvrtom koraku aktivno{}u faktora koji izmjenjuje gvanin (Ran GEF guanin nucleotide exchange factor) unutar jezgre izmjenjuje se GDP na Ran proteinu za GTP tako se , mijenja konfiguracija kompleksa, te se protein otpu{ta. U petom koraku, kompleks importin-Ran/GTP izlazi kroz poru iz jezgre, a protein koji aktivira GTP-azu (Ran GAP) u citoplazmi hidrolizira GTP na Ran proteinu do GDP .
protein NLS
importin
GDP
citoplazma Pi
Ran Ran GAP

GDP
GTP
GDP
Ran GEF
+
GDP
jezgra
nja Ran/GTP kompleksa na eksportine diktira kretanje proteina koji nose signal za izlazak iz jezgre iz smjera jezgre prema citoplazmi. Stoga, eksportini formiraju stabilne komplekse s proteinima koje prenose i Ran/GTP unutar jezgre. Nakon transporta prema citoplazmatskom licu jezgrine ovojnice, hidroliza GTP dovodi do odvajanja prenesenog proteina koji se otpu{ta u citoplazmu.
Regulacija ulaska proteina u jezgru

Zanimljivi aspekt promatranja transporta proteina u jezgru jest taj da je to zapravo nova (dodatna) razina na kojoj se aktivnost jezgrinih proteina moè kontrolirati. Transkripcijski su faktori, primjerice, funkcionalni samo kad se nalaze u jezgri, tako regulacija njihovog ulaska i izlaska iz jezgre predstavlja novi na~in kontrole ekspresije gena. Kao {to }e biti obja{njeno u 13. poglavlju, regulirani ulazak transkripcijskih faktora i protein-kinaza u jezgru igra klju~nu ulogu u kontroli pona{anja stanice kao njezina odgovora na promjene okoline, jer je tim na~inom ostvaren mehanizam kojim signali primljeni na povr{ini stanice mogu biti preneseni u jezgru. U jednom od na~ina regulacije, transkripcijski faktori (ili neki drugi proteini) udruùju se s citoplazmatskim proteinima koji maskiraju njihove je-
Jezgra
333
citoplazma
Slika 8-10. Izlazak proteina iz jezgre.

Unutar jezgre formira se kompleks izme|u proteina koji nosi jezgrin izlazni signal (NES nuclear export signal), eksportina i Ran/GTP Kako transport napreduje . kroz kompleks jezgrine pore, tako RanGAP (GTPase-activating protein) stimulira hidrolizu vezanog GTP {to dovodi do formiranja Ran/GDP i otpu{tanja proteina i eksportina u citoplazmu. Eksportin se tada prenosi natrag u jezgru.
GDP Ran GAP
Pi
Ran
protein eksportin jezgrin izlazni signal
jezgra
zgrine lokalizacijske signale; kako njihovi signali nisu vi{e prepoznatljivi, oni ostaju u citoplazmi. Primjer takvog na~ina regulacije je transkripcijski faktor NF-B koji aktivira transkripciju lakih lanaca -imunoglobulina u limfocitima B (slika 8-11). U nestimuliranim stanicama, NF-B postoji kao inaktivan kompleks s inhibitornim proteinom (I-B) u citoplazmi. Vezanjem na I-B maskira se jezgrin lokalizacijski signal transkripcijskog faktora NFB i sprje~ava njegov prijenos u jezgru. U stimuliranim stanicama, I-B je fosforiliran i razgra|en proteolizom posredovanom ubikvitinom, {to omogu}uje da NF-B u|e u jezgru i aktivira transkripciju svojih ciljnih gena. Ulazak ostalih transkripcijskih faktora u jezgru reguliran je direktno njihovom fosforilacijom, a ne udruìvanjem s inhibitornim proteinima. Primjerice kva{}ev transkripcijski faktor SW15 ulazi u jezgru samo u odre|enoj fazi stani~noga ciklusa (vidi sliku 8-11). Ina~e SW15 ostaje u citoplazmi zbog fosforiliranosti serinskih ostataka koji se nalaze tik do njegova jezgrinog lokalizacijskog slijeda, te sprje~avaju njegov ulazak u jezgru. Re-
citoplazma NF-B I-B NLS fosforilacija i proteoliza I-B SWI5 P NLS defosforilacija
Slika 8-11. Regulacija ulaska transkripcijskih faktora u jezgru.

Transkripcijski faktor NF-B odràva se u citoplazmi kao inaktivan kompleks s I-B {to maskira njegov jezgrin lokalizacijski slijed (NLS nuclear localization sequence). Kao odgovor na odre|ene izvanstani~ne signale I-B se fosforilira i razgra|uje proteolizom, dopu{tju}i ulazak NF-B u jezgru. Nasuprot tomu, kva{}ev transkripcijski faktor SW15 odràva se u citoplazmi fosforilacijom u blizini njegova jrzgrina lokalizacijskoga slijeda. Regulirana defosforilacija izlaè NLS i omogu}uje transport SW15 u jezgru u odre|enoj fazi stani~noga ciklusa.
importin
importin
jezgra
334
(A)
Poglavlje 8
(B)
(C)
(D)
0,1 mm
Slika 8-12. Transport ribonukleoproteinskoga kompleksa.

@lijezda slinovnica insekata proizvodi velike ribonukleoproteinske komplekse (RNP) koji sadràvaju 3540 kb RNA, a ukupne su mase otprilike 30 milijuna daltona. Ova serija elektronskomikroskopskih slika prikazuje prihva}anje takvog RNP na kompleks jezgrine pore (A) odmatanje RNA za vrijeme njezina prjelaska u citoplazmu (B-D). (Iz: H. Mehlin i sur., 1992. Cell 69:605).
gulirana defosforilacija ovih mjesta aktivira SW15 u to~no odre|enoj fazi stani~noga ciklusa dopu{taju}i njegov transport u jezgru.
Transport molekula RNA

Dok se mnogi proteini selektivno prenose iz citoplazme u jezgru, ve}ina RNA molekula izlazi iz jezgre u citoplazmu. Kako se proteini sintetiziraju u citoplazmi, izlazak mRNA, rRNA i tRNA predstavlja klju~ni korak u ekspresiji gena eukariotskih stanica. Isto kao i ulazak proteina, tako je i izlazak RNA molekula kroz komplekse jezgrinih pora aktivan proces koji zahtijeva energiju i protein koji veè GTP Ran. , RNA molekule prenose se kroz jezgrinu ovojnicu u obliku ribonukleoproteinskih kompleksa (RNP) (slika 8-12). Neki proteini u kompleksu sadràvaju jezgrine izlazne signale koje prepoznaju jezgrini transportni receptori (vidi sliku 8-10). Pre-mRNA kao i mRNA vezane su s najmanje 20 proteina (formiraju}i kompleks pre-mRNA-protein) za vrijeme dorade u jezgri i transporta u citoplazmu (vidi 6. poglavlje). Najmanje dva proteina mRNP sadràvaju jezgrine izlazne signale i smatra se da funkcioniraju kao nosa~i mRNA za vrijeme njezina transporta u citoplazmu. Ribosomne RNA prvo se povezuju sa ribosomnim proteinima, a onda i sa specifi~nim proteinima za doradu RNA u jezgrici, i tako nastale 60S i 40S ribosomne podjedinice transportiraju se u citoplazmu (vidi sliku 8-28). Njihov izlazak iz jezgre potpomognut je jezgrinim izlaznim signalima prisutnim na proteinima kompleksa ribosomne podjedinice. Specifi~ni proteini koji pomaù izlazak tRNA iz jezgre jo{ nisu identificirani. Za razliku od mRNA, tRNA i rRNA ~ija se funkcija ostvaruje u citoplazmi, mnoge male molekule RNA (snRNA i snoRNA) funkcioniraju unutar jezgre kao komponente sustava za doradu RNA. Mo`da iznena|uju}e, ali snRNA molekule se u po~etku transportiraju iz jezgre u citoplazmu, da bi se tamo vezale s proteinima i formirale funkcionalne snRNP te se nakon to, ga vratile u jezgru (slika 8-13). Proteini-transportni receptori koji se veù na 5' kapu snRNA molekula su, izgleda, uklju~eni u izlazak snRNA molekula
Jezgra
335
citoplazma vezanje proteina
snRNP
snRNA
snRNA
snRNP
jezgra
Slika 8-13. Transport snRNA molekula izme|u jezgre i citoplazme.

Male jezgrine RNA (snRNA small nuclear RNA) prvo se transportiraju iz jezgre u citoplazmu, gdje se veù s proteinima i formiraju snRNP Tako oblikovani snRNP zatim . se prenose natrag u jezgru.
u citoplazmu. Nasuprot tomu, sljedovi prisutni na proteinima snRNP su ti koji su odgovorni za transport snRNP iz citoplazme u jezgru.
Unutarnja organizacija jezgre

Jezgra je puno vi{e nego skladi{te gdje se nalaze kromatin i molekule RNA, a jezgrini proteini slobodno putuju kroz vodenu otopinu. Naprotiv, jezgra izgleda ima unutarnju strukturu koja organizira geneti~ki materijal i odre|uje prostorni smje{taj pojedinih funkcija unutar jezgre. Ve}ina se navedenoga, ako ne i sve, zasniva na visoko organiziranoj strukturi kromatina i njegovoj lokalizaciji unutar jezgre.
Kromosomi i struktura kromatina na vi{oj razini

Kromatin postaje visoko kondenziran za vrijeme mitoze da bi formirao kompaktne metafazne kromosome koji se raspore|uju me|u jezgrama stanica k}eri (vidi sliku 4-15). Za vrijeme interfaze, jedan dio kromatina (heterokromatin) ostaje visoko kondenziran i transkripcijski inaktivan; ostatak kromatina (eukromatin) se dekondenzira i raspore|uje po jezgri (slika 814), Stanice sadràvaju dva tipa heterokromatina. Konstitutivni heterokromatin sadràva sljedove DNA koje se nikad ne prepisuju, kao {to su, primjerice, satelitni sljedovi prisutne u centromerama. Fakultativni hetero kromatin sadràva sljedove koji se ne prepisuju u prou~avanoj stanici, ali se prepisuju u drugim tipovima stanica. Zaklju~no moèmo re}i da koli~ina fakultativnog heterokromatina varira ovisno o transkripcijskoj aktivnosti stanice. Iako se ~ini da je interfazni kromatin jednoliko raspore|en po jezgri, kromosomi su zapravo raspore|eni na organiziran na~in i podijeljeni u diskretne funkcionalne domene koje imaju va`nu ulogu u ekspresiji gena. Nasumi~na raspodjela kromatina unutar interfazne jezgre prvi je put predloèna 1885. godine kad je C. Rabl pretpostavio da svaki kromosom zauzima
336
Poglavlje 8
1 mm
Slika 8-14. Heterokromatin u interfaznoj jezgri.

Eukromatin je raspore|en po jezgri. Heterokromatin je nazna~en vrhovima strjelica, a jezgrica strjelicom. (Prema: Ada L. Olins i Donald E. Olins, Oak Ridge National Laboratory.)
odre|eno podru~je, tako da su centromere i telomere prihva}ene za suprotne strane jezgrine ovojnice (slika 8-15). Osnovni model organizacije kromosoma potvr|en je oko stotinu godina nakon toga (1984.) zahvaljuju}i detaljnom prou~avanju politenih (gorostasnih) kromosoma `lijezda slinovnica vinske mu{ice. Umjesto da se nasumce omataju jedan oko drugoga, svaki kromosom zauzima maleno podru~je jezgre (slika 8-16), a ~vrsto su vezani za jezgrinu ovojnicu na vi{e mjesta.
(A)
(B)
Slika 8-15. Organizacija kromosoma.

Reprodukcija crteà kromosoma u stanicama da`devnjaka. (A) kompletni kromosomi. (B) Samo telomere (smje{tene na jezgrinoj ovojnici). (Iz: C. Rabl, 1885. Morphologisches Jahrbuch 10:214.)
Jezgra
337
(A) centromere
Slika 8-16. Organizacija kromosoma vinske mu{ice.

(A) Model jezgre koji prikazuje pet kromosomskih krakova u razli~itim bojama. Nazna~eni su poloàji centromera i telomera. (B) Dva kraka kromosoma broj 3 istaknuta da pokaù topolo{ku separaciju me|u kromosomima. (Iz D. Mathog i sur., 1984. Nature 308:414.)
Pojedini kromosomi zauzimaju odre|ena mjesta unutar jezgre stanica sisavaca (slika 8-17). Geni koji se aktivno prepisuju nalaze se na telomere periferiji ovih podru~ja, uz kanale koji odvajaju pojedine kromoso(B) me. Novoprepisane RNA molekule se, izgleda, otpu{taju u te kanale izme|u kromosoma, gdje se odvija i proces dorade. Ve}ina heterokromatina lokalizirana je na periferiji jezgre, jer su proteini vezani na heterokromatin vezani i na matriks jezgrine lamine. Kako razli~iti tipovi stanica eksprimiraju razli~ite gene, njihov je heterokromatin razli~it i razli~ite se regije kromosoma veù s jezgrinom laminom u razli~itim tipovima stanica i tkiva. Neke stanice imaju centromere i telomere u nakupinama na suprotnim polovima, dok neke imaju kromosome raspore|ene radijalno. Kako raspored i smje{taj kromosoma unutar jezgre nije nasumi~an, tako se uvelike razlikuje u razli~itim tkivima i razli~itim organizmima. Poput DNA u metafaznim kromosomima (vidi sliku 4-16), i kromatin u interfaznoj jezgri organiziran je u petlje koje sadràvaju otprilike 50 do 100 kb DNA. Dobar primjer takve organizacije u obliku petlji jesu aktivni kromosomi oocita vodozemaca koji se u~estalo prepisuju. U njima se aktivni dijelovi DNA (gdje se vr{i transkripcija) vrlo lijepo vide kao izvu~ene petlje dekondenziranog kromatina (slika 8-18). Ove kromatinske domene, ~ini se, predstavljaju male funkcionalne jedinice koje neovisno jedna o drugoj reguliraju ekspresiju gena (vidi 6. poglavlje).
(A)
kopije kromosoma 4
Funkcionalne domene unutar jezgre

Unutarnja organizacija jezgre jo{ je dublje razja{njena nakon lokalizacije ostalih procesa u jezgri koji su ograni~eni na odre|ena podru~ja jezgre. Veliki broj komponenti jezgre lokaliziran je na zasebne subnuklearne strukture i domene. Priroda i funkcija ovih substruktura jezgre jo{ nije u potpunosti jasna, no razumijevanje organizacije funkcionalnih domena jezgre jo{ je uvijek potpuno neistraèno podru~je stani~ne biologije.
(B)
jezgrina ovojnica
Slika 8-17. Organizacija kromosoma u jezgri stanice sisavaca.

(A) Sonde na ponovljene sljedove kromosoma broj 4 hibridizirane su s ljudskim stanicama. Dvije kopije kromosoma 4, identificirane ùtom fluorescentnom bojom zauzimaju razli~ita podru~ja jezgre. (B) Model organizacije kromosoma. Kromosomi zauzimaju zasebna podru~ja jezgre odvojena intrakromosomskim domenama u kojima se, najvjerojatnije, doga|a dorada RNA i transport. (A, posredstvom Thomasa Cremera, Ludwig Maximilians University, iz: A. I. Lamond i W.C. Earnshaw, 1998. Science 280: 547.)
interkromosomska domena
kromosomska podru~ja
338
Poglavlje 8
0,1 mm
Slika 8-18. Domene kromatinskih petlji.

Svjetlosnomikroskopska slika kromosoma oocita vodozemaca koja prikazuje dekondenzirane petlje kromatina koji se prepisuju kako se izvijaju iz osi visoko kondenziranog neprepisuju}eg kromatina. (Posredstvom Josepha Galla, Carnegie Institute.)
Jezgre stanica sisavaca imaju, ~ini se, posebno grupirana mjesta replikacije DNA unutar kojih se doga|a replikacija vi{e molekula DNA. Ta zasebna mjesta replikacije DNA definirana su eksperimentima u kojima su novosintetizirane DNA vizualizirane unutar jezgre (slika 8-19). To je postignuto ozna~ivanjem stanica bromodeoksiuridinom, analogom timidina koji se ugra|uje u DNA, a zatim se detektira bojenjem s fluorescentnim protutijelima. U takvim eksperimentima, novoreplicirana DNA detektirana je u otprilike 200 zasebnih nakupina raspore|enih unutar jezgre. Kako je u diploidnoj stanici sisavaca aktivno otprilike 4.000 ishodi{ta replikacije u bilo koje vrijeme, svaka od tih nakupina mora sadràvati otprilike 40 replikacijskih ra{lji. Izgleda, dakle, da se replikacija DNA odvija u velikim strukturama koje sadràvaju veliki broj replikacijskih kompleksa organiziranih u zasebne funkcionalne domene, a koje su nazvane replikacijskim tvornicama. Geni koji se aktivno prepisuju raspore|eni su, ~ini se, po jezgri, ali su komponente sustava za prekrajanja koncentrirane u zasebnim subnuklearnim strukturnim domenama. Lokalizacija komponenti prekrajanja u zasebne domene unutar jezgre dokazana je imunofluorescentnim bojenjem protutijelima na snRNP i faktore prekrajanje (slika 8-20). Ove su komponente, umjesto raspr{ene jednoliko po jezgri, koncentrirane u 2050 zasebnih struktura nazvanih jezgrine pjege. Misli se da su pjege zapravo mjesta
Slika 8-19. Mjesta replikacije DNA.

Novoreplicirana DNA ozna~ena je kratkom ekspozicijom stanica bromodeoksiuridinom koji se ugradio u DNA na mjesto timidina. Ova zamjena omogu}uje direktnu detekciju novnosintetizirane DNA imunofluorescentnim bojenjem jezgara s protutijelima na bromodeoksiuridin. Uo~ite da je novoreplicirana DNA prisutna u zasebnim podru~jima raspr{enim po jezgri. (Posredstvom Ronalda Berezneya, SUNY/Buffalo.)
fluorescentna podru~ja replikacije DNA
Jezgra
339
pohrane komponenti prekrajanja, koje se zatim usmjeruju iz pjega na mjesta transkripcije gdje se doga|a dorada pre-mRNA. Osim pjega, jezgre sadràvaju nekoliko tipova morfolo{ki razli~itih struktura ili domena. Tri glavna tipa takvih jezgrinih domena su jezgrica Cajalova ili namotana tjele{ca (slika 8-21) i PML tjele{aca. Cajalova ili namotana tjele{ca bogata su malim RNP i vjeruje se da predstavljaju mjesta sastavljanja RNP Funkcija PML tjele{aca je nepoznata; ne posjeduju RNP ni. , su mjesta replikacije ili transkripcije. Stoga, iako spomenuta jezgrina tjele{ca pokazuju prisutnost u obliku substrukturalnih domena jezgre, njihova se funkcija mora razjasniti.
Jezgrica (nucleolus)
Najistaknutija substruktura jezgre jest nukleolus ili jezgrica (vidi sliku 8-1), koja predstavlja mjesto transkripcije ribosomne RNA i njezine dorade, kao i mjesto sastavljanja ribosoma. Kao {to je spomenuto u prethodnom poglavlju, stanice u odre|eno vrijeme trebaju veliki broj ribosoma da bi se mogla zadovoljiti potreba za sintezom proteina. Aktivna stanica sisavaca koja raste sadràva, primjerice, 510 milijuna ribosoma koji se moraju sintetizirati svaki put kad se stanica dijeli. Jezgrica je tvornica ribosoma, izgra|ena tako da zadovolji reguliranu i efikasnu proizvodnju rRNA i sastavljanje ribosomnih podjedinica. Nedavna otkri}a govore da jezgrice imaju i op}enitiju ulogu u modifikaciji RNA, te da vi{e tipova RNA molekula ulazi i izlazi iz jezgrice na specifi~nim stadijima njihove dorade.
Slika 8-20. Lokalizacija komponenti prekrajanja.

Bojenje imunofluorescentnim protutijelima pokazuje da su faktori prekrajanja koncentrirani u zasebnim domenama unutar jezgre. (Posredstvom Davida L. Spectora, Cold Spring Harbour Laboratory.)
Geni za ribosomnu RNA i organizacija jezgrice

Jezgricu koja nije okruèna membranom povezujemo s kromosomskim regijama koje sadràvaju gene za 5,8S, 18S i 28S ribosomne RNA. Ribosomi vi{ih eukariota imaju ~etiri tipa rRNA ozna~ena kao 5S, 5,8S, 18S i 28S rRNA (vidi sliku 7-4). 5,8S, 18S i 28S rRNA prepisuju se kao jedna molekula unutar jezgrice uz pomo} RNA-polimeraze I, {to daje 45S prekursor ribosomne RNA (slika 8-22). 45S ribosomna pre-RNA obra|uje se do 18S rRNA koju nalazimo u maloj ribosomnoj podjedinici (40S) te do 5,8S i 28S ribosomnih RNA, dijelova velike ribosomne podjedinice (60S). Transkripcija 5S rRNA, koju tako|er nalazimo u velikoj ribosomnoj podjedinici, doga|a se izvan jezgrice, a katalizira ju RNA-polimeraza III. Da bi spremno do~ekale transkripciju velikog broja molekula rRNA, sve stanice imaju veliki broj kopija gena za ribosomne RNA. Ljudski genom ima primjerice oko 200 kopija gena koji kodiraju za 5,8S, 18S i 28S rRNA i otprilike 2.000 kopija gena za 5S rRNA. Geni za 5,8S, 18S i 28S grupirani su
(A)
(B)
Slika 8-21. Cajalova tjele{ca u jezgri.

(A) Slika jezgre HeLa stanice dobivena diferencijalnom interferentno-kontrastnom mikroskopijom. Strjelice prikazuju dva Cajalova tjele{ca. (B) Imunofluorescentno bojenje iste jezgre s protutijelima na protein koilin (zeleno) i fibrilarin (cr veno). Fibrilarin je prisutan i u gustoj fibrilarnoj zoni jezgrice i u Cajalovim tjele{cima. Koilin je prisutan samo u Cajalovim tjele{cima. (Iz: J. G. Gall, 2000. Ann.Rev.Cell Dev.Biol. 16:273.)
340
Poglavlje 8
Bolesti jezgrinih lamina

Bolesti
Emery i Dreifuss opisali su 1966. godine novu mi{i}nu distrofiju vezanu na X kromosom. U ranoj fazi bolesti laktovi, vrat i pete pogo|enih osoba postaju uko~eni, a ~esto je prisutan i blok provodljivosti srca. Ovi se simptomi primje}uju u dobi od 10 godina, a uklju~uju hodanje na prstima zbog uko~enih Ahilovih tetiva i te{ko}e u savijanju laktova. Sr~ani problemi pojavljuju se oko dvadesete godine ìvota te mogu zahtijevati ugradnju pacemakera. Dolazi do postupnog tro{enja i slabosti mi{i}a ramena i nadlaktice gor njih udova te mi{i}a natkoljenice donjih udova, ali to se doga|a sporo i ne predstavlja problem sve do starije dobi. Gotovo 30 godina kasnije istraìva~i su pokazali da su za X vezanu Emery-Dreifussovu mi{i}nu distrofiju odgovor ne mutacije u transmembranskom proteinu. Protein su nazvali emerin po Alanu Emeryju. Ubrzo nakon toga nekoliko je skupina istraìva~a otkrilo da se emerin nalazi na unutra{njoj jezgrinoj membrani, a da ga bolesnici s Emery-Dreifuss mi{i}nom distrofijom nemaju. Ovakvo otkri}e nije bilo o~ekivano; mutacije proteina jezgrine ovojnice eksprimirane u svim stanicama nedvojbeno su uzrokovale bolest specifi~nu za jedno tkivo. Premda svim stanicama u tijelu nedostaje protein, patolo{ke su promjene vidljive jedino na mi{i}ima. Daljnja istraìvanja pokazala su da ista distrofija moè biti nasljedna, ali nevezana za X kromosom. Obitelji s takvom vrstom naslje|ivanja imale su mutacije u LMNA, genu koji kodira jezgrine lamine tipa A i C. Dakle, mutacije dvaju gena, jednoga koji kodira protein unutar nje membrane jezgrine ovojnice i drugoga koji kodira glavni jezgrin lamin, uzrokuju identi~nu klini~ku sliku mi{i}ne distrofije. Jo{ je vi{e iznenadilo da su paralelna istraìvanja razli~itih bolesti, Dunniganove parcijalne lipodistrofije i Charcot-Marie-Toothova poreme}aja tipa 2B1, dovela do razli~itih mutacija u LMNA genu. Prije toga lije~nici su smatrali ove bolesti potpuno razli~itim, kako po klini~kim manifestacijama, tako i po na~inu naslje|ivanja. Novija istraìvanja pokazuju da mutacije u jednom drugom proteinu unutra{nje jezgrine membrane, receptoru B lamina, predstavljaju bazu za razvitak PelgerHutove anomalije.
Molekularna i stani~na osnova

Ve}ina je biologa mislila da mutacije lamina moraju dovesti do op}enitih nepravilnosti arhitekture jezgre i ozbiljnih problema u stanicama koje se brzo dijele. Unato~ tomu, u bolesnika se zamje}uju samo minimalne promjene strukture jezgara. Stoga je zbunjuju}e kako mutacije jezgrinih lamina ili proteina koji se na njih veù mogu uzrokovati razli~ite tkivno specifi~ne bolesti. Odgovor nam jo{ nije poznat, ali postoje dvije glavne hipoteze. Pr va hipoteza jest hipoteza ekspresije gena. Ona polazi od toga da je pravilna interakcija izme|u dvaju proteina lamine, lamina A i C s jezgrinom ovojnicom klju~na za normalnu ekspresiju tkivno specifi~nih gena. Transkripcijski neaktivni geni smje{teni su uglavnom na periferiji jezgre, dok su oni koji se eksprimiraju koncentrirani u centru, specifi~no druga~ije za svaki tip stanice. Dakle, osnova ovih bolesti bila bi promjena u ekspresiji gena uzrokovana defektnim interakcijama proteina.
gen za rRNA 18S DNA 28S
razmaknica koja se ne prepisuje 18S
gen za rRNA 5,8S 28S
transkripcija razmaknica koja se prepisuje 45S pre-rRNA
Slika 8-22. Geni ribosomne RNA.

Svaki rRNA gen je jedna transkripcijska jedinica koja sadràva 18S, 5,8S i 28S rRNA i sljedove razmaknice. Geni za ribosomnu RNA grupirani su u podru~ja uzastopnih ponavljanja i odvojenih razmaknicama koje se ne prepisuju.
Jezgra
341
Prema hipotezi mehani~kog stresa smatra se da mutacije u kompleksu jezgrinih lamina i emerina dovode do oslabljene strukture mreè citoskeleta. U svim su stanicama, naime, lamina, unutra{nja jezgrina membrana i kompleksi jezgrinih pora ~vrsto povezani. Ova hipoteza, koja je najbolje primjenjiva na mi{i}nu distrofiju, govori da bi jezgrina lamina mogla biti indirektno povezana s mi{i}nim citoskeletom preko filamenata kompleksa jezgrinih pora.
Otkri}e da mutacije proteina jezgrine lamine uzrokuju nasljedne tkivno-specifi~ne bolesti bilo je iznena|uju}e i promijenilo je na~in razmi{ljanja znanstvenika o jezgrinoj ovojnici. Stoga su potrebna daljnja istraìvanja koja bi utvrdila je li osnova patolo{kih promjena u svakoj od ovih bolesti mehani~ka regulacija ili ekspresija gena. Dakako, poznata molekular na narav bolesti uvelike olak{ava dijagnozu i pove}ava vjerojatnost da }e se jednog
dana na}i prava terapija. Pr vi korak u rasvjetljivanju problema jest nedavno razvijeni mi{ji model gdje je izba~en gen LMNA. Kako se takvi zametci razvijaju, tako pokazuju simptome Emery-Dreifussove mi{i}ne distrofije. Na kraju, znanstvenici su sada svjesni da nekoliko nasljednih bolesti koje se sporo razvijaju mogu biti novi ~lanovi jezgrinih laminopatija.
Literatura
Nagano, A., Koga, R., Ogawa, M., Kurano, Y., Kawada, J., Okada, R., Hayashi, Y. K.,. Tsukahara T. i Arahata K. 1996. Emerin deficiency at the nuclear membrane in patients with Emery-Dreifuss muscular distrophy. Nat.Genet. 12:254-259. Worman, H.J. i J.C. Courvalin 2002. The nuclear lamina and inherited disease. Trends Cell Biol. 12:591-598
ribosomi
jezgrina pora vanjska jezgrina membrana unutarnja jezgrina membrana
LBR
emerin
lamina Jezgrina ovojnica sisavaca i jezgrina lamina. Unutarnja jezgrina membrana sadràva nekoliko integralnih proteina koji su u interakciji s jezgrinim laminima. Najzna~ajniji predstavnici su transmembranski protein emerin i receptor B lamina (LBR). Lamina je tako|er u interakciji s kromatinom.
kromatin
u podru~jima uzastopnih ponavljanja na pet razli~itih ljudskih kromosoma (kromosomi 13, 14, 15, 21 i 22); geni za 5S ribosomnu RNA prisutni su u jednom podru~ju uzastopnog ponavljanja na kromosomu broj 1. Va`nost proizvodnje ribosoma osobito je uo~ljiva u oocitama, u kojima su rRNA geni amplificirani da bi omogu}ili sintezu velikog broja ribosoma potrebnih za rani embrionalni razvitak. U oocitama àbe Xenopus geni za ribosomnu RNA amplificirani su otprilike 2.000 puta, {to daje oko milijun kopija po stanici. Ti su amplificirani geni raspore|eni u tisu}ama jezgrica (slika 8-23), {to rezultira brojem od oko 1012 ribosoma po oociti.
Slika 8-23. Jezgrice u oocitama vodozemca.

Amplificirani geni za rRNA u oocitama àbe Xenopus nakupljeni su u brojnim jezgricama (tamno obojene to~ke). (Iz: D. D. Brown i I. B. Dawid, 1968. Science 160:272.)
342
Poglavlje 8
Slika 8-24. Struktura jezgrice.

Elektronskomikroskopska slika pokazuje fibrilarni centar (FC), gustu fibrilarnu komponentu (DFC dense fibrilar component) i granular nu komponentu (G) jezgrice. (Posredstvom Davida L. Spectora, Cold Spring Harbor Laboratory.)
3 mm
Slika 8-25. Transkripcija gena za rRNA.

Elektronskomikroskopska slika kromatina jezgrice koja prikazuje tri gena za rRNA odvojena DNA razmaknicom koja se ne prepisuje. Svaki gen za rRNA okruèn je podru~jem rastu}eg lanca molekule RNA, {to rezultira pojavom oblika boì}nog drvca. (Posredstvom O. L. Millera, Jr.)
Morfolo{ki, jezgrice se sastoje od triju razli~itih regija: fibrilarnog centra, guste fibrilarne komponente i granularne komponente (slika 8-24). Misli se da ove razli~ite regije predstavljaju mjesta napredovanja procesa transkripcije rRNA, njezine dorade i sastavljanja ribosoma. Modifikacija ostalih malih RNA molekula kao {to je, recimo, ~estica za prepoznavanje signala (engl. signal recognition particle) (vidi 9. poglavlje), doga|a se negdje drugdje u jezgrici. Nakon svake diobe stanice, jezgrice nastaju na dijelovima kromosoma koji sadràvaju gene za 5,8S, 18S i 28S rRNA, pa se te regije nazivaju nukleolarnim organizacijskim regijama. Formiranje jezgrica zahtijeva transkripciju 45S pre-rRNA, a to, izgleda, dovodi do fuzije malih prenukleolarnih tjele{aca koja sadràvaju faktore potrebne za doradu i ostale komponente jezgrice. Veli~ina jezgrice ovisi o metaboli~koj aktivnosti stanice, pa velike jezgrice nalazimo u stanicama aktivno uklju~enim u sintezu proteina. Ova je razlika u veli~ini poglavito posljedica razlike u veli~ini granularne komponente {to odraàva razinu formiranja ribosoma.
Transkripcija i dorada ribosomne RNA

Svaka nukleolarna organizacijska regija sadràva skupinu uzastopno ponovljenih gena za ribosomnu RNA odvojenih jedan od drugog DNA--razmaknicom koja se ne prepisuje. Ove gene vrlo aktivno prepisuje RNA--poli-
Jezgra
343
meraza I, a sama je transkripcija vrlo lijepo vidljiva pod elektronskim mikroskopom (slika 8-25). Na takvim elektronskomikroskopskim slikama svaka skupina uzastopno ponovljenih gena okruèna je gusto pakiranim rastu}im lancima RNA koji formiraju strukture poput boì~nog drvca. Visoka gusto}a rastu}ih lanaca RNA odraàva zapravo molekule RNA-polimeraze koje se pojavljuju maksimalnom gusto}om od otprilike jedne polimeraze na stotinu parova baza kalupa DNA. U vi{ih eukariota primarni prijepis gena za ribosomnu RNA je velika 45S pre-rRNA, koja sadràva 18S, 5.8S i 28S ribosomne RNA, kao i podru~je razmaknice koje se prepisuje (slika 8-26). Vanjske prepisane razmaknice prisutne su i na 5' i na 3' kraju pre-rRNA, a dvije unutarnje prepisane razmaknice nalaze se izme|u 18S, 5,8S i 28S sljedova rRNA. Prvi korak dorade je kidanje molekule unutar vanjske prepisane razmaknice u blizini 5' kraja pre-rRNA, a doga|a se rano, na samom po~etku transkripcije. Za ovo kidanje potreban je U3, mali jezgrin RNP (vidi dalje) koji ostaje vezan za 5' kraj pre-rRNA formiraju}i na taj na~in karakteristi~an ~vori} vidljiv na slici 8-25. Kad je jedanput transkripcija zavr{ena, vanjska prepisana razmaknica na 3' kraju molekule se uklanja. U ljudskim stanicama odmah poslije ovog koraka slijedi kidanje na 5' kraju regije 5,8S, {to dovodi do stvaranja odvojenih prekursora 18S i 5.8S + 28S ribosomnih RNA. Dodatnim kidanjima dobijamo zrele ribosomne RNA. Dorada je vrlo sli~na i u ostalih vrsta, iako postoje razlike u redu odvijanja pojedinih kidanja. Uz kidanje, dorada pre-rRNA uklju~uje odre|enu koli~inu baza koje bivaju modificirane dodatkom metilnih skupina na specifi~ne baze i ostatke riboze, kao i konverziju uridina u pseudouridin (vidi sliku 6-40). U stanicama ìvotinja dorada pre-rRNA uklju~uje metilaciju otprilike stotine ostataka riboze i desetine baza, kao i formiranje oko stotinu pseudouridina. Ve}ina se ovih modifikacija doga|a brzo nakon sinteze pre-rRNA, premda se neke doga|aju i kasnije. Dorada pre-rRNA zahtijeva aktivnost i proteina i molekula RNA prisutnih u jezgri. Uklju~enost malih jezgrinih RNA (snRNA small nuclear
ETS pre-rRNA
18S
5,8S
28S
ETS
ITS
Slika 8-26. Dorada pre-rRNA.

Pre-rRNA transkript 45S sadràva vanjske prepisane razmaknice (ETS external transcribed spacers) na oba kraja molekule i unutarnje prepisane razmaknice (ITS internal transcribed spacers) izme|u sljedova 18S, 5.8S i 28S rRNA. Pre-rRNA obra|uje se nizom kidanja molekule (pokazano za ljudsku pre-rRNA) {to dovodi do zrele rRNA.
zrele molekule rRNA
18S
5,8S
28S
344
Poglavlje 8
pre-rRNA
RNA) u doradu pre-rRNA obra|ena je u 6. poglavlju. Jezgrice sadrè vi{e od 300 proteina i veliki broj (oko 200) malih jezgricinih RNA (snoRNA small nucleolar RNA) koje sudjeluju u doradi pre-rRNA. Isto kao i male jezgrine RNA koje su sklopu tjele{aca za prekrajanje, tako su i snoRNA udruène s proteinima te formiraju snoRNP Pojedini snoRNP izgra|en je od . jedne jedine snoRNA udruène s osam do deset proteina. snoRNP se tada slaù na pre-rRNA da bi formirali komplekse za doradu na na~in analogan onome kod formiranja tjele{aca za prekrajanje na pre-mRNA molekuli. Neke od snoRNA molekula odgovorne su za kidanje pre-rRNA u 18S, 5,8S i 28S molekule. Na primjer, naj~e{}e snoRNA jezgrice je U3, prisutna u otprilike 200.000 kopija po stanici. Kao {to smo ve} napomenuli, U3 je nu`no potrebna za po~etno kidanje pre-rRNA unutar razmaknica koje se prepisuju na 5' kraju. Sli~no tome, U8 snoRNA je odgovorna za kidanje prerRNA na 5,8S i 28S, a U22 snoRNA za kidanje pre-rRNA na 18S rRNA. Ve}ina snoRNA, ipak, u sintezi rRNA djeluje kao vodi~ RNA molekula da bi se usmjerile na specifi~nu modifikaciju pre-rRNA, kao {to je metilacija specifi~nih riboznih ostataka i formiranje pseudouridina (slika 8-27). Ve}ina molekula snoRNA sadràva kratke sljedove od otprilike 15 nukleotida koji su komplementarni s 18S i 28S rRNA. Ono {to je zna~ajno jest da te komplementarne regije uklju~uju mjesta modifikacije baza u rRNA. Komplementarnim sparivanjem sa specifi~nim podru~jem pre-rRNA, snoRNA navode enzime odgovorne za metilaciju riboze i pseudouridilaciju prema ispravnom mjestu na molekulama pre-rRNA. Uz rRNA, ostale molekule RNA tako|er zahtijevaju modificirane baze, pa se smatra da je lokalizacija snoRNA u jezgrici osnova za njezinu op}enitiju ulogu u modifikaciji molekula RNA. Jedan od primjera su RNA ~estice za prepoznavanje signala (vidi 9. poglavlje).
snoRNP
Sastavljanje ribosoma
Formiranje ribosoma uklju~uje spajanje prete~a ribosomne RNA s ribosomnim proteinima i 5S rRNA (slika 8-28). Geni koji kodiraju ribosomne proteine prepisuju se izvan jezgrice uz pomo} RNA-polimeraze II, a prepisane mRNA prevode se do proteina na ribosomima u citoplazmi. Ribosomni proteini tada se prenose iz citoplazme u jezgricu, gdje se udruùju s ribosomnim molekulama RNA da bi formirale preribosomne ~estice. Premda se geni za 5S rRNA tako|er prepisuju izvan jezgrice, u ovom slu~aju, uz pomo} RNA polimeraze III, 5S ribosomne RNA se tako|er spajaju s preribosomnim ~esticama unutar jezgrice. Udruìvanje ribosomnih proteina s rRNA zapo~inje dok se pre-rRNA jo{ sintetizira, te se vi{e od polovine ribosomnih proteina veè na prerRNA prije njezina kidanja. Ostatak ribosomnih proteina i 5S rRNA ugra|uju se u preribosomne ~estice dok je kidanje pre-rRNA u tijeku. Na po~etku sastavljanja ribosoma, dorada male i velike ribosomne podjedinice koje nastaju razlikuje se. Dorada male podjedinice, koja sadrì samo 18S rRNA jednostavnija je i uklju~uje samo ~etiri kidanja uz pomo} endonukleaza. Zavr{no kidanje, da bi se dobila zrela 18S rRNA, zapravo se doga|a nakon izlaska 40S podjedinice u citosol. Dorada velike podjedinice koja sadràva 28S, 5,8S i 5S ribosomne RNA uklju~uje opse`na kidanja nukleazama i potpuno se zavr{ava u jezgrici. Kao posljedica toga, ve}ina preribosomnih ~estica unutar jezgrice predstavlja prete~e velike (60S) podjedinice. Zadnji koraci sazrijevanja ribosoma doga|aju se nakon izlaska preribosomnih ~estica u citoplazmu, formiraju}i aktivne 40S i 60S podjedinice eukariotskih ribosoma.
3' pre-rRNA 5' CH3 snoRNA 5'
3'
Slika 8-27. Uloga snoRNA u modifikaciji baza pre-rRNA.

snoRNA sadràvaju kratke sljedove komplementarne s rRNA. Komplementarnim sparivanjem baza izme|u snoRNA i pre-rRNA usmjeruju se enzimi koji kataliziraju modifikaciju baza (primjerice, metilacija) na to~no odre|ena mjesta u pre-rRNA.
Jezgra
345
jezgra
rDNA
jezgrica
5S rRNA pre-rRNA
ribosomski proteini pre-18S preribosomske ~estice
28S 5,8S 5S
18S citoplazma 40S podjedinica 60S podjedinica
28S 5,8S 5S
Slika 8-28. Slaganje ribosoma.

Ribosomni proteini ulaze iz citoplazme u jezgricu i veù se na pre-rRNA prije njezina kidanja. Kako se pre-rRNA dora|uje, ostali ribosomni proteini i 5S rRNA (koja se sintetizira na drugom mjestu u jezgri) veù se na nju i formiraju se preribosomne ~estice. Zadnji korak sazrijevanja doga|a se nakon izlaska preribosomnih ~estica u citoplazmu, a to dovodi do formiranja 40S i 60S ribosomnih podjedinica.
Jezgra za vrijeme mitoze

Jedinstvena je zna~ajka jezgre da se razgra|uje i ponovno uspostavlja tijekom diobe ve}ine stanica. Na po~etku mitoze kromosomi se kondenziraju, jezgrica nestaje i jezgrina se ovojnica raspada, a sve to dovodi do otpu{tanja ve}ine sadràja jezgre u citoplazmu. Na kraju mitoze proces je obrnut: kromosomi se dekondenziraju, jezgrina se ovojnica ponovno formira oko odvojenih setova kromosoma-k}eri. U ~etvrtom je poglavlju detaljno prikazana mitoza, a u ovom }emo poglavlju razmotriti mehanizme uklju~ene u razgradnju i ponovno formiranje jezgre. Proces je glavninom kontroliran reverzibilnom fosforilacijom i defosforilacijom jezgrinih proteina, djelomi~no zbog aktivnosti Cdc2 protein-kinaze, koja je klju~ni regulator mitoze u svim eukariotskim stanicama.
Raspadanje jezgrine ovojnice

U ve}ine stanica razgradnja jezgrine ovojnice ozna~uje zavr{etak profaze mitoze (slika 8-29). Unato~ tomu, razgradnja jezgre nije univerzalna zna~ajka mitoze i ne doga|a se u svim stanicama. Neki jednostani~ni eukarioti (primjerice kvasci) prolaze tzv. zatvorenu mitozu u kojoj jezgrina ovojnica ostaje netaknuta (slika 8-30). U zatvorenoj mitozi kromosomi-k}eri putuju na suprotne polove jezgre, koja se tada podijeli na dvije. Stanice vi{ih eukariota naj~e{}e prolaze otvorenu mitozu koja je obiljeèna razgradnjom jezgrine ovojnice. Kromosomi-k}eri tada putuju na suprotne polove diobenoga vretena, a nove se jezgre formiraju oko njih.
346
profaza
Poglavlje 8
prometafaza
Slika 8-29. Jezgra za vrijeme mitoze.

Mikroskopske slike prikazuju progresivne stadije mitoze u biljnoj stanici. Za vrijeme profaze kromosomi se kondenziraju, jezgrica nestaje, a jezgrina ovojnica se raspada. U metafazi se kondenzirani kromosomi smje{taju u centar diobenoga vretena. Kromosomi-k}eri tada putuju prema suprotnim polovima diobenoga vretena (anafaza), a za vrijeme telofaze kromosomi se dekondenziraju, a jezgre se ponovo oblikuju. Kromosomi su obojeni plavo, a mikrotubuli diobenoga vretena crveno. (Posredstvom Andrewa S. Bajera, University of Oregon.)
metafaza
anafaza
telofaza
zatvorena mitoza diobeno vreteno
otvorena mitoza
Slika 8-30. Zatvorena i otvorena mitoza.

U zatvorenoj mitozi jezgrina ovojnica ostaje intaktna, a kromosomi putuju prema suprotnim polovima diobenoga vretena unutar jezgre. U otvorenoj mitozi jezgrina se ovojnica raspada i ponovno oblikuje oko dva seta odvojenih kromosoma.
diobeno vreteno
Jezgra
347
Razgradnja jezgrine ovojnice, s kojom se istovremeno doga|a i razgradnja endoplazmatskog retikula, uklju~uje promjene svih svojih triju komponenata: jezgrine membrane se fragmentiraju u vezikule, kompleksi jezgrinih pora disociraju, a jezgrina lamina se depolimerizira. Najbolje shva}en od svih ovih doga|aja jest depolimerizacija jezgrine lamine mreè filamenata koja prilijeè uz unutarnju jezgrinu membranu. Jezgrina lamina izgra|ena je od vlaknatih proteina, lamina, koji se udruùju jedan s drugim da bi formirali filamente. Razgradnja jezgrine lamine je rezultat fosforilacije lamina, a ima za posljedicu razgradnju filamenata do pojedina~nih dimera lamina (slika 8-31). Fosforilaciju lamina katalizira protein-kinaza Cdc2, koju smo upoznali u 7. poglavlju (vidi sliku 7-41), a bit }e detaljno obra|ena u 14. poglavlju kao sredi{nji regulator mitoze. Cdc2 (i ostale protein-kinaze aktivirane u mitoti~kim stanicama) fosforilira sve razli~ite oblike lamina, a tretiranje izoliranih jezgara s Cdc2 dovoljno je da se inducira depolimerizacija jezgrine lamine. Nadalje, nu`nost fosforilacije lamina za razgradnju jezgrine lamine pokazana je izravno konstruiranjem mutiranih lamina koji ne mogu biti fosforilirani. Kad su se geni koji kodiraju takve mutirane lamine ubacili u stanice, njihova je ekspresija blokirala normalnu razgradnju jezgrine lamine pri ulasku stanice u mitozu. Zajedno s razgradnjom jezgrine lamine, jezgrina se ovojnica fragmentira u brojne vezikule (slika 8-32). Uz te vezikule ostaju vezani lamini tipa B, ali lamini tipa A i C se odvajaju od jezgrine membrane i otpu{taju kao slobodni dimeri u citosol. Ova se razlika pojavljuje jer su lamini tipa B trajno modificirani dodatkom lipida (prenilne skupine), dok se C terminalne prenilne skupine s lamina A i C uklanjaju proteolizom onog trenutka kad se ugrade u laminu. Kompleksi jezgrinih pora tako|er disociraju u podjedinice kao rezultat fosforilacije nekoliko proteina jezgrinih pora. Integralni proteini jezgrine membrane isto tako bivaju fosforilirani za vrijeme mitoze, a fosforilacija tih proteina vrlo je vjerojatno va`na u formiranju vezikula i odvajanju jezgrine membrane, kako od kromosoma, tako i od jezgrine lamine.
Slika 8-31. Raspadanje jezgrine lamine.

Jezgrina lamina sastoji se od mreè filamenata lamina. Za vrijeme mitoze Cdc2 i ostale protein-kinaze fosforiliraju lamine {to uzrokuje disocijaciju vlakana u slobodne dimere lamina.
vlakna lamina
fosforilacija
P dimeri lamina P P
P P P
P P
348
Poglavlje 8
Slika 8-32. Razgradnja jezgrine membrane.

Kako jezgrina lamina disocira, tako se jezgrina membrana fragmentira u vezikule. Lamini tipa B ostaju vezani na vezikule, dok se lamini tipa A i C otpu{taju kao slobodni dimeri.
jezgrine membrane
jezgrina lamina
mitoza
slobodni dimeri lamina tipa A i C
vezikule jezgrine membrane lamin tipa B vezan na vezikule
Slika 8-33. Kondenzacija kromosoma.

Elektronskomikroskopska slika kondenzacije pojedina~nih kromosoma za vrijeme profaze mitoze. (K. G. Murti/Visuals Unlimited.)
Kondenzacija kromosoma
Jo{ jedna velika promjena u strukturi jezgre za vrijeme mitoze jest kondenzacija kromosoma. Interfazni kromatin koji je ve} upakiran u nukleosome, kondenzira se jo{ oko tisu}u puta da bi formirao kompaktne kromosome vidljive u mitoti~koj stanici (slika 8-33). Ova je kondenzacija potrebna da bi se kromosomima omogu}ilo pomicanje po diobenom vretenu bez da se zapetljaju ili puknu za vrijeme raspore|ivanja u stanice-k}eri. DNA u tako jako kondenziranom obliku ne moè se vi{e prepisivati, tako da za vrijeme mitoze bilo kakva sinteza RNA prestaje. Kako se kromosomi kondenziraju, a transkripcija prestaje, jezgrica tako|er nestaje. Kondenzirana DNA metafaznih kromosoma organizirana je u velike petlje. Svaka je petlja duljine otprilike stotinu kilobaza DNA pri~vr{}enih za proteinski kostur (vidi sliku 4-16). Osim njegove temeljne va`nosti, sam mehanizam kondenzacije kromosoma za vrijeme mitoze nije shva}en. Osnovna jedinica strukture kromatina je nukleosom koji se sastoji od 146 parova baza DNA namotanih oko srì histona koju ~ine po dvije molekule histona H2A, H2B, H3 i H4 (vidi sliku 4-12). Jedna molekula histona H1 vezana je na DNA na mjestu gdje ova ulazi u sr` nukleosoma, a interakcije me|u tim H1 histonima uklju~ene su u smatanje kromatina na vi{u razinu, kompaktniju strukturu. Histon H1 je supstrat za Cdc2 protein-kinazu i fosforiliran je u ve}ini sta2 mm
Jezgra
349
nica za vrijeme mitoze, {to je u skladu s njegovom ulogom u fosforiliranom obliku u kondenzaciji mitoti~kih kromosoma. Noviji eksperimenti pak pokazuju da fosforilacija histona H1 nije nu`na za kondenzaciju kromosoma, pa je fosforilacija H1 dosta nejasna. Nasuprot tomu, fosforilacija H3 histona potrebna je za kondenzaciju mitoti~kih kromosoma, premda mehanizam kojim fosforilacija H3 djeluje na kondenzaciju kromosoma jo{ uvijek nije jasan. Novijim istraìvanjima identificiran je kompleks od pet proteina nazvan kondenzin koji je evolucijski sa~uvan u eukariota. Kompleks sadràva dvije strukturne podjedinice koje su dio vi{e klase proteina strukturnog odràvanja kromosoma (SMC structural maintenance of chromosome), i tri regulatorne podjedinice. Kompleks ima va`nu ulogu u organizaciji normalnih interfaznih kromosoma, kao i u daljnjoj kondenzaciji koja se doga|a za vrijeme mitoze. Neke od regulatornih podjedinica fosforiliraju se uz pomo} kinaza, me|u njima je Cdc2-kinaza, {to moè posluìti kao veza za promjenu kondenzacije kromosoma u mitozi. Zanimljivo je da sli~an kompleks, nazvan kohezin, igra ulogu u sparivanju sestrinskih kromatida u metafazi.
Ponovno formiranje interfazne jezgre

Za vrijeme zavr{avanja mitoze (telofaza) formiraju se dvije jezgre oko odvojenih setova kromosoma-k}eri (vidi sliku 8-29). Dekondenzacija kromosoma i ponovno uspostavljanje jezgrine ovojnice je, izgleda, signalizirano inaktivacijom Cdc2, odgovornog za odvijanje po~etka mitoze fosforilacijom ciljnih proteina u koje su uklju~eni lamini. Napredovanje iz metafaze u anafazu uklju~uje aktivaciju ubikvitinom-posredovanog proteoliti~kog sustava koji inaktivira Cdc2 tako da razgra|uje njegovu regulatornu podjedinicu, ciklin B (vidi sliku 7-40). Inaktivacija Cdc2 dovodi do defosforilacije proteina koji su bili fosforilirani na po~etku mitoze, {to rezultira izlaskom iz mitoze i ponovnim formiranjem interfazne jezgre. Prvi korak u ponovnom formiranju jezgrine ovojnice jest vezanje vezikula, koje su nastale za vrijeme razgradnje jezgrine membrane, na povr{inu kromosoma (slika 8-34). Ova interakcija membrana vezikula s kromosomima vjerojatno je potpomognuta i laminima i integralnim membranskim proteinima unutarnje jezgrine membrane. Vezikule se tada stapaju da bi formirale dvostruku membranu koja okruùje kromosome. Nakon toga slijedi ponovno formiranje kompleksa jezgrinih pora, jezgrine lamine, kao i dekondenzacija kromosoma. Vezikule se prvo stapaju tako da formiraju membrane oko svakog pojedinog kromosoma, a tada se sve zajedno stapaju i tvore jednu kompletnu jezgru. Po~etak ponovnoga formiranja jezgrine ovojnice oko kondenziranih kromosoma isklju~uje citoplazmatske molekule iz novoformirane jezgre. Nova se jezgra tada pove}ava uz pomo} selektivnog transporta jezgrinih proteina iz citoplazme. Kako se jezgrini lokalizacijski signali ne odvajaju od proteina koji se transportiraju u jezgru, isti jezgrini proteini koji su se otpustili u citoplazmu prilikom razgradnje jezgrine ovojnice na po~etku mitoze, mogu sada biti vra}eni natrag u jezgru, formiranu nakon zavr{etka mitoze. Protein Ran uklju~en je u mnoge korake ranoga ponovnog formiranja jezgre. Kako se kromosomi dekondenziraju i zapo~inje transkripcija gena za ribosomne RNA, tako se ponovno formira i jezgrica zavr{avaju}i povratak iz mitoze u interfaznu jezgru.
350
Poglavlje 8
vezikule jezgrine membrane lamini
kromosomi
integralni membranski proteini
vezikule vezane na kromosome
stapanje vezikula
kondenzacija kromosoma
stapanje vezikula koje okruùju pojedine kromosome ponovno sastavljanje jezgrine lamine i kompleksa jezgrinih pora
dekondenzirani kromatin jezgrina lamina jezgrine membrane
Slika 8-34. Ponovno formiranje jezgrine ovojnice.

Prvi korak ponovnoga formiranja jezgrine ovojnice jest vezanje membranskih vezikula na kromosome, {to je vjerojatno potpomognuto integralnim membranskim proteinima i laminima tipa B. Tada se vezikule stapaju, ponovno se uspostavlja jezgrina lamina, a kromosomi se dekondenziraju.
Jezgra
351
S A @ E TA K JEZGRINA OVOJNICA I PROMET IZME\U JEZGRE I CITOPLAZME

Struktura jezgrine ovojnice: Jezgrina ovojnica odvaja sadràj jezgre od citoplazme, odràvaju}i jezgru kao zaseban biokemijski odjeljak koji udomljuje geneti~ki materijal i sluì kao mjesto transkripcije i dorade molekula RNA u eukariotskim stanicama. Jezgrina ovojnica sastoji se od vanjske i unutarnje jezgrine membrane koje su me|usobno spojene na mjestima kompleksa jezgrinih pora, a ispod membrane prilijeè jezgrina lamina. Kompleks jezgrine pore: Kompleksi jezgrinih pora su velike strukture koje ostvaruju jedini put kojim velike molekule mogu putovati izme|u jezgre i citoplazme. Male molekule mogu slobodno difundirati kroz otvorene kanale unutar kompleksa jezgrinih pora. Makromolekule se selektivno transportiraju uz utro{ak energije. Selektivni transport proteina u jezgru i iz jezgre: Proteini odre|eni za ulazak u jezgru nose jezgrin lokalizacijski signal koji prepoznaju receptori i usmjeruju transport kroz kompleks jezgrine pore. Proteini koji putuju iz jezgre u citoplazmu i natrag, nose jezgrin izlazni signal koji ih usmjeruje na transport iz jezgre u citoplazmu. U ve}ini je slu~ajeva za translokaciju kroz kompleks jezgrine pore potreban mali protein koji veè GTP , Ran. On upravlja smjerom transporta. Regulacija ulaska i izlaska proteina iz jezgre: Aktivnost nekih proteina, kao {to su transkripcijski faktori, kontrolirana je regulacijom njihovog ulaska i izlaska iz jezgre. Transport RNA molekula: RNA molekule prenose se kroz komplekse jezgrinih pora u obliku ribonukleoproteinskih kompleksa. mRNA, rRNA i tRNA prenose se iz jezgre kako bi sudjelovale u sintezi proteina. Nekoliko vrsta male jezgrine RNA prvo se prenosi iz jezgre u citoplazmu, gdje se spajaju sa proteinima i formiraju RNP a zatim se vra}aju u jezgru. ,
KLJU^NI POJMOVI
jezgrina ovojnica, jezgrina membrana, jezgrina lamina, lamin
jezgrin lokalizacijski signal, Ran, karioferin, importin, eksportin, jezgrin izlazni signal
UNUTARNJA ORGANIZACIJA JEZGRE

Kromosomi i struktura kromosoma na vi{oj razini: Interfazna jezgra sadràva transkripcijski inaktivan, visoko kondenziran heterokromatin i dekondenziran eukromatin. Interfazni kromosomi organizirani su unutar jezgre i podijeljeni na velike domene u obliku petlje koje funkcioniraju kao odvojene jedinice. Funkcionalne domene unutar jezgre: Neke jezgrine komponente lokalizirane su u odvojenim subnuklearnim strukturama i domenama.
heterokromatin, eukromatin
JEZGRICA
Geni za ribosomnu RNA i organizacija jezgrice: Jezgrica je povezana s genima za ribosomne RNA. To je mjesto transkripcije i dorade rRNA, mjesto sastavljanja ribosoma, kao i modifikacije nekolicine malih RNA molekula.
jezgrica, nuklearna organizacijska regija
352
Poglavlje 8
male jezgricine RNA (snoRNA)
Transkripcija i dorada ribosomne RNA: Primarni transkript gena za ribosomnu RNA je 45S pre-rRNA koja doradom daje 18S, 5,8S i 28S ribosomne RNA. Dorada pre-rRNA i ostalih malih molekula RNA doga|a se uz pomo} malih jezgricinih RNA (snoRNA). Sastavljanje ribosoma: Ribosomne podjedinice uspostavljaju se unutar jezgrice iz ribosomnih RNA i ribosomnih proteina.
JEZGRA ZA VRIJEME MITOZE

Cdc2
Razgradnja jezgrine ovojnice: Ulazak u mitozu signaliziran je aktivacijom Cdc2 protein-kinaze. U ve}ini stanica jezgrina se ovojnica raspada na po~etku profaze. Depolimerizacija jezgrinih lamina posljedica je fosforilacije lamina uz pomo} Cdc2 i ostalih protein-kinaza. Kondenzacija kromosoma: Fosforilacija histona H1 i H3 povezana je s kondenzacijom mitoti~kih kromosoma, a fosforilacija H3 histona potrebna je za pravilnu kondenzaciju kromosoma. Kompleks proteina, nazvan kondenzin, aktivira se uz pomo} fosforilacije Cdc2 i uklju~en je u kondenzaciju kromosoma. Ponovno for miranje inter fazne jezgre: Inaktivacija Cdc2 na kraju mitoze dovodi do ponovnog formiranja jezgrine ovojnice i dekondenzacije kromosoma. Jezgrini se proteini tada selektivno transportiraju u jezgru kroz komplekse jezgrinih pora.
Pitanja
1. Odvajaju}i transkripciju od translacije, jezgrina ovojnica omogu}uje eukariotima da reguliraju ekspresiju gena procesima koji nisu prona|eni u prokariota. Koji su to procesi karakteristi~ni samo za eukariote? 2. Koje su dvije uloge lamina u strukturi i funkciji jezgre? 3. Ako u jaje àbe injicirate dva proteina, jedan veli~ine 15 kDa, a drugi od 100 kDa, obama nedostaju jezgrini lokalizacijski signali, ho}e li ijedan u}i u jezgru? 4. [to odre|uje smjer ulaska u jezgru? 5. Opi{ite kako aktivnost transkripcijskoga faktora regulatora gena moè biti regulirana ulaskom u jezgru? 6. Prou~avate transkripcijski faktor koji je reguliran fosforilacijom serinskih ostataka {to inaktivira njegov jezgrin lokalizacijski signal. Kako }e mutacija tih serina u alanine djelovati na unutarstani~nu lokalizaciju transkripcijskog faktora s obzirom na njegove ciljne gene? 7. Kako }e inaktivacija mutacijom jezgrinog izlaznog signala na proteinu koji normalno putuje u jezgru i iz jezgre utjecati na njegovu unutarstani~nu raspodjelu? 8. Replikacija DNA doga|a se na oko 200 specifi~nih mjesta ili replikacijskih tvornica. Kako }ete locirati ta mjesta u stanici sisavaca u kulturi? 9. Jezgrini se lokalizacijski signali ne odvajaju uz pomo} signalne peptidaze kao signalni peptidi ER. Predo~uju}i promjene kroz koje prolaze jezgre za vrijeme stani~noga ciklusa, predloìte razlog za{to se jezgrini lokalizacijski signali ne odvajaju. 10. Koja je uloga protein-kinaze ovisne o ciklinima Cdc2 u pokretanju mitoze?
Jezgra
353
Literatura
Jezgrina ovojnica i promet izme|u jezgre i citoplazme
Akey, C. W. and M. Radermacher. 1993. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J. Cell Biol. 122: 119. I Ben-Efraim, I. and L. Gerace. 2001. Gradient of increasing affinity of importin beta for nucleoporins along the pathway of nuclear import. J. Cell Biol. 152: 411417. I Chook, Y. M. and G. Blobel. 1999. Structure of the nuclear transport complex karyopherin2-Ran.GppNHp. Nature 399: 230237. I Chook, Y. M. and G. Blobel. 2001. Karyopherins and nuclear import. Curr. Opin. Struct. Biol. 11: 703715. P Cingolani, G. C. Petosa, K. Weis and C. W. Muller. 1999. Structure of importin-b bound to the IBB domain of importin-a. Nature 399: 221229. I Daneholt, B. 1997. A look at messenger RNP moving through the nuclear pore. Cell 88: 585588. P Gant, T. M. and K. L. Wilson. 1997. Nuclear assembly. Ann. Rev. Cell Biol. 13: 669695. P Gerace, L. and B. Burke. 1988. Functional organization of the nuclear envelope. Ann. Rev. Cell Biol. 4: 353374. P Gerace, L. and R. Foisner. 1994. Integral membrane proteins and dynamic organization of the nuclear envelope. Trends Cell Biol. 4: 127131. P Goldman, R. D., Y. Gruenbaum, R. D. Moir, D. K. Shumaker and T. P Spann. 2002. Nuclear . lamins: building blocks of nuclear architecture. Genes Dev. 16: 533547. P Ohno, M., M. Fornerod and I. W. Mattaj. 1998. Nucleocytoplasmic transport: The last 200 nanometers. Cell 92: 327336. P Ryan, K. J. and S. R. Wente 2000. The nuclear pore complex: a protein machine bridging the nucleus and cytoplasm. Curr. Opin. Cell Biol. 2: 361371. P Ullman, K. S., M. A. Powers and D. J. Forbes. 1997. Nuclear export receptors: From importin to exportin. Cell 90: 967970. P Vandromme, M., C. Gauthier-Rouviere, N. Lamb and A. Fernandez. 1996. Regulation of transcription factor localization: Finetuning of gene expression. Trends Biochem. Sci. 21: 5964. P Vetter, I. R., A. Arndt, U. Kutay, D. Gorlich and A. Wittinghofer. 1999. Structural view of the Ran-importin b interaction at 2,3 resolution. Cell 67: 635646. I Weis, K. 2002. Nucleocytoplasmic transport: cargo trafficking across the border. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 328335. P Miller, O. L., Jr. and B. Beatty. 1969. Visualization of nucleolar genes. Science 164: 955957. I Olson, M. O., K. Hingorani and A. Szebeni. 2002. Conventional and nonconventional roles of the nucleolus. Int. Rev. Cytol. 219: 199266. P
Unutarnja organizacija jezgre

Gall, J. G. 2000. Cajal bodies: the first 100 years. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 273300. P Gilson, E., T. Laroche and S. M. Gasser. 1993. Telomeres and the functional architecture of the nucleus. Trends Cell Biol. 3: 128134. P Hozak, P and P R. Cook. 1994. Replication . . factories. Trends Cell Biol. 4: 4849. P Lamond, A. I. and W. C. Earnshaw. 1998. Structure and function in the nucleus. Science 280: 547553. P Manuelidis, L. 1990. A view of interphase chromosomes. Science 250: 15331540. P Matera, A. G. 1999. Nuclear bodies: Multifaceted subdomains of the interchromatin space. Trends Cell Biol. 9: 302309. P Mathog, D., M. Hochstrasser, Y. Gruenbaum, H. Saumweber and J. Sedat. 1984. Characteristic folding pattern of polytene chromosomes in Drosophila salivary gland nuclei. Nature 308: 414421. I Misteli, T., J. F. Caceres and D. L. Spector. 1997. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature 387: 523527. I Misteli, T. and D. L. Spector. 1997. Protein phosphorylation and the nuclear organization of pre-mRNA splicing. Trends Cell Biol. 7: 135138. P Worman, H. J. and J. C. Courvalin. 2002. The nuclear lamina and inherited disease. Trends Cell Biol. 12: 591598. P
Jezgra za vrijeme mitoze

Eide, T., C. Carlson, K. A. Tasken,T. Hirano, K. Tasken and P Collas. 2002. Distinct but over. lapping domains of AKAP95 are implicated in chromosome condensation and condensin targeting. EMBO Rep. 3: 426432. I Gant, T. M. and K. L. Wilson. 1997. Nuclear assembly. Ann. Rev. Cell Biol. 13: 669695. P Heald, R. and F. McKeon. 1990. Mutations of phosphorylation sites in lamin A that prevent nuclear lamina disassembly in mitosis. Cell 61: 579589. I Kimura, K., M. Hirano, R. Kobayashi and T. Hirano. 1998. Phosphorylation and activation of 13S condensin by Cdc2 in vitro. Science 282: 487490. I Koshland, D. and A. Strunnikov. 1996. Mitotic chromosome condensation. Ann. Rev. Cell Biol. 12: 305333. P Marshall, I. C. B. and K. L. Wilson. 1997. Nuclear envelope assembly after mitosis. Trends Cell Biol. 7: 6974. P Murray, A. and T. Hunt. 1993. The Cell Cycle: An Introduction. New York: W. H. Freeman. Murray, A. W. 1998. How to compact DNA. Science 282: 425427. P Peter, M., J. Nakagawa, M. Dore, J. C. Labb and E. A. Nigg. 1990. In vitro disassembly of the nuclear lamina and M phase-specific phosphorylation of lamins by cdc2 kinase. Cell 61: 591602. I Uhlmann, F. 2001. Chromosome condensation: packaging the genome. Curr. Biol. 11: R384R387. P Ward, G. E. and M. W. Kirschner. 1990. Identification of cell cycle-regulated phosphorylation sites on nuclear lamin C. Cell 61: 561577. I Wei, Y., L. Yu, J. Brown, M. A. Gorovsky and C. D. Allis. 1999. Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99109. I
Jezgrica (nucleolus)
Fatica, A. and D. Tollervey. 2002. Making ribosomes. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 313318. P Grosshans, H., K. Deinert, E. Hurt and G. Simos. 2001. Biogenesis of the signal recognition particle (SRP) involves import of SRP proteins into the nucleolus, assembly with the SRP-RNA, and Xpo1p-mediated export. J. Cell Biol. 153: 745762. I Johnson, A. W., E. Lund and J. Dahlberg. 2002. Nuclear export of ribosomal subunits. Trends Biochem. Sci. 27: 580585. P Kiss, T. 2002. Small nucleolar RNAs: an abundant group of noncoding RNAs with diverse cellular functions. Cell 109: 145148. P
Poglavlje
Razvrstavanje i prijenos proteina

Endoplazmatski retikul, Golgijev aparat i lizosomi
Endoplazmatski retikul 355 Golgijev aparat 374 Mehanizam vezikularnoga transporta 382 Lizosomi 389
KLJU^NI POKUS: Signalna
hipoteza 360
Gaucherova bolest 392
SIM [TO POSJEDUJE JEZGRU, eukariotska stanica razlikuje se od prokariotske po prisutnosti organela okruènih membranom unutar svoje citoplazme. Ove organele omogu}uju odvijanje odre|enih stani~nih aktivnosti u razli~itim odjeljcima koji razdjeljuju citoplazmu, pa je time eukariotska stanica u~inkovita unato~ svojoj veli~ini (oko tisu}u je puta ve}a od bakterijske). Zbog sloène unutra{nje organizacije eukariotske stanice, razvrstavanje i dostava proteina na odgovaraju}a odredi{ta predstavlja zahtjevan zadatak. Prvi korak u razvrstavanju proteina odvija se jo{ za vrijeme prevo|enja mRNA. Brojni proteini namijenjeni endoplazmatskom retikulu, Golgijevu aparatu, lizosomima ili izlu~ivanju, stvaraju se na ribosomima vezanim za membrane endoplazmatskog retikula. Tijekom prevo|enja polipeptidni se lanci unose u endoplazmatski retikul, gdje se odvija smatanje i dorada proteina. Iz endoplazmatskog retikula proteini se vezikulama prenose do Golgijeva aparata, gdje se nastavlja dorada i razvrstavanje za prijenos do lizosoma, stani~ne membrane ili za izlu~ivanje iz stanice. Neke od ovih organela sudjeluju zajedno s endosomima u razvrstavanju i prijenosu proteina unesenih u stanicu (vidi 12. poglavlje). Endoplazmatski retikul, Golgijev aparat, endosomi i lizosomi razlikuju se od ostalih citoplazmatskih organela po tome {to su svi uklju~eni u doradu proteina i prijenos vezikulama.
Endoplazmatski retikul
Endoplazmatski je retikul (ER) mreà cjev~ica i vre}ica (cisterni) okruènih membranom koja se proteè od jezgrine membrane kroz citoplazmu (slika 9-1). îtav je endoplazmatski retikul okruèn jednom neprekinutom membranom, pa je to najve}a organela ve}ine eukariotskih stanica. Udio membrane ER moè dose}i i do polovine ukupnih membrana stanice, a prostor unutar ER (lumen ili prostor cisterni) moè zauzimati i do 10% ukupnog stani~nog volumena. Kao
356
Poglavlje 9
(A) hrapavi endoplazmatski retikul
(B) glatki endoplazmatski retikul
Slika 9-1. Endoplazmatski retikul (ER).

(A) Elektronskomikroskopska snimka hrapavog ER u jetrenoj stanici {takora. Ribosomi su vezani na membrane ER na strani okrenutoj citosolu. (B) Elektronskomikroskopska snimka glatkog ER u Leydigovim stanicama testisa, koje proizvode steroidne hormone. (A, Richard Rodewald, University of Virginia/Biological Photo Service; Don Fawcett/Photo Researchers, Inc.)
{to }e biti opisano u nastavku teksta, postoje tri susjedna me|usobno povezana podru~ja membrana u sklopu ER, koja obavljaju razli~ite uloge u stanici. Hrapavi ER, koji je prekriven ribosomima na svojoj vanjskoj povr{ini i prijelazni ER, iz kojega vezikule odlaze prema Golgijevu aparatu, sudjeluju u doradi proteina. Glatki ER ne sadràva ribosome, pa nije uklju~en u metabolizam proteina, ve} u metabolizam lipida.
Endoplazmatski retikul i izlu~ivanje proteina

Ulogu endoplazmatskog retikula u doradi i razvrstavanju proteina otkrio je George Palade i njegovi suradnici 1960-ih (slika 9-2). Ovi su istraìva~i prou~avali sudbinu novostvorenih proteina u stanicama seroznih acinusa gu{tera~e, koje izlu~uju probavne enzime u tanko crijevo. S obzirom na to da ove stanice izlu~uju ve}inu proteina koje proizvode, Palade i suradnici mogli su jednostavno prou~avati put novosintetiziranih proteina ozna~iv{i ih radioaktivnim aminokiselinama. Poloàj radioaktivno obiljeènih proteina u stanici je potom odre|en autoradiografijom, otkrivaju}i mjesta u stanici uklju~ena u zbivanja koja dovode do izlu~ivanja proteina. Nakon kratkog izlaganja seroznih stanica gu{tera~e radioaktivnim aminokiselinama, novostvoreni proteini na|eni su u hrapavom endoplazmatskom retikulu, koji je tako bio prepoznan kao mjesto sinteze proteina namijenjenih izlu~ivanju. Ako su stanice potom bile kratko vrijeme inkubirane u mediju koji sadràva neradioaktivne aminokiseline (postupak poznat kao potjera, engl. chase), radioaktivno ozna~eni proteini bili su prona|eni u Golgijevu aparatu. Nakon dulje potjere, radioaktivno ozna~eni proteini bili su preneseni do stani~ne povr{ine u sekrecijskim vezikulama, koje su se potom stopile sa stani~nom membranom i otpustile svoj sadràj izvan stanice. Ovim je pokusima otkriven put koji koriste proteini koji se izlu~uju, tj. put izlu~ivanja ili sekrecijski put: hrapavi ER Golgijev aparat sekrecijske vezikule izlazak iz stanice. Daljnja su istraìvanja pro{irila ove rezultate i pokazala da ovaj put nije ograni~en samo na proteine namijenjene izlu~ivanju iz stanice. Dijelove toga puta koriste i proteini namijenjeni drugim odjeljcima. Proteini stani~ne membrane ili lizosoma tako|er putuju iz hrapavog endoplazmatskog retikula preko Golgijeva aparata do svojih kona~nih odredi{ta. I drugi proteini putuju kroz po~etne dijelove puta sekrecije, ali su tu zadràni i djeluju ili u ER ili u Golgijevu aparatu. Ulaz proteina u ER predstavlja glavno raskri`je u prometu proteina u eukariotskoj stanici. Proteini namijenjeni izlu~ivanju ili ugradnji u ER, Golgijev aparat, lizosome ili stani~nu membranu odmah su na po~etku usmjereni u ER. U stanicama sisavaca, ve}ina se proteina prenosi u ER jo{ dok se
357
radioaktivno obiljeèni proteini
sekrecijske vezikule
Golgijev aparat hrapavi endoplazmatski retikul
3 minute obiljeàvanje
7 minuta potjere
120 minuta potjere
Slika 9-2. Sekrecijski put.
odvija prevo|enje mRNA na ribosomima vezanim za membrane (slika 93). Nasuprot tomu, proteini predodre|eni za zadràvanje u citosolu ili za ugradnju u jezgru, mitohondrije, kloroplaste ili peroksisome, sintetiziraju se na slobodnim ribosomima, te se otpu{taju u citosol kad se prevo|enje mRNA zavr{i.
Usmjerivanje proteina u endoplazmatski retikul

Proteini mogu biti premje{teni u ER tijekom njihove sinteze na ribosomima vezanim za membrane (kotranslacijska translokacija) ili nakon zavr{enog prevo|enja na slobodnim ribosomima u citosolu (posttranslacijska translokacija). U stanicama sisavaca ve}ina proteina u ER ulazi kotranslacijski, dok oba puta, i kotranslacijski i posttranslacijski, koriste kvasci. Prvi korak u kotranslacijskom putu jest povezivanje ribosoma i ER. Ho}e li se ribosomi vezati za membranu ER ovisi o aminokiselinskom slijedu polipeptidnog lanca koji se sintetizira, a ne o osobitostima samih ribosoma. Slobodni ribosomi i oni vezani za membrane funkcionalno se ne razlikuju, a sinteza svakog proteina zapo~inje na ribosomima koji su slobodni u citosolu. Ribosomi koji zapo~nu sintezu proteina namijenjenih izlu~ivanju, bit }e usmjereni prema endoplazmatskom retikulu signalnim slijedom na amino-kraju novonastaju}eg polipeptidnog lanca. Signalni je slijed kratki niz hidrofobnih aminokiselina koji se obi~no uklanja s polipeptidnog lanca tijekom njegova prijenosa u lumen ER. Op}enita uloga signalnih sljedova u usmjerivanju proteina na odgovaraju}a mjesta u stanici razja{njena je prou~avanjem ulaska proteina namijenjenih izlu~ivanju u endoplazmatski retikul. Ovi su pokusi koristili in vitro pripravke hrapavog ER, koji je iz stani~nog ekstrakta izoliran centrifugiranjem u gradijentu gusto}e (slika 9-4). Kad se stanice razore i jezgre odvoje centrifugiranjem, ER se raspada na male vezikule koji se nazivaju mikrosomi. Kako su vezikule nastale od hrapavog ER prekrivene ribosomima, mogu se razdvojiti od sli~nih vezikula nastalih od glatkog ER ili od drugih membrana (primjerice, stani~ne membrane). Upravo velika koli~ina RNA u
Serozne stanice gu{tera~e koje izlu~uju gotovo sve svoje novosintetizirane proteine u probavni sustav, bile su ozna~ene radioaktivnim aminokiselinama kako bi se prou~io unutarstani~ni put za izlu~ivanje proteina. Nakon kratke inkubacije s radioaktivnim aminokiselinama (3 minute), autoradiografija je pokazala da se novosintetizirani proteini nalaze u hrapavom ER. Poslije daljnje inkubacije, sada s neradioaktivnim aminokiselinama (potjera), na|eno je da proteini prelaze iz ER u Golgijev aparat, a potom u sekrecijskim vezikulama dolaze do stani~ne membrane i izlu~uju se iz stanice.
358
Poglavlje 9
Slika 9-3. Pregled razvrstavanja proteina.

U stanici sisavaca, po~etno razvrstavanje proteina prema ER odvija se tijekom same translacije mRNA. Proteini koji se sintetiziraju na slobodnim ribosomima ostaju u citosolu ili se prenose u jezgru, mitohondrije, kloroplaste ili peroksisome. Nasuprot tomu, proteini koji se sintetiziraju na ribosomima vezanim za membranu, prebacuju se u ER jo{ dok traje translacija njihove mRNA. Ovi proteini mogu biti zadràni u ER ili se prenose do Golgijeva aparata, odakle dalje odlaze do lizosoma, stani~ne membrane ili se sekrecijskim vezikulama izlu~uju iz stanice.
slobodni ribosomi u citosolu citosol
ribosomi vezani za membranu citosol mRNA 5' 3'
mRNA 5'
3'
lumen endoplazmatskog retikula
protein
protein
jezgra mitohondrij
peroksisom kloroplast
stani~na membrana sekrecijska vezikula
endosomi
lizosomi
Slika 9-4. Izdvajanje hrapavoga ER.

Kad se stanica razori, ER se raspadne u male vezikule koji se nazivaju mikrosomi. Mikrosomi koji nastaju od hrapavoga ER (hrapavi mikrosomi) posjeduju ribosome sa svoje vanjske strane. Kako ribosomi sadràvaju velike koli~ine RNA, hrapavi ribosomi su gu{}i nego glatki i mogu biti izdvojeni ravnote`nim centrifugiranjem u gradijentu gusto}e.
ribosomima pove}ava gusto}u membranskih vezikula za koje su vezani, {to omogu}uje pro~i{}avanje mikrosoma nastalih od hrapavog ER ravnote`nim centrifugiranjem u gradijentu gusto}e. David Sabatini i Gnter Blobel su prvi, 1971. godine, predloìli da je signal za vezanje ribosoma na ER slijed u blizini amino-kraja rastu}eg polipeptidnog lanca. Ovu su hipotezu podràli rezultati in vitro prevo|enja mRNA koje kodiraju proteine predodre|ene za izlu~ivanje, kao {to su, primjerice imunoglobulini (sl. 9-5). Utvr|eno je da ako se mRNA koja kodira sekrecijski protein prevodi na slobodnim ribosomima in vitro, protein je ne{to ve}i nego odgovaraju}i izlu~eni protein. Me|utim, ako se u sustav dodaju mikrosomi, protein nastao in vitro ugra|uje se u mikrosome i kida do ispravne veli~ine. Ovi su pokusi doveli do detaljnije definicije signalne
glatki mikrosomi hrapavi mikrosomi ribosomi centrifugiranje u gradijentu gusto}e
razaranje stanice
pove}avanje gusto}e
glatki mikrosomi endoplazmatski retikul hrapavi mikrosomi
359
translacija na slobodnim ribosomima mRNA 5'
translacija sa mikrosomima
3'
signalni slijed N
N N N 5' mRNA 3'
N protein koji sadràva signalni slijed C N C membrana mikrosoma protein ugra|en u mikrosom
hipoteze, kojom se pretpostavlja da predvodni~ki slijed na amino-kraju usmjeruje polipeptid u mikrosome, nakon ~ega ga kidaju mikrosomske proteaze. Mnogi su naknadni rezultati potvrdili ovaj model, a me|u njima treba istaknuti pokuse s rekombinantnom DNA, koji su pokazali da je dodatak signalnoga slijeda proteinu koji se ne izlu~uje dostatan za usmjerivanje u ER. Mehanizam kojim se sekrecijski proteini usmjeruju u ER tijekom translokacije (kotranslacijski put) danas je dobro poznat. Signalni slijed ~ini dvadesetak uglavnom hidrofobnih aminokiselina koje su obi~no smje{tene na amino-kraju polipeptidnog lanca (slika 9-6). îm izroni iz ribosoma, signalni slijed prepoznaje i veè ~estica za prepoznavanje signala (engl. signal recognition particle, SRP) koja je izgra|ena od {est polipeptidnih lanaca i male citoplazmatske RNA (srpRNA). SRP se veè za ribosome i za signalni slijed, te zaustavlja daljnje prevo|enje i usmjeruje cijeli kompleks (SRP ribosom i , polipeptidni lanac u nastajanju) prema ER gdje se veè na receptor za SRP koji je smje{ten na membrani ER (slika 9-7). Vezanje za receptor poti~e otpu{tanje SRP od ribosoma i signalnoga slijeda polipeptidnog lanca u nastajanju. Ribosom se potom veè za kompleks za prijenos ili translokaciju proteina (engl. protein translocation complex) na membrani ER te se signalni slijed uvla~i u membranski kanal ili translokon. I u stanicama kvasaca i u stanicama sisavaca translokoni membrane ER su kompleksi izgra|eni od triju transmembranskih proteina, koji su nazvani proteini Sec61. Proteini translokona kvasaca i sisavaca vrlo su sli~ni onima koji prenose sekrecijske polipeptide kroz stani~ne membrane bakterija, {to pokazuje iznena|uju}u o~uvanost sustava za izlu~ivanje proteina od prokariotske do eukariotske stani-
Slika 9-5. Ugradnja sekrecijskih proteina u mikrosome.

Sekrecijski se proteini prema ER usmjeruju signalnim slijedom, koji se uklanja tijekom prijenosa nastaju}ega polipeptidnog lanca u ER. Ovo je pokazano pokusima u kojima su translacijom mRNA na slobodnim ribosomima nastali proteini koji su zadràli svoje signalne sljedove i tako ostali ne{to ve}im od odgovaraju}ih izlu~enih proteina. Me|utim, kad su se ovom sustavu dodali mikrosomi, novonastali polipeptidni lanci bili su ugra|eni u mikrosome i signalni slijed je bio uklonjen proteoliti~kim kidanjem.
Slika 9-6. Signalni slijed hormona rasta.

Ve}ina signalnih sljedova sadràva niz hidrofobnih aminokiselina, kojima prethode one s bazi~nim bo~nim ograncima (primjerice arginin)
mjesto djelovanja signalne peptidaze
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr
360
Poglavlje 9
Signalna hipoteza
Transfer of Proteins across Membranes. I. Presence of Proteolytically Processed and Unprocessed Nascent Immunoglobulin Light Chains on Membrane-Bound Ribosomes of Murine Myeloma Gnter Blobel and Bernhard Dobberstein
Rockefeller University, New York Journal of Cell Biology, 1975, Volume 67, pages 835851
Kontekst
Kako se odre|eni polipeptidni lanci prenose kroz odgovaraju}e membrane? Istraìvanja pedesetih godina 20. stolje}a upu}ivala su na to da se sekrecijski proteini sintetiziraju na ribosomima vezanima za membranu i prenose kroz membrane tijekom same sinteze. Me|utim, to nije obja{njavalo za{to su ribosomi na kojima se odvija sinteza ovih proteina pri~vr{}eni za membranu, a oni na kojima se odvija sinteza proteina citosola nisu. Hipotezu, koja je po pr vi put objasnila ovu razliku predloìli su Gnter Blobel i David Sabatini 1971. godine. Pretpostavili su da (1) mRNA koje se prevode na ribosomima vezanima za membranu, sadràvaju jedinstveni niz kodona u 3' smjeru, nedaleko od mjesta inicijacije translacije, (2) prevo|enje ovih kodona daje jedinstveni slijed na amino-kraju novonastaloga polipeptidnog lanca (signalni slijed) i (3) signalni je slijed poticaj za prianjanje ribosoma za membranu. Godine 1975. Blobel i Dobberstein izveli su niz pokusa koji su osigurali presudnu podr{ku ovoj ideji. Uz to, predloìli su ne{to detaljniju ina~icu ove hipoteze, od sada zvane signalna hipoteza.
proteina. Prija{nja istraìvanja u laboratoriju Cesara Milesteina pokazala su da proteini dobiveni in vitro translacijom mRNA za lake lance imunoglobulina na svom amino-kraju sadràvaju oko 20 aminokiselina koje nisu prisutne u izlu~enim lakim lancima. Ovaj je rezultat doveo do prijedloga da ove aminokiseline upravljaju vezanjem ribosoma za membranu. Kako bi provjerili ovu ideju, Blobel i Dobberstein prou~avali su sintezu lakih lanaca na ribosomima vezanim za membranu u stanicama mijeloma. Kao {to se o~ekivalo na osnovi prija{njih radova, in vitro translacijom mRNA lakih lanaca na slobodnim ribosomima nastajali su proteini koji su bili duì od izlu~enih lakih lanaca (vidi sliku). Nasuprot tomu in vitro prevo|enje mRNA na ribosomima vezanima na membranu mijelomskih stanica nastajali su proteini jednako veliki kao oni koji se izlu~uju. [tovi{e, laki lanci sintetizirani na ribosomima koji
Gnter Blobel
su ostali vezani za mikrosome, bili su otporni na razgradnju dodanim proteazama, upu}uju}i na to da su laki lanci bili premje{teni unutar mikrosoma. Ovi su rezultati pokazali da se signalni slijed na amino-kraju uklanja mikrosomskim proteazama, dok se rastu}i polipeptidni lanac prenosi kroz
Eksperiment
Mijelomi su tumori B limfocita koji izlu~uju imunoglobuline, pa osiguravaju model za prou~avanje sekrecijskih
In vitro translacija mRNA lakih lanaca imunoglobulina na slobodnim ribosomima (staza 1) daje proizvod koji tijekom elektroforeze putuje sporije nego izlu~eni laki lanci (staza S). Nasuprot tomu, laki lanci sintetizirani in vitro translacijom na ribosomima vezanim za membranu (staza 2) iste su veli~ine kao i izlu~eni laki lanci. Uz to, proizvodi in vitro translacije na ribosomima vezanima na membranu neo{te}eni su nakon razgradnje proteazom (staza 3), {to upu}uje na to da su bili za{ti}eni od proteaze unosom u mikrosome.
ce. Premje{tanje ribosoma sa SRP na translokon omogu}uje ponovno zapo~injanje prevo|enja, pa se rastu}i polipeptidni lanac prenosi izravno kanalom translokona kroz membranu ER kako se prevo|enje nastavlja. Na ovaj na~in sinteza proteina izravno pokre}e prijenos rastu}ih polipeptidnih la-
361
membrane. Rezultati su bili protuma~eni u skladu s ne{to detaljnijom ina~icom signalne hipoteze. Upravo kako su se izrazili Blobel i Dobberstein, bitno svojstvo signalne hipoteze jest postojanje jedinstvenoga slijeda kodona smje{tenog neposredno s desne strane inicijacijskoga kodona, a prisutnog samo u onim mRNA ~iji rezultat prevo|enja treba biti prenesen kroz membranu.
Utjecaj
Prijenos odabranih proteina kroz membrane presudan je za odràvanje organela okruènih membranom u eukariotskim stanicama. Kako bi organele zadràle svoje posebnosti, proteini se moraju prenositi kroz to~no odgovaraju}e membrane. Signalna hipoteza osigurala je osnovu za razumijevanje ovih ~injenica.
Ne samo da je ovaj osnovni model bio sa sigur no{}u potvr|en za slu~aj prijenosa proteina namijenjenih unosu u endoplazmatski retikul, nego je tako|er osigurao okvir za razumijevanje usmjerivanja proteina prema drugim odjeljcima stanice okruènim membranom, te je time utjecao na gotovo sva podru~ja stani~ne biologije.
naca kroz translokon u ER. Kako se prijenos nastavlja, signalna peptidaza kida signalni slijed te se polipeptidni lanac otpu{ta u lumen ER. Mnogi proteini kvasca, kao i neki stani~ni proteini sisavaca, ne prenose se u ER tijekom sinteze na ribosomima vezanim za membranu, ve} se u ER prenose nakon {to je translacija zavr{ena (posttranslacijska translokacija). Ovi se proteini sintetiziraju na slobodnim ribosomima u citosolu i njihova posttranslacijska ugradnja u ER ne zahtijeva prisutnost SRP Umjesto toga . signalni slijed prepoznaju drugi receptorski proteini (kompleks Sec62/63)
3' mRNA 5' signalni slijed 3' 5' korak 1 korak 2 5' 3' 5' SRP
Slika 9-7. Kotranslacijski prijenos sekrecijskih proteina u ER.

Korak 1: Signalni se slijed pojavljuje iz ribosoma, prepoznan je i vezan za ~esticu koja prepoznaje signal (SRP). Korak 2: SRP dovodi kompleks do membrane ER, gdje se veè za SRP-receptor. Korak 3: SRP se otpu{ta, ribosom se veè za translokon i signalni se slijed uvla~i u kanal u membrani. Korak 4: Prevo|enje se nastavlja, a novonastali polipeptidni lanac prebacuje se kroz membranu. Korak 5: Signalna peptidaza kida signalni slijed, pa se polipeptid moè otpustiti u lumen ER.
3'
5' korak 4
3'
korak 3
SRP-receptor lumen endoplazmatskoga retikula signalna peptidaza korak 5
translokon
362
Poglavlje 9
Slika 9-8. Posttranslacijski prijenos proteina u ER.

Proteini koji se unose u ER nakon translacije sintetiziraju se na slobodnim ribosomima i zadràvaju se u nesmotanom obliku s pomo}u citosolnih {aperona. Njihove signalne sljedove prepoznaje kompleks Sec62/63, koji je povezan s translokonom u membrani ER. Protein Sec63 je povezan i s {aperonom BiP koji , djeluje kao molekularna hvataljka koja povla~i protein u ER.
5'
3' mRNA signalni slijed
zavr{eni polipeptidni lanac
translokon
kompleks Sec62/63
BiP lumen endoplazmatskog retikula
BiP P
udruèni s translokonom na membrani ER (slika 9-8). Hsp70 {aperoni koji se nalaze u citosolu odràvaju polipeptidne lance u razmotanom stanju i omogu}uju njihov ulazak u translokon, a Hsp70 {aperon koji se nalazi unutar ER (nazvan BiP) provla~i polipeptidni lanac kroz kanal u lumen ER. îni se da je za pokretanje posttranslacijskoga prijenosa proteina u ER potrebno vezanje polipeptidnih lanaca za BiP dok se kotranslacijski prijenos , doga|a kao posljedica procesa sinteze proteina.
Ugradnja proteina u membranu ER

Proteini namijenjeni izlu~ivanju iz stanice ili zadràvanju u lumenu ER, Golgijeva aparata, endosoma ili lizosoma prenose se kroz membranu ER i otpu{taju u njegov lumen na ve} opisani na~in. S druge strane, proteini namijenjeni stani~noj membrani ili membranama navedenih odjeljaka ne otpu{taju se u lumen, ve} se na samom po~etku ugra|uju u membranu ER. Iz membrane ER oni nastavljaju prema svom kona~nom odredi{tu du` sekretornog puta: ER Golgijev aparat stani~na membrana, ili dodatnim smjerom endosomi lizosomi. Me|utim, du` cijeloga sekretornoga puta ovi se proteini transportiraju kao dio membrane, a ne kao topljivi proteini lumena. Integralni membranski proteini uklopljeni su u membranu s pomo}u hidrofobnih podru~ja koja premo{}uju fosfolipidni dvosloj (vidi sliku 2-48). Dijelovi ovih proteina unutar membrane obi~no tvore a-uzvojnice, izgra|ene od 20 do 25 hidrofobnih aminokiselina. Stvaranjem a-uzvojnice maksi-
363
citosol
C N C
membrana endoplazmatskoga retikula
lumen endoplazmatskoga retikula
Slika 9-9. Usmjerenost membranskih proteina.

Integralni membranski proteini premo{}uju membranu pomo}u a-uzvojnice izgra|ene od 20 do 25 hidrofobnih aminokiselina, koje mogu biti ugra|ene u razli~itim orijentacijama. Svaki od dvaju proteina s lijeve strane i u sredini premo{}uje membranu samo jednom, ali se razlikuju po tome je li im amino-kraj, ili karboksi-kraj okrenut prema citosolu. Desno je primjer proteina koji ima vi{estruka podru~ja koja premo{}uju membranu.
malizira se broj vodikovih veza izme|u atoma okosnice polipeptidnog lanca, a bo~ni ogranci hidrofobnih aminokiselina stupaju u interakciju s repovima masnih kiselina fosfolipida u membranskom dvosloju. Razli~iti integralni membranski proteini razlikuju se po na~inu na koji su uronjeni u membranu (slika 9-9). Neki integralni membranski proteini prolaze kroz membranu samo jednom, a neki drugi vi{e puta. Dio je proteina u membranu uronjen tako da im je amino-kraj usmjeren prema citosolu, a dio tako da se u citosolu nalazi karboksilni kraj. Ova se orijentacija proteina umetnutih u ER, Golgijev aparat, lizosome i stani~nu membranu uspostavlja tijekom translokacije rastu}ega polipeptidnog lanca u ER. Budu}i da lumen ER topolo{ki odgovara vanjskoj strani stani~ne membrane, to dijelovi proteina stani~ne membrane koji su izloèni na povr{ini stanice odgovaraju regijama polipeptidnog lanca koji se prenosi u lumen ER (slika 9-10). Transmembranski proteini koji su prema citosolu usmjereni svojim karboksilnim-krajem, u membranu ER unose se najjednostavnijim na~inom (slika 9-11). Ovi proteini imaju na amino-kraju uobi~ajeni signalni slijed, {to ga kida signalna peptidaza tijekom prijenosa polipeptidnog lanca kroz membranu ER putem translokona. Proteini se potom sidre u membranu s pomo}u sljede}e a-uzvojnice smje{tene u sredi{njemu dijelu proteina. Ovaj transmembranski slijed (nazivamo ga zaustavni slijed, engl. stop-transfer sequence) poti~e na zatvaranje kanala translokona ~ime zaustavlja daljnji prijenos polipeptidnog lanca kroz membranu ER, pri ~emu karboksilni kraj rastu}eg polipeptidnog lanca nastavlja sintezu u citosolu. Podjedinice translokona se razdvajaju i transmembransko podru~je proteina ulazi u lipidni dvosloj. Ovaj na~in uno{enja transmembranskih proteina u membranu sastoji se od uzastopnog djelovanja signalnoga slijeda na amino-kraju proteina koji zapo~inje prijenos, a zatim biva uklonjen, i zaustavnog slijeda koji protein ukotvljuje u membrani.
364
Poglavlje 9
prijelazni endoplazmatski retikul
Golgijev aparat
citosol
stani~na membrana
Slika 9-10. Topologija sekrecijskoga puta.

Lumen endoplazmatskoga retikula i Golgijeva aparata topolo{ki su istovjetni prostoru vanjske strane stanice. Zbog toga }e oni dijelovi proteina koji u|u u ER biti izloèni na povr{ini stanice nakon {to doputuju do stani~ne membrane.
365
citosol
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
signalni slijed
zaustavni slijed N N
Slika 9-11. Ugradnja membranskoga proteina sa signalnim slijedom i jednim zaustavnim slijedom.
Signalni slijed se uklanja kad polipeptidni lanac pro|e kroz membranu, pa se amino-kraj polipeptidnog lanca nalazi u lumenu ER. Me|utim, prijenos polipeptidnog lanca kroz membranu zaustavlja transmembranski zaustavni slijed. Ovaj slijed zatvara translokon i izlazi lateralno iz kanala kako bi usidrio protein u membrani ER. Nastavkom translacije nastaje protein koji premo{}uje membranu i ~iji je karboksilni kraj okrenut prema citosolu.
Proteini mogu tako|er biti ukotvljeni u membrani ER putem unutarnjih signalnih sljedova koje signalna peptidaza ne moè ukloniti (slika 9-12). SRP prepoznaje ovakve signalne sljedove i na ve} opisani na~in donosi ih do membrane ER. S obzirom na to da ih signalna peptidaza ne uklanja, ovi signalni sljedovi kad napuste translokon ostaju u membrani u obliku transmembranske a-uzvojnice koja ukotvljuje protein u membrani ER. Va`no je uo~iti da ova vrsta signalnoga slijeda moè translokaciju kroz membranu usmjerivati po~ev{i ili od amino-kraja, ili od karboksilnog kraja polipeptidnog lanca. Na ovaj na~in, ovisno o orijentaciji signalnoga slijeda, proteini uronjeni u membranu ovim mehanizmom mogu imati ili amino-kraj, ili karboksilni kraj izloèn citosolu. Za proteine koji vi{e puta prolaze kroz membranu, pretpostavlja se da se ubacuju nizom naizmjeni~nih signalnih i zaustavnih sljedova. Primjerice, unutarnji signalni slijed dovodi do ubacivanja polipeptidnog lanca s amino-krajem prema citosolu (slika 9-13). Ako potom nadolazi zaustavni slijed, polipeptid }e napraviti petlju u lumenu ER, a sinteza proteina nastavlja se u citosolu. Ako nai|e drugi signalni slijed, novonastali polipeptidni lanac opet }e se ubaciti u ER i na~initi drugu petlju sa strane membrane okrenute citosolu. Na ovo se moè nadovezati sljede}i zaustavni slijed i tako dalje, pa naizmjeni~no nizanje signalnih i zaustavnih sljedova dovodi do ugradnje proteina koji vi{e puta premo{}uju membranu, a dijelovi proteina u obliku petlje nalaze se s obiju strana membrane.
366
Poglavlje 9
Slika 9-12. Ugradnja membransko- (A) citosol ga proteina s pomo}u signalnih sljedova koji se ne uklanjaju. 5'
Signalni sljedovi koji se ne uklanjaju, N smje{teni unutar polipeptidnog lanca, dovode do ugradnje polipeptida u obje orijentacije u ER-membrani. (A) Signalni slijed usmjeruje ugradnju polipeptida kako bi njegov amino-kraj bio okrenut prema citosolu. Ostatak signalni slijed se polipeptidnog lanca prebacuje u ER unutar lanca kako se translacija nastavlja. Signalni se slijed ne uklanja, pa djeluje kao slijed koji premo{}uje membranu i usidri se s karboksilnim krajem prema lumenu ER. (B) Drugi signalni sljedovi usmjelumen endoplazmatskoga retikula reni su kako bi doveli do prijenosa amino-kraja polipeptida kroz membranu. (B) Nastavkom translacije nastaje protein citosol koji premo{}uje membranu tako da je 5' njezin amino-kraj u lumenu ER, a kar5' 3' boksilni kraj u citosolu. Uo~ite da je ova orijentacija istovjetna onoj koju zauzmu proteini koji imaju signalni slijed koji se uklanja, a iza kojega se nalazi zaustavni slijed (vidi sliku 9-11).
signalni slijed unutar lanca lumen endoplazmatskoga retikula
3'
5'
3' bez uklanjanja N N
3'
bez uklanjanja
Smatanje i dorada proteina u ER

Smatanje polipeptidnog lanca u njegov pravilni trodimenzionalni oblik, udruìvanje polipeptida u proteine s vi{e podjedinica i kovalentne preinake u doradi proteina bili su opisani u 7. poglavlju. Za proteine koji ulaze u sekretorni put, mnogi se ovi doga|aji zbivaju ili tijekom prijenosa kroz membrane ER ili u njegovom lumenu. Primjer dorade je proteoliti~ko uklanjanje signalnoga peptida kad se polipeptidni lanac prenosi kroz membrane ER Endoplazmatski je retikul, tako|er i mjesto smatanja proteina, udruìvanja podjedinica proteina, stvaranja disulfidnih veza, po~etnih stupnjeva glikozilacije, te dodavanja glikolipidnih sidara nekim proteinima stani~ne membrane. U stvari, primarna je uloga proteina koji su smje{teni u lumenu ER potpomo}i smatanje i udruìvanje novotranslociranih polipeptida. Kao {to je ve} bilo opisano, proteini se prenose kroz membrane ER kao razmotani polipeptidni lanci ~ije prevo|enje jo{ uvijek te~e. Stoga se ovi polipeptidi smataju u svoj trodimenzionalni oblik unutar ER, potpomognuti molekularnim {aperonima koji ubrzavaju ovaj proces (vidi 7. poglavlje). Misli se da se {aperon Hsp70 (BiP), veè za razmotani polipeptidni lanac kako ovaj prolazi kroz membranu ER i da potom posreduje u smatanju proteina i udruìvanju peptida proteina koji se sastoje od vi{e podjedinica (slika 9-14). Ispravno smotani proteini otpu{taju BiP i ostale {aperone, te se mogu dalje prenositi u Golgijev aparat. Nepravilno smotani ili udruèni proteini usmjeruju se na razgradnju, {to }e biti dalje opisano.
367
citosol 5' 3' 5' N 3' 5' 3' 5' 3' N
SRP N
receptor za SRP
signalni slijed unutar lanca zaustavni slijed
5'
3' N
5'
3' N
drugi signalni slijed
Slika 9-13. Ugradnja proteina koji vi{estruko premo{}uje membranu.
Nastanak disulfidnih veza izme|u bo~nih ogranaka cisteina vaàn je oblik smatanja i udruìvanja proteina u ER. Ove veze ne mogu nastati u citosolu kome je svojstveno reduciraju}e okru`je {to odràva cistein u reduciranom (-SH) obliku. Naprotiv, oksidiraju}e okru`je ER potpomaè stvaranje disulfidnih veza, pa one imaju va`nu ulogu u izgradnji proteina koji se izlu~uju ili nalaze na stani~noj povr{ini. Stvaranje disulfidnih veza olak{ava enzim protein-disulfid-izomeraza (vidi sliku 7-23), koja se nalazi u lumenu ER. Dok se translacija jo{ uvijek odvija, unutar ER proteini se glikoziliraju na specifi~nim bo~nim lancima asparagina (N-glikozilacija) (slika 9-15). Kao {to je opisano u 7. poglavlju, oligosaharidne jedinice od 14 {e}ernih ostataka prenose se na bo~ne ogranke asparagina rastu}ega polipeptidnog lanca tijekom translokacije u ER. Oligosaharid se sintetizira na lipidnom nosa~u (dolikolu) usidrenom u membrani ER. Potom se ~itava oligosaharidna struktura prenosi na akceptorske asparaginske ostatke koji su unutar konsenzus-slijeda Asn-X-Ser/Thr s pomo}u membranskog enzima oligosahariltransferaze. êtiri se {e}erne jedinice (tri glukoze i jedna manoza) uklanjaju jo{ dok je protein u ER, a protein se dalje preina~uje tijekom prijenosa u Golgijev aparat ({to je opisano dalje u ovom poglavlju). Neki proteini u stani~nu membranu nisu usidreni s pomo}u regije koja prolazi kroz membranu, nego s pomo}u glikolipida. Kako ovi glikolipidi
U ovom primjeru signalni slijed smje{ten unutar polipeptidnog lanca dovodi do ugradnje polipeptida kojem je amino-kraj usmjeren prema citosolu. Zaustavni slijed utje~e na zatvaranje kanala translokona, pa zato polipeptidni lanac ~ini petlju u lumenu ER, a prevo|enje se nastavlja u citosolu. Drugi signalni slijed ponovno otvara kanal i omogu}uje iznova ugradnju polipeptidnog lanca u membranu ER stvaraju}i sad petlju u citosolu. Ovaj se postupak moè ponavljati vi{e puta, {to dovodi do ugradnje proteina s vi{estrukim podru~jima unutar membrane.
368
Poglavlje 9
5'
3'
5'
3'
BiP
N lumen endoplazmatskoga retikula
Slika 9-14. Smatanje proteina u ER.

Molekularni {aperon BiP veè se za polipeptidni lanac ~im on pre|e membranu ER i olak{ava smatanje i udruìvanje proteina u ER.
usidreni u membranu sadràvaju fosfatidilinozitol, nazvani su glikozilfosfatidil-inozitolna (GPI) sidra, a struktura im je prikazana na slici 7-34. Ova GPI-sidra nastaju u membrani ER, a nadodaju se odmah po zavr{etku translacije na karboksilni kraj nekih proteina koji tako ostaju usidreni u membrani (slika 9-16). Transmembransko podru~je proteina zamjenjuje se GPI-sidrom i ovi se proteini za membranu drè samo s pomo}u pridruènoga glikolipida. Poput transmembranskih proteina, GPI usidreni proteini sekretornim se putem prenose do stani~ne povr{ine vezani za membranu. Njihovo usmjerenje u ER odre|uje da }e proteini usidreni s pomo}u GPI-sidra biti kona~no okrenuti u izvanstani~ni prostor.
Slika 9-15. Glikozilacija proteina u ER.

citosol 5' 3' dolikol 5' 3' 5' 3' 5' 3'
P Asn N-acetilglukozamin P Asn
P P Asn
P P Asn
P P
manoza
glukoza
Oligosaharid se prenosi s dolikolnoga lipidnoga nosa~a na polipeptidni lanac tijekom prijenosa kroz membranu ER.
Tri glukozna ostatka uklanjaju se s pomo}u dvaju razli~itih enzima.
Jedna se manoza uklanja.
369
citosol COO
Slika 9-16. Dodavanje GPI-sidara.

repovi masnih kiselina
etanolamin + NH3 CH2 CH2
P P CH2 CH2 + NH3 oligosaharid P CH2 CH2 NH C O
P CH2 CH2 + NH3
Glikozilfosfatidilinozitol (GPI) sidra sadràvaju dva lanca masnih kiselina, oligosaharidni dio koji sadràva inozitol i druge {e}ere, te etanolamin (za detaljniju gra|u vidi sliku 7-34). GPI-sidra sastavljaju se u ER i dodaju polipeptidima koji su u u membranu usidreni svojim karboksilnim krajem. Dio uronjen u membranu se kida, a novi karboksilni kraj spaja se s NH2 skupinom etanolamina odmah nakon {to je translacija zavr{ena, pa tako nastaje protein vezan za membranu samo GPI-sidrom.
+ NH3
lumen ER
+ NH3
Vjerojatno se ~ak polovina proteina nastalih u ER razgra|uje u slijede}ih 20 minuta, a naj~e{}e zato jer se neispravno smataju. Stoga je jedna od va`nih uloga ER prepoznavanje nepravilno smotanih proteina, njihovo obiljeìvanje i preusmjerivanje u put razgradnje. S obzirom na to da pomaù u ispravnom smatanju, {aperoni i enzimi uklju~eni u doradu ~esto su upravo ti koji otkrivaju neispravno smotane proteine. Nije u potpunosti jasno na koji na~in ER kontrolira kvalitetu proteina, ali je uloga glikoproteinskih {aperona, kalneksina i kalretikulina ve} prili~no poznata (slika 9-17). Ovi se proteini veù na {e}erne jedinice djelomi~no smotanih glikoproteina prije nego {to je prijenos u ER zavr{en, te potpomaù pravilno smatanje glikoproteina. Ako se glikoprotein nije uspio pravilno smotati tijekom vi{e poku{aja, kompleks {aperona }e ga usmjeriti u put razgradnje, {to obuhva}a vra}anje proteinskog lanca kroz kanal translokona. U citosolu se proteinski lanac obiljeàva s pomo}u ubikvitina i razgra|uje u proteasomu kao {to je to obja{njeno u 7. poglavlju.
Glatki ER i sinteza lipida

Osim {to sudjeluje u doradi membranskih i sekrecijskih proteina, ER je i glavno mjesto sinteze membranskih lipida u eukariotskoj stanici. S obzirom na to da su izuzetno hidrofobni, lipidi se ne sintetiziraju u vodenom okru`ju citosola, nego uklopljeni u ve} postoje}e stani~ne membrane. Ve}i-
370
Poglavlje 9
citosol
ubikvitin ribosom translokon
Kidanje signalnoga slijeda i vezanje N-vezanog oligosaharida odvija se jo{ dok polipeptidni lanac izlazi iz translokona. Dva glukozna ostatka se uklanjaju omogu}uju}i kalneksinu da se veè za glikoprotein.
kalneksin UDP UDP
Ako se glikoprotein ne moè pravilno smotati, manozni se nastavci uklanjaju i protein se prebacuje natrag u citosol, ubikvitinira i razgra|uje u proteasomu.
Ako se glikoprotein nije pravilno smotao, izloène hidrofobne nastavke prepoznaje UDP-glukoziltransferaza. Glukoza se prebacuje na glikoprotein i omogu}uje mu da se ponovno poku{a smotati pomo}u kalneksina.
Nakon smatanja pomo}u kalneksina glikoprotein se otpu{ta i zaostala glukoza se uklanja. Ako je protein ispravno smotan u transportnoj vezikuli odlazi prema prijelaznom ER.
prijelazni ER
citosol
Slika 9-17. Smatanje glikoproteina pomo}u kalneksina.
na se lipida stvara u ER, premda neki nastaju u drugim membranama stanice. Potom se iz ER prenose do svog zavr{nog odredi{ta, ili u vezikulama ili s pomo}u proteinskih nosa~a, kao {to je to opisano dalje u ovom i u 10. poglavlju. Membrane eukariotskih stanica sastoje se od triju glavnih vrsta lipida: fosfolipida, glikolipida i kolesterola. Ve}ina fosfolipida, koji su temeljne gradbene jedinice membrane, derivati su glicerola. Sintetiziraju se na membrani ER, na strani okrenutoj citosolu, iz u vodi topljivih prete~a (slika 918). Masne se kiseline najprije prebacuju sa svog nosa~a koenzima A na glicerol-3-fosfat s pomo}u za membranu vezanog enzima, nakon ~ega se novonastali fosfolipid (fosfatidna kiselina) ugra|uje u membranu. Enzimi smje{teni na citosolnoj strani membrane ER kataliziraju dodavanje razli~i-
371
citosol
CoA C O R1
CoA C O R2
Slika 9-18. Sinteza fosfolipida.

Fosfogliceridi se sintetiziraju u membrani ER od prete~a koje dolaze iz citosola. Dvije masne kiseline vezane za koenzime A (CoA) kao nosa~e, prvo se veù za glicerol-3-fosfat, te nastane fosfatidna kiselina, koja se odmah potom ugra|uje u membranu. Fosfataza tada pretvara fosfatidnu kiselinu u diacilglicerol. Vezanjem razli~itih polarnih skupina na diacilglicerol nastaju fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin ili fosfatidilserin. Fosfatidilinozitol ne nastaje od diacilglicerola, ve} od fosfatidne kiseline.
CoA s masnom kiselinom P CH2 CH OH OH 2 CoA CH2
glicerol-3-fosfat
CDP Pi P H CH H
CH2 CH2
N+(CH3)3 CMP CH2 CH2 P H N+(CH3)3
OH
C O
R1
R2
R1
R2
R1
R2
fosfa dna kiseli a fosfatidna kiselina osfa
diacilglicerol acilglicero acilglicer
fo fatidilkoli o osfatidilkolin
OH HO OH
+ NH3 + NH3
CH2 HO OH CH2 P CH2 CH2 CH O O C OC O P CH2
OOC
CH CH2 P
CH2 CH O O C OC O
CH2 CH O O C OC O
CH2
lumen ER
R1
R2
R1
R2
R1
R2
fosfatidilinozitol
fosfatidiletanolamin
fosfatidilserin
372
Poglavlje 9
citosol
Slika 9-19. Prijenos fosfolipida s jedne na drugu stranu membrane ER.

Kako se fosfolipidi sintetiziraju na citosolnoj strani membrane ER, ugra|uju se samo u citosolni sloj fosfolipidnog dvosloja. Potom se prebacuju na drugu stranu membrane s pomo}u fosfolipidnih flipaza, {to dovodi do jednakomjernog rasta obiju strana fosfolipidnog dvosloja.
me embrana ER
lumen sinteza fosfolipida
flipaza
tih polarnih skupina, pa na taj na~in nastaju fosfatidilkolin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin ili fosfatidilinozitol. Stvaranje ovih fosfolipida na citosolnoj strani membrane ER omogu}uje hidrofobnim lancima masnih kiselina da ostanu uronjeni u membranov vostvoreni nu dok enzimi vezani za membranu kataliziraju lipid ugra|uju di se samo s s njihove reakcije s prete~ama koje su topljive u cito osolne strane vodi i stoga smje{tene u citosolu (primjerice dvo osloja CDP-kolin). Me|utim, zbog ovakvog razmje{taja novi fosfolipidi bivaju dodani samo polovici membrane ER koja je okrenuta citosolu (slika 919). Kako bi se o~uvala stabilnost membrane, neki od ovako nastalih fosfolipida moraju biti preneseni u drugu polovicu lipidnog dvosloja ER (okrenutu prema lumenu). Ovaj se prijenos ne odvija spontano jer zahtijeva prolazak polarnih skupina kroz membranu. Umjesto toga membranski protein nazvan flipaza (od engl. flip, obrrast obiju t nuti) katalizira brzo prebacivanje fosfolipida na stra ana drugu stranu membrane ER, {to dovodi do ujedfosf folipidnog na~enog rasta obiju polovica lipidnog dvosloja. dvo osloja Uz svoju ulogu u sintezi fosfoglicerida, ER tako|er sluì kao glavno mjesto sinteze dvaju drugih membranskih lipida: kolesterola i ceramida (slika 9-20). Kao {to }e biti pokazano dalje, ceramid se u Golgijevu aparatu pretvara ili u glikolipide ili u sfingomijelin (jedini membranski lipid koji ne nastaje od glicerola). ER je stoga odgovoran za sintezu ili zavr{nih produkata ili prete~a svih glavnih lipida eukariotskih membrana. Kolesterol i sfingomijelin va`ni su sastojci lipidnih splavi koje su opisane u 12. poglavlju. Glatkog ER izrazito mnogo ima u stanicama koje su posebno aktivne u metabolizmu lipida. Primjerice, steroidni se hormoni sintetiziraju iz kolesterola u ER, pa se velike koli~ine glatkog ER nalaze u stanicama koje proizvode steroidne hormone, kao {to su stanice testisa ili jajnika. Uz to se mnogo glatkog ER nalazi u stanicama jetre, jer sadràvaju enzime za preradbu razli~itih sastojaka topljivih u lipidima. Ovi enzimi za detoksifikaciju inaktiviraju brojne potencijalno {tetne lijekove (primjerice fenobarbiton) pretvaraju}i ih u sastojke topljive u vodi, koje je potom mogu}e izlu~iti iz tijela mokra}om. Glatki ER je stoga uklju~en u vi{estruke oblike metabolizma lipida, kao i sastojaka topljivih u lipidima.
Izlazak proteina i lipida iz ER

I proteini i lipidi putuju du` sekrecijskog puta u transportnim vezikulama, koje pupaju iz membrana jednog organela i potom se stapaju s membranama drugog. Tako molekule odlaze iz ER u vezikulama koje pupaju iz prije-
373
kolesterol H3C C C C C C HO C CH3 C C C C C C CH3 C C
H C C C C CH2 CH2 CH2
H C CH3 CH3
Slika 9-20. Gra|a kolesterola i ceramida.

Vodikovi atomi vezani za ugljikove atome u prstenu kolesterola nisu prikazani.
ceramid H HO H C O H C N H HO CH2 C (CH2)14CH3 (CH2)12CH3
laznog ER i svoj teret nose prvo do ER-Golgijeva me|uodjeljka (ERGIC, od engl. ER-Golgi intermediate compartment), a potom do Golgijeva aparata (slika 9-21). Sljede}i koraci du` sekrecijskog puta obuhva}aju prijenos vezikulama izme|u razli~itih odjeljaka u sklopu Golgijeva aparata i iz Golgijeva aparata do lizosoma ili stani~ne membrane. U svim ovim slu~ajevima proteini se u lumenu jednog organela pakiraju u pupaju}u transportnu vezikulu, te se nakon {to se vezikula stopi s dolaznim organelom, otpu{taju u njezin lumen. Membranski proteini i lipidi prenose se sli~no, te je va`no da se njihova usmjerenost u membrani ne mijenja dok putuju od jednog do drugog organela okruènog membranom. Primjerice, regije proteina koje se nalaze na citosolnoj strani membrane ER, bit }e tako|er okrenute ka citosolu u Golgijevu aparatu i stani~noj membrani, dok }e regije proteina koje su izloène na luminalnoj strani ER, biti u lumenu Golgijeva aparata i na vanjskoj strani stanice (vidi sliku 9-10). Dok ve}ina proteina putuje iz ER prema Golgijevu aparatu, neki proteini moraju biti zadràni u ER, te ne nastavljaju sekrecijskim putem. Primjer su proteini koji djeluju u ER (primjerice BiP signalna peptidaza, protein-di, sulfid-izomeraza, te drugi ranije opisani enzimi), pa moraju biti zadràni u ovom organelu. Odlazak prema Golgijevu aparatu naspram zadràvanja u ER prvo je raskri`je na koje nailaze proteini koji se razvrstavaju prema svojim kona~nim odredi{tima du` sekrecijskoga puta. Sli~na se raskri`ja pojavljuju na svakom sljede}em koraku tijekom prijenosa, kao primjerice zadràvanje u Golgijevu aparatu naspram odlasku prema lizosomima ili stani~noj membrani. U svakom od ovih slu~ajeva specifi~ni lokalizacijski signali svojstveni odre|enom smje{taju usmjeruju proteine prema njihovim to~nim odredi{tima. Razlika izme|u proteina koji odlaze i onih koji bivaju zadràni u ER ~ini se da je odre|ena dvjema vrstama ciljnih sljedova koji nedvosmisleno obiljeùju proteine, ili kao (1) namijenjene za prijenos do Golgijeva aparata, ili
374
Poglavlje 9
Slika 9-21. Vezikularni transport iz ER u Golgijev aparat.

Proteini i lipidi iz ER u Golgijev se aparat prenose u transportnim vezikulama prijelazni koje pupaju iz membrane prijelaznog endoplazmatski ER i potom se stapaju s mjehuri}ima i retikul cjev~icama ER-Golgijeva me|uodjeljka (ERGIC). Proteini iz lumena ER putuju vezikulama i izlijevaju se u lumen Golgijeva aparata. Membranski proteini zadràvaju istu orijentaciju u Golgijevu aparatu, kao {to su ju imali u ER.
transportna vezikula
pupanje vezikula
stapanje vezikula
ERGIC
Golgijev aparat
(2) namijenjene za zadràvanje u ER. Mnogi se proteini zadràvaju u lumenu ER zbog prisutnosti ciljnog slijeda Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL, u jednoslovnom ozna~ivanju) na svom karboksilnom kraju. Ako se ovaj slijed ukloni iz proteina koji bi bio normalno zadràn u ER (primjerice, BiP ili protein-disulfid-izomeraze), mutirani protein biva prenijet u Golgijev aparat i izlu~en iz stanice. S druge strane dodatak slijeda KDEL na karboksilni kraj proteina koji bi se izlu~io uzrokuje njegovo zadràvanje u ER. Zadràvanje nekih transmembranskih proteina u ER na sli~an je na~in odre|eno kratkim sljedovima na karboksilnom kraju, koji sadràvaju dva lizina (sljedovi KKXX). Zanimljivo je da signali KDEL i KKXX ne sprje~avaju proteine ER da se unesu u vezikule i prenesu do Golgijeva aparata. Umjesto toga ovi signali uzrokuju selektivno izdvajanje rezidencijalnih proteina ER iz ER-Golgijeva me|uodjeljka ili iz Golgijevog kompleksa, te njihov povratak u ER recikla`nim putem (slika 9-22). îni se da proteine koji sadràvaju sljedove KDEL ili KKXX prepoznaju specifi~ni recikla`ni receptori u membranama ovih odjeljaka koji ih zatim prenose natrag u ER. Sljedovi KDEL i KKXX najbolje su opisani signali za zadràvanje/ vra}anje, no mogu}e je da postoje i neki drugi. Uz to, ~ini se da su neki proteini namijenjeni izlu~ivanju obiljeèni signalima koji ih aktivno usmjeruju za izlazak iz ER. Zbog toga nije potpuno jasno postoji li uvrijeèni put koji sve proteine koji nisu posebno obiljeèni izvodi iz ER prema Golgijevu aparatu, ili je svaki protein specifi~no obiljeèn za zadràvanje ili za izlazak iz ER.
Golgijev aparat
Golgijev aparat ili Golgijev kompleks djeluje kao tvornica u kojoj se proteini koji dolaze iz ER dalje dora|uju i razvrstavaju za prijenos do mogu}ih
375
Slika 9-22. Povratak proteina koji djeluju u ER.

ER
povratak KDEL KDEL
Proteini namijenjeni zadràvanju u lumenu ER obiljeèni su slijedom LysAsp-Glu-Leu (KDEL) na svom karboksilnom kraju. Ovi proteini odlaze iz ER prema Golgijevu aparatu, ali ih prepoznaje receptor u ERGIC ili Golgijevu aparatu, te bivaju izdvojeni i vra}eni u ER.
ERGIC
Golgijev aparat
odredi{ta u endosomu, lizosomu, stani~noj membrani ili izvan stanice. Uz to, kao {to je ve} re~eno, u Golgijevu se aparatu sintetiziraju glikolipidi i sfingomijelin. U biljnim stanicama Golgijev aparat nadalje sluì kao mjesto sinteze sloènih polisaharida stani~ne stijenke. Na taj je na~in Golgijev aparat uklju~en u preradbu {irokog spektra stani~nih sastojaka koji putuju du` sekrecijskoga puta.
Organizacija Golgijeva aparata

Morfolo{ki je Golgijev aparat sastavljen od spljo{tenih vre}ica (cisterni) okruènih membranom i pridruènih im vezikula (slika 9-23). Va`no svojstvo Golgijeva aparata njegova je stroga polarnost gra|e i djelovanja. Proteini iz ER ulaze s njegove cis strane (ulazna strana), koja je ispup~ena i obi~no okrenuta prema jezgri. Potom se prenose kroz Golgijev aparat i izlaze s njegove udubljene trans strane (izlazna strana). Tijekom prolaska kroz Golgijev aparat proteini se dora|uju i razvrstavaju za prijenos do svojih mogu}ih odredi{ta u stanici. Razli~ita zbivanja tijekom ove dorade i razvrstavanja odvijaju se to~no odre|enim slijedom u razli~itim podru~jima Golgijeva kompleksa, pa se stoga obi~no smatra da se Golgijev aparat sastoji od vi{e razdvojenih odjeljaka. Premda broj ovih odjeljaka nije odre|en, Golgijev se aparat naj~e{}e
376
Poglavlje 9
cis strana
Slika 9-23. Elektronskomikroskopska snimka Golgijeva aparata.

Golgijev se aparat sastoji od nakupine splo{tenih cisterni i pridruènih mjehuri}a u obliku stoga. Proteini i lipidi iz ER dolaze do Golgijeva aparata s njegove cis strane, a odlaze od njega s njegove trans strane. (Ljubazno{}u dr. L. Andrew Staehelin, University of Colorado at Boulder.)
trans strana
ER
ER-Golgijev me|uodjeljak cis Golgijeva mreà
Slika 9-24. Podru~ja Golgijeva aparata.
Mjehuri}i iz ER stapaju se s ER-Golgije- Golgijev vim me|uodjeljkom, te se potom proteistog ni iz ER prenose do cis Golgijeve mreè. trans Proteini koji djeluju u ER vra}aju se iz ER-Golgijeva me|uodjeljka i cis Golgijeve mreè recikla`nim putem. Medijalni i trans odjeljak Golgijeva stoga odgovaraju cister nama u sredini Golgijeva kompleksa u kojima se odvija najve}i trans dio dorade proteina. Proteini se potom Golgijeva prenose do trans Golgijeve mreè, gdje mreà se razvrstavaju za prijenos do stani~ne membrane, endosoma ili lizosoma, ili za izlu~ivanje.
medijalni
trans izlu~ivanje, stani~na membrana, endosomi, lizosomi
377
dijeli na ~etiri funkcionalno razli~ita podru~ja: cis Golgijevu mreù, Golgijev stog (koji je podijeljen u medijalni i trans pododjeljak) i trans Golgijevu mreù (slika 9-24). Proteini se iz ER prenose u ER-Golgijev me|uodjeljak (ERGIC, od engl. ER-Golgi intermediate compartment), a potom ulaze u Golgijev aparat u podru~ju cis Golgijeve mreè. Potom napreduju do medijalnog i trans odjeljka Golgijeva stoga, u kojem se odvija ve}ina metaboli~kih aktivnosti Golgijeva aparata. Preina~eni proteini, lipidi i polisaharidi potom se sele u trans Golgijevu mreù, koja razvrstava i raspore|uje, usmjeruju}i promet molekula prema endosomima, lizosomima, stani~noj membrani ili izvan stanice. Premda je Golgijev aparat prvi put opisan prije vi{e od 100 godina, mehanizam s pomo}u kojeg se proteini kre}u kroz Golgijev aparat jo{ uvijek nije razja{njen i predmet je suprotnih stavova stani~nih biologa. Jedna je mogu}nost da transportne vezikule prenose proteine izme|u cisterni u Golgijevim odjeljcima. No postoje i zna~ajni eksperimentalni podatci koji upu}uju na to da se proteini kroz odjeljke Golgijeva aparata prenose u njegovim cisternama, koje postupno dozrijevaju i napreduju kroz Golgijev aparat u smjeru od cis prema trans strani. Vjerojatno se prijenos odvija s pomo}u oba ova zbivanja. Nedavni radovi upu}uju na to da se pokretanje gradbenih jedinica Golgijeva aparata odràva me|udjelovanjima proteina i membrana cisterni s citoskeletom.
Glikozilacija proteina u Golgijevu aparatu

Dorada proteina u Golgijevu aparatu obuhva}a preinaku i sintezu ugljikohidratnih dijelova glikoproteina. Jedan od glavnih oblika dorade jest preinaka N-vezanih oligosaharida koji su na proteine vezani u ER. Kao {to je ve} bilo opisano u ovom poglavlju, proteini se u ER dora|uju vezanjem oligosaharida koji se sastoji od 14 {e}ernih podjedinica (vidi sliku 9-15). Tri glukoze i jedna manoza uklanjaju se jo{ dok je polipeptid u ER. Nakon prijenosa u Golgijev aparat, N-vezani oligosaharidi ovih glikoproteina podlo`ni su brojnim daljnjim preinakama. N-vezani oligosaharidi dora|uju se u Golgijevu aparatu to~no odre|enim nizom reakcija (slika 9-25). Prva preinaka proteina namijenjenih za izlu~ivanje ili za smje{taj na stani~noj membrani jest uklanjanje jo{ tri manoze. Potom slijedi u nizu: dodavanje N-acetilglukozamina, uklanjanje jo{ dvije manoze, pa dodavanje fukoze i jo{ dva N-acetilglukozamina. Kona~no se dodaju tri galaktoze i tri sijalinske kiseline. Kao {to je spomenuto u 7. poglavlju, glikoproteini se tijekom prolaska kroz Golgijev aparat dora|uju do razli~ite mjere, {to ovisi i o gra|i proteina i o koli~ini i tipu enzima prisutnih u Golgijevu aparatu razli~itih vrsta stanica. Stoga proteini mogu napustiti Golgijev aparat s nizom razli~itih N-vezanih oligosaharida. Lizosomski se proteini od sekrecijskih proteina ili proteina stani~ne membrane razlikuju po doradi N-vezanih oligosaharida. Dorada proteina predodre|enih za ugradnju u lizosome ne obuhva}a po~etno uklanjanje tri manoze, ve} se manoze fosforiliraju. U prvom se koraku ove reakcije N-acetilglukozamin-fosfat dodaje na odabrane manoze, vjerojatno jo{ dok je protein u cis Golgijevoj mreì (slika 9-26). Potom se N-acetilglukozaminska skupina uklanja i ostaje manoza-6-fosfat na N-vezanom oligosaharidu. Zbog ove se preinake ovaj nastavak ne uklanja tijekom daljnje dorade. Umjesto toga fosforiliranu manozu prepoznaje receptor za manoza-6-fosfat u trans Golgijevu retikulu, {to usmjeruje prijenos ovih proteina u lizosome. Fosforilacija manoze klju~ni je korak u razvrstavanju lizosomskih proteina na njihova ispravna unutarstani~na odredi{ta. Specifi~nost se ovog postupka temelji na enzimu koji katalizira prvi korak u slijedu reakcija, a to je
378
Poglavlje 9
Uklanjaju se tri manoze.
Dodaje se N
Uklanjaju se dvije dodatne manoze.
Dodaju se fukoza i dva N N-acetilglukozamin manoza galaktoza fukoza sijalinska kiselina
Slika 9-25. Dorada N-vezanih oligosaharida u Golgijevu aparatu.

N-vezani oligosaharidi glikoproteina koji su do{li iz ER dodatno se dora|uju to~no ure|enim nizom reakcija u Golgijevu aparatu.
Dodaju se tri sijalinske kiseline.
Dodaju se tri glukoze.
dodavanje N-acetilglukozamin-fosfata odabranim lizosomskim proteinima. Ovaj enzim prepoznaje specifi~na strukturna svojstva lizosomskih proteina, nasuprot onima predodre|enima za smje{taj na stani~noj membrani ili za izlu~ivanje. Primarni slijed aminokiselina u ovom slu~aju nije dovoljan, ve} odrednica prepoznavanja nastaje smatanjem proteina i pribliàvanjem aminokiselinskih sljedova iz razli~itih dijelova polipeptidnog lanca. Nasuprot signalnom slijedu koji usmjeruje prijenos proteina u ER, odrednica koja dovodi do ispravnog prepoznavanja manoze koju treba fosforilirati i time nedvosmisleno usmjeriti protein u lizosome, ovisi o trodimenzionalnom obliku smotanog proteina. Takve se odrednice nazivaju signalnim plohama (engl. signal patches), kako bi se razlikovale od linearnih signalnih sljedova koji su bili opisani ranije u ovom poglavlju.
lizosomski protein
Slika 9-26. Usmjerivanje lizosomskih proteina fosforilacijom manoze.

Proteini predodre|eni za ugradnju u lizosome prepoznaju se i preina~uju dodavanjem fosfatnih skupina na mjesto {est {e}era manoze. U pr vome koraku ove reakcije N-acetilglukozaminfosfat se prebacuje na manozu s UDP-N-acetilglukozamina. N-acetilglukozamin se potom uklanja ostavljaju}i manoza-6fosfat.
UDP
UMP
N-acetilglukozamin manoza
manoza-6-fosfat
379
Proteini tako|er mogu biti preina~eni dodavanjem {e}era na bo~ne ogranke serina i treonina u sklopu posebnih aminokiselinskih sljedova (Oglikozilacija) (vidi sliku 7-30). Ove se preinake odvijaju u Golgijevu aparatu, dodavanjem niza pojedina~nih {e}ernih ostataka. Serin ili treonin obi~no su vezani izravno za N-acetilgalaktozamin, na koji se potom veù ostali {e}eri. Ponekad se ovi {e}eri dodatno dora|uju dodavanjem sulfatnih skupina.
Metabolizam lipida i polisaharida u Golgijevu aparatu

Uz svoju ulogu u razvrstavanju glikoproteina, Golgijev aparat ima ulogu i u metabolizmu lipida, poglavito u sintezi glikolipida i sfingomijelina. Kao {to je prije bilo opisano, fosfogliceridi, kolesterol i ceramid sintetiziraju se u ER. Sfingomijelin i glikolipidi se sintetiziraju iz ceramida u Golgijevu aparatu (slika 9-27). Sfingomijelin (jedini neglicerolski fosfolipid u membranama stanice) nastaje prijenosom fosforilkolinske skupine s fosfatidilkolina na ceramid. Druga je mogu}nost nastanak razli~itih glikolipida dodavanjem ugljikohidrata na ceramid. Sfingomijelin se sintetizira na luminalnoj strani Golgijeva aparata, ali se glukoza na ceramid dodaje na citosolnoj strani. Glukozilceramid se o~igledno mora potom obrnuti, dok se ostali ugljikohidrati dodaju na strani okrenutoj prema lumenu. Ni sfingomijelin, niti glikolipidi ne mogu se obrnuti u membrani Golgijeva aparata, pa se u lipidnom dvosloju nalaze okrenuti isklju~ivo prema lumenu. Poslije transporta vezikulama, oni se nalaze na odgovaraju}oj vanjskoj polovici dvosloja stani~ne membrane, a polarne skupine (glave) vire sa stani~ne povr{ine. Kao {to }e biti opisano u 12. poglavlju, oligosaharidni dijelovi glikolipida stani~ne membrane va`ni su biljezi u procesu prepoznavanja izme|u stanica. U biljnim stanicama Golgijev aparat ima dodatnu zada}u jer je mjesto stvaranja sloènih polisaharida stani~ne stijenke. Kao {to }e biti opisano kasnije, u 12. poglavlju, stijenka biljne stanice sastoji se od tri glavne vrste polisaharida. Celuloza koja prevladava jest jednostavni linearni polimer sastavljen od 1 glukoze. Sintetizira se na stani~noj povr{ini enzimima koji su smje{teOH ni u membrani. Ostali polisaharidi CH2 stani~ne stijenke (hemiceluloza i pektini) su, me|utim, sloèni razHC NH granati lanci koji se sintetiziraju u HCOH C O Golgijevu aparatu i potom vezikulama prenose do stani~ne povr{ine. Sinteza polisaharida stani~ne stijenke jedna je od glavnih briga ceramid stanice, te ~ak 80% metaboli~ke ak2
fosforilkolinska skupina P CH2 HC HCOH NH C O CH2 CH2 N(CH3)3 sfingomijelin

+
O CH2 HC HCOH NH C O
{e}erni ostatci
glikolipidi
Slika 9-27. Sinteza sfingomijelina i glikolipida.

Ceramid, koji se sintetizira u ER, pretvara se ili u sfingomijelin (jedan od fosfolipida) ili u glikolipide u Golgijevu aparatu. U prvoj reakciji, fosforilkolinska skupina prenosi se sa fosfatidilkolina na ceramid. Druga je mogu}nost nastanak raznih glikolipida dodavanjem jednoga ili vi{e {e}era (primjerice, glukoze).
380
Poglavlje 9
tivnosti Golgijeva aparata u biljnim stanicama moè otpadati na sintezu polisaharida.
Razvrstavanje proteina i njihov odlazak iz Golgijeva aparata

Proteini se, kao i lipidi i polisaharidi iz Golgijeva aparata do svojih kona~nih odredi{ta prenose sekrecijskim putem. Ovo obuhva}a razvrstavanje proteina u razli~ite vrste transportnih vezikula, koje pupaju iz trans Golgijeve mreè i dostavljaju svoj sadràj na odgovaraju}a mjesta u stanici (slika 9-28). Neki se proteini iz Golgijeva aparata do stani~ne membrane prenose temeljnim sekrecijskim putem koji uklju~uje ugradnju novih proteina i lipida u stani~nu membranu, kao i trajno izlu~ivanje proteina iz stanice. Ostali se proteini do stani~ne povr{ine prenose posebnim putem regulirane sekrecije ili se specifi~no usmjeruju na druga unutarstani~na odredi{ta, kao {to su primjerice lizosomi u ìvotinjskim stanicama ili vakuole u kvasca. Proteini koji svoju ulogu obavljaju unutar Golgijeva aparata moraju biti zadràni u ovoj organeli, odnosno ne smiju biti odneseni dalje du` sekrecijskog puta. Nasuprot ER, svi proteini koji se zadràvaju u Golgijevu kompleksu povezani su s membranom Golgijeva aparata, a nisu otopljeni u lumenu. Signal odgovoran za zadràvanje nekih proteina u Golgijevu apara-
temeljna sekrecija
regulirana sekrecija
Slika 9-28. Promet iz Golgijeva aparata.

Proteini se razvrstavaju u trans Golgijevoj mreì i prenose vezikulama do svojih kona~nih odredi{ta. Ako nedostaje neki od signala za usmjerivanje, protein }e biti prenesen do stani~ne membrane temeljnim sekrecijskim putem. Druga je mogu}nost da proteini budu skrenuti s temeljnoga puta k drugomu odredi{tu kao {to su to endosomi i lizosomi, ili krenu put reguliranog izlu~ivanja iz stanice.
endosom
lizosom
381
tu nalazi se u njihovim transmembranskim podru~jima, {to sprje~ava pakiranje proteina u transportne vezikule koje napu{taju trans Golgijevu mreù. Uz to poput sljedova KKXX u proteinima koji ostaju u membrani ER, signali u citoplazmatskim repovima nekih proteina Golgijeva aparata odre|uju vra}anje ovih proteina iz odjeljaka koji slijede du` sekrecijskoga puta. Temeljni sekrecijski put, koji se odvija u svim stanicama, dovodi do neprekidnoga nereguliranog izlu~ivanja proteina. No, neke stanice tako|er posjeduju posebne regulirane sekrecijske puteve u kojima se odabrani proteini izlu~uju ovisno o signalima iz okoline. Primjeri ovakva reguliranog izlu~ivanja odnose se na otpu{tanje hormona iz endokrinih stanica, otpu{tanje neurotransmitora iz neurona, i otpu{tanje probavnih enzima iz seroznih stanica gu{tera~e, kao {to je bilo opisano na po~etku ovoga poglavlja (vidi sliku 9-2). Proteini se razvrstavaju u regulirani sekrecijski put u trans Golgijevoj mreì, gdje se pakiraju u posebne sekrecijske vezikule. Ove nezrele sekrecijske vezikule, koje su ve}e od transportnih vezikula, dalje dora|uju svoj proteinski sadràj i ~esto se stapaju jedne s drugima. Time tako|er i pohranjuju svoj sadràj sve dok odgovaraju}i signal ne odredi njihovo stapanje sa stani~nom membranom. Primjerice, probavni se enzimi, koji se proizvode u seroznim stanicama gu{tera~e, pohranjuju u zrelim sekrecijskim vezikulama sve dok prisutnost hrane u èlucu i tankomu crijevu ne potakne njihovo izlu~ivanje. Razvrstavanje proteina u regulirani sekrecijski put ~ini se da obuhva}a prepoznavanje signalnih ploha koje su zajedni~ke brojnim proteinima koji putuju ovim smjerom. Ovi se proteini odabiru i udruùju u trans Golgijevoj mreì, te potom odlaze iz nje pupanjem nezrelih sekrecijskih vezikula. Daljnja pote{ko}a u prijenosu proteina do stani~ne membrane pojavljuje se u mnogim epitelnim stanicama, koje su polarizirane kad su organizirane u epitelnom tkivu. Stani~na membrana ovih stanica podijeljena je u dva odvojena podru~ja: apikalno i bazolateralno podru~je, koja sadràvaju razli~ite proteine svojstvene njihovoj posebnoj ulozi. Primjerice, apikalna membrana crijevnih epitelnih stanica okrenuta je prema lumenu crijeva i zaduèna je za u~inkovitu apsorpciju hranjivih tvari. Ostatak stani~ne membrane je bazolateralna membrana (slika 9-29). Razli~ita podru~ja stani~ne membrane nisu prisutna samo u epitelnim stanicama, ve} i u drugim stani~nim vrstama. Zato temeljni sekrecijski put mora razlikovati prijenos iz trans Golgijeve mreè do ovih razli~itih podru~ja stani~ne membrane. To se postiè putem razli~itog spremanja proteina u najmanje dvije vrste temeljnih sekrecijskih vezikula, koje su usmjerene ili prema apikalnim, ili prema bazolateralnim podru~jima stani~ne membrane. Razli~ito se pakiranje moè zbivati ili u trans Golgijevoj mreì ili u endosomu. Najbolje opisani put razvrstavanja proteina u Golgijevu aparatu jest prijenos odabranih proteina prema lizosomima. Kao {to je ve} bilo re~eno, proteini koji }e sti}i u lumen lizosoma ozna~eni su manoza-6-fosfatom koja se stvara preinakom njihovih N-vezanih oligosaharida kratko nakon njihova ulaska u Golgijev aparat. Specifi~ni receptor u membrani trans Golgijeve mreè prepoznaje manozu-6-fosfat, te nastaje kompleks receptora i lizosomskog enzima, koji se pohranjuje u transportne vezikule usmjerene u lizosome. Lizosomski se membranski proteini usmjeruju na temelju sljedova u njihovim citoplazmatskim repovima, a ne s pomo}u manoza-6-fosfata. U kvascima i biljnim stanicama koje ne posjeduju lizosome, proteini se iz Golgijeva aparata prenose do jo{ jednog odredi{ta vakuola (slika 9-30). Vakuole preuzimaju ulogu lizosoma u ovim stanicama, te ujedno obavljaju i razne druge zada}e, kao {to je pohrana hranjivih tvari i odràvanje tlaka,
382
Poglavlje 9
Slika 9-29. Promet do stani~ne membrane u polariziranim stanicama.

Stani~na membrana polariziranih epitelnih stanica dijeli se na apikalno i bazolateralno podru~je. U ovomu primjeru (crijevni epitel), apikalna ploha stanice gleda prema lumenu crijeva, lateralne su plohe okrenute prema susjednim stanicama, a bazalna je ploha poloèna na sloj me|ustani~ne tvari (bazalna lamina). Apikalna membrana posjeduje mikrovile, koji olak{avaju apsorpciju hranjivih tvari pove}avaju}i povr{inu stanice. Odabrani se proteini usmjeruju prema apikalnim ili bazolateralnim membranama ili u trans Golgijevoj mreì ili u endosomu. ^vrsti spojevi izme|u susjednih stanica odràvaju razli~itost izme|u apikalnih i bazolateralnih membrana sprje~avaju}i difuziju bjelan~evina izme|u ovih dvaju podru~ja.
mikrovili
apikalna membrana lumen crijeva
~vrsti spoj
endosom
lateralna ploha Golgijev aparat
bazalna lamina bazalna ploha bazolateralna membrana
Slika 9-30. Vakuola biljne stanice.

Velika sredi{nja vakuola djeluje kao lizosom, pohranjuje hranjive tvari i odràva osmoti~ku ravnoteù. (E. H. Newcombe/Biological Photo Service.)
napetosti i osmoti~ke ravnoteè. Za razliku od usmjerivanja prema lizosomima, proteini se u vakuole usmjeruju kratkim peptidnim sljedovima, a ne ugljikohidratnim biljegom.
Mehanizam vezikularnoga transporta

Kao {to je vidljivo iz prethodnih dijelova ovoga poglavlja, transportne vezikule imaju sredi{nju ulogu u prometu molekula izme|u razli~itih odjeljaka okruènih membranom du` sekrecijskoga puta. Kao {to je opisano u 12. poglavlju, vezikule su na sli~an na~in uklju~ene u prijenos tvari preuzetih sa stani~ne povr{ine. Vezikularni transport stoga je glavna stani~na djelatnost, koja je odgovorna za promet molekula izme|u razli~itih odjeljaka okruènih membranom. Selektivnost je ovog prijenosa zato klju~na za odràvanje funkcionalne stani~ne organizacije. Primjerice, lizosomski enzimi moraju biti preneseni od Golgijeva aparata do lizosoma, a ne do stani~ne membrane ili do ER. Neki od ovih signala koji usmjeruju proteine do pojedine organele, kao {to je lizosom, bili su opisani prije u ovom poglavlju. Ovi se proteini prenose unutar vezikula, pa se ispravnost prijenosa temelji na pakiranju odabranog tereta upravo u vezikule koje }e prepoznati i stopiti se samo s odgovaraju}om ciljnom mem-
2 mm
383
branom. Zbog sredi{nje va`nosti vezikularnog transporta za organizaciju eukariotske stanice, razumijevanje molekularnih mehanizama koji kontroliraju pakiranje, pupanje i stapanje vezikula, glavno je podru~je istraìvanja u stani~noj biologiji.
Eksperimentalni pristup razumijevanju vezikularnoga transporta

Napredak u razja{njavanju molekularnih mehanizama vezikularnoga transporta postignut je trima razli~itim eksperimentalnim pristupima: (1) izdvajanjem kva{~evih mutanata kojima je prijenos i razvrstavanje proteina o{te}eno; (2) ponovno uspostavljanje vezikularnog transporta u sustavima bez stanica i (3) biokemijska analiza sinapti~kih vezikula, koje su odgovorne za regulaciju izlu~ivanja neurotransmitora u ìv~anim stanicama. Svaki od ovih eksperimentalnih pristupa ima odre|ene prednosti u razumijevanju pojedinih oblika vezikularnoga transporta. Najva`nija je, me|utim, ~injenica da se rezultati svih ovih triju smjerova istraìvanja podudaraju, pokazuju}i da sli~ni molekularni mehanizmi reguliraju izlu~ivanje u stanicama tako razli~itim kao {to su to kvasac i neuron sisavaca. Kao i u drugim podru~jima stani~ne biologije, kvasac se pokazao izuzetno korisnim u prou~avanju sekrecijskoga puta jer je pogodan za geneti~ke analize. Randy Schekman i njegovi suradnici prvi su zapo~eli s izolacijom kva{~evih mutanta s o{te}enim vezikularnim transportom. To obuhva}a mutante kojima su o{te}eni razli~iti stadiji izlu~ivanja proteina (sec mutante, od rije~i sekrecija), mutante koji ne mogu prenijeti proteine do vakuole i mutante koji ne mogu zadràti proteine ~iji je smje{taj u ER. Izdvajanje ovih mutanta vodilo je izravno do molekularnog kloniranja i prou~avanja odgovaraju}ih gena, te na taj na~in k otkrivanju brojnih proteina uklju~enih u razli~ite korake du` sekrecijskoga puta. Primjerice, uloga proteina Sec61 kao glavnog sastojka kanala za prijenos proteina u endoplazmatski retikul bila je opisana prije u ovom poglavlju. Biokemijska istraìvanja koja su rabila sustave in vitro vezikularnoga transporta nadopunila su geneti~ka istraìvanja, te su omogu}ila izravnu izolaciju transportnih proteina iz stanica sisavaca. Prvi prijenosni sustav bez stanica razvili su James Rothman i suradnici, koji su analizirali prijenos proteina izme|u odjeljaka Golgijeva aparata (slika 9-31). Eksperiment se temeljio na mutiranoj liniji stanica sisavaca kojima je nedostajao enzim potreban za prijenos N-acetilglukozamina do N-vezanog oligosaharida u ranom stadiju dorade u Golgijevu aparatu (vidi sliku 9-25). Zbog toga je proteinima proizvedenim u ovoj mutiranoj stani~noj liniji nedostajao N-acetilglukozamin. Me|utim, ako se Golgijev stog izdvojen iz mutirane stani~ne linije inkubirao sa stogovima izdvojenim iz normalnih stanica, N-acetilglukozamin je bio dodan glikoproteinima sintetiziranim u mutiranim stanicama. Niz pokusa pokazao je da se to dogodilo zbog prijenosa proteina vezikulama iz Golgijeva stoga mutirane stani~ne linije u Golgijev stog normalnih stanica, pa je dodavanje N-acetilglukozamina osiguralo lako prepoznatljiv biljeg za vezikularni transport u ovom in vitro uspostavljenom sustavu. Sli~ni su sustavi bili razvijeni za prou~avanje prijenosa izme|u drugih odjeljaka, primjerice prijenos iz ER do Golgijeva aparata i prijenos iz Golgijeva aparata do sekrecijskih vezikula, vakuole i stani~ne membrane. Razvoj ovih in vitro sustava omogu}io je biokemijsku analizu postupka prijenosa i prou~avanje uloge proteina prona|enih u mutiranim kvascima, kao i izravnu izolaciju nekih od proteina uklju~enih u pupanje i stapanje vezikula. Zna~ajan uvid u molekularne mehanizme vezikularnoga transporta do{ao je tako|er prou~avanjem sinapti~koga prijenosa u neuronima, koji
384
Poglavlje 9
Slika 9-31. Ponovno uspostavljanje vezikularnog transporta.

Golgijevi stogovi dobiveni iz mutirane linije stanice zaraène virusom, a koji ne mogu katalizirati dodatak N-acetilglukozamina na N-vezane oligosaharide, pomije{ani su s Golgijevim stogovima iz normalnih stanica. S obzirom na to da je mutirana stanica zaraèna virusom, njezini se proteini mogu prepoznati. Prijenos ovih proteina do nor malnog Golgijeva stoga temelji se na signalu nastalom dodatkom N-acetilglukozamina.
mutirana stanica zaraèna virusom virus
normalna stanica
virusni protein
mutirani Golgijev aparat
normalni Golgijev aparat
mutirani Golgijev aparat
vezikularni transport
normalni Golgijev aparat
dodavanje N-acetilglukozamina
predstavljaju visoko specijalizirani oblik reguliranog izlu~ivanja. Sinapsa je spoj neurona s drugom stanicom, koja moè biti ili drugi neuron ili izvr{na stanica, kao {to je to mi{i}na stanica. Informacija se prenosi sinapsom s pomo}u kemijskih neurotransmitora, kao {to je acetilkolin, koji su pohranjeni u neuronu u sinapti~kim vezikulama. Podraàj neurona poti~e stapanje
385
ovih sinapti~kih vezikula sa stani~nom membranom, uzrokuju}i otpu{tanje neurotransmitora u sinapsu i podraìvanje postsinapti~kog neurona ili izvr{ne stanice. Sinapti~ke su vezikule izrazito brojne u mozgu, {to omogu}uje da se pribave u velikim koli~inama za biokemijsku analizu. Neki od ovih proteina izoliranih iz sinapti~kih vezikula vrlo su sli~ni proteinima za koje je geneti~kim ispitivanjima pokazano da imaju klju~nu ulogu u prijenosu vezikulama. Tako su biokemijske analize ovih proteina omogu}ile vrijedan uvid u molekularni mehanizam stapanja vezikula.
Odabir tereta, oblaù}i proteini i pupanje vezikula

Tri su zbivanja nu`na za svaki korak sekrecijskoga puta, u kojem se transmembranski proteini i oni koje se nalaze u lumenu sa svojim receptorima pohranjuju u vezikule (slika 9-32). Prvo se proteini koji }e biti preneseni, razvrstavaju od proteina namijenjenih drugim odredi{tima, te od onih koje je potrebno zadràti. Potom na membrani mora nastati pupoljak koji sadràva odabrani teret i koji se odvoji kako bi nastala transportna vezikula. Kona~no transportna vezikula mora doputovati do ciljne membrane i s njom se spojiti. Nastajanje ve}ine transportnih vezikula reguliraju mali proteini koji veù GTP s pomo}u proteina adaptora {to djeluju izravno na proteine koji oblaù vezikule. Postoje tri porodice proteina koji veù GTP a za , koje se trenutno zna da su uklju~eni u pupanje vezikula: porodica faktora ADP-ribozilacije, me|u kojima je najpoznatiji ARF1, zatim Sar1 i na kraju velika porodica proteina Rab. Vezanje u slijedu i kooperativno djelovanje proteina koji veù GTP i proteina adaptora ili proteina efektora na membrani uspostavlja platformu za odre|eno zbivanje, kao {to je ustrojavanje i pupanje transportnih vezikula usmjerenih iz trans Golgijeve mreè prema endosomima i lizosomima. Pojedina~ni proteini u ovom kompleksu mogu sudjelovati u nastanku transportnih vezikula usmjerenih i nekamo drugdje, ali je svaki proteinski kompleks o~igledno jedinstven za odre|eno zbivanje, tj. pupanje, prijenos ili stapanje.
1. Proteini membrane i oni u lumenu koje razvrstavaju se od drugih proteina i
2. Pupoljak se odvaja i stvara se transportna vezikula.
3. Vezikula se stapa s membranom ciljnog organela. citosol
Slika 9-32. Nastanak i stapanje transportne vezikule.
386
Poglavlje 9
manoza-6-fosfat manoza-6-fosfat receptor lumen Golgijeva aparata trans Golgijeva mreà
lizosomski protein lizosomski proteini manoza-6-fosfata receptor manoza-6-fosfata adaptorski protein
trans citosolna strana pupanje
klatrin
mjehuri} obloèn klatrinom
slobodni klatrin
Slika 9-33. Ugradnja lizosomskih proteina u vezikule obloène klatrinom.

Proteini predodre|eni za smje{taj u lizosomima obiljeèni su manoza-6-fosfatom, koji se veè za receptore manoza-6-fosfata u trans Golgijevoj mreì. Receptori manoza-6-fosfata premo{}uju membranu Golgijeva aparata i sluè kao vezno mjesto za adaptorske proteine u citosolu, koji tada veù klatrin. Klatrin se sastoji od triju proteinskih lanaca koji se udruùju kako bi nastao retikul nalik ko{ari koja uvija membranu i pokre}e pupanje mjehuri}a.
Ve}ina transportnih vezikula obloèna je proteinima citosola, pa se nazivaju obloènim vezikulama. Opisane su tri vrste obloènih vezikula, za koje se ~ini da sudjeluju u razli~itim vrstama vezikularnoga prijenosa. Prve su bile otkrivene vezikule obloène klatrinom (slika 9-33), koje su odgovorne za unos izvanstani~nih molekula sa stani~ne membrane endocitozom (vidi 12. poglavlje) kao za i prijenos molekula iz trans Golgijeve mreè prema endosomima i lizosomima. Dvije druge vrste obloènih vezikula pupaju iz ER i Golgijeva kompleksa. Ove se vezikule nazivaju obloènim vezikulama bez klatrina, odnosno vezikulama obloènim COP (COP je skra}enica za engl. coat protein, oblaù}i protein). Jedna skupina ovih vezikula, vezikule obloène COPII, pupaju iz ER i nose svoj teret dalje du` sekrecijskoga puta do Golgijeva aparata. Za razliku od njih vezikule obloène COPI pupaju iz ER-Golgijeva me|uodjeljka ili Golgijeva aparata i sudjeluju u putu vra}anja koji zaustavlja proteine predodre|ene za ostanak u Golgijevu aparatu ili ER. Primjerice, vezikule obloène COPI prenose natrag proteine endoplazmatskog retikula koji su obiljeèni signalima KDEL ili KKXX za povratak iz ER-Golgijeva me|uodjeljka ili cis Golgijeve mreè. Koji su oblaù}i proteini, ukoliko uop}e postoje, uklju~eni u promet od jedne do druge cisterne Golgijeva aparata tijekom izlu~ivanja nije jo{ poznato. Za nastanak vezikula obloènih klatrinom u trans Golgijevoj mreì potreban je klatrin, dvije vrste proteina adaptora i ARF1 protein koji veè GTP . Sastavljanje ovog kompleksa odvija se vrlo precizno (slika 9-34). Prvo se kompleks ARF/GDP veè za proteine Golgijeve membrane. Faktor izmjene
387
ARF-gvaninskog nukleotida (eng. ARF-guanine nucleotide exchange factor), koji je smje{ten u membrani, potom poti~e izmjenu GDP s GTP-om. Kompleks ARF/GTP zapo~inje pupanje privla~enjem proteina adaptora, koji potom sluè kao vezna mjesta i za receptor manoza-6-fosfata i za klatrin. Klatrin sudjeluje u izgradnji ko{araste mreè koja uvija membranu i pokre}e pupanje vezikula. U nekom trenutku tijekom prijenosa GTP vezan za ARF1 hidrolizira se do GDP a nastali kompleks ARF/GDP otpu{ta se s membrane i reciklira. To , oslabljuje kooperativno vezanje oblaù}eg kompleksa, {to Hsp70 proteinima u citoplazmi omogu}uje da odvoje ve}inu oblaù}ih proteina od membrane vezikula. Neki od preostalih proteina stupaju u interakcije s posebnim tubulinskim molekularnim motorima i tako omogu}uju vezikulama koje se kre}u od trans Golgijeve mreè do endosoma i lizosoma da do svog cilja putuju du` mikrotubula na na~in opisan u 11. poglavlju.
citosol GTP
lumen ARF GDP ARFGEF
GDP
lizosomska hidrolaza
GGA receptor manoza-6-fosfata
Stapanje vezikula
Stapanje transportnih vezikula sa svojim kona~nim ciljem obuhva}a dvije vrste zbivanja. Prvo, transportna vezikula mora prepoznati ispravnu ciljnu membranu; primjerice, vezikula koja nosi lizosomske enzime treba dostaviti svoj teret samo lizosomima. Drugo, vezikula i ciljna membrana trebaju se stopiti, te predati sadràj vezikule ciljnoj organeli. Istraìvanja provedena tijekom nekoliko posljednjih godina dovela su do postavljanja nekoliko modela stapanja vezikula u kojima se ispravno prepoznavanje izme|u vezikule i njezina cilja (privezivanje) odvija na temelju me|udjelovanja membranskih proteina obiju strana, nakon ~ega slijedi stapanje njihovih fosfolipidnih dvosloja. Prvi proteini koji sudjeluju u stapanju vezikula otkriveni su u laboratoriju Jamesa Rothmana biokemijskom analizom in vitro uspostavljenih sustava za prijenos vezikulama iz stanice sisavaca (vidi sliku 9-31). Na osnovi istraìvanja proteina uklju~enih u stapanje vezikula u ovakvim rekonstruiranim vezikulama Rothman i suradnici predloìli su op}i model nazvan SNARE pretpostavka. (Naziv SNARE izveden je iz naziva SNAP receptor, gdje je SNAP naziv proteina uklju~enog u stapanje vezikula, o. p.). Prema toj pretpostavci stapanje vezikula odvija se na temelju ieeerakcije posebnih parova transmembranskih proteina nazvanih SNARE, od kojih se jedni nalaze na vezikuli (v-SNARE), a drugi na ciljnoj membrani (t-SNARE, od engl. target). Prema hipotezi, stvaranje kompleksa izme|u v-SNARE na vezikuli i t-SNARE na ciljnoj membrani dovodi do stapanja membrana. Podr{ku ovoj pretpostavci pruìla je identifikacija SNARE-proteina koji se nalaze na sinapti~kim vezikulama, te otkri}e da su kod mutanta kvasca s razli~itim poreme}ajima u vezikularnom transportu o{te}eni SNARE proteini. Primjerice, za prijenos iz ER u Golgijev aparat, kod kvasca su potrebni posebni SNARE-proteini koji su smje{teni i na vezikuli i na ciljnoj membrani. Nedavno je potvr|eno da su SNARE-proteini potrebni za stapanje vezikula s ciljnom membranom, te da SNARE/SNARE sparivanje osigurava energiju koja dovodi dva lipidna dvosloja dovoljno blizu da bi postali nestabilni i i na kraju se stopili. Me|utim, ~ini se da je pristajanje (engl. docking), privezivanje (engl. tethering) i stapanje (engl. fusing) transportnih vezikula posredovano slijedom nadogradnji proteinskoga kompleksa, na na~in vrlo sli~an procesu koji dovodi do pupanja vezikula. ^lanovi Rab-porodice malih proteina koji veù GTP imaju klju~nu ulogu u pristajanju transportnih vezikula. Rab proteini, poput proteina ARF-porodice, sudjeluju u mnogim reakcijama pupanja i stapanja tijekom vezikularnog transporta. Prona|eno je vi{e od 60 razli~itih Rab-proteina za koje je pokazano da sudjeluju u odre-
AP1
klatrin
Slika 9-34. Po~etak stvaranja mjehuri}a obloènog klatrinom s pomo}u ARF.

Mali protein koji veè GTP ARF, zapo, ~inje stvaranje klatrinom obloènih mjehuri}a na membrani trans Golgijeve mreè. Nakon {to se pribliì membrani, ARF/GDP se aktivira u ARF/GTP s pomo}u faktora izmjene gvaninskih nukleotida ARF. Kompleks ARF/GTP privu~e GGA-adaptorski protein do membrane, a ona opet, zbog interakcije s njegovim citosolskim repom, privu~e receptor manoza-6-fosfata za koji je ve} vezana lizosomska hidrolaza. GGA tako|er privla~i drugi adaptorski protein, AP1, koji sluì kao vezno mjesto za slaganje klatrinske obloge oko vezikule.
388
Poglavlje 9
lumen
citosol
Slika 9-35. Isporuka Rab proteina na membranu.

Mali Rab-protein koji veè GTP modificira se dodavanjem prenilne skupine, koja mu omogu}uje da se umetne u membranu (vidi sliku 7-37). Protein Rab u citosolu se nalazi vezan za inhibitor disocijacije GDP (GDI) koji ga odràva u Rab/GDP stanju. Kad se pribliì membrani, nespecifi~ni faktor uklanjanja GDI odvaja Rab/GDP od GDI i ume}e ga u membranu. Ako je prisutan ispravni faktor izmjene gvaninskih nukleotida, GDP vezan za Rab zamjenjuje se GTP i nastaje aktivni kompleks Rab/GTP koji moè djelovati na efektorske proteine. Ako ispravni faktor izmjene gvaninskih nukleotida nije prisutan, GDI }e ukloniti Rab/GDP s membrane i odnijeti ga do neke druge membrane.
izvr{ilac Rab Rab GEF
prenilna skupina
GDP GDI GDP faktor uklanjanja GDI
|enim zbivanjima vezikularnog transporta (tablica 9-1), uklju~uju}i i interakciju sa SNARE-proteinima koja regulira i olak{ava stvaranje SNARE/ SNARE kompleksa. Pojedina~ni Rab-proteini ili njihove kombinacije obiljeàvaju razli~ite organele i prijenosne vezikule, te je njihov smje{taj na ispravnoj membrani klju~ za uspostavljanje specifi~nosti transporta vezikulama (slika 9-35). Specifi~ni proteini inhibitori disocijacije GDP (GDI-proteini) prenose Rab-proteine kroz citosol u obliku koji veè GDP Dolaskom do membrane faktor . uklanjanja GDI uklanja GDI, a specifi~ni faktori izmjene gvaninskih nukleotida (GEF) pretvaraju kompleks Rab/GDP u njegov aktivni oblik Rab/ GTP Pojedina~ni faktori izmjene gvaninskih nukleotida smje{teni su na od. govaraju}im membranama i djeluju na odgovaraju}e ~lanove porodice Rab, te su na taj na~in odgovorni za stvaranje aktivnih Rab/GTP kompleksa na ispravnim mjestima na membrani. Ako nedostaje odgovaraju}i faktor izmjene, proteini Rab ostaju u obliku Rab/GDP i uklanjaju se s membrane. Kompleks Rab/GTP na transportnoj vezikuli inicira stapanje transportnih vezikula tako da povezuje proteine efektore i v-SNARE-proteine u pred-kompleks za stapanje (slika 9-36). Razli~iti Rab-proteini na ciljnoj membrani na sli~an na~in organiziraju druge efektorske proteine i tSNARE-proteine. Kad se transportna vezikula pribliì ciljnoj membrani, efektorski proteini povezuju membrane proteinskim interakcijama. Ovo privezivanje vezikula na ciljnu membranu omogu}uje v-SNARE-proteinima da stupe u kontakt s t-SNARE-proteinima. Svi SNARE-proteini imaju
Tablica 9-1. Rab-proteini koji veù GTP i mjesta njihova djelovanja

Korak u prijenosu
Egzocitoza od prijelaznog ER do Goldijeva aparata od Golgijeva aparata natrag do ER unutar Golgijeva aparata od trans Golgijeve mreè do stani~ne membrane Endocitoza od stani~ne membrane do ranih endosoma od ranih endosoma do stani~ne membrane od ranih do kasnih endosoma Posebne uloge egzocitoza sekretornih zrnaca od kasnih endosoma do trans Golgijeve mreè od trans Golgijeve mreè do bazolateralne membrane od trans Golgijeve mreè do apikalne membrane
Uklju~eni Rab-protein
Rab1, Rab1b, Rab2 Rab6, Rab6b Rab1, Rab6, Rab6b Rab11a, Rab11b Rab5a, Rab5b, Rab5c Rab4, Rab15, Rab18 Rab7 Rab8b Rab9, Rab11a, Rab11b Rab8a Rab21
Primjeri nekih od 60 proteina Rab kod sisavaca, ~iji su smje{taj i pretpostavljena uloga poznati.
389
Slika 9-36. Stapanje vezikula.

Stapanje vezikula zapo~inje kompleks Rab/GTP Specifi~ni proteini Rab na vezikuli i . ciljnoj membrani veù efektorske proteine i privezuju vezikulu za ciljnu membranu. Privezivanje omogu}uje me|udjelovanje v-SNARE i t-SNARE. Pletenasta podru~ja proteina SNARE spajaju se poput patentnog zatvara~a i time osiguravaju energiju potrebnu za priljubljivanje ciljne membrane i membrane vezikula. Priljubljivanje membrana ~ini nestabilnim lipidni dvosloj i vezikula se stapa s ciljnom membranom. Ove promjene u me|udjelovanjima proteina privla~e NSF i SNAP do SNARE kompleksa, te ga oni rastavljaju tro{e}i energiju dobivenu hidrolizom ATP .
vezikula v-SNARE
proteini
t-SNARE
cilj
duga~ku sredi{nju pletenastu domenu sli~nu onoj koju nalazimo u jezgrinim laminima (vidi sliku 8-31). Kao kod lamina, ova se domena sna`no povezuje s drugim pletenastim domenama i poput zatvara~a povezuje SNARE-proteine, ~ime dvije membrane dovodi u gotovo neposredan dodir. Ovo rezultira nestabilno{}u lipidnih dvosloja, te se oni spajaju. Nakon stapanja membrana kompleks NSF/SNAP rastavlja SNARE-kompleks i omogu}uje SNARE-proteinima da se ponovno upotrijebe u sljede}im stapanjima transportnih vezikula. Kako energija povezivanja SNARE-proteina pokre}e stapanje membrana, za njihovo razdvajanje potrebna je nova energija koja se dobiva hidrolizom ATP .
Lizosomi
Lizosomi su organele okruène membranom, koje sadràvaju niz enzima sposobnih razgraditi sve vrste biolo{kih polimera proteine, nukleinske kiseline, ugljikohidrate i lipide. Lizosomi djeluju kao probavni sustav stanice i sluè kako u razgradnji tvari unesenih izvana u stanicu, tako i u probavi dotrajalih dijelova same stanice. U svom najjednostavnijem obliku lizosomi izgledaju kao gusti okrugli mjehuri}i, ali mogu poprimiti vrlo razli~itu veli~inu i oblik ovisno o svojstvima onoga {to probavljaju (slika 9-37). Lizosomi su stoga morfolo{ki raznolike organele, koje su definirane zajedni~kom ulogom u razgradnji unutarstani~nih sastojaka.
membrane po~inju pucati
stapanje
Lizosomske kisele hidrolaze

Lizosomi sadràvaju oko 50 razli~itih enzima za razgradnju, koji hidroliziraju proteine, DNA, RNA, polisaharide i lipide. Mutacije gena koji kodiraju ove enzime odgovorne su za vi{e od 30 razli~itih nasljednih bolesti kod ljudi, nazvanih lizosomske bolesti odlaganja, jer se neprobavljeni sastojci nakupljaju u lizosomima oboljelih osoba. Ve}ina ovih bolesti nastaje zbog nedostatka samo jednoga lizosomskog enzima. Primjerice, Gaucherova bolest (naj~e{}i od ovih poreme}aja) nastaje zbog mutacije gena koji kodira lizosomski enzim potreban za razgradnju glikolipida. Zanimljiva iznimka jest inkluzijska bolest stanica (engl. I cell disease), koja je uzrokovana nedostatkom enzima koji katalizira prvi korak u obiljeàvanju lizosomskih enzima manoza-6-fosfatom u Golgijevu aparatu (vidi sliku 9-26), zbog ~ega se lizosomski enzimi uop}e ne mogu ugraditi u lizosome. Svi su lizosomski enzimi kisele hidrolaze, koje su aktivne u kiselom pH (oko 5) koji se odràva u lizosomima, a nisu aktivne pri neutralnom pH (oko 7,2) svojstvenom ostatku citoplazme (slika 9-38). Nu`nost kiselog pH za lizosomske enzime osigurava dvostruku za{titu od nekontrolirane razgradnje sastojaka citosola; ~ak ako se lizosomska membrana o{teti, ispu{tene kisele hidrolaze ne}e biti aktivne pri neutralnom pH citosola. Kako bi odràli svoj kiseli pH, lizosomi moraju aktivno koncentrirati H+ ione (protone). Ovo se ostvaruje s pomo}u protonskih crpki u lizosomskoj membrani, koje aktivno prenose protone iz citosola u lizosome. Za ovaj se prijenos
NSF
SNAPs
razgradnja SNARE-kompleksa
ADP
Pi
390
Poglavlje 9
Slika 9-37. Elektronskomikroskopska snimka lizosoma i mitohondrija u stanici sisavaca.

Lizosomi su ozna~eni strjelicama. (K. G. Murti / Visuals Unlimited.)
0,5 mm
tro{i energija dobivena hidrolizom ATP kako bi se odràla otprilike sto pu, ta ve}a koncentracija H+ iona unutar lizosoma.
Endocitoza i nastanak lizosoma

Jedna od glavnih uloga lizosoma jest probava sastojaka unesenih izvana endocitozom u stanicu, {to je detaljno obja{njeno u 12. poglavlju. Me|utim, uloga lizosoma u probavi sastojaka unesenih endocitozom ne odnosi se samo na njihovu funkciju, ve} i na njihov nastanak. Lizosomi zapravo nastaju stapanjem transportnih vezikula koje pupaju iz trans Golgijeve mreè s endosomima, a sadràvaju molekule unesene endocitozom sa stani~ne membrane. Nastanak endosoma i lizosoma stoga predstavlja raskri`je izme|u sekrecijskoga puta, tijekom kojeg se lizosomski enzimi dora|uju, i endocitoznog puta, kojim se izvanstani~ne molekule unose sa stani~ne povr{ine (slike 939). Sastojci iz okoline unose se u stanicu putem endocitoznih mjehuri}a obloènih klatrinom, koji pupaju sa stani~ne membrane i potom se stapaju s ranim endosomima. Sastojci membrane obnavljaju se tako da se vra}aju i ugra|uju natrag u stani~nu membranu (detaljno obja{njeno u 12. poglavlju), a rani endosomi postupno dozrijevaju u kasne endosome, koji su prethodnici lizosoma. Jedna od va`nih promjena tijekom dozrijevanja endosoma jest sniàvanje unutarnjeg pH do oko 5,5, {to je klju~no za lizosomske kisele hidrolaze koje dolaze iz trans Golgijeve mreè.
lizosom
pH 5 H+
ADP
Slika 9-38. Organizacija lizosoma.

H+ pH 7 citosol
Lizosomi sadràvaju niz kiselih hidrolaza, koje su aktivne pri kiselom pH koji se odràva u lizosomu, a nisu aktivne pri neutralnom pH citosola. Kiseli pH unutar lizosoma nastaje djelovanjem protonskih crpki u lizosomskoj membrani koja ubacuje protone iz citosola tro{e}i ATP hidrolizom.
391
izvan stanice
Slika 9-39. Endocitoza i nastanak lizosoma.

Molekule izvan stanice unose se u endocitozne vezikule, koje se stapaju s ranim endosomima. Sastojci membrane vra}aju se u stani~nu membranu, a rani endosomi dozrijevaju u kasne endosome. Transportne vezikule, koje nose kisele hidrolaze iz Golgijeva aparata, stapaju se s kasnim endosomima, koji dozrijevaju u lizosome kad steknu cijeli raspon lizosomskih enzima. Kisele se hidrolaze odvajaju od receptora manoza-6-fosfata kad se transportna vezikula stopi s kasnim endosomom, a receptori se vra}aju u Golgijev aparat.
vra}anje do stani~ne membrane
endocitozna vezikula
rani endosom
otpu{tanje hidrolaza
kasni endosom
kisela hidrolaza transportna vezikula koja nosi kisele hidrolaze
receptor manoza-6-fosfata
obnavljanje receptora
lizosom Golgijev aparat
392
Poglavlje 9
Gaucherova bolest
Bolest
Gaucherova bolest je naj~e{}a od lizosomskih bolesti odlaganja, koje su uzrokovane nemogu}no{}u lizosoma da razgrade tvari koje bi u zdrave osobe razgradili. Nakupljanje nerazgra|enih sastojaka dovodi do pove}anja veli~ine i broja lizosoma u stanici, {to moè dovesti do stani~nih poreme}aja i patolo{kih promjena na zahva}enim organima. Gaucherova bolest zahva}a poglavito ìdovsku populaciju s u~estalo{}u od jednog oboljelog na 2.500 ljudi. Postoje tri tipa ove bolesti, koji se razlikuju po teìni i po tome je li uklju~en ìv~ani sustav. U naj~e{}em obliku bolesti (tip I) ìv~ani je sustav neo{te}en, a simptomi bolesti su pove}ana jetra i slezena, te nastanak ko{tanih o{te}enja. Mnogi bolesnici s ovim oblikom bolesti nemaju ozbiljnijih simptoma i duljina ìvota im je nepromijenjena. Ozbiljniji oblici bolesti (tip II i III) mnogo su rje|i i zahva}aju i ìdovsku i neìdovsku populaciju. Najteì je tip III, u kojem su te{ki neurolo{ki poreme}aji vidljivi ve} u djetinjstvu, te oboljeli rano umiru. Tip II je po teìni izme|u tipa I i III, a ozna~uje ga po~etak neurolo{kih simptoma oko desete godine ìvota. je zbog mutacije prolin zamijenjen leucinom imat }e teè o{te}en enzim i razvit }e se tip II ili III. Osim u vrlo rijetkim oblicima tipa II i III, jedine stanice koje su zahva}ene bole{}u su makrofagi. Kako je njihova uloga uklanjanje dotrajalih i o{te}enih stanica fagocitozom, makrofagi stalno unose velike koli~ine lipida, koji se razgra|uju u lizosomima. Nedostatnost glukocerebrozidaze je stoga posebno vidljiva u makrofagima slezene i jetre, {to je u skladu s ~injenicom da se prve promjene u ve}ini slu~ajeva Gaucherove bolesti na|u u ovim organima. receptore koji veù ostatke manoze u glikoproteinima me|ustani~ne tvari i potom unose ove proteine u stanicu endocitozom. Ovaj je nalaz uputio na terapijsko uzimanje glukocerebrozidaze koja bi bila modificirana u smislu posjedovanja manoznih ostataka. Enzim dobiven iz ljudske posteljice bio je modificiran na odgovaraju}i na~in, te su klini~ke studije jasno pokazale u~inkovitost ovakvog lije~enja Gaucherove bolesti. Na àlost, nadomje{tanje enzima kao na~in lije~enja Gaucherove bolesti izuzetno je skupo: cijena enzima za lije~enje jednoga oboljelog u preporu~enim dozama je izme|u 500.000 i 5,000.000 kuna godi{nje. Tro{kovi ovakva lije~enja daleko su izvan mogu}nosti samih bolesnika, {to je otvorilo {iroku javnu raspravu o tro{kovima skupih lijekova u lije~enju rijetkih poreme}aja.
Gaucherova je bolest izvrstan primjer bolesti koja se moè lije~iti nadomje{tanjem enzima, jer uzimanje egzogenog enzima moè ispraviti njegovu nedostatnost. Ovaj pristup lije~enju lizosomskih bolesti odlaganja predloìo je Christian deDuve {ezdesetih godina pro{loga stolje}a, na temelju zamisli da bi enzimi uneseni izvana mogli biti preuzeti u stanicu endocitozom, te potom preneseni do lizosoma. U tipu I Gaucherove bolesti ovaj je pristup posebno prihvatljiv, jer je jedina ciljna stanica makrofag. Sedamdesetih je godina 20. stolje}a utvr|eno da makrofazi na svojoj povr{ini posjeduju
References
Beutler, E. 1996. The cost of treating Gaucher s disease. Nature Med. 2: 523524. Zhao, H. and G. A. Grabowski. 2002. Gaucher disease: prespectives on a prototype lysosomal disease. Cell. Mol. Life Sci. 59: 694707.

Gaucherova je bolest uzrokovana nedostatkom lizosomskog enzima glukocerebrozidaze, koji katalizira hidrolizu glukocerebrozida u glukozu i ceramid (vidi sliku). Ova nedostatnost enzima otkrivena je 1965. godine, a odgovor ni gen kloniran je 1985. godine. Od tada je prona|eno vi{e od 30 razli~itih mutacija odgovor nih za Gaucherovu bolest. Zanimljivo je da se teìna bolesti ve}inom moè predvidjeti na osnovi ovih mutacija. Primjerice, oboljeli nositelji mutacije, koja dovodi do relativno po{tedne zamjene aminokiseline serina asparaginom, imat }e tip I bolesti. Oboljeli kod kojih
O CH2 HC HCOH NH C O glukoza glukocerebrozidaza
OH CH2
HC HCOH
NH C O
glukocerebrozid
Nedostatnost enzima u Gaucherovoj bolesti zaustavlja hidrolizu glukocerebrozida u glukozu i ceramid.
ceramid
393
autofagija
fagocitoza
bakterija
endoplazmatski retikul fagosom fagocitoza
lizosom mitohondrij
autofagosom
fagolizosomi
Kao {to je obja{njeno prije, kisele se hidrolaze usmjeruju prema lizosomima dodavanjem manoza-6-fosfata, koji prepoznaju receptori manoza-6-fosfata u trans Golgijevoj mreì i pakiraju ga u vezikule obloène klatrinom. Nakon {to odbace klatrinski omota~ ove se vezikule stapaju s kasnim endosomima i kiseli pH uzrokuje razdvajanje hidrolaza od receptora manoza-6fosfata (vidi sliku 9-39). Hidrolaze se tako otpu{taju u lumen endosoma, dok receptori ostaju u membrani i eventualno se obnavljaju vra}aju}i se u Golgijev aparat. Kasni endosomi dozrijevaju u lizosome, jer na ovaj na~in steknu cijeli raspon kiselih hidrolaza, koje onda probavljaju molekule izvorno unesene endocitozom.
Slika 9-40. Lizosomi u fagocitozi i autofagiji.

U fagocitozi se velike ~estice (primjerice bakterije) unose u fagocitozne mjehuri}e ili fagosome. U autofagiji, vlastite se organele (kao {to su mitohondriji) zaokruè dijelovima membrane dobivenim od ER i nastaju autofagosomi. I fagosomi i autofagosomi stapaju se s lizosomima i stvaraju velike fagolizosome, koji probavljaju svoj sadràj.
Fagocitoza i autofagija
Osim razgradnje molekula unesenih endocitozom lizosomi probavljaju sastojke koji dolaze iz drugih dvaju procesa: fagocitoze i autofagije (slika 940). U fagocitozi, specijalizirane stanice, kao {to su makrofagi, unose i razgra|uju velike ~estice, uklju~uju}i bakterije, stani~ni debris i dotrajale stanice koje se moraju ukloniti iz tijela. Ove se velike ~estice unose u fagocitozne vezikule (fagosome), koje se potom stapaju s lizosomima, {to dovodi do probavljanja njihova sadràja. Lizosomi nastali na ovaj na~in (fagolizo-
394
Poglavlje 9
somi) mogu biti prili~no veliki i razli~iti, jer su njihova veli~ina i oblik odre|eni sadràjem koji se probavlja. Lizosomi su tako|er odgovorni za autofagiju, postupnu razgradnju dotrajalih ili suvi{nih stani~nih dijelova (obja{njeno u 7. poglavlju). Prvi korak u autofagiji predstavlja okruìvanje organele (primjerice mitohondrija) membranom dobivenom od ER. Nastala vezikula (autofagosom) potom se stapa s lizosomom, a sadràj se probavlja (vidi sliku 9-40).
KLJU^NI POJMOVI
S A @ E TA K ENDOPLAZMATSKI RETIKUL
endoplazmatski retikul (ER), hrapavi ER, prijelazni ER, glatki ER, sekrecijska vezikula, sekrecijski put
Endoplazmatski retikul i izlu~ivanje proteina: Endoplazmatski je retikul prvo raskri`je u razvrstavanju proteina. U stanicama se sisavaca proteini predodre|eni za izlu~ivanje, smje{taj u lizosomima ili stani~noj membrani sintetiziraju na ribosomima vezanim za membranu i prebacuju u hrapavi ER tijekom same translacije. Usmjerivanje proteina u endoplazmatski retikul: Proteini mogu biti uneseni u ER tijekom translacije ili kad je translacija u citosolu zavr{ena. U stanicama sisavaca ve}ina se proteina prenosi u ER tijekom translacije na ribosomima vezanim za membranu. Ribosomi koji sudjeluju u sintezi proteina namijenjenih izlu~ivanju usmjeruju se prema endoplazmatskom retikulu signalnim sljedovima na amino-kraju polipeptidnoga lanca. Novonastali polipeptidni lanci tada se prenose u lumen ER kroz proteinske kanale i otpu{taju u lumen ER nakon uklanjanja signalnoga slijeda. Ugradnja proteina u membranu ER: Membranski proteini stani~ne membrane ili membrana ER, Golgijeva aparata i lizosoma uvijek se prvo ugra|uju u membranu ER. Umjesto da se prebace u lumen ER, ovi proteini se usidre u membranu a-uzvojnicama, koje zaustavljaju prijenos novonastalog polipeptidnog lanca preko membrane.
signalni slijed, mikrosom, ~estica za prepoznavanje signala (SRP), srpRNA, SRP-receptor, translokon, signalna peptidaza
protein-disulfid-izomeraza, glikozilfosfatidilinozitolno (GPI) sidro, kalneksin, kalretikulin
Smatanje i dorada proteina u ER: Smatanje polipeptidnih lanaca u njihov pravilni trodimenzionalni oblik odvija se u ER. ER je tako|er mjesto N-glikozilacije i dodavanja GPI-sidara. Oni proteini koji se ne mogu ispravno smotati izdvajaju se iz sekrecijskoga puta i obiljeàvaju za razgradnju. Glatki ER i sinteza lipida: ER je glavno mjesto sinteze lipida u eukariotskoj stanici, a glatki ER je posebno obilan u stanicama koje su aktivne u metabolizmu lipida i detoksikaciji lijekova topljivih u lipidima. Odlazak proteina i lipida iz ER: Proteini i lipidi se iz ER prema Golgijevu aparatu prenose u vezikulama. Proteini koji djeluju u samom ER obiljeèni su sljedovima koji ih vra}aju iz Golgijeva aparata natrag u ER recikla`nim putem. Drugi ciljni sljedovi potpomaù selektivno pakiranje i izlazak proteina u vezikule koje ih zatim odnose do Golgijeva aparata.
flipaza
395
GOLGIJEV APARAT
Organizacija Golgijeva aparata: Golgijev aparat sudjeluje u doradi i razvrstavanju proteina, kao i u sintezi lipida i polisaharida. Proteini se prenose iz endoplazmatskog retikula do cis Golgijeve mreè. Odatle odlaze do Golgijeva stoga, koji je mjesto najja~e metaboli~ke aktivnosti Golgijeva aparata. Preina~eni proteini odlaze iz Golgijeva stoga u trans Golgijevu mreù, gdje se razvrstavaju i pakiraju u vezikule za prijenos do endosoma, lizosoma, stani~ne membrane ili izvan stanice. Glikozilacija proteina u Golgijevu aparatu: N-vezani oligosaharidi se na proteine veù u ER, a dora|uju se u Golgijevu aparatu. Proteinima predodre|enima za smje{taj u lizosomima fosforiliraju se manozni ostatci, pa manoza-6-fosfat sluì kao signal koji usmjeruje njihov prijenos prema lizosomima iz trans Golgijeve mreè. O-glikozilacija se tako|er odvija u Golgijevu aparatu. Metabolizam lipida i polisaharida u Golgijevu aparatu: Golgijev je aparat mjesto sinteze glikolipida, sfingomijelina i sloènih polisaharida biljne stani~ne stijenke. Razvrstavanje proteina i njihov odlazak iz Golgijeva aparata: Proteini se razvrstavaju u trans Golgijevoj mreì i pakiraju u transportne vezikule namijenjene za izlu~ivanje, ili za smje{taj u stani~noj membrani, lizosomima ili vakuolama kvasaca i biljaka. U polariziranim se stanicama proteini usmjeruju prema apikalnim ili bazolateralnim podru~jima stani~ne membrane.
apikalno podru~je, bazolateralno podru~je, vakuola Golgijev aparat, Golgijev kompleks, cis Golgijeva mreà, Golgijev stog, trans Golgijeva mreà
manoza-6-fosfat, signalna ploha
MEHANIZAM VEZIKULARNOGA TRANSPORTA

Eksperimentalni pristup razumijevanju vezikular noga transporta: Mehanizam vezikularnoga transporta razja{njen je na temelju prou~avanja mutanata kvasca, in vitro uspostavljenih sustava bez stanica i sinapti~kih vezikula. Odabir tereta, oblaù}i proteini i pupanje vezikula: Citoplazmatska strana vezikula obloèna je proteinima koji pokre}u pupanje vezikule i odabiru molekule koje }e biti prenesene. Stapanje vezikula: Vezanje vezikula za ispravnu ciljnu membranu odvija se me|udjelovanjem parova transmembranskih proteina koji dovode do stapanja membrana.
sinapti~ka vezikula
vezikula obloèna klatrinom vezikula obloèna s COP
SNARE hipoteza, Rab
LIZOSOMI
Lizosomske kisele hidrolaze: Lizosomi sadràvaju niz kiselih hidrolaza koje razgra|uju proteine, nukleinske kiseline, polisaharide i lipide. Ovi enzimi djeluju samo pri kiselom pH koji se odràva u lizosomima. Endocitoza i nastanak lizosoma: Molekule koje se u stanicu unose endocitozom, prenose se do endosoma, koji dozrijevaju u lizosome kad prime lizosomske kisele hidrolaze iz Golgijeva aparata. Fagocitoza i autofagija: Lizosomi su odgovorni za razgradnju velikih ~estica unesenih fagocitozom i za postupnu razgradnju vlastitih stani~nih sastojaka autofagijom.
lizosom, lizosomske bolesti odlaganja endocitoza, endosom
fagocitoza, fagosom, fagolizosom, autofagija, autofagosom
396
Poglavlje 9
Pitanja
1. Koji je izvor ni pokus pokazao da je sekrecijski put: ER Golgijev aparat sekrecijska vezikula izlu~eni protein? 2. Kako je in vitro transkripcija mRNA uputila na postojanje signalnoga slijeda koji usmjeruje budu}i sekrecijski protein u hrapavi endoplazmatski retikul? 3. Utvrdi razlike izme|u kotranslacijskog i posttranslacijskoga prijenosa polipeptidnih lanaca u endoplazmatski retikul, uklju~uju}i i {to ih pokre}e. 4. Protein Sec61 klju~ni je sastojak proteinskog kanala kroz membranu ER. U stanici kvasca u kojoj je protein Sec61 mutiran, koja je sudbina proteina predodre|enih za smje{taj u Golgijevu aparatu? 5. Za{to su oligosaharidni lanci glikoproteina stani~ne membrane uvijek okrenuti izvan stanice? 6. Kakvo bi bilo djelovanje mutacije ili delecije slijeda KDEL proteina endoplazmatskog retikula, kao {to je BiP te bi li , posljedice bile iste, ako bi sli~na ili razli~ita mutacija onemogu}ila protein koji je KDEL receptor? 7. Kako se lizosomski proteini (primjerice neka od lizosomskih hidrolaza) usmjeruju prema lizosomu? 8. Kakvo bi djelovanje imao dodatak signala za usmjerivanje prema lizosomu, na protein koji se normalno nalazi u citosolu? Kako bi se to odrazilo na protein koji se normalno izlu~uje? 9. Koja je pretpostavljena sudbina lizosomskih kiselih hidrolaza u inkluzijskoj bolesti stanica, u kojim stanicama nedostaje enzim potreban za sintezu manoza6-fosfata? 10. Koja zbivanja dovode do toga da se glikolipidi i sfingomijelin mogu na}i u vanjskoj, a ne u unutra{njoj polovici lipidnoga dvosloja stani~ne membrane? 11. Koji je pokus pokazao da se izme|u cisterni Golgijeva aparata proteini prenose vezikulama? 12. Bolesnik koji dolazi u va{u kliniku pati od nakupljanja glukocerebrozida u lizosomima. Koja je va{a dijagnoza i koju terapiju treba preporu~iti, ako tro{kovi nisu ograni~avaju}i ~imbenik?
Literatura
Endoplazmatski retikul
Abeijon, C. and C. B. Hirschberg. 1992. Topography of glycosylation reactions in the endoplasmic reticulum. Trends. Biochem. Sci. 17: 3236. P Antonny, B. and R. Schekman. 2001. ER export: public transportation by the COPII coach. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 438443. P Beckmann, R., D. R. Bubeck, P Grassuci, A. . Penczek, G. Verschoor, G. Blobel and J. Frank. 1997. Alignment of conduits for the nascent polypeptide chain in the ribosomeSec61 complex. Science 278: 21232130. I Bishop, W. R. and R. M. Bell. 1988. Assembly of phospholipids into cellular membranes: Biosynthesis, transmembrane movement, and intracellular translocation. Ann. Rev. Cell Biol. 4: 580610. P Blobel, G. and B. Dobberstein. 1975. Transfer of proteins across the membrane. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J. Cell Biol. 67: 835851. I Ellgaard, L. and A. Helenius. 2001. ER quality control: towards an understanding at the molecular level. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 431437. P Englund, P T. 1993. The structure and bio. synthesis of glycosyl phosphatidylinositol anchors. Ann. Rev. Biochem. 62: 121138. P Fiedler, K. and K. Simons. 1995. The role of N-glycans in the secretory pathway. Cell 81: 309312. P Glick, B. S. 2001. ER export: more than one way out. Curr. Biol. 11: R361R363. P Haucke, V. 2003. Vesicle budding: A coat for the COPs. Trends Cell Biol. 13: 5960. P Kent, C. 1995. Eukaryotic phospholipid biosynthesis. Ann. Rev. Biochem. 64: 315343. P Matlack, K. E. S., B. Misselwitz, K. Plath and T. A. Rapoport. 1999. BiP acts as a molecular ratchet during posttranslational transport of prepro-a factor across the ER membrane. Cell 97: 553564. I Menon, A. K. 1995. Flippases. Trends Cell Biol. 5: 355360. P Palade, G. 1975. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science 189: 347358. P Powers, T. and P Walter. 1997. A ribosome at . the end of the tunnel. Science 278: 2072 2073. P Singer, S. J. 1990. The structure and insertion of integral proteins in membranes. Ann. Rev. Cell Biol. 6: 247296. P Udenfriend, S. and K. Kodukula. 1995. How glycosylphosphatidylinositol anchored membrane proteins are made. Ann. Rev. Biochem. 64: 563591. P Barr, F. A. 2002. The Golgi apparatus: Going round in circles? Trends Cell Biol. 12: 101 104. P Brodsky, F. M., C. Y. Chen, C. Knuehl, M. C. Towler and D. E. Wakeham. 2001. Biological basket weaving: Formation and function of clathrin-coated vesicles. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 517568. P Chrispeels, M. J. and N. V. Raikhel. 1992. Short peptide domains target proteins to plant vacuoles. Cell 68: 613616. P Conibear, E. and T. H. Stevens. 1995. Vacuolar biogenesis in yeast: Sorting out the sorting proteins. Cell 83: 513516. P Driouich, A., L. Faye and L. A. Staehelin. 1993. The plant Golgi apparatus: A factory for complex polysaccharides and glycoproteins. Trends Biochem. Sci. 18: 210214. P Farquhar, M. G. and G. E. Palade. 1998. The Golgi apparatus: 100 years of progress and controversy. Trends Cell Biol. 8: 210. P Folsch, H., H. Ohno, J. S. Bonifacino and I. Mellman. 1999. A novel clathrin adaptor complex mediates basolateral targeting in polarized epithelial cells. Cell 99: 189196. I Glick, B. S. 2002. Can the Golgi form de novo? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3: 615619. P Hirschberg, C. B. and C. B. Snider. 1987. Topography of glycosylation in the rough endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Ann. Rev. Biochem. 56: 6387. P Kirchhausen, T. 2002. Clathrin adaptors really adapt. Cell 109: 413416. P
Golgijev aparat
Baranski, T. J., P L. Faust and S. Kornfeld. . 1990. Generation of a lysosomal enzyme targeting signal in the secretory protein pepsinogen. Cell 63: 281291. I
397
Kornfeld, R. and S. Kornfeld. 1985. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Ann. Rev. Biochem. 54: 631664. P Mostov, K., M. B. A. ter Beest and S. J. Chapin. 1999. Catch the 1B train to the basolateral surface. Cell 99: 121122. P Pearse, B. M. 1975. Coated vesicles from pig brain: purification and biochemical characterization. J. Mol. Biol. 97: 9398. I Rothman, J. E. 1994. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature 355: 409415. P Tooze, S. A., G. J. Martens and W. B. Huttner. 2001. Secretory granule biogenesis: Rafting to the SNARE. Trends Cell Biol. 11: 116122. P Varki, A. 1998. Factors controlling the glycosylation potential of the Golgi apparatus. Trends Cell Biol. 8: 3440. P
Chen, Y. A. and R. H. Scheller. 2001. SNAREmediated membrane fusion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 98106. P Gruenberg, J. 2001. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 721730. P Jahn, R., T. Lang and T. C. Sudhof. 2003. Membrane fusion. Cell 112: 519533. P Novick, P and P Brennwald. 1993. Friends . . and family: The role of the Rab GTPases in vesicular traffic. Cell 75: 597601. P Novick, P C. Field and R. Schekman. 1980. ., Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell 21: 205215. I Pelham, H. R. 2001. SNAREs and the specificity of membrane fusion. Trends Cell Biol. 11: 99101. P Pfeffer, S. 2003. Membrane domains in the secretory and endocytic pathways. Cell 112: 507517. P Rizo, J. and T. C. Sudhof. 2002. Snares and Munc18 in synaptic vesicle fusion. Nat. Rev. Neurosci. 3: 641653. P Segev, N. 2001. Ypt and Rab GTPases: Insight into functions through novel interactions. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 500511. P
Sllner, T., S. W. Whiteheart, M. Brunner, H. Erdjument-Bromage, S. Geromanos, P . Tempst and J. E. Rothman. 1993. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature 362: 318324. I
Lizosomi
Dunn, W. A., Jr. 1994. Autophagy and related mechanisms of lysosome-mediated protein degradation. Trends Cell Biol. 4: 139143. P Forgac, M. 1999. Structure and properties of the vacuolar (H+)-ATPases. J. Biol. Chem. 274: 1295112954. P Fukuda, M. 1991. Lysosomal membrane glycoproteins. J. Biol. Chem. 266: 2132721330. P Ghosh, P N. M. Dahms and S. Kornfeld. 2003. ., Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 202213. P Kornfeld, S. and I. Mellman. 1989. The biogenesis of lysosomes. Ann. Rev. Cell Biol. 5: 483525. P Neufeld, E. F. 1991. Lysosomal storage diseases. Ann. Rev. Biochem. 60: 257280. P
Mehanizam vezikular noga transporta

Balch, W. E., W. G. Dunphy, W. A. Braeli and J. E. Rothman. 1984. Reconstitution of the transport of protein between successive compartments of the Golgi measured by the coupled incorporation of N-acetylglucosamine. Cell 39: 405416. I
Poglavlje
10
Bioenergetika i metabolizam
Mitohondriji, kloroplasti i peroksisomi
Mitohondriji 399 Mehanizam oksidativne fosforilacije 408 Kloroplasti i ostali plastidi 415 Fotosinteza 422 Peroksisomi 426
KLJU^NI POKUS:
Kemiosmoti~ka teorija 412
Bolesti mitohondrija: Leberova hereditarna opti~ka neuropatija 406
ski organeli pruàju i mogu}nost specijalizacije pojedinih stani~nih odjeljaka za specifi~ne metaboli~ke procese. Proizvodnja metaboli~ke energije glavna je aktivnost svih stanica, a dva citoplazmatska organela posebice su posve}ena energetskom metabolizmu i proizvodnji ATP Mitohondriji su . odgovorni za proizvodnju glavnine uporabljive energije oslobo|ene razgradnjom lipida i ugljikohidrata, dok kloroplasti koriste energiju dobivenu od Sun~eva svjetla za proizvodnju ATP i reduktivnog potencijala potrebnoga za sintezu ugljikohidrata iz CO2 i H2O. Tre}i organel o kojem se govori u ovom poglavlju je peroksisom. Peroksisomi sadràvaju enzime uklju~ene u razli~ite metaboli~ke puteve, kao {to su primjerice razgradnja masnih kiselina i metabolizam nusprodukata fotosinteze. Mitohondriji, kloroplasti i peroksisomi se od organela o kojima se govorilo u prethodnom poglavlju ne razlikuju samo po funkciji, ve} i po na~inu na koji nastaju. Umjesto da se sintetiziraju na ribosomima vezanim za membranu i zatim premje{taju u endoplazmatski retikul, proteini namijenjeni peroksisomima, mitohondrijima i kloroplastima sintetiziraju se na slobodnim ribosomima u citosolu, a u ciljni se organel unose kao cjeloviti polipeptidni lanci. Osim toga mitohondriji i kloroplasti imaju i vlastite genome koji se prepisuju i prevode unutar organela, te je stoga usmjerivanje proteina u citoplazmatske organele o kojima je rije~ u ovom poglavlju, zna~ajno druga~ije od puteva vezikularnog transporta koji povezuju endoplazmatski retikul, Golgijevo tjele{ce, lizosome i stani~nu membranu.
SIM NJIHOVE ULOGE U RAZVRSTAVANJU I TRANSPORTU PROTEINA, citoplazmat-
Mitohondriji
Mitohondriji igraju klju~nu ulogu u proizvodnji metaboli~ke energije u eukariotskoj stanici. Kao {to je prikazano u 2. poglavlju, oni su odgovorni za stvaranje najve}eg dijela uporabljive energije oslobo|ene razgradnjom ugljikohidrata i masnih kiselina koja se procesom oksidativne fosforilacije pretvara u ATP Glav.
400
Poglavlje 10
ni proteini mitohondrija sintetiziraju se na slobodnim ribosomima citosola, a u organele se usmjeruju specifi~nim signalima za navo|enje. Mitohondriji su jedinstveni me|u citoplazmatskim organelima jer sadràvaju vlastitu DNA koja kodira transportne RNA (tRNA), ribosomne RNA (rRNA) i neke od proteina mitohondrija. Mitohondriji su stoga izgra|eni dijelom od proteina kodiranih vlastitim genomom i sintetiziranih unutar organela, a dijelom od proteina kodiranih genomom jezgre i unesenih iz citosola.
Organizacija i funkcija mitohondrija

Mitohondriji su okruèni dvostrukim sustavom membrana, sastavljenim od unutarnje i vanjske membrane koje su odijeljene me|umembranskim prostorom (slika 10-1). Unutarnja membrana mitohondrija oblikuje brojne nabore (kriste, lat. cristae), koji se proteù u unutra{njost (matriks) organela. Svaka od tih komponenata ima razli~itu funkciju, a zajedno s matriksom i unutarnjom membranom predstavljaju glavne radne odjeljke mitohondrija. Matriks sadràva geneti~ki sustav mitohondrija i enzime nu`ne za sredi{nje reakcije oksidativnog metabolizma (slika 10-2). Kao {to je prikazano u 2. poglavlju, oksidativna razgradnja glukoze i masnih kiselina glavni je izvor metaboli~ke energije animalnih stanica. Po~etni stupanj metabolizma glukoze (glikoliza) zbiva se u citosolu gdje se glukoza pretvara u piruvat (vidi sliku 2-32). Piruvat se zatim prenosi u mitohondrije, gdje se njegovom kompletnom oksidacijom do CO2 proizvodi ve}ina korisne energije (ATP) dobivene metabolizmom glukoze. Ovaj proces uklju~uje po~etnu oksidaciju piruvata do acetil CoA, koji se tada preko ciklusa limunske kiseline razgra|uje do CO2 (vidi slike 2-33 i 2-34). Oksidacijom masnih kiselina tako|er nastaje acetil CoA (vidi sliku 2-36), koji se poput onog nastalog iz glukoze metabolizira u ciklusu limunske kiseline u mitohondrijima, te su stoga enzimi ciklusa limunske kiseline (smje{teni u matriksu mitohondrija) klju~ni ~imbenici u oksidativnoj razgradnji i ugljikohidrata i masnih kiselina. Oksidacija acetil CoA do CO2 zdruèna je s redukcijom NAD+ i FAD u NADH i FADH2. Glavnina energije nastale oksidativnim metabolizmom za-
Slika 10-1. Struktura mitohondrija.

Mitohondriji su ome|eni dvostrukim sustavom membrana sastavljenim od unutarnje i vanjske membrane. Nabori unutarnje membrane (kriste) izduùju se u matriks. (Mikrografija prema K. R. Porter/Photo Researchers, Inc.)
kriste matriks unutarnja membrana vanjska membrana me|umembranski prostor
0,5 mm
401
piruvat
masne kiseline
Slika 10-2. Metabolizam u matriksu mitohondrija.

Piruvat i masne kiseline unose se iz citosola i pretvaraju u acetil-CoA u matriksu mitohondrija. Acetil-CoA se poslije oksidira do CO2 u ciklusu limunske kiseline, sredi{njem putu oksidativnog metabolizma.
piruvat
acetil CoA masne kiseline ciklus limunske kiseline NADH
NADH
CO2
FADH2 NADH vanjska membrana unutarnja membrana
O2 matriks
tim se proizvodi procesom oksidativne fosforilacije (prikazanom u sljede}em odlomku) koji se zbiva na unutarnjoj membrani mitohondrija. Visoko energetski elektroni iz NADH i FADH2 prenose se kroz seriju nosa~a u membrani na molekularni kisik. Energija koja se osloba|a reakcijama prijenosa elektrona pretvara se u potencijalnu energiju pohranjenu u gradijentu protona kroz membranu koja se zatim koristi za sintezu ATP Unutra{nja . membrana mitohondrija glavno je mjesto proizvodnje ATP a ta presudna , uloga odraàva se u njezinoj strukturi. Prvo, povr{ina membrane je znatno pove}ana nabiranjem u kriste. Nadalje, unutarnja membrana mitohondrija sadràva neobi~no visok udio proteina (vi{e od 70%) koji su uklju~eni u oksidativnu fosforilaciju i transport metabolita (primjerice piruvata i masnih kiselina) izme|u citosola i mitohondrija. Osim toga unutarnja je membrana nepropusna za ve}inu iona i male molekule, a upravo je to svojstvo najzna~ajnije za odràvanje gradijenta protona koji pokre}e oksidativnu fosforilaciju. Za razliku od unutra{nje membrane, vanjska membrana mitohondrija vrlo je propusna za male molekule jer sadràva proteine nazvane porini koji oblikuju kanale i dopu{taju slobodnu difuziju molekula manjih od 1.000 daltona. Zbog toga je sastav iona i malih molekula me|umembranskoga prostora sli~an citosolu, unutarnja membrana mitohondrija djeluje kao barijera za prolazak malih molekula izme|u citosola i matriksa, te odràva gradijent protona koji pokre}e oksidativnu fosforilaciju.
Geneti~ki sustav mitohondrija

Mitohondriji imaju vlastiti geneti~ki sustav, koji je odijeljen i razli~it od genoma jezgre stanice. Kao {to je prikazano u 1. poglavlju, smatra se da su se mitohondriji razvili od bakterija koje su uspostavile simbioti~ki odnos unutar ve}ih stanica u kojima ìve (endosimbioza). Ova hipoteza nedavno je potkrijepljena rezultatima analize slijeda nukleotida u DNA koja je pokazala izrazite sli~nosti izme|u genoma mitohondrija i bakterije Rickettsia prowazekii. Bakterije roda Rickettsia su unutarstani~ni paraziti koji se, kao i mitohondriji, razmnoàvaju samo unutar eukariotske stanice. U skladu s njihovim sli~nim na~inom ìvota, slijed DNA bakterija roda Rickettsia i mitohondrija sugerira da oni imaju zajedni~koga pretka od kojeg se razvio geneti~ki sustav dana{njih mitohondrija. Genomi mitohondrija obi~no su kru`ne molekule DNA sli~ne bakterijskim genomima, a prisutne su u velikom broju kopija po organeli. Veli~ina
402
Poglavlje 10
12S rRNA 16S rRNA

V
D petlja
P
III
F E
I I
L H
L Q I S
I
A C Y
I
W N S K R G
I I
IV V V
IV
IV
D
Slika 10-3. Genom mitohondrija ~ovjeka.

Genom sadràva 13 kodiraju}ih sljedova koji odre|uju strukturu proteina koji ulaze u strukturu respirator nih kompleksa I, III, IV ili V. Osim njih genom sadràva i gene za 12S i 16S rRNA i 22 tRNA (obiljeène jednoslovnom oznakom aminokiseline). Podru~je genoma ozna~eno D petlja sadràva ishodi{te replikacije DNA i promotore transkripcije.
Tablica 10-1. Razlike izme|u univerzalnoga geneti~kog kda i geneti~kog kda mitohondrija
Kd Univerzalni mitohondrija Kodon kd ~ovjeka
UGA AGA AGG AUA STOP Arg Arg Ile Trp STOP STOP Met
U mitohondrijima kvasaca i biljaka drugi se kodoni razlikuju od univerzalnoga koda.
mitohondrijskoga genoma znatno se razlikuje od vrste do vrste. Mitohondrijski genom ~ovjeka i ve}ine drugih ìvotinja ima samo oko 16 kb. Puno ve}i genomi mitohondrija prona|eni su u kvascima (otprilike 80 kb) i biljkama (vi{e od 200 kb). Me|utim, ti ve}i genomi mitohondrija sastavljeni su preteìto od nekodiraju}e DNA i ne sadràvaju zna~ajno vi{e geneti~ke informacije. Primjerice, najve}i dosad sekvencionirani genom mitohondrija je onaj u biljci Arabidopsis thaliana. Premda DNA mitohondrija A. thaliana ima otprilike 367 kb, ona kodira samo 32 proteina, tj. svega dvostruko vi{e od broja proteina kodiranih u DNA mitohondrija ~ovjeka. Najve}i broj gena mitohondrija prona|en je u DNA protozoa Reclinomonas americana, koji ima 69 kb i sadràva 97 gena. îni se da genom mitohondrija Reclinomonas vi{e nalikuje genomu bakterija od kojih su se razvili mitohondriji, nego ve}ini dana{njih genoma mitohondrija koji kodiraju svega mali broj proteina uklju~enih u proces oksidativne fosforilacije. Genomi mitohondrija kodiraju i sve rRNA i ve}inu tRNA potrebnih za prevo|enje gena za proteine unutar mitohondrija. Ostali proteini mitohondrija kodirani su genima smje{tenim u jezgri za koje se vjeruje da su preneseni u jezgru iz drevnih genoma mitohondrija. Genom mitohondrija ~ovjeka kodira 13 proteina uklju~enih u transportni lanac elektrona i oksidativnu fosforilaciju (slika 10-3). DNA mitohondrija ~ovjeka kodira i 16S i 12S rRNA i 22 vrste tRNA. Za razliku od ribosoma bakterija koji sadràvaju tri rRNA (23S, 16S i 5S), ribosomi mitohondrija ìvotinja i kvasaca sadràvaju samo dvije rRNA (16S i 12S). DNA mitohondrija biljaka tako|er kodiraju i tre}u rRNA od 5S. Mitohondriji biljaka i protozoa tako|er se razlikuju po tome {to unose i koriste tRNA kodirane genomima i jezgre i mitohondrija, dok su u mitohondrijima ìvotinja sve tRNA kodirane samo genomom organela. Mali broj tRNA kodiranih genomom mitohondrija odraz je ~injenice da mitohondriji rabe geneti~ki kod koji se razlikuje od univerzalnog geneti~koga koda koji je zajedni~ki i prokariotskim i eukariotskim stanicama (tablica 10-1). Kao {to je navedeno u tre}em poglavlju, postoje 64 mogu}a kodona, od kojih 61 kodiraju 20 razli~itih aminokiselina ugra|enih u proteine (vidi tablicu 3-1). Zahvaljuju}i fenomenu koji nazivamo kolebanje (engl. wobble), mnoge tRNA i prokariotskih i eukariotskih stanica mogu prepoznati vi{e od jednog kodona u mRNA. Kolebanje dopu{ta mogu}nost pogrje{nog sparivanja izme|u antikodona tRNA i nukleotida na tre}em poloàju nekih komplementarnih kodona (vidi sliku 7-3). Me|utim prema pravilima kolebanja, potrebno je najmanje 30 razli~itih tRNA za prevo|enje univerzalnoga koda. Unato~ tomu, DNA mitohondrija ~ovjeka kodira svega 22 vrste tRNA koje se koriste za prevo|enje mRNA mitohondrija. To je mogu}e zbog izrazitog kolebanja, u kojem se baza U u antikodonu tRNA moè spariti s bilo kojom od ~etiriju baza na tre}em mjestu u kodonu mRNA pa tako jedna tRNA moè prepoznati ~etiri razli~ita kodona. Dodatna razlika prisutna u mitohondrijima jest da se neki kodoni prevode u druge aminokiseline nego u univerzalnom kodu. Poput DNA genoma jezgre, i DNA mitohondrija moè biti djelomi~no izmijenjena mutacijama koje su ~esto {tetne za organele. Kako prakti~no svi mitohondriji oplo|enih jajnih stanica potje~u od oocite, a ne od spermija, mutacije nastale u DNA mitohondrija prenose se u sljede}u generaciju samo po maj~inoj liniji. Takve mutacije povezane su s brojnim bolestima. Primjerice, Leberova hereditarna opti~ka neuropatija je bolest koja dovodi do sljepo}e, a moè biti uzrokovana mutacijama u genima mitohondrija koji kodiraju sastavne dijelove transportnoga lanca elektrona. Pretpostavlja
403
se da nakupljanje mutacija u mitohondrijskoj DNA tijekom ìvota jedinke pridonosi procesu starenja.
Unos proteina i postanak mitohondrija

Za razliku od ribonukleinskih komponenti mitohondrijskoga sustava za translaciju (rRNA i tRNA), ve}ina mitohondrijskih genoma ne kodira proteine potrebne za replikaciju DNA, transkripciju ili translaciju. Umjesto toga, geni koji kodiraju proteine potrebne za replikaciju i ekspresiju DNA mitohondrija nalaze se u jezgri. Jezgra sadràva i gene koji kodiraju ve}inu proteina mitohondrija potrebnih za oksidativnu fosforilaciju i sve enzime uklju~ene u metabolizam mitohondrija (primjerice enzimi ciklusa limunske kiseline). Otprilike 1.000 proteina kodirano je s pomo}u tih gena (vi{e od 95% mitohondrijskih proteina), a oni se sintetiziraju na slobodnim ribosomima u citosolu i u mitohondrije unose kao cjeloviti polipeptidni lanci. Zbog dvostruke strukture membrane mitohondrija unos proteina je prili~no sloèn u usporedbi s prolaskom kroz jednostruki dvosloj fosfolipida. Proteini namijenjeni matriksu moraju pro}i i vanjsku i unutra{nju membranu mitohondrija, a ostali se proteini trebaju razvrstati u razli~ite odjeljke unutar organela (primjerice u me|umembranski prostor). Unos proteina u matriks mitohondrija najbolje je prou~en na~in razvrstavanja proteina (slika 10-4). Ve}ina proteina usmjeruje se u mitohondrije s pomo}u signalnih sljedova od 25 do 35 aminokiselina na N-kraju proteina (nazivamo ih presekvencije), koje se proteoliti~ki uklanjaju nakon unosa proteina u mitohondrij. Presekvencije proteina mitohondrija koje sadràvaju vi{e pozitivno nabijenih aminokiselina i naj~e{}e tvore amfipati~ku -uzvojnicu prvi je opisao Gottfried Schatz. Prvi korak u unosu proteina je vezanje presekvencija na receptore na povr{ini mitohondrija. Ti receptori ~ine dio proteinskoga kompleksa koji upravlja translokacijom kroz vanjsku membranu (Tom kompleks, translokaza vanjske membrane, od engl. Translocase of the Outer Membrane). Pojedina~ni Tom-proteini ozna~eni su prema njihovim molekularnim masama kao receptori Tom22, Tom20 i Tom5. S tih receptora proteini se prenose na protein pore Tom40 i prebacuju kroz vanjsku membranu. Proteini se potom prenose do drugoga proteinskog kompleksa u unutarnjoj membrani (jedne od dviju razli~itih translokaza unutarnje membrane, Tim kompleksa, engl. Translocases of the Inner Membrane). Proteini s presekvencijom prolaze kroz unutarnju membranu s pomo}u kompleksa Tim23. Za kontinuiranu translokaciju proteina potreban je elektrokemijski potencijal koji se na unutra{njoj membrani mitohondrija uspostavlja transportnim lancem elektrona. Kao {to }e biti prikazano u sljede}em odlomku ovog poglavlja, prijenos visokoenergetskih elektrona s NADH i FADH2 na molekularni kisik povezan je s prijenosom protona iz matriksa u me|umembranski prostor mitohondrija. Kako su protoni nabijene ~estice, ovaj prjelazak uspostavlja elektri~ni potencijal preko unutarnje membrane s matriksom kao negativno nabijenom stranom. Taj elektri~ni potencijal daje energiju potrebnu za translokaciju pozitivno nabijene presekvencije kroz membranu. Da bi se mogli prenijeti kroz membranu mitohondrija proteini trebaju biti barem djelomi~no razmotani i stoga su za unos proteina u mitohondrije osim proteina membrane uklju~enih u translokaciju potrebni i molekularni {aperoni, (vidi sliku 10-4). Na citosolnoj strani ~lanovi porodice {aperona Hsp70 odràvaju proteine u djelomi~no odmotanom obliku, pa oni mogu biti umetnuti u membranu mitohondrija. Kada pro|u unutarnju membranu, neodmotani polipeptidni lanci veù se s drugim {aperonom Hsp70, koji udruèn s Tim23 kompleksom djeluje kao zup~anik i koristi ponovljenu
404
Poglavlje 10
Slika 10-4. Unos proteina u matriks mitohondrija.

Proteini su usmjereni prema kompleksu Tom u vanjskoj membrani mitohondrija s pomo}u amino-ter minalnih presekvencija koje sadràvaju pozitivno nabijene aminokiseline. Presekvencija se najprije veè na Tom20 i Tom22, a zatim se prenosi na Tom5 i poru za unos, Tom40. Nakon prolaska kroz vanjsku membranu, presekvenciju veè me|umembranska domena Tom22 i predaje je Tim23-kompleksu u unutarnjoj membrani. U matriksu {aperon Hsp70 i Tim44 zajedno djeluju kao zup~anik koji hidroliziraju}i ATP prenosi protein kroz unutra{nju membranu. Ve}ini proteina namijenjenih matriksu mitohondrija presljedove odstranjuje enzim matriksna-procesiraju}a-peptidaza mitohondrija (MPP) i oni se tada povezuju s topljivim Hsp70 proteinima koji im pomaù u smatanju.
Hsp70 0 citosola + presekvencija a + + + Tom5
ADP
Pi citosol
Tom40 Tom20 Tom22
vanjska membrana
+ Tom6 Tom7 Tom70 + me|umembranski prostor Tim23 Tim17 + + + + +
+ Tim44
unutra{nja membrana + + + matriks
ADP
Pi mitohondrijski Hsp70
MPP
+++
+++
hidrolizu ATP za pokretanje unosa proteina. U ve}ini slu~ajeva, matriksna procesiraju}a-peptidaza (MPP) tada uklanja presekvenciju, a polipeptidni lanac veù drugi Hsp70 {aperoni matriksa koji olak{avaju njegovo smatanje. Neki se polipeptidi nakon toga prenose na {aperone iz porodice Hsp60 ({aperonin, vidi sliku 7-21), unutar kojih se doga|a daljnje smatanje proteina. Ove interakcije polipeptidnih lanaca s molekularnim {aperonima ovise o ATP i stoga unos proteina zahtijeva ATP i izvan i unutar mitohondrija, kao i elektri~ni potencijal kroz unutarnju membranu. Neki proteini mitohondrija ne usmjeruju se u matriks, ve} u vanjsku ili unutarnju membranu, odnosno u me|umembranski prostor, pa su za usmjerivanje tih proteina u odgovaraju}i mitohondrijski odjeljak potrebni dodatni mehanizmi. Mnogi proteini unutra{nje membrane su prijenosnici malih molekula koji razmjenjuju nukleotide i ione izme|u mitohondrija i citosola. Ovi proteini ne sadràvaju presekvencije ve} umjesto toga imaju vi{estruke unutarnje signale za unos u mitohondrij. U skladu s time njih ne prepoznaju kompleksi Tom20 i Tom22, ve} posebni receptor Tom70 na vanjskoj membrani mitohondrija. Ti proteini unutra{nje membrane mitohondri-
405
ADP
Pi
Slika 10-5. Unos proteina prijenosnika malih molekula u unutarnju membranu mitohondrija.
Ovi proteini umjesto N-ter minalnih presljedova sadràvaju unutar nje signalne sljedove koje prepoznaje receptor Tom70 i prenosi ih do pore za unos Tom40. U me|umembranskom se prostoru ti proteini nalaze vezani na male pokretne Tim proteine (nazivamo ih si}u{ni Tim proteini) koji ih vode do kompleksa Tim22 u unutra{njoj membrani. Si}u{ni Tim proteini pr vo ih predaju Tim54 proteinu, a zatim Tim 22-pori za unos. Unutarnji signal za prestanak prijenosa zaustavlja translokaciju i protein se lateralno prenosi u unutarnju mem-
Hsp70
Tom20 Tom22
Tom5 citosol vanjska membrana
Tom40
Tom6 Tom7 Tom70 me|umembranski prostor si}u{ni Tim proteini Tim54 Tim22 +
unutra{nja membrana matriks
ja zatim s pomo}u Tom40 prolaze kroz vanjsku membranu mitohondrija (slika 10-5). U me|umembranskom prostoru prepoznaju ih pokretne podjedinice kompleksa Tim22. Ove male pokretne podjedinice (nazvane si}u{ni Tim proteini) sluè i kao {aperoni i kao transportni proteini koji dovode proteine do Tim22. Proteini se potom djelomi~no premjeste s pomo}u Tim22, prije nego ih unutarnji signal za prestanak prijenosa zaustavi i potakne da lateralno iza|u iz pore Tim22 i tako ostanu umetnuti u unutarnjoj membrani. Ostali proteini, namijenjeni vanjskim ili unutra{njim membranama, odnosno me|umembranskom prostoru, sadràvaju i presekvenciju i unutra{nje signalne sekvencije. Budu}i da sadràvaju presekvenciju prepoznaju ih receptori Tom20 i Tom22 na vanjskoj membrani i prenose kroz unutra{nju membranu pomo}u kompleksa Tim23 (slika 10-6). Neki od ovih proteina napu{taju kompleks Tom lateralno prema vanjskoj membrani. Drugi proteini prolaze kroz vanjsku membranu, ali umjesto da u|u u Tim23 ostaju u me|umembranskom prostoru. Ostali proteini odre|eni za me|umembranski prostor, kao i neki proteini unutarnje membrane prvo se prenose kroz unutra{nju membranu u matriks mitohondrija. Otklanjanjem presekvencije u matriksu razotkriva se novi (sekundarni) signalni slijed koji ih
406
Poglavlje 10
Bolesti mitohondrija: Leberova hereditarna opti~ka neuropatija

Bolest
Leberova nasljedna opti~ka neuropatija (LHON, engl. Leber Hereditary Optical Neuropathy) rijetka je nasljedna bolest koja rezultira sljepo}om zbog degeneracije opti~koga ìvca. Gubitak vida obi~no se doga|a izme|u 15. i 35. godine ìvota i naj~e{}e je jedini pokazatelj bolesti. Bolest ne razvijaju sve osobe koje su naslijedile geneti~ke pogrje{ke odgovor ne za LHON, a ène su rje|e pogo|ene od mu{karaca. ê{}e pojavljivanje u mu{karaca moglo bi upu}ivati na to da je LHON X-vezana bolest, no to nije slu~aj jer mu{karci nikada ne prenose LHON svojim potomcima. Umjesto toga, LHON se naslje|uje isklju~ivo po maj~inoj liniji. Ova osobina LHON u skladu je s citoplazmatskim, a ne nuklear nim naslje|ivanjem, jer citoplazma oplo|enih jajnih stanica u potpunosti potje~e od oocite. vode oksidativnu fosforilaciju i proizvode ATP To ima najve}i u~inak na ona . tkiva koja najvi{e ovise o oksidativnoj fosforilaciji. Na taj na~in pogrje{ke u komponentama mitohondrija mogu dovesti do klini~kih manifestacija u specifi~nim organima, a ne do sistemne bolesti. Sredi{nji ìv~ani sustav (uklju~uju}i mozak i opti~ki ìvac) jako je ovisan o oksidativnom metabolizmu, {to je u skladu s ~injenicom da se sljepo}a pojavljuje kao primarna klini~ka manifestacija mutacije u mitohondrijskoj DNA koja je odgovorna za LHON. Kao {to smo spomenuli, naslje|ivanje LHON mutacija ne dovodi uvijek do razvoja bolesti. Samo oko 10% èna i 50% mu{karaca koji nose mutaciju pate od gubitka vida. Jedan od razloga niskoj incidenciji bolesti u nositelja LHON mutacija jest to {to svaka stanica sadràva tisu}e kopija mitohondrijske DNA koja moè biti kombinacija mutiranih i normalnih mitohondrija. Takvi se mitohondriji nasumice raspodjeljuju na stanice k}eri prilikom stani~ne diobe. Populacija mitohondrija moè se promijeniti kad se stanice dijele pa tako
P D om~a 12S F V 16S T Cyt b
LHON 15257 A
LHON 14484 C LDYT14459 A
E ND6 ND5
Molekular na i stani~na osnova bolesti

Douglas Wallace i njegove kolege 1988. godine prona{li su mutaciju u mitohondrijskoj DNA kod pacijenta koji je bolovao od LHON. Ta mutacija (na poloàju 11778) poga|a jednu od podjedinica kompleksa I u transportnom lancu elektrona (NADH-dehidrogenazu) i uzrokuje zamjenu histidina argininom. Mutacija 11778 potvr|ena je u pribli`no polovici svih slu~ajeva LHON. Tri druge mutacije u mitohondrijskoj DNA tako|er su identificirane kao primar ni uzrok LHON. Dvije od njih poga|aju druge podjedinice kompleksa I, dok tre}a poga|a citokrom b, koji je komponenta kompleksa III (vidi sliku). Ove ~etiri mutacije odgovorne su za vi{e od 80% slu~ajeva LHON. Peta mutacija (na paru baza 14459) poga|a podjedinicu kompleksa I i moè uzrokovati, ili LHON, ili poreme}aje mi{i}a. Mutacije koje uzrokuju LHON smanjuju sposobnost mitohondrija da proL ND1 Q I M LHON 3460 A
L H ND4
ND2 A C
W N Y OL G ND4L S COI D COII geni kompleksa I (NADH-dehidrogenaza) geni kompleksa III (ubikinol: citokrom c-oksidoreduktaza) tRNA geni ATPase6 ATPase8 geni kompleksa IV (citokrom c-oksidaza) geni kompleksa V (ATP-sintaza) rRNA geni K COIII ND3 R LHON 11778 A
LHON mutacije u DNA mitohondrija.
407
nastaju stanice koje sadràvaju ve}e ili manje udjele mutiranih organela. Me|utim, i mnoge osobe koje nose prete`no mutirane mitohondrijske DNA ipak ne razviju uvijek bolest te se ~ini da neki dodatni geneti~ki faktori ili faktori iz okoline, koje tek treba identificirati, imaju zna~ajnu ulogu u razvoju LHON.
Prevencija i lije~enje LHON

Utvr|ivanje mutacija mitohondrijske DNA vezanih uz nastanak LHON omogu}uje molekular nu dijagnozu bolesti {to moè biti va`no u postavljanju kona~ne dijagnoze u pacijenata bez obiteljske anamneze, no otkrivanje mutacija u mitohondrijskoj DNA od male je vrijednosti za ispitivanje ~lanova pogo|enih obitelji ili za plani-
ranje obitelji. Za razliku od ispitivanja nasljednih mutacija gena jezgre gdje molekular na analiza moè odrediti je li ~lan obitelji ili embrij naslijedio mutirani alel ili alel divljeg tipa, u LHON se mutirani mitohondriji prenose s majke na sve potomke. Kao {to je ve} napomenuto, oni ne }e svi razviti bolest, no geneti~kom analizom to nije mogu}e predvidjeti. Otkri}e da LHON uzrokuju mutacije u mitohondrijskoj DNA otvara nove mogu}nosti za terapiju. Jedan je pristup metaboli~ka terapija namijenjena ja~anju oksidativne fosforilacije dodatkom supstrata ili kofaktora (poput sukcinata ili koenzima Q) u transportnom lancu elektrona. Druga mogu}nost o kojoj se razmi{lja u lije~enju LHON je genska terapija kojom se namjerava premjestiti
nor malni alel gena u jezgru. Tom bi genu bio pridodan odgovaraju}i signal za usmjerivanje koji bi navodio genski produkt u mitohondrije gdje bi mogao zamijeniti neaktivni protein kodiran u mitohondriju.
Literatura
Brown, M. D., S. Voljavec, M. T. Lott, I. Mac Donald and D. C. Wallace. 1992. Leber s hereditary optic neuropathy: A model for mitochondrial neurodegenerative diseases. FASEB J. 6:27912799. Riordan-Eva, P and A. E. Harding. 1995. . Leber s hereditary optic neuropathy: The clinical relevance of different mitochondrial DNA mutations. J. Med. Genet. 32:8187.
Slika 10-6. Razvrstavanje proteina koji sadràvaju presekvence u razli~ite odjeljke mitohondrija.
Proteini mitohondrija s N-terminalnim presekvencijama mogu se unijeti u vanjsku membranu, unutra{nju membranu ili me|umembranski prostor. Presekvencije tih proteina prepoznaju receptori Tom20 i Tom22 i prenose ih do Tom40. Proteini namijenjeni vanjskoj membrani prekidaju translokaciju u kompleksu Tom40 i lateralno izlaze u membranu. Neki proteini namijenjeni me|umembranskom prostoru prenose se kroz Tom40, ali ne stupaju u interakciju s kompleksom Tim23, ve} ostaju u me|umembranskom prostoru. Ostali se proteini s pomo}u Tim23 kompleksa prenose u matriks mitohondrija. U matriksu dolazi do otklanjanja preslijeda {to otkriva sljede}i signal razvrstavanja koji te proteine moè usmjeriti natrag u unutra{nju membranu ili u me|umembranski prostor, s pomo}u pore za translokaciju Oxa1.
408
Poglavlje 10
Slika 10-7. Struktura kardiolipina.

Kardiolipin je neuobi~ajeni dvostruki fosfolipid s ~etiri lanca masnih kiselina koji nalazimo u unutra{njoj membrani mitohondrija.
O CH2 CH O C O C O CH2
OH CH2 CH CH2 P CH2 CH O O C CH2 O C O
R1
R2
R3
R4
usmjeruje prema tre}oj translokazi Oxa1 s pomo}u koje ili prolaze u me|umembranski prostor, ili zbog postojanja unutarnjih signala za prestanak prijenosa ostaju umetnuti u unutra{nju membranu. Oxa1 je tako|er translokaza za one me|umembranske i proteine unutra{nje membrane koji su kodirani genomom mitohondrija i sintetizirani na ribosomima u matriksu mitohondrija. Iz citosola se osim proteina unose i fosfolipidi membrana mitohondrija. U ìvotinjskim se stanicama, fosfatidilkolin i fosfatidiletanolamin sintetiziraju u ER i prenose u mitohondrije s pomo}u proteina prijenosnika fosfolipida (engl. phospholipid transfer proteins), koji izvla~e pojedina~ne molekule fosfolipida iz membrane ER. Lipid je tada mogu}e prenijeti kroz citosol (koji je vodeni medij) uronjen u hidrofobno vezno mjesto na proteinu, te ga otpustiti kada kompleks do|e do nove membrane kao {to je primjerice membrana mitohondrija. U mitohondrijima se zatim iz fosfatidiletanolamina sintetizira fosfatidilserin, a tamo je katalizirana i sinteza posebnog fosfolipida kardiolipina, koji sadràva ~etiri lanca masnih kiselina (slika 10-7).
Mehanizam oksidativne fosforilacije

Najve}i dio uporabljive energije dobivene razgradnjom ugljikohidrata ili masti nastaje oksidativnom fosforilacijom unutar mitohondrija. Primjerice razgradnja glukoze u glikolizi i ciklus limunske kiseline proizvode ukupno ~etiri molekule ATP deset molekula NADH i dvije molekule FADH2 (vidi 2. , poglavlje). Elektroni se s NADH i FADH2 zatim prenose na molekularni kisik {to je zdruèno s nastajanjem dodatne 32 do 34 molekule ATP oksidativnom fosforilacijom. Transport elektrona i oksidativna fosforilacija sluè kao glavni izvor energije u stanici, a odvijaju se na proteinskim kompleksima unutra{nje membrane mitohondrija.
Transportni lanac elektrona

Tijekom oksidativne fosforilacije elektroni s NADH i FADH2 povezuju se s kisikom, a energija oslobo|ena u tim reakcijama oksidacije i redukcije daje energiju za sintezu ATP iz ADP Prijenos elektrona od NADH do O2 jest . reakcija koja osloba|a energiju s DG = 52,5 kcal/mol za svaki par prenesenih elektrona. Da bi se mogla iskoristiti, ta se energija mora polagano osloba|ati postupnim prolaskom elektrona preko serije nosa~a koji ~ine transportni lanac elektrona. Ti su nosa~i organizirani u ~etiri kompleksa u unutra{njoj membrani mitohondrija. Peti kompleks proteina sluì za povezivanje energijom bogate reakcije transporta elektrona i sinteze ATP .
409
Slika 10-8. Prijenos elektrona s NADH.
citosol Elektroni se tada prenose na periferni membranski protein citokroma c koji ih zatim predaje kompleksu IV.
H+
Elektroni se potom prenose do koenzima Q koji ih kroz membranu prenosi do kompleksa III.
H+
H+
Prijenos elektrona u kompleksima I, III i IV vezan je uz smanjenje slobodne energije, {to se koristi za preno{enje protona iz matriksa u me|umembranski prostor. Na taj se na~in uspostavlja gradijent protona preko unutra{nje membrane. Energija pohranjena u gradijentu protona koristi se kao izvor energije za sintezu ATP na kompleksu V dok se protoni vra}aju nazad u matriks. H+ me|umembranski prostor
Cyt c 2 e Q 2 e III H+ 2 H+ +1/2 O2 H2O H+ Kompleks IV prenosi elektrone na molekularni kisik. H+ 2 e IV V
2 e
NAD + + H+ NADH I Parovi elektrona s NADH ulaze u transportni lanac elektrona na kompleksu I.
H+
ADP
matriks
Elektroni s NADH ulaze u transportni lanac elektrona u kompleksu I koji izgra|uje oko 40 polipeptidnih lanaca (slika 10-8). Prvo se prenose s NADH na flavin-mononukleotid, a zatim preko èljezo-sumpornog kompleksa na koenzim Q u procesu koji osloba|a energiju (DG= 16,6 kcal/ mol). Koenzim Q (ili ubikinon) je mala u lipidima topljiva molekula, koja kroz membranu prenosi elektrone s kompleksa I na kompleks III sastavljen od oko deset polipeptida. U kompleksu III elektroni se prenose s citokroma b na citokrom c, {to osloba|a dodatnu energiju (DG= 10,1 kcal/mol). Citokrom c je periferni membranski protein vezan za vanjsku stranu unutra{nje membrane, a prenosi elektrone s kompleksa III na kompleks IV (citokrom-oksidazu), gdje oni na kraju prelaze na molekularni kisik (DG= 25,8 kcal/mol). Drugi kompleks proteina (kompleks II) sastavljen je od ~etiri polipeptida i prima elektrone sa sukcinata, koji je me|uprodukt ciklusa limunske kiseline (slika 10-9). Ovi elektroni prenose se na FADH2 (a ne na NADH), a zatim na koenzim Q. Od koenzima Q elektroni se dalje prenose na kompleks III,
410
Poglavlje 10
citosol
H+
H+
H+
me|umembranski prostor II Q FADH2 2 e III H+ 2 e 2 H+ +1/2 O2 H2O sukcinat H+ H+ ADP Cyt c 2 e IV V
matriks
Elektroni sa sukcinata ulaze u transportni lanac elektrona putem FADH2 u kompleksu II. Zatim se prenose na koenzim Q i premje{taju kroz ostatak transportnoga lanca elektrona na na~in opisan u slici 10-8. Prijenos elektrona s FADH2 na koenzim Q nije povezan sa zna~ajnijim padom slobodne energije, pa se protoni ne crpe kroz membranu na kompleksu II.
Slika 10-9. Prijenos elektrona s FADH2.
a zatim na kompleks IV. Za razliku od prijenosa elektrona s NADH na koenzim Q na kompleksu I, prijenos elektrona s FADH2 na koenzim Q nije povezan sa zna~ajnijim sniènjem slobodne energije, te stoga nije povezan sa sintezom ATP Zbog toga prolazak elektrona od FADH2 kroz transportni la. nac elektrona osloba|a slobodnu energiju samo u kompleksima III i IV. Slobodna energija koja potje~e od prolaska elektrona kroz komplekse I, III i IV koristi se za sintezu ATP Zna~ajno je uo~iti da je mehanizam kojim . se energija oslobo|ena u reakcijama transporta elektrona zdruùje sa sintezom ATP bitno razli~it od sinteze ATP tijekom glikolize ili ciklusa limunske kiseline. U ovim potonjim slu~ajevima, energijom bogati fosfat prenosi se izravno s drugog supstrata na ADP u reakciji koja osloba|a energiju. Primjerice, u zadnjoj reakciji glikolize energijom bogat fosfat s fosfoenolpiruvata prenosi se na ADP pri ~emu nastaju piruvat i ATP (vidi sliku 2-32). Takav se izravni prijenos visoko energetskih fosfatnih skupina ne doga|a tijekom transporta elektrona. Umjesto toga, energija oslobo|ena tijekom transporta elektrona koristi se za stvaranje gradijenta protona kroz unutra{nju membranu mitohondrija. Potencijalna energija pohranjena u tom gradijentu iskori{tava se s pomo}u petoga kompleksa proteina koji zdruùje energetski povoljan protok protona kroz membranu sa sintezom ATP .
Kemiosmoti~ko zdruìvanje
Mehanizam kemiosmoti~kog zdruìvanja transporta elektrona i proizvodnje ATP izvanredan je primjer odnosa strukture i funkcije u biologiji stani-
411
ce. Hipotezu o kemiosmoti~kom zdruìvanju postavio je Peter Mitchell, 1961. godine. On je pretpostavio da ATP nastaje kori{tenjem energije pohranjene u obliku gradijenta protona preko biolo{kih membrana, a ne izravnim kemijskim prijenosom energijom bogatih skupina. Biokemi~ari su u po~etku bili vrlo skepti~ni prema toj pretpostavci pa je trebalo vi{e od desetlje}a da se kemiosmoti~ka hipoteza prihvati i prizna u znanstvenoj zajednici, no danas je kemiosmoti~ko zdruìvanje priznato i prihva}eno kao op}eniti mehanizam proizvodnje ATP u mitohondrijima, kloroplastima i bakterijama. Transport elektrona kroz komplekse I, III i IV zdruèn je s transportom protona iz matriksa mitohondrija u me|umembranski prostor (vidi sliku 10-8). Na ovaj se na~in slobodna energija oslobo|ena prijenosom elektrona iskori{tava za uspostavljanje gradijenta protona kroz unutra{nju membranu. Kompleksi I i IV djeluju kao protonske crpke koje kao rezultat konformacijskih promjena potaknutih transportom elektrona prenose protone kroz membranu. U kompleksu III protoni se prenose kroz membranu s pomo}u koenzima Q, koji prihva}a protone iz matriksa na kompleksu I ili II, a osloba|a ih u me|umembranski prostor na kompleksu III. I kompleks I i kompleks III prenose po ~etiri protona kroz membranu po jednom paru elektrona. U kompleksu IV dva se protona po paru elektrona prenose kroz membranu, a dva dodatna protona po paru elektrona reagiraju s kisikom i stvaraju molekulu vode unutar matriksa. Na ovaj se na~in, ekvivalent od ~etiri protona po paru elektrona prenosi iz matriksa mitohondrija na svakom od ta tri kompleksa. Ovaj prijenos protona iz matriksa u me|umembranski prostor ima klju~nu ulogu u pretvorbi energije koja se osloba|a reakcijama oksidacije i redukcije tijekom transporta elektrona u potencijalnu energiju pohranjenu u gradijentu protona. Kako su protoni elektri~ki nabijene ~estice, potencijalna energija pohranjena u gradijentu protona po svojoj je prirodi i elektri~na i kemijska. Elektri~na komponenta odgovara razlici napona kroz unutarnju membranu mitohondrija (s negativnim matriksom i pozitivnim me|umembranskim prostorom mitohondrija). Odgovaraju}a slobodna energija prikazana je jednad`bom DG = F D V gdje je F Faradayeva konstanta, a DV membranski potencijal. Dodatna slobodna energija koja odgovara razlici koncentracije protona kroz membranu prikazana je jednad`bom: DG = RT ln H+U H+I
gdje H+U i H+I ozna~uju koncentracije protona unutar i izvan mitohondrija. U metaboli~ki aktivnim stanicama gradijent protona kroz unutra{nju membranu odgovara otprilike jednoj pH jedinici, tj. koncentracija protona je oko deset puta nià u matriksu mitohondrija, nego u me|umembranskom prostoru (slika 10-10). U matriksu mitohondrija pH iznosi oko 8, u usporedbi s neutralnim pH (pribli`no 7) u citosolu i me|umembranskom prostoru. Taj gradijent tako|er stvara i elektri~ni potencijal od pribli`no 0,14 V kroz membranu (s negativnim matriksom). I gradijent pH i elektri~ni potencijal potiskuju protone iz citosola natrag u matriks te zajedno stvaraju
412
Poglavlje 10
Kemiosmoti~ka teorija
Coupling of Phosphorylation to Electron and Hydrogen Transfer by a Chemiosmotic Type of Mechanism Peter Mitchell
UPI/Corbis-Bettmann
University of Edinburgh, Edinburgh, Scotland Nature, 1961, Volume 191, pages 144148
Kontekst
Do pedesetih godina pro{loga stolje}a bilo je jasno dokazano da oksidativna fosforilacija uklju~uje stupnjeviti prijenos elektrona preko serije nosa~a na molekularni kisik, no nije bilo poznato na koji se na~in energija oslobo|ena u reakcijama prijenosa elektrona pretvara u ATP. Prirodna pretpostavka bila je da se ADP pretvara u ATP izravnim prijenosom energijom bogatih fosfatnih skupina s drugih me|uprodukata, kao {to je poznato da se zbiva za vrijeme glikolize. Stoga je pretpostavljeno da se energijom bogati me|uprodukti proizvode u reakcijama prijenosa elektrona, a da ti me|uprodukti
tada omogu}uju sintezu ATP izravnim prijenosom fosfatne skupine. Traènje tih pretpostavljenih energijom bogatih me|uprodukata bio je glavni cilj istraìvanja tijekom pedesetih i {ezdesetih godina pro{loga stolje}a. Brojne pogrje{ne pretpostavke su ispitane, no takvi me|uprodukti nisu prona|eni. [tovi{e, bilo je te{ko uskladiti nekoliko zna~ajki oksidativne fosforilacije s op}e prihva}enom pretpostavkom da se sinteza ATP odvija jednostavnim prijenosom fosfatne skupine. Posebice je bilo te{ko objasniti ~injenicu da je fosforilacija usko povezana s membranama i da je inhibiraju razli~iti spojevi koji razaraju
Peter Mitchell
strukturu membrane. Ova razmatranja navela su Petera Mitchella da postavi pretpostavku o bitno druga~ijem mehanizmu zdruìvanja energije u kojem za sintezu ATP nije odgovoran neki neuhvatljivi energijom bogati me|uprodukt, {to su ga traìli drugi istraìva~i, ve} je pokre}e elektrokemijski gradijent kroz membrane.
Pokusi
Osnova kemiosmoti~ke teorije bila je da je me|uprodukt koji zdruùje
citosol
Slika 10-10. Elektrokemijska priroda gradijenta protona.

Kako su protoni pozitivno nabijeni, gradijent protona uspostavljen kroz unutar nju membranu mitohondrija ima i kemijsku i elektri~nu komponentu. Kemijska komponenta je gradijent koncentracije protona (gradijent pH), s pribli`no deset puta vi{om koncentracijom protona na citosolnoj strani unutra{nje membrane mitohondrija (razlika od jedne pH jedinice). Zbog ve}e koli~ine pozitivnih naboja u me|umembranskom prostoru ovaj gradijent tvori i elektri~ni potencijal kroz membranu.
me|umembranski prostor H+ + H H+ pH 7 + H
H+ H+ H+
H+ H+ H+
H+ H+ H+
H+ H+ H+ H+ +++ + + + +++ + +
koncentracijski gradijent
elektri~ni potencijal
pH 8 matriks
H+
H+
H+ H+ H+
H+
H+
413
transport elektrona sa sintezom ATP elektrokemijski gradijent protona kroz membranu. Mitchell je pretpostavio da se takav gradijent stvara transportom elektrona, a da je protok protona natrag kroz membranu u energetski povoljnijem smjeru zdruèn sa sintezom ATP (vidi sliku). Pretpostavka o kemiosmoti~kom zdruìvanju jasno obja{njava izostanak
uspjeha u pronalaènju visoko energetskog me|uprodukta, kao i ~injenicu da su za sintezu ATP potrebne cjelovite membrane. No to je ipak bio radikalni koncept koji se suprotstavljao biokemijskoj dogmi tog vremena. U zaklju~nom poglavlju svojega rada iz 1961. godine Mitchell je filozofski prokomentirao taj revolucionarni prijedlog: U egzaktnim znanostima, uzrok i posljedica vi{e nisu izravno povezani doga|aji. Biokemi~ari sada op}enito prihva}aju ideju da je metabolizam uzrok membranskoga transporta. Nit vodilja ove pretpostavke jest da ukoliko se procesi koje zovemo metabolizam i transport doga|aju u slijedu, ne samo da metabolizam moè biti uzrok transporta, ve} i da transport moè biti uzrok metabolizma.
teze u bakterijama, mitohondrijima i kloroplastima, a i kao izvor energije za energetski nepovoljan transport razli~itih molekula kroz stani~nu membranu. Mitchellov rad je priznat i nagra|en 1978. godine Nobelovom nagradom. Predavanje koje je odrào tom prigodom zapo~inje rije~ima: Iako sam se nadao da }e kemiosmoti~ko obja{njenje vektorskoga metabolizma i prijenosa biolo{ke energije jednoga dana biti op}e prihva}eno, takvo {to o~ekivati bilo bi drsko. Nije li Max Planck istaknuo da nova znanstvena ideja ne ostvaruje trijumf uvjeriv{i svoje protivnike, ve} zato {to oni na koncu umru? înjenica da je ono {to je po~elo kao kemiosmoti~ka hipoteza sada prihva}eno kao kemiosmoti~ka teorija ... ujedno me iznenadila i odu{evila, posebice zbog toga {to su oni koji su prije bili moji najsposobniji protivnici jo{ uvijek na vrhuncu svog znanstvenoga rada.
Utjecaj
Mitchellova hipoteza do~ekana je s nevjericom i ostala je predmetom o{trih rasprava vi{e od desetlje}a. Me|utim, obilje dokaza koje su prikupili Mitchell i suradnici, te neki drugi istraìva~i, kona~no je dovelo do op}eg prihva}anja kemiosmoti~ke pretpostavke koja je postala poznata kao kemiosmoti~ka teorija. Danas je ona prihva}ena kao obja{njenje za proizvodnju ATP tijekom oksidativne fosforilacije i fotosin-
Mitchellov prikaz kemiosmoti~koga zdruìvanja sustava transporta elektrona (na vrhu slike) i sustava za proizvodnju ATP (na dnu slike) u membrani (M) okruènoj vodenom fazom L (od engl. left-lijevo) unutar vodene faze R (od engl. right-desno).
elektrokemijski gradijent kroz unutra{nju membranu mitohondrija koji odgovara razlici slobodne energije od pribli`no DG = 5 kcal/mol protona. Kako je fosfolipidni dvosloj nepropustan za ione, protoni mogu pro}i kroz membranu samo kroz proteinske kanale. Ta ~injenica omogu}uje da se energija pohranjena u elektrokemijskom gradijentu iskoristi za sintezu ATP djelovanjem ATP-sintaze, koju ~esto nazivamo i kompleks V (vidi sliku 10-8). ATP-sintaza sastoji se od dviju strukturno razli~itih komponenti F0 i F1, koje su me|usobno povezane tankom stapkom (slika 10-11). Dio F0 proteè se kroz unutra{nju membranu i oblikuje kanal kojim se protoni vra}aju iz me|umembranskoga prostora u matriks. Energetski povoljan povratak protona u matriks povezan je sa sintezom ATP iz ADP i fosfatnih iona (Pi). Detaljna strukturna ispitivanja utvrdila su to~an mehanizam djelovanja ATP-sintaze koji uklju~uje mehani~ko zdruìvanje F0 i F1 podjedinice. Protok protona kroz F0 podjedinicu uzrokuje rotaciju dijela F1 podjedinice koji djeluje kao rotacijski motor za pokretanje sinteze ATP . îni se da je za sintezu jedne molekule ATP na F1 podjedinici potrebno ~etiri protona vratiti kroz F0 podjedinicu natrag u matriks mitohondrija. To je u skladu s prijenosom protona na kompleksima I, III i IV koji svaki gradi-
414
Poglavlje 10
Slika 10-11. Struktura ATP-sintaze.

H+
Mitohondrijska ATP-sintaza (kompleks V) sastoji se od dviju vi{epodjedini~nih komponenti F0 i F1 koje povezuje tanka stapka. F0 prolazi kroz lipidni dvosloj membrane i tvori kanal kroz koji prolaze protoni. F1 koristi slobodnu energiju oslobo|enu prolaskom protona niz elektrokemijski gradijent za sintezu ATP .
F0
H+ F1
jentu protona pridonose dovoljno slobodne energije za sintezu jedne molekule ATP Oksidacija jedne molekule NADH stoga omogu}uje sintezu triju . molekula ATP a oksidacija FADH2 koji u transportni lanac elektrona ulazi , na kompleksu II, omogu}uje sintezu samo dviju molekula ATP .
Transport metabolita kroz unutra{nju membranu

Osim {to pokre}e sintezu ATP potencijalna energija pohranjena u elektro, kemijskom gradijentu pokre}e transport malih molekula u mitohondrije i iz mitohondrija. Primjerice, ATP sintetiziran u mitohondriju prenosi se u citosol, a za nastavak sinteze ATP potrebno je da se istovremeno ADP i Pi unesu iz citosola. Elektrokemijski gradijent proizveden crpljenjem protona priskrbljuje energiju potrebnu za transport ovih molekula i drugih metabolita koji se koncentriraju unutar mitohondrija (slika 10-12). Transport ATP i ADP kroz unutarnju membranu odvija se s pomo}u integralnog membranskoga proteina, nazvanog prijenosnik adeninskih nukleotida (engl. adenine nucleotide translocator), koji jednu molekulu ADP iz citosola unosi u mitohondrij, a istovremeno jednu molekulu ATP prenosi iz mitohondrija u citosol. Budu}i da ATP nosi vi{e negativnih naboja nego ADP (4 u usporedbi s 3), ta je izmjena potaknuta naponskom komponentom elektrokemijskoga gradijenta. Kako gradijent protona stvara pozitivni naboj na citosolnoj strani membrane, tako je izlazak ATP i njegova zamjena za ADP energetski povoljan. , Za sintezu ATP unutar mitohondrija, osim ADP potrebni su i fosfatni io, ni (Pi), pa je i njih potrebno unijeti iz citosola. To je posredovano jednim drugim membranskim transportnim proteinom koji u mitohondrij unosi fosfat (H2PO4), a iznosi hidroksilne ione (OH). Ova je izmjena elektri~ki neutralna jer i fosfat i hidroksilni ioni imaju naboj 1, no i nju pokre}e gradijent koncentracije protona. Vi{i pH unutar mitohondrija zna~i ve}u koncentraciju hidroksilnih iona, {to poti~e njihovo premje{tanje prema citosolnoj strani membrane. Energija elektrokemijskoga gradijenta sli~no se koristi za transport drugih metabolita u mitohondrije. Primjerice, unos piruvata iz citosola (gdje se on proizvodi glikolizom) odvija se s pomo}u transportnog proteina koji izmjenjuje piruvat za hidroksilne ione, a i drugi me|uprodukti ciklusa limunske kiseline mogu se na sli~an na~in izmjenjivati izme|u mitohondrija i citosola.
ADP
+Pi
Kloroplasti i ostali plastidi

Kloroplasti su organele odgovorne za fotosintezu i po mnogim su osobinama sli~ni mitohondrijima. I kloroplasti i mitohondriji stvaraju metaboli~ku energiju, nastali su endosimbiozom, sadràvaju vlastiti geneti~ki sustav i dijele se diobom. Me|utim, kloroplasti su ve}i i sloèniji od mitohondrija i u njima se, osim proizvodnje ATP odvija nekoliko klju~nih procesa. Najzna, ~ajniji od njih je pretvorba CO2 u ugljikohidrate u procesu fotosinteze.
415
Slika 10-12. Transport metabolita kroz unutra{nju membranu mitohondrija.

Transport malih molekula kroz unutra{nju membranu odvija se posredstvom proteina koji premo{}uju membranu, a pokre}e ga elektrokemijski gradijent. Primjerice ATP se iznosi iz mitohondrija u citosol s pomo}u prijenosnika koji ga zamjenjuje za ADP Tu izmjenu pokre}e . naponska komponenta elektrokemijskoga gradijenta. ATP nosi ve}i negativni naboj (4), nego ADP (3) pa je stoga povoljno da se ATP iznosi iz matriksa mitohondrija u citosol, a da se ADP unosi u mitohondrije. Nasuprot tomu, prijenos fosfata (Pi) i piruvata zdruèn je s izmjenom za hidroksilne ione (OH). U ovom je slu~aju pH komponenta elektrokemijskoga gradijenta koja poti~e izlaz hidroksilnih iona zdruèna s unosom Pi i piruvata u mitohondrije.
me|umembranski prostor ADP

+
3
piruvat
+ +
OH
OH
matriks
Osim toga, kloroplasti sintetiziraju aminokiseline, masne kiseline i sastojke lipida vlastitih membrana. Redukcija nitrita (NO2) do amonijaka (NH3), klju~ni korak u ugradnji du{ika u organske spojeve, tako|er se doga|a u kloroplastima. Osim kloroplasta, u biljnim stanicama postoje i druge srodne organele (plastidi) koje obavljaju razli~ite fiziolo{ke uloge.
Struktura i funkcija kloroplasta

Biljni kloroplasti su velike organele (duga~ke 5 do 10 mm) koje su poput mitohondrija ome|ene dvostrukom membranom nazvanom ovojnica kloroplasta (slika 10-13). Osim unutra{nje i vanjske membrane ovojnice, kloroplasti imaju i tre}i unutarnji sustav membrana koji zovemo tilakoidna membrana. Tilakoidna membrana oblikuje mreù plosnatih okruglih plo~ica zvanih tilakoide, koje su ~esto sloène na hrpe zvane grana. Zbog trostruke membranske strukture, unutarnja organizacija kloroplasta sloènija je od mitohondrija. Tri membrane dijele kloroplaste u tri razli~ita unutarnja odjeljka: (1) me|umembranski prostor izme|u dviju membrana ovojnice kloroplasta: (2) stroma koja se nalazi unutar ovojnice, ali izvan tilakoidne membrane i (3) lumen tilakoida. Iako su, membrane kloroplasta ne{to sloènije, one imaju jasne funkcionalne sli~nosti s membranama mitohondrija, {to se moè i o~ekivati jer oba tipa organela sudjeluju u kemiosmoti~koj proizvodnji ATP Vanjska mem. brana ovojnice kloroplasta, sli~no mitohondrijskoj, sadrì proteine porine pa je propusna za male molekule. Nasuprot tome, unutra{nja membrana nepropusna je za ione i metabolite, pa oni u kloroplaste ulaze samo s pomo}u specifi~nih membranskih prijenosnika. Ova svojstva unutra{njih i vanjskih membrana ovojnice kloroplasta sli~na su unutra{njim i vanjskim membranama mitohondrija: u oba slu~aja unutra{nja membrana ograni~ava prolazak molekula izme|u citosola i unutra{njosti organele. Stroma kloroplasta po funkciji je ekvivalent matriksu mitohondrija: sadràva geneti~ki sustav i razli~ite metaboli~ke enzime, uklju~uju}i one odgovorne za kona~nu pretvorbu CO2 do ugljikohidrata u fotosintezi.
416
Poglavlje 10
vanjska membrana
unutra{nja membrana
tilakoidna membrana
2 mm tilakoidni lumen
me|umembranski prostor
stroma
Slika 10-13. Struktura kloroplasta.

Osim unutra{nje i vanjske membrane ovojnice, kloroplasti sadràvaju i unutarnji membranski sustav (tilakoidnu membranu), te su stoga podijeljeni u tri razli~ita unutra{nja odjeljka. (Elektronskomikroskopska slika ljubazno{}u E. H. Newcombe/Biological Photo Service.)
I u pogledu strukture i u pogledu funkcije, najve}a razlika izme|u kloroplasta i mitohondrija jest tilakoidna membrana. Ta membrana je od klju~ne va`nosti za kloroplaste jer obavlja funkciju unutra{nje membrane mitohondrija u transportu elektrona i kemiosmoti~koj proizvodnji ATP (slika 10-14). Unutra{nja membrana ovojnice kloroplasta (koja nije nabrana u kriste) ne sudjeluje u fotosintezi. Umjesto toga, sustav za transport elektrona u kloroplastu smje{ten je u tilakoidnoj membrani, a protoni se crpe kroz tu membranu iz strome kloroplasta u lumen tilakoida. Uspostavljeni elektrokemijski gradijent izvor je energije za sintezu ATP do koje dolazi kad protoni prelaze natrag u stromu. S obzirom na njezinu ulogu u proizvodnji metaboli~ke energije, tilakoidna membrana kloroplasta ekvivalent je unutra{nje membrane mitohondrija.
417
mitohondrij
H+ H+
+
H+
H+
H+ H+
H+
+ H+ H
H+ H+ H+
H+ H+ H+ H
+
ADP
H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+
unutra{nja membrana b me|umembranski prostor kloroplast
matriks
ADP
+ H+ H
H+
H H
H+
H+
H+
H+
tilakoidna membrana
tilakoidni lumen
stroma
Slika 10-14. Kemiosmoti~ko stvaranje ATP u kloroplastima i mitohondrijima.

U mitohondrijima transport elektrona stvara gradijent protona kroz unutra{nju membranu koji se koristi za pokretanje sinteze ATP u matriksu. U kloroplastima se gradijent protona stvara kroz tilakoidnu membranu i koristi se za pokretanje sinteze ATP u stromi.
Genom kloroplasta
Poput mitohondrija i kloroplasti sadràvaju vlastiti geneti~ki sustav {to upu}uje na ~injenicu da potje~u od fotosinteti~kih bakterija. Genomi kloroplasta sli~ni su mitohondrijskim genomima po tome {to se sastoje od kru`nih molekula DNA koje su prisutne u vi{estrukim kopijama u svakoj organeli. S druge, strane genom kloroplasta ve}i je i sloèniji od mitohondrijskoga. Njegova veli~ina je u rasponu od 120 do 160 kb, a sadràva otprilike 150 gena. Cjelokupni slijed nukleotida u genomu kloroplasta odre|en je kod nekoliko biljaka {to nam je omogu}ilo da identificiramo brojne gene koje sadràva. Geni kloroplasta kodiraju RNA i proteine uklju~ene u ekspresiju gena, te razli~ite proteine koji djeluju u fotosintezi (tablica 10-2). I rRNA i tRNA koje se koriste za prevo|enje mRNA kloroplasta kodirane su genomom organele. Ovo uklju~uje ~etiri rRNA (23S, 16S, 5S i 4,5S) i 30 vrsta tRNA. Za razliku od manjeg broja tRNA kodiranih genomom mitohondrija, tRNA kloroplasta dostatne su za prevo|enje svih kodona u skladu s univerzalnim geneti~kim kodom. Osim navedenih RNA komponenti sustava za
418
Poglavlje 10
Tablica 10-2. Geni kodirani u DNA kloroplasta

Funkcija
Geni za geneti~ki aparat rRNA (23S, 16S, 5S, 4.5S) tRNA proteini ribosoma podjedinice RNA-polimeraze Geni za fotosintezu Fotosustav I Fotosustav II Kompleks citokrom bf ATP-sintaza Ribuloza-bisfosfat-karboksilaza
Broj gena
4 30 21 4 5 12 4 6 1
Analiza slijeda nukleotida pokazala je da genom kloroplasta osim navedenih gena sadràva i tridesetak drugih gena. Neki od tih gena kodiraju proteine uklju~ene u fotorespiraciju, no ve}ina ih tek treba biti identificirana.
translaciju, genom kloroplasta kodira i oko 20 ribosomnih proteina {to je otprilike tre}ina proteina ribosoma kloroplasta. Dio podjedinica RNA-polimeraze tako|er su kodirane u kloroplastima, dok su ostale podjedinice RNA-polimeraze i drugi faktori potrebni za ekspresiju gena kloroplasta kodirani u jezgri. Genom kloroplasta kodira i oko 30 proteina koji sudjeluju u fotosintezi, uklju~uju}i komponente fotosustava I i II, citokrom bf kompleks i ATP-sintazu. Nadalje, jedna od podjedinica enzima ribuloza-bisfosfat-karboksilaze (rubisko) kodirana je u DNA kloroplasta. Rubisko je klju~ni enzim koji katalizira dodavanje CO2 ribuloza-1,5-bisfosfatu u Calvinovu ciklusu (vidi sliku 2-39). Ne samo da je rubisko glavna proteinska komponenta strome kloroplasta, nego je to i najzastupljeniji pojedina~ni protein na Zemlji, pa je vrijedno zapamtiti da jednu od njegovih podjedinica kodira genom kloroplasta.
Unos i razvrstavanje proteina kloroplasta

Premda kloroplasti kodiraju vi{e vlastitih proteina od mitohondrija, oko 3.500 ili 95% proteina kloroplasta jo{ uvijek kodiraju geni jezgre. Kao i u mitohondriju, ti se proteini sintetiziraju na ribosomima citosola, unose u kloroplaste kao kompletni polipeptidni lanci i nakon toga razvrstavaju na odgovaraju}e mjesto u kloroplastu. Kako kloroplasti sadràvaju tri odvojene membrane koje ih dijele u tri razli~ita unutarnja odjeljka, taj je zadatak sloèniji od razvrstavanja proteina u mitohondriju. Proteini se usmjeruju za unos u kloroplaste s pomo}u N-terminalnih sljedova od 30 do 100 aminokiselina (nazivamo ih tranzitni peptidi) koji upravljaju premje{tanjem proteina kroz dvije membrane ovojnice kloroplasta, a zatim se uklanjaju proteoliti~kim kidanjem (slika 10-15). Kompleks za navo|enje (engl. guidance complex) prepoznaje tranzitne peptide i usmjeruje ih prema translokacijskom kompleksu vanjske membrane kloroplasta (Tockompleks) gdje se oni veù za Toc159-receptor. Za razliku od presekvencija za unos u mitohondrije, tranzitni proteini nisu pozitivno nabijeni, a ni unutra{nja membrana kloroplasta nema jaki elektri~ni potencijal. Za unos proteina u kloroplaste potrebne su molekule Hsp70 koje tijekom transporta odràvaju preprotein u razmotanom stanju. Osim toga, molekule Hsp70 pri~vr{}ene na Toc-kompleksu, gdje hidroliziraju}i ATP daju energiju za prijenos proteina. Najmanje jedan Toc-protein, Toc34, veè GTP te je mogu}e , da je hidroliza GTP dodatni izvor energijr za translokaciju.
419
Slika 10-15. Unos proteina u stromu kloroplasta.

Proteine s N-ter minalnim tranzitnim peptidom prepoznaje kompleks za navo|enje koji ih usmjerava prema kompleksu Toc u vanjskoj membrani kloroplasta. Tranzitni se peptid prvo veè za Toc159 (koji je udruèn s Hsp70), a zatim prolazi kroz poru za unos Toc75. Za prolazak kroz vanjsku membranu potrebna je hidroliza ATP koja se odvija na Hsp70 u me|umembranskom prostoru, a mogu}e je da dolazi i do hidrolize GTP na Toc34. Kada pro|e vanjsku membranu, tranzitni peptid dolazi do Tic kompleksa unutra{nje membrane kroz koji prolazi djelovanjem Hsp100. U stromi se tranzitni peptid uklanja s pomo}u stromalne procesiraju}e-peptidaze (SPP), a protein stupa u interakciju s Hsp70.
GDP
ADP
ADP
ADP
Nakon {to preproteini pro|u kroz Toc-kompleks, prenose se na translokacijski kompleks unutra{nje membrane (Tic-kompleks), a potom kroz unutra{nju membranu do strome. Poput kompleksa Toc, Tom i Tim, Tic je multiproteinski kompleks s jednim ili vi{e proteinskih kanala. Na àlost, vrlo se malo zna o specifi~nim proteinima koji izgra|uju Tic-kompleks, a mogu}e je i da postoji vi{e razli~itih Tic-kompleksa. [aperon iz porodice Hsp100 (porodica {aperona koja se razlikuje od porodica HSP60, Hsp70 i Hsp90 koje su prikazane u 7. poglavlju) koji je povezan sa stromalnim dijelom Tic-kompleksa prenosi preprotein kroz unutra{nju membranu. U stromi se tranzitni peptid uklanja s preproteina s pomo}u stromalne-procesiraju}e-peptidaze (SPP), a protein se povezuje sa stromalnim Hsp70 {aperonima. Kao i u matriksu mitohondrija, neki proteini koji ostaju u stromi dovr{avaju svoje smatanje unutar {aperonina Hsp60. Malo je poznato o na~inu na koji se proteini usmjeruju prema vanjskoj ili unutra{njoj membrani kloroplasta. Kao i u mitohondrijima, neki se proteini ume}u izravno u vanjsku membranu ovojnice kloroplasta. Na sli~an na~in se i neki proteini odre|eni za tilakoidnu membranu nakon smatanja u stromi ume}u izravno u tilakoidnu membranu.
420
Poglavlje 10
Slika 10-16. Unos proteina u lumen tilakoida.

Postoje tri razli~ita membranska kompleksa za prijenos proteina iz strome u lumen tilakoida. Razmotani proteini povezuju se u stromi s Hsp70 i navode prema svakom kompleksu s pomo}u specifi~nih N-terminalnih signala. Jednom od kompleksa nije nu`no potreban gradijent protona kroz tilakoidnu membranu, dok je drugom kompleksu potreban. Tre}i kompleks prepoznaje stromalnu ~esticu za prepoznavanje signala (Srp) koja se veè na neke proteine sintetizirane u citosolu, kao i na neke proteine koji se prevode na ribosomima kloroplasta.
stroma
Srp
Hsp70
+ smotani proteini
+ + + ++ lumen tilakoida
membrana tilakoida
Proteini koji se ugra|uju u lumen tilakoida prenose se do svog odredi{ta u dva koraka. Prvo se unose u stromu, a zatim se usmjeruju kroz tilakoidnu membranu s pomo}u sekundarnoga signalnog slijeda koji se otkriva uklanjanjem tranzitnog peptida. U lumen tilakoida proteini se prenose s pomo}u tri razli~ita translokacijska kompleksa (slika 10-16). Jedan translokacijski kompleks je neovisan o gradijentu protona kroz tilakoidnu membranu, dok je drugom potreban gradijent protona. Prema tre}em translokacijskom kompleksu proteini se usmjeruju s pomo}u stromalnih ~estice za prepoznavanje signala, koje tako|er prepoznaju i proteine koji su kodirani genomom kloroplasta i sintetizirani na ribosomima kloroplasta.
Ostali plastidi
Iako jesu najuo~ljiviji, kloroplasti su ipak samo jedan od ~lanova ve}e porodice biljnih organela koje zovemo plastidi. Svi plastidi sadràvaju isti genom kao i kloroplasti, ali se razlikuju po strukturi i funkciji. Kloroplasti su specijalizirani za fotosintezu, dok su ostali plastidi uklju~eni u razli~ite vidove biljnoga metabolizma stanice. Oni su tako|er okruèni dvostrukom membranom plastidne ovojnice kao i kloroplasti, no nemaju tilakoidne membrane i druge sastojke fotosinteti~kog aparata. Razli~iti tipovi plastida ~esto su klasificirani prema vrsti pigmenta koje sadràvaju. Kloroplasti se tako nazivaju jer sadràvaju klorofil. Kromoplasti (slika 10-17A) nemaju klorofil nego karotenoide. Oni su odgovorni za
421
(A)
(B)
1 mm
1 mm
Slika 10-17. Elektronskomikroskopska slika kromoplasta i amiloplasta.

(A) Kromoplasti sadràvaju kapljice lipida u kojima su pohranjeni karotenoidi. (B) Amiloplasti sadràvaju velike granule {kroba (A, Biophoto Associates/Photo Researchers, Inc.; B, Dr. Jeremy Burges/Photo Researchers, Inc.)
ùte, naran~aste i crvene boje nekih biljaka i vo}a, a njihova to~na funkcija u metabolizmu stanice nije potpuno jasna. Leukoplasti su nepigmentirani plastidi, koji pohranjuju razli~ite izvore energije u tkivima u kojima se ne odvija fotosinteza. Ako pohranjuju {krob, nazivamo ih amiloplasti (slika 10-17B), a ako pohranjuju lipide, elaioplasti. Svi plastidi, uklju~uju}i i kloroplaste, razvijaju se od proplastida. Proplastidi su mali nediferencirani organeli promjera izme|u 0,5 i 1 mm, a nalazimo ih u stanicama koje se brzo dijele kao {to su primjerice stanice korijena i izdanka. Ovisno o potrebama diferenciranih stanica, proplastidi se razviju u razli~ite tipove zrelih plastida, a mogu i prelaziti iz jednog tipa u drugi. Za vrijeme dozrijevanja plodova (primjerice raj~ice) kromoplasti se razvijaju iz kloroplasta. U tim procesima razgra|uju se klorofil i tilakoidne membrane, a sintetiziraju se nove vrste karotenoida. Zanimljivo je obilje`je plastida da njihov razvoj kontroliraju i signali iz okoline i unutra{nji program diferencijacije stanice. Primjerice, u fotosinteti~kim stanicama li{}a proplastidi se razvijaju u kloroplaste (slika 10-18). Za vrijeme tog procesa tilakoidna se membrana oblikuje pupanjem vezikula od unutra{nje membrane ovojnice plastida, a sintetiziraju se i sastavljaju razli~ite komponente fotosinteti~kog aparata. No, kloroplasti se razvijaju samo u prisutnosti svjetla. Ako biljku drìmo u tami, razvoj proplastida u li{}u zaustavlja se u intermedijarnom stadiju (nazivamo ga etioplast), u kojem su formirani polukristalni nizovi tubularnih unutarnjih membrana, no klorofil nije sintetiziran (slika 10-19). Ako se biljke, koje su rasle u tami kasnije izloè svjetlu, etioplasti nastavljaju razvoj do kloroplasta. Va`no je uo~iti da ova dvostruka kontrola razvoja plastida uklju~uje koordiniranu ekspresiju gena unutar genoma plastida i jezgre. Mehanizmi odgovorni za takvu koordiniranu ekspresiju gena ve}inom su nepoznati, a njihovo traènje predstavlja velik izazov u biljnoj molekularnoj biologiji.
422
Poglavlje 10
Slika 10-18. Razvoj kloroplasta.

Kloroplasti se razvijaju od proplastida u fotosinteti~kim stanicama li{}a. Proplastidi sadràvaju samo unutra{nju i vanjsku ovojnicu membrane. Tilakoidna membrana nastaje pupanjem vezikula od unutra{nje membrane tijekom razvoja kloroplasta. Ako se biljka drì u tami, razvoj kloroplasta je zaustavljen na inter medijar nom stupnju (etioplasti). Etioplasti nemaju klorofil, a sadràvaju polukristalne nizove membranskih tubula. Na svjetlu oni nastavljaju razvoj do kloroplasta.
proplastid
vanjska membrana unutra{nja membrana
etioplast
tama
unutra{nje tubularne membrane svjetlo kloroplast tilakoidna membrana
Fotosinteza
Fotosintezom se prikuplja energija Sun~eva svjetla koja se koristi za pokretanje sinteze glukoze iz CO2 i H2O. Zbog pretvorbe Sun~eve energije u uporabljivu potencijalnu kemijsku energiju, fotosinteza je temeljni izvor metaboli~ke energije za sve biolo{ke sustave. Fotosinteza se odvija u dva odvojena stupnja. U reakcijama na svjetlu, Sun~eva energija pokre}e sintezu ATP i NADPH, koja je povezana s nastankom O2 iz H2O. U reakcijama u tami (koje su tako nazvane jer ne trebaju Sun~evo svjetlo) ATP i NADPH stvoreni u reakcijama na svjetlu, pokre}u sintezu glukoze. U eukariotskim se stanicama fotosinteti~ke reakcije na svjetlu i tami odvijaju unutar kloroplasta; reakcije na svjetlu u tilakoidnoj membrani, a reakcije u tami unutar strome. U ovom }e odjeljku biti prikazane reakcije na svjetlu koje su sli~ne oksidativnoj fosforilaciji u mitohondrijima. Reakcije u tami detaljno su prikazane u 2. poglavlju.
1 mm
Protok elektrona kroz fotosustave I i II

Sun~eva svjetlost se apsorbira s pomo}u fotosinteti~kih pigmenata, od kojih su u biljkama najobilniji klorofili. Apsorpcija svjetla pobu|uje elektron u vi{e energetsko stanje i na taj na~in pretvara energiju Sun~eva svjetla u potencijalnu kemijsku energiju. Fotosinteti~ki pigmenti organizirani su u fotocentre u tilakoidnim membranama koji svaki sadràva stotine moleku-
Slika 10-19. Elektronskomikroskopska slika etioplasta.

(John N. A. Lott/Biological Photo Service.)
423
foton
Slika 10-20. Organizacija fotocentra.

Svaki fotocentar sastavljen je od stotinjak pigmentnih molekula koje poput antena apsorbiraju fotone i njihovu energiju prenose do klorofila u reakcijskom centru. Klorofil u reakcijskom centru zatim prenosi svoje pobu|ene elektrone na primatelja u transportnom lancu elektrona. Prikazani reakcijski centar dio je fotosustava II u kojem se elektroni prenose s reakcijskog centra klorofila na feofitin, a zatim na kinone (QA, QB i QH2).
rezonantni prijenos energije
klorofil u reakcijskom centru
molekule pigmenta koje sluè kao antene
QA e QB e fotosinteti~ki reakcijski centar
feofitin
u membranu QH2
la pigmenta (slika 10-20). Velik broj molekula pigmenta u svakom fotocentru djeluje kao antena koja apsorbira svjetlo i prenosi energiju pobu|enih elektrona do molekule klorofila u reakcijskom centru. Klorofil u reakcijskom centru tada prenosi svoj visoko energetski elektron do molekule akceptora u transportnom lancu elektrona. Visoko energetski elektroni zatim se prenose kroz seriju membranskih nosa~a u procesu koji je zdruèn sa sintezom ATP i NADPH. Najbolje je istraèn fotosinteti~ki reakcijski centar bakterije Rhodopseudomonas viridis ~iju su strukturu odredili Johann Deisenhofer, Hartmut Michel, Robert Huber i njihove kolege 1985. godine (slika 10-21). Reakcijski centar sastoji se od tri transmembranska polipeptida vezana na c-tip citokroma na vanjskoj strani membrane. Energiju Sun~eva svjetla hvata par molekula klorofila koji nazivamo specijalnim parom. Elektroni se zatim sa specijalnog para prenose na drugi par molekula klorofila, a od tamo na druge prosteti~ke skupine (feofitine i kinone). Zatim se elektroni prenose na kompleks citokrom bc unutar kojega je transport elektrona povezan sa stvaranjem gradijenta protona. Elektroni se nakon toga prenose do citokroma u reakcijskom centru i na kraju ponovo vra}aju na specijalni par klorofila. Na taj na~in reakcijski centar pretvara Sun~evu energiju u visoko energetske elektrone ~ija se potencijalna energija pretvara u gradijent protona s pomo}u kompleksa citokrom bc.
Slika 10-21. Struktura fotosinteti~koga reakcijskog centra.

Reakcijski centar R. viridis sastoji se od tri transmembranska proteina (ljubi~asti, modri i ùtosivi) i c-tipa citokroma (zeleni). Klorofili i ostale prosteti~ke skupine obojene su ùto. (Ljubazno{}u Johana Deisenhofera, University of Texas Medical Center and The Nobel Foundation, 1989.)
424
Poglavlje 10
stroma
ADP foton H+ foton H+
+ NADP +
2 e H+
PS II 2 e
PQ
Cyt bf PC
PS I NADP-reduktaza H+
H2O
1/2
O2
+2 H+
H+
lumen tilakoida
Slika 10-22. Transport elektrona i sinteza ATP u fotosintezi.

Pet proteinskih kompleksa tilakoidne membrane sudjeluje u transportu elektrona i sintezi ATP i NADPH. Fotone apsorbiraju kompleksi pigmentnih molekula koji su udruèni s fotosustavima I i II (PSI i PSII). U fotosustavu II energija apsorbiranih fotona koristi se za kidanje molekule vode u lumenu tilakoida. Elektroni se zatim prenose s pomo}u plastokinona (PQ) na kompleks citokrom bf gdje prelaze u niè energetsko stanje {to je zdruèno s prijenosom protona u lumen tilakoida. Elektroni se zatim prenose na fotosustav I s pomo}u plastocijanina (PC). U fotosustavu I energija dobivena apsorpcijom svjetla ponovno proizvodi visoko energetske elektrone koji se prenose na feredoksin (Fd) i koriste za redukciju NADP+ u NADPH u stromi. Energiju pohranjenu u gradijentu protona iskori{tava ATPsintaza za pretvorbu ADP u ATP .
Proteini uklju~eni u fotosinteti~ke reakcije na svjetlu kod biljaka su organizirani su u pet kompleksa u tilakoidnoj membrani (slika 10-22). Dva od ovih kompleksa su fotosustavi (fotosustav I i II) u kojima se svjetlo apsorbira i prenosi do klorofila u reakcijskom centru. Visoko energetski elektroni zatim se prenose kroz seriju nosa~a u fotosustavima I i II, te kroz tre}i kompleks proteina, citokrom bf kompleks. Kao i u mitohondrijima, prijenos elektrona povezan je s transportom protona u lumen tilakoida {to rezultira uspostavljanjem gradijenta protona kroz tilakoidnu membranu. Energiju pohranjenu u gradijentu protona iskori{tava ~etvrti kompleks proteina tilakoidne membrane, ATP-sintaza, koja poput mitohondrijskih enzima koristi protok protona kroz membranu za sintezu ATP . Zna~ajna razlika izme|u transporta elektrona u kloroplastima i mitohondrijima je u tome {to se energija proizvedena iz Sun~eva svjetla za vrijeme fotosinteze ne pretvara samo u ATP ve} se koristi i za proizvodnju NADPH , potrebnog za kasniju pretvorbu CO2 u ugljikohidrate. To se postiè uporabom dvaju razli~itih fotosustava u reakcijama na svjetlu, jednog za proizvodnju ATP a drugog za NADPH. Elektroni se prenose s jednoga na drugi , fotosustav. Fotosustav I proizvodi NADPH, a fotosustav II ATP . Tijek elektrona zapo~inje na fotosustavu II koji je homologan upravo opisanom fotosinteti~kom reakcijskom centru bakterije R. viridis. Me|utim, na fotosustavu II energija nastala apsorpcijom fotona koristi se za kidanje molekule vode na molekularni kisik i protone (vidi sliku 10-22). Ta se reakcija odvija unutar lumena tilakoida, a osloba|anje protona iz vode uspostavlja gradijent protona kroz tilakoidnu membranu. Visoko energetski elektroni nastali u ovom procesu prenose se preko serije nosa~a do plastokinona, lipofilnoga nosa~a sli~nog koenzimu Q (ubikinonu) mitohondrija. Plastokinon prenosi elektrone s fotosustava II na kompleks citokrom bf, unutar kojega se elektroni prenose na plastocijanin, a dodatni se protoni prenose u lumen tilakoida. Na ovaj je na~in transport elektrona kroz fotosustav II zdru-
425
èn s uspostavom gradijenta protona {to pokre}e kemiosmoti~ku sintezu ATP . S fotosustava II elektroni se prenose s pomo}u plastocijanina (periferni membranski protein) na fotosustav I gdje apsorpcija dodatnih fotona ponovno stvara visoko energetske elektrone. Za razliku od fotosustava II, fotosustav I ne djeluje kao crpka protona. Umjesto toga on koristi visoko energetske elektrone za redukciju NADP+ u NADPH. Reakcijski centar klorofila u fotosustavu I prenosi svoje pobu|ene elektrone kroz seriju nosa~a na feredoksin, mali protein na stromalnoj strani tilakoidne membrane. Enzim NADP-reduktaza zatim prenosi elektrone s feredoksina na NADP+ ~ime nastaje NADPH. Prema tome, prolazak elektrona kroz fotosustave I i II proizvodi ATP i NADPH koji }e s pomo}u enzima Calvinova ciklusa u stromi kloroplasta pretvoriti CO2 u ugljikohidrate (vidi sliku 2-39).
Kru`ni tok elektrona

Drugi transportni put elektrona (nazivamo ga kru`ni tok elektrona) omogu}uje stvaranje ATP bez sinteze NADPH te stoga dodatnim ATP opskrbljuje druge metaboli~ke procese. U kru`nom elektronskom toku, energija svjetla stvorena u fotosustavu I koristi se za sintezu ATP a ne za sintezu NADPH (slika 10-23). Umjesto da se prenesu na NADP+, energijom bogati elektroni fotosustava I prenose se na kompleks citokrom bf. Prijenos elektrona kroz kompleks citokrom bf je, kao i u fotosustavu II zdruèn s uspostavljanjem gradijenta protona kroz tilakoidnu membranu. Plastocijanin tada
stroma ADP
H+
H+ Cyt bf e PC PQ e
PS I H+
H+ lumen tilakoida
Slika 10-23. Put kru`noga toka elektrona.

Svjetlosna energija apsorbirana u fotosustavu I (PSI) umjesto za sintezu NADPH iskori{tava se za sintezu ATP Visoko energetski elektroni nastali apsorpcijom fotona . ne prenose se na NADP+, ve} na kompleks citokrom bf. Na kompleksu citokrom bf elektroni se prevode u niè energetsko stanje, a protoni se crpe u lumen tilakoida. Elektroni se zatim vra}aju u fotosustav I s pomo}u plastocijanina (PC).
426
Poglavlje 10
vra}a te elektrone natrag u fotosustav I u nièm energetskom stanju, zavr{avaju}i tako ciklus transporta elektrona u kojem je energija svjetla stvorena u fotosustavu I iskori{tena za crpljenje protona na kompleksu citokrom bf. Ovisno o metaboli~kim potrebama stanice, prijenos elektrona s fotosustava I moè stvoriti ili ATP ili NADPH. ,
Sinteza ATP
ATP-sintaza na tilakoidnoj membrani sli~na je ATP-sintazi koju nalazimo u mitohondrijima, no energija pohranjena u gradijentu protona kroz tilakoidnu membranu, za razliku od gradijenta protona kroz unutra{nju mitohondrijsku membranu, po svojoj je prirodi gotovo isklju~ivo kemijska. To je stoga {to se tilakoidna membrana, iako nepropusna za protone, razlikuje od unutra{nje mitohondrijske membrane po tome {to je propusna za druge ione, posebice Mg2+ i Cl. Slobodan prolazak tih iona neutralizira naponsku komponentu gradijenta protona, pa je tako energija nastala iz fotosinteze pohranjena uglavnom kao razlika u koncentraciji protona (pH) kroz tilakoidnu membranu. Me|utim, kako je za razliku od me|umembranskoga prostora mitohondrija tilakoidni lumen zatvoreni odjeljak, razlika u koncentraciji protona izme|u strome kloroplasta i lumena tilakoida moè biti vrlo velika (i vi{e od tri pH jedinice). Zbog velike razlike u koncentraciji protona, ukupna slobodna energija pohranjena u gradijentu protona kroz tilakoidnu membranu sli~na je onoj pohranjenoj u gradijentu protona kroz unutarnju membranu mitohondrija. Za svaki se par elektrona u fotosustavu II kroz tilakoidnu membranu prenesu dva, a u kompleksu citokrom bf dva do ~etiri protona. Kako su ~etiri protona potrebna za sintezu jedne molekula ATP prolazak svakog para , elektrona kroz fotosustave I i II necikli~kim tokom elektrona rezultira sintezom izme|u jedne i jedne i pol molekule ATP Kru`ni tok elektrona ima ni. ì prinos od pribli`no pola do jedne molekule ATP po paru elektrona.
Peroksisomi
Peroksisomi su male membranom ome|ene organele koje sadràvaju enzime uklju~ene u razli~ite metaboli~ke reakcije (slika 10-24). Iako su peroksisomi oblikom sli~ni lizosomima, oni se poput mitohondrija i kloroplasta sastavljaju od proteina sintetiziranih na slobodnim ribosomima koji se u pe-
peroksisomi
Slika 10-24. Elektronskomikroskopska slika peroksisoma.

Prikazana su tri peroksisoma jetre {takora. Dva sadràvaju gusta podru~ja u kojima se nalaze parakristalne nakupine enzima urat-oksidaze. (Don Fawcett/Photo Researchers, Inc.)
0,5 mm
427
O R CH2 CH2 C S CoA
+ O2
CH CH
CoA
+ H2O2
2 H2O2
katalaza ili
2 H2O
+ O2
H2O2
+ AH2
katalaza
2 H2O
+A
Slika 10-25. Oksidacija masnih kiselina u peroksisomima.

Oksidacija masnih kiselina povezana je sa stvaranjem vodikova peroksida (H2O2) iz kisika. Vodikov peroksid razgra|uje se s pomo}u katalaze, ili pretvorbom u vodu ili oksidacijom drugih organskih spojeva (ozna~enih AH2).
roksisome unose kao dovr{eni polipeptidni lanci. Iako peroksisomi nemaju vlastiti genom, sli~ni su mitohondrijima i kloroplastima po tome {to se udvostru~uju diobom. Ve}ina humanih stanica sadràva oko 500 peroksisoma.
Funkcije peroksisoma
Peroksisomi sadràvaju najmanje 50 razli~itih enzima koji su uklju~eni u raznolike biokemijske putove u razli~itim vrstama stanica. Peroksisomi su prvotno definirani kao organeli u kojima se odvijaju reakcije oksidacije koje stvaraju vodikov peroksid. Kako je vodikov peroksid {tetan za stanicu, peroksisomi sadràvaju i enzim katalazu koja razgra|uje peroksid, ili tako da ga pretvara u vodu, ili tako da s pomo}u njega oksidira neki drugi organski spoj. Takvim se oksidativnim reakcijama u peroksisomima razgra|uju razli~iti supstrati kao {to su primjerice mokra}na kiselina, aminokiseline, purini, metanol i masne kiseline. Oksidacija masnih kiselina (slika 10-25) posebice je zna~ajna jer predstavlja glavni izvor metaboli~ke energije. U stanicama ìvotinja masne se kiseline oksidiraju i u peroksisomima i u mitohondrijima, no u kvascima i biljkama oksidacija masnih kiselina ograni~ena je samo na peroksisome. Osim {to predstavljaju odjeljak za reakcije oksidacije, peroksisomi su uklju~eni i u biosintezu lipida i aminokiseline lizina. U animalnim stanicama, kolesterol i dolikol se osim u endoplazmatskom retikulu sintetiziraju i u peroksisomima. U jetri su peroksisomi uklju~eni u sintezu ù~nih soli koje nastaju iz kolesterola. Osim toga, peroksisomi sadràvaju enzime potrebne za sintezu plazmalogena, skupine fosfolipida u kojima je jedan od ugljikovodikovih lanaca s glicerolom spojen eterskom, a ne esterskom vezom (slika 10-26). Plazmalogeni su va`ni sastojci membrane nekih tkiva, posebice srca i mozga, dok ih u drugim tkivima nema. Peroksisomi obavljaju razli~ite biokemijske reakcije u razli~itim tkivima, no nije poznato postoje li subpopulacije peroksisoma koje su specijalizirane samo za jedan, ili za ograni~en broj procesa unutar stanice. U biljkama peroksisomi imaju dvije posebice va`ne uloge. Peroksisomi u sjemenkama odgovorni su za pretvorbu pohranjenih masnih kiselina u ugljikohidrate, {to je va`no za opskrbu energijom i potrebnim sirovinama za rast biljke prilikom klijanja. To se zbiva u reakcijskom nizu nazvanom
H2C O HC O H2C P
H O C CH2
R1
R2 CH2 N+(CH3)3
Slika 10-26. Struktura plazmalogena.

Plazmalogen je sli~an fosfatidilkolinu, no jedan od lanaca masnih kiselina spojen je s glicerolom eterskom, a ne esterskom vezom.
428
Poglavlje 10
masne kiseline
glukoza acetil-CoA CoASH A H2C COO HO C COO citrat oksaloacetat H2C COO O COO HO C H CoASH A CoA S C O CH3 C H glioksilat COO H2C HC HC OH izocitrat fumarat a-ketoglutarat sukcinat COO CH2 CH2 COO sukcinil CoA CO2 CO2 COO COO COO
CH2 COO malat
Slika 10-27. Glioksilatni ciklus.

Biljke sintetiziraju ugljikohidrate od masnih kiselina glioksilatnim ciklusom koji je varijanta ciklusa limunske kiseline (vidi sliku 2-34). Kao i u ciklusu limunske kiseline, acetil-CoA spaja se s oksaloacetatom i stvara citrat, koji se zatim pretvara u izocitrat, no umjesto da se on zatim razgradi na CO2 i a-ketoglutarat (sive strjelice), u glioksilatnom se ciklusu izocitrat pretvara u sukcinat i glioksilat. Kasnije glioksilat reagira s drugom molekulom acetil CoA i nastaje malat, koji se pretvara u oksaloacetat i koristi se za sintezu glukoze.
glioksilatni ciklus, koji je zapravo varijanta ciklusa limunske kiseline (slika 10-27). Peroksisome u kojima se to doga|a ponekad nazivamo glioksisomi. Peroksisomi u li{}u uklju~eni su u fotorespiraciju koja prera|uje nusprodukte koji nastaju tijekom fotosinteze (slika 10-28). U fotosintezi se CO2 pretvara u ugljikohidrate serijom reakcija koje zovemo Calvinov ciklus (vidi sliku 2-39). Prvi korak u ovom procesu je dodavanje CO2 {e}eru s pet ugljikovih atoma, ribuloza-1,5-bisfosfatu (~ime nastaju dvije molekule 3fosfoglicerata, svaka s po tri atoma ugljika). Me|utim, enzim (ribuloza-bisfosfat-karboksilaza ili rubisko) umjesto dodavanja CO2 ponekad katalizira dodavanje O2, pa tako nastaje jedna molekula 3-fosfoglicerata i jedna molekula fosfoglikola (dva ugljika). To je sporedna reakcija, a fosfoglikol nije koristan produkt. On se prvo pretvara u glikolat, a potom se prenosi u peroksisome gdje se oksidira i pretvara u glicin. Glicin se tad prenosi u mitohondrije u kojima se dvije molekule glicina pretvaraju u jednu molekulu serina uz gubitak CO2 i NH3. Serin se poslije ponovno vra}a u peroksisome gdje se pretvara u glicerat. Na kraju se glicerat prenosi natrag u kloroplaste gdje
429
kloroplast O2 3-fosfoglicerat + fosfoglikolat CO2 Calvinov ciklus ribuloza-1,5-bisfosfat f 2,3-fosfogli icerat
glikolat
peroksisom glikolat O2 H2O2 glioksilat 2 glicina glicin CO2 serin glicerat mitohondrij
serin
+ NH3
Slika 10-28. Uloga peroksisoma u fotorespiraciji.

Za vrijeme fotosinteze CO2 se pretvara u ugljikohidrate u Calvinovu ciklusu koji zapo~inje dodavanjem molekule CO2 {e}eru s pet ugljikovih atoma ribuloza-1,5bisfosfatu. Me|utim, enzim ponekad katalizira dodavanje O2 {to rezultira nastankom spoja s dva ugljika fosfoglikolatom. Fosfoglikolat prelazi u glikolat, koji se prenosi u peroksisome, oksidira i pretvara u glicin. Glicin se potom prenosi u mitohondrije i pretvara u serin. Zatim se serin vra}a u peroksisome i pretvara u glicerat, koji se prenosi natrag u kloroplaste.
ponovno ulazi u Calvinov ciklus. Proces fotorespiracije ne ~ini se korisnim za biljke jer je u svojoj osnovi obrat fotosinteze. Tro{i se molekula kisika, a CO2 se osloba|a bez ikakvog dobitka ATP No ~ini se da je povremeno kori. {tenje O2 umjesto CO2 svojstveno rubisku, pa je tako i fotorespiracija nu`na popratna pojava fotosinteze koja omogu}uje ve}ini atoma ugljika u glikolatu da se vrate i iskoriste u metabolizmu stanice.
Nastajanje peroksisoma
Kao {to smo ve} spomenuli, nastajanje peroksisoma sli~nije je nastajanju mitohondrija i kloroplasta, nego endoplazmatskog retikula, Golgijeva tjele{ca ili lizosoma. Prakti~no svi proteini namijenjeni peroksisomima sintetiziraju se na slobodnim ribosomima u citosolu i u peroksisome se prenose kao kompletni polipeptidni lanci (slika 10-29). I fosfolipidi se u peroksisome unose izvana. Od njihova glavnoga mjesta sinteze u ER, u peroksisome ih donose posebni proteini prijenosnici fosfolipida. Unos proteina i fosfolipida rezultira rastom peroksisoma, a novi peroksisomi se kasnije formiraju diobom postoje}ih.
430
Poglavlje 10
Slika 10-29. Nastajanje peroksisoma.

protein sintetiziran na slobodnim ribosomima
Proteini namijenjeni peroksisomima sintetiziraju se na slobodnim ribosomima i unose u postoje}e peroksisome kao cjeloviti polipeptidni lanci. Unos proteina rezultira rastom peroksisoma, a diobom postoje}ih peroksisoma nastaju novi peroksisomi.
unos u peroksisom
rast peroksisoma
nastanak novih peroksisoma diobom
Proteini se u unutra{njost peroksisoma usmjeruju s pomo}u najmanje dva puta koji su evolucijski konzervirani od kvasaca do ~ovjeka. Ve}ina proteina usmjeruje se u peroksisome jednostavnim slijedom aminokiselina Ser-Lys-Leu na karboksilnom kraju (signal za usmjerivanje u peroksisome 1 ili PTS1, od engl. peroxisome targeting signal 1). Manji broj proteina u peroksisome se usmjeruje s pomo}u slijeda od devet aminokiselina (PTS2) na amino-kraju. PTS1 i PTS2 prepoznaju razli~ite vrste citosolnih receptora ili proteina nosa~a {to ih prenose do kompleksa koji posreduje u njihovom premje{tanju kroz membranu peroksisoma. Za razliku od premje{tanja polipeptidnih lanaca kroz membrane endoplazmatskog retikula, mitohondrija i kloroplasta, usmjeruju}i se signali tijekom unosa proteina u peroksisome obi~no ne uklanjaju. Citosolni Hsp70 uklju~en je u unos proteina u peroksisome, ali uloga(e) molekularnih {aperona unutar peroksisoma nije poznata. Smatanje peroksisomalnih proteina odvija se u citosolu u kompleksu s receptorskim proteinima i oni mogu u peroksisome biti transportirani i u djelomi~no smotanoj konformaciji, a ne samo kao izduèni polipeptidni lanci. Peroksisomi podlijeù kompleksnom procesu sazrijevanja koji uklju~uje unos razli~itih vrsta proteina iz citosola u razli~itim trenutcima. Prvo se u membranu peroksisoma moraju unijeti receptori potrebni za usmjerivanje enzima u lumen. Postoje dokazi da ti receptori pupaju iz ER u pre-peroksisomnoj lipidnoj vezikuli. Nedavna istraìvanja upu}uju na ~injenicu da se sadràj enzima, a samim tim i metaboli~ke aktivnosti peroksisoma mijenjaju s njihovim sazrijevanjem. Zanimljivo je da neke komponente putova za unos u peroksisome nisu identificirane kao mutante samo u kvascima, nego i kao mutacije povezane s ozbiljnim bolestima ~ovjeka koje uklju~uju poreme}aje peroksisoma. U nekim od tih bolesti nedostaje samo jedan enzim u peroksisomima, no u nekim drugim bolestima brojni se enzimi ne mogu unijeti u peroksisome, ve} zaostaju u citosolu. Ova skupina bolesti uzrokovana je nedostatkom PTS1 ili PTS2 putova koji su odgovorni za unos proteina u peroksisome. Tipi~an primjer je Zellwegerov sindrom koji je letalan ve} u prvih deset godina ìvota. Zellwegerov sindrom moè biti posljedica mutacija u najmanje deset razli~itih gena koje poga|aju unos proteina u peroksisome. Jedan od njih je identificiran kao gen koji kodira receptor za PTS1 signal za usmjerivanje u peroksisome.
KLJU^NI POJMOVI MITOHONDRIJI

mitohondriji, krista, matriks, porin
S A @ E TA K
Organizacija i funkcija mitohondrija: Mitohondriji imaju presudnu ulogu u proizvodnji metaboli~ke energije, a okruèni su sustavom dvostruke membrane. Matriks sadràva enzime ciklusa limunske kiseline; unu-
431
tra{nja membrana sadràva kompleks proteina uklju~en u transport elektrona i oksidativnu fosforilaciju. Za razliku od unutarnje membrane, vanjska membrana je vrlo propusna za male molekule. Geneti~ki sustav mitohondrija: Mitohondriji sadràvaju vlastiti genom koji kodira ribosomne RNA, transportne RNA i neke proteine uklju~ene u oksidativnu fosforilaciju. Unos proteina i postanak mitohondrija: Ve}ina proteina mitohondrija kodirana je genomom jezgre. Ti se proteini sintetiziraju na slobodnim ribosomima u citoplazmi i unose u mitohondrije kao kompletni polipeptidni lanci. Pozitivno nabijene presekvencije usmjeruju proteine za unos u matriks mitohondrija. Fosfolipidi se prenose u mitohondrije s endoplazmatskog retikula s pomo}u proteina prijenosnika fosfolipida.
endosimbioza
presekvenca, Tom kompleks, Tim kompleks, matriksnaprocesiraju}a-peptidaza (MMP), protein prijenosnik fosfolipida, kardiolipin
MEHANIZAM OKSIDATIVNE FOSFORILACIJE

Transportni lanac elektrona: Glavnina energije koja nastaje oksidativnim metabolizmom potje~e od prijenosa elektrona s NADH i FADH2 na O2. Kako bi se ta energija prikupila u uporabivom obliku elektroni se prenose kroz seriju nosa~a organiziranih u ~etiri proteinska kompleksa u unutra{njoj membrani mitohondrija. Kemiosmoti~ko zdruìvanje: Reakcije koje osloba|aju energiju tijekom transporta elektrona povezane su sa stvaranjem gradijenta protona kroz unutra{nju membranu mitohondrija. Potencijalna energija pohranjena u tom gradijentu iskori{tava se s pomo}u petog kompleksa, ATP-sintaze, koji zdruùje sintezu ATP i energetski povoljan povratak protona u matriks mitohondrija. Transport metabolita kroz unutra{nju membranu: Osim za sintezu ATP , potencijalna energija pohranjena u gradijentu protona koristi se za transport ATP ADP i ostalih metabolita u mitohondrij i iz mitohondrija. ,
oksidativna fosforilacija, transportni lanac elektrona, koenzim Q, ubikinon, citokrom c, citokrom oksidaza
kemiosmoti~ko zdruìvanje, elektrokemijski gradijent, ATPsintaza
KLOROPLASTI I OSTALI PLASTIDI

Struktura i funkcija kloroplasta: Kloroplasti su velike organele koje sudjeluju u fotosintezi i brojnim drugim metaboli~kim procesima. Poput mitohondrija i kloroplasti su ome|eni dvostrukom membranom. Osim nje kloroplasti imaju i unutarnju tilakoidnu membranu koja je mjesto transporta elektrona i kemiosmoti~ke proizvodnje ATP . Genom kloroplasta: Genom kloroplasta sadràva vi{e od 100 gena, uklju~uju}i gene koji kodiraju ribosomne RNA, transportne RNA, neke proteine ribosoma i neke proteine uklju~ene u fotosintezu. Unos i razvrstavanje proteina kloroplasta: Glavnina proteina kloroplasta sintetizira se na slobodnim ribosomima u citosolu, a za unos u kloroplaste usmjeruju se pomo}u N-terminalnih tranzitnih peptida. Proteini koji su umetnuti u lumen tilakoida prvo se unose u stromu kloroplasta, a zatim se usmjeruju za transport kroz membranu tilakoida pomo}u s sekundarnoga signalnog slijeda.
tranzitni peptid, kompleks za navo|enje, Toc kompleks, Tic kompleks, stromalnaprocesiraju}a-peptidaza (SPP) kloroplast, tilakoidna membrana, stroma
432
Poglavlje 10
plastid, kromoplast, leukoplast, amiloplast, elaioplast, proplastid, etioplast
Ostali plastidi: Kloroplasti su samo jedan od pripadnika porodice srodnih organela koje sve imaju isti genom. Ostali plastidi pohranjuju izvore energije poput {kroba ili lipida, a sudjeluju i u drugim vidovima metabolizma biljaka.
FOTOSINTEZA
klorofil, fotocentar, fotosustav I, fotosustav II, kompleks citokrom bf, NADP-reduktaza
Protok elektrona kroz fotosustave I i II: Tijekom fotosinteze energija Sun~eva svjetla prikuplja se i pretvara u uporabljive oblike potencijalne kemijske energije. Apsorpcija svjetla s pomo}u klorofila pobu|uje elektrone u vi{e energetsko stanje. Ti energijom bogati elektroni se zatim prenose kroz seriju nosa~a organiziranih u dva fotosustava i kompleks citokrom bf u tilakoidnoj membrani. Postupni protok elektrona kroz oba fotosustava zdruèn je sa sintezom ATP u fotosustavu II i redukcijom NADP+ do NADPH u fotosustavu I. ATP i NADPH se kasnije upotrebljavaju za sintezu ugljikohidrata od CO2 koja se odvija u stromi kloroplasta. Kru`ni tok elektrona: Alternativni kru`ni tok elektrona omogu}uje svjetlosnoj energiji prikupljenoj fotosustavom I da se pretvori u ATP a ne u , NADPH. Sinteza ATP: Kemiosmoti~ku sintezu ATP pokre}e gradijent protona kroz membranu tilakoida.
kru`ni tok elektrona
PEROKSISOMI
peroksisom, katalaza, plazmalogen, glioksilatni ciklus, glioksisom, fotorespiracija
Funkcije peroksisoma: Peroksisomi su male organele ome|ene jednostrukom membranom koje sadràvaju enzime uklju~ene u razli~ite metaboli~ke reakcije kao {to su primjerice oksidacija masnih kiselina, glioksilatni ciklus i fotorespiracija. Nastajanje peroksisoma: Proteini peroksisoma sintetiziraju se na slobodnim ribosomima u citosolu, a u peroksisome se unose kao kompletni polipeptidni lanci. Najmanje dvije vrste signala usmjeruju proteine u unutra{njost peroksisoma, a mehanizam unosa proteina nije potpuno obja{njen.
Pitanja
1. Koja dva svojstva omogu}uju unutra{njoj membrani mitohondrija neobi~no visoku metaboli~ku aktivnost? 2. U skladu sa standardnim pravilima kolebanja sinteza citosolnih proteina zahtijeva najmanje 30 razli~itih tRNA. Kako humani mitohondriji uspijevaju prevesti mRNA u proteine koriste}i samo 22 razli~ite tRNA? 3. Pretpostavimo da je elektri~ni potencijal kroz unutra{nju membranu mitohondrija raspr{en i da elektrokemijski gradijent tvori jedino koncentracijski gradijent protona koji odgovara jednoj pH jedinici. Izra~unajte slobodnu energiju pohranjenu u tom gradijentu. Za izra~un su Vam potrebni sljede}i podatci: R = 1,98 103 kcal/mol/stupanj, T = 298 K (25 C) i ln(c) = 2,3 log10 (c). 4. Koje uloge imaju molekularni {aperoni u unosu proteina u mitohondrij? 5. Citokrom b2 sintetizira se u citosolu i sadràva sekundarni hidrofobni signalni slijed iza uobi~ajene pozitivno nabijene mitohondrijske presekvencije. Predloìte metaboli~ki put koji }e taj protein dovesti do njegova kona~noga poloàja u me|umembranskom prostoru mitohondrija. 6. Koje su uloge koenzima Q i citokroma c u transportnom lancu elektrona? 7. ATP-sintaza sastoji se od dva multiproteinska kompleksa F0 i F1. Gdje je smje{ten svaki od njih u mitohondrijima i kloroplastima, te kakva im je funkcija?
433
8. Za{to tranzitni peptidi proteina kloroplasta, za razliku od presekvencija proteina mitohondrija, ne trebaju biti pozitivno nabijeni?
9. Koliko je potrebno visoko energetskih elektrona za sintezu jedne molekule glukoze u fotosintezi, {to je zdruèno sa stvaranjem {est molekula O2? Koliko molekula ATP i NADPH se proizvodi prolaskom ovih elektrona kroz fotosustave I i II?
10. Koji udio ugljikovih atoma pretvorenih u glikol za vrijeme fotorespiracije biva sa~uvan s pomo}u peroksisoma? 11. Na koji se na~in proteini usmjeruju u peroksisome?
Literatura
Mitohondriji
Andersson, S. G. E., A. Zomorodipour, J. O. Andersson, T. Sicheritz-Ponten, U. C. M. Alsmark, R. M. Podowski, A. K. Naslund, A.-S. Eriksson, H. H. Winkler and C. G. Kurland. 1998. The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria. Nature 396: 133140. I Clayton, D. A. 1991. Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA. Ann. Rev. Cell Biol. 7: 453478. P Dietrich, A., J. H. Weil and L. MarechalDrouard. 1992. Nuclear-encoded transfer RNAs in plant mitochondria. Ann. Rev. Cell Biol. 8: 115131. P Gabriel, K., S. K. Buchanan and T. Lithgow. 2001. The alpha and the beta: Protein translocation across mitochondrial and plastid outer membranes. Trends Biochem. Sci. 26: 3640. P Gray, M. W., G. Burger and B. F. Lang. 1999. Mitochondrial evolution. Science 283: 14761481. P Jensen, R. E. and C. D. Dunn. 2002. Protein import into and across the mitochondrial inner membrane: Role of the TIM23 and TIM22 translocons. Biochim. Biophys. Acta 1592: 2534. P Lang, B. F., G. Burger, C. J. OKelly, R. Cedergren, G. B. Golding, C. Lemieux, D. Sankoff, M. Turmel and M. W. Gray. 1997. An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. Nature 387: 493497. I Luft, R. 1994. The development of mitochondrial medicine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 87318738. P Michel, H. 1998. The mechanism of proton pumping by cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1281912824. I Michikawa, Y., F. Mazzucchelli, N. Bresolin, G. Scarlato and G. Attardi. 1999. Agingdependent large accumulation of point mutations in the human mtDNA control region for replication. Science 286: 774779. I Neupert, W. and M. Brunner. 2002. The protein import motor of mitochondria. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3: 555565. P Peeters, N. and I. Small. 2001. Dual targeting to mitochondria and chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta 1541: 5463. P Pfanner, N. and A. Chacinska. 2002. The mitochondrial import machinery: Preproteinconducting channels with binding sites for presequences. Biochim. Biophys. Acta 1592: 1524. P Pfanner, N. and A. Geissler. 2001. Versatility of the mitochondrial protein import machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 339349. P Pfanner, N. and N. Wiedemann. 2002. Mitochondrial protein import: Two membranes, three translocases. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 400411. P Rapaport, D. 2002. Biogenesis of the mitochondrial TOM complex. Trends Biochem. Sci. 27: 191197. P Shadel, G. S. and D. A. Clayton. 1997. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates. Ann. Rev. Biochem. 66: 409435. P Stuart, R. 2002. Insertion of proteins into the inner membrane of mitochondria: The role of the Oxa1 complex. Biochim. Biophys. Acta 1592: 7987. P Wallace, D. C. 1999. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283: 14821488. P dont know them. Trends Biochem. Sci. 27: 564572. P Yoshida M., E. Muneyuki and T. Hisabori. 2001. ATP synthase a marvellous rotary engine of the cell. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 669677. P
Kloroplasti i ostali plastidi

Chen, X. and D. J. Schnell. 1999. Protein import into chloroplasts. Trends Cell Biol. 9: 222227. P Douce, R. and J. Joyard. 1990. Biochemistry and function of the plastid envelope. Ann. Rev. Cell Biol. 6: 173216. P Ellis, R. J. 1990. Molecular chaperones: The plant connection. Science 250: 954959. P Gruissem, W. 1989. Chloroplast gene expression: How plants turn their plastids on. Cell 56: 161170. P Jackson-Constan, D., M. Akita and K. Keegstra. 2001. Molecular chaperones involved in chloroplast protein import. Biochim. Biophys. Acta 1541: 102113. P Jarvis, P and J. Soll. 2002. Toc, Tic, and chloro. plast protein import. Biochim. Biophys. Acta 1590: 177189. P Rochaix, J. -D. 1992. Post-transcriptional steps in the expression of chloroplast genes. Ann. Rev. Cell Biol. 8: 128. P Subramanian, A. R. 1993. Molecular genetics of chloroplast ribosomal proteins. Trends Biochem. Sci. 18: 177180. P Sugiura, M. 1992. The chloroplast genome. Plant Mol. Biol. 19: 149168. P van Dooren, G. G., S. D. Schwartzbach, T. Osafune and G. I. McFadden. 2001. Translocation of proteins across the multiple membranes of complex plastids. Biochim. Biophys. Acta 1541: 3453. P
Mehanizam oksidativne fosforilacije

Hatefi, Y. 1985. The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Ann. Rev. Biochem. 54: 10151069. P Mitchell, P 1979. Keilins respiratory chain . concept and its chemiosmotic consequences. Science 206: 11481159. P Nicholls, D. G. and S. J. Ferguson. 2002. Bioenergetics, 3rd ed. London: Academic Press. Racker, E. 1980. From Pasteur to Mitchell: A hundred years of bioenergetics. Fed. Proc. 39: 210215. P Rastogi, V. and M. E. Girvin. 1999. Structural changes linked to proton translocation by subunit c of the ATP synthase. Nature 402: 263268. I Saraste, M. 1999. Oxidative phosphorylation at the fin de siecle. Science 283: 14881493. P Tielens, A. G., C. Rotte, J. J. Van Hellemond and W. Martin 2002. Mitochondria as we
Fotosinteza
Arnon, D. I. 1984. The discovery of photosynthetic phosphorylation. Trends Biochem. Sci. 9: 258262. P Barber, J. and B. Andersson. 1994. Revealing the blueprint of photosynthesis. Nature 370: 3134. P
434
Poglavlje 10
Bennett, J. 1979. The protein that harvests sunlight. Trends Biochem. Sci. 4: 268271. P Deisenhofer, J., O. Epp, K. Miki, R. Huber and H. Michel. 1985. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis. Nature 318: 618624. I Deisenhofer, J. and H. Michel. 1991. Structures of bacterial photosynthetic reaction centers. Ann. Rev. Cell Biol. 7: 123. P Kuhlbrandt, W., D. N. Wang and Y. Fujiyoshi. 1994. Atomic model of plant light-harvesting complex by electron crystallography. Nature 367: 614621. I Nicholls, D. G. and S. J. Ferguson. 2002. Bioenergetics, 3rd ed. San Diego, CA: Academic Press.
Rhee, K.-H., E. P Morris, J. Barber and W. . Kuhlbrandt. 1998. Three-dimensional structure of the plant photosystem II reaction centre at 8 resolution. Nature 396: 283286. I Rogner, M., E. J. Boekema and J. Barber. 1996. How does photosystem 2 split water? The structural basis of efficient energy conversion. Trends Biochem. Sci. 21: 4449. P Youvan, D. C. and B. L. Marrs. 1987. Molecular mechanisms of photosynthesis. Sci. Am. 256(6): 4248. P
Tabak, H. F., I. Braakman and B. Distel. 1999. Peroxisomes: Simple in function but complex in maintenance. Trends Cell Biol. 9: 447453. P Titorenko, V. I. and R. A. Rachubinski. 2001. The life cycle of the peroxisome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 357368. P Tolbert, N. E. 1981. Metabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes. Ann. Rev. Biochem. 50: 133157. P Van den Bosch, H., R. B. H. Schutgens, R. J. A. Wanders and J. M. Tager. 1992. Biochemistry of peroxisomes. Ann. Rev. Biochem. 61: 157197. P
Peroksisomi
Gould, S. J. and C. S. Collins. 2002. Peroxisomal-protein import: Is it really that complex? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3: 382389. P
Poglavlje
11
Citoskelet i stani~no kretanje
Struktura i organizacija aktinskih vlakana 435 Aktin, miozin i stani~no kretanje 447 Intermedijarna vlakna 455 Mikrotubuli 462 Mikrotubularni motori i kretnje 468
KLJU^NI POKUS: Ekspresija
mutiranoga keratina uzrokuje nenormalan razvitak koè 460 kinezina 470
KLJU^NI POKUS: Izolacija
RGANELI S VLASTITIM MEMBRANAMA, o kojima se raspravljalo u prethodnim poglavljima, ~ine jednu razinu organizacijske podstrukture eukariotske stanice. Sljede}u razinu organizacije odre|uje citoskelet sastavljen od mreè proteinskih vlakana {to se rasprostiru citoplazmom eukariotske stanice. Citoskelet ~ini strukturnu okosnicu stanice, sluè}i kao potporanj koji odre|uje oblik stanice i op}u organizaciju citoplazme. Uz ovu strukturnu ulogu, citoskelet je odgovoran i za stani~no kretanje. To ne uklju~uje samo kretanje cijele stanice, nego i unutra{nji transport organela i ostalih struktura (kao {to je mitoti~ki kromosom) kroz citoplazmu. Va`no je napomenuti da je stani~ni skelet puno manje krut i stalan nego {to to njegovo ime govori. Naprotiv, to je dinami~na struktura koja se trajno reorganizira u ovisnosti o kretanju stanica i promjeni njihova oblika, na primjer, tijekom stani~ne diobe. Citoskelet se sastoji od triju osnovnih tipova proteinskih vlakana: aktinskih vlakana, intermedijarnih vlakana i mikrotubula, koji su me|usobno povezani, a tako|er se putem razli~itih pomo}nih proteina veù i na unutarstani~ne organele i stani~nu membranu. U ovom }emo poglavlju raspravljati o strukturi i organizaciji svakog od ovih triju glavnih dijelova citoskeleta, kao i o njihovoj ulozi u stani~noj pokretljivosti, transportu organela, diobi stanice i ostalim vrstama stani~nog kretanja.
Struktura i organizacija aktinskih vlakana

Glavni protein citoskeleta ve}ine stanica je aktin, koji polimerizira stvaraju}i tanka aktinska vlakna gipka, savitljiva vlakna promjera pribli`no 7 nm i duljine sve do nekoliko mm (slika 11-1). Unutar stanice su aktinska vlakna (jo{ ih zovemo i mikrofilamenti) organizirana u sloènije strukture, {to oblikuju snopove ili trodimenzionalne mreè s obilje`jima polu~vrstih gelova. Izgradnja i razgradnja aktinskih vlakana, njihovo poprje~no povezivanje u snopove i mreè, te njihovo povezivanje s ostalim stani~nim strukturama (kao {to je stani~na membrana) regulirano je razli~itim proteinima koji veù aktin, klju~nim dijelovima aktinskog citoskeleta. Aktinska vlakna osobito su gusta ispod stani~ne mem-
436
Poglavlje 11
brane, gdje ~ine mreù {to daje mehani~ku potporu, odre|uje oblik stanice i dopu{ta kretanje stani~ne povr{ine, ~ime stanicama omogu}uju migraciju, gutanje ~estica i diobu.
Izgradnja i razgradnja aktinskih vlakana

Aktin je prvi put izoliran 1942. godine iz mi{i}ne stanice, gdje ~ini pribli`no 20% ukupne koli~ine stani~nih bjelan~evina. Iako se za aktin isprva mislilo da sudjeluje samo u mi{i}noj kontrakciji, danas znamo da se radi o izuzetno obilno prisutnom proteinu (tipi~no 5 do 10% svih proteina) u svih vrsta eukariotskih stanica. Kvasci imaju samo jedan aktinski gen, dok vi{i eukarioti imaju nekoliko razli~itih tipova aktina, koje kodiraju razli~iti ~lanovi aktinske porodice gena. Sisavci, na primjer, imaju najmanje {est razli~itih aktinskih gena: ~etiri se eksprimiraju u razli~itim tipovima mi{i}a, ostala dva se izraàvaju u nemi{i}nim stanicama. Pa ipak, svi su aktini u aminokiselinskom slijedu vrlo sli~ni jer su visoko konzervirani tijekom evolucije eukariota. Primjerice, aktin kvasca je 90% identi~an u aminokiselinskom slijedu aktina stanica sisavaca. Protein nazvan MreB, koji daje oblik {tapi}astim bakterijama, nedavno je identificiran kao prokariotski predak aktina. Trodimenzionalnu strukturu kako pojedina~nih molekula aktina tako i aktinskih vlakana odredili su 1990. godine Kenneth Holmes i Wolfgang Kabsch sa suradnicima. Pojedina~ne molekule aktina su globularni proteini od 375 aminokiselina (43 kd). Svaki monomer aktina (globularni G aktin) ima ~vrsta vezna mjesta {to posreduju u interakcijama glave i repa molekule s dva druga monomera aktina, tako da aktinski monomeri polimeriziraju oblikuju}i vlakna (vlaknasti F aktin)(slika 11-2). Svaki monomer je u vlaknima rotiran za 166, ~ime vlakna poprimaju oblik dvolan~ane uzvojnice. Kako su svi aktinski monomeri orijentirani u istom smjeru, aktinska vlakna imaju izraènu polarnost i njihove je krajeve mogu}e razlikovati (nazivaju se plus i minus kraj). Polarnost aktinskih vlakana va`na je kod njihovog zdruìvanja, a tako|er i u uspostavljanju jedinstvenog smjera kretanja miozina u odnosu na aktin, {to }e biti opisano ne{to dalje u ovom poglavlju. Zdruìvanje aktinskih vlakana moè se prou~avati in vitro regulacijom ionske jakosti otopina aktina. U otopinama niske ionske jakosti, aktinska se vlakna depolimeriziraju u monomere. Ako ionska jakost poraste do fiziolo{ke razine aktin }e spontano polimerizirati. Prvi korak u polimerizaciji aktina (nazvan nukleacija) oblikovanje je male nakupine od tri monomera aktina. Aktinska vlakna tada mogu rasti reverzibilnim dodavanjem monomera na oba kraja, no jedan se kraj (plus kraj) pritom produùje pet do deset puta brè od drugoga (minus kraja). Monomeri aktina tako|er veù ATP koji hidrolizira na ADP nakon zdruìvanja vlakana. Iako ATP nije nuàn za polimerizaciju, monomeri aktina na koje je vezan ATP polimeriziraju lak{e od onih na koje je vezan ADP Kao {to }e dalje biti opisano, vezanje ATP i nje. gova hidroliza imaju klju~nu ulogu u regulaciji zdruìvanja i dinami~kom pona{anju aktinskih vlakana. Zbog reverzibilnosti polimerizacije aktina, vlakna mogu depolimerizirati odvajanjem aktinskih podjedinica, dopu{taju}i aktinskim vlaknima raspad kad je to potrebno (slika 11-3). Dakle, postoji ravnoteà izme|u aktinskih monomera i vlakana, koja ovisi o koncentraciji slobodnih monomera. Brzina pripajanja monomera u aktinska vlakna proporcionalna je njihovoj koncentraciji, tako da postoji jedna kriti~na koncentracija aktinskih monomera pri kojoj je brzina njihove polimerizacije u vlakna jednaka brzini njihovog odvajanja. Pri toj kriti~noj koncentraciji, monomeri i vlakna su u dinami~koj ravnoteì. Kao {to je ve} spomenuto, dva kraja aktinskih vlakana rastu razli~itim brzinama, na na~in da se na brzorastu}i (plus) kraj monomeri dodaju pet
50 nm
Slika 11-1. Aktinska vlakna

Elektronskomikroskopska slika aktinskih vlakana. (Ljubazno{}u Rogera Craiga, University of Massachusetts Medical Center)
437
(A)
kraj
(C)
G aktin (B) kraj
dimer
trimer
+kraj F aktin
Slika 11-2. Zdruìvanje i struktura aktinskih vlakana.

(A) Monomeri aktina (G aktin) polimeriziraju stvaraju}i aktinska vlakna (F aktin). Prvi korak je stvaranje dimera i trimera, koji dalje rastu dodavanjem monomera na oba kraja. (B) Struktura monomera aktina. (C) Prostorni model F aktina. êtrnaest aktinskih monomera prikazano je razli~itim bojama. (C, Temeljeno na podatcima iz Chen et al. 2002. J. Struct. Biol. 138:92.)
+kraj
do deset puta brè nego na spororastu}i (minus) kraj. Budu}i da se ATP-aktin disocira teè od ADP-aktina, to rezultira razlikom u kriti~noj koncentraciji monomera potrebnoj za polimerizaciju na dva kraja. Ta razlika moè izazvati fenomen hoda u mjestu (engl. treadmilling), koji nam zorno prikazuje dinami~ko pona{anje aktinskih vlakana (slika 11-4). Da bi sustav bio u sveukupno stabilnom stanju, koncentracija slobodnih monomera aktina mora biti na srednjoj vrijednosti izme|u kriti~nih koncentracija potrebnih za polimerizaciju na plus i minus kraju aktinskih vlakana. Pod tim uvjetima, na minus kraju postoji neto gubitak monomera, koji je uravnoteèn s neto dodavanjem monomera na plus kraj. Hodanje u mjestu zahtijeva ATP gdje ATP-aktin polimerizira na plus kraju vlakna dok se ADP-aktin , odvaja s minus kraja. Iako uloga fenomena hodanja u mjestu u stanici jo{ uvijek nije jasna, pretpostavlja se da on moè utjecati na dinami~ku izgradnju i razgradnju aktinskih vlakana potrebnu za kretanje i promjenu oblika stanice.
k off
k on
Slika 11-3. Reverzibilna polimerizacija monomera aktina.

Polimerizacija aktina je reverzibilni proces u kojem se monomeri aktina istovremeno veù i odvajaju s krajeva aktinskih vlakana. Brzina odvajanja podjedinica (koff) ne ovisi o koncentraciji monomera, dok je brzina zdruìvanja podjedinica proporcionalna koncentraciji slobodnih monomera, a iznosi C kon (C = koncentracija slobodnih monomera). Dinami~ka ravnoteà se postiè pri kriti~noj koncentraciji monomera (Cc), gdje je koff = Cc kon.
438
Poglavlje 11
Slika 11-4. Fenomen hoda u mjestu.

Minus kraj raste sporije od plus kraja vlakna aktina. Ta se razlika u brzini rasta odraàva na razliku u koncentraciji potrebnoj za dodavanje monomera na krajevima vlakana. Aktin vezan na ATP veè se na brzorastu}i plus kraj, pri ~emu se ATP vezan na aktin hidrolizira u ADP Zbog lak{eg odvajanja ADP-ak. tina s aktinskih vlakana u odnosu na ATP-aktin, potrebna koncentracija monomera aktina je ve}a za dodavanje na minus nego na plus kraj aktinskih vlakana. Hod u mjestu doga|a se pri srednjoj koncentraciji monomera izme|u kriti~nih koncentracija za plus i minus kraj. Pod tim uvjetima, postoji neto disocijacija monomera (vezanih na ADP) s minus kraja, uravnoteèna s dodavanjem monomera (vezanih na ATP) na plus kraj.
kraj
ADP ADP ADP ADP ADP
Pi hidroliza ATP
ADP ADP
+kraj
ADP
ADP
ADP
ADP
ADP
ADP ADP
ADP
ADP
ADP
izmjena ATP i ADP
ADP
Vrijedno je spomena da nekoliko tvari korisnih u stani~noj biologiji djeluje vezanjem na aktin i utje~e na njegovu polimerizaciju. Na primjer, citohalazini se veù na plus kraj aktinskih vlakana i sprje~avaju njihovo produljivanje. To dovodi do promjena oblika stanice kao i do inhibicije nekih stani~nih pokreta (primjerice, stani~ne podjele tijekom mitoze), {to upu}uje na to da je polimerizacija aktina nu`na za navedene procese. Druga tvar, faloidin, veè se ~vrsto na aktinska vlakna i sprje~ava njihov raspad na pojedina~ne aktinske molekule. Faloidin obiljeèn fluorescentnom bojom ~esto se koristi za prikaz aktinskih vlakana fluorescentnim mikroskopom. Unutar stanice, proteini koji veù aktin reguliraju izgradnju i razgradnju aktinskih vlakana. Ova je promjena aktinskih vlakana oko 100 puta brà u stanici nego in vitro, i ima klju~nu ulogu u razli~itim stani~nim pokretima. Na primjer, gusto zbita aktinska vlakna na vode}em kraju migriraju}e stanice (opisane dalje u poglavlju) mogu se zdruìti u par sekunda. Klju~ za razumijevanje ovih procesa dobili smo zahvaljuju}i Tomu Pollardu i njegovim suradnicima koji su 1994. godine otkrili kompleks proteina nazvan Arp2/3 kompleks, koji se veè na aktin/ATP plus krajeve mikrofilamenata (slika 11-5). Arp2/3 kompleks sadràva sedam proteina od kojih su dva sli~na aktinu. Sam kompleks ima vrlo nisku aktivnost, ali se aktivira s pomo}u nekoliko proteina koji se na njega veù. Jednom aktiviran, Arp2/3 kom-
=
kraj
ADP
Arp2/3
Slika 11-5. Inicijacija ogranaka aktinskih vlakana.

Arp2/3 kompleks veè se na aktinska vlakna blizu plus kraja i zapo~inje oblikovanje ogranaka.
+kraj
439
(A)
=
kraj
Slika 11-6. Djelovanje ADF/kofilina i profilina na aktinska vlakna

ADF/kofilin ima dvojako djelovanje. (A) On je aktinski depolimerizacijski faktor, {to zna~i da se veè na aktinska vlakna i pove}ava brzinu odvajanja monomera aktina s minus kraja. ADF/kofilin ostaje vezan na aktin/ADP monomere, onemogu}uju}i tako njihovo ponovno zdruìvanje u vlakna. Profilin moè potaknuti izmjenu ADP za ATP s posljedi~nim , stvaranjem aktin/ATP monomera {to se mogu ponovo polimerizirati u vlakna. (B) ADF/kofilin se tako|er moè vezati na aktinska vlakna, te ih prekinuti stvaraju}i nove plus krajeve.
profilin
ADF/kofilin
ADP
+ kraj
kraj
(B) kraj + kraj
kraj ADF/kofilin
+ kraj
+ kraj
pleks veè se na stranu postoje}eg aktinskog vlakna blizu plus kraja i stvara novi ogranak. Druga porodica proteina odgovornih za preoblikovanje aktinskih vlakana unutar stanice je porodica ADF/kofilina (ADF od engl. actin depolymerizing factor) (slika 11-6). Ovi se proteini veù na aktinska vlakna i poja~avaju brzinu odvajanja aktin/ADP monomera s minus kraja. ADF/kofilin moè tako|er raskinuti aktinska vlakna stvaraju}i vi{e plus krajeva, ~ime poja~ava daljnje zdruìvanje vlakana. Kako se ADF/kofilin bolje veè na ADP-aktin, on po raspadu vlakana ostaje vezan na monomere aktina ostavljaju}i ih u ADP-veznom obliku, ~ime sprje~ava njihovo ponovno povezivanje u vlakna. Jedan drugi protein koji veè aktin, profilin, moè dokinuti ovo djelovanje kofilina i potaknuti zamjenu vezanog ADP za ATP s posljedi~nim , stvaranjem aktin/ATP monomera, koji se odvajaju od kofilina i ponovno su na raspolaganju za zdruìvanje u vlakna. Kao {to se i moè pretpostaviti, aktivnosti kofilina, profilina, i Arp2/3 kompleksa kontrolirane su razli~itim stani~nim signalnim mehanizmima (opisano u 13. poglavlju), koji omogu}uju da se polimerizacija aktina primjereno regulira kao odgovor na podraàje iz okoline. ADF/kofilin, profilin, te Arp2/3 kompleks (kao i ostali proteini koji veù aktin) stoga mogu za-
440
Poglavlje 11
jedni~ki djelovati u poticanju brzih promjena aktinskih vlakana i preure|enju aktinskog citoskeleta potrebnog za razli~ite stani~ne pokrete i promjene oblika stanice. To je njihova glavna zada}a: u nekim tipovima stanica izgradnja i razgradnja mikrofilamenata odgovorna je za polovinu hidrolize i tro{enja ATP u stanici.
Organizacija aktinskih vlakana

Pojedina aktinska vlakna udruùju se u dva glavna strukturna tipa, nazvana aktinski snopovi i aktinske mreè, koji imaju razli~ite uloge u stanici (slika 11-7). U snopovima su aktinska vlakna poprje~no povezana u tijesno stisnute paralelne redove. U mreàma, aktinska vlakna ukrièno su povezana u redove me|usobno gotovo okomite jedan na drugi, {to ~ine trodimenzionalne mreè s obilje`jima polu~vrstih gelova. Nastajanjem tih struktura upravljaju razli~iti proteini koji veù aktin i dovode do umreàvanja aktinskih vlakana u razli~itim uzorcima. Svi proteini koji veù aktin uklju~eni u umreàvanje sadràvaju najmanje dvije domene koje veù aktin, {to im omogu}uje da ukrièno poveù dva aktinska vlakna. Narav udruìvanja izme|u tih vlakana odre|ena je veli~inom i oblikom ovih proteina za ukrièno vezanje (vidi sliku 11-7). Proteini koji povezuju aktinska vlakna u snopove (nazvani proteinima koji usnopljuju aktin) naj~e{}e su mali kruti proteini {to prisiljavaju vlakna da se posloè blizu jedni drugima. Nasuprot njima, proteini {to organiziraju aktinska vlakna u mreè obi~no su veliki, savitljivi proteini {to mogu povezivati me|usobno okomita vlakna. Proteini koji ukrièno veù aktin jesu moduliraju}i proteini sa~injeni od srodnih strukturnih jedinica. Osobito se to odnosi na strukturnu sli~nost domene koja veè aktin mnogih spomenutih proteina. Domene koje veù aktin odvojene su sljedovima razmaka {to se razlikuju po duljini i savitljivosti, i upravo su te razlike u razmaknicama odgovorne za odlike ukriènog vezanja razli~itih proteina koji veù aktin. Postoje dva strukturno i funkcionalno razli~ita tipa snopova aktina, a oni uklju~uju razli~ite proteine koji usnopljuju aktin (slika 11-8). Prvi tip snopa sadràva tijesno zbijena paralelna vlakna aktina koja podupiru izbo~ine membrane citoplazme kao {to su mikrovili (vidi slike 11-6 i 11-7). U tim snopovima, sva vlakna imaju jednaku polarnost, tako da su plus krajevima okrenuta prema stani~noj membrani. Primjer proteina koji usnopljuje aktin uklju~enoga u stvaranje ovih struktura je fimbrin, koji je prvi put izoliran iz crijevnih mikrovila, a kasnije prona|en i u izdancima citoplazme mnogih razli~itih vrsti stanica. Fimbrin je protein od 68 kd, a sadràva dvije domene koje veù aktin {to se nalaze jedna blizu drugoj. Veè se na aktinska vlakna kao monomer, drè}i dva paralelna vlakna jedno uz drugo. Drugi tip aktinskoga snopa sastavljen je od vlakana izme|u kojih se nalazi vi{e mjesta, {to omogu}uje snopovima kontrakciju. Otvorenija struktumreà
Slika 11-7. Aktinski snopovi i mreè.

(A) Elektronskomikroskopska slika aktinskih snopova (vr{ci strjelica) {to str{e iz aktinske mreè (strjelice) ispod membrane citoplazme makrofaga. Snopovi podràvaju izbo~ine stani~ne povr{ine nazvane filopodijima (vidi sliku 11-18). (B) Shematska organizacija snopova i mreà. Aktinska vlakna u snopovima su poprje~no povezana u paralelna podru~ja s pomo}u malih proteina {to poravnavaju vlakna blizu jedno drugome. Nasuprot tome, mreè su oblikovane od velikih savitljivih proteina koji me|usobno povezuju okomita vlakna. (A, ljubazno{}u Johna H. Hartwiga, Brigham & Womens Hospital.)
(A)
(B) snop
0,1 mm
aktinska vlakna umreùju}i proteini
aktinska vlakna
umreùju}i proteini
441
Slika 11-8. Proteini koji veù aktin.

Vlakna aktina povezuju se u dva tipa snopova s pomo}u razli~itih proteina koji usnopljuju aktin. Fimbrin ima dvije susjedne domene koje veù aktin (ABD) i povezuje aktinska vlakna u tijesno zbijene paralelne snopove u kojima su vlakna udaljena pribli`no 14 nm. Nasuprot tomu, dvije odvojene domene koje veù aktin dimera -aktinina poprje~no povezuju vlakna u labavije kontraktilne snopove u kojima su vlakna odvojena 40 nm. I fimbrin i -aktinin sadràvaju dvije srodne domene koje veù Ca2+, a a-aktinin sadràva ~etiri ponavljaju}e -uzvojite domene razmaknice.
paralelni snop
ra tih snopova (nazvanih kontraktilni snopovi) odraàva svojstva ukrièno vezanog proteina a-aktinina. Za razliku od fimbrina, a-aktinin se veè na aktin kao dimer, a svaka njegova podjedinica je protein od 102 kd i ima jedno vezno mjesto za aktin. Vlakna povezana a-aktininom tako su me|usobno udaljenija nego ona povezana fimbrinom (40 nm umjesto 14 nm). Pove}an razmak izme|u vlakana dopu{ta motori~kom proteinu miozinu interakciju s aktinskim vlaknima, {to omogu}uje ovim snopovima kontrakcije (opisano dalje u poglavlju). Aktinska su vlakna u mreàma povezana velikim proteinima koji veù aktin, kao {to je filamin (slika 11-9). Filamin (poznat tako|er kao protein koji veè aktin ili ABP-280) veè aktin kao dimer od dvije podjedinice od po 280 kd. Domene koje veù aktin i dimerizacijske domene nalaze se na suprotnim krajevima svake podjedinice, pa je filaminski dimer fleksibilna molekula V-oblika s domenama koje veù aktin na krajevima svake ruke. Stoga filamin stvara ukriène veze izme|u me|usobno okomitih aktinskih vlakana stvaraju}i labavu trodimenzionalnu mreù. Kao {to }e biti raspravljano u sljede}em odlomku, takve mreè aktinskih vlakana nalaze se ispod stani~ne membrane i podupiru povr{inu stanice. Smje{taj razli~itih tipova aktinskih mreà i snopova u specifi~nim podru~jima stanice reguliran je djelomi~no i od strane jo{ jedne porodice proteina koji veù aktin, tropomiozinske porodice (opisano dalje). Karboksi-terminalna dimerizacijska domena je odvojena od amino-terminalne domene koja veè aktin s pomo}u ponavljaju}ih b-plo~astih domena razmaknice.
b-plo~asta domena razmaknice
aktinska vlakna ABD Ca2+-vezna domena kontraktilni snop ABD fimbrin
dimerizacijska domena
domena koja veè aktin
aktinska vlakna ABD
aktinska vlakna a-uzvojita domena razmaknice
Slika 11-9. Aktinska mreà i filamin.

Filamin je dimer od dvije velike (280kd) podjedinice {to ~ine fleksibilnu molekulu V-oblika koja ukrièno povezuje aktinska vlakna u pravokutnu mreù.
a-aktinin ABD
442
Poglavlje 11
Slika 11-10. Morfologija crvenih krvnih stanica.

Pretra`na elektronskomikroskopska slika crvenih krvnih stanica prikazuje njihov bikonkavni oblik. (Omikron / Photo Researchers, Inc.)
5 mm
Udruìvanje aktinskih vlakana sa stani~nom membranom

Aktinska vlakna visoko su koncentrirana u perifernim dijelovima stanice gdje oblikuju trodimenzionalne mreè ispod stani~ne membrane (vidi sliku 11-7). Ova mreà aktinskih vlakna i s njima povezanih proteina koji veù aktin (nazvana stani~na kora) odre|uje oblik stanice i uklju~ena je u razli~ite aktivnosti stani~ne povr{ine, uklju~uju}i kretanje. Povezanost aktinskog citoskeleta sa stani~nom membranom zato predstavlja jedno od klju~nih pitanja stani~ne strukture i funkcije. Crvene krvne stanice (eritrociti) pokazale su se osobito korisnima u istraìvanjima kako stani~ne membrane ({to je opisano u idu}em poglavlju), tako i citoskeleta stani~ne kore. Temeljna prednost crvenih krvnih stanica za ovakva istraìvanja jest ta {to one nemaju ni jezgru niti unutra{nje organele, pa im stani~na membrana, zajedno s proteinima koji su za nju vezani, moè biti izolirana bez zaga|enja razli~itim unutarstani~nim membranama kakvih je puno kod ostalih vrsti stanica. Osim toga, eritrociti ~ovjeka nemaju ostale dijelove citoskeleta (mikrotubule i intermedijarna vlakna), tako da je isklju~ivo kortikalni citoskelet odgovoran za njihov osobit oblik bikonkavnih diskova (slika 11-10). Glavni protein {to daje strukturni temelj kortikalnom citoskeletu u eritrocitima je protein koji veè aktin spektrin (slika 11-11). Spektrin je ~lan velike kalponinske porodice proteina koji veù aktin, koja uklju~uje a-aktinin i fimbrin. Spektrin eritrocita je tetramer sa~injen od dvaju razli~itih polipeptidnih lanaca, a i b, molekularne mase 240 i 220 kd. b-lanac ima jednu domenu koja veè aktin na svom amino-kraju. a i b lanac udruùju se pobo~-
Slika 11-11. Struktura spektrina.

Spektrin je tetramer sa~injen od dva a i dva b lanca. Svaki b lanac ima jednu domenu koja veè aktin (ABD) na svom amino-kraju. Oba a i b lanca sadràvaju vi{estruka ponavljanja a-uzvojitih domena razmaknice, koja razdvajaju dvije domene koje veù aktin tetramera. a-lanac ima dvije domene koje veù Ca2+ na svom karboksi-kraju.
spektrinski tetramer ABD b-lanac
a-uzvojita domena
b-plo~asta domena
a-lanac
a-lanac domena koja veè Ca2+
b-lanac
ABD
443
glikoforin vrpca 3
ankirin aktin
protein 4.1 spektrin
no da bi oblikovali dimere, koji se zatim spajaju u tetramere s dvije domene koje veù aktin razdvojene pribli`no 200 nm. Krajevi spektrinskih tetramera tada se povezuju s kratkim aktinskim vlaknima ~ine}i spektrin-aktinsku mreù koja oblikuje citoskelet kore crvenih krvnih stanica (slika 11-12). Glavnu sponu izme|u spektrin-aktinske mreè i stani~ne membrane ~ini protein nazvan ankirin, koji se veè i na spektrin i na citoplazmatsku domenu, u ve}oj koli~ini prisutnoga, transmembranskog proteina nazvanog vrpca 3. Dodatnu vezu izme|u spektrin-aktinske mreè i stani~ne membrane ~ini protein 4.1, koji se veè na spektrin-aktinska spojna mjesta, a prepoznaje i citoplazmatsku domenu glikoforina (jo{ jedan obilno prisutan transmembranski protein). I druge vrste stanica sadràvaju poveznice izme|u kortikalnog citoskeleta i stani~ne membrane sli~ne onima uo~enim kod crvenih krvnih stanica. Proteini srodni spektrinu (ne-eritroidni spektrin naziva se jo{ i fodrin), ankirin i protein 4,1 eksprimiraju se u mnogim tipovima stanica, gdje izvr{avaju uloge analogne onima opisanim kod eritrocita. Na primjer, porodica proteina srodna s proteinom 4,1 (ERM proteini) povezuje aktinska vlakna sa stani~nom membranom mnogih razli~itih vrsti stanica, a filamin (vidi sliku 119) tvori glavnu sponu izme|u aktinskih vlakana i stani~ne membrane krvnih plo~ica. Jo{ jedan ~lan kalponinske porodice proteina, distrofin, od osobitog je interesa zbog ~injenice da je proizvod gena odgovornog za dva tipa mi{i}ne distrofije (Duchenneovu i Beckerovu). Te nasljedne bolesti vezane uz spolni X kromosom rezultiraju progresivnom degeneracijom skeletnih mi{i}a, a bolesnici s teìm oblikom bolesti (Duchenneova mi{i}na distrofija) obi~no umiru u adolescenciji ili u ranim dvadesetim godinama ìvota. Molekularno kloniranje gena odgovornog za ovaj poreme}aj otkrilo je da on kodira veliki protein (427 kd) koji je ili odsutan ili nenormalan u bolesnika s Duchenneovom i Beckerovom mi{i}nom distrofijom. Aminokiselinski slijed distrofina pokazuje prisutnost jedne domene koja veè aktin na njegovom amino-kraju i membransku veznu domenu na karboksilnom kraju. Kao i spektrin, distrofin stvara dimere {to spajaju aktinska vlakna na transmembranske proteine stani~ne membrane mi{i}ne stanice. Ti transmembranski proteini dalje povezuju citoskelet s izvanstani~nim matriksom, {to ima va`nu ulogu u odràvanju stani~ne stabilnosti tijekom mi{i}ne kontrakcije.
Slika 11-12. Zdruìvanje citoskeleta kore eritrocita sa stani~nom membranom.

Stani~na je membrana povezana s mreòm spektrinskih tetramera poprje~no povezanih kratkim aktinskim vlaknima s proteinom 4.1. Spektrin-aktinska mreà povezana je s membranom s pomo}u ankirina, koji se veè i na spektrin i na obilato prisutni transmembranski protein vrpca 3. Dodatna spona proistje~e iz vezanja proteina 4,1 s glikoforinom.
444
Poglavlje 11
snopovi aktinskih vlakna
Slika 11-13. Tla~na vlakna i àri{ne adhezije.

Fluorescentna mikroskopija fibroblasta ~ovjeka u kojem su aktinska vlakna obojena fluorescentnom bojom. Tla~na vlakna prikazana su kao snopovi aktinskih vlakana usidreni na mjestima stani~nog dodira s povr{inom posude za kulturu stanica (àri{ne adhezije). (Don Fawcett / Photo Researchers, Inc.)
Za razliku od jedinstvene povr{ine crvenih krvnih stanica, ve}ina stanica ima specijalizirana podru~ja stani~ne membrane koja se dodiruju sa susjednim stanicama, dijelovima tkiva ili ostalim povr{inama (kao {to je povr{ina posude za kulturu stanica). Ta podru~ja sluè kao mjesta za pri~vr{}ivanje snopova aktinskih vlakna {to usidruju citoskelet za podru~ja dodira stanice. Ova mjesta za pri~vr{}ivanje osobito su jasno vidljiva kod fibroblasta u stani~noj kulturi (slika 11-13). Takvi fibroblasti u kulturi izlu~uju proteine izvanstani~nog matriksa (o ~emu }e biti rije~i u 12. poglavlju) {to se lijepe za povr{inu posude za kulturu stanica. Fibroblasti se zatim priljubljuju za posudu vezanjem transmembranskih proteina (nazvanih integrini) na izvanstani~ni matriks. Mjesta pri~vr{}ivanja su posebna podru~ja (nazvana àri{ne adhezije) {to tako|er sluè i kao mjesta za pri~vr{}ivanje velikih snopova aktinskih vlakana zvanih tla~na (stresna) vlakna. Tla~na vlakna su kontraktilni snopovi aktinskih vlakana, poprje~no povezani s pomo}u a-aktinina, {to usidruju stanicu i nastoje odràti napetost naspram podloge. Sa stani~nom membranom spojeni su na àri{tima adhezije interakcijom s integrinom. Takva sloèna i jo{ uvijek nedovoljno prou~ena povezivanja posredovana su s nekoliko razli~itih proteina, uklju~uju}i talin i vinkulin (slika 11-14). Na primjer, i talin i a-aktinin veù se na citoplazmatsku domenu integrina. Talin se tako|er veè na vinkulin, koji zatim stupa u interakciju s aktinom. Ostali proteini prona|eni na àri{nim adhezijama mogu tako|er sudjelovati u pri~vr{}ivanju aktinskih vlakana, a kombinacija tih interakcija mo`da je odgovorna za vezanje aktinskih vlakana na stani~nu membranu. Na sli~an na~in usidren je i aktinski citoskelet u podru~jima stani~no-stani~nih dodira nazvanim prianjaju}i (sdhezivni) spojevi (slika 11-15). U plo~ama epitelnih stanica, ti spojevi stvaraju neprekidnu pojasastu strukturu (nazvanu adhezijski pojas) oko svake stanice, a u njoj se nalazi kontraktilni snop aktinskih vlakana povezan sa stani~nom membranom. Dodir izme|u stanica na prianjaju}im spojevima posredovan je transmembranskim
a-aktinin
Slika 11-14. Pri~vr{}ivanje tla~nih vlakana na stani~nu membranu u àri{nim adhezijama

@ari{ne adhezije nastaju vezanjem integrina na proteine izvanstani~nog ma triksa. Tla~na vlakna (snopovi aktinskih vlakana poprje~no povezani -aktininom) tada se povezuju s citoplazmatskom domenom integrina sloènim udruìvanjima {to uklju~uju brojne proteine. Dvije mogu}nosti udruìvanja prikazane su na slici: 1) talin se veè na integrin i vinkulin, a ovaj posljednji zatim se dalje veè na aktin, i 2) integrin se veè na -aktinin. I mnogi drugi proteini (nisu prikazani) mogu biti uklju~eni u sidrenje tla~nih vlakana u stani~nu membranu.
aktinsko vlakno vinkulin talin
stani~na membrana
integrin
izvanstani~ni matriks
445
okolina stanice a b a b a b a b a b aktinska vlakna b b b b b kadherin a a a a a stani~na membrana katenini
Slika 11-15. Vezanje aktinskih vlakana na adherentne spojeve.

Me|ustani~ni i dodiri na prianjaju}im spojevima posredovani su kadherinima, koji sluè kao mjesta za pri~vr{}ivanje aktinskih snopova. U plo~ama epitelnih stanica ti spojevi tvore neprekidni pojas aktinskih vlakana oko svake stanice. Kadherini su transmembranski proteini {to veù b-katenin na svoju citoplazmatsku domenu. b-katenin je u interakciji s a-kateninom, koji pak sluì kao veza za aktinska vlakna.
proteinima kadherinima o kojima }e biti raspravljano u 12. poglavlju. Kadherini oblikuju sloène tvorbe s citoplazmatskim proteinima kateninima, a katenini se zdruùju s aktinskim vlaknima.
Izbo~enja stani~ne povr{ine

Povr{ina ve}ine stanica ima razli~ita izbo~enja uklju~ena u stani~no pokretanje, fagocitozu ili specijalizirane funkcije kao {to je apsorpcija hranjivih tvari. Ve}ina tih povr{inskih izbo~enja temelji se na aktinskim vlaknima, koja su organizirana bilo u relativno stalne ili pak brzo reorganiziraju}e snopove ili mreè. Najdetaljnije prou~ena izbo~enja stani~ne povr{ine su mikrovili, prstasta izduènja stani~ne membrane {to su osobito obilno prisutna na povr{inama stanica uklju~enih u apsorpciju, kao primjerice, epitelnih stanica na povr{ini crijeva (slika 11-16). Mikrovili tih stanica tvore sloj na apikalnoj povr{ini (nazvan ~etkasta membrana) {to se sastoji od pribli`no tisu}u mikrovila po stanici, ~ime se izloèna povr{ina za apsorpciju pove}ava 10 do 20 puta. Osim njihove uloge u apsorpciji, specijalizirani oblici mikrovila, na zvani stereocilije, osjetnih slu{nih dla~ica odgovorni su za sluh jer otkrivaju vibracije zvuka. Obilna prisutnost i lako}a izolacije olak{ali su detaljne strukturne analize crijevnih mikrovila, koji se sastoje od tijesno zbitih paralelnih snopova od 20 do 30 aktinskih vlakana (slika 11-17). Vlakna u tim snopovima djelomi~no su popre~no povezana fibrinom, proteinom koji usnopljuje aktin (o kojem se raspravljalo prije) {to je prisutan u stani~nim izbo~enjima razli~iSlika 11-16. Elektronskomikroskopska slika mikrovila.
Mikrovili crijevnih epitelnih stanica prstaste su izbo~ine stani~ne membrane. Podupiru ih aktinski snopovi usidreni u gusto podru~je kore nazvano zavr{na mreà. (Ljubazno{}u Nobutaka Hirokawe.)
0,25 mm
446
Poglavlje 11
+kraj
Slika 11-17. Organizacija mikrovila.

Sredi{nja aktinska vlakna mikrovila poprje~no su povezana u tijesno zbite snopove s pomo}u fimbrina i vilina. Na stani~nu su membranu vlakna aktina vezana po duljini s pomo}u bo~nih ruku {to se sastoje od miozina I i kalmodulina. Plus krajevi aktinskih vlakna uloèni su u kapicu jo{ uvijek neidentificiranih proteina na vrhu mikrovila.
stani~na membrana
aktinska vlakna
bo~na ruka (miozin I kalmodulin)
vilin i fimbrin
zavr{na mreà
tih vrsti stanica. Ipak, glavni protein koji usnopljuje aktin u crijevnim mikrovilima je vilin, protein od 95kd prisutan u mikrovilima samo nekoliko specijaliziranih vrsti stanica, kao onima {to oblaù crijevo i tubule bubrega. Uzdu` cijelih mikrovila, aktinski su snopovi vezani na stani~nu membranu bo~nim rukama {to se sastoje od proteina koji veè kalcij, kalmodulina zdruènog s miozinom I, a ovaj posljednji moè biti uklju~en u pokrete stani~ne membrane du` aktinskog snopa mikrovila. Svojom bazom, aktinski su snopovi usidreni u spektrinom bogato podru~je aktinske kore nazvano zavr{na mreà, koja povezuje i stabilizira mikrovile. Nasuprot mikrovilima, mnoga povr{inska izbo~enja su prolazne strukture {to nastaju kao odgovor na podraàje iz okoline. Nekoliko tipova tih struktura proteù se s vode}eg ruba stanice u pokretu i uklju~eni su u stani~no kretanje (slika 11-18). Pseudopodiji su izbo~enja promjenjive duìne odgovorna za fagocitozu i kretanje ameba. Lamellipodiji su {iroka, plahtolika izbo~enja na vode}em rubu fibroblasta, koja sli~no pseudopodijima sadràvaju mreù aktinskih vlakna. Mnoge stanice tako|er izbo~uju mikro{iljke ili filopodiji, tanka izbo~enja stani~ne membrane poduprta aktinskim snopovima. Stvaranje i nestajanje (povla~enje) tih struktura temelji se na precizno reguliranoj izgradnji i razgradnji aktinskih vlakna, {to }e biti opisano u idu}em odlomku.
Slika 11-18. Primjeri izbo~enja stani~ne povr{ine uklju~enih u fagocitozu i kretanje.
(A) Pretra`na elektronskomikroskopska slika pseudopodija makrofaga {to guta tumorsku stanicu tijekom fagocitoze. (B) Ameba s nekoliko izduènih pseudopodija. (C) Ilustracija lamelipodija (L) i filopodija (strjelica) na stanici iz kulture tkiva. (A, K.Wassermann / Visuals Unlimited; B, Stanley Flegler / Visuals Unlimited; C, Don Fawcett / Photo Researchers, Inc.)
(A)
(C) L
447
Aktin, miozin i stani~no kretanje

Aktinska valkna, obi~no zdruèna s miozinom, odgovorna su za mnoge vrste stani~nog kretanja. Miozin je prototip molekularnog motora protein koji kemijsku energiju u obliku ATP pretvara u mehani~ku energiju, tako proizvode}i silu i kretanje. Najdojmljiviji primjer takvoga kretanja jest mi{i}na kontrakcija, koja je postala model za razumijevanje interakcija aktina i miozina, i motori~ke aktivnosti miozinskih molekula. Pa ipak, interakcije aktina i miozina nisu odgovorne samo za mi{i}nu kontrakciju, ve} i za niz pokreta nemi{i}nih stanica, uklju~uju}i diobu stanice, pa se moè re}i da su ove interakcije od klju~ne va`nosti u stani~noj biologiji. [tovi{e, aktinski citoskelet je odgovoran za puzanje stanica po povr{ini, a ~ini se da je ono direktno vo|eno aktinskom polimerizacijom, kao i interakcijama aktina i miozina.
Mi{i}na kontrakcija
Mi{i}ne su stanice visoko specijalizirane za jedinstvenu zada}u, kontrakciju, i ta specijalizacija u strukturi i funkciji ~ini mi{i} prototipom za istraìvanje kretanja na stani~noj i molekularnoj razini. U kralje`njaka postoje tri razli~ita tipa mi{i}nih stanica: skeletni mi{i} odgovoran za sve voljne pokrete, sr~ani mi{i} {to pumpa krv iz srca, i glatki mi{i} odgovoran za nevoljne pokrete organa kao {to su èludac, crijevo, maternica i krvne ìle. U skeletnom i sr~anom mi{i}u kontraktilni elementi citoskeleta raspore|eni su vrlo precizno i pravilno, {to daje karakteristi~nu sliku poprje~ne ispruganosti. Prou~avanje tih struktura u skeletnom mi{i}u dovelo je do na{ih dana{njih spoznaja o kontrakciji mi{i}a, kao i drugim, na aktinu utemeljenim stani~nim pokretima na molekularnoj razini. Skeletni mi{i}i su snopovi mi{i}nih vlakana, jedinstvenih velikih stanica (promjera pribli`no 50 m i nekoliko centimetara duga~kih) nastalih stapanjem (fuzijom) mnogih individualnih stanica tijekom razvoja (slika 11-19). Ve}ina citoplazme im se sastoji od miofibrila, cilindri~nih snopova sastavljenih od dvaju tipova vlakana: debelih vlakana miozina snop mi{i}nih vlakana (promjera oko 15 nm) i tankih vlakana aktina (promjera oko 7 nm). Svaka miofibrila organizirana je mi{i} kao lanac kontraktilnih jedinica nazvanih sarkomere, koje su odgovorne za poprje~no-prugasti izgled skeletnog i sr~anog mi{i}a.
jedno mi{i}no vlakno (mi{i}na stanica)
jezgra stani~na membrana
Slika 11.19. Struktura mi{i}nih stanica.

Mi{i}i su izgra|eni od snopova pojedina~nih velikih stanica (zovemo ih mi{i}na vlakna) {to nastaju stapanjem stanica i stoga sadràvaju mnogobrojne jezgre. Svako mi{i}no vlakno sadràva veliki broj miofibrila, koje se sastoje od snopova aktinskih i miozinskih vlakana organiziranih u lance ponavljaju}ih jedinica zvanih sarkomere.
A-pruga Z-plo~a
miofibrila Z-plo~a
sarkomera
448
(A)
Poglavlje 11
I-pruga
A-pruga
Slika 11-20. Struktura sarkomere.

(A) Elektronskomikroskopska slika sarkomere. (B) Dijagram prikazuje organizaciju aktinskih (tankih) i miozinskih (debelih) vlakana u ozna~enim podru~jima. (A, Frank A. Pepe/ Biological Photo Service.)
0,5 mm (B) H-pruga aktin miozin
Z-plo~a
linija M sarkomera
Sarkomere (duga~ke pribli`no 2,3 mm) sastoje se od nekoliko razli~itih podru~ja vidljivih elektronskim mikroskopom, a ti su podatci dali klju~ne informacije za razumijevanje mehanizma mi{i}ne kontrakcije (slika 11-20). Krajevi svake sarkomere ome|eni su Z-plo~ama. Kroz svaku sarkomeru, tamna podru~ja (nazvana A-pruge, jer su anizotropne za polarizirano svjetlo) izmjenjuju se sa svijetlim podru~jima (nazvanim I-prugama, jer su uglavnom izotropne za polarizirano svjetlo). Te pruge odgovaraju prisutnosti ili odsutnosti miozinskih vlakana. I-pruge sadràvaju samo tanka (aktinska) vlakna, dok A-pruge sadràvaju debela (miozinska) vlakna. Miozinska i aktinska vlakna preklapaju se u perifernim dijelovima A-pruge, dok sredi{nje podru~je (nazvano zona H) sadràva samo miozin. Aktinska vlakna vezana su svojim plus krajem na Z-plo~u, {to uklju~uje i umreùju}i protein a-aktinin. Miozinska su vlakna usidrena u liniji M u sredini sarkomere. Dva dodatna proteina (titin i nebulin) tako|er pridonose gra|i i stabilnosti sarkomere (slika 11-21). Titin je izuzetno velik protein (3.000 kd), a jedna titinska molekula proteè se od linije M do Z-plo~e. Za ove duga~ke molekule titina misli se da djeluju poput opruga {to drè miozinska vlakna centrirana u sarkomeri i tako zadràvaju stalnu napetost u mirovanju {to u slu~aju prevelike istegnutosti omogu}uje mi{i}u brzi povratak u prija{nje stanje. Nebulinska vlakna su zdruèna s aktinom, a misli se da reguliraju
Z-plo~a
aktin
nebulin
miozin
titin
Slika 11-21. Titin i nebulin.

Molekule titina pruàju se od Z-plo~e do linije M i djeluju kao opruge {to zadràvaju miozinska vlakna u sredi{njem dijelu sarkomere. Molekule nebulina tako|er se proteù od Z-plo~e prema liniji M, a misli se da odre|uju duljinu s njima zdruènih aktinskih vlakna.
linija M
449
Z-plo~a + kraj
aktin kraj linija M
miozin kraj + kraj
Slika 11-22. Model mi{i}ne kontrakcije klizanjem vlakana.

Aktinska vlakna klize izme|u miozinskih vlakana prema sredini sarkomere. Rezultat je skra}ivanje sarkomere bez ikakve promjene u duljini vlakna.
klizanje vlakana kontrakcija
zdruìvanje aktinskih vlakana djeluju}i poput ravnala {to odre|uje njihovu duljinu. Temelj za razumijevanje mi{i}ne kontrakcije je model klizanja vlakana, {to su ga prvi put, 1954. godine istovremeno predloìli Andrew Huxley i Ralph Niedergerk, te Hugh Huxley i Jean Hanson (slika 11-22). Tijekom mi{i}ne kontrakcije, svaka se sarkomera skra}uje pribliàvaju}i Z-plo~e jednu drugoj. Nema promjene u {irini A-pruge, ali i I-pruga i zona H gotovo potpuno nestaju. Te promjene obja{njavaju se aktinskim i miozinskim filamentima {to klize jedni preko drugih, tako da aktinska vlakna ulaze u A-prugu i zonu H. Kontrakcija mi{i}a stoga je rezultat interakcije izme|u aktinskih i miozinskih vlakana, koja je ujedno i odgovorna da je njihovo kretanje me|usobno ovisno. Molekularni temelj za tu interakciju jest vezanje miozina na aktinska vlakna jer omogu}uje miozinu da djeluje kao motor {to pokre}e klizanje vlakana. Tip miozina prisutan u mi{i}u (miozin II) je vrlo velik protein (oko 500 kd) sastavljen od dvaju identi~nih te{kih lanaca (svaki od 200 kd), te dva para lakih lanaca (svaki 20 kd) (slika 11-23). Svaki te{ki lanac sastoji se od globularnog podru~ja glavice i duga~kog repa u obliku a-uzvojnice. a-uzvojiti repovi dvaju te{kih lanaca zavijaju jedan oko drugog u pletenasto-uzvojitu strukturu oblikuju}i dimer, a dva laka lanca zdruùju se s vratom svakog podru~ja glavice tvore}i potpunu molekulu miozina II. Debela mi{i}na vlakna sastoje se od nekoliko stotina miozinskih molekula zdruènih u paralelne razmaknute redove, a za to su odgovorne interakcije izme|u njihovih repova (slika 11-24). Globularne glavice miozina veù aktin, oblikuju}i poprje~ne mostove izme|u tankih i debelih vlakana. Va`no je uo~iti da je orijentacija miozinskih molekula kod debelih vlakana obrnuta u odnosu na M liniju sarkomere. Polarnost aktinskih vlakana ({to su vezana na Z-plo~e svojim plus krajevima) jednako je obrnuta s obzirom na M liniju, tako da je odnos miozinskih i aktinskih vlakana jednih naspram drugima jednak na objema polovicama sarkomere. Kao {to }e biti
Slika 11-23. Miozin II.
Molekule miozina II sastoje se od dvaju te{kih lanaca i dva para lakih lanaca (nazvanih temeljni i regulacijski laki lanci). Te{ki lanci imaju globularna podru~ja glavice i duge a-uzvojite repove {to zavijaju jedan oko drugog oblikuju}i dimer.
ELC (od engl. essential light chain; temeljni laki lanac) globularno podru~je glavice te{ki lanac
RLC (od engl. regulatory zavojnica od dva light chain; a-uzvojita repa regulacijski laki lanac)
450
Poglavlje 11
Z-plo~a
aktin
skupine miozinskih glavica
debelo miozinsko vlakno
+ kraj
kraj
M linija
kraj
+k kraj
+ kraj
kraj
Slika 11-24. Organizacija debelih miozinskih vlakana.

Debela vlakna stvaraju se zdruìvanjem nekoliko stotina molekula miozina II u na~i~kane nizove s razmaknutim glavicama. Globularne glavice miozina veù aktin stvaraju}i poprje~ne mostove izme|u miozinskih i aktinskih vlakana. Orijentacija i aktinskih i miozinskih vlakana obrnuta je s obzirom na M liniju, pa je polarnost jednih u odnosu na druge jednaka na objema stranama sarkomere.
razdvajanje aktin-miozinskog kompleksa
P konformacijska promjena pomi~e glavicu miozina
se na novi poloàj na aktinu ADP
+Pi
miozinska glavica vra}a se u po~etni poloàj klizanje aktinskog vlakna
opisano dalje, motori~ka aktivnost miozina pomi~e njihove skupine glavica du` aktinskog vlakna u smjeru plus kraja. Tim kretanjem aktinska vlakna klize s obje strane sarkomere prema M liniji, skra}uju}i sarkomeru i dovode}i do mi{i}ne kontrakcije. Osim vezanja aktina, miozinske glavice veù i hidroliziraju ATP koji da, je energiju za klizanje vlakna. Ta pretvorba kemijske energije u kretanje posredovana je promjenama u obliku miozina, a kao rezultat vezanja ATP . Op}e prihva}en model (model pokretnoga poprje~noga mosta) jest da hidroliza ATP pokre}e ponavljaju}e cikluse interakcije izme|u miozinskih glavica i aktina. Tijekom svakog ciklusa, konformacijske promjene miozina rezultiraju kretanjem miozinskih glavica du` aktinskih vlakana. Iako molekularni mehanizmi jo{ uvijek nisu u potpunosti shva}eni, prihvatljiv radni model djelovanja miozina izveden je iz in vitro studija kretanja miozina du` aktinskog vlakna (model su razvili James Spudich i Michael Sheetz), te odre|ivanja trodimenzionalne strukture miozina Ivana Raymenta i suradnika (slika 11-25). Ciklus zapo~inje miozinom (u odsutnosti ATP) ~vrsto vezanim na aktin. Vezanje ATP razdvaja miozin-aktin kompleks, a hidroliza ATP tada izaziva konformacijske promjene miozina. Ova promjena utje~e na podru~je vrata miozina koji veè laki lanac (slika 1123), te djeluje kao poluga za pomicanje miozinske glavice za oko 5 nm. Produkti hidrolize (ADP i Pi) ostaju vezani na miozinsku glavicu, za koju se kaè da se sad nalazi u neodrìvom poloàju. Miozinska glavica tada se ponovno veè na novu poziciju na aktinskom vlaknu, {to dovodi do otpu{tanja ADP i Pi, i zapo~injanja sna`nog zamaha kojim se miozinska glavica vra}a u svoju po~etnu konformaciju, uslijed ~ega aktinska vlakna otkliù prema M liniji sarkomere. Kontrakcija skeletnog mi{i}a zapo~inje ìv~anim impulsom {to poti~e otpu{tanje Ca2+ iz sarkoplazmatskog retikula specijalizirane mreè unutra{njih membrana, sli~ne endoplazmatskom retikulu, {to sadràva visoke
Slika 11-25. Model djelovanja miozina.

Vezanjem ATP razdvaja se miozin od aktina. Hidroliza ATP tada izaziva konformacijsku promjenu koja pomi~e skupinu glavica miozina. Uslijedi vezanje glavice miozina na novi poloàj na aktinskom vlaknu, te otpu{tanje ADP i Pi. Ponovna pretvorba glavice miozina u po~etnu konformaciju pokre}e klizanje aktinskog vlakna.
451
(A)
tropomiozin troponinski kompleks TnI TnC TnT Ca2+
aktin
izloèna miozinska vezna mjesta
(B) TnC
TnI aktin
Ca2+ aktin
TnT miozinska vezna mjesta miozinske glavice tropomiozin
Slika 11-26. Zdruìvanje tropomiozina i troponina s aktinskim vlaknima.

(A) Tropomiozin se veè du` aktinskog vlakna i, u poprje~no-prugastom mi{i}u, zdruèn je s kompleksom triju troponina: troponin I (TnI), troponin C (TnC) i troponin T (TnT). U odsutnosti Ca2+, kompleks tropomiozin-troponin sprje~ava vezanje miozina na aktin. Vezanje Ca2+ na TnC pomi~e kompleks dokidaju}i ovu inhibiciju i omogu}uju}i nastavak kontrakcije. (B) Pogled na poprje~ni presjek.
koncentracije Ca2+ iona. Otpu{tanje Ca2+ iz sarkoplazmatskog retikula pove}ava koncentraciju Ca2+ u citosolu s 10-7 na 10-5 M. Pove}ana koncentracija Ca2+ signalizira mi{i}nu kontrakciju djelovanjem dvaju pomo}nih proteina vezanih na aktinska vlakna: tropomiozina i troponina (slika 11-26). Tropomiozin je vlaknasti protein koji se veè du` `lijeba aktinskih vlakna. Kod poprje~no-prugastog mi{i}a svaka tropomiozinska molekula vezana je na troponin, kompleks triju polipeptida: troponina C (Ca2+-veznog), troponina I (inhibitornog) i troponina T (tropomiozin-veznog). Kad je koncentracija Ca2+ niska, kompleks troponina s tropomiozinom sprje~ava interakciju aktina i miozina, pa se mi{i} ne kontrahira. Pri visokim koncentracijama, vezanje Ca2+ na troponin C pomi~e poloàj kompleksa, dokida ovu inhibiciju i dopu{ta nastavak kontrakcije.
Kontraktilne nakupine aktina i miozina u nemi{i}nim stanicama

Kontraktilne nakupine aktina i miozina, sli~ne umanjenoj verziji mi{i}nih vlakana, tako|er su prisutne i u nemi{i}nim stanicama. Kao i u mi{i}u, aktinska vlakna u tim su kontraktilnim nakupinama isprepletena s bipolar-
452
Poglavlje 11
Slika 11-27. Kontraktilne nakupine u nemi{i}nim stanicama.

Bipolarna vlakna miozina II stvaraju kontrakciju klizanjem aktinskih vlakana u suprotnim smjerovima.
aktinsko vlakno kraj
klizanje vlakna
miozin II klizanje vlakana
kontraktilni prsten
nim vlaknima miozina II, sastavljenim od 15 do 20 molekula miozina II, {to dovode do kontrakcije klizanjem jednih aktinskih vlakana u odnosu prema drugima (slika 11-27). Aktinska vlakna u kontraktilnim snopovima u nemi{i}nim stanicama povezana su tako|er tropomiozinom, koji olak{ava njihove interakcije s miozinom II, vjerojatno natjecanjem s filaminom za vezna mjesta na aktinu. Dva primjera kontraktilnih nakupina u nemi{i}nim stanicama, tla~na vlakna i adhezijski pojas, spominjani su ve} ranije u kontekstu pri~vr{}ivanja aktinskog citoskeleta za podru~ja dodira stanica-supstrat i stanica-stanica (vidi sliku 11-14 i 11-15). Kontrakcija tla~nih vlakana stvara napetost kroz stanicu, omogu}uju}i joj da se kre}e po supstratu (na primjer, izvanstani~nom matriksu) za koji je usidrena. Kontrakcija adhezijskih pojasa mijenja oblik plo~a epitelnih stanica: ovaj je proces osobito vaàn tijekom embrionalnog razvitka kad se plo~e epitelnih stanica savijaju u strukture poput cijevi. Najdramati~niji primjer aktin-miozinske kontrakcije u nemi{i}nim stanicama vidi se prilikom citokineze diobe jedne stanice u dvije u mitozi (slika 11-28). Pred kraj mitoze u ìvotinjskim stanicama nastaje kontraktilni prsten gra|en od nakupina aktinskih vlakana i miozina II tik ispod membrane citoplazme. Njegova kontrakcija povla~i membranu citoplazme sve vi{e prema unutra, steù}i sredi{te stanice i prepolavljaju}i je na dva dijela. Zanimljivo je da debljina kontraktilnog prstena ostaje stalna, {to pokazuje da se tijekom kontrakcije jedan dio aktinskih vlakana raspada. Nakon diobe stanice prsten u potpunosti nestaje. Regulacija aktin-miozinske kontrakcije u poprje~no-prugastom mi{i}u, opisana prije, posredovana je vezanjem Ca2+ na troponin. U nemi{i}nim stanicama i u glatkom mi{i}u kontrakcija je regulirana ponajprije fosforilacijom jednog od miozinskih lakih lanaca nazvanog regulacijski laki lanac (slika 11-29). Fosforilacija regulacijskoga lakog lanca u tim stanicama ima najmanje dva u~inka: promovira zdruìvanje miozina u vlakna, te pove}ava kataliti~ku aktivnost miozina omogu}uju}i nastavak kontrakcije. Enzim koji katalizira tu fosforilaciju nazvan je kinaza miozinskoga lakoga lanca, a njegova regulacija povezana je s proteinom koji veè Ca2+- kalmodulinom. Pove}anje koncentracije Ca2+ u citosolu poti~e vezanje kalmodulina na kinazu, {to rezultira fosforilacijom miozinskih regulacijskih lakih lanaca. Iako indirektno, pove}anje koncentracije Ca2+ u citosolu stoga je odgovorno za aktivaciju miozina u glatkim mi{i}ima i ne-mi{i}nim stanicama, ba{ kao i u poprje~no-prugastom mi{i}u.
Slika 11-28. Citokineza.
Po zavr{etku mitoze (podjele jezgre), kontraktilni prsten {to se sastoji od aktinskih vlakna i miozina II dijeli stanicu na dva dijela.
453
kalmodulin vezanje Ca2+
Ca2+ se veè na kalmodulin, koji se zatim veè na kinazu miozinskoga lakoga lanca (MLCK). Aktivni kalmodulin-MLCK kompleks tada fosforilira regulacijski laki lanac miozina II, pretvaraju}i miozin iz inaktivnog u aktivno stanje.
Slika 11-29. Regulacija miozina fosforilacijom.
MLCK aktivni kalmodulin/ MLCK kompleks
regulacijski laki lanac
ADP
inaktivni m ktivni miozin
aktivni mio vni miozin
Nekonvencionalni miozini
Kao dodatak miozinu II (konvencionalnom dvoglavom miozinu), u nemi{i}nim stanicama prona|eno je i nekoliko drugih tipova miozina. Za razliku od miozina II, ti nekonvencionalni miozini ne oblikuju vlakna i stoga nisu uklju~eni u kontrakcije. Svejedno, oni mogu biti uklju~eni u niz drugih stani~nih pokreta, kao {to su transport membranskih vezikula i organela du` aktinskih vlakana, fagocitoza i produljivanje pseudopodija kod ameba (slika 11-18). Primjer nekonvencionalnih miozina su ~lanovi porodice miozina I (slika 11-30). Proteini porodice miozina I imaju globularnu skupinu glavice koja djeluje kao molekularni motor, poput one miozina II. Ipak, ~lanovi porodice miozina I su puno manje molekule (oko 110 kd u stanicama sisavaca) koje nemaju duga~ki rep miozina II i ne oblikuju dimere. Njihovi se repovi umjesto toga mogu vezati na druge strukture, kao {to su membranske vezikule i organele. Kretanjem miozina I du` aktinskog vlakna moè se tako prenijeti na njega vezani teret. Jedna od funkcija miozina I, spomenuta prije, jest oblikovanje bo~nih ru~ica {to veù aktinske snopove na stani~nu membranu crijevnih mikrovila (vidi sliku 11-17). U ovim strukturama, motori~ka aktivnost miozina I moè pomicati stani~nu membranu du` aktinskih snopova prema vrhu mikrovila. Dodatne funkcije miozina I mogu biti transport vezikula i organela du` aktinskih vlakana, kretanje stani~ne membrane tijekom fagocitoze i produljivanje pseudopodija. Osim miozina I i II, identificirano je jo{ najmanje 12 drugih klasa nekonvencionalnih miozina (III do XIV). Neki od tih nekonvencionalnih miozina su jednoglavi kao miozin I, dok su drugi, primjerice, miozin V (slika 11-31), dvoglavi kao miozin II. Funkcije ve}ine ovih nekonvencionalnih miozina tek se trebaju otkriti, no za neke je ve} sada jasno pokazano da imaju va`nu ulogu u transportu tereta i kretanju organela (miozin V i VI), te u osjetilnim funkcijama kao {to su vid (miozin III) i sluh (miozin VI i VII). Povrh toga, neki od ovih miozina sudjeluju u reorganizaciji aktinskih vlakana.
aktinsko vlakno kraj kraj
glavica miozina I rep miozina I
membranska vezikula
Slika 11-30. Miozin I.

Miozin I ima jednu skupinu glavice sli~nu onoj miozina II, ali ima znatno kra}i rep, te ne oblikuje dimere i vlakna. Iako ne moè izazvati kontrakciju, miozin I se moè kretati du` aktinskih vlakana (prema +kraju) nose}i razli~ite terete (kao {to su membranske vezikule) vezane na svoj rep.
454
Poglavlje 11
kraj
+ kraj
Slika 11-31. Miozin V.

Miozin V je dvoglavi miozin poput miozina II. Prenosi organele i drugi teret (primjerice, intermedijarna vlakna) prema plus kraju aktinskih vlakana. Prikazani model utemeljen je na najnovijim podatcima dobivenim kristalografijom X-zrakama (R. D. Vale, 2003. Cell 112:467).
domena glavice
Migracija i puzanje stanica

Kretanje stanica po povr{ini predstavlja temeljni oblik stani~noga kretanja, a koristi ga {iroki spektar razli~itih vrsti stanica. Neki od primjera uklju~uju puzanje ameba, migraciju embrionalnih stanica tijekom razvitka, navalu bijelih krvnih stanica u razli~ita tkiva radi borbe protiv infekcije, migraciju stanica uklju~enih u zacjeljivanje rana, te rasprostiranje stanica raka tijekom metastaziranja malignih tumora. Sli~ne vrste kretanja tako|er su odgovorne za fagocitozu i izduìvanje izbo~enja ìv~anih stanica tijekom razvitka ìv~anoga sustava. Premda su svi ovi pokreti utemeljeni na dinami~kim svojstvima aktinskog citoskeleta, oni tako|er uklju~uju mikrotubule i intermedijarna vlakna. Detaljni mehanizmi na razini citoskeleta i njihova regulacija kao odgovor na izvanstani~ne signale (opisano u 13. poglavlju) jo{ uvijek nisu u potpunosti poznati. Migracija stanice ili puzanje uklju~uje koordinirani ciklus kretanja koji se moè promatrati u tri faze. Prvo, izbo~enja kao {to su pseudopodiji, lamelipodiji ili filopodiji (vidi sliku 11-18) moraju se protegnuti od vode}ega ruba stanice (slika 11-32). Drugo, ta izbo~enja moraju se pri~vrstiti na povr{inu preko koje se stanica kre}e. Napokon, stra`nji rub stanice mora se odvojiti od podloge i uvu}i u tijelo stanice. Niz eksperimenata pokazuje da protezanje od vode}eg ruba uklju~uje grananje i polimerizaciju filamenata aktina. Na primjer, inhibicija polimerizacije aktina (primjerice, citohalazinom) sprje~ava oblikovanje izbo~enja stani~ne povr{ine. Stani~no kretanje in vivo je najbolje prou~eno kod zacjeljivanja rana, gdje se stanice s ruba rane kre}u po izvanstani~nom matriksu ili stanicama koje se nalaze ispod njih da bi prekrile ranu. Regulacija ovog procesa uklju~uje male proteine koji veù GTP iz Rho porodice, o ~emu }e biti rije~i u 13. poglavlju. Rho proteini iniciraju lokalni rast aktinskih vlakana i njihovo grananje aktiviranjem Arp2/3 kompleksa, dok aktivacijom ADF/kofilina prekidaju postoje}a vlakna i omogu}uju rast na novonastalim plus krajevima. Dok novi mikrofilamenti urastaju u rastu}e produljke stanice, reorganizacija mikrotubula i novih mikrofilamenata osigurava puteve za prijenos membranskih vezikula i proteina potrebnih za kontinuirano produljivanje stani~nih izdanaka. Me|u tim proteinima koji se prenose nalaze se proteini {to usnopljuju aktin, a koji su potrebni za oblikovanje aktinskih snopova i tla~nih vlakana u podru~ju odmah iza vode}ega ruba stanice, proteini kalponinske porodice, proteini kao talin i vinkulin {to su prona|eni u àri-
pletenasta uzvojnica
laki lanac
fragment intermedijarnog vlakna
istezanje vode}ega ruba
pri~vr{}ivanje na podlogu
uvla~enje stra`njega ruba
Slika 11-32. Migracija stanice.

Kretanje stanice preko podloge moè se promatrati kroz tri stadija koordiniranih kretanja: (1) istezanje vode}ega ruba, (2) pri~vr{}ivanje vode}ega ruba na podlogu i (3) uvla~enje stra`njega dijela stanice u tijelo stanice.
Citoskelet i stani~no kretanje {nim adhezijama (vidi sliku 11-14), i kontaktin protein povezan s membranom koji spaja Arp2/3 kompleks na membranu vode}ega ruba. Proteini intermedijarnih vlakana tako|er se transportiraju prema vode}em rubu, gdje sluè za reorganizaciju mreè intermedijarnih vlakana. U tim procesima sudjeluju i kinezinski i miozinski motori. U neuronima je nekonvencionalni miozin, miozin V, potreban za opskrbu novim komadi}ima membrane nu`nim za produljivanje filopodija. Pri~vr{}ivanje stanica na podlogu zahtijeva ponovno stvaranje stani~nih adhezija tipa stanica-podloga ili stanica-stanica. Za stanice koje se sporo kre}u, kao {to su epitelne stanice ili fibroblasti, pri~vr{}ivanje uklju~uje stvaranje àri{nih adhezija (vidi sliku 11-14). Stanice koje se kre}u brè, kao {to su amebe i bijele krvne stanice, stvaraju vi{e difuzne dodire s podlogom, a njihov molekularni sastav nije poznat. Rekonstrukcija àri{nih adhezija odvija se u dva koraka: u prvom se pojavljuju mali àri{ni kompleksi koji sadràvaju manji broj mikrofilamenata pri~vr{}enih na integrinske proteine, a u drugom koraku ti àri{ni kompleksi izrastaju u zrele àri{ne kontakte (prikazano na slici 11-14). Pojavljivanje zrelih àri{nih kontakata zahtijeva stvaranje napetosti izme|u stanice i podloge, {to je stvaraju miozinski motori djeluju}i na aktinske snopove ili tla~na vlakna. Zavr{ni stadij migracije stanice, uvla~enje stra`njega ruba, uklju~uje djelovanje malih proteina koji veù GTP iz porodice ARF (vidi 9. poglavlje), koji trgaju postoje}e àri{ne adhezije na stra`njem rubu stanice. Kontrakcija aktinskih snopova i tla~nih vlakana povezanih na nove àri{ne adhezije stvara tada silu potrebnu za uvla~enje stra`njega ruba stanice prema prednjem dijelu tijela stanice. Nu`nost miozina II za uvla~enje stra`njega ruba stanice prvi put je dokazana u mutanata amebe Dictyostelium kojima nedostaje miozin II, a danas je poznata u svih eukariotskih stanica.
455
Intermedijarna vlakna
Intermedijarna vlakna imaju promjer od otprilike 10 nm, {to je izme|u promjera dvaju temeljnih elemenata citoskeleta, aktinskih vlakana (7 nm) i mikrotubula (oko 25 nm). Za razliku od aktinskih vlakana i mikrotuTablica 11-1. Proteini intermedijarnih vlakana bula, intermedijarna vlakna nisu direktno uklju~ena u stani~ne poTip Protein Veli~ina (kd) Mjesto ekspresije krete. Umjesto toga, ~ini se da ona I kiseli keratini 4060 epitelne stanice imaju temeljnu strukturnu ulogu (15 proteina) daju}i mehani~ku ~vrsto}u stanicaII neutralni ili lu`nati keratini 5070 epitelne stanice ma i tkivima. (15 proteina)
Proteini intermedijarnih vlakana

Dok su aktinska vlakna i mikrotubuli polimeri jednog tipa proteina (aktina odnosno tubulina), intermedijarna vlakna sastavljena su od niza proteina eksprimiranih u razli~itim vrstama stanica. Do sada je identificirano vi{e od 50 razli~itih proteina intermedijarnih vlakana {to su na temelju sli~nosti aminokiselinskoga slijeda klasificirani u {est skupina (tabl. 11-1). Tipove I i II ~ine dvije skupine keratina, sva-
III
vimentin dezmin glijalni fibrilarni kiseli protein periferin
54 53 51 57 67 150 200 66 6075 200
fibroblasti, bijele krvne stanice i druge vrste stanica mi{i}ne stanice glija stanice periferni neuroni neuroni neuroni neuroni neuroni jezgrina ovojnica svih vrsti stanica mati~ne stanice sredi{njega ìv~anoga sustava
IV
proteini neurofilamenata NF-L NF-M NF-H a-interneksin lamini jezgrine ovojnice nestin
V VI
456
Poglavlje 11
ka sastavljena od otprilike 15 razli~itih proteina koji se eksprimiraju u epitelnim stanicama. Svaka vrsta epitelnih stanica sintetizira najmanje jedan keratin tipa I (kiseli) i jedan keratin tipa II (neutralni/lu`nati), a oni kopolimeriziranjem oblikuju vlakna. Neki tipovi keratina I i II (nazvani ~vrsti keratini) sudjeluju u nastanku struktura kao {to su kosa, nokti i rogovi. Drugi tipovi keratina I i II (meki keratini) u ve}oj su koli~ini i s razli~itim izraàjem prisutni u citoplazmi drugih vrsti diferenciranih epitelnih stanica. Proteini intermedijarnih vlakana tipa III uklju~uju vimentin, koji moèmo na}i u vi{e vrsti stanica, uklju~uju}i fibroblaste, stanice glatkih mi{i}a i bijele krvne stanice. Suprotno aktinskim vlaknima, vimentin oblikuje mreè koje se pruàju od jezgre prema periferiji stanice. Drugi protein tipa III, dezmin, specifi~no je izraèn u mi{i}nim stanicama gdje povezuje Z-plo~e pojedina~nih kontraktilnih elemenata. Tre}i protein intermedijarnih vlakana tipa III specifi~no se eksprimira u glija stanicama, a ~etvrti u neuronima perifernoga ìv~anoga sustava. Tip IV proteina intermedijarnih niti uklju~uje tri proteina neurofilamenata (NF), a ozna~ujemo ih kao NF-L, NF-M i NF-H, od Light (laki), Medium (srednje teàk) i Heavy (teàk). Ti proteini ~ine glavninu intermedijarnih vlakana mnogih tipova zrelih neurona. Osobito su obilno prisutni u aksonima motori~kih neurona i misli se da imaju klju~nu ulogu u odràvanju tih duga~kih, tankih izbo~enja, koja se mogu protegnuti i vi{e od jednog metra u duljinu. Jedan drugi protein tipa IV (-interneksin) eksprimiran je u ranijim stadijima razvitka neurona, i prije izraàja proteina neurofilamenata. Jedini protein intermedijarnih vlakana tipa VI (nestin) izraèn je tijekom razvitka neurona ~ak i ranije, i to u mati~nim stanicama sredi{njega ìv~anoga sustava. Proteini intermedijarnih vlakana tipa V su lamini jezgrine ovojnice, koji se mogu na}i u ve}ini eukariotskih stanica. Lamine jezgrine ovojnice prije moèmo nazvati dijelom jezgre, a ne citoskeleta, jer se zdruùju ispod ovojnice jezgre stvaraju}i pravokutne mreè koje se difuzno nastavljaju u samu jezgru (vidi sliku 8-3). Unato~ znatnoj razli~itosti u veli~ini i slijedu aminokiselina, razli~iti proteini intermedijarnih vlakana dijele sli~nu strukturnu organizaciju (slika 11-33). Svi proteini intermedijarnih vlakana imaju sredi{nju a-uzvojitu {tapi}astu domenu od pribli`no 310 aminokiselina (350 aminokiselina u laminima jezgre). Ta sredi{nja {tapi}asta domena stoji uz bok amino- i karboksiterminalnim domenama, koje se razlikuju izme|u razli~itih proteina intermedijarnih vlakana po veli~ini, slijedu i sekundarnoj strukturi. Kao {to }e biti opisano u sljede}em odlomku, a-uzvojita {tapi}asta domena ima sredi{nju ulogu u zdruìvanju vlakana, dok varijabilne domene glavica i repova vjerojatno odre|uju specifi~ne funkcije razli~itih proteina intermedijarnih vlakana.
Izgradnja intermedijarnih vlakana

Prvi korak u izgradnji vlakana je stvaranje dimera u kojima su sredi{nje {tapi}aste domene dvaju polipeptidnih lanaca omotane jedna oko druge u pletenasto-uzvojitu strukturu, sli~nu onoj kakvu ~ini te{ki lanac miozina II
Slika 11-33. Struktura proteina intermedijarnih vlakana.
Proteini inter medijar nih filamenata sadràvaju sredi{nju -uzvojitu {tapi}astu domenu od otprilike 310 aminokiselina (350 aminokiselina u laminima jezgre). N-terminalne domene glavice i C-ter minalne domene repa variraju u veli~ini i obliku.
sredi{nja {tapi}asta domena (a-uzvojnica, 310350 aminokiselina) C-kraj
N kraj
glavica (promjenjiva veli~ina i struktura)
rep (promjenjiva veli~ina i struktura)
457
polipeptid
N glavica
sredi{nja {tapi}asta domena rep
Slika 11-34. Izgradnja intermedijarnih vlakana.

Sredi{nje {tapi}aste domene dvaju polipeptida omataju se jedna oko druge u pletenasto-uzvojitu strukturu oblikuju}i dimere. Dimeri se tada spajaju antiparalelno i poredani s pravilnim pomakom stvaraju tetramere. Tetrameri se me|usobno zdruùju svojim krajevima oblikuju}i protofilamente, a njihovim pobo~nim povezivanjem nastaju vlakna. Svako vlakno sadràva pribli`no 8 protofilamenata omotanih jedan oko drugog u strukturu nalik uètu.
pletenasta uzvojnica dimer N
C N tetramer C C N
protofilament
vlakno
(slika 11-34). Dimeri se tada povezuju antiparalelno i s pravilnim pomakom, te tako oblikuju tetramere, koji se mogu me|usobno zdruìti svojim krajevima da bi nastali protofilamenti. Zavr{ni oblik intermedijarnog vlakna sadràva otprilike 8 protofilamenata omotanih jedan oko drugog u strukturu nalik uètu. Zbog ~injenice da su nastali od antiparalelnih tetramera, oba su kraja intermedijarnih vlakana jednaka. Stoga, za razliku od aktinskih vlakana i mikrotubula, intermedijarna vlakna su apolarna; tj. nemaju izraène plus i minus krajeve. Izgradnja vlakana zahtijeva interakcije izme|u proteina specifi~nih tipova intermedijarnih vlakana. Na primjer, keratinska vlakna su uvijek sastavljena od heterodimera {to sadràvaju po jedan polipeptid tipa I i tipa II. Nasuprot tome, proteini tipa III mogu se zdruìvati u vlakna sadràvaju}i samo jedan polipeptid (na primjer, vimentin) ili dva razli~ita proteina tipa III (na primjer, vimentin plus dezmin). Ipak, proteini tipa III ne tvore kopolimere s keratinima. Od proteina tipa IV, a-interneksin se moè zdruìvati u vlakna samostalno, dok tri proteina neurofilamenata kopolimeriziraju stvaraju}i heteropolimere. Intermedijarna vlakna su op}enito puno stabilnija od aktinskih vlakana ili mikrotubula, te ne pokazuju dinami~ka svojstva kakva imaju ovi drugi elementi citoskeleta (primjerice, hod u mjestu aktinskih vlakana prikazano na slici 11-4). Svejedno, proteini intermedijarnih vlakana ~esto se mijenjaju fosforilacijom, koja moè upravljati njihovom izgradnjom i razgradnjom unutar stanice. Jedan primjer je fosforilacija jezgrinih lamina (vidi sliku 831), koja rezultira raspadanjem jezgrine ovojnice tijekom mitoze. Citoplazmatska intermedijarna vlakna, kao primjerice, vimentin, tako|er bivaju fosforilirani, {to moè dovesti do njihova raspada i reorganizacije u stanicama koje se dijele ili migriraju.
Unutarstani~na organizacija intermedijarnih vlakana

Intermedijarna vlakna tvore finu mreù u citoplazmi ve}ine stanica, pruàju}i se od prstena oko jezgre sve do stani~ne membrane (slika 11-35). I kera-
458
Poglavlje 11
Slika 11-35. Unutarstani~na organizacija keratinskih vlakana.

Elektronskomikroskopska slika epitelnih stanica obojenih fluorescentnim protutijelima na keratin (zeleno). Jezgre su obojene plavo. Keratinska vlakna se pruàju od prstena oko jezgre do stani~ne membrane. (Nanoy Kedersha/Immunogen/Photo Researchers, Inc.)
10 mm
Slika 11-36. Pri~vr{}ivanje intermedijarnih vlakana na dezmosome i hemidezmosome.

(A) Elektronskomikroskopska slika prikazuje keratinska vlakna (strjelice) pri ~vr{}ena na guste plo~e unutarstani~nih proteina s obiju strana dezmosoma. (B) Shematski prikaz dezmosoma. Intermedijar na su vlakna usidrena s pomo}u dezmoplakina u mjestima me|ustani~ne adhezije. (C) Shematski prikaz hemidezmosoma. Inter medijar na su vlakna usidrena na integrin s pomo}u plektina. (A, Don Fawcett/Photo Researchers, Inc.)
(A) (B) gusta plo~a
tinska i vimentinska vlakna pri~vr{}uju se za ovojnicu jezgre, o~igledno sluè}i pozicioniranju i sidrenju jezgre unutar stanice. K tome, intermedijarna vlakna mogu se spajati ne samo sa stani~nom membranom, ve} i s ostalim elementima citoskeleta, aktinskim vlaknima i mikrotubulima. Intermedijarna vlakna na taj na~in ~ine potporanj koji integrira razli~ite dijelove citoskeleta i organizira unutra{nju strukturu stanice. Keratinska vlakna epitelnih stanica ~vrsto su usidrena u stani~nu membranu na dva podru~ja specijaliziranih stani~nih dodira, dezmosomima i hemidezmosomima (slika 11-36). Dezmosomi su spojevi izme|u susjednih stanica, na kojima su me|ustani~ni dodiri posredovani transmembranskim proteinima srodnim kadherinima. Na svojoj citoplazmatskoj strani, dezmosomi su povezani s karakteristi~nim gustim plo~ama unutarstani~nih proteina na koje su vezana keratinska vlakna. Te su veze posredovane dezmoplakinom, ~lanom porodice proteina zvanih plakini {to veù intermedijarna vlakna i povezuju ih s ostalim stani~nim strukturama. Hemidezmosomi su morfolo{ki sli~ni spojevi izme|u epitelnih stanica i vezivnoga tkiva ispod njih, a na njima su keratinska vlakna s pomo}u razli~itih ~lanova plakinske porodice (primjerice, plektinom) vezana na integrine. Stoga se moè re}i da dezmosomi usidruju intermedijarna vlakna u podru~jima me|ustani~nog kontakta dok hemidezmosomi to ~ine u podru~ju kontakta stanice i podloge, sli~no pri~vr{}enjima aktinskog citoskeleta sa stani~nom membranom na prianjaju}im spojevima i àri{tima prianjanja. Va`no je spomenuti da keratinska vlakna usidrena na objema stranama dezmosoma sluè kao mehani~ka spona izme|u susjednih stanica u epitelnom sloju, pruàju}i tako mehani~ku stabilnost cijelom tkivu. Osim vezanja intermedijarnih vlakana s me|ustani~nim spojevima, neki plakini veù intermedijarna vlakna na druge elemente citoskeleta. Plektin, na primjer, pored intermedijarnih vlakana veè i aktinska vlakna i mikrotubule, osiguravaju}i tako mostove izme|u tih elemenata citoskeleta
keratinska vlakna
(C) dezmop plakin
intermedijarna vlakna plektin
kadherini stani~na membrana
unutarstani~ni prostor
plo~a
integrin izvanstani~ni matriks
459
(slika 11-37). Za mostove prema intermedijarnim vlaknima misli se da sapinju i u~vr{}uju aktinska vlakna i mikrotubule, ~ime se pove}ava mehani~ka stabilnost stanice. Dva tipa intermedijarnih vlakana imaju specijalizirane uloge u mi{i }nim (dezmin) i ìv~anim (neurofilamenti) stanicama. Dezmin povezuje pojedina~ne aktin-miozinske nakupine mi{i}nih stanica, kako me|usobno tako i sa stani~nom membranom, na taj na~in povezuju}i djelovanja pojedina~noga kontraktilnog elementa. Neurofilamenti su glavni intermedijarni filamenti u ve}ine zrelih neurona. Osobito su obilno prisutni u duga~kim aksonima motori~kih neurona, gdje su, izgleda, usidreni u aktinska vlakna i mikrotubule s pomo}u neuronalnih ~lanova porodice plakina. Za neurofilamente se smatra da imaju va`nu ulogu u davanju mehani~ke potpore i u stabilizaciji ostalih elemenata citoskeleta u tim duga~kim, tankim izbo~enjima ìv~anih stanica.
Funkcije keratina i neurofilamenata: bolesti koè i ìv~anoga sustava

Iako se za intermedijarna vlakna ve} dugo vremena mislilo da pomaù u odràvanju strukture stanice, izravni dokazi za ovu njihovu funkciju dobiveni su tek nedavno. Neke stanice u kulturi ne stvaraju proteine intermedijarnih vlakana, pokazuju}i da ti proteini nisu nu`ni za rast stanice in vitro. Sli~no tomu, injiciranje protutijela na vimentin u stanice u kulturi kida mreù intermedijarnih vlakana bez utjecaja na stani~ni rast i kretanje. Stoga je pretpostavljano da su intermedijarna vlakna nu`na za u~vr{}ivanje citoskeleta stanice u tkivima vi{estani~nih organizama, gdje su vlakna podvrgnuta nizu mehani~kih utjecaja {to ina~e ne utje~u na stanicu u izoliranom okoli{u posude za kulturu. Eksperimentalni dokaz za takvu ulogu intermedijarnih vlakana in vivo prvi je put dobiven 1991. godine istraìvanjima u laboratoriju Elaine Fuchs. Ovi su istraìva~i koristili transgeni~ne mi{eve da bi prou~ili in vivo u~inke ekspresije mutacije deletiranoga keratinskoga gena koji kodira krnji polipeptid {to sprje~ava stvaranje normalnih keratinskih vlakana (slika 11-38).
Slika 11-37. Elektronskomikroskopska slika plektinskih mostova izme|u intermedijarnih filamenata i mikrotubula.
Elektronskomikroskopska slika fibroblasta obojenoga protutijelom na plektin. Slika je umjetno obojena da bi se istodobno prikazali plektin (zeleno), plektinska protutijela (ùto), intermedijarna vlakna (plavo) i mikrotubuli (crveno). (Ljubazno{}u Tatyane Svitkine i Garya Borisya, University of Wisconsin, Madison.)
oplo|ena jajna stanica mikroubrizgavanje plazmida koji kodira mutantni keratin
embriji prijenos embrija u maternicu mi{ice hraniteljice
Slika 11-38. Eksperimentalna demonstracija funkcije keratina.

Plazmid koji kodira mutantni keratin ({to ometa normalnu izgradnju keratinskih vlakana)i ubrizgan je u jedan pronukleus oplo|enoga jaja{ca. Tako dobiveni embriji su mikroubrizgavanjem implantirani u maternicu mi{ice hraniteljice, a neki od potomaka inkorporirali su gen za mutantni keratin u svoj genom. Ekspresija mutiranoga gena u ovako dobivenim transgeni~nim mi{evima ometa stvaranje normalnog keratinskog citoskeleta stanica epidermisa, {to uslijed pucanja stanica i nakon blagoga mehani~kog podraàja rezultira bolnim ko`nim plikovima.
transgeni~ni mi{ koji eksprimira mutantni keratin
ko`ni plikovi potomstvo
460
Poglavlje 11
Ekspresija mutantnoga keratina uzrokuje nenormalan razvitak koè

Mutant Keratin Expression in Transgenic Mice Causes Marked Abormalities Resembling a Human Genetic Skin Disease Robert Vassar, Pierre A. Coulombe, Linda Degenstein, Kathryn Albers i Elaine Fuchs University of Chicago
Cell, 1991, Volume 64, pages 365380
Kontekst
Intermedijarna vlakna u epitelnim stanicama bila su do 1991. godine dobro upoznana, a upravo se prou~avala ekspresija razli~itih oblika keratina tipa I i tipa II u koì tijekom razvitka. Ono {to je ostalo nepoznato za sva inter medijar na vlakna bila je njihova funkcija. Iako se znalo da sve stanice kralje`njaka sadràvaju inter medijarna vlakna, stani~ne linije koje ih nisu imale, mogle su preìvjeti u kulturi i nastaviti s proliferacijom. Zato je, bez obzira na to koju bi funkciju inter medijar na vlakna mogla imati, smatrano da uloga inter medijar nih vlakana nije bitna za stanice u kulturi, ali bi mogla biti va`na za stanice u tkivu vi{estani~nih organizama. Fuchs i suradnici znali su da tijekom ranoga razvitka epitel koè izraàva keratin 5 (tip I) i keratin 14 (tip II). Budu}i da keratini polimeriziraju kao heterodimeri, mislilo se da ekspresija nenor malnoga proteina moè utjecati na stvaranje nor malnih inter medijarnih vlakana. Fuchs i njezini kolege najprije su ispitali ovu mogu}nost u kulturi stanica koè, i pokazali da ekspresija kr njega keratina 14 ometa stvaranje keratinskih vlakana. To je upu}ivalo na to da bi sli~na ekspresija mutiranoga keratina u transgeni~nim mi{evima mogla uzrokovati pogrje{ku u mreì inter medijar nih vlakana u stanicama koè embrija. Kad bi se to dogodilo, osigurali bi se uvjeti za testiranje uloge intermedijarnih vlakana u intaktnom tkivu. U eksperimentima opisanima ovdje, Fuchs i njezini suradnici pokazali su
da je ekspresija mutiranoga keratina u transgeni~nim mi{evima ne samo poremetila mreù intermedijarnih vlakana stanica koè, nego dovela i do te{kih o{te}enja organizacije i tkivne stabilnosti koè. Ti su eksperimenti tako pruìli prvi dokaz fiziolo{ke uloge intermedijarnih vlakana.
Elaine Fuchs
Eksperimenti
Za svoje ranije eksperimente u kulturi stanica, Fuchs i suradnici konstruirali su mutirani gen za keratin 14, koji se kao kr nji protein bez 30% sredi{nje a-uzvojite domene i cijelog karboksilnog kraja, eksprimirao od normalnoga keratinskog promotora. Da bi istraìli ulogu keratina 14 u ranom razvitku mi{a, ubacili su plazmid koji kodira mutirani keratin 14 u oplo|ena mi{ja jaja, koja su nakon toga preba~ena u maternicu mi{ice hraniteljice gdje im je omogu}eno da se razviju. Nakon {to su svi potomci ispitani na keratin 14, neki od njih bili su transgeni~ni i eksprimirali mutirani protein keratin 14. Ve}ina transgeni~nih ìvotinja umrla je u roku od 24 sata nakon ro|enja. Oni koji su preìvjeli dulje imali su te{ke abnor malnosti koè, uklju~uju}i plikove zbog lize epidermalnih stanica nakon blage mehani~ke traume, kao {to je trljanje koè. Analiza obojenih rezova tkiva koè transgeni~nih ìvotinja pokazala je te{ku dezorganizaciju epider misa u najja~e pogo|enih ìvotinja (vidi sliku) i krpice dezorganiziranog tkiva u drugih. Krpasti izraàj je ina~e obilje`je ìvotinja s mozaicizmom, gdje se neka tkiva razvijaju iz nor malnih stanica embrija, a neka iz
Koà normalnoga i transgeni~noga mi{a. (Gore) Koà nor malnoga mi{a pokazuje pravilno organizirane vanjske slojeve (uglate zagrade) bez razmaka prema netaknutom tkivu koje se nalazi ispod njih. (Dolje) Koà transgeni~noga mi{a pokazuje te{ki razdor vanjskih slojeva, koji su puni praznih prostora zbog abrazije mehani~kom traumom (strjelica).
461
stanica koje nose transgene. Analizom mutiranoga proteina oni su prona{li da su podru~ja dezorganiziranoga tkiva povezana s ekspresijom mutiranog keratina 14. Osim toga, postojala je jasna korelacija izme|u koli~ine dezorganiziranog epider misa i osjetljivosti na ko`na o{te}enja, i smrti tijekom traume ro|enja. Fuchs i njezini suradnici nadalje su u transgeni~nih mi{eva primijetili obrazac tkivne dezorganizacije nalik onome kakav se vidi u skupini ko`nih bolesti ~ovjeka zvanih epidermolysis bullosa simplex. Usporedbom rezova tkiva transgeni~noga mi{a s rezovima koè
dobivenim od bolesnika na|en je vrlo sli~an obrazac disrupcije tkiva. Iz toga su Fuchs i suradnici zaklju~ili da nedostatci keratina ili proteina intermedijarnih vlakana mogu biti uzrok genskih bolesti koè ~ovjeka.
Utjecaj
Nepravilnosti koè opisanih transgeni~nih mi{eva dale su pr vi direktni oslonac za pretpostavljenu ulogu keratina u pruànju mehani~ke potpore epitelnim stanicama u tkivima. Danas se zna da je citoskelet inter medijar nih vlakana nuàn za strukturu tkiva podlo`nih mehani~kom stresu,
kao {to su koà, crijevo, srce i skeletni mi{i}. Nasuprot tomu, jednostani~ni eukarioti, kao kvasci i mnogi mali beskralje`njaci savr{eno preìvljavaju bez intermedijarnih vlakana, ~esto mijenjaju}i aktinski ili tubulinski citoskelet da bi obavljali strukturnu ulogu. Rezultati Fuchsove i njezinih suradnika tako|er su upozorili na uzrok nekoliko ljudskih bolesti. To~nije, do danas je otkriveno vi{e od sedamnaest razli~itih keratina za koje se zna da su o{te}eni u bolestima ~ovjeka; oni uklju~uju i keratin 5 i keratin 14 koji su prvi bili prou~eni u transgeni~nim mi{evima.
Taj mutirani keratinski gen uveden je u transgeni~ne mi{eve, gdje se eksprimirao u bazalnim stanicama epidermisa i poremetio oblikovanje normalnoga keratinskog citoskeleta. To je rezultiralo nastankom te{kih ko`nih nepravilnosti, uklju~uju}i plikove zbog lize epidermalnih stanica nakon blage mehani~ke traume kao {to je trljanje koè. Nepravilnosti ovih transgeni~nih mi{eva tako su dale izravnu potvrdu predmnijevanoj ulozi keratina u pruànju mehani~ke potpore epitelnim stanicama u tkivima. Kasnije je jednak rezultat dobiven u mi{eva u kojih je gen za isti keratin inaktiviran homolognom rekombinacijom. Ovi eksperimenti tako|er su pokazali molekularni temelj genske bolesti ~ovjeka epidermolysis bullosa simplex (EBS). Kao i transgeni~ni mi{evi koji izraàvaju mutirani keratinski gen, ljudi s ovom bole{}u dobivaju ko`ne plikove zbog stani~ne lize nakon manje traume. Ta sli~nost navela je na istraìvanja keratinskih gena u bolesnika s EBS, koja su dovela do potvrde da je EBS uzrokovan mutacijama keratinskih gena {to onemogu}uju normalno zdruìvanje keratinskih vlakana. Tako su obje eksperimentalne studije u transgeni~nih mi{eva i molekularne genske bolesti ~ovjeka dokazale ulogu keratina u podno{enju mehani~kih stresova stanica koè. Daljnje studije pokazale su da su mutacije drugih keratina odgovorne za jo{ nekoliko nasljednih ko`nih bolesti, koje su sli~no obiljeène nenormalnom lomljivo{}u epidermalnih stanica. Druga istraìvanja u transgeni~nih mi{eva pokazala su abnormalnosti neurofilamenata u bolestima motori~kih neurona, osobito kod amiotrofi~ne lateralne skleroze (ALS). ALS, poznata i kao Lou Gehrigova bolest i bolest od koje pati poznati fizi~ar Stephen Hawking, nastaje zbog progresivnog gubitka motori~kih neurona {to dovodi do atrofije mi{i}a, paralize i na posljetku, smrti. ALS i druge vrste bolesti motori~kih neurona karakterizira nakupljanje i nepravilno zdruìvanje neurofilamenata, upozoravaju}i na to da abnormalnosti neurofilamenata mogu pridonijeti patolo{kim promjenama u ovim bolestima. U skladu s ovom pretpostavkom, otkriveno je da pretjerana ekspresija NF-L ili NF-H u transgeni~nih mi{eva dovodi do stanja sli~nog ALS. Iako detaljni mehanizam tek treba otkriti, ovi eksperimenti jasno upu}uju na uklju~enost neurofilamenata u patogenezu bolesti motori~kih neurona.
462
Poglavlje 11
Slika 11-39. Struktura mikrotubula.

14 nm 25 nm
Dimeri a- i b-tubulina polimeriziraju oblikuju}i mikrotubule sastavljene od 13 protofilamenata zdruènih oko sredi{nje {upljine.
25
Mikrotubuli
Mikrotubuli, tre}i temeljni dio citoskeleta jesu kruti {uplji {tapi}i pribli`nog promjera 25 nm. Kao i aktinska vlakna, mikrotubuli su dinami~ke strukture {to podlijeù stalnom zdruìvanju i razilaènju unutar stanice. Njihovo je djelovanje dvojako: sudjeluju u stvaranju stani~nog oblika i niza stani~nih pokreta, uklju~uju}i neke oblike stani~nog kretanja, te u transportu organela i odjeljivanju kromosoma tijekom mitoze.
b-tubulin
a-tubulin
Struktura, izgradnja i dinami~ka nestabilnost mikrotubula

Za razliku od intermedijarnih vlakana, sastavljenih od niza razli~itih vlaknatih proteina, mikrotubuli su sastavljeni od samo jednog tipa globularnog proteina zvanog tubulin. Tubulin je dimer sastavljen od dva blisko srodna 55kd te{ka polipeptida, a-tubulina i b-tubulina. Kao i aktin, oba tubulina, - i -tubulin, kodirani su malim porodicama srodnih gena. Osim njih postoji i tre}i tip tubulina (-tubulin), specifi~no smje{ten u centrosomu, gdje igra presudnu ulogu u zapo~injanju zdruìvanja mikrotubula (najkra}e re~eno). îni se da je evolucijski predak svih tih tubulina protein sli~an prokariotskom proteinu FtsZ. Dimeri tubulina polimeriziraju tvore}i mikrotubule, koji se op}enito sastoje od 13 linearnih protofilamenata zdruènih oko sredi{nje {upljine (slika 11-39). Protofilamenti se sastoje od redova tubulinskih dimera usmjerenih od glavice prema repu, a poslaguju se paralelno. Zato su mikrotubuli (kao i aktinska vlakna) polarne strukture s dva razli~ita kraja: brzorastu}im plus krajem i spororastu}im minus krajem. Ovu polarnost je va`no imati na umu prilikom odre|ivanja smjera pokreta du` mikrotubula, ba{ kao {to i polarnost aktinskih vlakana odre|uje smjer kretanja miozina. Dimeri tubulina mogu depolimerizirati i polimerizirati, pa mikrotubuli mogu imati brze cikluse izgradnje i razgradnje. I a- i b-tubulin veù GTP , koji djeluje analogno ATP vezanom na aktin, tj. reguliraju}i polimerizaciju. Preciznije, GTP vezan na b-tubulin (ali ne i onaj vezan na a-tubulin) biva hidroliziran u GDP tijekom ili ubrzo nakon polimerizacije. Ta hidroliza , GTP slabi afinitet vezanja tubulina za susjedne molekule, favoriziraju}i tako depolimerizaciju {to rezultira dinami~kim pona{anjem mikrotubula. Kao i aktinska vlakna (vidi sliku 11-4), i mikrotubuli se podvrgavaju hodu u mjestu, dinami~kom pona{anju u kojem se molekule tubulina vezane na GDP neprestano gube s minus kraja i bivaju zamijenjene dodavanjem molekula tubulina vezanih na GTP na plus kraju istog mikrotubula. U mikrotubulima hidroliza GTP tako|er dovodi do pona{anja poznatog kao dinami~ka nestabilnost, u kojem se pojedina~ni mikrotubuli izmjenjuju izme|u ciklusa rasta i skra}ivanja (slika 11-40). Ho}e li mikrotubul rasti ili se smanjivati, odre|eno je djelomi~no odnosom brzine dodavanja tubulina i brzine hidrolize GTP Dok god je dodavanje molekula tubulina vezanih za GDP . brè od hidrolize GTP mikrotubul zadràva kapicu sa~injenu od GTP mole, kula na svom plus kraju i rast mikrotubula se nastavlja. No, ako se brzina polimerizacije smanji, GTP vezan na tubulin na plus kraju mikrotubula bit }e hidroliziran na GDP Kad se to dogodi, tubulin vezan za GDP }e se odva. jati, rezultiraju}i brzom depolimerizacijom i skra}ivanjem mikrotubula.
463
visoka koncentracija tubulina vezanoga na GTP Pi h
niska koncentracija tubulina vezanoga na GTP Pi a
Pi
Pi
GDP
GDP
GDP
GDP
GDP
Slika 11-40. Dinami~ka nestabilnost mikrotubula.
Dinami~ka nestabilnost, {to su je opisali Tim Mitchison i Marc Kirschner 1984. godine, rezultira stalnom i brzom izmjenom ve}ine mikrotubula koji imaju poluvijek ìvota u stanici od samo nekoliko minuta. Kao {to }e biti opisano dalje, ta brza izmjena mikrotubula osobito je nu`na za vrijeme preure|enja citoskeleta {to se doga|a tijekom mitoze. Zbog sredi{nje uloge mikrotubula u mitozi, lijekovi koji utje~u na izgra|ivanje mikrotubula su korisni, ne samo kao eksperimentalno oru|e u stani~noj biologiji, ve} tako|er i u lije~enju raka. Kolhicin i kolcemid su primjeri svakodnevno kori{tenih eksperimentalnih tvari {to vezanjem tubulina inhibiraju polimerizaciju mikrotubula i tako blokiraju mitozu. Dvije srodne tvari (vinkristin i vinblastin) koriste se u kemoterapiji raka jer selektivno inhibiraju stanice koje se brzo dijele. Jo{ jedna korisna tvar, taksol, stabilizira mikrotubule umjesto inhibicije njihovoga zdruìvanja. Takva stabilizacija tako|er sprje~ava podjelu stanica, a taksol se koristi i kao sredstvo protiv raka i kao eksperimentalno oru|e.
Dimeri tubulina polimeriziraju na plus krajevima mikrotubula u ravnoj plo~i koja se tada zatvara u zreli mikrotubul odmah iza podru~ja rasta. Dinami~ka nestabilnost rezultira hidrolizom GTP vezanog na b-tubulin, tijekom ili odmah nakon polimerizacije, {to smanjuje njegov afinitet za vezanje susjednih molekula. Rast mikrotubula nastavlja se sve dok postoji visoka koncentracija tubulina vezanog na GTP Nove molekule . tubulina vezane na GTP tada se dodaju brè nego {to se GTP hidrolizira, pa kapa GTP biva sa~uvana na rastu}em kraju. Ipak, ako se GTP hidrolizira brè nego {to se dodaju nove podjedinice, prisutnost tubulina vezanog na GDP na kraju mikrotubula dovodi do njegove razgradnje i skra}ivanja.
Centrosomi, centrioli i organizacija mikrotubula

Mikrotubuli se u ve}ini stanica pruàju prema van iz sredi{ta mikrotubularnog ustrojavanja, u koji su usidreni minus krajevi mikrotubula. U ìvotinjskim stanicama, glavno sredi{te mikrotubularnog ustrojavanja je centrosom (prvi ga je opisao Theodor Boveri 1888. godine), koji je smje{ten pokraj jezgre, blizu sredi{njeg dijela stanica u interfazi (koje se ne dijele) (slika 11-
464
Poglavlje 11
stanica u interfazi
+ + + +
Slika 11-41. Unutarstani~na organizacija mikrotubula.

Minus krajevi mikrotubula usidreni su u centrosom. U stanicama koje se nalaze u interfazi, centrosom je smje{ten blizu jezgre, a mikrotubuli se pruàju prema van u smjeru periferije stanice. Tijekom mitoze, udvostru~eni se centrosomi odvajaju, a mikrotubuli reorganiziraju da bi oblikovali mitoti~ko vreteno.
jezgra
+ + +
+ +
stanica u mitozi
+ + + + + + + + + + + + + +
kromosomi
41). Tijekom mitoze, mikrotubuli se sli~no pruàju prema van od udvostru~enog centrosoma da bi oblikovali mitoti~ko vreteno, koje je odgovorno za podjelu i razmje{taj kromosoma u stanicama-k}erima. Centrosom stoga ima klju~nu ulogu u odre|ivanju unutarstani~ne organizacije mikrotubula, iako mnogi + detalji ove njegove funkcije jo{ uvijek nisu poznati. + Centrosom sluì kao mjesto inicijacije zdruìvanja mikrotu+ bula, koji rastu od centrosoma prema van, prema periferiji stani+ ce. To se moè jasno vidjeti u stanicama obra|ivanim kolcemi+ dom s ciljem razdruìvanja njihovih mikrotubula (slika 11-42). + Kad se kolcemid ukloni, stanice se oporavljaju i mogu se vidjeti + novi mikrotubuli kako rastu iz centrosoma. Va`no je re}i da inicijacija rasta mikrotubula na centrosomu uspostavlja polarnost centrosom mikrotubula unutar stanice. Preciznije, mikrotubuli rastu dodavanjem tubulina na njihove plus krajeve, a pruàju se prema van od centrosoma prema periferiji stanice. Klju~ni protein u centrosomu koji tvori jezgru zdruìvanja mikrotubula je g-tubulin, a on ~ini manje zastupljenu vrstu tubulina prvi put identificiranu u gljivica. Neke vrste stanica mogu zapo~eti stvaranje mikrotubula u odsutnosti centrosoma; misli se da je za to odgovorna prisutnost g-tubulina u njihovom citosolu. Osim toga, stanice u interfazi ili one koje se vi{e ne dijele, kao primjerice, polarizirane epitelne stanice ili ìv~ane stanice, ~esto iz centrosoma osloba|aju svoje mikrotubule da bi djelovali drugdje u stanici. Centrosomi ve}ine ìvotinjskih stanica sadràvaju par centriola orijentiranih okomito jedan prema drugom, okruènih amorfnom pericentriolarnom tvari (slika 11-43). Centrioli su cilindri~ne strukture na~injene od decentrosom
(A)
(B)
Slika 11-42. Rast mikrotubula iz centrosoma.

Mikrotubuli u mi{jim fibroblastima prikazani su imunofluorescentnim mikroskopom uz pomo} protutijela na tubulin. (A) Raspodjela mikrotubula u nor malnoj stanici u inter fazi. (B) Ova stanica je obra|ena kolcemidom kroz jedan sat da bi se razdruìli mikrotubuli. Kolcemid je tada uklonjen i stanici je dopu{teno da se oporavi kroz 30 minuta, {to je omogu}ilo prikaz novih mikrotubula kako rastu iz centrosoma. (Od M. Osborn i K. Weber, 1976. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:867.)
10 mm
465
(A)
(B)
0,1 mm
Slika 11-43. Struktura centrosoma.

(A) Elektronskomikroskopska slika centrosoma pokazuje {irenje mikrotubula iz pericentriolar ne tvari {to okruùje par centriola. (B) Poprje~ni presjek centriola prikazuje njegovih devet tripleta mikrotubula. (A, Cytographics; B, Don Fawcett, Photo Researchers, Inc.)
vet tripleta mikrotubula, sli~no bazalnim tijelima trepetiljki i bi~eva (opisanih dalje u poglavlju). Centrioli su nu`ni za stvaranje bazalnih tijela, trepetljiki i bi~eva, a uloga im je u koordiniranju stani~nog ciklusa slabo poznata. Ipak, zna se da nisu nu`ni za funkcije centrosoma u organizaciji mikrotubula i nisu na|eni u biljnim stanicama, kod jednostani~nih eukariota i ve}ine mejoti~kih ìvotinjskih stanica (kao primjerice, jajnim stanicama mi{a). Pericentriolarna tvar, a ne centrioli, zapo~inje zdruìvanje mikrotubula. Ipak, uklanjanje centriola iz ìvotinjskih stanica dovodi do rasipanja sadràja centrosoma i smanjenja preoblikovanja mikrotubula. Centrioli su kompleksne strukture s izrazitom polarno{}u i proteinskim strukturama nalik kota~u na jednom kraju i brojnim izduènjima u centrosom (slika 11-44). Za ova se izduènja misli da pomaù organiziranje mat-
kota~
tubulinski tripleti
a-tubulin b-tubulin d-tubulin
sateliti
privjesci j
Slika 11-44. Struktura centriola.

Centrioli su izrazito polarne strukture s proteinskom strukturom nalik kota~u na jednom kraju i brojnim nastavcima koji se ispruàju s drugog kraja. Misli se da su ti nastavci (nazvani sateliti i privjesci) u interakciji sa specifi~nim proteinima u matriksu centrosoma. Ostali proteini centrosomskog matriksa kao {to je g-tubulin vezani su s lumenom centriola. Triplet mikrotubula sadràva jako promijenjene a- i b-tubuline i jedinstveni g-tubulin. Centrinska vlakna pruàju se van iz tripleta mikrotubula i spajaju s drugim centriolom. (Modificirano od W. F. Marshalla, 2001. Curr. Biol. 11:R487.)
g-tubulin
centrinsko vlakno
466
Poglavlje 11
Slika 11-45. Elektronskomikroskopska slika mitoti~koga vretena.

Mikrotubuli vretena vezani su na kondenzirane kromosome u metafazi. (Od C.L. Rieder i S.S. Bowser, 1985. J. Histochem. Cytochem. 33:165/ Biological Photo Service.)
2 mm
riksa centrosoma. Centrioli tako|er sadràvaju nekoliko jedinstvenih proteina, uklju~uju}i d-tubulin, koji je dio karakteristi~nog tripleta mikrotubula. Tijekom interfaze dva centriola povezana su s pomo}u jednog ili vi{e vlakana {to sadràvaju centrin (protein koji veè Ca2+-, a koji je srodan kalmodulinu).
Reorganizacija mikrotubula tijekom mitoze

Kao {to je ve} ranije spomenuto, tijekom mitoze mikrotubuli se potpuno reorganiziraju, {to je dramati~an primjer va`nosti njihove dinami~ke nestabilnosti. Zdruènost mikrotubula prisutna u stanicama u interfazi nestaje, a slobodne tubulinske podjedinice ponovno se zdruùju oblikuju}i mitoti~ko vreteno odgovorno za razdvajanje kromosoma k}eri (slika 11-45). Ovaj preustroj citoskeleta mikrotubula vo|en je udvostru~ivanjem centrosoma da bi se stvorila dva odvojena sredi{ta mikrotubularnog ustrojavanja na suprotnim polovima mitoti~koga vretena. Centrioli i ostali dijelovi centrosoma udvostru~uju se u stanicama u interfazi, ali do po~etka mitoze ostaju zajedno s jedne strane stanice (slika 1146). Dva centrosoma se tada odvajaju i pomi~u prema suprotnim stranama jezgre, tvore}i dva pola mitoti~koga vretena. Kako stanica ulazi u mitozu, dinamika mikrotubularne izgradnje i razgradnje dramati~no se mijenja. Prvo, brzina razgradnje mikrotubula se pove}ava oko deset puta, {to rezultira op}om depolimerizacijom i skra}ivanjem mikrotubula. Istovremeno se broj mikrotubula koji se {ire iz centrosoma pove}ava za pet do deset puta. U kombinaciji, te promjene rezultiraju u razilaènju interfaznih mikrotubula i osloba|anju velikog broja kratkih mikrotubula iz centrosoma. Kao {to su to prvi predloìli Marc Kirschner i Tim Mitchison 1986. godine, stvaranje mitoti~koga vretena uklju~uje selektivnu stabilizaciju nekih mikrotubula koji se {ire iz centrosoma. Ti mikrotubuli mogu se podijeliti u tri tipa, od kojih dva stvaraju mitoti~ko vreteno. Kinetohorni mikrotubuli pri~vr{}uju se na kondenzirane kromosome stanica u mitozi u podru~ju njihovih centromera, koji su povezani sa specifi~nim proteinima da bi oblikovali kinetohore (vidi sliku 4-19). Pri~vr{}ivanje uz kinetohore stabilizira ove mikrotubule, koji kao {to je opisano dalje, imaju klju~nu ulogu u razdvaja-
467
Tijekom interfaze udvostru~uju se centrioli i centrosom. Za vrijeme profaze mitoze, odvajaju se udvostru~eni centrosomi i pomi~u prema suprotnim stranama jezgre. Slijedi rastavljanje jezgrine ovojnice, a mikrotubuli se reorganiziraju oblikuju}i mitoti~ko vreteno. Kinetohorni mikrotubuli su pri~vr{}eni na kondenzirane kromosome, polarni se mikrotubuli preklapaju u sredi{tu stanice, a astralni se mikrotubuli pruàju van prema periferiji stanice. Kondenzirani kromosomi su tijekom metafaze poravnati u sredi{tu vretena.
Slika 11-46. Oblikovanje mitoti~kog vretena
interfazna stanica
+
+ + + + + + + + + + + +
interfazna jezgra
+
nju mitoti~kih kromosoma. Drugi tip mikrotubula prona|en u mitoti~kom vretenu (polarni mikrotubuli) nije vezan uz kromosome. Umjesto toga, polarni mikrotubuli {to se {ire iz dvaju centrosoma stabilizirani su me|usobnim preklapanjem u sredi{tu stanice. Astralni mikrotubuli pruàju se iz centrosoma van prema periferiji stanice i imaju slobodno izloèn plus kraj. Kao {to }e dalje biti opisano, i polarni i astralni mikrotubuli tako|er pridonose kretanju kromosoma jer odmi~u polove vretena. Kako se mitoza nastavlja, kondenzirani se kromosomi najprije poravnaju na metafaznoj plo~i, a zatim razdvoje tako da dvije kromatide istog kromosoma bivaju odvu~ene na suprotne polove vretena. Kretanje kromosoma je posredovano motori~kim proteinima povezanim s mikrotubulima vretena, {to }e biti ukratko opisano. U zavr{noj fazi mitoze, ovojnica jezgre se ponovno oblikuje, kromosomi dekondenziraju, i nastupa citokineza. Svaka stanica-k}er tada sadràva jedan centrosom koji tvori jezgru stvaranja nove mreè interfaznih mikrotubula.
udvostru~enje centrosoma
+ + + + +
odvajanje centrosoma kondenzacija kromosoma profaza

+ + + + +
Stabilizacija mikrotubula i stani~na polarnost

Zbog njima svojstvene dinami~ke nestabilnosti, ve}ina mikrotubula se u~estalo razgra|uje unutar stanice. To dinami~ko pona{anje ipak moè biti modificirano interakcijama mikrotubula s drugim proteinima. Neki stani~ni proteini poti~u razgradnju mikrotubula, bilo kidaju}i ih ili pak pove}avaju}i brzinu depolimerizacije tubulina s krajeva mikrotubula. Jedan takav protein je stratmin koji je izvorno bio otkriven kao protein koji se pretjerano izraàva kod mnogih leukemija, visoko proliferativnog raka dojke i malignih tumora jajnika. Ostali proteini (zvani MAPs, od microtubule-associated proteins, proteini povezani s mikrotubulima) veù se na mikrotubule i modificiraju njihovu stabilnost. Jedna klasa MAP naziva se proteini traga~i plus kraja jer se veù na GTP/tubulin, a misli se da prate (navode) rastu}e mikrotubule prema specifi~nim stani~nim lokacijama. Drugi MAP ~ine kapice plus ili minus krajeva mikrotubula. Takve interakcije dopu{taju stanici da stabilizira mikrotubule na specifi~nim mjestima i predstavljaju vaàn mehanizam za stvaranje stani~nog oblika i polarnosti. Do sada je otkriven velik broj MAP a ekspresija im varira u zavisnosti od , vrste stanice. Najbolje su upoznani MAP-1, MAP-2 i tau, izolirani iz ìv~anih stanica, te MAP-4 koji je prisutan u svim neìv~anim vrstama stanica kralje`njaka. Protein tau iscrpno je prou~avan jer je glavni sastojak karakteristi~nih o{te}enja {to se mogu na}i u mozgu bolesnika oboljelih od Alzheimerove bolesti. Aktivnost MAP regulirana je fosforilacijom, {to omogu}uje stanici kontrolu nad stabilno{}u mikrotubula. Dobar primjer uloge stabilnih mikrotubula u odre|ivanju stani~ne polarnosti vidi se kod ìv~anih stanica, koje se sastoje od dvaju razli~itih tipova izbo~enja (aksona i dendrita) {to se pruàju iz tijela stanice (slika 11-47). I aksoni i dendriti odràvaju svoju strukturu stabilnim mikrotubulima, zajedno s neurofilamentima o kojima je bilo govora prije u ovom poglavlju.
razgradnja jezgrine ovojnice oblikovanje mitoti~kog vretena metafaza polarni mikrotubuli

+ + + + + + + + + + + + + + + +
astralni mikrotubuli
kinetohorni mikrotubuli
468
Poglavlje 11
Slika 11-47. Organizacija mikrotubula u ìv~anim stanicama.

Dva razli~ita tipa stani~nih izbo~enja pruàju se iz tijela ìv~anih stanica (neurona). Dendriti su kratka izbo~enja koja primaju signale od drugih ìv~anih stanica. Jedan duga~ki akson tada prenosi impulse od tijela stanice do drugih stanica, koje mogu biti ili neuroni ili izvr{ne stanice, kao {to je mi{i}. Stabilni mikrotubuli i u aksoni + ma i u dendritima radije zavr{avaju u citoplazmi nego usidreni u centrosomu. U dendritima su mikrotubuli orijentira+ ni u oba smjera, tako da su svojim plus krajevima usmjereni i prema tijelu i od tijela stanice. Nasuprot tomu, svi mikrotubuli aksona orijentirani su svojim plus krajevima prema vr{ku aksona.
zavr{ni ogranci aksona
+ + +
dendrit
akson
tijelo stanice
Ipak, mikrotubuli u aksonima i dendritima organizirani su razli~ito, te spojeni razli~itim MAP U aksonima su svi mikrotubuli svojim plus krajevima . orijentirani od stani~nog tijela, sli~no op}oj orijentaciji mikrotubula u ostalim vrstama stanica. Minus krajevi ve}ine mikrotubula u aksonima nisu pak usidreni u centrosomima ve} umjesto toga njihovi plus i minus krajevi zavr{avaju u citoplazmi aksona. U dendritima su mikrotubuli orijentirani u oba smjera; neki plus krajevi prema stani~nom tijelu, a neki prema periferiji stanice. Te razlike mikrotubularnih ure|enja usporedno prate i razlike u MAP: akson sadràva tau proteine, ali ne i MAP-2, dok dendriti sadràvaju MAP-2, ali ne i tau proteine, pa se ~ini da su ove razlike u raspodjeli MAP-2 i tau proteina odgovorne za razli~itu organizaciju stabilnih mikrotubula u aksonima i dendritima.
Mikrotubularni motori i kretanja

Mikrotubuli su odgovorni za niz razli~itih stani~nih kretanja, uklju~uju}i unutarstani~ni prijenos i razmje{taj membranskih vezikula i organela, razdvajanje kromosoma u mitozi, te udaranje trepetljiki (cilija) i bi~eva (flagella). Kao {to je opisano prije u poglavlju o aktinskim vlaknima, kretanje du` mikrotubula utemeljeno je na djelovanju motori~kih proteina {to koriste energiju dobivenu hidrolizom ATP da bi proizveli silu i kretanje. ^lanovi dviju velikih porodica motori~kih proteina kinezini i dineini odgovorni su za potenciranje niza pokreta u kojima sudjeluju mikrotubuli.
Identifikacija mikrotubularnih motori~kih proteina

Kinezin i dinein, prototipovi mikrotubularnih motori~kih proteina, kre}u se du` mikrotubula u suprotnim smjerovima ve}ina kinezina prema plus kraju, a dinein prema minus kraju (slika 11-48). Prvi identificirani mikrotu-
469
kraj
+kraj
Slika 11-48. Mikrotubularni motori~ki proteini.

Kinezin i dinein kre}u se u suprotnim smjerovima du` mikrotubula, prema plus i minus kraju. Kinezin se sastoji od dvaju te{kih lanaca omotanih jedan oko drugog u pletenasto-uzvojitu strukturu, te od dvaju lakih lanaca. Globularne domene glavice te{kih lanaca veù mikrotubule i motori~ke su domene molekule. Dinein se sastoji od dva do tri te{ka lanca (ovdje su prikazana dva) povezana s mnogobrojnim lakim i lancima srednje teìne. Globularne domene glavice te{kih lanaca motori~ke su domene. Prikazani model utemeljen je na najnovijim podatcima dobivenim kristalografijom X-zrakama. (R. D. Vale, 2003. Cell 112:467).
domene glavice
pletenasta uzvojnica laki lanci i lanci srednje teìne laki lanci dinein
kinezin
bularni motori~ki protein je bio dinein, koji je izolirao Gibbons 1965. godine. Pro~i{}avanje tog oblika dineina (nazvanog aksonemalni dinein) bilo je olak{ano zbog ~injenice da se radi o proteinu koji je obilno prisutan u trepetljikama, ba{ kao {to je i obilna prisutnost miozina olak{ala njegovu izolaciju iz mi{i}nih stanica. Identifikacija ostalih motora povezanih s mikrotubulima ipak je bila puno problemati~nija, jer su proteini odgovorni za procese kao {to su kretanje kromosoma i prijenos organela prisutni u razmjerno niìm koncentracijama u citoplazmi. Izolacija tih proteina zbog toga je ovisila o razvoju novih eksperimentalnih metoda za otkrivanje aktivnosti molekularnih motora u sustavima bez stanica. Razvoj in vitro metoda za citoplazmatske motori~ke proteine utemeljen je na uporabi mikroskopije unaprije|ene videosnimanjem, koju su za prou~avanje kretanja membranskih vezikula i organela du` mikrotubula u aksonima lignje razvili Robert Allen i Shinya Inou u ranim osamdesetima. U toj metodi, videokamera se koristi za pove}anje kontrasta slika dobivenih svjetlosnim mikroskopom, {to bitno pobolj{ava otkrivanje malih objekata i omogu}uje pra}enje kretanja organela u ìvim stanicama. Koriste}i taj pristup Allen, Scott Brady i Ray Lasek pokazali su da se kretanje organela odvija i u bezstani~nom sustavu kojem je uklonjena stani~na membrana, a ekstrakt citoplazme ra{iren po stakalcu. Ta su promatranja dovela do razvoja in vitro sustava za rekonstrukciju, {to je omogu}ilo analizu kojom je bilo mogu}e otkrivanje stani~nih proteina odgovornih za kretanje organela. Brady, kao i Ronald Vale, Thomas Reese i Michael Sheetz, godine 1985. kapitalizirali su razvoj ovih metoda da bi identificirali kinezin (danas poznat kao konvencionalni kinezin ili kinezin I) kao novi mikrotubularni motori~ki protein, prisutan u aksonima lignje i u mozgu goveda. Daljnje su studije pokazale da se kinezin I premje{ta du` mikrotubula u samo jednom smjeru prema plus kraju. Zbog toga {to su svi plus krajevi mikrotubula u aksonima orijentirani od tijela stanice (vidi sliku 11-47) kreta-
470
Poglavlje 11
Izolacija kinezina
Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility Ronald D. Vale, Thomas S. Reese, i Michael P Sheetz .
National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA; University of Connecticut Health Center, Farmington, CT; Stanford University School of Medicine, Stanford, CA Cell, Volume 42, 1985, pages 3950
Eksperimenti
Dvije eksperimentalne strategije bile su klju~ne za izolaciju kinezina. Pr va, utemeljena na radu Allena i njegovih suradnika, bila je uporaba in vitro sustava u kojima se moè otkriti aktivost motori~kog proteina. Vale, Reese i Sheetz koristili su sustav u kojem su proteini u citoplazmi aksona potenci-
Kontekst
Prijenos i razmje{taj citoplazmatskih organela od klju~ne je va`nosti za organizaciju eukariotske stanice, pa je poznavanje mehanizma odgovor nog za transport vezikula i organela jedno od temeljnih pitanja u biologiji stanice. Robert Allen, Scott Brady, Ray Lasek i njihovi kolege, 1982. godine, upotrijebili su mikroskopiju unaprije|enu videosnimanjem za vizualizaciju kretanja organela du` citoplazmatskih vlakana i divovskog aksona lignje kako in vivo, tako i u bezstani~nom sustavu. Ta vlakna su tada elektronskomikroskopski identificirana kao mikrotubuli, ali motori~ki proteini odgovorni za kretanje organela bili su nepoznati. Jedini mikrotubular ni motor do tada identificiran bio je aksonemalni dinein, prisutan samo u trepetljikama i bi~evima. Ronald Vale, Thomas Reese i Michael
Sheetz opisali su 1985. godine izolaciju novog motori~kog proteina, kinezina, koji je bio odgovoran za kretanje organela du` mikrotubula. Sli~ne je eksperimente istovremeno publicirao i Scott Brady (Nature, 1985, 317:7375).
205 Vezanje motori~kog proteina za mikrotubule u prisutnosti AMP-PNP Uzorci proteina analizirani su elektroforezom u . poliakrilamidnom gelu, obojeni i fotografirani. Molekularne mase proteinskih markera u kilodaltonima ozna~ene su na lijevoj strani. Stupac a predstavlja pro~i{}ene mikrotubule u kojima je primjetan samo tubulin (55 kd). Stupac b je topljivi ekstrakt citoplazme aksona lignje koji sadràva mnogo razli~itih polipeptida. Ovaj topljivi ekstrakt inkubiran je s mikrotubulima bez AMP-PNP stupac c) i (stupac d) sa AMP-PNP Mikrotubuli su tada oporavljeni i inkubirani s . ATP da bi se oslobodili vezani proteini, koji su podvrgnuti elektroforezi. Va`no je uo~iti da je 110 kd polipeptid specifi~no vezan za mikrotubule u prisutnosti AMP-PNP te poslije , otpu{ten s pomo}u ATP Za proteine vezane u prisutnosti . AMP-PNP tako|er je prona|eno da induciraju kretanje mikrotubula (ozna~eni s + iznad gela).
+ b c
+ d
116 97
66
nje kinezina I u tom smjeru prenosi vezikule i organele od tijela stanice prema vr{ku aksona. Ipak, unutar intaktnih aksona primije}eno je da se vezikule i organele kre}u i natrag prema tijelu stanice, upozoravaju}i na mogu}nost da je neki drugi motori~ki protein odgovoran za kretanje du` mikrotubula u suprotnom smjeru prema minus kraju. U skladu s tim predvi|anjem, daljnja su istraìvanja pokazala da je protein, prethodno identificiran kao MAP-1C (od engl. microtubule-associated protein, protein povezan s mikrotubulom), zapravo motori~ki protein koji se kretao du` mikrotubula u smjeru minus kraja. Kasnije su analize pokazale da je MAP-1C srodan dineinu izoliranom iz trepetljika (aksonemalni dinein), tako da se MAP-1C danas naziva i citoplazmatski dinein. Kinezin I je molekula od pribli`no 380 kd, sastavljena od dvaju te{kih lanaca (svaki ima 120 kd) i dvaju lakih lanaca (svaki ima 64 kd) (vidi sliku 11-48). Dva te{ka lanca imaju duga~ka podru~ja a-uzvojnice {to se omataju jedan oko drugoga u pletenasto-uzvojitu strukturu. Amino-terminalne glo-
471
rali kretanje mikrotubula preko povr{ine staklenih pokrovnica. Taj bezstani~ni sustav postao je osjetljiva i brza metoda za analizu aktivnosti kinezina kao molekularnog motora. Drugi vaàn pristup upotrijebljen za izolaciju kinezina iskoristio je njegovu sposobnost vezanja na mikrotubule. Lasek i Brady (Nature, 1985, 316: 645647) napravili su klju~no opaànje da in vitro kretanje mikrotubula zahtijeva ATP i inhibirano je analogom ATP (adenil-imidodifosfatom, AMP-PNP) koji ne moè biti hidroliziran i stoga ne moè biti iskoristivi izvor energije. U prisutnosti AMP-PNP, organele ostaju vezane na mikrotubule, pokazuju}i da je pod tim uvjetima motori~ki protein odgovoran za kretanje organela mo`da, tako|er, ostao vezan na mikrotubule. Na temelju ovih pronalazaka, Vale i suradnici inkubirali su mikrotubule s citoplazmatskim proteinima iz aksona lignje u prisutnosti AMP-PNP Mikrotu. buli su tada oporavljani te inkubirani s ATP da bi oslobodili proteine koji su bili specifi~no vezani u prisutnosti nehidrolizibilnog analoga ATP Ovaj je . eksperiment identificirao polipeptid od 110 kd koji je bio vezan za mikrotubule u prisutnosti AMP-PNP, a otpu{ten kasnijom inkubacijom s ATP (vidi sliku). Nadalje, pokazalo se da proteini vezani na mikrotubule i zatim otpu{teni s pomo}u ATP, podupiru
kretanje mikrotubula in vitro. Vezanje na mikrotubule u prisutnosti AMPPNP-a tako je omogu}ilo u~inkovit pristup izolaciji motori~kog proteina, za koji je daljnjim biokemijskim istraìvanjima pokazano da sadràva 110 kd polipeptid sastavljen od polipeptida od 60-70 kd. Sli~nim pristupom je njemu srodan protein pro~i{}en iz mozga goveda. Autori zaklju~uju da ti proteini predstavljaju novi razred proteina uklju~enih u stani~na kretanja koji su struktur no i enzimski razli~iti od dineina, i predlaù da ih se zove translokatorski kinezini (od gr~ki knw, kretati se).
R. D. Vale
Utjecaj
Kretanje vezikula i organela du` mikrotubula temeljno je obilje`je organizacije eukariotske stanice, a motori~ki proteini odgovorni za ta kretanja stoga imaju klju~nu ulogu u stani~noj biologiji. Daljnji eksperimenti koji su koristili in vitro metode sli~ne onima opisanim ovdje, utvrdili su da se kinezin kre}e du` mikrotubula u smjeru plus kraja, dok je citoplazmatski dinein odgovoran za prijenos vezikula i organela prema minus kraju mikrotubula. [tovi{e, od onda do sada identificirana je velika porodica kinezinu srodnih proteina. Osim njihove uloge u prijenosu vezikula i organela, ~lanovi tih porodica motori~kih proteina odgovor ni su za odjeljivanje i raspodjelu
T. S. Reese
M. P. Sheetz
kromosoma tijekom mitoze. Identifikacija kinezina tako je otvorila vrata razumijevanju niza pokreta utemeljenih na mikrotubulima, a od klju~ne su va`nosti za strukturu i funkciju eukariotske stanice.
bularne domene glavice te{kih lanaca su motori~ke domene molekule. Veù se na mikrotubule i ATP hidroliza kojega daje energiju potrebnu za kre, tanje. Iako je motori~ka domena kinezina (pribli`no 340 aminokiselina) puno manja od one miozina (oko 850 aminokiselina), kristalografija s pomo}u X-zraka pokazuje da su se kinezin i miozin (vidi sliku 11-31) razvili od zajedni~kog pretka i da su strukturno sli~ni. Repni dio kinezinske molekule sastoji se od lakih lanaca povezanih s karboksi-terminalnim domenama te{kih lanaca. Taj dio kinezina odgovoran je za vezanje s drugim dijelovima stanice (kao {to su vezikule i organele) {to se prenose du` mikrotubula djelovanjem kinezinskih motora. Citoplazmatski dinein izuzetno je velika molekula (i do 2.000 kd) koja se sastoji od dva do tri te{ka lanca (svaki oko 500 kd) povezana s promjenjivim brojem lakih i lanaca srednje teìne, veli~ine od 14 do 120 kd (vidi sliku 11-48). Kao i u kinezinu, te{ki lanci stvaraju globularne motori~ke domene
472
Poglavlje 11
koje veù ATP koje su odgovorne za kretanje du` mikrotubula. Za bazalni , dio molekule, uklju~uju}i lake lance i lance srednje teìne, misli se da se veù na ostale unutarstani~ne strukture kao {to su organele i vezikule. Kao i miozin, kinezin i dinein definiraju porodice srodnih motori~kih proteina. Nakon prvobitne izolacije kinezina 1985. godine, identificiran je niz kinezinu srodnih proteina. U genomu C. elegans kodirano je osamnaest razli~itih kinezina, a misli se da u ~ovjeka postoji stotinjak razli~itih ~lanova kinezinske porodice. Neki se ~lanovi kinezinske porodice, kao kinezin I, kre}u du` mikrotubula u smjeru plus kraja (vidi sliku 11-48). Ostali se ~lanovi kinezinske porodice, pak, kre}u u suprotnom smjeru, prema minus kraju. Razli~iti se ~lanovi porodice kinezina razlikuju u aminokiselinskom slijedu svojih karboksi-terminalnih repova koji su odgovorni za pokretanje razli~itih vrsti tereta du` tubula, uklju~uju}i vezikule, organele, i kromosome. Postoji tako|er i nekoliko tipova aksonemalnog dineina, kao i mnogi citoplazmatski dineini. Svi se ~lanovi dineinske porodice kre}u prema minus kraju mikrotubula, no razli~iti citoplazmatski dineini mogu prenositi razli~ite terete.
Prijenos organela i unutarstani~na organizacija

Jedna od glavnih uloga mikrotubula jest prijenos membranskih vezikula i organela kroz citoplazmu eukariotske stanice. Kao {to je ve} opisano, takav citoplazmatski prijenos organela osobito je uo~ljiv u aksonima ìv~anih stanica, koji se mogu izduìvati vi{e od jednog metra u duljinu. Ribosomi su prisutni samo u tijelu stanice i dendritima, tako da se proteini, membranske vezikule i organeli (na primjer mitohondriji) moraju prenositi iz tijela stanice u akson. S pomo}u mikroskopije unaprije|ene videosnimanjem prijenos membranskih vezikula i organela u oba smjera moè biti promatran du` mikrotubula aksona, gdje kinezin prenosi svoj teret prema vr{ku aksona, a dinein u suprotnom smjeru. Na primjer, sekrecijske vezikule koje sadràvaju neurotransmitore prenose se od Golgijeva aparata do zavr{nih ogranaka aksona s pomo}u kinezina. U obrnutom smjeru, citoplazmatski dinein prenosi endocitoti~ke vezikule od aksona natrag prema tijelu stanice. Na sli~an na~in mikrotubuli prenose membranske vezikule i organela i u ostalim vrstama stanica. Zbog ~injenice da su mikrotubuli obi~no orijentirani sa svojim minus-krajevima prema periferiji stanice, za razli~ite ~lanove kinezinske i dineinske porodice misli se da prenose vezikule i organela u suprotnom smjerovima kroz citoplazmu (slika 11-49). Konvencionalni kinezin i ostali plus-kraju usmjereni ~lanovi kinezinske porodice prenose svoj teret prema periferiji stanice, dok citoplazmatski dineini i minus-kraju usmjereni ~lanovi kinezinske porodice prenose materijal prema sredi{tu stani-
vezikula {to je prenosi dinein
vezikula {to je prenosi kinezin
Slika 11-49. Transport vezikula du` mikrotubula.

Kinezin i drugi plus-kraju usmjereni ~lanovi porodice kinezina prenose vezikule i organele u smjeru plus-kraja mikrotubula, koji se proteè prema periferiji stanice. Nasuprot tomu, dinein i minus-kraju usmjereni ~lanovi porodice kinezina prenose svoj teret u smjeru minus-kraja mikrotubula, koji su usidreni u sredi{te stanice.
+
+ +
+ + +
jezgra
+ + +
+ +
centrosom
473
(A)
(B)
Slika 11-50. Povezanost endoplazmatskoga retikula s mikrotubulima.

Fluorescencijska mikroskopija endoplazmatskoga retikula (A) i mikrotubula (B) u epitelnoj stanici. Endoplazmatski retikul je obojen fluorescentnom bojom, a mikrotubuli protutijelima na tubulin. Uo~ite blisku vezu izme|u endoplazmatskoga retikula i mikrotubula na periferiji stanice. (Od M. Terasaki, L. B. Chen i K. Fujiwara, 1986. J. Cell Biol. 103:1557).
10 mm
ce. Osim prijenosa membranskih vezikula endocitnim i sekrecijskim putovima, mikrotubuli i njima pridruèni motori~ki proteini pozicioniraju organela s vlastitim membranama (kao {to su endoplazmatski retikul, Golgijev aparat, lizosomi i mitohondriji) unutar stanice. Na primjer, endoplazmatski se retikul pruà prema periferiji stanice zajedno s mikrotubulima (slika 1150). Tvari koje depolimeriziraju mikrotubule uzrokuju povla~enje endoplazmatskog retikula prema sredi{tu stanice, pokazuju}i da je povezanost s mikrotubulima potrebna za odràvanje endoplazmatskog retikula u njegovom razvu~enom stanju. Ovo pozicioniranje endoplazmatskog retikula, izgleda, uklju~uje djelovanje kinezina (ili mo`da mnogobrojnih ~lanova kinezinske porodice), koji povla~i endoplazmatski retikul du` mikrotubula u smjeru plus-kraja, prema periferiji stanice. Sli~no, ~ini se da kinezin igra klju~nu ulogu u razmje{tanju lizosoma dalje od sredi{ta stanice, a za tri razli~ita ~lana kinezinske porodice pretpostavlja se da su uklju~eni u kretanje mitohondrija. Za citoplazmatski se dinein, naprotiv, misli da ima ulogu u pozicioniranju Golgijeva aparata. Golgijev aparat je smje{ten u sredi{tu stanice, blizu centrosoma. Ako su mikrotubuli poreme}eni, bilo zbog tvari dodanih u kulturu stanice ili zbog ulaska stanice u mitozu, Golgijev aparat se raspada u male vezikule {to se raspr{uju kroz citoplazmu. Kad se mikrotubuli ponovo oblikuju, Golgijev aparat se tako|er ponovno sastavlja tako da se Golgijeve vezikule o~igledno prenose prema sredi{tu stanice (prema minus-kraju mikrotubula) s pomo}u citoplazmatskog dineina. Kretanje du` mikrotubula je stoga odgovorno ne samo za prijenos vezikula, nego i za utvr|ivanje smje{taja organela s vlastitim membranama unutar citoplazme eukariotske stanice.
474
Poglavlje 11
Odvajanje mitoti~kih kromosoma

Kao {to je opisano prije u ovom poglavlju, mikrotubuli se reorganiziraju na po~etku mitoze da bi oblikovali mitoti~ko vreteno, koje ima sredi{nju ulogu u diobi stanice jer raspodjeljuje udvostru~ene kromosome u jezgre stanica-k}eri. Ova klju~na raspodjela genskog materijala odvija se tijekom anafaze mitoze, kad se sestrinske kromatide odvajaju i kre}u prema suprotnim polovima vretena. Kretanje kromosoma se odvija s pomo}u dvaju razli~itih mehanizama, koje nazivamo anafaza A i anafaza B, a oni uklju~uju razli~ite vrste mikrotubula vretena i pridruènih motori~kih proteina. Anafaza A sastoji se od kretanja kromosoma prema mitoti~kim polovima du` kinetohornih mikrotubula, koji se skra}uju kako se kromosomi sve vi{e odmi~u (slika 11-51). îni se da je taj tip kretanja kromosoma vo|en kinetohori-pridruènim motori~kim proteinima {to premje{taju kromosome du` mikrotubula vretena u smjeru minus-kraja, prema centrosomima. Citoplazmatski dinein povezan je s kinetohorima i moè imati ulogu u kretanju kromosoma prema polovima, kao {to to mogu i minus-kraju usmjereni ~lanovi kinezinske porodice. Djelovanje tih kinetohornih motori~kih proteina spregnuto je razilaènjem i skra}ivanjem kinetohornih mikrotubula, {to posreduju neki ~lanovi kinezinske porodice ~ija enzimska aktivnost destabilizira mikrotubule. Pod anafazom B misli se na me|usobno odvajanje polova vretena (slika 11-52). Odvajanje polova vretena sli~no je po~etnom odvajanju udvostru~enih centrosoma, a popra}eno je produìvanjem polarnih mikrotubula da bi se stvorili polovi vretena na po~etku mitoze (vidi sliku 11-46). Tijekom anafaze B, preklapaju}i polarni mikrotubuli klize jedan nasuprot drugom, odvla~e}i polove vretena. Pokazano je da je ovaj tip kretanja rezultat djelovanja nekoliko plus-kraju usmjerenih ~lanova kinezinske porodice, koji poprje~no povezuju polarne mikrotubule te ih pomi~u prema plus-kraju njihovog preklapaju}eg mikrotubula, dalje od suprotnog pola vretena. Osim toga, polovi vretena mogu biti odvu~eni astralnim mikrotubulima. Mehanizam odgovoran za ovu vrstu kretanja jo{ nije spoznan, ali mogao bi biti rezultat djelovanja citoplazmatskih dineina usidrenih u koru stanice ili neku drugu strukturu u citoplazmi. Premje{tanje tako usidrenih dineinskih motora du` astralnih mikrotubula u smjeru minus-kraja imalo bi u~inak odvla~enja polova vretena prema periferiji stanice. Druga je mogu}nost da bi se motori~ki protein vezan s polom vretena mogao kretati du` astralnih mikrotubula u smjeru plus-kraja, {to bi tako|er odvla~ilo polove vretena prema periferiji stanice.
polarni mikrotubuli
+ + + + + + + + + + + + + + + +
astralni mikrotubuli
+ + +
+ + + + + + +
Trepetljike i bi~evi
Minus kraju usmjeren motori~ki protein dio je kinetohornoga kompleksa.
Trepetljike i bi~evi su izbo~enja membrane citoplazme utemeljena na mikrotubulima i odgovorna za kretanje niza razli~itih eukariotskih stanica. Mnoge bakterije tako|er imaju bi~eve, ali ovi prokariotski bi~evi dosta su razli~iti od onih u eukariota. Bakterijski bi~evi (o kojima ovdje vi{e ne}e biti govora) su proteinska vlakna koja str{e iz stani~ne povr{ine, a ne izbo~enja membrane citoplazme podràna mikrotubulima.
razgradnja mikrotubula kromosom
Slika 11-51. Kretanje kromosoma u anafazi A.

Kromosomi se kre}u prema polovima vretena du` kinetohornih mikrotubula. Misli se da kretanje kromosoma vode minus-kraju usmjereni motori~ki proteini spojeni s kinetohorima. Djelovanje tih motori~kih proteina udruèno je s razgradnjom i skra}ivanjem kinetohornih mikrotubula.
475
+ + +
astralni mikrotubul
polarni mikrotubul
kinetohorni mikrotubul
+ +
+ +
+
plus-kraju usmjereni motor
+
minus kraju-usmjereni motor
+
plus-kraju usmjereni motor
Slika 11-52. Odvajanje polova vretena u anafazi B.

Odvajanje polova vretena rezultat je dviju vrsti kretanja. Prvo, preklapaju}i polarni mikrotubuli klize jedan kraj drugoga da bi odvukli polove vretena, vjerojatno kao rezultat djelovanja plus-kraju usmjerenih motori~kih proteina. Drugo, polovi vretena bivaju odvu~eni svaki na svoju stranu s pomo}u astralnih mikrotubula. Vu~na sila moè biti ili minus-kraju usmjereni motor usidren u neku strukturu citoplazme, kao primjerice, stani~nu koru, ili plus-kraju usmjereni motor povezan s polom vretena.
Eukariotske trepetljike i bi~evi veoma su sli~ne strukture, svaka s promjerom od pribli`no 0,25 mm (slika 11-53). Mnoge su stanice pokrivene s mnogobrojnim trepetljikama duljine oko 10 mm. Trepetljike udaraju koordiniranim pokretima natrag-naprijed, {to pokre}e stanicu kroz teku}inu ili pokre}e teku}inu preko povr{ine stanice. Primjerice, trepetljike nekih praìvotinja (kao {to je Paramecium) odgovorne su za stani~nu pokretljivost i guranje hrane preko stani~ne povr{ine prema oralnoj {upljini. Kod ìvotinja, va`na funkcija trepetljiki je premje{tanje teku}ine ili sluzi preko povr{ine slojeva epitelnih stanica. Dobar primjer za ovo su stanice s trepetljikama koje oblaù di{ne puteve i iz njih uklanjaju sluz i pra{inu. Bi~evi se razlikuju od trepetljiki u svojoj duljini (mogu biti duga~ki i do 200 mm) i po svom valovitom na~inu udaranja. Stanice obi~no imaju jedan ili dva bi~a, koji su odgovorni za pokretanje razli~itih praìvotinja i spermija. Temeljna struktura i trepetljika i bi~eva je aksonema, koja je sastavljena od mikrotubula i njima pridruènih proteina (slika 11-54). Mikrotubuli su poredani u karakteristi~ni obrazac 9+2 u kojem je sredi{nji par mikrotu-
476
Poglavlje 11
Slika 11-53. Primjeri trepetljika i bi~eva.
(A)
(C)
(A) Scanning (pretra`na) elektronskomikroskopska slika koja prikazuje brojne trepetljike {to prekrivaju povr{inu praìvotinje Paramecium. (B) Pretra`na elektronskomikroskopska slika trepetljikavih epitelnih stanica {to oblaù povr{inu traheje. (C) Vi{estruko-osvijetljena fotografija (500 puta u sekundi) pokazuje valovite pokrete bi~a spermija morskog jeà. (A, Karl Aufderheide/ Visuals Unlimited; B, Fred E. Hossler/ Visuals Unlimited; C, C. J. Brokaw; California Institute of Technology.)
(B) 20 mm
5 mm
10 mm
(A)
(B) vanjski duplet mikrotubula
radijalna pre~ka A-tubul B-tubul neksinska veza
vanjska dineinska ruka unutra{nji omot unutra{nja dineinska ruka
stani~na membrana a
sredi{nji par mikrotubula
0,1 mm
Slika 11-54. Struktura aksoneme trepetljika i bi~eva.

(A) Kompjuterski pobolj{ana elektronskomikroskopska slika poprje~nog presjeka aksoneme bi~a {takorskog spermija. (B) Shematski prikaz poprje~nog presjeka aksoneme. Devet vanjskih parova sastoje se od jednog potpunog (A) i jednog nepotpunog (B) mikrotubula, koji sadràva samo 10 ili 11 protofilamenata. Vanjski parovi su udruèni jedan s drugim neksinskim vezama, a sa sredi{njim parom mikrotubula radijalnim pre~kama (kao `bice na kota~u bicikla). Svaki vanjski par mikrotubula povezan je s unutra{njim i vanjskim dineinskim ru~icama. (A, K. G. Murti/ Visuals Unlimited.)
477
bula okruèn s devet vanjskih parova mikrotubula. Dva sparena mikrotubula svakoga vanjskog para su razli~ita: jedan (nazvan A-tubul) je potpun mikrotubul sa~injen od 13 protofilamenata; drugi (Btubul) je nepotpun, sastoji se od samo 10 ili 11 protofilamenata povezanih s A tubulom. Vanjski parovi mikrotubula povezani su sa sredi{njim parom radijalnim pre~kama i me|usobno s pomo}u veza proteina zvanog neksin. Osim toga, dvije ru~ice dineina spojene su sa svakim A-tubulom, a motori~ka aktivnost tih aksonemalnih dineina izaziva udaranje trepetljika i bi~eva. Minus-krajevi mikrotubula trepetljika i bi~eva usidreni su u bazalno tijelo, koje je po strukturi sli~no centriolu i sadràva devet tripleta mikrotubula (slika 11-55). O centriolima kao dijelovima centrosoma (u kojima je njihovo djelovanje sloèno) govoreno je ve} ranije. Bazalno tijelo, ipak, ima jasnu ulogu u organizaciji mikrotubula aksoneme. Naime, svaki od vanjskih parova mikrotubula aksoneme zapo~et je izduìvanjem dvaju mikrotubula {to su prisutni u tripletima bazalnog tijela. Bazalna tijela tako sluè za zapo~injanje rasta mikrotubula aksoneme, kao i za sidrenje trepetljika i bi~eva za stani~nu povr{inu. Pokreti trepetljika i bi~eva rezultat su klizanja vanjskih parova mikrotubula jednih u odnosu na druge, {to je potencirano motori~kom aktivno{}u aksonemalnog dineina (slika 11-56). Bazalni dijelovi dineina veù se na Atubule dok se dineinske skupine glavica veù na B-tubule susjednih parova. Kretanje dineinske skupine glavice u smjeru minus-kraja tada dovodi do klizanja A-tubula jednog para prema bazalnom kraju susjednog B-tubula. Budu}i da su parovi mikrotubula u aksonemi spojeni neksinskim vezama, klizanje jednoga para du` drugoga uzrokuje njihovo savijanje, {to je temelj za pokrete udaranja trepetljika i bi~eva. O~ito je, ipak, da djelovanje dineinske molekule u razli~itim podru~jima aksoneme mora biti pa`ljivo regulirano da bi se proizvelo koordinirano udaranje trepetljika i valovito titranje bi~eva to je proces koji je jo{ uvijek slabo poznat.
(A)
(B)
0,1 mm
0,1 mm
Slika 11-55. Elektronskomikroskopska slika bazalnih tijela.

(A) Uzdu`ni prikaz trepetljika usidrenih u bazalno tijelo. (B) Poprje~ni presjek bazalnoga tijela. Svako bazalno tijelo sastoji se od devet tripleta mikrotubula. (A, Conly L. Reider/Biological Photo Service; B, W. L. Dentler, Biological Photo Service.)
478
Poglavlje 11
Slika 11-56. Pokreti mikrotubula u trepetljikama i bi~evima.

Baze dineinskih ruku vezane su na A-tubule, a motori~ke skupine glavica u interakciji su s B-tubulima susjednih parova mikrotubula. Kretanje dineinskih skupina glavica u smjeru minus-kraja (prema bazi trepetljike) tada uzrokuje klizanje A-tubula jednog para mikrotubula prema bazi susjednog B-tubula. Kako su oba para mikrotubula povezana neksinskim vezama, ovo ih klizanje tjera da se savijaju.
B A
dinein +kraj B A
kretanje dineinskih skupina glavica prema minus-kraju B-tubula
savijanje mikrotubula
kraj neksinska veza
KLJU^NI POJMOVI
S A @ E TA K STRUKTURA I ORGANIZACIJA AKTINSKIH VLAKANA
aktin, mikrofilamenti, globularni (G) aktin, vlaknati (F) aktin, hod u mjestu, citohalazin, faloidin, protein koji veè aktin, Arp2/3 kompleks, ADF/kofilin, profilin aktinski snop, aktinska mreà, protein koji usnopljuje aktin, fimbrin, kontraktilni snop, a-aktinin, filamin stani~na kora, spektrin, ankirin, fodrin, ERM proteini, distrofin, integrin, àri{na adhezija, tla~no vlakno, talin, vinkulin, prianjaju}i spoj, adhezijski pojas, kadherin, katenini mikrovili, ~etkasta membrana, stereocilije, vilin, pseudopodiji, lamelipodiji, mikro{iljci, filopodiji
Izgradnja i razgradnja aktinskih vlakana: Aktinska vlakna oblikuju se polimerizacijom monomera aktina od glave prema repu u strukturu uzvojnice. Niz proteina koji veù aktin regulira izgradnju i razgradnju aktinskih vlakana unutar stanice. Organizacija aktinskih vlakana: Aktinska vlakna su umreèna proteinima koji veù aktin da bi oblikovala snopove ili trodimenzionalne mreè. Spajanje aktinskih vlakana sa stani~nom membranom: Mreà aktinskih vlakana i dugih proteina citoskeleta podupire stani~nu membranu i odre|uje oblik stanice. Aktinski snopovi se tako|er pri~vr{}uju na stani~nu membranu i usidruju stanicu u podru~jima me|ustani~nog kontakta i kontakta s podlogom. Izbo~enja stani~ne povr{ine: Aktinska vlakna daju potporu trajnim izbo~enjima stani~ne povr{ine, kao {to su mikrovili, kao i prolaznim izduènjima koja su odgovorna za fagocitozu i stani~no pokretanje.
AKTIN, MIOZIN I STANI^NO KRETANJE

miozin, molekularni motor, mi{i}no vlakno, miofibrila, sarkomera, titin, nebulin, model mi{i}ne kontrakcije, miozin II, sarkoplazmatski retikul, tropomiozin, troponin
Mi{i}na kontrakcija: Prou~avanja mi{i}a utvrdila su ulogu miozina kao motori~kog proteina {to koristi energiju dobivenu hidrolizom ATP u stvaranju sile i kretanju. Mi{i}na kontrakcija je rezultat klizanja aktinskih i miozinskih vlakana jednih izme|u drugih. Hidroliza ATP pokre}e ponavljaju}e cikluse interakcija izme|u miozina i aktina, tijekom kojih konformacijske promjene dovode do kretanja skupina glavica miozina du` aktinskih vlakana.
479
Kontraktilno zdruìvanje aktina i miozina u nemi{i}nim stanicama: Zdruìvanje aktina i miozina II odgovorno je za niz pokreta nemi{i}nih stanica, uklju~uju}i citokinezu. Nekonvencionalni miozin: Ostali tipovi miozina koji ne sudjeluju u kontrakciji sluè za prijenos membranskih vezikula i organela du` aktinskih vlakana. Stani~na migracija i puzanje: Stani~na migracija je sloèn proces u kojem se izbo~enja stani~ne membrane oblikuju polimerizacijom aktinskih vlakana na vode}em rubu stanice. Ova izbo~enja tada se veù na podlogu, a stra`nji se dio uvla~i u tijelo stanice.
citokineza, kontraktilni prsten, miozinska kinaza lakog lanca, kalmodulin miozin I
INTERMEDIJARNA VLAKNA
Proteini inter medijar nih vlakana: Intermedijarna vlakna su polimeri vi{e od 50 razli~itih proteina {to se eksprimiraju u razli~itim vrstama stanica. Nisu uklju~eni u stani~no kretanje, ali pruàju mehani~ku podr{ku stanicama i tkivima. Izgradnja inter medijar nih vlakana: Intermedijarna vlakna oblikuju se od dimera dvaju polipeptidnih lanaca {to se omataju jedan oko drugog u pletenasto-uzvojitu strukturu. Dimeri se tada povezuju da bi stvorili tetramere, koji se zdruùju u protofilamente. Intermedijarna vlakna nastaju smatanjem protofilamenata u strukturu sli~nu uètu. Unutarstani~na organizacija inter medijar nih vlakana: Intermedijarna vlakna stvaraju mreù {to se proteè od prstena koji okruùje jezgru prema membrani citoplazme. U epitelnim stanicama, intermedijarna vlakna usidrena su za stani~nu membranu u podru~jima specijaliziranih stani~nih kontakata (dezmosomi i hemidezmosomi). Intermedijarna vlakna tako|er imaju specijaliziranu ulogu u mi{i}u i ìv~anim stanicama. Funkcije keratina i neurofilamenata: Bolesti koè i ìv~anoga sustava: Va`nost intermedijarnih vlakana u osiguravanju mehani~ke potpore stanicama u tkivu dokazana je uvo|enjem mutiranih gena za keratin u transgeni~ne mi{eve. Sli~ne mutacije gena za keratin uzrokom su nekih ko`nih bolesti ~ovjeka, a nepravilnosti neurofilamenata su uklju~ene i u razvoj bolesti motori~kih neurona.
dezmosom, hemidezmosom, plakin intermedijarna vlakna, keratin, ~vrsti keratin, meki keratin, vimentin, dezmin, neurofilamentni (NF) protein
MIKROTUBULI
Struktura, zdruìvanje i dinami~ka nestabilnost mikrotubula: Mikrotubuli nastaju reverzibilnom polimerizacijom tubulina. Zbog svojstva dinami~ke nestabilnosti podvrgnuti su neprekidnim ciklusima zdruìvanja i razilaènja, {to je posljedica hidrolize GTP nakon polimerizacije tubulina. Centrosom, centrioli i organizacija mikrotubula: Mikrotubuli se u ve}ini stanica pruàju od sredi{ta mikrotubularnog ustrojavanja ili centrosoma, smje{tenog blizu sredi{ta stanice, prema van. U ìvotinjskim stanicama, centrosom obi~no sadràva par centriola okruènih pericentriolarnom tvari. Rast mikrotubula zapo~inje u pericentriolarnoj tvari, koja tada sidri njihov minus kraj.
mikrotubuli, tubulin, dinami~ka nestabilnost, kolhicin, kolcemid, vinkristin, vinblastin, taksol
sredi{te mikrotubularnoga ustrojavanja, centrosom, centrioli, pericentriolarna tvar
480
Poglavlje 11
mitoti~ko vreteno, kinetohorni mikrotubul, polarni mikrotubul, astralni mikrotubul proteini povezani s mikrotubulom (MAP)
Reorganizacija mikrotubula tijekom mitoze: Mikrotubuli se reorganiziraju po~etkom mitoze da bi oblikovali mitoti~ko vreteno, koje je odgovorno za odvajanje kromosoma. Stabilizacija mikrotubula i stani~na polar nost: Selektivna stabilizacija mikrotubula proteinima povezanim s mikrotubulom moè odrediti oblik stanice i polarnost, kao i izduìvanje aksona i dendrita ìv~ane stanice.
MIKROTUBULARNI MOTORI I KRETANJE

kinezin, dinein, aksonemalni dinein, mikroskopija unaprije|ena videosnimanjem, citoplazmatski dinein
Identifikacija mikrotubular nih motori~kih proteina: Dvije porodice motori~kih proteina, kinezini i dineini, odgovorni su za kretanje du` mikrotubula. Kinezin i ve}ina kinezinu srodnih proteina kre}e se u smjeru pluskraja, dok se dinein i neki ~lanovi porodice kinezina kre}u prema minus-krajevima. Prijenos organela i unutarstani~na organizacija: Kretanje du` tubula prenosi membranske vezikule i organela kroz citoplazmu, te pozicionira citoplazmatska organela unutar stanice.
anafaza A, anafaza B
Razdvajanje kromosoma u mitozi: Tijekom anafaze mitoze, kromosomi-k}eri odvajaju se i kre}u prema suprotnim polovima mitoti~kog vretena. Odvajanje kromosoma rezultat je nekoliko tipova kretanja u kojima sudjeluju razli~iti razredi mikrotubula vretena i motori~kih proteina. Trepetljike i bi~evi: Trepetljike i bi~evi su izduènja stani~ne membrane potpomognuta mikrotubulima. Njihovo kretanje je rezultat klizanja mikrotubula, vo|enog djelovanjem dineinskih motora.
trepetljika, bi~, aksonema, neksin, bazalno tijelo
Pitanja
1. [to daje aktinskim vlaknima razli~itu polarnost tako da nastaju plus- i minuskraj? 2. [to je hod u mjestu i pri kojoj koncentraciji monomera se pojavljuje? 3. Usporedi djelovanje citohalazina i faloidina na aktinska vlakna za vrijeme hoda u mjestu. 4. Kako proteini koji veù aktin-kofilin, profilin i Arp2/3 reguliraju zdruìvanje aktinskih vlakana i njihovu izmjenu? 5. Petogodi{njak dolazi u va{u kliniku s iznenadnim napadajem mi{i}ne slabosti, i vi otkrivate nasljedni model te bolesti u maj~inoj obitelji. Koja je najvjerojatnija dijagnoza i uzrok ove bolesti? 6. Koje pruge ili zone sarkomera mi{i}a mijenjaju duljinu tijekom kontrakcije? Za{to A-pruga ne mijenja duljinu? 7. Za{to je polar nost aktinskih vlakana va`na za mi{i}nu kontrakciju? 8. Kako otpu{tanje Ca2+ iz sarkoplazmatskog retikula omogu}uje kontrakciju poprje~no-prugastog mi{i}a? 9. Biste li o~ekivali da mutacije keratinskoga gena utje~u na fibroblaste? 10. Na koji su na~in kinezin i miozin II sli~ni, a kako se razlikuju? 11. Kako bi uklanjanje neksina utjecalo na udaranje trepetljika?
481
Literatura
Op}enita literatura
Bray, D. 2001. Cell Movements, 2nd ed., New York: Garland Publishing.
Aktin, miozin i stani~no kretanje

Chou, Y. H., B. T. Helfand and R. D. Goldman. 2001. New horizons in cytoskeletal dynamics: Transport of intermediate filaments along microtubule tracks. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 106109. P Erickson, H. P 1997. Stretching single protein . molecules: Titin is a weird spring. Science 276: 10901092. P Finer, J. T., R. M. Simmons and J. A. Spudich. 1994. Single myosin molecule mechanics: Piconewton forces and nanometre steps. Nature 368: 113119. I Geeves, M. A. and K. C. Holmes. 1999. Structural mechanism of muscle contraction. Ann. Rev. Biochem. 68: 687728. P Goldman, Y. E. 1998. Wag the tail: Structural dynamics of actomyosin. Cell 93: 14. P Higuchi, H. and S. A. Endow. 2002. Directionality and processivity of molecular motors. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 5057. P Huxley, H. E. 1969. The mechanism of muscle contraction. Science 164: 13561366. P Huxley, H. E. and J. Hanson. 1954. Changes in the cross-striations of muscle contraction and their structural interpretation. Nature 173: 973976. I Huxley, A. F. and R. Niedergerke. 1954. Interference microscopy of living muscle fibres. Nature 173: 971973. I Pantaloni, D., C. Le Clainche and M. F. Carlier. 2001. Mechanism of actin-based motility. Science 292: 15021506. P Rayment, I., W. R. Rypniewski, K. SchmidtBase, R. Smith, D. R. Tomchick, M. M. Benning, D. A. Winkelmann, G. Wesenberg and H. M. Holden. 1993. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: A molecular motor. Science 261: 5058. I Rayment, I., H. M. Holden, M. Whittaker, C. B. Yohn, M. Lorenz, K. C. Kolmes and R. A. Milligan. 1993. Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction. Science 261: 5865. I Ruppel, K. M. and J. A. Spudich. 1996. Structure-function analysis of the motor domain of myosin. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 543573. P Small, J. V., T. Stradal, E. Vignal and K. Rottner. 2002. The lamellipodium: Where motility begins. Trends Cell Biol. 12: 112120. P Tan, J. L., S. Ravid and J. A. Spudich. 1992. Control of nonmuscle myosins by phosphorylation. Ann. Rev. Biochem. 61: 721 759. P Trinick, J. and L. Tskhovrebova. 1997. Titin: A molecular control freak. Trends Cell Biol. 9: 377380. P
Turner, C. E. and M. C. Brown. 2001. Cell motility: ARNO and ARF6 at the cutting edge. Curr. Biol. 11: R875R877. P Zot, A. S. and J. D. Potter. 1987. Structural aspects of troponin-tropomyosin regulation of skeletal muscle contraction. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16: 535559. P
Struktura i organizacija aktinskih vlakana

Bamburg, J. R. and O. P Wiggan. 2002. ADF/ . cofilin and actin dynamics in disease. Trends Cell Biol. 12: 598605. P Bennett, V. and D. M. Gilligan. 1993. The spectrin-based membrane skeleton and micron-scale organization of the plasma membrane. Ann. Rev. Cell Biol. 9: 2766. P Campbell, K. P 1995. Three muscular dystro. phies: Loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell 80: 675679. P Chen, L. F., H. Winkler, M. K. Reedy, M. C. Reedy and K. A. Taylor. 2002. Molecular modeling of averaged rigor crossbridges from tomograms of insect flight muscle. J. Struct. Biol. 138(12): 92104. Cooper, J. A., M. A. Wear and A. M. Weaver. 2001. Arp2/3 complex: advances on the inner workings of a molecular machine. Cell 107: 703705. P Dawe, H. R., L. S. Minamide, J. R. Bamburg and L. P Cramer. 2003. ADF/Cofilin controls . cell polarity during fibroblast migration. Curr. Biol. 13: 252257. I Holmes, K. C., D. Popp, W. Gebhard and W. Kabsch. 1990. Atomic model of the actin filament. Nature 347: 4449. I Kabsch, W., H. G. Mannherz, D. Suck, E. F. Pai and K. C. Holmes. 1990. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature 347: 3744. I Luna, E. J. and A. L. Hitt. 1992. Cytoskeletonplasma membrane interactions. Science 258: 955964. P Machesky L. M., S. J. Atkinson, C. Ampe, J. Vandekerckhove and T. D. Pollard. 1994. Purification of a cortical complex containing two unconventional actins from Acanthamoeba by affinity chromatography on profilin-agarose. J. Cell Biol. 127: 107115. I Pollard, T. D., S. Almo, S. Quirk, V. Vinson and E. E. Lattman. 1994. Structure of actin binding proteins: Insights about function at atomic resolution. Ann. Rev. Cell Biol. 10: 207249. P Schmidt, A. and M. N. Hall. 1998. Signaling to the actin cytoskeleton. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 305338. P Winder, S. J. 2003. Structural insights into actin-binding, branching and bundling proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 1422. P Yap, A. S., W. M. Brieher and B. M. Gumbiner. 1997. Molecular and functional analysis of cadherin-based adherens junctions. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 119146. P
Intermedijarna vlakna
Bonifas, J. M., A. L. Rothman and E. H. Epstein, Jr. 1991. Epidermolysis bullosa simplex: Evidence in two families for keratin gene abnormalities. Science 254: 12021205. I Brown, R. H., Jr. 1995. Amyotrophic lateral sclerosis: Recent insights from genetics and transgenic mice. Cell 80: 687692. P Coulombe, P A., M. E. Hutton, A. Letai, A. . Hebert, A. S. Paller and E. Fuchs. 1991. Point mutations in human keratin 14 genes of epidermolysis bullosa simplex patients: Genetic and functional analyses. Cell 66: 13011311. I Coulombe, P A. and M. B. Omary. 2002. . Hard and soft principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 110122. P Fuchs, E. and D. W. Cleveland. 1998. A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease. Science 279: 514519. P Fuchs, E. and Y. Yang. 1999. Crossroads on cytoskeletal highways. Cell 98: 547550. P Fuchs, E. and S. Raghavan. 2002. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat. Rev. Genet. 3: 199209. P Schwarz, M. A., K. Owaribe, J. Kartenbeck and W. W. Franke. 1990. Desmosomes and hemidesmosomes: Constitutive molecular components. Ann. Rev. Cell Biol. 6: 461491. P Vassar, R., P A. Coulombe, L. Degenstein, K. . Albers and E. Fuchs. 1991. Mutant keratin expression in transgenic mice causes marked abnormalities resembling a human genetic skin disease. Cell 64: 365380. I
Mikrotubuli
Bornens, M. 2002. Centrosome composition and microtubule anchoring mechanisms. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 2534. P Cassimeris, L. 2002. The oncoprotein 18/ stathmin family of microtubule destabilizers. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 1824. P Desai, A. and T. J. Mitchison. 1997. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 83117. P Drewes, G., A. Ebneth and E.-M. Mandelkow. 1998. MAPs, MARKs and microtubule
482
Poglavlje 11
dynamics. Trends Biochem. Sci. 23: 307311. R Hays, T. and M. Li. 2001. Kinesin transport: driving kinesin in the neuron. Curr. Biol. 11: R136R139. P Job, D., O. Valiron and B. Oakley. 2003. Microtubule nucleation. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 111117. P Karsenti, E. and I. Vernos. 2001. The mitotic spindle: a self-made machine. Science 294: 543547. P Mandelkow, E. and E. M. Mandelkow. 2002. Kinesin motors and disease. Trends Cell Biol. 12: 585591. P Marshall, W. F. 2001. Centrioles take center stage. Curr. Biol. 11: R487R496. P Mitchison, T. and M. Kirschner. 1984. Dynamic instability of microtubule growth. Nature 312: 237242. I Mitchison, T. and M. Kirschner. 1984. Microtubule assembly nucleated by isolated centrosomes. Nature 312: 232237. I Nogales, E., M. Whittaker, R. A. Milligan and K. H. Downing. 1999. High-resolution model of the microtubule. Cell 96: 7988. I
Oakley, B. R., C. E. Oakley, Y. Yoon and M. K. Jung. 1990. g-Tubulin is a component of the spindle pole body that is essential for microtubule function in Aspergillus nidulans. Cell 61: 12891301. I Osborn, M. and K. Weber. 1976. Cytoplasmic microtubules in tissue culture cells appear to grow from an organizing structure towards the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 867871. I Zheng, Y., M. L. Wong, B. Alberts and T. Mitchison. 1995. Nucleation of microtubule assembly by a g-tubulin-containing ring complex. Nature 378: 578583. I
Gibbons, I. R. 1981. Cilia and flagella of eukaryotes. J. Cell Biol. 91: 107s124s. P Gibbons, I. R., and A. Rowe. 1965. Dynein: A protein with adenosine triphosphatase activity from cilia. Science 149: 424426. I Lasek, R. J. and S. T. Brady. 1985. Attachment of transported vesicles to microtubules in axoplasm is facilitated by AMP-PNP . Nature 316: 645647. I Rieder, C. L. and E. D. Salmon. 1998. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol. 8: 310318. P Salmon, E. D. 1995. VE-DIC light microscopy and the discovery of kinesin. Trends Cell Biol. 5: 154157. P Saunders, W. S. 1993. Mitotic spindle pole separation. Trends Cell Biol. 3: 432437. R Vale, R. D. 2003. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell 112: 467480. P Vale, R. D., T. S. Reese and M. P Sheetz. 1985. . Identification of a novel force-generating protein, kinesin, involved in microtubulebased motility. Cell 42: 3950. I Vallee, R. B. and M. P Sheetz. 1996. Targeting . of motor proteins. Science 271: 15391544. P
Mikrotubular ni motori i kretanje

Brady, S. T. 1985. A novel brain ATPase with properties expected for the fast axonal motor. Nature 317: 7375. I Brady, S. T., R. J. Lasek and R. D. Allen. 1982. Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon. Science 218: 11291131. I Desai, A., S. Verma, T. J. Mitchison and C. E. Walczak. 1999. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell 96: 6978. I
Poglavlje
12
Stani~na povr{ina
Struktura stani~ne membrane 483 Transport malih molekula 493 Endocitoza 510 Stani~na stijenka i izvanstani~ni matriks 518 Me|ustani~ne interakcije 528
KLJU^NI POKUS:
LDL-receptor 512 Cisti~na fibroza 509
VE STANICE PROKARIOTSKE KAO I EUKARIOTSKE okruène su stani~nom membranom (plazma-membranom) koja odre|uje stani~ne granice i odjeljuje njihov sadràj od okoli{a. Sluè}i kao selektivna barijera za prolazak molekula, ona odre|uje sastav citoplazme. To kona~no odre|uje identitet stanice pa je tako stani~na membrana jedna od temeljnih struktura u stani~noj evoluciji. Zato se, kako je obja{njeno u prvom poglavlju, misli da su prve stanice nastale zatvaranjem samorepliciraju}e RNA unutar membrane od fosfolipida. Stani~na membrana dana{njih stanica sastoji se od lipida i proteina. Osnova strukture je fosfolipidni dvosloj koji je nepropustan za ve}inu u vodi topljivih molekula. Stoga ioni i ve}ina biolo{kih molekula mogu prolaziti kroz membrane samo zahvaljuju}i proteinima koji su odgovorni za selektivni transport molekula u stanicu i iz stanice. Ostali proteini stani~ne membrane nadziru me|ustani~ne interakcije u vi{estani~nim organizmima ili sluè kao senzori s pomo}u kojih stanica prima signale iz svojega okoli{a. Tako membrana ima dvostruku ulogu: izolira citoplazmu i posreduje u interakcijama izme|u stanice i njezina okoli{a.
Struktura stani~ne membrane

Ba{ kao i sve druge stani~ne membrane, tako se i plazma-membrana sastoji od lipida i proteina. Temeljna struktura membrane je fosfolipidni dvosloj koji oblikuje stabilnu barijeru izme|u dvaju razli~itih vodenih odjeljaka. U slu~aju stani~ne membrane, ovi su odjeljci unutra{njost stanice i izvanstani~ni prostor. Proteini uronjeni u dvosloj fosfolipida izvr{avaju specifi~ne funkcije membrane, uklju~uju}i selektivni transport molekula i me|ustani~no prepoznavanje.
Fosfolipidni dvosloj
Vanjska membrana stanice najbolje je istraèna pa se na{e dana{nje razumijevanje strukture membrane uglavnom razvilo kroz istraìvanje ove membrane.
484
Poglavlje 12
Slika 12-1. Dvoslojna struktura stani~ne membrane.

Elektronskomikroskopska slika crvene kr vne stanice ~ovjeka. Obratite pozornost na izgled èljezni~kih tra~nica. (Ljubazno{}u: J. David Robertson, Duke University, Medical Center).
membrana
20 nm
Posebno je koristan model za izu~avanje membranske strukture bila membrana crvenih krvnih stanica (eritrocita) sisavaca. Crvene krvne stanice sisavaca nemaju jezgre ni bilo koju drugu unutarstani~nu membranu pa su zato izvrsne za izolaciju ~istih stani~nih membrana za biokemijske analize. Upravo se studijom stani~nih membrana crvenih krvnih stanica do{lo do prvih dokaza da biolo{ke membrane tvori dvosloj fosfolipida. Dva su nizozemska znanstvenika (E. Gorter i R. Grendel) 1925. godine ekstrahirali lipide membrane iz poznatoga broja crvenih krvnih stanica s namjerom da broj stanica usporede s poznatom povr{inom stani~ne membrane. Potom su odredili povr{inu koju zauzima jednostruki sloj ekstrahiranih lipida raspore|en na povr{ini vode. Ispostavilo se da je povr{ina jednostrukoga sloja lipida dvostruko ve}a od povr{ine stani~ne membrane eritrocita, {to je dovelo do zaklju~ka da se membrane sastoje od dvosloja, a ne jednostrukih slojeva lipida. Dvoslojna struktura membrane eritrocita jasno je vidljiva na elektronskomikroskopskim snimkama s velikim pove}anjem (slika 12-1). Stani~na membrana ocrtava se kao dvije guste crte odvojene me|uprostorom izgled koji se ~esto opisuje kao èljezni~ke tra~nice. Ova slika nastaje zbog vezanja elektronski gustih te{kih metala, koji se koriste kao boja u transmisijskoj elektronskoj mikroskopiji (vidi 1. poglavlje), za skupine polarnih glava fosfolipida, {to kona~no izgleda kao tamna crta. Dvije guste crte razdvaja slabo obojeni unutra{nji dio membrane, koji se sastoji od hidrofobnih lanaca masnih kiselina. Kako je obja{njeno u 2. poglavlju, stani~ne membrane animalnih stanica gra|ene su iz ~etiriju osnovnih fosfolipida (fosfatidilkolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina i sfingomijelina) koji zajedno ~ine vi{e od polovine svih lipida ve}ine membrana. Ti su fosfolipidi nesimetri~no raspodijeljeni izme|u dviju polovina membranskoga dvosloja (slika 12-2). Vanjski se sloj stani~ne membrane sastoji uglavnom od fosfatidilkolina i sfingomijelina, dok su fosfatidiletanolamin i fosfatidilserin prete`ni fosfolipidi unutarnjega sloja. Peti fosfolipid, fosfatidilinozitol, tako|er je smje{ten u unutarnjoj polovini stani~ne membrane. Mada je fosfatidilinozitol kvantitativno minorna komponenta membrane, on igra va`nu ulogu u stani~noj signalizaciji, kako }e biti obja{njeno u sljede}em poglavlju. Polarne su glave fosfatidilserina i fosfatidilinozitola negativno nabijene pa je rezultat njihove prevlasti u unutarnjemu sloju ukupni negativni naboj citoplazmatskoge strane stani~ne membrane.
Stani~na povr{ina
485
izvanstani~ni prostor sfingomijelin glikolipid fosfatidilkolin kolesterol
Slika 12-2. Lipidne komponente stani~ne membrane.

Vanjski sloj sastoji se prete`no od fosfatidilkolina, sfingomijelina i glikolipida, dok unutarnji ~ine uglavnom fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin i fosfatidilinozitol. Kolesterol je raspore|en u oba sloja. Negativni naboj polarnih skupina fosfatidilserina i fosfatidilinozitola posebno je nazna~en. Strukture fosfolipida, glikolipida i kolesterola prikazane su slikama 2-7, 2-8 i 2-9.
fosfatidilserin citosol fosfatidilinozitol fosfatidiletanolamin
Uz fosfolipide, membrana animalnih stanica sadràva glikolipide i kolesterol. Glikolipidi se nalaze isklju~ivo u vanjskome sloju membrane, ugljikohidratnim dijelom okrenuti prema stani~noj povr{ini. îne}i svega 2% lipida ve}ine stani~nih membrana, oni su njezina relativno mala komponenta. Kolesterol je, naprotiv, glavna komponenta ìvotinjskih stanica, zauzimaju}i molarnim udjelom gotovo isto koliko i fosfolipidi. Za funkciju membrane kriti~ne su dvije op}e osobine fosfolipidnog dvosloja. Prva je da su strukture fosfolipida odgovorne za osnovnu funkciju membrana kao barijere izme|u vodenih odjeljaka. Kako je unutra{njost fosfolipidnog dvosloja zauzeta hidrofobnim lancima masnih kiselina tako su membrane nepropusne za molekule topljive u vodi, uklju~uju}i ione i ve}inu drugih biolo{kih molekula. Drugo je da su dvosloji fosfolipida koji se pojavljuju u prirodi viskozne teku}ine, a ne krutine. Ve}ina masnih kiselina fosfolipida u prirodi ima jednu ili dvije dvostruke veze koje unose pregibe u lanac ugljikovodika i oteàvaju im gusto pakiranje. Zato se ugljikovodi~ni lanci masnih kiselina slobodno kre}u unutar membrane pa je i sama membrana mekana i savitljiva. Uz to se i fosfolipidi i proteini mogu kretati unutar membrane lateralnom difuzijom, {to je kriti~no svojstvo za mnoge membranske funkcije. Zahvaljuju}i svojoj krutoj prstenastoj strukturi, kolesterol igra posebnu ulogu u strukturi membrane. Kolesterol sam od sebe ne tvori membrane, ali se ugra|uje u dvosloj fosfolipida tako da mu se polarna hidroksilna skupina na|e u blizini polarnih skupina glava fosfolipida (slika 12-2). Kolesterol ima razli~ite efekte na membransku fluidnost pri razli~itim temperaturama. Na visokim temperaturama ograni~ava pokretanje lanaca masnih kiselina fosfolipida, ~ine}i vanjski dio membrane manje fluidnim i smanjuju}i propusnost za male molekule. Na niskim temperaturama, naprotiv, ima obrnuti efekt: onemogu}uju}i me|udjelovanje lanaca masnih kiselina, kolesterol sprje~ava smrzavanje membrana i odràva njihovu fluidnost. Mada bakterije nemaju kolesterol, on je esencijalna komponenta ìvotinjskih stani~nih membrana. Biljnim stanicama tako|er nedostaje kolesterol, ali one sadràvaju srodne spojeve (sterole) koji izvr{avaju sli~nu funkciju. Nedavne studije pokazuju da svi lipidi ne difundiraju slobodno u stani~noj membrani. Naprotiv, odre|ene membranske domene oboga}ene su ko-
486
Poglavlje 12
lesterolom i sfingolipidima (sfingomijelinom i glikolipidima). Misli se da ove nakupine sfingolipida i kolesterola formiraju splavi (engl. rafts) koje se lateralno pomi~u unutar stani~ne membrane i mogu se udruìvati sa specifi~nim membranskim proteinima. Mada nam jo{ preostaje da shvatimo funkciju lipidnih splavi, one bi mogle igrati va`nu ulogu u procesima kao {to su stani~na signalizacija i uzimanje molekula izvanstani~noga prostora endocitozom, o ~emu }emo raspravljati dalje u ovome poglavlju.
Membranski proteini
Dok su lipidi temeljni strukturni element membrane, proteini su odgovorni za izvr{avanje specifi~nih membranskih funkcija. Ve}ina se stani~nih membrana sastoji od 50% lipida i 50% proteina u teìnskim udjelima, dok ugljikohidratni dijelovi glikolipida i glikoproteina ~ine 5 do 10% ukupne mase membrane. Budu}i da su proteini mnogo ve}i od lipida, ovaj omjer odgovara otprilike jednoj molekuli proteina na svakih 50 do 100 molekula lipida. Jonathan Singer i Garth Nicolson 1972. godine predloìli su model teku}ega mozaika koji je danas {iroko prihva}en kao osnovni obrazac organizacije svih biolo{kih membrana. U ovom modelu, membrane su prikazane kao dvodimenzionalne teku}ine u kojima su proteini uronjeni u dvosloje lipida (slika 12-3). Singer i Nicolson razlikuju dvije klase membranama pridruènih proteina koje su oni nazvali periferni i integralni membranski proteini. Periferne membranske proteine definirali su na osnovi njihova svojstva da se disociraju od membrana pod djelovanjem polarnih reagencija, kao {to su otopine s visokim pH ili visokom koncentracijom soli koje ne remete dvosloj fosfolipida. Jednom disocirani od membrane, periferni su membranski proteini topljivi u vodenim puferima. Ovi proteini nisu uronjeni u hidrofobnu unutra{njost lipidnoga dvosloja. Naprotiv, indirektno su pridruèni membranama putem me|udjelovanja protein-protein. Ta se me|udjelovanja
ugljikohidrat
Slika 12-3. Model teku}ega mozaika stani~ne membrane.

Integralni membranski proteini uronjeni su u lipidni dvosloj, dok su periferni proteini vezani za membranu indirektnim protein-protein interakcijama. Ve}ina je integralnih membranskih proteina transmembranska, s dijelovima koji izviruju s obje strane lipidnog dvosloja. Izvanstani~ni dijelovi tih proteina obi~no su glikozilirani, ba{ kao i kod perifer nih membranskih proteina vezanih na vanjskoj strani membrane.
integralni membranski protein
Stani~na povr{ina
487
detergent
hidrofilna skupina hidrofobni rep oktilglukozid CH2OH O OH H OH hidrofobni rep
+
CH2 (CH2)6 CH3
HO
hidrofilna skupina
~esto ostvaruju ionskim vezama koje se kidaju ekstremnim pH ili koncentracijom soli. Suprotno perifernim membranskim proteinima, integralni membranski proteini osloba|aju se samo nakon djelovanja koja razbijaju fosfolipidni dvosloj. Kako su integralni membranski proteini jednim svojim dijelom uronjeni u lipidni dvosloj, tako se oni mogu disocirati samo uz pomo} takvih reagencija koje remete hidrofobna me|udjelovanja. Naj~e{}e se za otapanje integralnih membranskih proteina koriste detergenti, male amfipati~ne molekule koje imaju i hidrofobne i hidrofilne skupine (slika 12-4). Svojim hidrofobnim krajem molekule detergenta istiskuju membranske lipide i same se veù na hidrofobne dijelove integralnih membranskih proteina. Kako je drugi kraj molekule detergenta hidrofilan, tako je kompleks detergent-protein topljiv u vodenim otapalima. Mnogi su integralni membranski proteini ujedno i transmembranski, {to zna~i da jednim dijelom prolaze lipidni dvosloj, dok su im drugi dijelovi izloèni na objema stranama membrane. Ovi se proteini mogu prikazati na elektronskomikroskopskim snimkama stani~ne membrane pripremljenim tehnikom smrzavanja i lomljenja (vidi sliku 1-36). Kod tih se pripravaka membrana lomi i dijeli u dva lista. Nakon toga se transmembranski proteini prikazuju kao ~estice na unutra{njim stranama membrane (slika 12-5). Transmembranski proteini obi~no prolaze kroz membranu dijelom koji se oblikuje u obliku a-uzvojnice koju ~ini 20 do 25 hidrofobnih aminokiselina, a koje se ume}u u membranu endoplazmatskoga retikula tijekom sinteze polipeptidnoga lanca (vidi slike 9-11, 9-12 i 9-13). Ti se proteini zatim transportiraju membranskim vezikulama od endoplazmatskoga retikula do Golgijeva aparata, a od tamo do stani~ne membrane. Ugljikohidratne skupine dodaju se na polipeptidni lanac u endoplazmatskom retikulu i u Golgijevom aparatu, pa su ve}ina transmembranskih proteina stani~ne membrane glikoproteini ~iji su oligosaharidi okrenuti prema povr{ini stanice. Istraìvanja crvenih krvnih stanica pruìla su dobre primjere kako perifernih tako i integralnih proteina pridruènih membrani. Membrane humanih eritrocita sadr-
Slika 12-4. Otapanje integralnih membranskih proteina detergentima.

Detergenti (npr. oktilglukozid) amfipati~ke su molekule koje se sastoje od hidrofilnih skupina glave i hidrofobnog repa. Hidrofobni rep veè se u blizini hidrofobne regije integralnih membranskih proteina, oblikuju}i kompleks detergentprotein koji je topljiv u vodenim otopinama.
Slika 12-5. Elektronskomikroskopska slika stani~ne membrane ljudskih crvenih krvnih stanica na~injena tehnikom smrzavanja i lomljenja.
êstice u membrani transmembranski su proteini. (Harold H. Edwards/Visuals Unlimited.)
0,2 mm
488
Poglavlje 12
Slika 12-6. Integralni membranski proteini crvenih krvnih stanica.

Glikoforin (131 aminokiselina) ima jednu transmembransku a-uzvojnicu. Jako je glikoziliran, s oligosaharidnim lancima koji su vezani na 16 mjesta izvanstani~noga dijela polipeptidnoga lanca. Protein vrpca 3 (929 aminokiselina) sastoji se od vi{estrukih transmembrankih a-uzvojnica i misli se da membranu prolazi ukupno 14 puta.
ugljikohidrati
vanjska strana stanice
C glikoforin N vrpca 3
C citosol
àvaju oko desetak glavnih proteina, koji su izvorno utvr|eni gel-elektroforezom preparacije membrana. Ve}ina njih su periferni membranski proteini koji su identificirani kao komponente kortikalnog citoskeleta koji je postavljen ispod stani~ne membrane i odre|uje oblik stanice (vidi 11. poglavlje 11). Primjerice, najzastupljeniji periferni membranski protein crvenih krvnih stanica je spektrin, koji je glavni protein citoskeleta eritrocita. Me|u ostalim su perifernim proteinima crvenih krvnih stanica aktin, ankirin i vrpca 4.1 (engl. band 4.1). Ankirin je glavna poveznica stani~ne membrane i citoskeleta jer se jednom stranom veè na spektrin, a drugom na integralni membranski protein vrpca 3 (vidi sliku 11-12). Dodatnu vezu izme|u membrane i citoskeleta osigurava protein vrpca 4.1 koja se veè na spoj izme|u spektrina i aktina, kao i na glikoforin (sljede}i od glavnih integralnih membranskih proteina eritrocita). Dva glavna integralna proteina crvenih krvnih stanica, glikoforin i protein vrpca 3, dobro su izu~en primjer transmembranskih proteinskih struktura (slika 12-6). Glikoforin je mali glikoprotein od 131 aminokiseline s molekularnom teìnom od oko 30.000, od ~ega je jedna polovina proteinski, a druga ugljikohidratni dio. On prolazi kroz membranu jednom a-uzvojnicom od 23 aminokiseline, a glikozilirani amino-kraj izloèn je na povr{ini stanice. Mada je glikoforin bio jedan od prvih opisanih transmembranskih proteina, njegova je to~na funkcija nepoznata. No, funkcija drugoga glavnog transmembranskog proteina crvenih krvnih stanica dobro je poznata. Taj protein, izvorno poznat kao vrpca 3, anionski je izmjenjiva~ odgovoran za prolazak bikarbonatnih (HCO3) i kloridnih (Cl) iona kroz membranu crvenih krvnih stanica. Polipeptidni lanac vrpca 3 proteina sastoji se od 929 aminokiselina i misli se da ima 14 transmembranskih regija sa strukturom a-uzvojnice. Unutar membrane, dimeri vrpca 3 proteina oblikuju globularne strukture sa zajedni~kim kanalom kojim ioni putuju kroz lipidni dvosloj. Zbog svog amfipati~nog karaktera, transmembranski proteini pokazali su se te{kima za kristalizaciju, tehniku nu`nu pri analizi trodimenzionalne strukture difrakcijom X-zraka. Prvi transmembranski protein analiziran metodom kristalografije difrakcijom X-zraka bio je fotosinteti~ki reakcijski centar bakterije Rhodopseudomonas viridis, ~ija je struktura objavljena 1985. godine (slika 12-7). Reakcijski centar sadràva tri transmembranska proteina, ozna~ena kao L, M i H (od engl.: light, medium i heavy) prema njihovim veli~inama dobivenim gel-elektroforezom. Svaka od podjedinica L i M ima po pet transmembranskih a-uzvojnica. H podjedinica ima samo jednu trans-
Stani~na povr{ina
489
membransku domenu, a najve}i je dio polipeptidnoga lanca na citosolnoj strani membrane. êtvrta podjedinica reakcijskoga centra je citokrom, koji je periferni membranski protein vezan na kompleks interakcijama protein-protein. Mada ve}ina transmembranskih proteina prolazi kroz membranu a-uzvojnicom, to ipak nije uvijek slu~aj. Jedna dobro opisana iznimka su porini proteini koji oblikuju kanale u vanjskoj membrani bakterija. Mnoge bakterije, uklju~uju}i i E. coli, imaju dvostruki membranski sustav u kojemu je unutarnja membrana okruèna stani~nom stijenkom i jo{ jednom vanjskom membranom (slika 12-8). Za razliku od unutra{nje membrane, vanjska je membrana visoko propusna za ione i male polarne molekule (u slu~aju E. coli za molekule molekularne mase do 600). Tu propusnost omogu}uju porini, koji oblikuju vodene kanale kroz lipidni dvosloj. Kao {to je razja{njeno u 10. poglavlju, proteini srodni bakterijskim porinima mogu se na}i i u vanjskoj membrani mitohondrija i kloroplasta. Strukturna analiza potvr|uje da porini nemaju regiju s hidrofobnim auzvojnicama. Umjesto toga, membranu prolaze kao b-nabrane plo~e, gdje 8 22 b-nabrane poo~e oblikuju ba~vastu strukturu koja se zatvara oko vodenog kanala. Polarni bo~ni lanci aminokiselina obrubljuju poru, dok se bo~ni lanci hidrofobnih skupina okre}u prema unutra{njosti membrane. Neki porini postoje u membrani u monomernom obliku, dok se drugi udruùju u stabilne polimere koji imaju vi{estruke kanale kroz koje mogu difundirati polarne molekule. Suprotno transmembranskim proteinima, razli~iti su proteini (od kojih se mnogi pona{aju kao integralni) usidreni u stani~noj membrani zahvaljuju}i kovalentnim vezama s lipidima ili glikolipidima (slika 12-9). ^lanovi jedne od obitelji tih proteina drè se za vanjsku stranu membrane s pomo}u glikozilfosfatidilinozitolnog (GPI) sidra. GPI sidro dodaje se nekim proteinima ~iji je aminokraj tijekom sinteze unesen u endoplazmatski retikul,
citosol
Slika 12-7. Bakterijski fotosinteti~ki reakcijski centar.

Reakcijski centar sastoji se od triju transmembranskih proteina, ozna~enih kao L (cr veno), M (ùto) i H (zeleno). Podjedinice L i M imaju pet transmembranskih a-uzvojnica, dok H ima samo jednu. êtvrta podjedinica reakcijskog centra je citokrom (bijelo) koji je periferni membranski protein.
porin
vanjska membrana
stani~na stijenka periplazmatski prostor
Slika 12-8. Vanjska membrana bakterija.

membrana
citosol
Membrana nekih bakterija okruèna je stani~nom stijenkom i dodatnom vanjskom membranom. Vanjska membrana sadràva porine, koji oblikuju vodene kanale za prolazak iona i malih molekula. Porini prolaze kroz membranu kao b-nabrane plo~e.
490
Poglavlje 12
Thy-1 C P
Src C
Slika 12-9. Primjeri proteina usidrenih na stani~noj membrani s pomo}u lipida i glikolipida.
Neki proteini (npr. protein limfocita Thy-1) usidreni su na vanjskoj strani membrane s pomo}u GPI-sidra dodanoga na njihov C-terminalni kraj u endoplazmatskom retikulu. Ti su proteini glikozilirani i izloèni na stani~noj povr{ini. Drugi se proteini usidre na unutarnjoj strani stani~ne membrane nakon translacije na slobodnim ribosomima citosola. Prikazani Ras protein usidren je prenilnom skupinom dodanom na bo~ni lanac C-ter minalnog cisteina i palmitilnom skupinom dodanom na cistein koji je 5 aminokiselina uzvodno. Src protein usidren je miristilnom skupinom dodanom na amino-kraj. Dodatnu ulogu u pri~vr{}ivanju igra pozitivno nabijena regija Src, veù}i se na negativno nabijene polarne glave fosfatidilserina. Struktura tih lipida i glikolipida prikazana je na slikama od 7-31 do 7-34.
dok su transmembranskom domenom na C-terminalnom kraju usidreni u membrani (vidi sliku 9-16). Transmembranska domena kida se i dodaje se GPI-sidro pa ti proteini ostaju usidreni na membrani samo preko glikolipida. Kako je polipeptidni dio GPI-usidrenih proteina u lumenu endoplazmatskog retikula, tako se oni glikoziliraju i kona~no okre}u prema vanjskomu licu stanice kad jednom budu preneseni do stani~ne membrane. Neki su proteini usidreni na unutarnjoj strani stani~ne membrane preko kovalentnih veza s lipidima. Oni se, umjesto prolaska sekretornim putem, sintetiziraju na slobodnim ribosomima u citosolu i modificiraju dodavanjem lipida. U te modifikacije pripada dodavanje miristilne kiseline (masna kiseS S lina s 14 C atoma) na amino-kraj C polipeptidnoga lanca, dodavanje Cys Cys palmitinske kiseline (16 ugljikovih atoma) na bo~ne ostatke cisteina i dodavanje prenilne skupine (15 do 20 ugljika) na bo~ni lanac cisteina na karboksilnom kraju peptida Ras (vidi slike 7-13, 7-32 i 7-33). U neN kim slu~ajevima, ti se proteini (mnogi od njih pona{aju se poput citosol perifernih proteina) dodatno usmjeruju prema stani~noj membrani zahvaljuju}i jednoj pozitivno nabijenoj domeni polipeptidnoga lanca, kao i pridruènim lipidima. Ta pozitivno nabijena domena proteina moè ostvariti dodatne polarne veze s negativno nabijenim polarnim glavama fosfatidilserina na citosolnoj strani stani~ne membrane. Va`no je napomenuti da mnogi proteini usidreni na unutarnjoj strani membrane (uklju~uju}i Src i Ras proteine prikazane na slici 12-9) igraju va`nu ulogu u prijenosu signala od receptora na stani~noj povr{ini do unutarstani~nih ciljnih molekula, o ~emu }emo raspravljati u sljede}em poglavlju.
izvanstani~ni prostor
Pokretljivost membranskih proteina

Membranski proteini i fosfolipidi ne mogu se zamjetnom brzinom prebacivati izme|u unutarnje i vanjske strane membrane. No, kako su umetnuti u teku}i lipidni dvosloj i proteini i lipidi mogu lateralno difundirati u membrani. To je lateralno pomicanje prvi put direktno prikazano eksperimentom koji su proveli Larry Frye i Michael Edidin 1970. godine, a koji je pruìo dodatne dokaze modelu teku}ega mozaika. Frye i Edidin u kulturi su fuzionirali ljudske i mi{je stanice kako bi proizveli hibridoma-stanice ~ovjek-mi{ (slika 12-10). Potom su analizirali raspodjelu proteina u membrani hibridnih stanica koriste}i protutijela koja specifi~no prepoznaju proteine
Stani~na povr{ina
491
mi{jega, odnosno humanoga podrijetla. Ta su protutijela bila ozna~ena razli~itim fluorescentnim bojama pa su se ljudski i mi{ji proteini mogli razlikovati pod fluorescentnim mikroskopom. Odmah nakon fuzije, mi{ji i ljudski proteini bili su lokalizirani na razli~itim polovinama hibridoma stanice. No, nakon kratkoga perioda inkubacije na 37 C, ljudski i mi{ji proteini posve su se izmije{ali na povr{ini stanice, upu}uju}i na to kako se mogu slobodno kretati unutar stani~ne membrane. Unato~ tomu, svi se proteini nisu u stanju slobodno kretati u membrani. U nekim je slu~ajevima pokretljivost proteina smanjena njihovim vezama s citoskeletom. Na primjer, jedan je udio proteina vrpca 3 membrane crvenih krvnih stanica imobiliziran zahvaljuju}i svojim vezama s ankirinom i spektrinom. U drugom je slu~aju mobilnost membranskih proteina ograni~ena vezama s drugim membranskim proteinima na povr{ini susjedne stanice ili vezama s proteinima me|ustani~noga matriksa. Suprotno stanicama krvi, epitelne se stanice polariziraju prilikom organizacije u tkivo, kada razli~iti dijelovi postaju odgovorni za izvr{avanje razli~itih zada}a. Kao posljedica toga, stani~na membrana mnogih epitelnih stanica podijeljena je u to~no ograni~ene apikalne i bazolateralne domene koje se razlikuju funkcijom i sastavom proteina (slika 12-11). Primjerice, funkcija je epitelnih stanica tankoga crijeva apsorpcija hranjivih tvari iz probavnoga trakta. Apikalna povr{ina tih stanica (ona koja gleda prema lumenu crijeva) pokrivena je mikrovilima i specijalizirana za apsorpciju hranjiva. Bazolateralna povr{ina (ona koja prilijeè na vezivno tkivo i krvne ìle) specijalizirana je za posredovanje u transportu apsorbiranih hranjivih tvari u cirkulaciju. Kako bi se odràla raspodjela ovih funkcija, pokretljivost proteina membrane ograni~ena je na odre|ene domene stani~ne povr{ine. Jednim dijelom mehanizam toga ograni~avanja obuhva}a oblikovanje ~vrstih spojeva (o kojima se raspravlja dalje u ovome poglavlju) koji nastaju izme-
ljudska stanica
mi{ja stanica
fuzija hibridoma-stanica
humani protein 40 minuta inkubacije
mi{ji protein
Slika 12-10. Mobilnost membranskih proteina.

Fuzionirane su ljudske i mi{je stanice u hibridoma stanice. Zatim je analizirana raspodjela proteina stani~ne povr{ine uporabom protutijela na ljudske i mi{je proteine obiljeènih razli~itim fluorescentnim bojama (crvena i zelena, kako slijedi). Neposredno nakon fuzije ljudski i mi{ji proteini detektirani su na razli~itim polovicama hibridoma stanica, no nakon 40 minuta inkubacije me|usobno su se izmije{ali.
mikrovili lumen crijeva apikalna membrana apikalni protein
~vrsti spoj
bazolateralna membrana lumen crijeva
bazolateralni protein
Slika 12-11. Polarizirana epitelna stanica crijeva.

Apikalna povr{ina stanice pokrivena je mikrovilima i specijalizirana za apsorpciju hranjivih tvari iz lumena crijeva. Bazolateralna povr{ina specijalizirana je za prijenos apsorbiranih tvari do vezivnog tkiva opskrbljenoga kapilarama ispod epitela. Apikalna domena odvojena je od bazolateralne ~vrstim spojem. Membranski proteini slobodno difundiraju unutar svake domene, ali ne mogu prelaziti iz jedne domene u drugu.
vezivno tkivo
krvna kapilara
492
Poglavlje 12
sfingomijelin
glikolipidi
kolesterol
lipidne splavi
citosol
Slika 12-12. Struktura lipidnih splavi.

Lipidne splavi organiziraju se me|udjelovanjem sfingomijelina, glikolipida i kolesterola. Proteini s GPI-sidrom uglavnom se nalaze u tim domenama, ali i niz drugih membranskih proteina povremeno obitava na splavima posreduju}i u stani~noj signalizaciji i endocitozi.
|u susjednih epitelnih stanica. Te veze ne samo da potpuno zatvaraju prostor izme|u stanica ve} sluè i kao prepreka kretanju membranskih lipida i proteina. Kao rezultat toga, proteini se mogu kretati unutar apikalne ili bazolateralne domene membrane, ali se ne mogu prebacivati iz jedne domene u drugu. Slobodna difuzija membranskih proteina moè tako|er biti naru{ena sastavom lipida. Temperatura taljenja sfingolipida (sfingomijelina i glikolipida) razli~ita je od one fosfolipida koji su derivati glicerola. Sfingomijelin i glikolipidi prete`no se nalaze u malim polukrutim otocima ozna~enim kao lipidne splavi, koje su tako|er bogate i kolesterolom zbog afiniteta kolesterola za sfingolipide (slika 12-12). Na splavima su ~esto GPI-usidreni proteini, kao i neki proteini koji se uglavnom nalaze u fosfolipidnom dvosloju, primjerice proteini koji veù GTP i neke protein-kinaze, ali imaju sposobnost ulaènja i izlaènja sa splavi. Prolazna prisutnost ovih proteina na splavima omogu}uje okupljanje nu`no za procese kao {to su endocitoza i signalizacija posredovana receptorima. Neke se splavi stabiliziraju vezama s citoskeletom koje se ostvaruju putem perifernih membranskih proteina. Jedan od takvih proteina je kaveolin, koji se udruùje s podvrstom splavi, poznatom kao kaveole. Kako se raspravlja dalje u ovome poglavlju, kaveole su posebno vezane za endocitozu.
Glikokaliks
Kao {to smo ve} prikazali, izvanstani~ni kraj proteina stani~ne membrane obi~no je glikoziliran. Isto tako je ugljikohidratni dio glikolipida izloèn na vanjskoj strani stani~ne membrane. Kao posljedica toga, povr{ina je stanice
Stani~na povr{ina
493
Slika 12-13. Glikokaliks.

Elektronskomikroskopska snimka epitela crijeva koja prikazuje glikokaliks (strjelice). (Don Fawcett/Visuals Unlimited.)
1 mm
pokrivena ugljikohidratnim pokrovom, poznatim kao glikokaliks, kojega oblikuju oligosaharidi glikolipida i glikoproteina (slika 12-13). Dio je zada}e glikokaliksa za{tita stani~ne povr{ine. Osim toga, oligosaharidi glikokaliksa sluè kao biljezi kod niza me|ustani~nih interakcija. Dobro prou~eni primjer takvoga uzajamnog djelovanja je adhezija bijelih krvnih stanica (leukocita) na endotelne stanice koje oblaù stijenke krvnih ìla proces koji leukocitima omogu}uje da napuste cirkulaciju i posreduju tijekom upalnoga odgovora u o{te}enome tkivu. U po~etnome koraku u adheziji leukocita i endotelnih stanica posreduju transmembranski proteini iz obitelji selektina, koji prepoznaju to~no odre|ene ugljikohidrate na stani~noj povr{ini (slika 12-14). Dva ~lana selektinske obitelji (E-selektin i P-selektin) koje eksprimiraju endotelne stanice i krvne plo~ice, veù specifi~ne oligosaharide eksprimirane na povr{iendotelna ni leukocita. Sasvim razli~iti selektin (L-selektin) eksprimiraju leustanica kociti, a on prepoznaje oligosaharide na povr{ini endotelnih stanica. Tako oligosaharidi izloèni na povr{ini stanice oblikuju niz biljega koji pomaè u identifikaciji odre|enih tipova stanica u vi{estani~nome organizmu.
Transport malih molekula

Unutarnji sastav stanice odràva se zahvaljuju}i selektivnoj permeabilnosti stani~ne membrane za male molekule. Ve}ina biolo{kih molekula ne moè difundirati kroz fosfolipidni dvosloj, pa tako
oligosaharid E-selektin NANA
Fuc GlcNAc
Gal
Slika 12-14. Vezanje selektina na oligosaharide.

E-selektin je transmembranski protein koji eksprimiraju stanice endotela, a koji veè oligosaharide eksprimirane na povr{ini leukocita. Oligosaharidi koje prepoznaje E-selektin sastoje se od N-acetilglukozamina (GlcNAc), fukoze (Fuc), galaktoze (Gal) i sijalinske kiseline (N-acetilneuraminske kiseline, NANA).
leukocit
494
Poglavlje 12
Slika 12-15. Propusnost fosfolipidnoga dvosloja.

Plinovi, hidrofobne molekule i male polarne nenabijene molekule mogu difundirati kroz fosfolipidni dvosloj. Ve}e polar ne molekule i nabijene molekule ne mogu.
plinovi
hidrofobne molekule
male polarne molekule
velike polarne molekule
nabijene molekule Cl H+ Ca2+ Na+ ioni
CO2 O2 benzen
H2O
etanol
glukoza
aminokiseline
membrana stvara prepreku koja blokira slobodnu razmjenu molekula izme|u citoplazme i izvanstani~noga prostora stanice. Posebni transportni proteini (proteini nosa~i i kanalni proteini) posreduju pri selektivnom prolasku malih molekula preko membrane, omogu}uju}i tako stanici da nadzire sastav svoje citoplazme.
Pasivna difuzija
Pasivna difuzija je najjednostavniji mehanizam kojim molekule mogu prije}i membranu. Za vrijeme pasivne difuzije, molekula se naprosto otopi u fosfolipidnom dvosloju, difundira kroz njega, a zatim se otopi u vodenom mediju na drugoj strani membrane. U tome ne sudjeluju membranski proteini, a smjer transporta odre|en je samo relativnim koncentracijama molekule unutar i izvan stanice. Neto tijek molekula uvijek je niz koncentracijski gradijent od odjeljka s visokom koncentracijom molekula prema onome s niskom koncentracijom. Stoga je pasivna difuzija neselektivan proces u kojemu svaka molekula, koja se moè otopiti u fosfolipidnom dvosloju, moè prije}i stani~nu membranu i posti}i ravnoteù izme|u unutarnjega i vanjskoga prostora stanice. Jako je va`no da samo male, relativno hidrofobne molekule mogu difundirati kroz fosfolipidni dvosloj zna~ajnijom brzinom (slika 12-15). Stoga su plinovi (poput O2 i CO2), hidrofobne molekule (poput benzena) i male polarne, ali nenabijene molekule (poput H2O i etanola), u stanju difundirati kroz membranu. Druge biolo{ke molekule, naprotiv, nisu u stanju otopiti se u hidrofobnoj unutra{njosti fosfolipidnog dvosloja. Kao posljedica toga, velike nenabijene polarne molekule poput glukoze, ne mogu prije}i membranu pasivnom difuzijom, kao ni nabijene molekule bilo koje veli~ine (uklju~uju}i male ione poput H+, Na+, K+ i Cl). Za prjelazak preko membrane te molekule trebaju specifi~ne nosa~e ili kanalne proteine, koji tako nadziru promet ve}ine biolo{kih molekula u stanice i iz stanice.
Olak{ana difuzija i proteini nosa~i

Olak{ana difuzija, kao i pasivna difuzija, podrazumijeva gibanje molekula u smjeru odre|enom njihovom relativnom koncentracijom unutar i
Stani~na povr{ina
495
izvan stanice. Kako za ovaj tip gibanja nije osiguran vanjski izvor energije tako molekule putuju kroz membranu u smjeru odre|enom svojim koncentracijskim gradijentom, a u slu~aju nabijenih molekula i elektri~nim potencijalom membrane. Pa ipak, olak{ana se difuzija razlikuje od pasivne difuzije po tomu {to se molekule koje se transportiraju ne otapaju u fosfolipidnom dvosloju. Umjesto toga, u njihovome prjelasku posreduju transportne molekule koje omogu}uju prijenos bez izravne interakcije s hidrofobnom unutra{njo{}u. Tako olak{ana difuzija omogu}uje polarnim i nabijenim molekulama, poput ugljikohidrata, aminokiselina, nukleotida i iona, prijenos preko stani~ne membrane. Op}enito razlikujemo dvije skupine proteina koji posreduju tijekom olak{ane difuzije: proteini nosa~i i kanalni proteini. Proteini nosa~i na jednoj strani membrane veù specifi~nu molekulu koju treba transportirati. Zatim doìvljavaju konformacijsku promjenu koja molekuli omogu}uje prjelazak preko membrane i otpu{tanje na drugoj strani. Kanalni proteini (vidi sljede}i odlomak) oblikuju otvorene pore kroz membranu, dopu{taju}i prolazak svim molekulama odgovaraju}e veli~ine i naboja. Proteini nosa~i odgovorni su za olak{anu difuziju {e}era, aminokiselina i nukleozida preko stani~ne membrane ve}ine stanica. Jedna od najva`nijih transportnih funkcija membrane je transport glukoze koja sluì kao primarni izvor metaboli~ke energije, a transporteri glukoze jedan su od najbolje prou~enih primjera proteina nosa~a. U po~etku su identificirani kao 55-kd proteini ljudskih crvenih krvnih stanica, u kojima ~ine oko 5% ukupnih membranskih proteina. Nakon izolacije i sekvenciranja cDNA klona jasno je da transporter glukoze ima 12 transmembranskih a-uzvojnica {to je tipi~na struktura za mnoge proteine nosa~e (slika 12-16). Te transmembranske domene uglavnom se sastoje od hidrofobnih aminokiselina, ali u nekima su i polarni aminokiselinski ostatci za koje se misli da oblikuju vezno mjesto za glukozu u unutra{njosti proteina. Kao kod ve}ine transmembranskih proteina, trodimenzionalna struktura transportera glukoze nije poznata, pa je i molekularni mehanizam transporta glukoze jo{ uvijek otvoreno pitanje. Pa ipak, kineti~ke studije kaù da transporter glukoze funkcionira tako da se izmjenjuju dva konformacij-
10
11
12
Slika 12-16. Struktura transportera glukoze.

Transporter glukoze ima 12 transmembranskih a-uzvojnica. Polar ni ostatci aminokiselina smje{tenih unutar fosfolipidnoga dvosloja ozna~eni su kao tamnoljubi~asti kruì}i. (Prilago|eno iz G.I. Bell, C.F. Burant, J. Takeda i G.W. Gould, 1993. J. Biol. Chem. 268: 19161.).
N C citosol
496
Poglavlje 12
Slika 12-17. Model olak{ane difuzije glukoze.

Transporter glukoze izmjenjuje dva konformacijska stanja u kojima se vezno mjesto za glukozu naizmjence izlaè prema van ili unutar stanice. U prvome prikazanom konfor macijskome stanju (A), glukoza se vezuje na mjesto izloèno na vanjskoj strani stani~ne membrane. Potom transporter prolazi kroz konfor macijsku promjenu tako da je vezno mjesto za glukozu okrenuto prema unutra{njosti stanice i glukoza se otpu{ta u citosol (B). Transporter se zatim vra}a u prethodno stanje (C).
(A)
(B) vanjska strana stanice glukoza
(C)
unutra{njost stanice
ska stanja (slika 12-17). U prvome konformacijskom stanju, vezno mjesto za glukozu gleda izvan stanice. Vezanje glukoze na ovako izloèno mjesto uzrokuje konformacijsku promjenu transportera tako da vezno mjesto za glukozu potom gleda prema unutra{njosti stanice. Glukoza se sada moè otpustiti u citosol, nakon ~ega slijedi konformacijska promjena transportera i povratak u prija{nje stanje. Ve}ina stanica, uklju~uju}i eritrocite, izloèna je koncentracijama glukoze koje su ve}e od onih unutar stanice pa olak{ana difuzija ide u smjeru transporta glukoze u stanicu. Jednom kad stanice uzmu glukozu ona se brzo metabolizira pa unutarstani~na koncentracija glukoze ostaje niska i nastavlja se transportirati u stanicu iz izvanstani~nih teku}ina. Kako su konformacijska stanja transportera glukoze reverzibilna tako se glukoza moè prenositi i u obrnutome smjeru ako samo okrenemo slijed koraka prikazanih na slici 12-17. Takav obrnuti tijek doga|a se, primjerice, u stanicama jetre gdje se glukoza sintetizira i otpu{ta u cirkulaciju.
Ionski kanali
Za razliku od proteina nosa~a, kanalni proteini naprosto oblikuju otvorene pore u membrani omogu}uju}i tako malim molekulama odgovaraju}e veli~ine i naboja slobodan prolazak kroz lipidni dvosloj. Jedna su skupina kanalnih proteina, o kojima se ranije raspravljalo, porini, koji omogu}uju slobodan prolazak iona i malih polarnih molekula kroz vanjsku membranu bakterija (vidi sliku 12-8). Tijesni spojevi, o kojima }emo raspravljati u ovome poglavlju, tako|er sadràvaju kanalne proteine koji omogu}uju prolazak molekula izme|u stanica. Stani~ne membrane mnogih stanica sadràvaju tako|er i kanale za vodu (akvaporine), kroz koje molekule vode prolaze mnogo brè nego difuzijom kroz fosfolipidni dvosloj. Najbolje okarakterizirani kanalni proteini svakako su ionski kanali, koji posreduju pri prijenosu iona kroz stani~ne membrane. Mada ih moèmo na}i u membranama svih stanica, posebno su dobro izu~eni u ìv~anim i mi{i}nim stanicama gdje je njihovo regulirano otvaranje i zatvaranje odgovorno za prijenos elektri~nih signala.
Stani~na povr{ina
497
Slika 12-18. Model ionskoga kanala.

U zatvorenoj konformaciji, prolazak iona blokiran je vratnicama. Otvaranje vratnica omogu}uje ionima brz prolazak kroz kanal. Unutar kanala je uska pora koja ograni~ava prolazak iona neprikladne veli~ine i naboja.
zatvoreno vratnice
Tri su osobine ionskih kanala glavne za njihovu funkciju (slika 12-18). Prva, transport kanalima je izuzetno brz. U jednoj sekundi kroz otvoreni kanal pro|e vi{e od milijun iona {to je brzina tijeka koja je oko tisu}u puta ve}a od brzine transporta proteinima nosa~ima. Drugo, ionski kanali visoko su selektivni jer uske sredi{nje pore ograni~avaju prolaz iona s obzirom na veli~inu i naboj. Stoga posebni kanali omogu}uju prolaz Na+, K+, Ca2+ i Cl kroz membranu. Tre}e, ve}ina kanala nije stalno otvorena. Umjesto toga, otvaranje ionskih kanala regulirano je vratnicama koje se prolazno otvore na neki poticaj. Neki kanali (nazvani kanali nadzirani ligandom) otvaraju se kao odgovor na vezanje neurotransmitora ili neke druge signalne molekule; drugi (kanali nadzirani naponom) otvaraju se kao odgovor na promjene elektri~noga potencijala kroz stani~nu membranu. Osnovna uloga ionskih kanala u prijenosu elektri~nih impulsa bila je razja{njena serijom domi{ljatih eksperimenata koje su izveli Alan Hodgkin i Andrew Huxley 1952. godine. Ti su istraìva~i kao model koristili golemu ìv~anu stanicu lignje. Aksoni tih gigantskih neurona imaju promjer od oko 1 mm, {to omogu}uje da se u njih zadjenu elektrode i da se mjere promjene elektri~nog potencijala do kojih dolazi tijekom prijenosa ìv~anoga impulsa. Koriste}i ovaj pristup, Hodgkin i Huxley pokazali su da do promjena membranskog potencijala dolazi uslijed reguliranog otvaranja i zatvaranja Na+ i K+ kanala u stani~noj membrani. Kasnije je omogu}eno prou~avanje aktivnosti pojedina~noga ionskog kanala, kori{tenjem tehnike stezaljke istaknute povr{ine (engl. patch clamp) koju su razvili Erwin Neher i Bert Sakmann tijekom 1976. godine (slika 12-19). U toj metodi, mikropipeta s promjerom od oko 1 mm koristi se da bi se izolirao mali odsje~ak membrane, {to omogu}uje protok iona kroz pojedina~ni kanal koji se analizira te uvelike pove}ava preciznost kojom se moè pratiti aktivnost ionskih kanala. Protok iona kroz membranske kanale ovisi o uspostavljanju ionskoga gradijenta kroz stani~nu membranu. Sve stanice, uklju~uju}i ìv~ane i mi{i}ne, imaju ionske crpke (o kojima }emo raspravljati u sljede}emu odlomku) koje trebaju energiju za aktivni transport iona preko membrane, a koja se dobiva hidrolizom ATP Kao rezultat toga, ionski sastav citoplazme zna. tno je druk~iji od onoga izvanstani~nih teku}ina (tablica 12-1). Primjerice, Na+ aktivno se crpi iz stanice, a K+ u stanicu. Stoga je u aksonu lignje koncentracija Na+ oko 10 puta ve}a u izvanstani~nim teku}inama nego unutar stanice, dok je koncentracija K+ oko 20 puta ve}a u citosolu nego u okolini stanice. Budu}i da su ioni nabijeni, njihovim se transportom uspostavlja elektri~ni gradijent preko stani~ne membrane. U mirovanju je elektri~ni potencijal lignjina aksona oko 60 mV, s tim da je unutra{njost stanice negativna u
pore
otvoreno
mikropipeta
stanica
kanal
Slika 12-19. Tehnika stezaljke istaknute povr{ine.

Mala povr{ina membrane izolira se vr{kom mikropipete. Potom se unutar pipete primjenjuju razni stimulansi {to omogu}uje mjerenje pona{anja samo jednoga uhva}enog kanala. (Prilago|eno iz E. Neher i B. Sakmann, 1992, Sci Am. 266(3):44.)
498
Poglavlje 12
Tablica 12-1. Izvanstani~ne i unutarstani~ne koncentracije iona

Ion Koncentracija (mM) u stanici izvan stanice
20 450 560 10 5 145 110 2,55
Akson lignje K+ 400 Na+ 50 Cl 40150 Ca2+ 0,0001 Stanica sisavaca K+ 140 Na+ 515 Cl 4 Ca2+ 0,0001
odnosu na vanjsku stranu (slika 12-20). Elektri~ni potencijal nastaje zahvaljuju}i i ionskim crpkama i protoku iona kroz kanalne proteine koji se otvaraju kad je membrana u stanju mirovanja. Stani~na membrana aksona lignje u mirovanju ima otvorene K+ kanale pa je vi{e propusna za K+ nego za Na+ ili druge ione. Kao posljedica toga, protok K+ iona daje najve}i udio u oblikovanju miruju}ega membranskog potencijala. Kako je protuma~eno u 10. poglavlju, protok iona kroz membrane oblikuje se uslijed dvojakoga uticaja: koncentracije i naponske sastavnice elektrokemijskoga gradijenta. Primjerice, 20 puta vi{a koncentracija K+ u aksonu lignje u odnosu na izvanstani~nu teku}inu usmjeruje K+ izvan stanice. Unato~ tomu, kako je K+ pozitivno nabijen, tako taj efluks K+ iz stanice oblikuje elektri~ni potencijal na membrani, a unutra{njost stanice postaje negativno nabijena. Taj se membranski potencijal opire kontinuiranome tijeku K+ iz stanice i sustav se pribliàva ravnote`nomu stanju u kojemu membranski potencijal uravnoteùje K+ koncentracijski gradijent. Kvantitativno je odnos izme|u koncentracije iona i membranskog potencijala dan Nernstovom jednad`bom: C V = RT ln o Ci zF gdje je V ravnote`ni potencijal u voltima, R je plinska konstanta, T je apsolutna temperatura, z je naboj iona, F je Faradayeva konstanta, a Co i Ci su koncentracije iona izvan stanice i u stanici. Ravnote`ni potencijal nije ovisan ni o jednome ionu, a membranski je potencijal odre|en tijekom svih iona preko stani~ne membrane. Unato~ tomu, kako je akson lignje u mirovanju vi{e propustan za K+ nego Na+ ili druge ione (uklju~uju}i Cl), tako je membranski potencijal u mirovanju (60 mV) blizu ravnote`nom potencijalu odre|enomu s pomo}u izvanstani~ne i unutarstani~ne koncentracije K+ iona (75 mV). @iv~ani impuls (akcijski potencijal) putuje du` aksona, a membrana se depolarizira (slika 12-21). Membranski se potencijal mijenja od 60 mV na
izvan stanice
Slika 12-20. Ionski gradijent i membranski potencijal u mirovanju divovskoga aksona lignje.
Prikazane su samo koncentracije iona Na+ i K+, radi toga {to su to ioni koji sudjeluju u prijenosu ìv~anih podraàja. Na+ crpi se izvan stanice dok se K+ crpi u stanicu pa je tako koncentracija Na+ ve}a izvan nego unutar aksona, dok je koncentracija K+ ve}a unutra nego izvana. Membrana je u mirovanju vi{e propusna za K+ nego Na+ ili druge ione zato {to ima otvorene K+ kanale. Protok K+ kroz ove kanale daje glavni doprinos miruju}emu potencijalu membrane koji je oko 60 mV pa je tako blizu ravnote`nomu potencijalu za K+.
Na+/K+ crpka +
K+ kanal
po otencijal 60 mV 6
ADP u stanici i
Stani~na povr{ina
499
membranski potencijal (mV)
(A)
(B) 50 ENa
akson lignje
0 Na+ kanal 50 EK 0 1 2 3 vrijeme (ms) 4 mir ruju}i pot tencijal 60 mV 0 K+ kanal
otvaranje Na+ kanala nadziranog naponom pono
Na+
Slika 12-21. Membranski potencijal i ionski kanali tijekom akcijskoga potencijala.

(A) Promjene membranskoga potencijala u jednoj to~ki divovskog aksona lignje neposredno nakon stimulacije. ENa i EK ravnote`ni su potencijali za Na+ i K+. (B) Membranski potencijal pr vo raste kako se otvaraju Na+ kanali nadzirani naponom. Zatim membranski potencijal pada ispod vrijednosti miruju}eg potencijala kako se Na+ kanali inaktiviraju i kako se otvaraju K+ kanali nadzirani naponom. Zatim se inaktiviraju K+ kanali nadzirani naponom, a membranski se potencijal vra}a na vrijednosti u mirovanju.
+3 mV 30
+ kanali nadzirani naponom se zatvaraju K+ kanali nadzirani naponom se otvaraju
K+
75 mV 5
K+ kanali nadzirani naponom se zatvaraju
mir ruju}i 60 mV 0
pribli`no +30 mV u manje od jedne milisekunde, nakon ~ega postaje ponovno negativan i vra}a se na miruju}e vrijednosti. Do tih promjena dolazi uslijed otvaranja i zatvaranja Na+ i K+ kanala nadziranih naponom u slijedu. Relativno male po~etne promjene membranskoga potencijala (od 60 do oko 40 mV) vode brzom, ali prolaznom, otvaranju Na+ kanala. To omogu}uje utjecanje Na+ u stanicu, tjerano kako koncentracijskim gradijentom tako i membranskim potencijalom. Nagli ulazak Na+ vodi velikoj promjeni membranskoga potencijala, koji se pove}ava na gotovo + 30mV, pribliàvaju}i se ravnote`nom potencijalu za Na+ od otprilike + 50mV. U tom su trenutku Na+ kanali inaktivirani, a K+ kanali nadzirani naponom otvoreni, postupno pove}avaju}i permeabilnost membrane za K+. K+ brzo izlazi iz
500
Poglavlje 12
ìv~ani impuls
sinapti~ka pukotina
(zatvoreni) kanal nadziran ligandom
(otvoreni) kanal nadziran ligandom
stani~na membrana ciljne stanice neurotransmitor sinapti~ke vezikule
Slika 12-22. Signalizacija otpu{tenim neurotransmitorima na sinapsi.

Dospije}e ìv~anoga podraàja na zavr{ni kraj aksona signalizira po~etak fuzije sinapti~kih vezikula sa stani~nom membranom te otpu{tanje neurotransmitora iz presinapti~ke stanice u sinapti~ku pukotinu. Neurotransmitor se veè na receptor i otvara ionske kanale nadzirane ligandom u stani~noj membrani ciljne stanice.
izvan stanice
pora
vezno mjesto acetilkolina
stanice, tjeran kako membranskim potencijalom tako i koncentracijskim gradijentom K+, {to vodi u nagli pad membranskoga potencijala na oko 75 mV (ravnote`ni potencijal K+). Ta promjena membranskoga potencijala inaktivira kalijske kanale nadzirane naponom i membranski se potencijal vra}a na svoje miruju}e vrijednosti od 60 mV, odre|ene utjecanjem K+ i drugih iona kroz kanale koji ostaju otvoreni u nepodraènoj stanici. Depolarizacija susjedne regije membrane omogu}uje akcijskom potencijalu da napreduje uzdu` aksona ìv~ane stanice kao elektri~ni signal, {to rezultira brzim prijenosom ìv~anog impulsa na velike udaljenosti. Primjerice, aksoni ljudskih motori~kih neurona mogu biti dugi vi{e od metra. Dospije}e akcijskoga potencijala na zavr{etak ve}ine neurona signalizira otpu{tanje neurotransmitora, poput acetilkolina, koji prenose signal izme|u stanica koje tvore sinapsu (slika 12-22). Neurotransmitor otpu{ten iz presinapti~ke stanice veè se na receptor koji je na membrani postsinapti~ke stanice gdje djeluje tako da otvara kanale nadzirane ligandom. Jedan od najbolje okarakteriziranih takvih receptora je nikotinski receptor za acetilkolin na membrani mi{i}ne stanice. Vezanjem acetilkolina otvara se kanal koji je propustan za Na+ i K+. Ovo omogu}uje brzo utjecanje Na+, {to depolarizira membranu mi{i}ne stanice i poti~e akcijski potencijal. Akcijski potencijal omogu}uje otvaranje Ca2+ kanala nadziranih naponom, {to pove}ava koncentraciju unutarstani~noga Ca2+ i signalizira kontrakciju (vidi sliku 1126). Acetilkolinski receptor, prvotno izoliran iz elektri~nog organa torpedo raè 1970. godine, prototip je kanala nadziranog ligandom. Receptor se sastoji od pet podjedinica sloènih poput cilindra u membrani (slika 12-23). U zatvorenom je stanju pora kanala blokirana bo~nim lancima hidrofobnih
Slika 12-23. Model nikotinskoga receptora za acetilkolin.

unutra{njost stanice
vratnice
Receptor se sastoji od pet podjedinica okupljenih oko centralne pore. Vezanje acetilkolina na mjesto u izvanstani~noj regiji receptora uzrokuje alosteri~ku promjenu koja otvara vratnice kanala. Kanal je obrubljen negativno nabijenim aminokiselinama koje onemogu}uju prolazak negativno nabijenim ionima. (Prilago|eno iz N. Unwin, 1993. Cell 72/Neuron 10(Suppl.):31.)
Stani~na povr{ina
501
K+-H2O Na+-H2O
K+-H2O
Slika 12-24. Ionska selektivnost Na+ kanala.

Uska pora omogu}uje prolazak iona Na+ vezanoga za jednu molekulu vode, ali ometa prolazak K+ ili ve}ih iona.
aminokiselina. Vezanje acetilkolina izaziva konformacijsku promjenu receptora time {to se hidrofobni lanci maknu izvan kanala otvaraju}i poru za prolazak pozitivno nabijenih iona, uklju~uju}i Na+ i K+. Unato~ tomu, kanal ostaje zatvoren za prolazak negativno nabijenih iona kao {to su Cl jer je obloèn negativno nabijenim aminokiselinama. Ve}u ionsku selektivnost imaju Na+ i K+ kanali nadzirani naponom. Na+ kanali su deset puta propusniji za Na+ nego za K+, dok su K+ kanali vi{e od tisu}u puta propusniji za K+ nego za Na+. Selektivnost Na+ kanala moè se, barem djelomice, objasniti usko}om pore koja djeluje kao filtar za veli~inu. Promjer iona Na+ (0,095 nm) manji je od promjera K+ (0,133 nm) pa se misli da je promjer pore Na+ kanala dovoljno uzak da bi onemogu}ivao prolaz ve}ih K+ iona (slika 12-24). I K+ kanal ima uske pore koje sprje~avaju prolazak ve}ih iona. Unato~ tomu, kako Na+ ima manji promjer iona, to ne obja{njava selektivnost K+ kanala za Na+. Selektivnost K+ kanala zasniva se na drugom mehanizmu koji je bio razja{njen odre|ivanjem trodimenzionalne strukture K+ kanala kristalografijom i difrakcijom X zraka 1998. godine (slika 12-25). Pora kanala sadràva uski selektivni filtar obrubljen atomima karbonilnog kisika (C=O) iz polipeptidne okosnice. Kad K+ ion prilazi selektivnom filtru, interakcija s karbonilnim kisikom odmi~e molekule vode za koje je K+ vezan,
Slika 12-25. Selektivnost K+ kanala.
K+ kanal sadràva uski selektivni filtar obrubljen atomima karbonilnog kisika (C=O). Pora je taman toliko velika da dopu{ta prolaz dehidriranog K+ iona s kojega su skinute sve molekule vode uslijed interakcije K+ iona i karbonilnog kisika. Na+ je premali da bi reagirao s karbonilnim kisikom selektivnoga filtra i zato ostaje vezan u kompleksu s molekulama vode koji je prevelik da bi pro{ao kroz poru.
Na+-H2O
K+-H2O Na+
2O
karbonil kisik
H2O
K+
502
Poglavlje 12 omogu}uju}i tako dehidriranom K+ da pro|e kroz poru. Suprotno tomu, dehidrirani Na+ je premalen za interakciju s karbonilnim kisikom selektivnoga filtra, te Na+ ostaje vezan u hidriranom kompleksu s molekulama vode i prevelik za prolazak kroz kanal. Na+, K+ i Ca2+ kanali nadzirani naponom pripadaju velikoj obitelji sli~nih proteina (slika 12-26). Primjerice, genom C. elegans sadràva oko 200 gena koji kodiraju ionske kanale, za koje se pretpostavlja da igraju razli~ite uloge u stani~noj signalizaciji. K+ kanal sadràva ~etiri identi~ne podjedinice, a svaka ima od 2 do 6 transmembranskih a-uzvojnica. Na+ i Ca2+ kanali imaju samo jedan polipeptidni lanac, ali imaju ~etiri ponovljene domene koje odgovaraju onima u K+ podjedinici. U otvaranju vratnica naponom posreduje jedna transmembranska a-uzvojnica, koja ima vi{e pozitivno nabijenih aminokiselina. Depolarizacija membrane dovodi do izvrtanja tih pozitivnih naboja prema vanjskoj strani stanice, pomicanja transmembran-
Kanali za K+, Na+ i Ca2+ pripadaju porodici srodnih proteina. K+ kanal oblikuje se udruìvanjem ~etiri istovjetne podjedinice, od kojih je jedna prikazana. Na+ kanal ~ini jednostruki polipeptidni lanac od ~etiri ponovljene domene, od kojih je svaka sli~na podjedinici K+ kanala. Ca2+ kanal sli~an je Na+ kanalu. Svaka podjedinica ili domena ima {est a-uzvojnica koje prolaze kroz membranu. a-uzvojnica ozna~ena s 4 ima vi{e pozitivno nabijenih aminokiselina koje djeluju kao naponski senzor koji posreduje u otvaranju kanala kao odgovor na promjene membranskoga potencijala.
Slika 12-26. Struktura kationskih kanala nadziranih naponom.
K+ kanal izvana
Na+ kanal izvana I II III IV
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
C N N
iznutra
iznutra
Ca2+ kanal izvana I II III IV
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
C N
iznutra
Stani~na povr{ina
503
K+ kanal
otvoren K
+
inaktiviran
Na+ kanal
otvoren Na+
inaktiviran
C C N NN N C C N N
K+ Na+
skih odjeljaka i otvaranja kanala. Brza inaktivacija Na+ i K+ kanala tijekom napredovanja akcijskoga potencijala postiè se citoplazmatskim dijelom polipeptidnoga lanca, koji se pomi~e na citoplazmatski otvor pore kanala i sprje~ava dalje utjecanje iona (slika 12-27). Veliki broj razli~itih ionskih kanala (uklju~uju}i Ca2+ i Cl kanale) biva pobu|en razli~itim neurotransmitorima, ili se otvara i zatvara razli~itom kinetikom nakon depolarizacije membrane. Uskla|ena aktivnost tih razli~itih kanala odgovorna je za kompleksnost signalizacije u ìv~anome sustavu. âk {to vi{e, kako }emo objasniti u sljede}emu poglavlju, uloga ionskih kanala ne ograni~ava se na stanice s elektri~nom podra`ljivo{}u, poput ìv~anih i mi{i}nih, nego oni igraju odlu~nu ulogu i u signalizaciji kod drugih stani~nih tipova. Stoga regulacija otvaranja i zatvaranja kanala opskrbljuje stanicu osjetljivim i prilagodljivim mehanizmom odgovaranja na razli~ite poticaje iz okoli{a.
Nakon otvaranja naponom, K+ i Na+ kanali brzo se inaktiviraju vezanjem citoplazmatskog dijela polipeptidnog lanca na otvor pore. Kod K+ kanala, inaktivacija se postiè mehanizmom lopte i lanca gdje je lopta amino-kraj polipeptidnoga lanca. Kod Na+ kanala, inaktivacija se postiè unutarstani~nom petljom koja povezuje domene III i IV.
Slika 12-27. Inaktivacija K+ i Na+ kanala.
Aktivni transport tjeran hidrolizom ATP

Ukupni tijek molekula olak{anom difuzijom, ili putem proteina nosa~a, ili kanalnim proteinima, uvijek je energetski u smjeru niz elektrokemijski gradijent kroz membranu. U mnogim slu~ajevima, suprotno tomu, stanica mora transportirati molekule protiv njihova koncentracijskoga gradijenta. U aktivnom transportu, koristi se energija dobivena iz zdruène reakcije (poput hidrolize ATP) da bi se tjerao transport molekula u energetski nepovoljnome smjeru. Ionske crpke, odgovorne za odràvanje gradijenta na stani~noj membrani, dobar su primjer aktivnoga transporta tjeranog direktno hidrolizom ATP Kao {to smo ranije raspravljali (vidi tablicu 12-1), koncentracija Na+ . otprilike je deset puta ve}a izvan nego unutar stanice, dok je koncentracija K+ ve}a unutra nego vani. Taj se ionski gradijent odràva Na+/K+-crpkom (tako|er nazvanom Na+/K+-ATPaza) (slika 12-28) koja koristi energiju dobivenu hidrolizom ATP za transport Na+ i K+ protiv elektrokemijskoga gradijenta. Taj je proces rezultat ATP-uzrokovane konformacijske promjene
504
Poglavlje 12
Slika 12-28. Struktura Na+/K+-crpke.

Na /K -crpka je heterodimer s 10 transmembranskih domena u a-podjedinici i jednom u b-podjedinici. Podjedinica b obilno je glikozilirana.
+ +
vanjska strana
b-podjedinica N CN
a-podjedinica unutra{nja strana
crpke (slika 12-29). Prvo se Na+ ioni veù na mjesta s visokim afinitetom na unutra{njoj strani. To vezanje stimulira hidrolizu ATP i fosforilaciju same crpke, induciraju}i konformacijsku promjenu koja mjesta s vezanim Na+ izlaè prema vanjskoj strani stanice smanjuju}i istodobno njihov afinitet za Na+. Posljedica toga je da se vezani Na+ otpu{ta u izvanstani~nu teku}inu. Istovremeno se visokoafinitetna mjesta za K+ izlaù na stani~noj povr{ini. Vezanje izvanstani~noga K+ na ta mjesta stimulira hidrolizu fosfatnih skupina vezanih na crpku, {to dovodi do druge konformacijske promjene, koja izlaè mjesta s vezanim K+ prema citosolu smanjuju}i njihov afinitet za K+, a rezultat je njegovo otpu{tanje u stanicu. Crpka ima tri vezna mjesta za Na+ i dva za K+ pa se u svakome ciklusu na ra~un jedne molekule ATP prenesu tri Na+ i dva K+ preko stani~ne membrane. Va`nost Na+/K+ crpke o~igledna je iz ~injenice da se procjenjuje kako ona tro{i gotovo 25% raspoloìvog ATP u mnogim animalnim stanicama. Jedna od kriti~nih uloga gradijenta Na+ i K+ uspostavljenoga djelovanjem crpke je propagacija elektri~nog signala u ìvcima i mi{i}ima. Kao {to }emo obrazloìti, uspostavljeni gradijent Na+ koristi se i da bi tjerao aktivni transport raznih drugih molekula. Sljede}a va`na uloga Na+/K+ crpke je odràvanje osmoti~ke ravnoteè i stani~noga volumena ve}ine animalnih stanica. Citoplazma sadràva visoku koncentraciju organskih molekula, uklju~uju}i makromolekule, aminokiseline, {e}ere i nukleotide. Kad ne bi bilo kontrateè, ovo bi dovodilo do osmoti~kog utoka vode u stanicu, {to bi, da nije pod kontrolom, dovelo do oticanja i mogu}ega pucanja stanice. Nu`na kontrateà osigurava se gradijentom iona uspostavljenim djelovanjem Na+/K+ crpke (slika 12-30). Va`no je da crpka uspostavlja vi{u koncentraciju Na+ izvan nego unutar stanice. Kao {to smo ve} rekli, protok K+ kroz otvorene kanale dodatno uspostavlja elektri~ni potencijal na stani~noj membrani. Taj potencijal zatim tjera Cl izvan stanice pa je koncentracija Cl (kao ona Na+) oko deset puta ve}a u izvanstani~nim teku}inama nego u citoplazmi. Te razlike u koncentraciji iona uravnoteùju visoku koncentraciju organ-
Stani~na povr{ina
505
vanjska strana
3 Na+
unutra{nja strana 3 Na+ 3Na+ veù se na mjesto izloèno prema unutra{njosti stanice. Vezanje Na+ stimulira o ATP ovisnu fosforilaciju crpke.
ADP Fosforilacija izlaè vezna mjesta Na+ prema stani~noj povr{ini se Na+ otpu{ta izvan stanice.
2 K+
P P 2 K+ se istovremeno veù na visokoafinitetna mjesta na stani~noj povr{ini. Vezanje K+ stimulira defosforilaciju crpke. 2 K+ Crpka se potom vra}a u svoje izvorno stanje, otpu{taju}i K+ u stanicu.
Slika 12-29. Model djelovanja Na+/K+-crpke.
skih molekula u stanici, izjedna~avaju}i osmoti~ki tlak i sprje~avaju}i neto utjecaj vode u stanicu. Aktivni transport Ca2+ preko stani~ne membrane tjera Ca2+ crpka koja je strukturno srodna Na+/K+-crpki i jednako zdruèna s hidrolizom ATP . Ca2+ crpka transportira Ca2+ izvan stanice pa je unutarstani~na koncentracija Ca2+ jako niska; otprilike 0,1 mM, u odnosu na izvanstani~nu koja je oko 1 mM. Ova niska unutarstani~na koncentracija Ca2+ ~ini stanice osjetljiH 2O H 2O Na+ = 145 mM K+ = 5 mM Cl = 110 mM
Koncentracija Na+ i Cl vi{a je izvan nego unutar stanice, dok je koncentracija K+ vi{a unutar nego izvana. Niska koncentracija Na+ i Cl uravnoteùje visoku unutarstani~nu koncentraciju organskih komponenti, izravnavaju}i osmoti~ki tlak i sprje~avaju}i neto utjecaj vode u stanicu.
Slika 12-30. Ionski gradijent na stani~noj membrani tipi~ne stanice sisavaca.
= 10 mM K+ = 140 mM Cl = 4 mM organske komponente
Na+
506
Poglavlje 12
Slika 12-31. Struktura ABC transportera.

Osnovna strukturna jedinica ABC transportera sastoji se od {est transmembranskih domena iza kojih slijedi vezno mjesto za ATP U transporterima na . stani~noj membrani (kakav je prikazani MDR-transporter) spojene su dvije takve jedinice pa transporter sadràva 12 transmembranskih domena i dva vezna mjesta za ATP .
vanjska strana
vezno mjesto za ATP unutra{nja strana
vezno mjesto za ATP C
vima na male promjene razine Ca2+. Takva prolazna i visoko lokalizirana pove}anja unutarstani~noga Ca2+ igraju va`nu ulogu u stani~noj signalizaciji, kao {to je ve} ranije obja{njeno kod kontrakcije mi{i}a (vidi sliku 11-26) i dodatno }e biti obja{njeno u sljede}emu poglavlju. Sli~ne su ionske crpke u stani~noj membrani bakterija, gljivica i biljnih stanica odgovorne za aktivni transport H+ izvan stanice. K tomu, H+ se aktivno crpi iz stanica koje oblaù èludac pa je èlu~ana teku}ina kisela. Strukturno razli~ite crpke odgovorne su za transport H+ u lizosome i endosome (vidi sliku 9-38). Tre}i tip H+ crpke koristi se za sintezu ATP u mitohondrijima i kloroplastima: u tome se slu~aju moè gledati kao da crpka radi obrnuto, gdje se kretanje iona niz koncentracijski gradijent koristi da bi se tjerala sinteza ATP . Najve}a obitelj membranskih transportera su ABC-transporteri, nazvani tako zato {to se sastoje od visoko konzervirane domene koje veù ATP (engl. ATP-Binding Cassettes) (slika 12-31). Vi{e od stotinu ~lanova obitelji identificirano je kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. Kod bakterija, ABC-transporteri koriste energiju dobivenu hidrolizom ATP za transport razli~itih molekula, uklju~uju}i ione, {e}ere i aminokiseline. U eukariotskim je stanicama prvi ABC-transporter otkriven kao proizvod gena (nazvanog engl. multidrug resistance ili mdr gen, gen za rezistenciju na lijekove) koji tumorske stanice ~ini otpornima na razli~ite lijekove koji se koriste u kemoterapiji. Identificirana su dva MDR-transportera. Normalno ih eksprimiraju mnoge stanice, gdje djeluju tako da uklanjaju potencijalno {tetne strane tvari. Primjerice, ekspresija MDR-transportera na endotelnim stanicama kapilara mozga ~ini se da igra va`nu ulogu u za{titi mozga od toksi~nih kemikalija. Na àlost, MDR-transporteri ~esto se u visokim razinama eksprimiraju na stanicama raka, gdje prepoznaju najrazli~itije lijekove i crpe ih iz stanice te tako tumore ~ine otpornima na {iroki spektar kemoterapijskih sredstava stvaraju}i tako veliku prepreku za uspje{nu terapiju. Drugi medicinski zna~ajan ~lan ABC-obitelji transportera je gen odgovoran za cisti~nu fibrozu. Mada je ~lan ABC-obitelji, proizvod toga gena (nazvan transmembranski regulator provodnosti u cisti~noj fibrozi ili CFTR, engl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) funkcionira kao Cl
Stani~na povr{ina kanal u epitelnim stanicama, a defekt transporta Cl obilje`je je te bolesti. CFTR-kloridni kanal neobi~an je i po tomu {to za otvaranje treba i hidrolizu ATP i cAMP-ovisnu fosforilaciju. Strukturna osnova funkcije CFTR kao reguliranoga ionskog kanala razjasnit }e se daljnjim istraìvanjima.
507
Aktivni transport tjeran ionskim gradijentom

Ionske crpke i ABC-transporteri, opisani u prethodnim odjeljcima, koriste energiju dobivenu direktno hidrolizom ATP da bi transportirale molekule protiv njihova koncentracijskoga gradijenta. Druge se molekule transportiraju protiv svog koncentracijskoga gradijenta koriste}i energiju ne iz hidrolize ATP nego veù}i se uz transport drugih molekula koje se prenose u, za , njih, energetski povoljnome smjeru. Gradijent natrija uspostavljen Na+/K+ crpkom osigurava izvor energije koji se ~esto koristi da bi tjerao aktivni transport {e}era, aminokiselina i iona u stanicama sisavaca. Sli~nu ulogu ima gradijent H+ uspostavljen H+ crpkom u bakterija, kvasaca i biljnih stanica. Epitelne stanice koje oblaù crijeva dobar su primjer aktivnog transporta tjeranoga gradijentom Na+. Te stanice koriste sustave aktivnog transporta na svojim apikalnim stani~nim membranama da bi preuzele prehrambene {e}ere i aminokiseline iz lumena crijeva. Primjerice, transport glukoze obavlja transporter koji koordinirano transportira u stanicu dva Na+ i jednu glukozu (slika 12-32). Protok Na+ niz njegov elektrokemijski gradijent osigurava potrebnu energiju za preuzimanje glukoze iz hrane i akumulaciju visokih koncentracija glukoze u stanici. Zatim se glukoza otpu{ta u vezivno tkivo (koje sadràva krvne kapilare) na bazolateralnoj povr{ini crijevnog epitela, gdje se prenosi niz svoj koncentracijski gradijent olak{anom difuzijom (slika 12-33). Preuzimanje glukoze iz lumena crijeva i otpu{tanje u cirkulaciju stoga daje dobar primjer polarizacije funkcija epitelnih stanica, koje su rezultat specifi~ne lokacije molekula za aktivni transport i olak{anu difuziju u apikalnoj, odnosno bazolateralnoj, domeni stani~ne membrane.
lumen crijeva vanjska strana visoki Na+ niska glukoza vanjska strana visoki Na+ niska glukoza
glukoza
2 Na+
Slika 12-32. Aktivni transport glukoze.

Za preuzimanje glukoze iz lumena crijeva odgovoran je aktivni transport tjeran gradijentom Na+. Transporter koordinirano veè i prenosi u stanicu jednu glukozu i dva Na+. Transport Na+ u energetski povoljnom smjeru tjera transport glukoze protiv njezina koncentracijskoga gradijenta.
glukoza
2 Na+
nizak Na+ unutra{nja strana
visoka glukoza
nizak Na+ unutra{nja strana
visoka glukoza
508
Poglavlje 12
Slika 12-33. Transport glukoze kroz epitelne stanice crijeva.

Transporter u apikalnoj domeni stani~ne membrane odgovoran je za aktivni transport glukoze (u kotransportu s Na+) iz lumena crijeva. Rezultat toga je da se glukoza iz hrane koncentrira unutar epitelnih stanica crijeva. Zatim se glukoza transportira iz tih stanica u vezivo i krvne ìle ispod njih s pomo}u olak{ane difuzije, {to je posredovano transporterom u bazolateralnoj domeni stani~ne membrane. Sistem je tjeran Na+/K+ crpkom, koja se nalazi i u bazolateralnoj domeni. Obratite pozornost na to da je preuzimanje glukoze iz probavnoga trakta i prijenos do cirkulacije ovisan o ograni~enoj lokalizaciji transportera za glukozu koji posreduju u aktivnome transportu i olak{anoj difuziji u apikalnoj i bazolateralnoj domeni membrane.
aktivni transport izvana apikalna domena lumen crijeva
glukoza 2 Na+ citosol ~vrsti spoj
ADP 2 K+ citosol
3 Na+ izvana citosol
bazolateralna domena
vezivno tkivo i krvne ìle
olak{ana difuzija
glukoza
izvana
izvana
Na+
Ca2+
Na+
H+
Koordinirani unos glukoze i Na+ primjer je simporta, transporta dvaju molekula u istom smjeru. Suprotno tomu, olak{ana je difuzija glukoze primjer uniporta, transporta samo jedne molekule. Aktivni transport moè te}i i kao antiport, u kojemu se dvije molekule prenose u suprotnome smjeru (slika 12-34). Primjerice, Ca2+ se izbacuje iz stanice ne samo Ca2+ crpkom nego i Na+/Ca2+ antiporterom koji transportira Na+ u stanicu, a Ca2+ iz nje. Drugi je primjer protein Na+-H+-izmjenjiva~, koji djeluje u regulaciji unutarstani~nog pH. Na+-H+-izmjenjiva~ veè transport Na+ u stanicu s izbacivanjem H+, uklanjaju}i tako vi{ak H+ nastao metaboli~kim reakcijama i sprje~avaju}i zakiseljavanje citoplazme.
Na+ iznutra
Ca2+
Na+
H+
Ca2+ i H+ izbacuju se iz stanice antiportom, koji njihovo izbacivanje vezuje s energijski povoljnim unosom Na+.
Slika 12-34. Primjeri antiporta.
Stani~na povr{ina
509
Cisti~na fibroza
Bolest
Cisti~na fibroza je recesivna geneti~ka bolest koja poga|a djecu i mlade. To je naj~e{}a letalna nasljedna bolest bijele rase, koja zahva}a jedno od 2.500 novoro|en~adi i vrlo je rijetka u drugih rasa. Karakteristi~ni poreme}aj funkcije u cisti~noj fibrozi produkcija je nenormalno guste sluzi u nekoliko tipova epitelnih stanica, uklju~uju}i stanice koje oblaù respirator ni i gastrointestinalni trakt. Primar na klini~ka manifestacija jest pojava bolesti respirator noga trakta do kojih dolazi zbog za~epljenja plu}nih putova gustim ~epovima sluzi, nakon ~ega slijedi razvoj opetovanih bakterijskih infekcija. U ve}ine je pacijenata zahva}en i pankreas zato {to su pankreati~ki putovi tako|er za~epljeni sa sluzi. @lijezde znojnice tako|er ne funkcioniraju kako treba, a prisutnost velike koli~ine soli dijagnosti~ki je znak cisti~ne fibroze. Dana{nja terapija bolesti uklju~uje fizikalnu terapiju da bi se olak{ala drenaà bronha, davanje antibiotika i nadomje{tanje enzima pankreasa. Mada ova terapija pove}ava preìvljavanje oboljelih na oko 30 godina ìvota, cisti~na fibroza je kona~no fatalna, a plu}ne su bolesti u 95% slu~ajeva odgovorne za tu smrtnost. ductance regulator regulator transmembranske provodnosti u cisti~noj fibrozi) koji pripada obitelji ABC-transportera. Cijeli je niz sljede}ih studija pokazao da CFTR funkcionira kao Cl kanal te da je njegova nasljedna mutacija direktno odgovor na za manjkavi transport Cl. moè sigur no unijeti i eksprimirati u stanicama epitela bronha oboljelih od cisti~ne fibroze. Do sada je, unato~ svemu, efikasnost prijenosa bila mala, a ekspresija unesene CFTR cDNA ne traje dulje od mjesec dana. Tako su uspostavljeni principi genskoga prijenosa, ali se jo{ moraju prevladati zna~ajne prepreke u razvoju protokola efikasne genske terapije.
Kao i kod drugih nasljednih bolesti, izolacija gena odgovor nog za cisti~nu fibrozu otvara mogu}nost genskoga pregleda kojim se mogu otkriti pojedinci koji nose mutirane alele. U nekim populacijama, u~estalost je heterozigotnih nosilaca mutiranoga gena visokih jedan na 25 osoba, {to nalaè mogu}nost op}ega populacijskog pregleda kako bi se identificirali rizi~ni parovi radi geneti~koga savjetovanja. Osim toga, razumijevanje funkcije CFTR kao Cl kanala dalo je nove prijedloge za lije~enje. Jedna je mogu}nost uporaba lijekova koji poti~u otvaranje drugih Cl kanala u zahva}enome epitelu. Alter nativa je i genska terapija kojom bi se izvr{ila zamjena za nor malni CFTR gen u respirator nome epitelu oboljelih od cisti~ne fibroze. Potencijal genske terapije potkrijepljen je eksperimentima u kojima je bilo dovoljno da se uvede nor malni CFTR gen u stani~ne kulture fibroblasta pacijenata s cisti~nom fibrozom da bi se obnovila normalna funkcija Cl kanala. Jedan od mogu}ih na~ina primjene genske terapije za cisti~nu fibrozu jest zgodna dostupnost epitelnih stanica koje oblaù di{ne puteve za primjenu aerosola. Studije na eksperimentalnim ìvotinjama pokazale su da se virusnim vektorima moè unijeti CFTR cDNA u respiratorni epitel, a prvi pokusi s genskom terapijom za cisti~nu fibrozu na ~ovjeku po~eli su 1993. godine. Pokusima se do danas dokazalo da se CFTR
Literatura
Collins, F.S. 1992. Cystic fibrosis: Molecular biology and therapeutic implications. Science 256: 774-779. Driskell, R.R. and J.F. Engelhardt. 2003. Current status of gene therapy for inherited lung disease. Ann. Rev. Physiol. 65: 585-612.

Obilje`je cisti~ne fibroze jest defekt transporta Cl u zahva}enome epitelu, uklju~uju}i vodove znojnica i stanice koje oblaù di{ne putove. Da kloridni kanali ne funkcioniraju nor malno u epitelnim stanicama pacijenata s cisti~nom fibrozom dokazano je 1984. godine. Molekular na osnova bolesti odgonetnuta je 1989., kad je izoliran gen za cisti~nu fibrozu tehnikom kloniranja. Sekvenciranje gena otkrilo je da se radi o proteinu (nazvanom CFTR od engl. cystic fibrosis transmembrane con-
vezno mjesto za ATP Model regulatora transmembranske provodnosti kod cisti~ne fibroze (CFTR).
510
bakterija
Poglavlje 12
Endocitoza
pseudopodiji
fuzija membrana fagosom lizosom
Nosa~i i kanalni proteini opisani u prethodnim odlomcima prenose male molekule kroz fosfolipidni dvosloj. Eukariotske stanice tako|er su u stanju uzeti makromolekule i ~estice iz svoje okoline posebnim procesom nazvanim endocitoza. U endocitozi, materijal koji treba unijeti u stanicu zaokruèn je odsje~kom stani~ne membrane, koji zatim pupa u stanicu i oblikuje vezikulu koja sadràva progutani materijal. Naziv endocitoza skovao je Christian deDuve 1963. godine kako bi njime obuhvatio oboje, ingestiju velikih ~estica (poput bakterija) i upijanje teku}ine ili makromolekula malim vezikulama. Prva od tih dviju aktivnosti poznata je kao fagocitoza (stani~no hranjenje), a druga kao pinocitoza (stani~no napajanje).
Fagocitoza
Tijekom fagocitoze, stanica pro`dire velike ~estice poput bakterija, stani~nih debrija, ili ~ak intaktnih stanica (slika 12-35). Vezanje ~estica na receptore na povr{ini stanica fagocita otpo~inje produljivanje pseudopodija pokretanje zasnovano na aktinu koji se nalazi uz povr{inu stanice {to je opisano u 11. poglavlju. Pseudopodiji kona~no zaokruè ~esticu, a njihove se membrane stope u veliku intracelularnu vezikulu (> 0,25 mm u promjeru) zvanu fagosom. Fagosom se zatim stopi s lizosomom, a u nastalom se fagolizosomu razlaè progutani materijal uz pomo} lizosomskih kiselih hidrolaza (vidi 9. poglavlje). Tijekom sazrijevanja fagolizosoma, neki se od internaliziranih membranskih proteina recikliraju natrag do stani~ne membrane, {to }e biti obja{njeno u sljede}em odlomku kod endocitoze posredovane receptorima. Ingestija velikih ~estica fagolizosomima igra razli~itu ulogu u razli~itim tipovima stanica (slika 12-36). Mnoge se amebe sluè fagocitozom da bi uhvatile ~estice hrane, poput bakterija ili drugih protozoa. U vi{estani~nih ìvotinja, najva`nija uloga fagocitoze jest da osigura mehanizam obrane protiv invazije mikroorganizama i eliminaciju ostarjelih ili o{te}enih stanica iz tijela. U sisavaca je fagocitoza primarna funkcija dvaju tipova bijelih krvnih stanica, makrofaga i neutrofila, koji se ~esto nazivaju i profesionalnim fagocitima. I makrofagi i neutrofili igraju kriti~nu ulogu u tjelesnim
fagolizosom
Slika 12-35. Fagocitoza.

Vezanje bakterije na povr{inu stanice stimulira izduljivanje pseudopodija, koji kona~no progutaju bakteriju. Stapanje membrane pseudopodija zatim rezultira oblikovanjem velike unutarstani~ne vezikule (fagosoma). Fagosom se stapa s lizosomom i oblikuje fagolizosom, unutar kojega se probavi pojedena bakterija.
(A)
(B)
Slika 12-36. Primjeri stanica fagocita.

(A) Ameba koja guta drugog protista. (B) Makrofagi koji pro`diru crvene krvne stanice. La`na boja je dodana na sliku. (A. R. N. Band i H. S. Pankratz/ biological Photo Ser vice; B, dobrotom Joela Swansona).
Stani~na povr{ina
511
(A) izvanstani~ne makromolekule (ligandi) receptor
(B) Faza 1
Faza 2
klatrin pupanje klatrinom obloèna jaìca Faza 3 Faza 4
klatrinom obloèna vezikula 0,2 mm
Slika 12-37. Formiranje vezikula obloènih klatrinom.

(A) Izvanstani~ne makromolekule (ligandi) veù se na receptore stani~ne povr{ine koji se koncentriraju u klatrinom obloènim jaìcama. Te jaìce pupaju i oblikuju unutarstani~ne klatrinom obloène vezikule. (B) Snimka elektronskim mikroskopom koja pokazuje ~etiri stadija u oblikovanju klatrinom obloènih vezikula od klatrinom obloènih jaìca. (B, M. M. Perry, 1979. J Cell Science 34: 266)
obrambenim sustavima eliminacijom mikroorganizama iz inficiranoga tkiva. K tomu, makrofagi eliminiraju ostarjele ili mrtve stanice iz tkiva {irom tijela. Zapanjuju}i primjer opsega tih aktivnosti pruàju makrofagi ljudske slezene i jetre, koji su odgovorni za uklanjanje vi{e od 1011 ostarjelih krvnih stanica na dan.
Endocitoza posredovana receptorom

Za razliku od fagocitoze, koja igra samo vrlo posebnu ulogu, pinocitoza je zajedni~ka mnogim stanicama eukariota. Najbolje okarakterizirani oblik toga procesa je endocitoza posredovana receptorom, koja osigurava mehanizam za selektivno uzimanje specifi~nih makromolekula (slika 12-37). Makromolekule koje }e se internalizirati prvo se veù na specifi~ne receptore na stani~noj povr{ini. Ti su receptori koncentrirani u specifi~noj regiji membrane, nazvanoj klatrinom obloène jaìce. Te jaìce pupaju od membrane da bi oblikovale klatrinom obloène vezikule koje sadràvaju receptore i na njih vezane molekule (ligande). Klatrinom obloène vezikule zatim se stapaju s ranim endosomima, u kojima se njihov sadràj sortira ili za transport do lizosoma ili za recikliranje na stani~nu membranu. Uzimanje kolesterola u stanice sisavaca klju~ni je model za razumijevanje endocitoze posredovane receptorom na molekularnoj razini. Kolesterol se cirkulacijom prenosi u obliku lipoproteinskih ~estica, od kojih je naj~e{}a lipoprotein male gusto}e ili LDL (engl. low density lipoprotein) (slika 12-38). Studije u laboratoriju Michaela Browna i Josepha Goldsteina pokazale su da uzimanje ~estica LDL kod stanica sisavaca iziskuje vezivanje LDL na
fosfolipid
kolesterol
Slika 12-38. Struktura LDL.

Svaka se ~estica LDL sastoji od otprilike 1.500 molekula kolesterilestera unutar uljevite jezgre. Jezgra je okruèna pokriva~em od 500 molekula kolesterola, 800 molekula fosfolipida i jedne molekule apoproteina B100.
kolesterilesteri apoprotein B100
512
Poglavlje 12
LDL-receptor
Familial Hypercholesterolemia: Defective Binding of Lipoproteins to Cultured Fibroblasts Associated with Impaired Regulation of 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase Activity Michael S. Brown and Joseph L. Goldstein
University of Texas Southwestern Medical School, Dallas Proceedings of the National Academy of Science USA, 1974, Volume 71, pages 788792
Kontekst
Familijar na hiperkolesterolemija (FH) geneti~ka je bolest u kojoj pacijenti imaju jako povi{ene razine serumskoga kolesterola i rano tijekom ìvota doìvljavaju sr~ani udar. Michael Brown i Joseph Goldstein po~eli su svoja nastojanja da shvate tu bolest tijekom 1972. godine s idejom da je pretjerana proizvodnja kolesterola rezultat defekta kontrolnoga mehanizma koji normalno regulira sintezu kolesterola. U skladu s tom hipotezom, prona{li su da dodavanje LDL u medij za kultivaciju nor malnih humanih fibroblasta inhibira aktivnost enzima 3-hidroksi3-metilglutaril koenzim A-reduktaze (HMG-CoA-reduktaze), enzima koji ograni~ava brzinu biosinteze kolesterola. Suprotno, aktivnost HMG-CoA reduktaze nije smanjena ako se LDL dodaje stanicama FH-pacijenata, rezultiraju}i pretjeranom proizvodnjom kolesterola u FH-stanicama. Vjerojatno iznena|uju}e, daljnji su eksperimenti pokazali da ta abnormalnost u regulaciji HMG-CoA-reduktaze nije rezultat mutacije gena za HMGCoA-reduktazu. Naprotiv, abnormalna regulacija HMG-CoA-reduktaze slijedi iz nesposobnosti FH-stanica da ekstrahiraju kolesterol iz LDL. Tijekom 1974. godine, Brown i Goldstein pokazali su da je o{te}enje u FH-stanicama defekt u vezanju LDL na receptor na stani~noj povr{ini. Identifikacija LDL receptora izazvala je seriju probita~nih eksperimenata u kojima su Brown,
Goldstein i njihovi kolege obiljeìli put k receptorom posredovanoj endocitozi.
Eksperimenti
U svojemu radu iz 1974. godine, Brown i Goldstein objavili su rezultat eksperimenata u kojima su pratili vezanje radioaktivno obiljeènih ~estica LDL na fibroblaste nor malnih osoba ili FH-pacijenata. Mala koli~ina radioaktivnog LDL dodana je u medij za kultivaciju, a koli~ina radioaktivnosti vezane na stanice odre|ivana je nakon razli~itog vremena inkubacije
Normalna stanica 250 125ILDL vezan (ng/mg proteina) 200 150 100 50 0
(vidi slike). Pove}ana koli~ina LDL vezanoga na nor malne stanice u funkciji je s vremenom inkubacije. Va`no je re}i, da velika koli~ina dodanoga neradioaktivnog LDL smanjuje koli~inu vezanoga radioaktivnog, pokazuju}i da je vezanje rezultat specifi~ne interakcije LDL s odre|enim brojem mjesta na povr{ini stanice. Specifi~nost interakcije dodatno je pokazana nemogu}no{}u da se dodavanjem velike koli~ine drugih lipoproteina omete vezanje LDL. Suprotno tim rezultatima na nor malnim fibroblastima, stanice FH-pacijenata ne mogu specifi~no vezati radioaktivni LDL. Zato se ~inilo da nor malni fibroblasti imaju specifi~ni LDL-receptor koji je nedostajao ili bio defektan na FH-stanicama. Brown i Goldstein zaklju~ili su da je defekt vezanja LDL primije}en na FH stanicama vjerojatno primar ni gen-
FH stanica 250 125ILDL vezan (ng/mg proteina) 200 150 100 50 0
2 sati
2 sati
Vremenski tijek vezanja radioaktivnog LDL na normalne i FH stanice. Stanice su bile inkubirane s radioaktivnim 125 I LDL uz prisutnost (neispunjeni kruì}i) ili bez (ispunjeni kruì}i) dodatnoga neobiljeènog LDL. Stanice su potom sastrugane, a zatim je odre|ena koli~ina vezanoga radioaktivnog LDL. Rezultati su prikazani kao nanogrami LDL vezanoga po miligramu stani~nih proteina.
Stani~na povr{ina
513
ski defekt u ovoj bolesti te zbog toga LDL ne inhibira HMG-CoA-reduktazu {to rezultira pretjeranom produkcijom kolesterola. Daljnji su eksperimenti pokazali da se LDL koji se vezao na normalne fibroblaste nalazi u membranskoj frakciji stanica, pokazuju}i tako da je LDL-receptor protein stani~ne povr{ine.
Utjecaj
Nakon identifikacije LDL-receptora, Brown i Golstein pokazali su da se LDL vezan na stani~nu povr{inu brzo internalizira i razgra|uje do slobodnog kolesterola u lizosomima. Zatim su u suradnji s Richardom Andersonom utvrdili da se LDL-receptor inter nali-
zira uz pomo} endocitoze u obloènim jaìcama. Uz to su njihove rane studije pokazale da se LDL-receptor reciklira do stani~ne membrane po{to se ligand disocira u stanici. Tako su eksperimenti koji su zapo~eti s ciljem da se shvati regulacija biosinteze kolesterola doveli do razumijevanja najva`nijeg puta kojim eukariotska stanica inter nalizira specifi~ne makromolekule zapanjuju}i primjer na~ina na koji znanost i znanstvenici mogu napredovati u nepredvi|enom, ali uzbudljivom smjeru.
Michael Brown
Joseph Goldstein
specifi~ne receptore na stani~noj povr{ini koji su koncentrirani u klatrinom obloènim jaìcama, a koji se internaliziraju endocitozom. Kao {to je obja{njeno u sljede}em odlomku, receptor se zatim reciklira do stani~ne membrane dok se LDL prenosi do lizosoma, gdje se osloba|a kolesterol da bi ga stanica mogla koristiti. Klju~ni uvid u taj proces dolazi iz studije pacijenata s nasljednom bole{}u poznatom kao obiteljska hiperkolesterolemija. Pacijenti s tom bole{}u imaju jako visoke razine serumskog kolesterola i mladi doìvljavaju sr~ani udar. Brown i Goldstein otkrili su da stanice tih pacijenata nisu u stanju internalizirati LDL iz izvanstani~ne teku}ine, {to dovodi do akumulacije visokih razina kolesterola u cirkulaciji. Daljnji su eksperimenti pokazali da stanice normalnih pojedinaca imaju receptor za LDL, koji je koncentriran u obloènim jaìcama te da je obiteljska hiperkolesterolemija rezultat nasljedne mutacije LDL-receptora. Te su mutacije dvaju tipova. Stanice ve}ine pacijenata s obiteljskom hiperkolesterolemijom jednostavno ne uspijevaju vezati LDL, pokazuju}i da je specifi~ni receptor sa stani~ne povr{ine nu`da za prihva}anje LDL. Uz to je identificirano nekoliko pacijenata ~ije stanice veù LDL, ali ga ne mogu internalizirati. LDL-receptor ovih pacijenata ne uspijeva se koncentrirati u obloènim jaìcama, priskrbljuju}i tako direktne dokaze za sredi{nju ulogu obloènih jaìca u endocitozi potaknutoj receptorima. Mutacije koje sprje~avaju koncentriranje LDL-receptora u obloènim jaìcama doga|aju se unutar citoplazmatskog repa receptora i mogu biti sasvim neznatne poput promjene jednog tirozina u cistein (slika 12-39). Daljnje su studije definirale internalizacijski signal LDL-receptora kao niz od {est aminokiselina, uklju~uju}i jedan neophodni tirozin. Sli~ni internalizacijski signali, koji ~esto uklju~uju tirozinske ostatke, prona|eni su u citoplazmatskom repu drugih receptora koji se uzimaju putem klatrinom obloènih jaìca. Ti se internalizacijski signali veù na proteine adaptere, koji se zatim veù na klatrin na citoplazmatskoj strani membrane, sli~no na~inu na koji se oblikuju klatrinom obloène vezikule tijekom transporta lizosom-
514
Poglavlje 12
domena koja veè LDL
Lys Asn Trp N Arg internalizacijski signal Asn Asn Asp Phe Asn Pro Ile Ser Asn Ile Val mutacija Tyr Cys Cys His Thr Thr Glu Asp Glu Val Ile Lys Gln His Asn Gln Asp Gly Tyr Ser Leu Lys
N-vezani oligosaharidi O-vezani oligosaharidi
stani~na membrana
Asp Asp Glu Leu Ser Val Ala Val Met
Tyr Gln Arg Ser Pro
citoplazmatski rep
Slika 12-39. LDL-receptor.

LDL-receptor ima slijed od 700 izvanstani~nih aminokiselina, transmembransku a-uzvojnicu od 22 aminokiseline i citoplazmatski rep od 50 aminokiselina. 292 N-ter minalne aminokiseline ~ine domenu koja veè LDL. [est aminokiselina u citoplazmatskom repu odre|uje internalizacijski signal, u po~etku prepoznan poradi mutacije Tyr u Cys u slu~aju obiteljske hiperkolesterolemije kod koje je sprije~eno koncentriranje receptora u obloènoj jaìci.
skih hidrolaza od trans Golgijeve mreè (vidi sliku 9-33). Klatrin se zdruùje u ko{arastu strukturu koja uvija membranu, oblikuju}i invaginacijske jaìce (slika 12-40). Protein koji veè GTP nazvan dinamin, slaè se u prsten , oko vrata tih invaginacijskih jaìca, dovode}i kona~no do osloba|anja obloènih vezikula u unutra{njost stanice.
Slika 12-40. Oblikovanje klatrinom obloène jaìce.

(A) Protein adapter veè se na klatrin i internalizacijske signale izloène na citoplazmatskim repovima receptora. (B) Elektronskomikroskopska snimka klatrinom obloène jaìce koja prikazuje ko{arastu strukturu klatrinske mreè (B, dobrotom Johna E. Heusera, Washington University School of Medicine).
(B)
(A) ligand receptor
protein adapter
klatrin
0,1 mm
Stani~na povr{ina
515
(A)
(B)
0,1 mm
0,2 mm
Slika 12-41. Kaveole.
Endocitoza posredovana receptorima glavna je aktivnost stani~ne membrane eukariotskih stanica. Pokazalo se da se vi{e od 20 razli~itih receptora selektivno internaliziraju ovim putem. Kako pupaju od stani~ne membrane tako je u obloène vezikule uklju~ena i izvanstani~na teku}ina te stoga endocitoza posredovana receptorima kao rezultat ima, osim internalizacije specifi~nih makromolekula, i neselektivno uzimanje izvanstani~ne teku}ine i cijeloga njezina sadràja (endocitoza teku}e faze). Tipi~no je da obloène jaìce zauzimaju 1 do 2% povr{ine stani~ne membrane, a procjenjuje se da ìve 1 do 2 minute. Iz ovih brojki, svatko }e lagano izra~unati da receptorima potaknuta endocitoza dovodi do internalizacije podru~ja ekvivalentnoga stani~noj povr{ini cijele membrane otprilike svaka 2 sata. Razli~ite studije pokazuju da stanice imaju i put endocitoze neovisan o klatrinu. Primjerice, teku}ine i neke membranski vezane molekule nastavljaju se unositi endocitozom i u uvjetima eksperimenta kad je inhibirana endocitoza klatrinom obloènim jaìcama. Jedan od o klatrinu neovisnih putova obuhva}a uzimanje molekula kaveolama, malim invaginacijama membrane (promjera 50 do 80 nm) (slika 12-41). Osim toga, velike vezikule (promjera 0,15 do 5,0 mm) posreduju kod uzimanja teku}ina procesom poznatim kao makropinocitoza. Stoga, dok o klatrinu ovisna endocitoza o~ito osigurava glavni put za uzimanje kako teku}ina tako i specifi~nih makromolekula, stanice tako|er koriste i nekoliko o klatrinu neovisnih mehanizama.
Elektronskomikroskopska snimka kaveole. (A, dobrotom Johna E. Heusera, Washington University School of Medicine; B, dobrotom R. G.W. Andersona, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas).
Promet proteina u endocitozi

Nakon internalizacije, klatrinom obloène vezikule brzo gube svoj omota~ i stapaju se s ranim endosomima, koji su vezikule s cjevastim nastavkom smje{tene na periferiji stanice. U stapanju endocitoznih vezikula posreduju Rab proteini koji veù GTP njihovi efektori i komplementarni par trans, membranskih proteina vezikule i ciljne membrane (SNARE proteini) (vidi sliku 9-36). Rani endosomi sluè kao odjeljak za sortiranje, od kojega se molekule uzete endocitozom ili recikliraju prema stani~noj membrani ili transportiraju u lizosome za razgradnju. Osim toga, rani endosomi polariziranih stanica mogu prebacivati proteine uzete endocitozom izme|u raznih domena membrane primjerice, izme|u apikalne i bazolateralne domene epitelnih stanica. Va`no obilje`je ranih endosoma jest da im se u unutra{njosti odràva kiseli pH (oko 6,0 do 6,2) zahvaljuju}i radu membranske H+ crpke. Kiseli pH dovodi do disocijacije mnogih liganda od receptora unutar odjeljka ranog
516
Poglavlje 12
LDL-receptor LDL obloèna jaìca recikliranje prema stani~noj membrani
Slika 12-42. Sortiranje u ranome endosomu.

LDL vezan na svoj receptor internalizira se s pomo}u klatrinom-obloène vezikule, koja gubi svoj omota~ i stapa se s ranim endosomom. Uz kiseli pH ranoga endosoma, LDL disocira se od svojega receptora, a materijal unesen endocitozom sortira se za razlaganje u lizosomu ili reciklira prema stani~noj membrani. LDL se prebacuje iz ranoga u kasni endosom u velikoj vezikuli nosa~u koja se pomi~e du` mikrotubula. Zatim se transportne vezikule koje nose lizosomske hidrolaze iz Golgijeva aparata stapaju s kasnim endosomom i on sazrijeva do lizosoma u kojemu se razgra|uje LDL, a osloba|a kolesterol. Nasuprot tomu, LDL-receptor reciklira se od ranog endosoma do stani~ne membrane.
obloèna vezikula klatrin disocijacija od LDL-receptora rani endosom
mikrotubuli
vezikula nosa~
kasni endosom
Golgijev aparat
endosoma. Nakon ovog razvezivanja, receptori i njihovi ligandi mogu se transportirati na razli~ita unutarstani~na odredi{ta. Klasi~an primjer je LDL koji se disocira od svoga relizosom ceptora u ranom endosomu (slika 12-42). Receptor se zatim vra}a u stani~nu membranu s pomo}u transportne vezikule koja pupa od cjevastog produètka endosoma. Nasuprot tome, LDL se transportira (zaosloba|anje jedno s drugim topljivim sadràjem kolesterola endosoma) do lizosoma, gdje se njegovim razlaganjem osloba|a kolesterol. Recikliranje prema stani~noj membrani sudbina je membranskih proteina koji se unose endocitozom potaknutom receptorima kod mnogih receptora (poput LDL-receptora) koji se u membranu vra}aju nakon disocijacije od liganda u ranom endosomu. To stalno recikliranje receptora ima za posljedicu stalnu internalizaciju njihovih liganda. Primjerice, svaki LDL-receptor pro|e ovom kru`nom rutom od stani~ne membrane do endosoma i natrag pribli`no svakih 10 minuta. Va`nost recikliraju}eg puta nadalje se nagla{ava udjelom membranskog prometa koji proizlazi iz endocitoze. Kako je ve} spomenuto, receptorima posredovanom endocitozom internalizira se oko 50% stani~ne membrane svakoga sata, {to se mora nadomje{tati istom brzinom. Najve}i dio toga izmjenjivanja postiè se recikliranjem receptora; svega oko 5% stani~ne povr{ine novo je sintetizirano tijekom jednoga sata. Ligandi i membranski proteini namijenjeni razgradnji u lizosomima transportiraju se od ranoga endosoma do kasnoga koji je smje{ten u blizini jezgre (vidi sliku 12-42). U transportu od ranoga do kasnoga endosoma posreduje pokretanje velikih vezikula endocitoznih nosa~a du` mikrotubula. Kasni su endosomi kiseliji od ranih (pH od 5,5 do 6,0) i kao {to je obja{njeno u 9. poglavlju, mogu se stopiti s transportnim vezikulama koje nose kisele hidrolaze iz Golgijeva aparata. Nakon {to se nadopune lizosomskim enzimima i postanu jo{ kiseliji (pH oko 5), kasni endosomi sazrijevaju u lizoso-
Stani~na povr{ina
517
me. Unutar lizosoma, aktivno{}u kiselih hidrolaza, razgradi se endocitozom zahva}eni materijal. Mada se receptori (poput LDL-receptora) recikliraju do stani~ne membrane, ostali doìvljavaju druk~iju sudbinu. Neki se transportiraju do lizosoma i razgra|uju zajedno sa svojim ligandima. Primjerice, stani~ni receptori za nekoliko faktora rasta (obja{njenih u sljede}emu poglavlju) internaliziraju se nakon vezanja odgovaraju}ega faktora rasta i kona~no razgra|uju u lizosomu. Efekt toga procesa jest uklanjanje kompleksa receptor-ligand sa stani~ne membrane, okon~avaju}i time stani~ni odgovor na stimulaciju faktorom rasta fenomen poznat kao regulacijsko smanjenje broja receptora (engl. receptor down-regulation. Posebna vrsta recikliranja od endosoma igra va`nu ulogu u prijenosu ìv~anih podraàja preko sinapse (slika 12-43). Kako smo ve} objasnili u ovom poglavlju, pristizanje akcijskoga potencijala do aksonskoga zavr{etka ve}ine neurona signalizira fuziju sinapti~kih vezikula sa stani~nom membranom, osloba|aju}i neurotransmitor koji prenosi signal postsinapti~koj stanici. Prazne sinapti~ke vezikule zatim se obnavljaju sa stani~ne membrane u klatrinom obloènim vezikulama, koje se stapaju s ranim endosomima. Nakon toga sinapti~ke se vezikule regeneriraju direktnim pupanjem od endosoma. One akumuliraju novu koli~inu neurotransmitora i recikliraju se do membrane, spremne za sljede}i ciklus sinapti~ke transmisije. U polariziranim se stanicama (primjerice epitelnim) internalizirani receptori mogu prenositi kroz stanicu u suprotne domene stani~ne membrane proces zvan transcitoza. Primjerice, receptor koji se endocitozom preuzme iz bazolateralne domene membrane moè se sortirati u rani endosom za transport u apikalnu domenu. U nekim stanicama to je vaàn mehanizam za sortiranje proteina (slika 12-44). Umjesto da su sortirani za isporuku u apikalnu ili bazolateralnu domenu u trans Golgijevoj mreì (vidi sliku 929), proteini se prvo isporu~e u bazolateralnu membranu. Proteini namijenjeni apikalnoj membrani zatim se prebace na mjesto za transcitozu. Osim toga, transcitoza osigurava mehanizam za prebacivanje izvanstani~nih molekula preko omota~a epitelnih stanica. Primjerice, mnoge vrste epitelnih
Slika 12-43. Recikliranje sinapti~kih vezikula.

neurotransmitor 2. Membrana sinapti~ke vezikule nadokna|uje se endocitozom iz klatrinom obloènih jaìca.
1. Prispije}e ìv~anoga podraàja do aksonskoga kraja neurona okida fuziju sinapti~kih vezikula sa stani~nom membranom, osloba|aju}i neurotransmiter. 4. Sinapti~ke vezikule regeneriraju se pupanjem iz endosoma i nanovo pune neurotransmiterom iz citosola.
slobodni klatrin
3. Endocitozne vezikule stapaju se s ranim endosomom. rani endosom
518
Poglavlje 12
apikalna domena
Slika 12-44. Sortiranje proteina transcitozom.

Protein namijenjen apikalnoj domeni stani~ne membrane prvo se prebacuje iz Golgijeva aparata u bazolateralnu domenu. Zatim se endocitozom selektivno transportira iz ranoga endosoma u apikalnu domenu.
~vrsti spoj
endosom Golgijev aparat
membranski proteini
bazolateralna domena
stanica prebacuju protutijela iz krvi u najrazli~itije teku}ine za sekreciju, poput mlijeka. Protutijela se veù na receptor na bazolateralnoj povr{ini, a zatim se zajedno sa svojim receptorom transcitozom prebace na apikalnu povr{inu. Receptor se zatim kida, osloba|aju}i protutijelo u izvanstani~ni sekret.
Stani~na stijenka i izvanstani~ni matriks

gram-negativne
vanjska membrana stani~na stijenka unutarnja membrana citosol gram-pozitivne
Mada su stani~ne granice odre|ene stani~nom membranom, mnoge su stanice okruène neprobojnim slojem secerniranih molekula. Stanice bakterija, gljivica, algi i vi{ih biljaka okruène su krutom stani~nom stijenkom koja je sastavni dio stanice. Mada nisu zatvorene u stani~noj stijenci, animalne su stanice i tkiva ~vrsto zdruèni s izvanstani~nim matriksom koji se sastoji od proteina i polisaharida. Izvanstani~ni matriks ne samo da osigurava strukturnu potporu stanicama i tkivima, nego igra i va`nu ulogu u reguliranju stani~noga pona{anja u vi{estani~nim organizmima.
Bakterijska stani~na stijenka

Krute stani~ne stijenke bakterija odre|uju oblik stanice i sprje~avaju njezino pucanje zbog osmoti~koga pritiska. Bakterije se prema strukturi stijenke dijele u dvije velike skupine koje se mogu razlikovati prema bojenju poznatom kao Gramovo, a koje je razvio Christian Gram 1884. godine (slika 1245). Kako je ve} ranije obja{njeno u ovome poglavlju, gram-negativne bakterije (poput E. coli) imaju sustav dvostruke membrane, kod kojeg je unutarnja membrana okruèna propusnom vanjskom membranom. Te bakterije imaju tanke stani~ne stijenke koje se nalaze izme|u unutarnje i vanjske membrane. Nasuprot tomu, gram-pozitivne bakterije (poput Staphylococcus aureus, ~estog patogena u ljudi) imaju samo jednu membranu koja je okruèna mnogo debljom stijenkom. Unato~ tim strukturnim razlikama, glavna komponenta stani~ne stijenke i gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija je peptidoglikan (slika 12-46) koji se sastoji od linearnih polisaharidnih lanaca ukrièno povezanih kratkim peptidima. Zbog te umreène strukture, peptidoglikan oblikuje ~vrstu kovalentnu ljusku oko cijele bakterijske stijenke. Zanimljivo je da jedinstvena struktura njihove stani~ne stijenke ~ini bakterije osjetljivima na neke antibiotike. Primjerice, penicilin inhibira enzim zaduèn za oblikova-
stani~na stijenka stani~na membrana citosol
Slika 12-45. Stani~na stijenka bakterija.

Unutarnja membrana gram-negativnih bakterija okruèna je tankom stani~nom stijenkom koja se nalazi ispod vanjske membrane. Gram-pozitivne bakterije nemaju vanjsku membranu i imaju debelu stani~nu stijenku.
Stani~na povr{ina
519
NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAG NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAG NAM NAM NAG NAM NAG NAG
NAG CH2OH C NAM CH2 C O OH O NH OH O NH O C CH3 C OH O NH C O O NAM CH2OH O O NH C CH3 O OH C CH3 C O NAG CH2OH O O O O
NAG CH2OH C OH O NH C CH3 O H3C O O
CH C
ukrièno povezani tetrapeptidi O HC C
CH3
CH3 O
Slika 12-46. Peptidoglikan E. coli.
nje ukriènih veza izme|u razli~itih lanaca peptidoglikana, interferiraju}i tako sa sintezom stani~ne stijenke i blokiraju}i rast bakterija.
Stani~ne stijenke biljnih stanica

Za razliku od bakterija, glavni sastojci stani~nih stijenki eukariota (uklju~uju}i gljive, alge i vi{e biljke) su polisaharidi (slika 12-47). Osnovni strukturni polisaharid stani~ne stijenke gljiva je hitin (polimer od N-acetilglukozaminskih ostataka), koji tako|er oblikuje vanjski skelet artropoda (npr. lju{turu raka). Glavni sastojak stani~ne stijenke ve}ine algi i vi{ih biljaka je
Polisaharidni lanac sastoji se od naizmjeni~nih ostataka N-acetilglukozamina (NAG) i N-acetilmuraminske kiseline (NAM) povezanih b(14) glikozidnom vezom. Paralelni lanci ukrièno su povezani tetrapeptidom koji se veè na NAM ostatak. Aminokiselinski sastav tetrapeptida razlikuje se kod razli~itih sojeva bakterija.
520
Poglavlje 12
(A)
hitin CH2 O OH NH O C CH3 b (1 celuloza CH2OH O OH OH O CH2OH O OH OH 4) veza O O CH2OH O OH NH C CH3
Slika 12-47. Polisaharidi stani~ne stijenke gljiva i biljnih stanica.

(A) Hitin (glavni polisaharid stani~ne stijenke gljiva) linearni je polimer N-acetilglukozamina, dok je celuloza linearni polimer glukoze. Ugljikohidratni monomeri povezani su b(14) vezom, {to omogu}uje nastanak dugih, ravnih lanaca. (B) Paralelni lanci celuloze udruùju se u mikrofibrile.
celuloza, koja je ujedno najzastupljeniji polimer na zemlji. Celuloza je linearni polimer glukoze, a ~esto sadràva vi{e od 10.000 monomera glukoze. Ostatci glukoze vezani su b(14) vezom, {to omogu}uje oblikovanje dugih ravnih lanaca. Nekoliko desetaka takvih lanaca zdruùju se paralelno jedan s drugim i tvore celulozne mikrofibrile koje se proteù nekoliko mikrometara u duljinu. Unutar stani~ne stijenke celulozne su mikrofibrile uronjene u matriks od proteina i dva tipa polisaharida: hemiceluloze i pektina (slika 12-48). Hemiceluloza je visokorazgranani polisaharid koji je vodikovim vezama vezan na povr{inu celuloznih mikrofibrila. Ovo umreàva mikrofibrile u mreù ~vrstih, vlaknastih molekula koja je zaslu`na za mehani~ku ~vrsto}u stijenki biljnih stanica. Pektini su razgranani polisaharidi koji se sastoje od veli-
(B) mikrofibril (A) hemiceluloza celulozni lanci

O Glc O O O Xyl O Glc O O O Xyl O Glc O O O Xyl O O Gal O O Fuc O Glc O
pektin
COO COO COO O O O Rha GalA O GalA O GalA O O O OOC GalA O O
COO
COO
Rha O
O O O GalA O GalA O
(B)
hemiceluloza
celuloza
pektin
Slika 12-48. Model biljne stani~ne stijenke.

(A) Tipi~na struktura hemiceluloze (ksiloglikan) i pektina (ramnogalakturonan). Ksiloglikan ima kostur od ostataka glukoze (Glc) s bo~nim lancima od ksiloze (Xyl), galaktoze (Gal) i fukoze (Fuc). Osnova ramnogalakturonana sadràva galakturonsku kiselinu (GalA) i ramnozu (Rha), a na nju su tako|er vezani brojni bo~ni lanci. (B) Hemiceluloza se veè na povr{inu celuloznih mikrofibrila, oblikuju}i vlaknatu mreù koja je uronjena u èlatinozni matriks pektina.
Stani~na povr{ina
521
kog broja negativno nabijenih ostataka galakturonske kiseline. Zbog tih vi{estrukih negativnih naboja, pektini na sebe veù pozitivno nabijene ione (poput Ca2+) i love molekule vode oblikuju}i gel. înjenica da se dèm i èle prave dodavanjem pektina u vo}ni sok ilustracija je za ovo èliraju}e svojstvo. U stani~noj stijenci, pektini formiraju èlatinoznu mreù koja se u~vr{}uje ukriènim celuloznim mikrofibrilima. Osim toga, stani~ne stijenke sadràvaju najrazli~itije glikoproteine koji se ugra|uju u matriks i tako osiguravaju dodatno strukturno u~vr{}enje. Struktura i funkcija stani~nih stijenki mijenja se s razvojem biljne stanice. Stijenke rastu}e biljne stanice (nazvane primarnim stani~nim stijenkama) relativno su tanke i fleksibilne, {to omogu}uje stanici da se {iri. Jednom kad rast prestane, ~esto se polaù sekundarne stani~ne stijenke izme|u stani~ne membrane i primarne stani~ne stijenke (slika 12-49). Te sekundarne stani~ne stijenke koje su deblje i tvr|e od primarnih, posebno su va`ne kod tipova stanica odgovornih za provo|enje vode i osiguravanje mehani~ke ~vrsto}e biljke. Primarne i sekundarne stani~ne stijenke razlikuju se sastavom i debljinom. Primarne stani~ne stijenke sastoje se od podjednakih udjela celuloze, hemiceluloze i pektina. Suprotno tomu, tvr|im sekundarnim, obi~no nedostaje pektin, a imaju 50 do 80% celuloze. Mnoge su sekundarne stani~ne stijenke dodatno u~vr{}ene ligninom, kompleksnim polimerom od fenolnih ostataka najve}im dijelom odgovornim za ~vrsto}u i gusto}u drveta. Primarne i sekundarne stani~ne stijenke razlikuju se i po orijentaciji celuloznih mikrofibrila. Dok su celulozna vlakna primarnih stijenki nasumce raspore|ena, ona sekundarnih, pa`ljivo su ure|ena (vidi sliku 12-49). êsto se sekundarne stijenke polaù u slojevima u kojima se celulozna vlakna razlikuju prema orijentaciji, oblikuju}i tako slojevitu strukturu koja uvelike pove}ava ~vrsto}u stani~ne stijenke. Jedna od kriti~nih funkcija stani~nih stijenki biljaka prevencija je bubrenja stanice zbog osmoti~koga pritiska. Za razliku od animalnih stanica, biljne stanice ne odràvaju osmoti~ku ravnoteù izme|u citosola i izvanstani~nih teku}ina. Zato osmoti~ki pritisak stalno tjera vodu u stanicu. Biljna stanica podnosi to stalno utjecanje vode radi svojih tvrdih stani~nih stijenki koje sprje~avaju otjecanje i pucanje. Umjesto toga, unutarnji hidrostati~ki tlak (nazvan turgor) raste unutar stanice, kona~no uravnoteùju}i osmoti~ki tlak i sprje~avaju}i daljnje utjecanje vode. Turgor je odgovoran za najve}i dio tvrdo}e biljnih tkiva, {to je sasvim o~ito ako se osmotri dehidrirana, uvenula biljka. K tomu, turgor osigurava osnovu za oblik stani~noga rasta koji je jedinstven za biljke. Kona~no, biljne se stanice ~esto {ire uzimanjem vode bez sinteze novih komponenti citoplazme (slika 12-50). Biljni hormoni (auksini) signaliziraju {irenje stanica tim mehanizmom {to oslabljuje jedno podru~je stani~ne stijenke omogu}uju}i turgoru da dovede do {irenja stanice u tom smjeru. Dok se to doga|a, voda koja utje~e u stanicu akumulira se unutar velike centralne vakuole pa se stanica {iri bez pove}avanja volumena svoje citoplazme. Na taj se na~in stanica moè pove}ati 10 do 100 puta tijekom razvoja. Tek po~injemo shva}ati kako biljne stanice mijenjaju svoje stani~ne stijenke, ali mogu}e je da to uklju~uje transmembranske protein-kinaze nazvane stijenci pridruènim kinazama, za koje se misli da ulaze u interakciju sa specifi~nim proteinima ili pektinskim polisaharidima stani~nih stijenki. Kako se stanica pove}ava, izvan membrane se odlaù nove komponente stani~ne stijenke. Komponente matriksa, uklju~uju}i hemicelulozu i pektine, sintetiziraju se u Golgijevom aparatu i izlu~uju. Celuloza se, naprotiv, sintetizira s pomo}u enzimskoga membranskoga kompleksa (celuloza-sin-
primarna stijenka
sekundarna stijenka sloj 1 sloj 2 sloj 3
citoplazma
primarna stijenka
sekundarna stijenka
1 mm
0,2 mm
Slika 12-49. Primarne i sekundarne stani~ne stijenke.

Sekundar ne stani~ne stijenke polaù se izme|u primar ne stani~ne stijenke i stani~ne membrane. Sekundar ne se stijenke obi~no sastoje od triju slojeva, koji se razlikuju po orijentaciji svojih celuloznih mikrofibrila. Elektronskomikrografska snimka pokazuje celulozne mikrofibrile u primar nim i sekundarnim stani~nim stijenkama. (Primar na stijenka, dobrotom F. C. Stewarda; sekundarna stijenka, Biophoto Associates/Photo Researchers, Inc.).
522
Poglavlje 12
jezgra vakuola
O H2
H2O
jezgra
vakuole stani~na stijenka H2O
H2O
H 2O
H2O
O H2
citoplazma
tetaza). U stanicama koje rastu, novosintetizirane celulozne mikrofibrile odlaù se pod pravim kutom u odnosu na smjer produljivanja stanice orijentacija za koju se misli da igra va`nu ulogu u odre|ivanju smjera budu}e stani~ne ekspanzije (slika 12-51). Zanimljivo je da se celulozne mikrofibrile u rastu}im stani~nim stijenkama polaù paralelno s kortikalnim mikrotubulima koji su neposredno ispod stani~ne membrane. îni se da ovi mikrotubuli odre|uju orijentaciju novosintetiziranih celuloznih mikrofibrila, vjerojatno time {to odre|uju smjer kretanja kompleksa celuloza-sintetaze u membrani. Tako kortikalni mikrotubuli odre|uju smjer rasta stani~ne stijenke, koji zatim odre|uje smjer stani~ne ekspanzije te kona~no oblik cijele biljke. Stani~ne se stijenke razli~itih biljnih tkiva, poput listova, stabljika, korijenja i cvijeta, poglavito sastoje od celuloze, ali se razlikuju po sastavu matriksa i vjerojatno organizaciji celuloznih fibrila. Postoji najmanje 10 razli~itih enzima celuloza-sintetaza, a svaki se enzimski kompleks sastoji od dvaju razli~itih oblika, {to je vjerojatno zaslu`no za razli~itu organizaciju stani~nih stijenki u razli~itim tkivima.
Slika 12-50. Ekspanzija biljne stanice.

Pritisak turgora tjera ekspanziju biljne stanice s pomo}u uzimanja vode koja se akumulira u velikoj centralnoj vakuoli.
Izvanstani~ni matriks
Mada ìvotinjske stanice nisu okruène stani~nom stijenkom, mnoge su stanice u tkivima vi{estani~nih organizama uronjene u izvanstani~ni matriks koji se sastoji od secerniranih proteina i polisaharida. Izvanstani~ni matriks ispunjava prostor izme|u stanica i povezuje stanice u tkivo. Jedan primjer izvanstani~noga matriksa je tanka, pokriva~u nalik bazalna lamina, (prije zvana bazalnom membranom, a na koju su sloèni slojevi epitelnih stanica (slika 12-52). Uz to {to podupire slojeve epitelnih stanica, bazalna lamina okruùje mi{i}ne stanice, masne stanice i periferne ìvce. Izvanstani~ni matriks je, unato~ svemu, najobilniji u vezivnome tkivu. Primjerice, rahlo vezivno tkivo ispod slojeva epitelnih stanica uglavnom se sastoji od izvanstani~nog matriksa u kojemu su raspore|eni fibroblasti. Druge vrste vezivnoga tkiva, poput kostiju, tetiva i hrskavice, sli~no se sastoje uglavnom od izvanstani~noga matriksa, koji je u osnovi odgovoran za njihovu strukturu i funkciju.
membrana
celuloza-sintetaza
mikrotubuli
celulozni mikrofibrili smjer stani~ne ekspanzije
Slika 12-51. Sinteza celuloze za vrijeme produljivanja stanice.

Nove celulozne mikrofibrile, koje sintetizira kompleks enzima (celuloza-sintetaze) u stani~noj membrani, polaù se pod pravim kutom u odnosu na smjer produljivanja stanice. Smjer sinteze celuloze paralelan je s mikrotubulima ispod membrane.
Stani~na povr{ina
523
Slika 12-52. Primjeri izvanstani~noga matriksa.

Slojevi epitelnih stanica leè na tankom sloju izvanstani~noga matriksa koji se naziva bazalna lamina. Ispod bazalne lamine je rahlo vezivno tkivo koje se uglavnom sastoji od izvanstani~noga matriksa {to ga izlu~uju fibroblasti. Izvanstani~ni matriks sadràva vlaknaste strukturne proteine uronjene u èlatinoznu polisaharidnu temeljnu tvar.
bazalna lamina
slojevi epitela
Izvanstani~ni matriks ~ine vlaknasti proteini uronjeni u èlatinoznu polisaharidnu temeljnu tvar dizajn temeljno isti kao kod stijenki biljnih stanica. Uz vlaknaste strukturne proteine i polisaharide, izvanstani~ni matriks sadràva adhezijske proteine koji povezuju komponente matriksa kako jedne s drugima tako i s pridruènim stanicama. Razlike izme|u razli~itih tipova izvanstani~noga matriksa proizlaze iz varijacija na istu osnovnu temu. Primjerice, tetive sadràvaju visoki postotak fibroznih proteina, dok hrskavice imaju visoki postotak polisaharida koji tvore ~vrsti gel otporan na kompresiju. Depozicijom kristala kalcijeva fosfata u kostima otvrdne izvanstani~ni matriks. Struktura bazalne lamine sli~na pokriva~u tako|er je rezultat uporabe komponenti matriksa koje se razlikuju od onih koje nalazimo u vezivnome tkivu. Glavni strukturni protein izvanstani~noga matriksa je kolagen, koji je pojedina~no najzastupljeniji protein animalnih tkiva. Kolageni su velika obitelj proteina, koja se sastoji od najmanje 19 ~lanova. Karakterizira ih sposobnost stvaranja trostrukih uzvojnica u kojima su tri polipeptidna lanca ~vrsto zamotani jedan oko drugoga u strukturu nalik na uè (slika 12-53). Domene trostrukih uzvojnica sastoje se od ponavljaju}eg slijeda aminokiselina Gly-X-Y. Kako bi se polipeptidni lanci ~vrsto sljubili jedan uz drugoga da bi formirali trostruku uzvojnicu, nuàn je glicin (najmanja aminokiselina, s bo~nim lancem od samo jednog vodika) na svakom tre}em poloàju. Prolin ~esto dolazi na X poloàju, a hidroksiprolin na Y poloàju; te aminokiseline stabiliziraju konformaciju uzvojnice od polipeptidnih lanaca radi njihove prstenaste strukture.
krvne kapilare
fibroblasti vlaknasti proteini temeljna tvar
(A) trostruka uzvojnica kolagena
Slika 12-53. Struktura kolagena.

(A) Tri polipeptidna lanca zamotana jedan oko drugoga u karakteristi~nu strukturu trostruke uzvojnice. (B) Niz aminokiselina unutar domene trostruke uzvojnice sastoji se od Gly-X-Y, uz to je X naj~e{}e prolin, a Y hidroksiprolin (Hyp).
(B) slijed aminokiselina

Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Pro Hyp Gly Pro Hyp Gly Ala Hyp Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Hyp
Pro
Pro
Gly Hyp
Gly Hyp
rahlo vezivno tkivo
524
Poglavlje 12
prolin N H2C
H C
O C
Tablica 12-2. Predstavnici obitelji

Klasa kolagena
oni koji oblikuju vlakna
CH2 CH2 prolil-hidroksilaza O C
Tip
I II III V XI IX XII XIV XVI IV VII
Tkivna distribucija
ve}ina vezivnoga tkiva hrskavica i staklovina oka rastegljiva vezivna tkiva (npr. koà i plu}a) tkiva koja sadràvaju kolagen I tkiva koja sadràvaju kolagen II tkiva koja sadràvaju kolagen II tkiva koja sadràvaju kolagen I tkiva koja sadràvaju kolagen I mnoga tkiva bazalne lamine u~vr{}ivanje bazalne lamine za podlogu od vezivnoga tkiva
N H2C hidroksiprolin
H C
vlaknima-pridruèni
CH2 CH OH oni koji oblikuju mreè sidri{ne niti
Slika 12-54. Sinteza hidroksiprolina.

Prolilhidroksilaza pretvara prolinske ostatke kolagena u hidroksiprolin.
(A) razmak ukrièna veza
trostruka uzvojnica kolagena
(B)
Neuobi~ajena aminokiselina hidroksiprolin sintetizira se u endoplazmatskom retikulu modifikacijom prolinskih ostataka koji su ve} ugra|eni u polipeptidne lance kolagena (slika 12-54). Lizinski ostatci kolagena tako|er se ~esto prevode u hidroksilizin. Smatra se da hidroksilne skupine tih modificiranih aminokiselina stabiliziraju trostruku uzvojnicu kolagena stvaranjem vodikovih veza izme|u polipeptidnih lanaca. Te se aminokiseline rijetko nalaze u drugim proteinima, mada je hidroksiprolin ~est u glikoproteinima biljnih stani~nih stijenki. Najobilnije zastupljeni tip kolagena (tip I kolagen) je onaj {to oblikuje vlakna koja su osnovna strukturna komponenta vezivnih tkiva (tabl. 12-2). Polipeptidni lanci tih kolagena sastoje se od oko tisu}u aminokiselina ili 330 Gly-X-Y ponovljenih slijedova. Nakon {to se secerniraju iz stanice, slaù se u kolagena vlakanca u kojima su molekule trostrukih uzvojnica zdruène u pravilne redove s razmakom (slika 12-55). Ta se vlakanca ne oblikuju unutar stanice, jer se kolagen koji tvori vlakna sintetizira kao topljiva prete~a (prokolagen) koja na oba kraja polipeptidnog lanca ima segment bez uzvojnice. Prokolagen se kida do kolagena nakon sekrecije pa se zato slaganje vlakna doga|a samo izvan stanice. Zdruìvanje kolagenih molekula u vlakanca dalje je potkrijepljeno oblikovanjem kovalentnih ukriènih veza izme|u bo~nih ostataka lizina i hidroksilizina. êsto se vlakanca dalje udruùju jedna s drugima i oblikuju kolagena vlakna, koja mogu biti nekoliko mikrometara u promjeru. Neki drugi tipovi kolagena ne oblikuju vlakna, ali igraju va`nu ulogu u razli~itim vrstama izvanstani~noga matriksa. Uz kolagen koji oblikuje vlakna, vezivno tkivo sadràva i vlaknima pridruèni kolagen, koji se veè na povr{inu vlakna i povezuje ih kako jedne s drugima tako i s drugim komponentama matriksa. Bazalna lamina oblikuje se od drugoga tipa kolagena
Slika 12-55. Kolagenska vlakna.

(A) Kolagene molekule udruùju se u pravilne redove s razmakom. Molekule se preklapaju jednom ~etvrtinom svoje duljine, a izme|u N-terminalnog kraja jedne molekule i C-terminalnog kraja sljede}e mali je razmak. Zdruìvanje je potkrijepljeno ukriènim vezama izme|u bo~nih ostataka lizina i hidroksilizina, poglavito na krajevima molekula. (B) Elektronskomikroskopska snimka kolagenskih vlakana. Slaganje molekula jednih na druge i mali razmaci izme|u njih vide se kao karakteristi~ne pruge na vlaknima. (B, J. Gross, F. O. Sahmitt i D. Fawcett/ Visuals Unlimited.)
1 mm
Stani~na povr{ina
525
Slika 12-56. Kolagen tipa IV.

(A) Ponavljaju}a struktura Gly-X-Y kolagena tipa IV (ùto) prekinuta je s vi{e sljedova koji ne oblikuju uzvojnicu (crtica). (B) Elektronskomikroskopska snimka mreè kolagena tipa IV. (B, P D. Yurchenco i J.C. Schittny, 1990. FASEB J. 4: 1577.) .
(A)
domena trostruke uzvojnice
domena bez uzvojnice
(kolagen tipa IV), koji pripada skupini onih koji stvaraju mreè (slika 1256). Ponavljanja Gly-X-Y u ovome kolagenu ~esto su prekinuta kratkim sekvencijama koje ne oblikuju uzvojnice. Zbog tih prekida, kolagen koji oblikuje mreè fleksibilniji je od kolagena koji oblikuje vlakna. Posljedica toga je zdruìvanje u dvodimenzionalne ukriène mreè umjesto u vlakna. Jo{ jedan drugi tip kolagena oblikuje sidri{na vlakna koja povezuju neke bazalne lamine s vezivnim tkivom ispod njih. Vezivno tkivo tako|er sadràva elasti~na vlakna koja su posebno obilna u organima koji se obi~no razvla~e i zatim vra}aju u izvorni oblik. Primjerice, plu}a se razvuku svaki put kad udahnemo i zatim se vrate u prethodni oblik kad izdahnemo. Elasti~na vlakna uglavnom se sastoje od proteina koji se zove elastin, a ukrièno je povezan u mreù kovalentnim vezama pobo~nih lanaca lizinskih ostataka (jednakim onima koje nalazimo u kolagenu). Ta mreà ukrièno povezanih elastinskih lanaca pona{a se poput elasti~ne trake, rasteù}i se pod pritiskom i zatim se vra}aju}i kad pritisak popusti. Vlaknasti strukturni proteini izvanstani~noga matriksa uronjeni su u gel od polisaharida koji se zovu glukozaminoglikani ili GAG-ovi, a koje ~ine ponavljanja jedinica disaharida (slika 12-57). Jedan {e}er tih disaharida je ili N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin, dok je drugi obi~no kiseo (ili glukuronska ili iduronska kiselina). S izuzetkom hijaluronana, ti se {e}eri modificiraju dodavanjem sulfatnih skupina. Kao rezultat toga, GAG-ovi su relativno jako negativno nabijeni. Ba{ kao i pektini biljnih stani~nih stijenki, oni veù pozitivno nabijene ione i love molekule vode da bi oblikovali
prekid ponavljaju}ega niza Gly-X-Y
domena bez uzvojnice
(B)
200 nm
glukuronska kiselina COO H O H OH H H OH O H
N-acetilglukozamin CH2OH H HO H O H H H O
iduronska kiselina H H O COO OH H H OH O H
N-acetilgalaktozamin
O S 3
CH2OH O H H H H O
Slika 12-57. Glavni tipovi glikoza aminoglikana.

Glikozaminoglikani sastoje se od ponavljaju}ih disaharidnih jedinica. S izuzetkom hijaluronata, {e}eri ~esto imaju sulfatne skupine. Heparan-sulfat sli~an je heparinu, osim {to heparin ima manje sulfatnih skupina.
O H
NHCOCH3
NHCOCH3
hijaluronan
dermatan-sulfat iduronska kiselina N-acetilglukozamin CH2O SO3 O COO OH H H H O H O H OH H H H O
glukuronska kiselina COO O H OH H H OH O H
N-acetilglukozamin CH2O SO3 HO H H O H H H O HO H
galaktoza CH2OH O H H H OH H O
N-acetilglukozamin CH2O SO3 H O H OH H H O H H
O SO3
NH SO3
NHCOCH3
NHCOCH3
kondroitinsulfat
keratan-sulfat
heparin (heparan-sulfat)
526
Poglavlje 12
kondroitinsulfat
sr`ni protein
Slika 12-58. Kompleks agrekana i hijaluronana.

Agrekan je veliki proteoglikan koji se sastoji od vi{e od 100 lanaca kondroitinsulfata vezanih na sredi{nji protein. Vi{e molekula agrekana veè se na duga~ki lanac hijaluronana, oblikuju}i veliki kompleks u izvanstani~nom matriksu hrskavice. Ta je veza stabilizirana vezuju}im proteinima.
agrekan
hijaluronan
C S C S S S
hidrirane gelove, osiguravaju}i mehani~ku potporu izvanstani~nomu matriksu. Hijaluronan je jedini GAG koji dolazi u obliku jednostrukoga poagrekan lisaharidnog lanca. Svi ostali GAG vezani su za proteine i oblikuju proteoglikane, koji se po masi sastoje i od vi{e od 95% polisaharivezni protein da. Proteoglikani mogu sadràvati samo jedan ili vi{e od stotinu GAG-lanaca vezanih na serinske ostatke sr`noga proteina. Identificirani su razli~iti sr`ni proteini (u podru~ju od 10 do >500 kd) pa su proteoglikani raznolika skupina makromolekula. Osim {to su komponente izvanstani~noga matriksa, neki su proteoglikani proteini stani~ne povr{ine koji sudjeluju u stani~noj adheziji. Neki od tih proteoglikana, sindekani, imaju transmembransku domenu i zajedno s integrinima sudjeluju u signalizaciji preko adhezijskih kompleksa. Veliki broj proteoglikana ulazi u interakciju s hijaluronanom i oblikuje velike komplekse u izvanstani~nome matriksu. Dobro opisan primjer je agrekan, glavni proteoglikan hrskavice (slika 12-58). Na sr`ni protein od oko 250 kd vezano je vi{e od stotinu lanaca kondroitinsulfata, oblikuju}i proteoglikan od oko 3.000 kd. Vi{e molekula agrekana veè se zatim s lancima hijaluronana, oblikuju}i velike agregate (> 100.000 kd) koji se uhvate u mreù kolagena. Proteoglikani tako|er ulaze u interakciju s kolagenom i drugim proteinima matriksa oblikuju}i èlatinozne mreè u koje su uronjeni vlaknasti strukturni proteini izvanstani~noga matriksa. Primjerice, perlekan (glavni heparansulfatni proteoglikan bazalne lamine) veè se za kolagen tipa IV i adhezijski protein laminin, {to }emo uskoro objasniti. Adhezijski proteini, tre}a skupina komponenti izvanstani~noga matriksa, odgovorni su za povezivanje komponenti matriksa, kako jednih za druge, tako i sa stanicom. Prototip tih molekula je fibronektin, glavni adhezijski protein vezivnoga tkiva. Fibronektin je dimerni glikoprotein koji se sastoji od dvaju polipeptidnih lanaca, svakog od oko 2.500 aminokiselina (slika 12-59). U izvanstani~nom matriksu fibronektin se dalje ukrièno veè u vlakna disulfidnim vezama. Fibronektin ima vezna mjesta i za kolagen i za GAG pa tako me|usobno povezuje te komponente matriksa. Odre|eno mjesto na molekuli fibronektina prepoznaje receptor na povr{ini stanice pa je stoga fibronektin odgovoran za vezanje stanice na izvanstani~ni matriks. Bazalna lamina sadràva odre|ene adhezijske proteine lamininske porodice (slika 12-60). Ba{ kao i kolagen tipa IV, laminini se mogu samoudruìvati u mreàste polimere. Te su lamininske mreè glavni strukturni sastojak N bazalne lamine sintetiziran u ranim embrijima, koji jo{ nemaju kolagen. Laminini imaju i vezna mjesta za receptore stani~ne povr{ine, kolagen tipa IV
N vezanje s proteoglikanom vezanje na stanicu
Slika 12-59. Struktura fibronektina.

vezanje na kolagen
Fibronektin je dimer dvaju sli~nih polipeptidnih lanaca povezanih disulfidnom vezom u blizini C-terminalnog kraja. Ozna~ena su mjesta vezanja na proteoglikane, stanice i kolagen. Molekula ima i dodatna mjesta vezanja koja nisu prikazana.
Stani~na povr{ina
527
lanac A
Slika 12-60. Struktura laminina.

Laminin sadràva tri polipeptidna lanca ozna~ena kao A, B1 i B2. Ozna~ena su i neka mjesta vezanja entaktina, kolagena tipa IV, proteoglikana i receptora stani~ne povr{ine.
lanac B1
lanac B2
vezno mjesto kolagena stani~no vezanje
vezno mjesto entaktina
stani~no vezanje
vezanje proteoglikana
i perlekan. Uz to se laminini ~vrsto veù s drugim adhezijskim proteinom, zvanim entaktin ili nidogen, koji se veè i za kolagen tipa IV. Kao rezultat tih vi{estrukih interakcija, laminin, entaktin, kolagen tipa IV i perlekan ~ine ukrièno povezanu mreù unutar bazalne lamine. Integrini su glavni receptori stani~ne povr{ine koji su odgovorni za povezivanje stanice s izvanstani~nim matriksom. Integrini su obitelj transmembranskih proteina koji se sastoje od dviju podjedinica, ozna~enih kao a i b (slika 12-61). Do danas je identificirano vi{e od 20 razli~itih integrina, koji se oblikuju od 18 poznatih a-podjedinica i 8 poznatih b-podjedinica. Integrini se veù na kratki slijed aminokiselina koji se pojavljuje na mnogim komponentama izvanstani~noga matriksa, uklju~uju}i kolagen, fibronektin i laminin. Prvi takav slijed koji veè integrine bio je Arg-Gly-Asp koji prepoznaje nekoliko ~lanova integrinske obitelji. Drugi se integrini, naprotiv, veù na odre|ene peptidne sljedove uklju~uju}i prepoznavaju}e sljedove na kolagenima i lamininima. Transmembranski proteoglikani na povr{ini razli~itih stanica veù se tako|er na komponente izvanstani~noga matriksa i moduliraju interakciju stanice i matriksa. Osim {to povezuju stanicu i izvanstani~ni matriks, integrini sluè kao sidro za citoskelet (slika 12-62). To povezivanje citoskeleta i izvanstani~nog matriksa odgovorno je za stabilnost spoja stanica-matriks. Do interakcija izme|u integrina i citoskeleta dolazi na dva tipa spojeva stanica-matriks, fokalnim adhezijama i hemidezmosomima, o kojima smo raspravljali u 11. poglavlju. Fokalnim adhezijama pri~vr{}uju se mnoge stanice za izvanstani~ni matriks, uklju~uju}i fibroblaste. Citoplazmatska domena b-podjedinice integrina na tim spojevima stanica-matriks usidruje aktinski citoskelet,
iznutra
iz
Mg2+
Slika 12-61. Struktura integrina.

Integrini su heterodimeri dviju transmembranskih podjedinica, ozna~eni kao a i b. Podjedinica a veè divalentne katione (Mg2+). Vezno mjesto matriksa ~ine dijelovi obiju podjedinica.
vezno mjesto matriksa
528
Poglavlje 12
Slika 12-62. Spoj izme|u stanice i izvanstani~noga matriksa

Integrini podràvaju dva tipa stabilnih spojeva u kojima je citoskelet vezan s izvanstani~nim matriksom. U fokalnim adhezijama, snopi}i aktinskih vlakana usidreni su na b-podjedinice ve}ine integrina kroz zdruìvanje s mnogim drugim proteinima, uklju~uju}i a-aktinin, talin i vinkulin (vidi sliku 11-14). U hemidezmosomima a6b4 integrin povezuje bazalnu laminu s intermedijarnim vlaknima preko plektina.
fokalna adhezija hemidezmosom intermedijarna vlakna
aktinska vlakna
plektin
usidruju}i se sa snopi}ima aktinskih vlakana preko proteina koji veù aktin poput talina i vinkulina. Hemidezmosomi su specijalizirana dodirna mjesta epitelnih stanica na kojima specifi~ni integrini (ozna~eni kao a6b4) preko plektina ulaze u interakciju s intermedijarnim vlaknima umjesto s aktinom. Integrin a6b4 veè se na laminin pa tako hemidezmosomi sidri epitelnu stanicu za bazalnu membranu.
Me|ustani~ne interakcije
Izravna interakcija me|u stanicama, kao i izme|u stanica i izvanstani~nog matriksa, kriti~na je za razvoj i funkciju vi{estani~noga organizma. Neke su me|ustani~ne interakcije prolazne, poput interakcija izme|u stanica imunosustava i interakcija koje usmjeruju bijele krvne stanice na mjesto upale u tkivu. U drugim slu~ajevima, stabilne me|ustani~ne veze igraju klju~nu ulogu pri organizaciji stanica u tkiva. Primjerice, nekoliko je razli~itih tipova stabilnih me|ustani~nih spojeva kriti~no za odràvanje i funkciju slojeva epitelnih stanica. Biljne se stanice tako|er udruùju sa susjednima ne samo kroz interakciju izme|u stani~nih stijenki, ve} i kroz specijalne veze izme|u svojih membrana.
Proteini stani~ne adhezije

Me|ustani~na adhezija selektivan je proces, tako da stanica prilijeè samo uz stanicu specifi~nog tipa. Ta je selektivnost prvi put pokazana u klasi~nim studijama embrionalnoga razvoja, koje su pokazale da stanice iz jednoga tkiva (npr. jetre) specifi~no prilijeù uz stanice istoga tkiva prije nego uz stanice razli~itog tkiva (npr. mozga). U toj selektivnoj me|ustani~noj adheziji posreduju transmembranski proteini nazvani molekule stani~ne adhezije, koje moèmo podijeliti u ~etiri velike skupine: selektini, integrini, imunoglobulinska (Ig) superporodica (tako nazvana zato {to ima strukturne domene sli~ne onima na imunoglobulinima) i kadherini (tabl. 12-3). Stani~na adhezija posredovana selektinima, integrinima i kadherinima iziskuje Ca2+ ili Mg+ pa su mnoge adhezijske interakcije me|u stanicama ovisne o Ca2+ ili Mg 2+.
Stani~na povr{ina
529
Tablica 12-3. Molekule stani~ne adhezije

Obitelj
selektini integrini Ig superporodica kadherini
Ligand kojeg prepoznaju

ugljikohidrati izvanstani~ni matriks ~lanovi Ig superporodica integrini homofilne interakcije homofilne interakcije
Stabilni stani~ni spoj

niti jedan fokalne adhezije ili hemidezmosomi niti jedan niti jedan niti jedan adhezijski spojevi i dezmosomi
Selektini posreduju u prolaznim interakcijama izme|u leukocita i endotelnih stanica ili krvnih plo~ica. Postoje tri ~lana selektinske obitelji: L-selektin, koji je eksprimiran na leukocitima, E-selektin eksprimiran na endotelnim stanicama i P-selektin eksprimiran na krvnim plo~icama. Kao {to smo to ve} objasnili u ovome poglavlju, selektini prepoznaju ugljikohidrate na stani~noj povr{ini (vidi sliku 12-14). Jedna od njihovih kriti~nih uloga je inicijacija interakcije izme|u leukocita i endotelnih stanica tijekom migracije leukocita iz cirkulacije do mjesta upale u tkivu (slika 12-63). Selektini posreduju u inicijalnoj adheziji leukocita na endotelne stanice. Nakon toga slijedi stabilnija adhezija, kod koje se integrini na povr{ini leukocita veù na me|ustani~ne adhezijske molekule (engl. intercellular adhesion molecules ICAMs), koje su ~lanovi Ig superporodice eksprimirane na povr{ini endotelnih stanica. Dobro pri~vr{}eni leukociti zatim su u stanju penetrirati kroz stijenku kapilare i u}i u tkivo ispod nje migriraju}i izme|u endotelnih stanica. Vezivanje ICAM na integrine primjer je heterofilne interakcije, u kojoj adhezijska molekula na povr{ini jedne stanice (npr. neki ICAM) prepoznaje druk~iju molekulu na povr{ini druge stanice (npr. neki integrin). Drugi ~lanovi Ig superporodice posreduju u homofilnim interakcijama, kod kojih neka adhezijska molekula na povr{ini jedne stanice veè istu takvu molekulu na povr{ini druge stanice. Takvo homofilno vezanje dovodi do selektivne adhezije izme|u stanica istog tipa. Primjerice, neuronske stani~ne ad-
leukocit
leukocit
Slika 12-63. Adhezija izme|u leukocita i endotelnih stanica.

Leukociti napu{taju cirkulaciju na mjestu upale u tkivu djeluju}i me|usobno s endotelnim stanicama kapilarne stijenke. Prvi korak u toj interakciji je vezanje selektina leukocita na ugljikohidratne ligande stani~ne povr{ine endotela. Nakon toga koraka slijedi stabilnija interakcija izme|u leukocitnih integrina i ~lanova Ig superporodice (ICAM) na endotelnim stanicama.
selektin ugljikohidrat
integrin ICAM
endotelna stanica
530
Poglavlje 12
Slika 12-64. Stabilne me|ustani~ne veze posredovane kadherinima.

Homofilne interakcije izme|u kadherina posreduju u dvama tipovima stabilnih me|ustani~nih veza. U adhezivnim spojevima, kadherini su povezani sa snopi}ima aktinskih vlakana preko katenina (vidi sliku 11-15). U dezmosomima, dezmoplakin povezuje ~lanove kadherinske superporodice (dezmogleini i dezmokolini) s inter medijar nim vlaknima (vidi sliku 11-36).
hezijske molekule (engl. neural cell adhesion molecules N-CAMs) ~lanovi su Ig superporodice eksprimirani na ìv~anim stanicama, a homofilno vezanje izme|u N-CAM pridonosi oblikovanju selektivnih veza izme|u ìv~anih stanica tijekom razvoja. Postoji vi{e od 100 ~lanova Ig superporodice koji posreduju u razli~itim me|ustani~nim interakcijama. êtvrta grupa stani~nih adhezijskih molekula, kadherini, tako|er pokazuju specifi~no homofilno vezanje. Oni su uklju~eni u selektivnu adheziju izme|u embrionalnih stanica, oblikovanje specifi~nih sinapsi u ìv~anome sustavu te su proteini primarno odgovorni za stvaranje stabilnih spojeva izme|u stanica u tkivu. Kadherini su velika porodica proteina (oko 80 ~lanova) koja dijeli zajedni~ku izvanstani~nu domenu zaduènu za homofilne interakcije. Postoji nekoliko potporodica kadherina (klasi~ni-kadherini, mastima-sli~ni kadherini, kadherini sa sedam transmembranskih domena), a me|usobno se razlikuju kako u transmembranskoj tako i u citosolnoj domeni. Klasi~ni kadherini imaju jednu transmembransku domenu i usidreni su za citoskelet interakcijom citosolne domene s b-kateninom ili dezmoplakinom (slika 12-64). Drugi dio citosolne domene veè GTP izmjenjuju}i faktor koji regulira male proteine koji veù GTP iz Rho porodice, koja kontrolira oblikovanje i stabilnost me|ustani~noga kontakta. Primjerice, E-kadherin eksprimiran je na epitelnim stanicama pa homofilne interakcije izme|u E-kadherina dovode do selektivne adhezije epitelnih stanica jednih za druge. Va`no je napomenuti da gubitak E-kadherina moè dovesti do razvoja karcinoma epitelnih stanica, ilustriraju}i va`nost me|ustani~ne interakcije u kontroli stani~noga pona{anja. Drugi ~lanovi kadherinske porodice, poput N-kadherina (neuralni kadherin) i P-kadherina (placentalni kadherin) posreduju u selektivnoj adheziji drugih tipova stanica. Za razliku od stabilnih spojeva stanice s molekulama izvanstani~nog prostora obrazloènih u prethodnim odlomcima, me|ustani~ne interakcije posredovane selektinima, integrinima i ~lanovima Ig-superporodice prolazni su spojevi u kojima citoskelet susjednih stanica nije povezan jedan s drugim. Stabilni adhezijski spojevi koji uklju~uju citoskelet susjedne stanice posredovani su kadherinima. Kako je obja{njeno u 11. poglavlju, ti me|ustani~ni spojevi mogu biti dvaju tipova: adherentni spojevi i dezmosomi, u kojima su kadherini ili srodni proteini (dezmogleini i dezmokolini) povezani s aktinskim sve`nji}ima i intermedijarnim vlaknima (vidi sliku 12-64). Uloga kadherina u povezivanju citoskeleta susjednih stanica analogna je
dezmosom
adhezijski spoj izvan stanice
ktinska vlakna
katenini
stani~na membrana kadherin intermedijarna vlakna kadherini (dezmoglein i dezmokolini) spona dezmoplakin
Stani~na povr{ina
531
onoj integrina u oblikovanju stabilnih spojeva izme|u stanica i izvanstani~noga matriksa.
^vrsti spojevi
Kao dodatak adhezijskim spojevima u kojima posreduju kadherini, dva druga tipa specijaliziranih me|ustani~nih spojeva igraju klju~nu ulogu u animalnim tkivima. ^vrsti spojevi, koji su obi~no udruèni s adherentnim spojevima i dezmosomima u spojnom kompleksu (slika 12-65) od presudne su va`nosti za funkciju slojeva epitelnih stanica kao zapreka izme|u teku}ih odjeljaka. Primjerice, epitel crijeva odjeljuje lumen crijeva od vezivnoga tkiva ispod njega koje sadràva krvne kapilare. ^vrsti spojevi igraju dvije uloge u omogu}ivanju epitelu da ispuni funkciju brane. Prvo, ~vrsti spoj oblikuje brtvu koja onemogu}uje slobodan prolazak molekula (uklju~uju}i i ione) izme|u stanica epitelnoga pokrova. Drugo, ~vrsti spojevi odjeljuju apikalnu i bazolateralnu domenu stani~ne membrane tako da onemogu}uju slobodnu difuziju lipida i membranskih proteina izme|u njih. Posljedica toga je da specijalni transportni sustav u apikalnoj i bazolateralnoj domeni moè kontrolirati transport molekula izme|u odvojenih izvanstani~nih odjeljaka, poput transporta glukoze izme|u lumena crijeva i krvnog optoka (vidi sliku 12-33). ^vrsti spojevi najtje{nji su poznati spoj izme|u susjednih stanica. U po~etku su bili opisani kao mjesta o~ite fuzije izme|u vanjskih strana stani~ne membrane, mada je sada jasno da se membrane ne stapaju. Umjesto toga, ~ini se da se ~vrsti spojevi oblikuju s pomo}u mreè proteinskih lanaca koja se nastavlja oko cijeloga oboda stanice (vidi sliku 12-65). Misli se da su vlakna te mreè sastavljena od transmembranskih proteina (klaudina i okludina) koji veù sli~ne proteine na susjednoj stanici i tako ~vrsto zatvaraju spoj izme|u svojih stani~nih membrana.
Slika 12-65. ^vrsti spoj.

(A) Elektronskomikroskopska snimka epitelnih stanica povezanih spojnim kompleksom, uklju~uju}i ~vrsti spoj, adherentni spoj i dezmosom. (B) ^vrsti spojevi oblikuju se kroz interakciju izme|u lanaca transmembranskih proteina (okludin i klaudini) na susjednim stanicama. (A, Don Fawcett/Photo Researchers, Inc.)
Tijesni spoj ili premosnica

Tijesni spojevi ili premosnice, koje nalazimo u ve}ini animalnih stanica, sluè kao izravna veza izme|u citoplazmi susjednih stanica. Oni osigurava-
(A)
(B)
~vrsti spoj
~vrsti spoj
apikalna domena
adherentni spoj
dezmosom
transmembranski proteini (okludin i klaudini) bazolateralna domena
532
Poglavlje 12
(A)
(B)
Slika 12-66. Tijesni spoj ili premosnica.

(A) Elektronskomikroskopska snimka premosnice (strjelice) izme|u dvije jetrene stanice. (B) Premosnice se sastoje od skupine od {est koneksina koji oblikuju otvoreni kanal kroz stani~nu membranu susjednih stanica. (A, Don Fawcet i R. Wood/Photo Researchers, Inc.)
koneksin
ju otvorene kanale kroz stani~nu membranu, omogu}uju}i ionima i malim molekulama (manjim od oko tisu}u daltona) da slobodno difundiraju izme|u susjednih stanica, ali sprje~avaju}i prolazak proteina i nukleinskih kiselina. Posljedica toga je da premosnice udruùju oboje metaboli~ku aktivnost i elektri~ni odgovor stanica koje povezuju. Ve}ina stanica u animalnim tkivima uklju~uju}i epitelne stanice, endotelne stanice i stanice sr~anog i glatkih mi{i}a komuniciraju putem premosnica. U elektri~ki podra`ljivim stanicama, poput stanica sr~anoga mi{i}a, izravni prolazak iona kroz tijesni spoj povezuje i sinkronizira kontrakciju okolnih stanica. Premosnice tako|er dopu{taju prolazak nekim unutarstani~nim signalnim molekulama, poput cAMP i Ca2+, izme|u susjednih stanica, potencijalno koordiniraju}i odgovor stanica u tkivima. Premosnice su sastavljene od transmembranskih proteina iz obitelji koneksina, koja se sastoji od najmanje 13 razli~itih humanih proteina. [est koneksina udruùje se i oblikuje cilindar s otvorenom vodenom porom u sredi{tu (slika 12-66). Taj spoj koneksina u stani~noj membrani stanice poravnava se s koneksinima u drugoj membrani, stvaraju}i otvoreni kanal izme|u dviju citoplazmi. Membrane dviju stanica odvojene su pukotinom (engl. gap) koja odgovara veli~ini prostora koji zauzimaju izvanstani~ne domene koneksina odatle naziv gap junction (engl. junction spoj), koji su dali istraìva~i iz polja elektronske mikroskopije. Mnoge stanice eksprimiraju vi{e od jednog ~lana koneksinske porodice pa kombinacija razli~itih koneksina moè rezultirati premosnicama razli~itih odlika.
Adhezije izme|u biljnih stanica i plazmodezmosomi

Adhezije izme|u biljnih stanica posredovane su stani~nim stijenkama prije nego transmembranskim proteinima. Posebice, specijalizirana, pektinom
Stani~na povr{ina
533
Slika 12-67. Plazmodezmata.

(A) Elektronskomikroskopska snimka plazmodezme (strjelice). (B) Na plazmodezmi su membrane susjednih stanica kontinuirane, oblikuju}i citoplazmatske kanale kroz susjedne stani~ne stijenke. Produljenje endoplazmatskoga retikula obi~no prolazi kroz kanal. (A, E. H. Newcomb, University of Wisconsin/ Biological Photo Service.)
(A)
(B) citosol 1 endoplazmatski retikul
stani~na stijenka 1 sredi{nja lamela stani~na stijenka 2 0,1 mm membrana
bogata regija stani~ne stijenke zvana sredi{nja lamela djeluje kao ljepilo koje drì susjedne stanice skupa. Zbog krutosti biljne stani~ne stijenke, stabilne sveze izme|u biljnih stanica ne iziskuju oblikovanje veza s citoskeletom, kako to osiguravaju dezmosomi i adherentni spojevi u animalnim stanicama. Unato~ tomu, susjedne biljne stanice komuniciraju jedna s drugom s pomo}u citoplazmatskih spojeva nazvanih plazmodezme, koje funkcioniraju analogno ìvotinjskim premosnicama. Unato~ sli~nosti u njihovoj funkciji, plazmodezme strukturno nisu srodne premosnicama. Na svakoj se plazmadezmi membrana jedne stanice nastavlja na onu njoj susjednu, tvore}i otvoreni kanal izme|u dva citosola (slika 12-67). Produljenje glatkoga endoplazmatskog retikula prolazi kroz poru, ostavljaju}i prostor za prsten citoplazme kroz koju ioni i male molekule mogu slobodno prolaziti izme|u stanica. Ba{ kao i premosnice, plazmodezme su dinami~ne strukture. One se mogu pro{iriti kao odgovor na prikladni podraàj, omogu}uju}i regulirani prolaz makromolekula izme|u susjednih stanica. Uz to postoje dokazi da su specifi~ni proteini usmjereni k plazmodezmama. Zato plazmadezme mogu igrati klju~nu ulogu u razvoju biljaka kontroliraju}i promet regulatornih molekula izme|u stanica, poput transkripcijskih faktora ili molekula RNA.
citosol 2
S A @ E TA K STRUKTURA STANI^NE MEMBRANE

Fosfolipidni dvosloj: Osnovna struktura stani~ne membrane je fosfolipidni dvosloj koji sadràva tako|er glikolipide i kolesterol.
KLJU^NI POJMOVI
fosfatidilkolin, fosfatidiletanolam in, fosfatidilserin, sfingomijelin, fosfatidilinozitol, glikolipidi, kolesterol model teku}ega mozaika, periferni membranski proteini, integralni membranski proteini, transmembranski proteini, porin, glikozilfosfatidilinozitolno (GPI) sidro
Membranski proteini: Membrani pridruèni proteini odgovorni su za izvr{avanje specifi~nih funkcija membrane. Membrane prikazujemo kao teku}i mozaik u kojemu su proteini umetnuti u fosfolipidni dvosloj.
534
Poglavlje 12
apikalna domena, bazolateralna domena, lipidne splavi
Pokretljivost membranskih proteina: Proteini mogu slobodno lateralno difundirati kroz fosfolipidni dvosloj. Unato~ tomu, pokretljivost je nekih proteina ograni~ena zbog njihove veze s drugim proteinima ili specifi~nim lipidima. Osim toga, ~vrsti spojevi onemogu}uju kretanje proteina izme|u odre|enih domena stani~ne membrane epitelnih stanica. Glikokaliks: Povr{ina stanice prekrivena je ugljikohidratnim pokriva~em koji zovemo glikokaliks. Ugljikohidrati stani~ne povr{ine sluè kao obiljeìva~ pri me|ustani~nom prepoznavanju.
glikokaliks, selektin
TRANSPORT MALIH MOLEKULA

pasivna difuzija olak{ana difuzija, proteininosa~i, kanalni proteini
Pasivna difuzija: Male hidrofobne molekule mogu prije}i membranu difuzijom kroz fosfolipidni dvosloj. Olak{ana difuzija i proteini-nosa~i: Pri prolasku ve}ine biolo{kih molekula posreduju ili proteini-nosa~i ili kanalni proteini koji polarnim i nabijenim molekulama omogu}uju prjelazak preko membrane bez interakcije s hidrofobnom unutra{njo{}u. Ionski kanali: Ionski kanali omogu}uju brzi prolazak odre|enih iona kroz stani~nu membranu. Oni su posebno dobro okarakterizirani u ìv~anim i mi{i}nim stanicama, gdje su odgovorni za prijenos elektri~noga signala. Aktivni transport tjeran hidrolizom ATP: Energija oslobo|ena hidrolizom ATP moè tjerati transport molekula u smjeru suprotnom od njihova elektrokemijskoga gradijenta. Aktivni transport tjeran ionskim gradijentom: Ionski gradijenti ~esto se koriste kao izvor energije da pokrenu aktivni transport drugih molekula.
ionski kanali, kanali nadzirani ligandom, kanali nadzirani naponom, tehnika stezaljke istaknute povr{ine, Nernstova jednad`ba, akcijski potencijal, aktivni transport, ionske crpke, Na+/K+ crpka, Na+-K+ATP-aza, ABC-transporteri simport, uniport, antiport
ENDOCITOZA
endocitoza, fagocitoza, pinocitoza, fagosom, fagolizosom endocitoza posredovana receptorima, klatrinom obloène jaìce, klatrinom obloène vezikule, ligand, lipoproteini male gusto}e, endocitoza teku}e faze, kaveole, makropinocitoza endosom, receptorsko potiskivanje, transcitoza
Fagocitoza: Stanice gutaju velike ~estice, poput bakterija i stani~nih debrija, s pomo}u fagocitoze. Endocitoza posredovana receptorima: Najbolje okarakterizirani oblik endocitoze je endocitoza posredovana receptorima koja osigurava mehanizam selektivnog unosa makromolekula.
Promet proteina u endocitozi: Molekule koje se unesu endocitozom u stanici se transportiraju endosomima gdje se sortiraju za recikliranje ili razlaganje u lizosomima.
STANI^NA STIJENKA I IZVANSTANI^NI MATRIKS

peptidoglikan
Stani~na stijenka bakterija: Osnovni sastojak stani~nih stijenki bakterija je peptidoglikan koji se sastoji od polisaharidnih lanaca me|usobno povezanih malim peptidima. Stani~na stijenka biljaka: Stani~ne stijenke gljiva, alga i vi{ih biljaka sastoje se od vlaknastih polisaharida (npr. celuloze) uronjenih u èlatinozni matriks polisaharida i proteina. Krute stani~ne stijenke omogu}uju biljnim stanicama brzu ekspanziju nakon uzimanja vode.
hitin, celuloza, celulozne mikrofibrile, hemiceluloza, pektin, primarna stani~na stijenka, sekundarna stani~na stijenka, lignin, turgor, auksin, celulozasintetaza
Stani~na povr{ina
535
Izvanstani~ni matriks: @ivotinjske su stanice u tkivima okruène izvanstani~nim matriksom koji ~ine secernirani proteini i polisaharidi. Receptori na povr{ini stanice vezuju se na izvanstani~ni matriks i sidre citoskelet na mjestu spojeva stanica-matriks.
izvanstani~ni matriks, bazalna lamina, kolagen, kolageno vlakance, prokolagen, fibronektin, laminin, entaktin, nidogen, integrin, fokalna adhezija, hemidezmosom
ME\USTANI^NE INTERAKCIJE
Adhezijski proteini stanice: U selektivnim me|ustani~nim interakcijama sudjeluju ~etiri glavne skupine adhezijskih proteina: selektini, integrini, imunoglobulinska superporodica i kadherini. Kadherini povezuju citoskelet susjednih stanica na mjestu me|ustani~nih spojeva.
adhezijski proteini stanice, selektin, integrin, imunoglobulinska (Ig) superporodica, kadherin, heterofilne interakcije, homofilne interakcije, adherentni spojevi, dezmosomi, ~vrsti spoj, spojni kompleks
^vrsti spoj: ^vrsti spoj onemogu}uje slobodan prolazak molekula izme|u epitelnih stanica i odjeljuje apikalnu od bazolateralne domene stani~ne membrane. Tijesni spoj ili premosnica: Premosnice su otvoreni kanali koji povezuju citoplazme susjednih stanica. Adhezijski spojevi biljnih stanica i plazmodezme: Susjedne biljne stanice povezane su citoplazmatskim spojevima nazvanim plazmodezmama.
tijesni spoj ili premosnica, koneksin sredi{nja lamela, plazmodezma
Pitanja
1. Objasnite kako kolesterol moè pro{iriti temperatur no podru~je u kojemu moè funkcionirati membranski dvosloj. 2. Kako moèmo eksperimentalno razlikovati perifer ne membranske proteine od integralnih? 3. [to bi bila posljedica ugra|ivanja porina u unutra{nju membranu bakterija umjesto u njihovu vanjsku membranu? 4. Kako su eksperimenti stani~ne fuzije koje su izveli Frye i Eddin potvrdili model teku}ega mozaika kao membranske strukture? Koji bi rezultat dobili da su fuzionirane stanice inkubirali na 2 C? 5. Koje su dvije glavne funkcije glikokaliksa? 6. Koncentracija K+ oko 20 puta je ve}a u aksonu lignje nego u izvanstani~noj teku}ini, {to stvara ravnote`ni membranski potencijal od 75mV. Koliko bi bio o~ekivani ravnote`ni membranski potencijal kada bi koncentracija K+ bila samo 10 puta ve}a unutar nego izvan stanice? Za{to se stvarni potencijal membrane u mirovanju (60mV) razlikuje od ravnote`noga potencijala za K+ koji je 75mV? 7. Jedna od va`nih funkcija Na+K+ crpke u animalnim stanicama jest odràvanje osmoti~ke ravnoteè. Za{to to nije va`no za biljne stanice? 8. [to smo zaklju~ili o mehanizmu endocitoze posredovane receptorima iz studija stanica djece s obiteljskom hiperkolesterolemijom? 9. U ~emu je razlika izme|u stani~nih stijenki i pridruènih im membrana u gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija? 10. Nakon izlaganja mutagenim karcinogenima, epitelne stanice gube kontakt sa susjednim epitelnim stanicama, dijele se i kona~no postaju tumorske. Koji bi gen mogao mutirati da bi do{lo do gubitka kontakta sa susjednim stanicama? 11. Koja je va`nost selektivnoga usmjerivanja razli~itih transportera za glukozu u apikalnu, odnosno bazolateralnu, domenu stani~ne membrane crijevnih epitelnih stanica? 12. Po ~emu su sli~ne premosnice i plazmodezme? Je li mogu}e da su to analogne ili homologne strukture ìvotinja i biljaka?
536
Poglavlje 12
Literatura
Struktura stani~ne membrane
Bennett, V. and D. M. Gilligan. 1993. The spectrin-based membrane skeleton and micron-scale organization of the plasma membrane. Ann. Rev. Cell Biol. 9: 2766. P Branton, D., C. M. Cohen and J. Tyler. 1981. Interaction of cytoskeletal proteins on the human erythrocyte membrane. Cell 24: 2432. I Bretscher, M. S. and S. Munro. 1993. Cholesterol and the Golgi apparatus. Science 261: 12801281. P Diesenhofer, J., O. Epp, K. Miki, R. Huber and H. Michel. 1985. The structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3- resolution. Nature 318: 618624. I Edidin, M. 2001. Shrinking patches and slippery rafts: scales of domains in the plasma membrane. Trends Cell Biol. 11: 492496. P Englund, P T. 1993. The structure and bio. synthesis of glycosyl phosphatidylinositol anchors. Ann. Rev. Biochem. 62: 121138. P Ikonen, E. 2001. Roles of lipid rafts in membrane transport. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 470477. P Jay, D. G. 1996. Role of band 3 in homeostasis and cell shape. Cell 86: 853854. P Lasky, L. A. 1995. Selectin-carbohydrate interactions and the initiation of the inflammatory response. Ann. Rev. Biochem. 64: 113139. P Lee, A. 2001. Membrane structure. Curr. Biol. 11: R811R814. P London, E. 2002. Insights into lipid raft structure and formation from experiments in model membranes. Curr. Opin. Struct. Biol. 12: 480486. P Magee, T. and C. Marshall. 1999. New insights into the interaction of Ras with the plasma membrane. Cell 98: 912. P Montell, C., L. Birnbaumer and V. Flockerzi. 2002. The TRP channels, a remarkably functional family. Cell 108: 595598. P Rees, D. C., H. Komiya, T. O. Yeates, J. P Allen . and G. Feher. 1989. The bacterial photosynthetic reaction center as a model for membrane proteins. Ann. Rev. Biochem. 58: 607633. P Sharon, N. and H. Lis. 1993. Carbohydrates in cell recognition. Sci. Am. 268(1): 8289. R Singer, S. J. 1990. The structure and insertion of integral proteins in membranes. Ann. Rev. Cell Biol. 6: 247296. P Singer, S. J. and G. L. Nicolson. 1972. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175: 720731. I Tamm, L. K., A. Arora and J. H. Kleinschmidt. 2001. Structure and assembly of beta-barrel membrane proteins. J. Biol. Chem. 276: 3239932402. P Thompson, T. E. and T. W. Tillack. 1985. Organization of glycosphingolipids in bilayers and plasma membranes of mammalian cells. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14: 361386. P Yu, J., D. A. Fischman and T. L. Steck. 1973. Selective solubilization of proteins and phospholipids from red blood cell membranes by nonionic detergents. J. Supramol. Struct. 1: 233248. I Zhang, F. L. and P J. Casey. 1996. Protein pre. nylation: Molecular mechanisms and functional consequences. Ann. Rev. Biochem. 65: 241269. P Hille, B. 2001. Ionic Channels of Excitable Membranes. 3rd ed. Sunderland, MA: Sinauer Associates. Hodgkin, A. L. and A. F. Huxley. 1952. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. 117: 500544. I Jongsma, H. J. and R. Wilders. 2001. Channelopathies: Kir2.1 mutations jeopardize many cell functions. Curr. Biol. 11: R747 R750. P Kaplan, J. H. 2002. Biochemistry of Na, KATPase. Ann. Rev. Biochem. 71: 511535. P Lanyi, J. K. 1995. Bacteriorhodopsin as a model for proton pumps. Nature 375: 461463. P MacLennan, D. H., W. J. Rice and N. M. Green. 1997. The mechanism of Ca2+ transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPases. J. Biol. Chem. 272: 2881528818. P Neher, E. and B. Sakmann. 1992. The patch clamp technique. Sci. Am. 266(3): 4451. P Perozo, E., D. M. Cortes and L. G. Cuello. 1999. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science 285: 7378. I Sakmann, B. 1992. Elementary steps in synaptic transmission revealed by currents through single ion channels. Science 256: 503512. P Sansom, M. S. and R. J. Law. 2001. Membrane proteins: Aquaporins channels without ions. Curr. Biol. 11: R71R73. P Unwin, N. 1993. Neurotransmitter action: Opening of ligand-gated ion channels. Cell 72/Neuron 10 (Suppl.): 3141. P Walmsley, A. R., M. P Barrett, F. Bringaud and . G. W. Gould. 1998. Sugar transporters from bacteria, parasites and mammals: Structure-activity relationships. Trends Biochem. Sci. 23: 476481. P Welsh, M. J. and A. E. Smith. 1993. Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis. Cell 73: 12511254. P
Transport malih molekula

Bell, G. I., C. F. Burant, J. Takeda and G. W. Gould. 1993. Structure and function of mammalian facilitative sugar transporters. J. Biol. Chem. 268: 1916119164. P Borgnia, M., S. Nielsen, A. Engel and P Agre. . 1999. Cellular and molecular biology of the aquaporin water channels. Ann. Rev. Biochem. 68: 425458. P Borst, P and A. H. Schinkel. 1997. Genetic . dissection of the function of mammalian P-glycoproteins. Trends Genet. 13: 217222. P Carafoli, E. 1992. The Ca2+ pump of the plasma membrane. J. Biol. Chem. 267: 21152118. P Catterall, W. A. 1995. Structure and function of voltage-gated ion channels. Ann. Rev. Biochem. 64: 493531. P Clapham, D. E. 1999. Unlocking family secrets: K+ channel transmembrane domains. Cell 97: 547550. P Cole, S. P and R. G. Deeley. 1998. Multidrug . resistance mediated by the ATP-binding cassette transporter protein MRP Bioessays . 20: 931940. P Cooper, E. C. and L. Y. Jan. 1999. Ion channel genes and human neurological disease: Recent progress, prospects, and challenges. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 47594766. P Doyle, D. A., J. M. Cabral, R. A. Pfuetzner, A. Kuo, J. M. Gulbis, S. L. Cohen, B. T. Chait and R. MacKinnon. 1998. The structure of the potassium channel: Molecular basis of K+ conductivity and selectivity. Science 280: 6977. I Gottesman, M. M. and I. M. Pastan. 1993. Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter. Ann. Rev. Biochem. 62: 385427. P Higgins, C. F. 1992. ABC transporters: From microorganisms to man. Ann. Rev. Cell Biol. 8: 67113. P
Endocitoza
Brown, M. S. and J. L. Goldstein. 1986. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science 232: 3447. P Gruenberg, J. 2001. The endocytic pathway: A mosaic of domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 721730. P Liu, P M. Rudick and R. G. Anderson. 2002. ., Multiple functions of caveolin-1. J. Biol. Chem. 277: 4129541298. P McNiven, M. A. 1998. Dynamin: A molecular motor with pinchase action. Cell 94: 151 154. P
Stani~na povr{ina
537
Mostov, K., T. Su and M. ter Beest. 2003. Polarized epithelial membrane traffic: Conservation and plasticity. Nat. Cell Biol. 5: 287293. P Nelson, W. J. 1992. Regulation of cell surface polarity from bacteria to mammals. Science 258: 948955. P Parton, R. G. 2003. Caveolae from ultrastructure to molecular mechanisms. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 162167. P Rabinovitch, M. 1995. Professional and nonprofessional phagocytes: An introduction. Trends Cell Biol. 5: 8587. P Smith, C. J. and B. M. Pearse. 1999. Clathrin: Anatomy of a coat protein. Trends Cell Biol. 9: 335338. P Sudhof, T. C. 1995. The synaptic vesicle cycle: A cascade of protein-protein interactions. Nature 375: 645653. P Takei, K. and V. Haucke. 2001. Clathrin-mediated endocytosis: membrane factors pull the trigger. Trends Cell Biol. 11: 385391. P Trowbridge, I. S., J. F. Collawn and C. R. Hopkins. 1993. Signal-dependent membrane protein trafficking in the endocytic pathway. Ann. Rev. Cell Biol. 9: 129161. P Van Ijzendoorn, S. C. D. and D. Hoekstra. 1999. The subapical compartment: A novel sorting centre? Trends Cell Biol. 9: 144149. P
Kohorn, B. D. 2001. WAKs; cell wall associated kinases. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 529533. P Loftus, J. C., J. W. Smith and M. H. Ginsberg. 1994. Integrin-mediated cell adhesion: The extracellular face. J. Biol. Chem. 269: 2523525238. P Lukashev, M. E. and Z. Werb. 1998. ECM signalling: Orchestrating cell behaviour and misbehaviour. Trends Cell Biol. 8: 437441. P McDonald, J. A. 1988. Extracellular matrix assembly. Ann. Rev. Cell Biol. 4: 183207. P Perrin, R. M. 2001. Cellulose: How many cellulose synthases to make a plant? Curr. Biol. 11: R213R216. P Prockop, D. J. and K. I. Kivirikko. 1995. Collagens: Molecular biology, diseases, and potentials for therapy. Ann. Rev. Biochem. 64: 403434. P Reiter, W. D. 2002. Biosynthesis and properties of the plant cell wall. Curr. Opin. Plant Biol. 5: 536542. P Ruoslahti, E. 1988. Structure and biology of proteoglycans. Ann. Rev. Cell Biol. 4: 229 255. P Ruoslahti, E. 1996. RGD and other recognition sequences for integrins. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 697715. P Stals, H. and D. Inze. 2001. When plant cells decide to divide. Trends Plant Sci. 6: 359 364. P Varner, J. E. and L.-S. Lin. 1989. Plant cell wall architecture. Cell 56: 231239. P Vertel, B. M. 1995. The ins and outs of aggrecan. Trends Cell Biol. 5: 458464. P Vuorio, E. and B. de Crombrugghe. 1990. The family of collagen genes. Ann. Rev. Biochem. 59: 837872. P Wight, T. N. 2002. Versican: A versatile extracellular matrix proteoglycan in cell biology. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 617623. P Woods, A. and J. R. Couchman. 2001. Syndecan-4 and focal adhesion function. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 578583. P Yurchenko, P D. and J. C. Schnitty. 1990. . Molecular architecture of basement membranes. FASEB J. 4: 15771590. P
Fukata, M. and K. Kaibuchi. 2001. Rho-family GTPases in cadherin-mediated cell-cell adhesion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 887 897. P Garrod, D. R., A. J. Merritt, and Z. Nie. 2002. Desmosomal cadherins. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 537545. P Gonzalez-Mariscal, L., A. Betanzos, P Nava . and B. E. Jaramillo. 2003. Tight junction proteins. Prog. Biophys. Mol. Biol. 81: 144. P Gumbiner, B. M. 1996. Cell adhesion: The molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell 84: 345357. P Heinlein, M. 2002. Plasmodesmata: Dynamic regulation and role in macromolecular cell-to-cell signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 5: 543552. P Humphries, M. J. and P Newham. 1998. The . structure of cell-adhesion molecules. Trends Cell Biol. 8: 7883. P Hynes, R. O. 2002. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 110: 673687. P Knust, E. and O. Bossinger. 2002. Composition and formation of intercellular junctions in epithelial cells. Science 298: 19551959. P Miranti, C. K. and J. S. Brugge. 2002. Sensing the environment: A historical perspective on integrin signal transduction. Nat. Cell Biol. 4: E83E90. P Pickard, B. G. and R. N. Beachy. 1999. Intercellular connections are developmentally controlled to help move molecules through the plant. Cell 98: 58. P Simon, A. M. and D. A. Goodenough. 1998. Diverse functions of vertebrate gap junctions. Trends Cell Biol. 8: 477483. P Springer, T. A. 1994. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: The multistep paradigm. Cell 76: 301314. P Stevenson, B. R. and B. H. Keon. 1998. The tight junction: Morphology to molecules. Ann. Rev. Cell Biol. 14: 89109. P Tsukita, S. and M. Furuse. 2002. Claudinbased barrier in simple and stratified cellular sheets. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 531 536. P Yagi, T. and M. Takeichi. 2000. Cadherin superfamily genes: Functions, genomic organization, and neurologic diversity. Genes Dev. 14: 11691180. P Yap, A. S. and E. M. Kovacs. 2003. Direct cadherin-activated cell signaling: A view from the plasma membrane. J. Cell Biol. 160: 1116. P
Stani~na stijenka i izvanstani~ni matriks

Bernfield, M., M. Gotte, P W. Park, O. Reizes, . M. L. Fitzgerald, J. Lincecum and M. Zako. 1999. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Ann. Rev. Biochem. 68: 729777. P Carpita, N. C. and D. M. Gibeaut. 1993. Structural models of primary cell walls in flowering plants: Consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3: 130. P Cosgrove, D. J. 2001. Plant cell walls: Wallassociated kinases and cell expansion. Curr. Biol. 11: R558R559. P Cosgrove, D. J. 1997. Assembly and enlargement of the primary cell wall in plants. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 171201. P Cyr, R. J. 1994. Microtubules in plant morphogenesis: Role of the cortical array. Ann. Rev. Cell Biol. 10: 153180. P Iozzo, R. V. 1998. Matrix proteoglycans: From molecular design to cellular function. Ann. Rev. Biochem. 67: 609652. P Kjellen, L. and U. Lindahl. 1991. Proteoglycans: Structures and interactions. Ann. Rev. Biochem. 60: 443475. P
Me|ustani~ne interakcije
Chothia, C. and E. Y. Jones. 1997. The molecular structure of cell adhesion molecules. Ann. Rev. Biochem. 66: 823862. P Christofori, G. and H. Semb. 1999. The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-suppressor gene. Trends Biochem. Sci. 24: 7376. P
Dio
IV
Stani~na regulacija
13 Stani~no signaliziranje 14 Stani~ni ciklus 15 Rak
Poglavlje
13
Stani~no signaliziranje
Signalne molekule i njihovi receptori 541 Djelovanje stani~nih povr{inskih receptora 550 Putevi unutarstani~noga prijenosa signala 558 Prijenos signala i citoskelet 571 Signaliziranje u razvoju i diferencijaciji 575 Regulacija programirane stani~ne smrti 579
KLJU^NI POKUS: Src
protein-tirozin-kinaza 554 Karcinom: Prijenos signala i onkogen ras 572
iz svoga okoli{a. âk i najjednostavnije bakterije zapaàju i plivaju prema visokim koncentracijama hranidbenih tvari, kao {to su glukoza ili aminokiseline. Mnogi jednostani~ni eukarioti tako|er odgovaraju na signalne molekule {to ih izlu~uju druge stanice, {to omogu}uje me|ustani~nu komunikaciju. Primjerice, sparivanje stanica kvasca signalizirano je s pomo}u peptida koje jedna stanica izlu~uje, a veù se za receptore na povr{ini druge stanice. Me|utim, komunikacija izme|u stanica doseè najvi{u razinu sofisticiranosti u vi{estani~nim organizmima. Dok su stanice prokariota i jednostani~nih eukariota u velikoj mjeri autonomne, pona{anje pojedine stanice vi{estani~nih biljaka i ìvotinja mora se pa`ljivo nadzirati kako bi se zadovoljile potrebe organizma u cjelini. To se postiè s pomo}u razli~itih signalnih molekula koje se izlu~uju ili izlaù na povr{ini jedne stanice i veù za receptore izloène na povr{ini drugih stanica. Tako se integriraju i koordiniraju brojne pojedina~ne stanice koje grade organizme tako sloène, kao {to su to ljudska bi}a. Vezanje mnogih signalnih molekula za specifi~ne receptore zapo~inje niz unutarstani~nih promjena, koje nadziru gotovo sve vidove stani~noga pona{anja, kao {to su metabolizam, kretanje, proliferacija, preìvljenje i diferencijacija. Razumijevanje molekularnoga mehanizma, koji je odgovoran za puteve stani~noga signaliziranja, tako je postalo glavno podru~je istraìvanja u suvremenoj stani~noj biologiji. Zanimanje za to podru~je dodatno je pove}ano zbog ~injenice da su brojne vrste raka posljedica prekidanja signalnih puteva koji nadziru normalnu stani~nu proliferaciju i preìvljenje. Obrnuto, mnoge sada{nje spoznaje o mehanizmima stani~noga signaliziranja dobivene su tijekom prou~avanja stanica raka, {to je o~iti primjer plodnoga proìmanja izme|u medicine i bazi~nih istraìvanja u stani~noj i molekularnoj biologiji.
VE STANICE PRIMAJU SIGNALE I ODGOVARAJU NA SIGNALE
Signalne molekule i njihovi receptori

Brojni razli~iti oblici molekula prenose informacije izme|u stanica vi{estani~nih organizama. Iako se sve ove molekule pona{aju kao ligandi, koji se veù za receptore izloène na povr{ini ciljnih stanica, postoje znatne razlike u strukturi i funkciji razli~itih vrsta molekula koje djeluju kao prijenosnici poruka. Strukturno, signalne molekule koje koriste biljke i ìvotinje po svojoj se sloènosti ras-
542
Poglavlje 13
izravno signaliziranje dviju stanica
prostiru od jednostavnih plinova do proteina. Neke od ovih molekula prenose signale na velike udaljenosti, dok druge djeluju lokalno kako bi prenijele informaciju izme|u susjednih stanica. Dodatno, signalne se molekule razlikuju po na~inu djelovanja na ciljne stanice. Neke signalne molekule mogu pro}i kroz stani~nu membranu i vezati se za unutarstani~ne receptore u citoplazmi ili jezgri, dok se ve}ina veè za receptore izloène na povr{ini ciljne stanice. Odjeljci koji slijede opisuju glavne vrste signalnih molekula i receptora, te njihovo me|udjelovanje. Potom }emo se usredoto~iti na mehanizme djelovanja receptora smje{tenih na povr{ini stanice u regulaciji stani~noga pona{anja.
Oblici signaliziranja izme|u dviju stanica

Stani~no signaliziranje moè biti posljedica izravnoga me|udjelovanja stanice sa susjednom stanicom ili djelovanja izlu~enih signalnih molekula (sl. 13-1). Signaliziranje izravnim me|udjelovanjem dviju stanica (ili stanice i matriksa) ima klju~nu ulogu u nadziranju stani~noga pona{anja u ìvotinjskim tkivima. Primjerice, integrini i kadherini (koje smo opisali u prethodnom poglavlju) djeluju ne samo kao molekule stani~noga prianjanja, ve} tako|er i kao signalne molekule koje nadziru stani~nu proliferaciju i preìvljenje u odgovoru na dodir dviju stanica ili stanice i matriksa. [tovi{e, stanice imaju razli~ite povr{inske receptore koji me|usobno djeluju sa signalnim molekulama na povr{ini susjednih stanica. Signaliziranje putem takva izravnoga dodira dviju stanica ima klju~nu ulogu u nadziranju brojnih me|udjelovanja razli~itih stanica tijekom embrionalnoga razvoja, kao i u odràvanju odraslih tkiva. Brojni oblici signaliziranja s pomo}u izlu~enih molekula ~esto se dijele u tri op}enite vrste, a podjela se zasniva na udaljenosti koju premo{}uju signali. U endokrinom signaliziranju, specijalizirane endokrine stanice izlu~uju signalne molekule (hormone), koje se prenose cirkulacijom, kako bi djelovale na ciljne stanice na udaljenim mjestima u tijelu. Klasi~an je primjer steroidni hormon estrogen, koji stvaraju ovariji, a poti~e razvoj i odràvanje ènskoga reproduktivnoga sustava, kao i sekundarnih spolnih osobina. U ìvotinja, endokrine `lijezde, kao {to su hipofiza, tireoidna, paratireoidna, gu{tera~a, nadbubre`ne i spolne `lijezde, stvaraju vi{e od 50 razli~itih hormona. Za razliku od hormona, neke signalne molekule djeluju lokalno na pona{anje susjednih stanica. U parakrinom signaliziranju, molekula koju otpu{ta jedna stanica djeluje na susjednu ciljnu stanicu. Primjer je djelovanje neurotransmitora koji prenosi signal u sinapsi izme|u ìv~anih stanica. Kona~no, neke stanice odgovaraju na signalne molekule koje same stvaraju. Jedan vaàn primjer autokrinog signaliziranja je odgovor stanica imunolo{koga sustava kralje`njaka na strane antigene. Odre|ene vrste limfocita T odgovaraju na poticaj antigenima tako da stvaraju faktor rasta, koji poti~e njihovu proliferaciju te tako pove}ava broj T-limfocita koji odgovara na podraàj i poja~ava imunoodgovor. Treba naglasiti da nepravilno autokrino signaliziranje ~esto pridonosi nekontroliranom rastu stanica raka (vidi 15. po-
signaliziranje izlu~enim molekulama (A) endokrino signaliziranje
cirkulacijski sustav
ciljna stanica
(B) parakrino signaliziranje
(C) autokrino signaliziranje
Slika 13-1. Oblici signaliziranja izme|u dviju stanica.

Signaliziranje izme|u stanica moè se odvijati putem izravnoga dodira dviju stanica ili putem izlu~enih signalnih molekula. (A) U endokrinom signaliziranju hormoni se prenose cirkulacijom, kako bi djelovali na udaljene ciljne stanice. (B) U parakrinom signaliziranju, stanica otpu{ta molekulu koja djeluje lokalno na susjedne ciljne stanice. (C) U autokrinom signaliziranju stanica stvara signalnu molekulu koja djeluje na tu istu stanicu.
543
glavlje), pri ~emu stanice raka stvaraju faktor rasta, a na faktor i same odgovaraju tako da neprekidno i nekontrolirano poti~u vlastitu proliferaciju.
Steroidni hormoni i superporodica receptora u jezgri

Ve} smo zamijetili da sve signalne molekule djeluju tako da se veù za receptore koji su izraèni na ciljnim stanicama. Receptori su ~esto smje{teni na povr{ini ciljnih stanica, ali neki receptori su unutarstani~ni proteini, koji su smje{teni u citoplazmi ili jezgri. Ti unutarstani~ni receptori odgovaraju na male, hidrofobne, signalne molekule koje mogu difundirati kroz stani~nu membranu. Steroidni hormoni su klasi~an primjer ove skupine signalnih molekula, koja tako|er uklju~uje tireoidni hormon, vitamin D3 i retinoi~nu kiselinu (sl. 13-2). Svi se steroidni hormoni (uklju~uju}i testosteron, estrogen, progesteron, kortikosteroide i ekdison) sintetiziraju iz kolesterola. Testosteron, estrogen i progesteron su spolni steroidi koje stvaraju spolne `lijezde. Kortikosteroide stvaraju nadbubre`ne `lijezde, a uklju~uju glukokortikoide, koji djeluju na razli~ite stanice jer poti~u stvaranje glukoze, i mineralokortikoide, koji djeluju na bubreg jer nadziru ravnoteù soli i vode. Ekdison je hormon u kukaca koji ima klju~nu ulogu u razvoju jer poti~e metamorfozu li~inke u odrasloga kukca. Brasinosteroidi su steroidni hormoni specifi~ni za biljke, a nadziru brojne razvojne procese kao {to su rast i diferencijacija. Iako strukturno i funkcionalno razli~iti od steroida, tireoidni hormon, vitamin D3 i retinoi~na kiselina djeluju istim mehanizmom u ciljnim stanicama. Tireoidni hormon sintetizira se iz tirozina u tireoidnoj `lijezdi, te ima va`nu ulogu u razvoju i nadzoru nad metabolizmom. Vitamin D3 nadzire
CH3 OH OH C O
HO
testosteron
estradiol (estrogen)
CH2OH O C
+
progesteron
CH2OH C O I H O I I OH COO H3N C CH2 I
HO
C O OH
H HO
kortizol (glukokortikoid)
aldosteron (mineralokortikoid)
tireoidni hormon
H3C
CH3
CH3
CH3
O OH
CH3 CH2
vitamin D3
retinoi~na kiselina
Slika 13-2. Struktura steroidnih hormona, tireoidnoga hormona, vitamina D3 i retinoi~ne kiseline.
HO
Steroidi su spolni hormoni (testosteron, estrogen i progesteron), glukokortikoidi i mineralokortikoidi.
544
Poglavlje 13
Slika 13-3. Djelovanje estrogena.

Estrogen difundira kroz stani~nu membranu i veè se za svoj receptor u jezgri. U odsutnosti hor mona, estrogenski je receptor vezan za Hsp90. Vezanje estrogena odvaja receptor od Hsp90 i omogu}uje oblikovanje receptorskih dimera, koji se veù za DNA, spajaju s koaktivatorima koji posjeduju aktivnost histon-acetil-transferaze (HAT) i poti~u transkripciju ciljnih gena.
estrogen stani~na membrana
jezgra Hsp90 inaktivni estrogenski receptor receptorski dimer
koaktivator HAT
transkripcija
metabolizam Ca2+ i ko{tani rast. Retinoi~na kiselina i sli~ni spojevi (retinoidi), koji se sintetiziraju iz vitamina A, imaju va`nu ulogu u razvoju kralje`njaka. Zbog svoje hidrofobnosti, steroidni hormoni, tireoidni hormon, vitamin D3 i retinoi~na kiselina mogu u}i u stanicu difuzijom kroz stani~nu membranu. Kad se jednom na|u u stanici, veù se za unutarstani~ne receptore u ciljnim stanicama koje odgovaraju na podraàj hormonom. Ovi receptori pripadaju porodici proteina, koja je poznata kao superporodica receptora u jezgri. To su transkripcijski faktori koji imaju odgovaraju}e domene za vezanje liganda, vezanje DNA i aktivaciju transkripcije. Vezanje liganda nadzire njihovu funkciju kao aktivatora ili represora ciljnih gena, tako da steroidni hormoni i sli~ne molekule izravno nadziru gensku ekspresiju. Vezanje liganda ima razli~ite u~inke na razli~ite receptore. Neki pripadnici superporodice steroidnih receptora ne mogu se vezati za DNA u odsutnosti hormona. Primjerice, estrogenski se receptor veè za {aperone Hsp90 u odsutnosti hormona (sl. 13-3). Vezanje estrogena poti~e konformacijsku promjenu receptora, uklanja Hsp90, te poti~e nastanak receptorskih dimera, koji se veù za regulacijske sljedove DNA i aktiviraju transkripciju ciljnih gena. U drugim slu~ajevima, receptori se veù za DNA bez obzira na prisutnost ili odsutnost hormona, a vezanje hormona mijenja aktivnost receptora kao molekule koja nadzire transkripciju. Primjerice, u odsutnosti hormona, receptor za tireoidni hormon povezan je s korepresorskim kompleksom i onemogu}uje transkripciju ciljnih gena (sl. 13-4). Vezanje hormona poti~e konformacijsku promjenu, koja uzrokuje me|udjelovanje recep-
545
odsutnost hormona
Slika 13-4. Regulacija gena s pomo}u receptora za tireoidni hormon.

receptor za tireoidni hormon
korepresor
HDAC
onemogu}ena transkripcija dodatak hormona
Receptor za tireoidni hormon vezan je za DNA u prisutnosti, kao i u odsutnosti hormona. Me|utim, vezanje hormona mijenja djelovanje receptora, koji, umjesto represora, postaje aktivator transkripcije ciljnih gena. U odsutnosti hormona, receptor se spaja s korepresorima koji imaju aktivnost histon-deacetilaze (HDAC). U prisutnosti hormona, receptor se spaja s koaktivatorima koji imaju aktivnost histon-acetil-transferaze (HAT).
koaktivator HAT
aktivirana transkripcija
tora i koaktivatora, a ne korepresora, te dovodi do aktivacije transkripcije gena na koje djeluje tireoidni hormon.
Du{ikov oksid i ugljikov monoksid

Du{ikov oksid (NO), jednostavni plin, glavna je parakrina signalna molekula u ìv~anom, imunolo{kom i cirkulacijskom sustavu. Poput steroidnih hormona, NO moè difundirati izravno kroz membranu svojih ciljnih stanica. Me|utim, molekularna osnova djelovanja NO razlikuje se od djelovanja steroida jer NO, umjesto vezanja za receptor koji nadzire transkripciju, mijenja aktivnost unutrastani~nih ciljnih enzima. NO se sintetizira iz aminokiseline arginina djelovanjem enzima sintaze du{ikova oksida (sl. 13-5). Sintetizirani NO difundira izvan stanice i moè djelovati lokalno na susjedne stanice. Njegovo je djelovanje ograni~eno na takve lokalne u~inke jer je NO izuzetno nestabilan, s poluvijekom od svega nekoliko sekunda. Glavni unutarstani~ni cilj NO je gvanil-ciklaza. NO se veè za hem-skupinu na aktivnom mjesta tog enzima, te poti~e sintezu drugoga glasnika cikli~koga GMP (o njemu se raspravlja dalje u ovom poglavlju). [tovi{e, NO moè izravno promijeniti neke ciljne proteine tako da nitrozilira cisteinske ostatke. Dobro opisani primjer u~inka NO jest signaliziranje koje dovodi do dilatacije krvnih ìla. Prvi je korak u tom procesu otpu{tanje neurotransmitora, kao {to je acetilkolin, iz zavr{etaka ìv~anih stanica u stijenkama krvnih ìla. Ti neurotransmitori djeluju na endotelne stanice tako da poti~u sintezu NO. Potom NO difundira u susjedne glatke mi{i}ne stanice, gdje poti~e gvanil-ciklazu, {to uzrokuje nastanak cikli~koga GMP koji poti~e relaksaciju mi{i}nih stanica i {iri krvne ìle. Primjerice, NO je odgovoran za signaliziranje koje uzrokuje {irenje krvnih ìla penisa, {to uzrokuje erekciju. Tako|er je zanimljivo napomenuti da se medicinska uporaba nitroglicerina u lije~enju sr~ane bolesti zasniva na njegovom pretvara-
546
Poglavlje 13
Slika 13-5. Sinteza du{ikova oksida.

Enzim sintaza du{ikova oksida (NOS, prema engl. nitric oxid synthase) katalizira stvaranje du{ikova oksida iz arginina.
H3N
+
COO C H O2
COO
CH2 CH2 CH2 NH C + N H2
H3N NADP +
CH2 CH2 CH2 NH C O NH2
NOS
NO
du{ikov oksid
acetilkolin O CH3 glicin H3N

+
NH2 O CH2 O CH2 N+ (CH3)3 arginin
citrulin
CH2
glutamat H3N
+
O CH2 O CH2 C O
CH C O
nju u NO, koji dilatira koronarne krvne ìle i pove}ava protok krvi prema srcu. Ugljikov monoksid (CO), jo{ jedan jednostavni plin, tako|er djeluje kao signalna molekula u ìv~anom sustavu. CO je vrlo sli~an NO i ~ini se da isto tako djeluje kao neurotransmitor i posrednik u dilataciji krvnih ìla. Sinteza CO u ìv~anim stanicama, poput sinteze NO, potaknuta je neurotransmitorima. [tovi{e, CO moè poticati gvanil-ciklazu, koja bi mogla predstavljati glavni fiziolo{ki cilj CO-signaliziranja.
dopamin HO HO CH2 CH2

+ NH3
Neurotransmitori
Neurotransmitori prenose signale izme|u ìv~anih stanica ili od ìv~anih stanica do drugih vrsta ciljnih stanica (kao {to su mi{i}ne stanice). To je skupina razli~itih malih, hidrofilnih molekula, koja uklju~uje acetilkolin, dopamin, adrenalin, serotonin, histamin, glutamat, glicin i g-aminomasla~nu kiselinu (GABA, prema engl. g-aminobutyric acid) (slika 13-6). Signal za otpu{tanje neurotransmitora je pristizanje akcijskoga potencijala na ìv~ani zavr{etak (vidi sliku 12.22). Neurotransmitori potom difundiraju kroz sinapti~ku pukotinu i veù se za receptore na povr{ini ciljnih stanica. Uo~ite da neki neurotransmitori mogu djelovati i kao hormoni. Primjerice, adrenalin djeluje kao neurotransmitor i kao hormon iz nadbubre`nih `lijezda, koji signalizira razgradnju glikogena u mi{i}nim stanicama. Budu}i da su neurotransmitori hidrofilne molekule, ne mogu pro}i kroz stani~nu membranu svojih ciljnih stanica. Stoga, razli~ito od steroidnih hormona i NO ili CO, neurotransmitori djeluju tako da se veù za receptore na stani~noj povr{ini. Mnogi receptori za neurotransmitore ujedno su i ionski kanali, kao {to je to receptor za acetilkolin, koji smo opisali u prethodnom poglavlju (vidi sliku 12-23). Vezanje neurotransmitora za te receptore poti~e konformacijske promjene, {to otvara ionske kanale i izravno uzrokuje promjene ionskoga protoka u ciljnoj stanici. Drugi receptori za neurotransmitore povezani su s G-proteinima glavnom skupinom signalnih molekula (opisuje se dalje u ovom poglavlju), koji povezuju receptore na stani~noj povr{ini s razli~itim unutarstani~nim odgovorima. Kod receptora za neurotransmitore, pridruèni G-proteini ~esto djeluju tako da neizravno nadziru aktivnost ionskoga kanala.
noradrenalin HO HO CH OH adrenalin HO HO CH OH serotonin HO CH2 CH2 NH3

+
CH2
NH3
CH2
NH2
CH3
N histamin HC N CH g-aminomasla~na kiselina (GABA) O H3N

+
H CH2 CH2 NH3

+
NH
Peptidni hormoni i faktori rasta

Najrazli~itije signalne molekule u ìvotinja jesu peptidi, koji se veli~inom razlikuju od peptida sa svega nekoliko aminokiselina do onih koji sadràvaSlika 13-6. Struktura tipi~nih neurotransmitora
Neurotransmitori su hidrofilne molekule koje se veù za receptore na povr{ini stanice.
CH2
CH2
CH2
547
Tablica 13-1. Tipi~ni peptidni hormoni, neuropeptidi i faktori rasta

Signalna molekula
Peptidni hormoni inzulin
Veli~inaa
A = 21, B = 30
U~incib
regulacija unosa glukoze; poticanje proliferacije stanica poticanje sinteze glukoze op}enito poticanje rasta poticanje rasta oocita i folikula ovarija poticanje stvaranja mlijeka prijenos u osjetnoj sinapsi poticanje kontrakcije glatkog mi{i}a poticanje reapsorpcije vode u bubregu analgezija analgezija diferencijacija i preìvljenje neurona proliferacija razli~itih vrsta stanica proliferacija fibroblasta i drugih vrsta stanica proliferacija limfocita T razvoj crvenih krvnih zrnaca
glukagon 29 hormon rasta 191 folikulostimulacijski a = 92, b = 118 hormon (FSH) prolaktin 198 Neuropeptidi i neurohormoni tvar P 11 oksitocin 9 vazopressin 9 enkefalin 5 b-endorfin 31 Faktori rasta faktor rasta neurona (NGF) 118 epidermalni faktor rasta 53 (EGF) trombocitni faktor rasta A = 125, B = 109 (PDGF) interleukin-2 133 eritropoetin 166
a Veli~ina ozna~uje broj aminokiselina. Neki hormoni i faktori rasta gra|eni su od dvaju razli~itih polipeptidnih lanaca {to je ozna~eno kao A i B ili a i b. b Ve}ina navedenih hormona i faktora rasta ima i druge u~inke osim ovdje nabrojenih u~inaka.
ju vi{e od stotine. Ova skupina signalnih molekula uklju~uje peptidne hormone, neuropeptide i razli~ite polipeptidne faktore rasta (tablica 13-1). Poznati primjeri peptidnih hormona jesu inzulin, glukagon i hormoni koje stvara hipofiza (hormon rasta, folikulostimulacijski hormon, prolaktin i drugi). Neke ìv~ane stanice izlu~uju neuropeptide, umjesto malih molekula neurotransmitora koje smo opisali u prethodnom odsje~ku. Neki od ovih peptida, kao {to su enkefalini i endorfini, ne djeluju samo kao neurotransmitori u sinapsama, ve} i kao neurohormoni koji imaju u~inke na udaljene stanice. Enkefalini i endorfini dobro su prou~eni jer djeluju kao prirodni analgetici koji smanjuju odgovor na bol u sredi{njemu ìv~anome sustavu. Ti su prirodni spojevi otkriveni tijekom prou~avanja ovisnosti o drogama, a veù se za iste receptore kao i morfij na povr{ini stanica u mozgu. Polipeptidni faktori rasta uklju~uju razli~ite vrste signalnih molekula koje nadziru rast i diferencijaciju animalnih stanica. Prvi takav faktor (NGF, prema engl. nerve growth factor, faktor rasta neurona) otkrila je Rita LevyMontalcini 1950. godine. NGF je ~lan porodice polipeptida (nazvanih neurotrofini) koji nadziru razvoj i preìvljenje neurona. Tijekom prou~avanja NGF-a, Stanley Cohen je posve slu~ajno otkrio neovisni faktor (nazvan EGF, prema engl. epidermal growth factor, epidermalni faktor rasta) koji poti~e proliferaciju stanica. EGF, polipeptid sastavljen od 53 aminokiseline (sl. 13-7), posluìo je kao prototip velikog broja faktora rasta, koji imaju klju~nu ulogu u nadzoru nad proliferacijom ìvotinjskih stanica, kako tijekom embrionalnoga razvoja, tako i u odraslom organizmu.
548
Poglavlje 13
Slika 13-7. Struktura epidermalnoga faktora rasta (EGF).

EGF je jednolan~ani polipeptid gra|en od 53 aminokiseline. Ozna~ene su disulfidne veze izme|u cisteinskih ostataka. (Prema G. Carpenter i S. Choen, 1979. Ann. Rev. Biochem. 48:193.)
Tyr N Asn Ser
Pro
Gly
Cys Pro Ser Ser Cys Val Met 20 Gly His Ile Glu Ser Leu Gly
10
Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Cys Thr Cys Gln Thr Arg Asp Trp Leu Arg Trp Glu
50
Asn
Asn
Cys
Val Ile Gly
Tyr Ser
Asp Ser Tyr
30
Arg Asp
40
Gly
Leu Arg C
Dobar primjer u~inka faktora rasta jest djelovanje trombocitnoga faktora rasta (PDGF, prema engl. platelet-derived growth factor) tijekom cijeljenja rane. PDGF je pohranjen u krvnim plo~icama i otpu{ta se tijekom procesa zgru{avanja krvi na mjestu rane. On potom poti~e proliferaciju fibroblasta u neposrednoj blizini ugru{ka, te na taj na~in pridonosi obnavljanju o{te}enoga tkiva. Pripadnici druge velike skupine polipeptidnih faktora rasta (nazvanih citokini) nadziru razvoj i diferencijaciju krvnih stanica, te aktivnost limfocita tijekom imunoodgovora. Drugi polipeptidni faktori rasta (faktori rasta usidreni u membrani) ostaju povezani sa stani~nom membranom umjesto da se otpu{taju u izvanstani~nu teku}inu, stoga specifi~no djeluju kao signalne molekule tijekom izravnih me|udjelovanja dviju stanica. Peptidni hormoni, neuropeptidi i faktori rasta ne mogu pro}i kroz stani~nu membranu svojih ciljnih stanica, tako da djeluju vezanjem za receptore na povr{ini stanice, {to se opisuje dalje u ovom poglavlju. Kao {to se moè o~ekivati od kriti~ne uloge polipeptidnih faktora rasta koji nadziru stani~nu proliferaciju, nepravilnosti u signaliziranju faktora rasta osnova su za razli~ite bolesti, uklju~uju}i mnoge vrste raka. Primjerice, nepravilna ekspresija bliskoga srodnika receptora za EGF vaàn je ~imbenik u razvoju mnogih karcinoma dojke i jajnika u ljudi.
Eikozanoidi
Vi{e vrsta lipida sluì kao signalne molekule koje, razli~ito od steroidnih hormona, djeluju tako da se veù za receptore na povr{ini stanice. Najva`nije od ovih molekula jesu pripadnici vrste lipida koje nazivamo eikozanoidima, {to uklju~uje prostaglandine, prostaciklin, tromboksane i leukotriene (sl. 13-8). Eikozanoidi se brzo razgra|uju i zbog toga djeluju lokalno u autokrinim ili parakrinim signalnim putevima. Oni poti~u raznovrsne odgovore u svojim ciljnim stanicama, kao {to su agregacija krvnih plo~ica, upala i kontrakcija glatkih mi{i}a. Svi se eikozanoidi stvaraju iz arahidonske kiseline, koja nastaje iz fosfolipida. Prvi korak puta koji vodi prema sintezi prostaglandina ili tromboksana jest pretvorba arahidonske kiseline u prostaglandin H2. Zanimljivo je da je ciljni enzim koji katalizira ovu reakciju (ciklooksigenaza), cilj djelovanja aspirina i drugih nesteroidnih protuupalnih lijekova. Aspirin smanjuje upalu i bol s pomo}u ko~enja sinteze prostaglandina, a ko~enjem sinteze tromboksana, aspirin smanjuje agregaciju krvnih plo~ica i zgru{avanje krvi.
549
fosfolipidi PLA2 arahidonska kiselina
Slika 13-8. Sinteza i struktura eikozanoida.

Eikozanoidi uklju~uju prostaglandine, prostaciklin, tromboksane i leukotriene. Oni se sintetiziraju iz arahidonske kiseline, koja nastaje hidrolizom fosfolipida djelovanjem fosfolipaze A2 (PLA2). Metabolizam arahidonske kiseline moè se odvijati na dva na~ina. Jedan put uzrokuje sintezu prostaglandina, prostaciklina i tromboksana, dok drugi dovodi do sinteze leukotriena.
OH COO
COO CH3
prostaglandin H2
O COO CH3 OH
OH
leukotrieni
leukotrien B4
drugi prostaglandini prostaciklin tromboksani

COO
prostaglandin A2
OH
OOC O
O O OH
COO
tromboksan A2
prostaciklin
OH OH
Zbog toga djelovanja, male dnevne doze aspirina ~esto se prepisuju za prevenciju mo`danog udara ili infarkta miokarda. [tovi{e, pokazano je da aspirin i nesteroidni protuupalni lijekovi smanjuju u~estalost raka debeloga crijeva (kolona) kako u ìvotinjskim modelima tako i u ljudi, o~ito time {to ko~e sintezu prostaglandina koji poti~u proliferaciju i promi~u razvoj raka.
Biljni hormoni
Rast i razvoj biljaka nadzire skupina malih molekula, koje se zovu biljni hormoni. Razina ovih molekula u biljaka tipi~no se mijenja pod utjecajem faktora iz okoli{a, kao {to su svjetlo ili infekcija, tako da se odgovori tkiva u razli~itim dijelovima biljke uskla|uju sa signalima iz okoline. Biljni su hormoni klasi~no podijeljeni u pet velikih skupina: auksini, giberelini, citokinini, apscizinska kiselina i etilen (sl. 13-9), iako je nedavno otkriveno nekoliko dodatnih biljnih hormona (kao {to su biljni steroidni hormoni). Prvi otkriveni biljni hormon je auksin, pri ~emu je rane pokuse koji su doveli do njegova otkri}a izveo Charles Darwin davne 1880. godine. Jedan od u~inaka auksina jest da zapo~inje izduìvanje biljne stanice oslabljivanjem stani~ne stijenke (vidi sliku 12-50). Dodatno, auksini nadziru mnoge druge vidove razvoja biljaka, kao {to su dioba stanice i diferencijacija. Drugi biljni hormoni isto tako imaju mnogostruke u~inke na ciljna tkiva, uklju~uju}i izduìvanje stabljike (giberelini), dozrijevanje vo}a (etilen), diobu stanice (citokinini) i zapo~injanje razdoblja mirovanja (apscizinska kiselina).
550
Poglavlje 13
O O C HOOC H H
H H CH2COOH OH
H HO
H3C
H H CH2
N H indol-3-octena kiselina (auksin)
giberelinska kiselina (giberelin)
H HN HN H C H etilen C H H N H zeatin (citokinin) N H C CH2 C
CH2OH CH3 N CH CH H H O H3C CH3
OH C H CH3 H C C
COOH CH
CH3
apscizinska kiselina
Slika 13-9. Struktura biljnih hormona.
Signalni putevi, koje pokre}u ovi hormoni u biljaka, koriste se razli~itim mehanizmima koji su sa~uvani u ìvotinjskim stanicama, kao i nekim elementima koji su jedinstveni za biljke. Primjerice, jedan dobro poznati put, koji je rasvijetljen geneti~kom analizom Arabidopsis thaliana, signalizira odgovor biljke na etilen. Dijelovi ovoga puta uklju~uju receptor za etilen na povr{ini biljne stanice, protein-kinazu koja je srodna protein-kinazama Raf u ìvotinjskim stanicama i novi faktor transkripcije koji nadzire ekspresiju gena na koje djeluje etilen.
Djelovanje stani~nih povr{inskih receptora

Kao {to je ve} opisano, ve}ina liganda odgovornih za signaliziranje izme|u dviju stanica (poput neurotransmitora, peptidnih hormona i faktora rasta) veè se za receptore na povr{ini ciljne stanice. Zbog toga je glavni izazov u razumijevanju signaliziranja izme|u dviju stanica otkrivanje mehanizama kojima receptori na povr{ini stanice prenose signale zapo~ete vezanjem liganda. Kao {to je raspravljeno u 12. poglavlju, neki receptori za neurotransmitore ujedno su ionski kanali koji tako izravno nadziru protjecanje iona kroz stani~nu membranu. Drugi receptori na povr{ini stanice, kao {to su receptori za peptidne hormone i faktore rasta, djeluju tako da nadziru djelovanje unutarstani~nih proteina. Ti proteini potom prenose signale od receptora do niza dodatnih unutarstani~nih ciljeva, {to ~esto uklju~uje transkripcijske faktore. Tako ligand, koji se vezao za receptor na povr{ini stanice, zapo~inje slijed unutarstani~nih promjena, a signal na posljetku dopire do jezgre ciljne stanice i dovodi do programiranih promjena u genskoj ekspresiji. Najprije }emo opisati djelovanje glavnih skupina receptora na povr{ini stanice, dok se o nizvodnim putevima unutarstani~noga signaliziranja tih receptora raspravlja u sljede}em odsje~ku ovoga poglavlja.
551
Slika 13-10. Struktura receptora povezanih s G-proteinima.

Osobina receptora povezanih s G-proteinima je sedam transmembranskih a-uzvojnica.
izvan stanice
ugljikohidrat N
Receptori povezani s G-proteinima

Najve}a porodica receptora na povr{ini stanice prenosi signale do unutarstani~nih ciljeva posredstvom proteina koji veù gvanin-nukleotid, nazvanih G-proteinima. Identificirano je vi{e od tisu}u receptora povezanih s G-proteinima, uklju~uju}i receptore za eikozanoide, mnoge neurotransmitore, neuropeptide i peptidne hormone. Dodatno, porodica receptora povezanih s G-proteinima uklju~uje veliki broj receptora koji su odgovorni za miris, vid i okus. Receptori povezani s G-proteinima strukturno su i funkcionalno srodni proteini, ~ija je osobina sedam membranskih -uzvojnica koje prolaze kroz membranu (sl. 13-10). Vezanje liganda za izvanstani~nu domenu receptora zapo~inje konformacijsku promjenu, koja omogu}uje vezanje citosolne domene receptora za G-protein povezan s unutra{njom stranom stani~ne membrane. Ovo me|udjelovanje aktivira G-protein, koji se potom odvaja od receptora i prenosi signal do unutarstani~noga cilja, koji moè biti enzim ili ionski kanal. G-protein je otkriven tijekom prou~avanja hormona (kao {to je adrenalin) koji nadziru sintezu cikli~kog AMP (cAMP) u ciljnim stanicama. Kao {to se raspravlja dalje u ovom poglavlju, cAMP je vaàn drugi glasnik koji posreduje stani~ne odgovore na razli~ite hormone. Godine 1970., Martin Rodbell i suradnici zapazili su da je GTP potreban za hormonsku stimulaciju adenil-ciklaze (enzima koji je odgovoran za stvaranje cAMP-a). Ovo zapaànje je dovelo do otkri}a da je protein koji veè gvanin-nukleotid (nazvan G-protein) posrednik u aktivaciji adenil-ciklaze (sl. 13-11). Od tada je prona|eno mnogo G-proteina, koji djeluju kao fiziolo{ki prekida~i koji reguliraju djelovanje razli~itih unutarstani~nih ciljeva u odgovoru na izvanstani~ne signale. G-proteini se sastoje od tri podjedinice, ozna~ene kao a, b i g (sl. 13-12). êsto se nazivaju heterotrimerni G-proteini, kako bi se razlikovali od drugih proteina koji veù gvanin-nukleotid, kao {to su to proteini Ras o kojima se raspravlja dalje u ovom poglavlju. Gvanin-nukleotidi, koji nadziru aktivnost G-proteina, veù se na a-podjedinicu. U mirovanju, a-podjedinica vezana je za GDP u kompleksu s b- i g-podjedinicama. Vezanje hormona uzrokuje konformacijsku promjenu receptora, tako da dolazi do me|udjelova-
unutar stanice
hormon adenil-ciklaza
receptor
bg a G-protein stani~na membrana cAMP
Slika 13-11. Aktivacija adenil-ciklaze hormonom.

Vezanje hormona poti~e me|udjelovanje receptora i G-proteina. Potom se aktivirana -podjedinica G-proteina odvaja od receptora i stimulira adenil-ciklazu, koja katalizira pretvorbu ATP u cAMP .
552
Poglavlje 13
receptor Aktivnost a-podjedinice zavr{ava a-podjedinica koja veè GDP ponovno se spaja s bg-kompleksom. Pi hidroliza GTP bg a GDP
U inaktivnom stanju, a-podjedinica je vezana s b i g.
G-protein (inaktivno stanje)
hormon receptor GDP izmjena nukleotida bg a Aktivirana a-podjedinica koja veè GTP i bg-kompleks odvajaju se od receptora i djeluju na ciljne proteine. GDP
(inaktivno stanje)
ciljni proteini
receptora i G-proteina, te stimulira otpu{tanje GDP u zamjenu za GTP.
Slika 13-12. Regulacija G-proteina.
nja citosolne domene receptora s G-proteinom, te se poti~e otpu{tanje vezanoga GDP u zamjenu za GTP Aktivirana podjedinica a, za koju je vezan . GTP disocira od b- i g-podjedinica, koje ostaju povezane i djeluju kao bg, kompleks. Potom aktivna a-podjedinica, za koju je vezan GTP i bg-komple, ks djeluju na svoje ciljeve kako bi izazvali unutarstani~ni odgovor. Aktivnost a-podjedinice prestaje hidrolizom vezanoga GTP te se inaktivna , podjedinica (uz koju je sada vezan GDP) ponovo spaja s bg-kompleksom, kako bi ciklus mogao po~eti iz po~etka. Genom sisavaca kodira najmanje 20 razli~itih a-podjedinica, 6 b-podjedinica i 11 g-podjedinica. Razli~iti G-proteini povezani su s razli~itim receptorima, tako da G-proteini povezuju receptore s razli~itim unutarstani~nim ciljevima. Primjerice, G-protein koji je povezan s receptorom za adrenalin nazivamo Gs budu}i da njegova a-podjedinica stimulira adenil-ciklazu (vidi sliku 13-11). a- i bg-podjedinice drugih G-proteina djeluju suprotno, time {to inhibiraju adenil-ciklazu ili nadziru aktivnost drugih ciljnih enzima. Osim toga {to nadziru ciljne enzime, a- i bg-podjedinice nekih G-proteina izravno nadziru ionske kanale. Dobar je primjer djelovanje neurotransmitora acetilkolina na sr~ani mi{i}, koje se razlikuje od njegovoga djelovanja na ìv~ano vlakno ili skeletni mi{i}. Nikotinski acetilkolinski receptor na ìv~anom vlaknu i skeletnom mi{i}u jest ionski kanal nadziran ligandom (vidi sliku 12-23). Stanice sr~anoga mi{i}a imaju razli~it acetilkolinski receptor, koji je povezan s G-proteinom. Taj se G-protein ozna~uje kao Gi budu}i da njegova a-podjedinica inhibira adenil-ciklazu. Dodatno, bg-pod-
553
jedinica Gi proteina izravno otvara kalijske kanale u stani~noj membrani, {to uzrokuje usporavanje kontrakcije sr~anoga mi{i}a.
Receptorske protein-tirozin-kinaze
Razli~ito od receptora povezanih s G-proteinima, drugi receptori na stani~noj povr{ini izravno su povezani s unutarstani~nim enzimima. Najve}a porodica takvih receptora povezanih s enzimima su receptorske protein-tirozin-kinaze, koje fosforiliraju proteinske supstrate na tirozinu. Ova porodica uklju~uje receptore za ve}inu polipeptidnih faktora rasta, te je stoga fosforilacija proteina na tirozinu posebno dobro prou~ena kao mehanizam signaliziranja uklju~en u nadzor rasta i diferencijacije ìvotinjskih stanica. Prvu protein-tirozin-kinazu otkrili su Tony Hunter i Bartolomew Sefton tijekom prou~avanja onkogenih proteina ìvotinjskih tumorskih virusa, i to Rousova sarkomskoga virusa, 1980. godine. Stanley Cohen i suradnici otkrili su da EGF-receptor djeluje kao protein-tirozin-kinaza, {to je potvrdilo da je fosforilacija proteina na tirozinu klju~ni mehanizam signaliziranja u odgovoru na podraìvanje stanice faktorom rasta. Ljudski genom kodira 58 receptorskih protein-tirozin-kinaza, uklju~uju}i receptore za EGF, NGF, PDGF, inzulin i mnoge druge faktore rasta. Svi ti receptori imaju zajedni~ko strukturno ustrojstvo: izvanstani~nu domenu na N-kraju koja veè ligand, jednu -uzvojnicu koja se proteè kroz membranu i citosolnu domenu na C-kraju koja ima protein-tirozin-kinaznu aktivnost (sl. 13-13). Ve}ina receptorskih protein-tirozin-kinaza sastoji se od jednoga polipeptida, iako su inzulinski receptor i njemu sli~ni receptori, dimeri koje ~ine dva polipeptidna lanca. Vezanje liganda (npr. faktora rasta) za izvanstani~nu domenu tih receptora aktivira njihovu citosolnu kinaznu domenu, te uzrokuje fosforilaciju i samoga receptora i unutarstani~nih ciljnih proteina, preko kojih se {iri signal, koji je zapo~eo vezanjem faktora rasta.
izvan stanice
N N
N a-podjedinica
domena nalik na Ig
Slika 13-13. Ustrojstvo receptorskih protein-tirozin-kinaza.

Pojedini receptor sastoji se od izvanstani~ne domene na N-kraju za vezanje liganda, jedne transmembranske -uzvojnice i unutarstani~ne domene na C-kraju s protein-tirozin-kinaznom aktivno{}u. Prikazana je struktura triju razli~ite potporodice receptorskih protein-tirozin-kinaza. Receptor za EGF i receptor za inzulin imaju izvanstani~ne domene bogate cisteinom, dok receptor za PDGF ima domenu nalik na imunoglobulin (Ig). Receptor za PDGF zna~ajan je po tome {to ima kinaznu domenu prekinutu umetkom od pribli`no stotinu aminokiselina, koje nisu srodne s onima u ve}ini ostalih protein-tirozinkinaznih domena. Receptor za inzulin je, pak, neobi~an po tome {to je dimer, gra|en od dvaju parova polipeptidnih lanaca (ozna~enih a i b).
domene bogate cisteinom stani~na membrana
N
S S
S S
S S
N b-podje-
tirozinkinazna domena C receptor za EGF C C receptor za inzulin C receptor za PDGF
citosol
554
Poglavlje 13
Src protein-tirozin-kinaza
Transforming Gene Product of Rous Sarcoma Virus Phosphorylates Tyrosine Tony Hunter i Bartholomew M. Sefton
The Salk Institute, San Diego, CA Proceedings of the National Academy of Science, USA, 1980, Volume 77, stranice 13111315
Kontekst
Nakon izolacije 1911. godine, Rousov sarkomski virus (RSV) postao je pr vi virus za koji je op}enito prihva}eno da uzrokuje tumore u ìvotinja (vidi odlomak Molekular na medicina u 1. poglavlju). RSV se pokazao privla~nim modelom za prou~avanje razvoja raka zbog nekoliko osobina. Mali genom RSV pobudio je nadu da je mogu}e identificirati virusni gen koji je odgovoran za poticanje nekontrolirane proliferacije, {to je osobina stanica raka. Ovaj je cilj postignut 1970. godine, kad je otkriveno da je jedan gen RSV (nazvan src, prema engl. sarcoma) nuàn za poticanje rasta tumora. Nadalje, gen koji je srodan genu src prona|en je tako|er u normalnom genomu razli~itih kralje`njaka, uklju~uju}i i ljudski. Budu}i da je virusni Src-protein odgovoran za nekontroliranu proliferaciju stanica raka, ~inilo se da bi razumijevanje djelovanja proteina Src dalo klju~ni uvid u molekular nu osnovu indukcije raka i regulaciju nor malne proliferacije stanica. Godine 1977., Ray Erikson i suradnici, identificirali su protein Src imunoprecipitacijom (vidi sl. 3-30) s pomo}u protutijela dobivenih iz ìvotinja koje su imale tumore potaknute RSV. Ubrzo nakon toga, otkriveno je da inkubacija Src-imunoprecipitata s radioaktivnim ATP uzrokuje fosforilaciju imunoglobulinskih molekula. Stoga je zaklju~eno da je Src protein-kinaza, {to je jasno uputilo na ulogu fosforilacije proteina u nadzoru nad proliferacijom stanica. Sve do tada prou~avane protein-kinaze fosforilirale su serin ili treonin,
te su fosforilirani serin i treonin bile jedine fosfoaminokiseline prona|ene u ìvotinjskim stanicama. Me|utim, Walter Eckhardt i Tony Hunter su godine 1979. zapazili da su onkogeni proteini drugih ìvotinjskih tumorskih virusa (poliomavirusi) fosforilirani na tirozinu. Stoga su Hunter i Sefton ispitali mogu}nost da Src moè fosforilirati tirozin umjesto serin/treonina u svojim proteinskim supstratima. Njihovi su pokusi pokazali da Src doista djeluje kao protein-tirozin-kinaza, a danas se zna da ta aktivnost ima glavnu ulogu u stani~nim signalnim putevima.
Tony Hunter
Bartholomew Sefton
Eksperimenti
Hunter i Sefton otkrili su aminokiselinu koju fosforilira Src tako da su inkubirali Src-imunoprecipitate s 32P-ozna~enim ATP. Zbog toga se radioaktivno obiljeìla ona aminokiselina u proteinskom supstratu (u ovom slu~aju, imunoglobulinu), koja je fosforilirana s pomo}u Src. Potom je imunoglobulin izoliran i hidroliziran, kako bi se dobile pojedine aminokiseline i analizirale metodama elektroforeze i kromatografije, koje su odvojile fosfotirozin, fosfoserin i fosfotreonin (vidi sliku). Radioaktivna aminokiselina odre|ena u ovim pokusima bio je fosfotirozin, {to je upu}ivalo da Src specifi~no fosforilira tirozin. Sljede}i su pokusi pokazali da nor malni stani~ni Src-protein, kao i virusni Src, djeluje kao protein-tirozin-kinaza u imunoprecipitacijskom eseju. Hunter i Sefton dodatno su pro{irili ove in vitro pokuse, time {to su pokazali da je fosfotirozin prisutan u proteinima koji su izolirani iz cijelih stanica. U nor malnim stanicama, fosfotirozin ~ini samo 0,03% od ukupne koli~ine fosforiliranih aminokiselina (ostalo ~ine fosfoserin i fosfotreonin), {to obja{njava za{to je promakla detek-
Tyr(P) Thr(P) Ser(P)
Odre|ivanje fosfotirozina u imunoglobulinu fosforiliranom s pomo}u Src. Imunoprecipitat, koji sadràva RSV Src inkubiran je s 32P-ATP. Potom je imunoglobulin izoliran i hidroliziran. Uporabom elektroforeze i tankoslojne kromatografije odvojene su aminokiseline iz hidrolizata. Poloàj aminokiselina obiljeènih s 32P odre|en je tako da je plo~a za tankoslojnu kromatografiju izloèna rentgenskom filmu. Isprekidane crte ozna~uju poloàje neobiljeènih fosfoaminokiselina koje su uklju~ene kao biljezi. Uo~ite da je fosfotirozin glavna aminokiselina koja je obiljeèna s 32P .
555
cija fosfotirozina u prethodnim mjerenjima. Me|utim, koli~ina fosfotirozina pribli`no je deset puta ve}a u stanicama inficiranim s RSV, {to upu}uje na zaklju~ak da je pove}ana aktivnost protein-tirozin-kinaze virusnog Srcproteina odgovor na za njegovu sposobnost da potakne nekontroliranu proliferaciju.
Utjecaj
Otkri}e da je Src protein-tirozinkinaza istodobno je utvrdilo postoja-
nje nove protein-kinazne aktivnosti i povezalo tu aktivnost s nadzorom nad stani~nom proliferacijom. Nakon otkri}a Huntera i Seftona, pokazano je da mnogi drugi virusni proteini tako|er djeluju kao protein-tirozin-kinaze, a to je uop}ilo vezu izme|u proteintirozin fosforilacije i nekontrolirane proliferacije stanica raka. Stanley Cohen i suradnici, prona{li su da je EGF-receptor protein-tirozin-kinaza, {to je izravno povezalo fosforilaciju proteina na tirozinu s nadzorom nor-
malne proliferacije stanica. Daljnjim su prou~avanjima odre|eni brojni dodatni receptori i nereceptorske protein-tirozin-kinaze, koje pripadaju razli~itim signalnim putevima u stanici. Prou~avanje mehanizama, kojima virusi uzrokuju rak u pili}a, dovelo je do otkri}a dotad nepoznatih enzimskih aktivnosti koje igraju sredi{nju ulogu u signalnim putevima, a koje nadziru rast ìvotinjskih stanica, preìvljenje i diferencijaciju.
Prvi korak u signaliziranju koje posreduju receptorske protein-tirozin-kinaze jest dimerizacija receptora u odgovoru na vezanje liganda (sl. 13-14). Neki faktori rasta, kao {to su PDGF i NGF, sami po sebi su dimeri, koji se sastoje od dvaju istovjetnih polipeptidnih lanaca, pa ti faktori rasta izravno poti~u dimerizaciju istodobnim vezanjem za dvije susjedne molekule receptora. Drugi faktori rasta (kao EGF) jesu monomeri, ali dovode do dimerizacije receptora jer uzrokuju konformacijske promjene koje poti~u me|udjelovanje dvaju proteina izme|u razli~itih receptorskih polipeptida. Dimerizacija, koja je potaknuta ligandom, uzrokuje autofosforilaciju receptora jer se dva polipeptidna lanca uzajamno fosforiliraju (vidi sliku 1314). Takva fosforilacija ima dvije klju~ne uloge u signaliziranju tim receptorima. Prvo, fosforilacija tirozina unutar kataliti~ke domene pove}ava aktivnost protein-kinaze. Drugo, fosforilacija tirozina izvan kataliti~ke domene oblikuje specifi~no vezno mjesto za dodatne proteine koji prenose unutarstani~ne signale nizvodno od aktiviranih receptora. Nizvodne signalne molekule povezane su s receptorskom protein-tirozin-kinazom s pomo}u proteinskih domena koje veù specifi~ne peptide
Slika 13-14. Dimerizacija i autofosforilacija protein-tirozin-kinaznoga receptora.

Vezanje faktora rasta poti~e dimerizaciju receptora, {to uzrokuje autofosforilaciju receptora, pri ~emu se dva polipeptidna lanca uzajamno fosforiliraju.
dimerizacija receptora N N faktor rasta
autofosforilacija N N faktor rasta
stani~na membrana
stani~na membrana
stani~na membrana
tirozin-kinazna domena P C C C C C C
556
Poglavlje 13
Slika 13-15. Spajanje nizvodnih signalnih molekula s receptorskim protein-tirozin-kinazama.

SH2-domene veù se za specifi~ne peptide aktiviranih receptora koji sadràvaju fosfotirozin.
N faktor rasta
stani~na membrana P P nizvodna signalna molekula P C SH2-domena C SH2-domena P P P nizvodna signalna molekula
koji sadràvaju fosfotirozin (sl. 13-15). Prve su takve opisane domene nazvane SH2-domene (SH2, prema engl. Src homology 2) budu}i da su prvotno zapaène u protein-tirozin-kinazama koje su srodne onkogenom proteinu Src iz Rousova sarkomskoga virusa. SH2-domena sastoji se od pribli`no stotinu aminokiselina i veè specifi~ne kratke peptidne sljedove koje sadràvaju fosfotirozin (sl. 13-16). Drugi se proteini veù za peptide koji sadràvaju fosfotirozin putem PTB-domena (PTB, prema engl. phosphotyrosinebinding, vezanje fosfotirozina). Povezivanje proteina koji sadràvaju SH2 ili PTB s aktiviranim receptorskim protein-tirozin-kinazama moè imati nekoliko u~inaka. Proteini se lokaliziraju na stani~nu membranu, povezuju se s drugim proteinima, poti~e se njihova fosforilacija i pove}ava enzimska aktivnost. Tako povezivanje tih proteina s autofosforiliranim receptorima
Slika 13-16. Kompleks SH2-domene i peptida s fosfotirozinom.

Polipeptidni lanac Src sa SH2 domenom prikazan je crvenom bojom pri ~emu je njegova povr{ina ozna~ena zelenim to~kama. Ljubi~aste kuglice ozna~uju `lijeb na povr{ini. Tri aminokiselinska ostatka koja veù fosfotirozin prikazana su plavom bojom. Peptid koji sadràva fosfotirozin prikazan je kao model koji ispunjava prostor. @ute kuglice ozna~uju atome kostura, a bijele atome bo~nih lanaca, dok je fosfatna skupina prikazana crvenom bojom. (Iz: G. Waksman i 13 ostalih autora, 1992. Nature 358:646.)
557
predstavlja prvi korak u unutarstani~nom prijenosu signala koji je zapo~eo vezanjem faktora rasta za povr{inu stanice.
Receptori za citokine i nereceptorske protein-tirozin-kinaze

Mnogi receptori nemaju vlastitu enzimsku aktivnost, ve} djeluju tako da poti~u unutarstani~ne protein-tirozin-kinaze s kojima su povezani s pomo}u nekovalentnih veza. Ova porodica receptora (nazvana superporodicom receptora za citokine) uklju~uje receptore za citokine (primjerice, interleukin-2 i eritropoetin) i za neke polipeptidne hormone (npr. hormon rasta). Poput receptorskih protein-tirozin-kinaza, receptori za citokine sadràvaju izvanstani~ne domene za vezanje liganda na N-kraju, jednu transmembransku a-uzvojnicu i citosolne domene na C-kraju. Me|utim, citosolne domene receptora za citokine li{ene su svake kataliti~ke aktivnosti. Umjesto toga, receptori za citokine djeluju zdruèno s nereceptorskim proteintirozin-kinazama, koje se aktiviraju u odgovoru na vezanje liganda. Smatra se da je prvi korak u signaliziranju receptorima za citokine dimerizacija receptora u odgovoru na vezanje liganda, te uzajamna fosforilacija pridruènih nereceptorskih protein-tirozin-kinaza. (sl. 13-17). Aktivirane kinaze potom fosforiliraju receptor i tako stvaraju fosfotirozinska vezna mjesta za nova~enje nizvodnih signalnih molekula koje sadràvaju SH2-domene. Kombinacije receptora za citokine zajedno s pridruènim nereceptorskim protein-tirozin-kinazama djeluju istovjetno kao receptorske protein-tirozin-kinaze o kojima smo raspravljali u prethodnom odlomku. Kinaze zdruène s receptorima za citokine pripadaju porodici Janus-kinaza ili JAK, koja se sastoji od ~etiriju srodnih nereceptorskih protein-tirozin-kinaza. îni se da su pripadnici JAK-porodice uvijek nu`ni za signaliziranje potaknuto receptorima za citokine, te da porodica JAK-kinaza ima klju~nu ulogu u povezivanju tih receptora s tirozinskom fosforilacijom unutarstani~nih ciljeva. Druge nereceptorske protein-tirozin-kinaze pripadaju porodici Src koja se sastoji od Src i osam srodnih proteina. Kao {to smo ve} spomenuli, Src je otkriven kao onkogeni protein Rousova sarkomskoga virusa i kao prvi protein koji posjeduje protein-tirozin-kinaznu aktivnost, te je tako odigrao va`nu ulogu u pokusima koji su doveli do na{ega dana{njega razumijevanja stani~noga signaliziranja. Pripadnici Src-porodice imaju klju~ne uloge u signaliziranju nizvodno od receptorskih protein-tirozin-kinaza, od antigenskih receptora na limfocitima B i T, te od integrinskih receptora na mjestima pri~vr{}ivanja stanica za izvanstani~ni matriks.
citokin receptor
stani~na membrana
nereceptorska tirozin-kinaza
uzajamna fosforilacija nereceptorskih kinaza
stani~na membrana
Receptori povezani s drugim enzimskim aktivnostima

Iako velika ve}ina receptora povezanih s enzimima poti~e protein-tirozinsku fosforilaciju, neki su receptori povezani s enzimima koji imaju druga~iju aktivnost. Ti receptori uklju~uju protein-tirozin-fosfataze, protein-serin/ treonin-kinaze i gvanil-ciklaze. Protein-tirozin-fosfataze uklanjaju fosfatnu skupinu s fosfotirozinskih ostataka, te tako odràvaju ravnoteù u~inku protein-tirozin-kinaza. U mnogim slu~ajevima, protein-tirozin-fosfataze imaju negativnu nadzornu
fosforilacija receptora
stani~na membrana
Slika 13-17. Signaliziranje receptorima za citokine.

Vezanje liganda poti~e dimerizaciju receptora i dovodi do aktivacije pridruènih nereceptorskih protein-tirozin-kinaza, {to je posljedica uzajamne fosforilacije. Aktivirane kinaze potom fosforiliraju tirozinske ostatke receptora i oblikuju fosfotirozinska vezna mjesta za nizvodne signalne molekule.
P P P P
558
Poglavlje 13
ulogu u stani~nim signalnim putevima jer zavr{avaju signale koji zapo~inju fosforilacijom proteina na tirozinu. Me|utim, neke su proteinske tirozin-fosfataze receptori na stani~noj povr{ini ~ija enzimska aktivnost ima pozitivnu ulogu u stani~nom signaliziranju. Dobar primjer je receptor, nazvan CD45, koji je izraèn na povr{ini limfocita T i B. Nakon antigenskog podraàja, CD45 defosforilira specifi~ni fosfotirozin koji ko~i enzimsku aktivnost pripadnika porodice Src. Tako proteinska tirozin-fosfataza CD45 poti~e (a {to je pomalo paradoksalno) nereceptorske protein-tirozin-kinaze. Receptori za transformiraju}i faktor rasta b (TGF-b, prema engl. transforming growth factor b) i srodne polipeptide jesu protein-kinaze koje, umjesto tirozina, fosforiliraju serinske ili treoninske ostatke na svojim proteinskim supstratima. TGF-b je prototip porodice polipeptidnih faktora rasta koji nadziru proliferaciju i diferencijaciju razli~itih stanica, op}enito tako da ko~e proliferaciju ciljnih stanica. Kloniranje prvoga receptora za jedan od ~lanova porodice TGF-b godine 1991. pokazalo je da je receptor prototip jedinstvene porodice receptora s citosolnom protein-serin/treonin-kinaznom domenom. Otada je otkriveno da su receptori za dodatne ~lanove TGF-b-porodice tako|er protein-serin/treonin-kinaze. Vezanje liganda za ove receptore uzrokuje spajanje dvaju razli~itih polipeptidnih lanaca koje kodiraju razli~iti pripadnici porodice TGF-b-receptora. Tako se oblikuju heterodimeri u kojima jedna receptorska kinaza fosforilira drugu. Potom aktivirani TGF-breceptori fosforiliraju pripadnike porodice transkripcijskih faktora nazvanih SMAD, koji se premje{taju u jezgru i poti~u ekspresiju ciljnih gena. Neki peptidni ligandi veù se za receptore ~ije su citosolne domene gvanil-ciklaze, koje kataliziraju nastanak cikli~koga GMP Kao {to je ranije ras. pravljeno, du{ikov oksid tako|er poti~e gvanil-ciklazu, no du{ikov oksid djeluje na unutarstani~ni enzim, a ne na transmembranski receptor. Receptorske gvanil-ciklaze imaju izvanstani~nu domenu za vezanje liganda, jednu transmembransku a-uzvojnicu i citosolnu domenu s kataliti~kom aktivno{}u. Vezanje liganda poti~e aktivnost ciklaze i uzrokuje stvaranje cGMPa, drugoga glasnika o ~ijim se unutarstani~nim u~incima raspravlja u sljede}em odlomku ovoga poglavlja. Drugi receptori veù citoplazmatske proteine s dodatnom biokemijskom aktivno{}u. Primjerice, citokin, faktor tumorske nekroze (TNF, prema engl. tumor necrosis factor) uzrokuje stani~nu smrt, {to je jedan od na~ina kako se mogu ukloniti o{te}ene ili nepoèljne stanice iz tkiva (kao {to se raspravlja dalje u ovom poglavlju). Receptori za TNF i srodne molekule koje signaliziraju smrt, povezani su sa specifi~nim proteazama, a aktiviraju se u odgovoru na vezanje liganda. Aktivacija tih proteaza povezanih s receptorima zapo~inje aktivaciju dodatnih nizvodnih proteaza, a to u kona~nici uzrokuje razgradnju razli~itih unutarstani~nih proteina i smrt stanice.
Putevi unutarstani~noga prijenosa signala

Ve}ina receptora na povr{ini stanice poti~e unutarstani~ne ciljne enzime, koji mogu biti direktno ili indirektno povezani s receptorima preko G-proteina. Ovi unutarstani~ni enzimi sluè kao nizvodni signalni elementi {to prenose i poja~avaju signal koji je zapo~eo vezanjem liganda. U ve}ini slu~ajeva, lanac reakcija prenosi signale od povr{ine stanice do razli~itih unutarstani~nih ciljeva i taj se proces naziva unutarstani~ni prijenos signala. Ciljevi ovakvih signalnih puteva ~esto uklju~uju transkripcijske faktore koji nadziru ekspresiju gena. Unutarstani~ni signalni putevi tako povezuju povr{inu stanice s jezgrom i uzrokuju promjene u genskoj ekspresiji u odgovoru na izvanstani~ni podraàj.
559
O
O
O O CH2 H H HO O ATP O adenin H H OH adenil-ciklaza

O
P O
CH2 H H O
adenin H H OH cAMP-fosfodiesteraza
P O
CH2 H H
adenin H H OH
P O
O P O
OH AMP
P O
cikli~ki AMP
Slika 13-18. Sinteza i razgradnja cAMP.
cAMP-put: drugi glasnici i fosforilacija proteina

Unutarstani~no signaliziranje je prvotno razja{njeno prou~avanjem djelovanja hormona kao {to je adrenalin, koji signalizira razgradnju glikogena na glukozu {to prethodi mi{i}noj aktivnosti. Godine 1958., Earl Sutherland otkrio je da je u~inak adrenalina posredovan pove}anjem unutarstani~ne koncentracije cikli~kog AMP (cAMP), {to je dovelo do koncepta da je cAMP drugi glasnik u hormonskom signaliziranju (pri ~emu je prvi glasnik sam hormon). Cikli~ki AMP nastaje iz ATP djelovanjem adenil-ciklaze i razgra|uje se do AMP djelovanjem cAMP-fosfodiesteraze (sl. 13-18). Kao {to je ve} opisano, receptor za adrenalin povezan je s adenil-ciklazom putem G-proteina koji poti~e enzimsku aktivnost, te tako pove}ava unutarstani~nu koncentraciju cAMP (vidi sliku 13-11). Kako cAMP signalizira razgradnju glikogena? Taj, i ve}ina drugih u~inaka, cAMP u ìvotinjskim stanicama posredovan je djelovanjem protein-kinaze ovisne o cAMP ili protein-kinaze A, enzima koji su 1968. godine otkrili Donal Walsh i Ed Krebs. Inaktivni oblik protein-kinaze A jest tetramer, koji se sastoji od dviju kataliti~kih i dviju regulacijskih podjedinica (sl. 1319). Cikli~ki AMP se veè za regulacijske podjedinice i odvaja ih od kataliti~kih podjedinica. Slobodne su kataliti~ke podjedinice tada enzimski aktivne, te mogu fosforilirati serinske ostatke na ciljnim proteinima. U nadzoru nad metabolizmom glikogena, protein-kinaza A fosforilira dva klju~na ciljna enzima (sl. 13-20). Prvi je druga protein-kinaza, fosforilaza-kinaza, koja se fosforilira i aktivira s pomo}u protein-kinaze A. Fosforilaza-kinaza potom fosforilira i aktivira glikogen-fosforilazu, koja katalizira razgradnju glikogena do glukoza-1-fosfata. Dodatno, protein-kinaza A fosforilira enzim glikogen-sintazu, koji katalizira sintezu glikogena. Me|utim, u ovom slu~aju, fosforilacija inhibira enzimsku aktivnost. Porast razine cAMP i aktivacija protein-kinaze A tako onemogu}uju daljnju sintezu glikogena, dok istovremeno poti~u njegovu razgradnju. Lanac reakcija koji vodi od receptora za adrenalin do glikogen-fosforilaze predstavlja dobar primjer poja~avanja signala tijekom unutarstani~noga prijenosa signala. Svaka molekula adrenalina aktivira samo jedan receptor. Me|utim, svaki receptor moè aktivirati do stotinu molekula Gs, a svaka molekula Gs potom stimulira enzimsku aktivnost adenil-ciklaze, koja moè katalizirati sintezu mnogo molekula cAMP Poja~avanje signala dalje se na. stavlja jer pojedina molekula protein-kinaze A fosforilira mnogo molekula
Cikli~ki AMP nastaje iz ATP djelovanjem adenil-ciklaze, a razgra|uje se do AMP djelovanjem cAMP-fosfodiesteraze.
C cAMP cAMP cAMP cAMP
C inaktivna
cAMP cAMP R
cAMP cAMP R
aktivna
Slika 13-19. Regulacija protein-kinaze A.

Inaktivni oblik protein-kinaze A sastoji se od dviju regulacijskih (R) i dviju kataliti~kih (C) podjedinica. Vezanje cAMP za regulacijske podjedinice poti~e konformacijsku promjenu, koja uzrokuje odvajanje i enzimsku aktivaciju kataliti~kih podjedinica.
C C
560
Poglavlje 13
inaktivna
fosforilaza-kinaza
ADP
ADP
inaktivna P
inaktivna ADP
glikogen-fosforilaza
glikogen
glukoza-1-fosfat
Slika 13-20. Regulacija metabolizma glikogena s pomo}u protein-kinaze A.

Protein-kinaza A fosforilira glikogen-sintazu i fosforilaza-kinazu. Ta fosforilacija ko~i glikogen-sintazu (koja katalizira sintezu glikogena), a poti~e fosforilaza-kinazu. Potom fosforilaza-kinaza fosforilira i aktivira glikogen-fosforilazu, koja katalizira razgradnju glikogena do glukoza-1-fosfata.
fosforilaza-kinaze, a one potom fosforiliraju mnogo molekula glikogen-fosforilaze. Vezanje hormona za malen broj receptora tako dovodi do aktivacije mnogo ve}eg broja unutarstani~nih ciljnih enzima. U brojnim ìvotinjskim stanicama, porast razine cAMP aktivira transkripciju specifi~nih ciljnih gena koji sadràvaju regulacijske sljedove nazvane elementi odgovora na cAMP ili CRE (prema engl. cAMP response element) (sl. 13-21). U ovom slu~aju, signal se prenosi iz citoplazme u jezgru posredstvom kataliti~ke podjedinice protein-kinaze A, koja moè u}i u jezgru nakon odvajanja od regulacijske podjedinice. Unutar jezgre, protein-kinaza A fosforilira transkripcijski faktor nazvan CREB (prema engl. CRE-binding protein, protein koji veè CRE), te dovodi do aktivacije gena koje poti~e cAMP . Takva regulacija genske ekspresije s pomo}u cAMP-a ima va`nu ulogu u nadzoru nad proliferacijom, preìvljenjem i diferencijacijom razli~itih animalnih stanica. Va`no je uo~iti da protein-kinaze, kao {to je protein-kinaza A, ne djeluju izdvojeno unutar stanice. Naprotiv, fosforilacija proteina brzo prestaje zbog u~inka protein-fosfataza. Neke su protein-fosfataze transmembranski receptori, kao {to smo raspravili u prethodnom odsje~ku. Brojne druge fosfataze su citosolni enzimi koji uklanjaju fosfatne skupine s fosforiliranoga tirozina ili serin/treonina u proteinskim supstratima. Uloga je tih proteinfosfataza da zavr{e odgovor koji je zapo~et receptorskom aktivacijom protein-kinaza. Primjerice, serin u proteinu koji fosforilira protein-kinaza A obi~no se defosforilira djelovanjem fosfataze nazvane protein-fosfataza 1 (sl. 13-22). Stoga je razina fosforilacije supstrata protein-kinaze A (kao {to
561
Slika 13-21. Genska ekspresija koju inducira cAMP.

Slobodna kataliti~ka podjedinica protein-kinaze A premje{ta se u jezgru i fosforilira transkripcijski faktor CREB (protein koji veè CRE), te poti~e ekspresiju gena potaknutih cAMP .
cAMP
protein-kinaza A C citosol
R C
su fosforilaza-kinaza i CREB) odre|ena ravnoteòm izme|u unutarstani~noga djelovanja protein-kinaze A i u~inka protein-fosfataze. Iako je ve}ina u~inaka cAMP posredovana protein-kinazom A, cAMP tako|er moè izravno nadzirati ionske kanale, neovisno o fosforilaciji proteina. Na taj na~in, cAMP djeluje kao drugi glasnik u osjetu mirisa. Mnogi receptori za prepoznavanje mirisa u senzornim neuronima nosa jesu receptori povezani s G-proteinima koji stimuliraju adenil-ciklazu i dovode do porasta razine unutarstani~noga cAMP Umjesto stimuliranja protein-kinaze . A, cAMP u ovom sustavu izravno otvara Na+-kanale u stani~noj membrani, te dovodi do depolarizacije membrane i zapo~injanja ìv~anoga impulsa.
jezgra
Cikli~ki GMP
Cikli~ki GMP (cGMP) tako|er je vaàn drugi glasnik u ìvotinjskim stanicama, iako njegovu ulogu ne razumijemo tako dobro kao ulogu cAMP Cik. li~ki GMP nastaje iz GTP djelovanjem gvanil-ciklaze, a razgra|uje se do GMP djelovanjem fosfodiesteraze. Kao {to je raspravljeno prije u ovom poglavlju, du{ikov oksid, ugljikov monoksid i peptidni ligandi aktiviraju gvanil-ciklaze. Stimulacija gvanil-ciklaza uzrokuje porast razine cGMP koji , potom posreduje biolo{ke odgovore, kao {to je {irenje krvnih ìla. Djelovanje cGMP ~esto je posredovano aktivacijom protein-kinaze ovisne o cGMP , iako cGMP moè djelovati i kao nadzornik drugih ciljeva, uklju~uju}i ionske kanale. Najbolje je okarakterizirana uloga cGMP u oku kralje`njaka, gdje djeluje kao drugi glasnik odgovoran za pretvorbu vidnih signala, kao {to je svjetlost, u ìv~ane impulse. Fotoreceptor u {tapi}ima retine je receptor povezan s G-proteinom i zove se rodopsin (sl. 13-23). Rodopsin se aktivira u odgovoru na apsorpciju svjetla s pomo}u male, pridruène molekule 11-cis-retinala, koja se izomerizacijom pretvori u trans-retinal, a to uzrokuje konformacijsku promjenu proteina rodopsina. Rodopsin zatim aktivira G-protein transducin, a a-podjedinica transducina poti~e aktivnost cGMP-fosfodiesteraze, {to dovodi do sniènja unutarstani~ne razine cGMP-a. Ta promjena razine cGMP u {tapi}u retine prevodi se u ìv~ani impuls izravnim djelova-
ADP
CREB CRE
CREB
transkripcija
protein-kinaza A
ADP inaktivan Pi aktivan
Slika 13-22. Regulacija proteinske fosforilacije s pomo}u protein-kinaze A i protein-fosfataze 1.

Protein-kinaza A fosforilira, a proteinfosfataza 1 defosforilira ciljne proteine.
protein-fosfataza 1
562
Poglavlje 13
Slika 13-23. Uloga cGMP u fotorecepciji.

Apsorpcija svjetla s pomo}u retinala aktivira receptor rodopsin, koji je povezan s G-proteinom. Potom -podjedinica transducina poti~e cGMP-fosfodiesterazu, {to uzrokuje smanjenje unutarstani~ne razine cGMP .
svjetlo rodopsin retinal stani~na membrana bg a GDP fosfodiesteraza
transducin cGMP GMP
njem cGMP na ionske kanale u stani~noj membrani, sli~no djelovanju cAMP u osjetu mirisa.
Fosfolipidi i Ca2+
Jedan od najra{irenijih puteva unutarstani~noga signaliziranja zasniva se na uporabi drugih glasnika koji potje~u od membranskoga fosfolipida fosfatidil-inozitol-4,5-bisfosfata (PIP2). PIP2 ~ini malen dio stani~ne membrane, a smje{ten je u unutra{njem sloju fosfolipidnoga dvosloja (vidi sliku 12-2). Razli~iti hormoni i faktori rasta poti~u hidrolizu PIP2 aktivacijom fosfolipaze C. U toj reakciji nastaju dva razli~ita druga glasnika: diacil-glicerol i inozitol-1,4,5-trifosfat (IP3) (slika 13-24). Diacil-glicerol i IP3 stimuliraju razli~ite nizvodne signalne puteve (protein-kinazu C, odnosno mobilizaciju Ca2+), tako da hidroliza PIP2 pobu|uje dvije kaskade unutarstani~noga signaliziranja. Zna~ajno je da hidroliza PIP2 zapo~inje nizvodno od receptora povezanih s G-proteinom, ali i nizvodno od protein-tirozin-kinaza. To se zbiva za-
Fosfolipaza C (PLC) katalizira hidrolizu fosfatidil-inozitol-4,5-bisfosfata (PIP2), kojom nastaje diacil-glicerol (DAG) i inozitol-trifosfat (IP3). Diacil-glicerol aktivira ~lanove porodice protein-kinaze C, a IP3 signalizira otpu{tanje Ca2+ iz unutarstani~nih spremnika.
Slika 13-24. Hidroliza PIP2.
unutra{nji sloj stani~ ne membrane
P P P PIP2 PLC
HO DAG
protein-kinaza C
P P mobilizacija Ca2+ P IP3
563
Slika 13-25. Aktivacija fosfolipaze s pomo}u protein-tirozin-kinaza.

faktor rasta
Fosfolipaza C-g (PLC-g) veè se za aktiviranu receptorsku protein-tirozin-kinazu putem svoje SH2-domene. Fosforilacija tirozina pove}ava aktivnost PLC-g i poti~e hidrolizu PIP2.
stani~na membrana P SH2-domena P P P P PLC- g P IP3

2
OH
DAG
ADP
to {to jedan oblik fosfolipaze C (PLC-b) stimuliraju G-proteini, dok drugi oblik (PLC-g) sadràva SH2-domene koje posreduju njezino povezivanje s aktiviranim receptorskim protein-tirozin-kinazama (sl. 13-25). Ovo me|udjelovanje privla~i PLC-g na stani~nu membranu i uzrokuje fosforilaciju tirozina, {to pove}ava njezinu kataliti~ku aktivnost. Diacil-glicerol koji nastaje hidrolizom PIP2, aktivira protein-serin/ treonin-kinaze koje pripadaju porodici protein-kinaza C, od kojih mnoge imaju va`ne uloge u nadzoru nad stani~nim rastom i diferencijacijom. U~inak forbol-estera dobro ocrtava ulogu protein-kinaze C (sl. 13-26). Forbolesteri su opse`no prou~avani jer poti~u rast tumora u ìvotinja, a taj se u~inak zasniva na sposobnosti forbol-estera da poti~u protein-kinazu C time {to djeluju kao analozi diacil-glicerola. Protein-kinaza C potom aktivira druge unutarstani~ne ciljeve, uklju~uju}i transkripcijske faktore, te dovodi do promjena u genskoj ekspresiji i stimulacije stani~ne proliferacije. Dok diacil-glicerol ostaje povezan sa stani~nom membranom, IP3, druga molekula koja nastaje hidrolizom PIP2, jest mali, polarni drugi glasnik koji se otpu{ta u citosol, gdje djeluje tako da poti~e otpu{tanje Ca2+ iz unutarstani~nih spremnika (sl. 13-27). Kao {to je opisano u 12. poglavlju, citoplazmatska se koncentracija Ca2+ odràva na krajnje niskoj razini (oko 0,1 mM) s pomo}u Ca2+-crpki koje aktivno izbacuju Ca2+ izvan stanice. Ca2+ se ne prenosi samo kroz stani~nu membranu, ve} se ubacuje u endoplazmatski retikul koji sluì kao unutarstani~ni spremnik Ca2+. IP3 djeluje tako da otpu{ta Ca2+ iz endoplazmatskoga retikula, nakon {to se veè za receptore koji su Ca2+-kanali regulirani ligandom. Zbog toga djelovanja, unutarstani~na razina Ca2+ raste na pribli`no 1 mM, {to utje~e na aktivnost razli~itih
O H3C H3C HO
C O O CH3 CH3 C O
Slika 13-26. Struktura forbol-estera.

Forbol-esteri poti~u protein-kinazu C time {to djeluju kao analozi diacil-glicerola.
HO CH2OH
564
Poglavlje 13
Slika 13-27. Mobilizacija Ca2+ s pomo}u IP3.
stani~na membrana
OH
Ca2+ se prebacuje iz citosola u endoplazmatski retikul, koji sluì kao unutarstani~ni spremnik Ca2+. IP3 se veè za receptor, koji je Ca2+-kanal nadziran ligandom smje{ten u membrani endoplazmatskog retikula, te omogu}uje istjecanje Ca2+ u citosol.
PIP2 DAG
citosol IP3 Ca2+
receptor za IP3
endoplazmatski retikul
kalmodulin
Ca2+
vezanje Ca2+
kompleks Ca2+/kalmodulin
inaktivna
ciljnih proteina, kao {to su protein-kinaze i fosfataze. Primjerice, neki pripadnici porodice protein-kinaza C trebaju i Ca2+ i diacil-glicerol za svoju aktivaciju, pa se njihova aktivnost zajedni~ki regulira s pomo}u oba kraka PIP2-signalnoga puta. U ve}ini stanica, prolazno pove}anje koncentracije unutarstani~noga Ca2+ zbog stvaranja IP3, poti~e trajno pove}anje koje nastaje zbog ulaska izvanstani~noga Ca2+ kroz kanale u stani~noj membrani. Taj ulazak Ca2+ iz izvanstani~noga prostora sluì za produènje signala, koji je zapo~eo otpu{tanjem Ca2+ iz endoplazmatskoga retikula, te za ponovno punjenje spremnika Ca2+ unutar endoplazmatskoga retikula. Mnogi su u~inci Ca2+ posredovani kalmodulinom, proteinom koji veè 2+ Ca i koji se aktivira kada se citoplazmatska koncentracija Ca2+ pove}a na pribli`no 0,5 mM (sl. 13-28). Potom se kompleks Ca2+/kalmodulin veè za razli~ite ciljne proteine, uklju~uju}i protein-kinaze. Jedan primjer proteinkinaze ovisne o kompleksu Ca2+/kalmodulina je kinaza lakog lanca miozina, koja prenosi signal za aktin-miozinsku kontrakciju tako da fosforilira jedan od lakih lanaca miozina (vidi sl. 11-29). Druge su protein-kinaze, koje se aktiviraju s pomo}u kompleksa Ca2+/kalmodulin, ~lanovi porodice CaM-kinaza, a one fosforiliraju brojne druge proteine, kao {to su metaboli~ki enzimi, ionski kanali i transkripcijski faktori. Jedan je oblik CaM-kinaze prisutan u velikim koli~inama u ìv~anom sustavu gdje nadzire sintezu i otpu{tanje neurotransmitora. Dodatno, CaM-kinaze mogu nadzirati ekspresiju gena tako da fosforiliraju transkripcijske faktore. Zanimljivo je da je transkripcijski faktor CREB jedan od transkripcijskih faktora koje fosforilira CaM-kinaza, a ta se fosforilacija CREB odvija na istom mjestu koje ina~e fosforilira i protein-kinaza A. Tako je fosforilacija CREB primjer jednog od mnogih sjeci{ta signalnih puteva Ca2+ i cAMP Drugi su primjeri regulacija . adenil-ciklaza i fosfodiesteraza s pomo}u kompleksa Ca2+/kalmodulin, regulacija Ca2+-kanala s pomo}u cAMP te fosforilacija brojnih ciljnih protei, na s pomo}u protein-kinaze A i protein-kinaza koje ovise o kompleksu Ca2+/kalmodulin. Signalni putevi cAMP i Ca2+ djeluju uskla|eno kako bi nadzirali mnoge stani~ne odgovore. Ulazak izvanstani~noga Ca2+ osobito je vaàn u elektri~ki podra`ljivim stanicama ìvaca i mi{i}a, gdje se Ca2+-kanali regulirani naponom u stani~noj membrani otvaraju depolarizacijom membrane (sl. 13-29). Porast razine unutarstani~noga Ca2+ potom pokre}e daljnje otpu{tanje Ca2+ iz unutarstani~nih spremnika, koje je posljedica aktivacije druga~ijih Ca2+-kanala znanih kao rajanodinski receptori. Jedan od u~inaka porasta unutarstani~noga Ca2+ u ìv~anim stanicama jest poticanje otpu{tanja neurotransmitora, stoga Ca2+ u ìv~anom sustavu ima klju~nu ulogu u prevo|enju elektri~noga u kemijski signal. U mi{i}nim stanicama, Ca2+ je pohranjen u sarkoplazmatskom retikulu, iz kojega se otpu{ta otvaranjem rajanodinskih recep-
kompleksu Ca2+/kalmodulin
Kalmodulin je protein oblikovan poput bu~ica s ~etiri vezna mjesta za Ca2+. Aktivni kompleks Ca2+/kalmodulin veè se za razli~ite ciljne proteine, kao {to su protein-kinaze ovisne o kompleksu Ca2+/kalmodulin.
Slika 13-28. Djelovanje kalmodulina.
Slika 13-29. Regulacija unutarstani~noga Ca2+ u elektri~ki podra`ljivim stanicama.
565
Ca2+ Ca2+ kanal nadziran naponom p stani~na membrana citosol
Depolarizacija membrane uzrokuje otvaranje Ca2+-kanala nadziranih naponom u stani~noj membrani i uzrokuje utjecanje Ca2+ iz izvanstani~ne teku}ine. To dovodi do pove}anja koncentracije unutarstani~noga Ca2+, {to signalizira daljnje otpu{tanje Ca2+ iz unutarstani~nih spremnika otvaranjem druga~ijih Ca2+ kanala (rajanodinskih receptora) u membrani endoplazmatskog retikula. Rajanodinski receptori sarkoplazmatskog retikula u mi{i}nim stanicama mogu se tako|er direktno otvoriti u odgovoru na depolarizaciju membrane.
tora u odgovoru na promjene membranskoga potencijala. Otpu{tanje pohranjenoga Ca2+ uzrokuje velik porast razine Ca2+ u citoplazmi, {to pokre}e mi{i}nu kontrakciju (vidi 11. poglavlje). Stanice tako koriste razli~ite mehanizme za nadzor razine unutarstani~noga Ca2+, {to ~ini Ca2+ svestranim drugim glasnikom koji nadzire veliki broj stani~nih procesa. PIP2 ne sluì samo kao izvor diacil-glicerola i IP3, ve} je tako|er polazna to~ka jednog razli~itog signalnog puta koji ima klju~nu ulogu u nadzoru stani~noga preìvljenja. U tom putu, PIP2 se fosforilira na poloàju 3' u molekuli inozitola s pomo}u enzima fosfatidil-inozitol (PI)-3-kinaze (sl. 1330). Poput fosfolipaze C, jedan oblik PI 3-kinaze aktivira se s pomo}u G-proteina, dok drugi ima SH2-domene i aktivira se spajanjem s receptorskim protein-tirozin-kinazama. Fosforilacijom PIP2 nastaje fosfatidil-inozitol3,4,5-trifosfat (PIP3), koji djeluje kao razli~it drugi glasnik. Klju~ni cilj PIP3, koji je vaàn za signaliziranje preìvljenja stanice, jest protein-serin/ treonin-kinaza nazvana Akt. PIP3 se veè za domenu Akt, koja je poznata kao domena homologna plekstrinu (sl. 13-31). Zbog toga me|udjelovanja, Akt se premje{ta na unutarnju stranu stani~ne membrane, gdje se fosforilira i aktivira s pomo}u druge protein-kinaze (nazvane PDK1) koja tako|er sadràva plekstrin-homolognu domenu i veè PIP3. Stvaranje PIP3 tako dovodi do vezanja Akt i PDK1 za stani~nu membranu, {to uzrokuje fosforilaciju i aktivaciju Akt-a. Aktivirana Akt fosforilira brojne ciljne proteine, a to uklju~uje proteine koji su izravni regulatori stani~noga preìvljenja, transkripcijske faktore i druge protein-kinaze.
rajanodinski receptor membrana ER
endoplazmatski retikul
unutra{nji sloj stani~ne membrane
P P P PIP2
Ras, Raf i signalni put MAP-kinaze

Signalni je put MAP-kinaze kaskada evolucijski o~uvanih protein-kinaza koje imaju klju~nu ulogu u prijenosu signala u svim eukariotskim stanicama, od kvasaca do ljudi. Sredi{nji je element toga puta porodica protein-serin/treonin-kinaza koje se zovu MAP-kinaze ili protein-kinaze aktivirane mitogenom (MAP prema engl. mitogen-activated protein kinases), a aktiviraju , se u odgovoru na razli~ite faktore rasta i druge signalne molekule. U kvasaca, signalni put MAP-kinaze nadzire razli~ite stani~ne odgovore, kao {to su sparivanje, oblik stanice i sporulacija. U vi{ih eukariota, {to uklju~uje C. elegans, D. melanogaster, àbe i sisavce, MAP-kinaze su ubikvitarni regulatori stani~noga rasta i diferencijacije. MAP-kinaze, koje su prvobitno opisane u stanicama sisavaca, pripadaju porodici kinaza reguliranih s pomo}u izvanstani~nih signala ili porodici ERK (ERK, prema engl. extracellular signal-regulated kinase). Aktivacija ERK
PI3- kinaza ADP
P P P
Slika 13-30. Aktivnost PI3-kinaze.

PI3-kinaza fosforilira inozitol na poloàju 3 i pretvara PIP2 u PIP3.
PIP3
566
Poglavlje 13
Slika 13-31. Aktivacija protein-kinaze Akt.

Akt se veè za PIP3 u stani~noj membrani s pomo}u domene koja je homologna plekstrinu (PH-domena). Potom se kinaza Akt aktivira fosforilacijom, a ta je fosforilacija posljedica aktivnosti jedne druge protein-kinaze, kinaze PDK1, koja tako|er veè PIP3.
P PIP3 P P
P P PIP3
P PH-domena
PH-domena
Akt
PDK1
Akt
ima klju~nu ulogu u prijenosu proliferacijskoga signala potaknuta s pomo}u faktora rasta, koji djeluje preko protein-tirozin-kinaze ili receptora povezanih s G-proteinima. I protein-kinaza C moè aktivirati signalni put ERK, a to pridonosi poticanju stani~ne proliferacije u odgovoru na forbol-esterske promotore tumora. Povrh toga, i signalni putevi Ca2+ i putevi cAMP ispreple}u se sa ERK-signaliziranjem, bilo tako da poti~u, ili pak, ko~e aktivnost ERK u razli~itim stanicama. Aktivacija ERK posredovana je dvjema uzvodnim proteinskim kinazama koje su povezane s receptorima faktora rasta preko Ras-proteina koji veè GTP (sl. 13-32). Aktivacija Ras uzrokuje aktivaciju protein-serin/ treonin-kinaze Raf, a Raf potom fosforilira i aktivira drugu protein-kinazu, nazvanu MEK (prema MAP kinaza/ERK kinaza). MEK je protein-kinaza dvostruke specifi~nosti, koja aktivira ~lanove porodice ERK tako da fosforilira i treoninske i tirozinske ostatke, koji su me|usobno odvojeni jednom aminokiselinom (primjerice, treonin-183 i tirozin-185 u ERK2). Jednom kad se aktivira, ERK fosforilira razli~ite ciljeve, a to uklju~uje druge protein-kinaze i transkripcijske faktore.
567
faktor rasta
stani~na membrana Ras
P MEK
P ADP
Raf
ADP P
P ERK
ADP
jezgreni i citoplazmatski proteini
Sredi{nja uloga puta ERK u stanicama sisavaca upoznana je tijekom prou~avanja Ras-proteina, koji su prvi put otkriveni kao onkogeni proteini tumorskih virusa koji uzrokuju sarkome u {takora (otuda ime Ras, prema engl. rat sarcoma virus). Zanimanje za Ras znatno se pove}alo 1982. godine, kad su mutacije gena ras po prvi put povezane s nastankom karcinoma u ljudi (opisano u 15. poglavlju). Na va`nost Ras u unutarstani~nom signaliziranju upozorili su pokusi u kojima je proliferacija normalnih stanica sisavaca izravno potaknuta s pomo}u mikroinjiciranja aktivnoga proteina Ras. Obratno, ometanje funkcije Ras, bilo mikroinjiciranjem anti-Ras protutijela ili ekspresijom dominantno-negativne mutante Ras, zako~ilo je stani~nu proliferaciju u odgovoru na faktore rasta. Dakle, Ras je ne samo odgovoran za poticanje abnormalnoga rasta koji je svojstven stanicama karcinoma, ve} je potreban i za odgovor normalnih stanica na podraìvanje faktorima rasta. Ras-proteini veù gvanin-nukleotid i djeluju sli~no u~inku a-podjedinica G-proteina, tako da se izmjenjuje inaktivni oblik Ras koji veè GDP i aktivni oblik koji veè GTP (sl. 13-33). Me|utim, razli~ito od a-podjedinica G-proteina, Ras radije djeluje kao monomer, nego zdruèn s bg-podjedinicama. Aktivaciju Ras posreduju faktori izmjene gvanin-nukleotida, koji poti~u otpu{tanje vezanoga GDP i njegovu zamjenu za GTP Aktivnost . kompleksa Ras-GTP prestaje zbog hidrolize GTP a ta je hidroliza potaknu, ta uzajamnim djelovanjem Ras-GTP i proteina koji aktiviraju GTPazu. Zanimljivo je da mutacije gena ras u ljudskih karcinoma imaju u~inak ko~enja hidrolize GTP s pomo}u proteina Ras. Ti mutirani Ras-proteini ostaju stoga neprestano u aktivnom obliku koji veè GTP i tako poti~u nekontroliranu proliferaciju karcinomskih stanica, ~ak i u odsutnosti faktora rasta. Ras-proteini su prototipovi velike porodice koja uklju~uje pribli`no 50 srodnih proteina, a ~esto se nazivaju mali proteini koji veù GTP, jer su
Slika 13-32. Aktivacija ERK MAP-kinaza

Aktivacija receptora za faktore rasta uzrokuje aktivaciju maloga Ras-proteina koji veè GTP Ras potom me|usobno . djeluje s protein-kinazom Raf, a Raf fosforilira i aktivira MEK. MEK je protein-kinaza dvostruke specifi~nosti, koja aktivira ERK s pomo}u fosforilacije na treoninskom i tirozinskom ostatku (Thr-183 i Tyr-185). ERK zatim fosforilira mno{tvo ciljnih proteina u citoplazmi i jezgri.
568
Poglavlje 13
Slika 13-33. Regulacija Ras-proteina.

Inaktivni oblik Ras-proteina koji veè GDP izmjenjuje se s aktivnim oblikom Ras koji veè GTP .
stani~na membrana Ras GDP
Ras se pretvara u aktivni oblik koji veè GTP tako da se vezani GDP zamijeni za GTP a ta je izmjena , potaknuta faktorom izmjene gvanin-nukleotida (GEF).
inaktivno stanje GEF GDP Pi GTPaza GAP P
Aktivnost Ras prestaje nakon hidrolize GTP koju poti~u proteini koji , aktiviraju GTPazu (GAP).
tanje
Ras i njegovi srodnici pribli`no upola manji od a-podjedinica G-proteina. I dok Ras-proteini nadziru stani~ni rast i diferencijaciju, ostale podskupine malih proteina koji veù GTP nadziru druge stani~ne aktivnosti. Primjerice, najve}a podskupina malih proteina koji veù GTP (Rab-proteini) djeluju tako da nadziru promet mjehuri}a, kao {to smo opisali u 9. poglavlju. Drugi mali proteini koji veù GTP uklju~eni su u unos i iznos proteina iz jezgre (Ran-proteini, opisani u 8. poglavlju) i organizaciju citoskeleta (Rhopodskupina, koju }emo opisati dalje u ovom poglavlju). Najvi{e se zna o mehanizmu aktivacije Ras koji je posredovan receptorskim protein-tirozin-kinazama (sl. 13-34). Autofosforilacija receptora omogu}uje vezanje receptora i faktora izmjene gvanin-nukleotida Ras putem me|usobnoga djelovanja SH2-domena dvaju proteina. Najpoznatiji primjer takvog me|udjelovanja je faktor izmjene gvanin-nukleotida Sos, koji je u citoplazmi stanica u mirovanju povezan s proteinom Grb2, koji sadràva SH2-domenu. Tirozinska fosforilacija receptora (ili drugih kinaza povezanih s receptorom) stvara vezno mjesto za domenu SH2 molekule Grb2. Kako se Grb2 veè za aktivirane receptore, tako se i molekula Sos pribliàva stani~noj membrani, a tu moè djelovati na Ras-proteine jer su oni usidreni u unutarnjem sloju stani~ne membrane s pomo}u lipida koji su pri~vr{}eni za karboksilni kraj Ras (vidi sliku 12-9). Sos tada poti~e izmjenu gvaninnukleotida, pa nastaje aktivni kompleks Ras-GTP U svom aktivnom obliku . koji veè GTP Ras uzajamno djeluje s brojnim izvr{nim proteinima, kao {to , je protein-serin/treonin-kinaza Raf. Zbog toga se kinaza Raf premje{ta iz citoplazme u stani~nu membranu, gdje se aktivira fosforilacijom koju posreduju i protein-tirozin-kinaze i protein-serin/treonin-kinaze.
569
faktor rasta
stani~na membrana P P P P P P SOS (GEF) GDP Raf Grb2 Ras GDP Ras
Kao {to smo prethodno napomenuli, aktivacija Ras poti~e kaskadu protein-kinaza koje uzrokuju aktivaciju ERK. Potom ERK fosforilira razli~ite ciljne proteine, a to uklju~uje i druge protein-kinaze. Va`no je da se dio aktiviranih ERK premje{ta u jezgru, gdje nadzire transkripcijske faktore s pomo}u fosforilacije (sl. 13-35). S time u vezi treba zamijetiti da je primarni odgovor na poticanje faktorima rasta brzo pobu|ivanje prepisivanja genske porodice koja sadràva pribli`no stotinu gena, a nazivaju se neposredno rani geni. Pobu|ivanje neposredno ranih gena posredovano je regulacijskim sljedovima, koje se nazivaju elementi odgovora na serum (SRE, prema engl. serum response elements), a te sljedove prepoznaje kompleks transkripcijskih faktora, kao {to je faktor odgovora na serum (SRF, prema engl. serum response factor) i Elk-1. ERK fosforilira i aktivira Elk-1, te tako omogu}uje izravnu vezu izme|u ERK porodice MAP-kinaza i pobu|ivanja neposredno ranih gena. Mnogi neposredno rani geni i sami nose upute za sintezu transkripcijskih faktora, pa njihovo poticanje u odgovoru na podraìvanje faktorima rasta mijenja ekspresiju cijelog niza nizvodnih gena, te se uspostavlja sasvim novi program genske ekspresije. I stanice kvasaca i stanice sisavaca sadràvaju vi{estruke signalne puteve MAP-kinaza koji nadziru razli~ite stani~ne odgovore. Svaka kaskada sastoji se od triju protein-kinaza; zavr{ne MAP-kinaze, te dviju uzvodnih kinaza (analogno Raf i MEK), koje nadziru njezinu aktivnost. U kvasca S. cerevisiae, pet razli~itih MAP-kinaznih kaskada nadzire sparivanje, sporulaciju, filamentaciju, preoblikovanje stani~ne stijenke i odgovor na pove}anu osmolarnost. U stanicama sisavaca, otkrivene su tri glavne skupine MAP-kinaza. Osim ~lanova porodice ERK, te skupine uklju~uju kinaze JNK i p38 MAP-kinaze, koje se prete`no aktiviraju u odgovoru na upalne citokine i stani~ni stres (kao {to je, npr., ultraljubi~asto zra~enje) (sl. 13-36). I dok
Slika 13-34. Ras se aktivira nizvodno od receptorskih protein-tirozin-kinaza.

Kompleks, koji se sastoji od molekule Grb2 i faktora izmjene gvanin-nukleotida Sos, veè se s pomo}u SH2-domene molekule Grb2 za slijed pobu|enog receptora koja sadràva fosfotirozin. Tako se molekula Sos privla~i na stani~nu membranu, gdje poti~e Ras-GDP/GTPizmjenu. Potom se aktivirani kompleks Ras-GTP veè za protein-kinazu Raf.
P citosol
P ERK
jezgra P P ERK
ADP SRF SRF transkripcija
Elk-1
Slika 13-35. Indukcija neposredno ranih gena s pomo}u ERK-a.

Aktiviran ERK premje{ta se u jezgru i fosforilira transkripcijski faktor Elk-1. Kompleks, koji se sastoji od Elk-1 i faktor odgovora na serum (SRF), veè se za element odgovora na serum (SRE). Fosforilacija poti~e aktivnost Elk-1 kao transkripcijskog aktivatora, {to dovodi do indukcije neposredno ranih gena.
DNA
SRE
570
Poglavlje 13
Slika 13-36. Putevi aktivacije MAP-kinaze u stanicama sisavaca.

Osim kinaze ERK, stanice sisavaca dodatno sadràvaju kinaze JNK i p38 MAP-kinaze. Kaskade protein-kinaza aktiviraju kinaze JNK i p38 MAP-kinaze, a ta se kaskada odvija paralelno s onom koja je odgovorna za aktivaciju kinaze ERK. îni se da se kaskade protein-kinaza koje su odgovorne za aktivaciju JNK i p38 ponajprije aktiviraju u odgovoru na upalne citokine ili stani~ni stres, {to uzrokuje upalu i smrt stanice.
podraàj
faktori rasta
upalni citokini stani~ni stres
Raf uzvodne kinaze MEK MAP kinaza
ASK1, MEKK, MLK, TAK1, TPL-2
MKK4, MKK7
MKK3, MKK6
ERK
JNK
p38
proliferacija odgovor diferencijacija preìvljenje stanice
upala stani~na smrt
podraàj
MLK
ERK-signaliziranje uglavnom dovodi do stani~ne proliferacije, preìvljenja i diferencijacije, signalni putevi kinaze JNK i p38 MAP-kinaze obi~no vode u upalu i stani~nu smrt. Poput ERK-a, kinaze JNK i p38MAP mogu se premje{tati u jezgru i fosforilirati transkripcijske faktore koji nadziru gensku ekspresiju. Vi{estruki putevi MAP-kinaza stoga djeluju u svim vrstama eukariotskih stanica u kontroli stani~nih odgovora na razli~ite signale iz okoli{a. Specifi~nost signaliziranja MAP-kinazama odràva se, bar djelomice, tako da se pojedini dijelovi svake MAP-kinazne kaskade organiziraju kao kompleksi koji su povezani sa konstrukcijskim proteinima (engl. scaffold skela). Primjerice, konstrukcijski protein JIP-1 organizira MAP-kinazu JNK i njezine uzvodne aktivatore MLK i MKK7 u signalnu kasetu (sl. 13-37). Zbog specifi~ne povezanosti tih protein-kinaza i JIP-1 proteina, uzvodni podraàji koji poti~u MLK uzrokovat }e specifi~nu i u~inkovitu aktivaciju MKK7, a MKK7 }e potom aktivirati JNK. Razli~iti konstrukcijski proteini uklju~eni su ne samo u organizaciju drugih MAP-kinaznih signalnih kaseta, ve} povezuju i druge nizvodne signalne molekule sa svojim receptorima. Smatra se da fizi~ka povezanost komponenti signalnoga puta s konstrukcijskim proteinima ima bitnu ulogu u odre|ivanju specifi~nosti signalnih putova unutar stanice.
JAK/STAT-put
JIP- 1 MKK7
JNK
Signalni put MAP-kinaze omogu}uje posrednu vezu izme|u stani~ne povr{ine i jezgre jer kaskada protein-kinaza u kona~nici dovodi do fosforilacije transkripcijskih faktora. Alternativni put, poznat kao JAK/STAT-put, predstavlja izravnu vezu izme|u protein-tirozin-kinaza i transkripcijskih faktora. U tom putu, protein-tirozinska fosforilacija izravno utje~e na smje{taj i funkciju transkripcijskih faktora (sl. 13-38).
Slika 13-37. Konstrukcijski protein za MAP-kinaznu kaskadu JNK.

odgovor
Konstrukcijski protein JIP-1 veè MLK, MKK7 i JNK, te tako organizira komponente JNK-puta u signalnu kazetu.
Stani~no signaliziranje Klju~ni elementi toga puta su STAT-proteini (STAT, prema engl. signal transducers and activators of transcription), koji su prvi put otkriveni tijekom prou~avanja signaliziranja citokinskih receptora. STAT-proteini su porodica transkripcijskih faktora koji sadràvaju domene SH2. U stanica koje miruju, STAT su inaktivni i smje{teni u citoplazmi. Podraìvanje citokinskih receptora privla~i STAT-proteine, koji se veù s pomo}u svojih SH2-domena na fosfotirozine u citoplazmatskim domenama receptorskih polipeptida. Nakon vezanja s aktiviranim receptorima, STAT-proteini se fosforiliraju, a fosforilacija je posredovana nereceptorskim protein-tirozin-kinazama iz porodice JAK, koje su pridruène citokinskim receptorima. Tirozinska fosforilacija poti~e dimerizaciju STAT-proteina, a STAT se potom premje{ta u jezgru, gdje poti~e transkripciju ciljnih gena. Susljedne studije pokazale su da se STAT-proteini tako|er aktiviraju nizvodno od receptorskih protein-tirozin-kinaza, a fosforiliraju ih ili sami receptori ili pridruène nereceptorske kinaze. Tako transkripcijski faktori STAT sluè kao izravna veza izme|u citokinskih receptora i faktora rasta na stani~noj povr{ini i regulacije genske ekspresije u jezgri.
571
stani~na membrana
citokin
JAK
P P P
STAT
STAT
Prijenos signala i citoskelet

Dosad smo uglavnom opisivali signalne puteve koji nadziru promjene metabolizma ili genske ekspresije u odgovoru na hormone ili faktore rasta. Me|utim, funkcija mnogih stanica isto tako ovisi o stani~noj adheziji i organizaciji citoskeleta. Receptori koji su odgovorni za stani~nu adheziju poti~u unutarstani~ne signalne puteve koji nadziru razli~ite stani~ne odgovore, {to uklju~uje i gensku ekspresiju. Obratno, faktori rasta ~esto djeluju tako da poti~u promjene citoskeleta koje uzrokuju pokretanje stanice ili promjene njezina oblika. Dakle, dijelovi citoskeleta djeluju istodobno kao receptori i kao ciljevi stani~nih signalnih puteva, pa tako povezuju stani~ni oblik i pokretanje s drugim stani~nim odgovorima.
jezgra
P P
Slika 13-38. JAK/STAT-put.

STAT-proteini su transkripcijski faktori koji sadràvaju domene SH2, a SH2 posreduju vezanje STAT za sljedove koji sadràvaju fosfotirozin. U stanicama koje miruju, STAT su inaktivne i smje{tene u citosolu. Kad se pobude citokinski receptori, STAT-proteini se ve` i fosforiliraju s pomo}u protein-tirozin-kinaza JAK, koje su pridruène receptoru. Potom se fosforilirani STAT-proteini dimeriziraju i premje{taju u jezgru, gdje poti~u transkripciju ciljnih gena.
Integrini i prijenos signala

Kao {to je opisano u poglavljima 11 i 12, integrini su glavni receptori koji su odgovorni za prianjanje stanica za izvanstani~nu tvar. U dvije vrste takvih spojeva (fokalne adhezije i hemidezmosomi), me|usobno vezanje integrina i dijelova citoskeleta omogu}uje stabilnu vezu izme|u izvanstani~ne tvari i adherentnih stanica (vidi sliku 12-62). Osim te strukturne uloge, integrini sluè kao receptori koji aktiviraju unutarstani~ne signalne putove, te tako nadziru gensku ekspresiju i druge stani~ne odgovore (kao {to je stani~na proliferacija i preìvljenje) u odgovoru na adheziju. Poput ~lanova citokinske receptorske superporodice, integrini imaju kratki citoplazmatski rep kojemu nedostaje samosvojna enzimska aktivnost. Unato~ tomu, rani odgovor na me|udjelovanje integrina i izvanstani~ne tvari uklju~uje tirozinsku fosforilaciju, {to upu}uje na povezanost integrina s nereceptorskim protein-tirozin-kinazama. Jedan na~in signaliziranja nizvodno od integrina uklju~uje aktivaciju nereceptorske protein-tirozin-kinaze nazvane FAK (FAK, prema engl. focal adhesion kinase) (sl. 13-39). Kao {to ime govori, FAK je smje{ten u fokalnim adhezijama, te se brzo fosforilira na tirozinu u odgovoru na vezanje integrina za komponente izvanstani~ne tvari, kao {to je fibronektin. Poput ostalih tirozin-kinaza, FAK se aktivira autofosforilacijom, koja se pobu|uje nakupljanjem integrina nakon vezanja za izvanstani~nu tvar. Autofosforilacija FAK stvara vezno mjesto za signalne molekule koje sadràvaju SH2-domene, {to uklju~uje ~lanove Src-porodice nereceptorskih protein-tirozin-kinaza, koje fosforiliraju do-
572
Poglavlje 13
Karcinom: Prijenos signala i onkogeni ras

Bolest
Zbog karcinoma umire gotovo svaki ~etvrti Amerikanac, {to je vi{e od 500.000 umrlih godi{nje u Sjedinjenim Ameri~kim Dràvama. Postoji vi{e od stotine razli~itih vrsti karcinoma, a neki se karcinomi pojavljuju sa znatno ve}om u~estalo{}u. U SAD-u, naj~e{}i smrtonosni karcinomi su karcinomi plu}a i debeloga crijeva, koji su zajedno odgovor ni za pribli`no 40% smrti zbog karcinoma. Pomoru od karcinoma znatno pridonose i karcinomi dojke, prostate i gu{tera~e, koji su odgovorni za pribli`no 7,2% (karcinom dojke), 5,2% (karcinom prostate) i 5,4% (karcinom gu{tera~e) ukupnog mortaliteta zbog karcinoma u SAD-u. Zajedni~ko je obilje`je svih karcinoma neobuzdana proliferacija karcinomskih stanica, koje se u kona~nici pro{ire po cijelom tijelu, zahva}aju nor malna tkiva i organe, te uzrokuju smrt bolesnika. Kirur{ko lije~enje i radioterapija u~inkoviti su oblici lije~enja lokaliziranih karcinoma, ali te vrste lije~enja ne mogu dosegnuti stanice karcinoma koje su se pro{irile po udaljenim mjestima u tijelu. Stoga lije~enje pro{irenih karcinoma zahtijeva uporabu kemoterapijskih lijekova. Na nesre}u, kemoterapijski lijekovi, koji su danas dostupni, nisu specifi~ni samo za stanice karcinoma. Ve}ina lijekova djeluje tako da o{te}uje DNA ili ometa njezinu sintezu, pa se istodobno ubijaju i normalne stanice koje se brzo dijele, kao {to su epitelne stanice koje oblaù probavni sustav ili krvotvorne stanice u ko{tanoj srì. Toksi~nost kemoterapijskih lijekova ograni~ava njihovu u~inkovitost, te se mnogi karcinomi ne mogu eliminirati s onom koli~inom lijeka koju bolesnik moè podnijeti. Zbog toga, unato~ tomu {to je postignut veliki napredak u lije~enju karcinoma, gotovo polovina bolesnika s dijagnozom karcinoma, na posljetku umire od te bolesti. pretvaraju normalne gene ras u onkogene znatno smanjuju hidrolizu GTP s pomo}u Ras-proteina. Zbog toga, mutirani onkogeni~ni Ras-protein ostaje zako~en u aktivnom obliku koji veè GTP te nema normalne izmjene aktiv, noga i inaktivnoga oblika Ras u odgovoru na izvanstani~ne signale. Tako onkogeni~ni Ras-protein neprestano poti~e signalni put ERK i stani~nu proliferaciju, ~ak i u odsutnosti faktora rasta, koji su ina~e nu`ni za aktivaciju Ras i proliferacijski signal u nor malnim stanicama.

Otkri}e virusnih gena, koji mogu pretvoriti nor malnu stanicu u stanicu karcinoma, poput gena src iz RSV, pruìlo je pr vi dokaz da karcinomi mogu na-stati zbog djelovanja specifi~nih gena (onkogena). Zbog susljednog otkri}a da su virusni onkogeni srodni genima u normalnim stanicama, pretpostavilo se da karcinomi, koji nisu uzrokovani virusima (a to uklju~uje ve}inu karcinoma u ljudi), mogu nastati zbog mutacija nor malnih stani~nih gena, koje uzrokuju nastanak onkogena stani~noga podrijetla, a ne virusnoga. Takvi su stani~ni onkogeni prvi put otkriveni u ljudskim karcinomima 1981. godine. Ubrzo nakon toga, otkriveno je da su ljudski onkogeni u karcinomima mokra}noga mjehura, plu}a i debeloga crijeva srodni genima ras, koji su prethodno otkriveni u virusima {takorskoga sarkoma. Iako se danas zna da razli~iti geni imaju klju~nu ulogu u razvoju karcinoma, mutacija gena ras i nadalje je jedna od naj~e{}ih genskih abnormalnosti u ljudskim tumorima. Mutirani onkogen ras prona|en je u oko 20% svih ljudskih karcinoma, a to uklju~uje pribli`no 25% karcinoma plu}a, 50% karcinoma debeloga crijeva i vi{e od 90% karcinoma gu{tera~e. Nadalje, u~inak onkogena ras jasno je pokazao povezanost razvoja ljudskih karcinoma i signalnih putova koji nadziru stani~nu proliferaciju. Mutacije koje
Otkri}e mutiranih onkogena u ljudskim karcinomima otvorilo je mogu}nost za razvoj lijekova koji bi specifi~no djelovali na onkogene proteine. U na~elu, takvi bi lijekovi mogli, u usporedbi s uobi~ajenim kemoterapijskim lijekovima, djelovati selektivno na stanice karcinoma, a znatno manje
Polip u ljudskom kolonu (rani stadij karcinoma debeloga crijeva). Onkogen ras pridonosi nastanku gotovo polovine svih karcinoma debeloga crijeva. (E. P Ewing, Jr, . Centers for Disease Control)
datna mjesta na kinazi FAK. Sli~no receptorima za faktore rasta, koje smo ranije opisali, tirozinska fosforilacija kinaze FAK stvara vezna mjesta za SH2-domene drugih nizvodnih signalnih molekula, kao {to su fosfolipaza C-g, PI 3-kinaza, te kompleks Grb2-Sos. Nova~enje faktora izmjene gvanin-
573
toksi~no na normalne stanice. Budu}i da je ras ~esto mutiran u ljudskim karcinomima, protein Ras je pobudio dosta zanimanja kao mogu}a ciljna molekula za lijekove. Jedno je od va`nih obilje`ja djelovanja proteina Ras njegovo premje{tanje u stani~nu membranu s pomo}u posttranslacijskoga dodatka lipida (far nezil izoprenoida) na karboksilni-kraj (sl. 7-32). Far nezilacija nije osobitost samo Ras, ali je relativno rijetki na~in
modifikacije stani~nih proteina, pa je to potaklo vi{e skupina istraìva~a da poku{aju razviti inhibitore enzima farnezil-transferaze, kako bi proizveli lijek koji djeluje na Ras kao ciljnu molekulu. Doista, pokazalo se da takvi lijekovi ko~e premje{tanje Ras i njegovo djelovanje, te istodobno znatno ko~e ljudske tumorske stanice. Iako se dio u~inka tih inhibitora moè pripisati djelovanju na druge ciljeve, osim Ras, razli~iti inhibitori far nezil-trans-
feraze danas se ispituju u klini~kim pokusima, a kona~ni podatci o njihovoj u~inkovitosti o~ekuju se u skoroj budu}nosti.
Literatura
Prendergast, G.C. i A. Oliff. 2000. Far nesyltransferase inhibitors: antineoplastic properties, mechanisms of action, and clinical prospects. Semin. Cancer. Biol. 10:443-452.
P P P
P P
FAK
Src
Src
P P P
stani~na membrana
integrin
izvanstani~na tvar
P P
P P
PI 3-kinaza Src
ERK
P P P
PLCSOS
Slika 13-39. Integrinsko signaliziranje.

Vezanje integrina za izvanstani~nu tvar uzrokuje nakupljanje integrina i aktivaciju kinaze FAK s pomo}u autofosforilacije. Src se potom veè za autofosforilirano mjesto kinaze FAK i fosforilira FAK na dodatnom tirozinskom ostatku. Fosfotirozini kinaze FAK sluè kao vezno mjesto za razli~ite nizvodne signalne molekule, kao {to su kompleks Grb2-Sos, {to uzrokuje aktivaciju Ras, PI 3-kinaze i fosfolipaze C-g.
Grb2
574
Poglavlje 13
nukleotida Sos uzrokuje aktivaciju Ras, koji zauzvrat spaja integrine s aktivacijom ERK-signalnoga puta. Tako integrinska aktivacija kinaze FAK i nereceptorskih protein-tirozin-kinaza Src povezuje stani~nu adheziju s istim signalnim putevima koji nadziru gensku ekspresiju, stani~nu proliferaciju i stani~no preìvljenje nizvodno od receptora faktora rasta. Dodatno, integrini mogu me|usobno djelovati i poticati aktivnost receptorskih protein-tirozin-kinaza, kao {to je EGF-receptor, te se tako paralelno aktiviraju signalni putevi potaknuti s pomo}u faktora rasta i stani~ne adhezije.
Regulacija aktinskoga citoskeleta

Stani~ni odgovori na izvanstani~ne signale, kao {to je odgovor na faktore rasta, ~esto uklju~uju promjene u stani~nom kretanju i stani~nom obliku. Primjerice, faktori rasta poti~u promjene stani~ne pokretljivosti (kao i stani~ne proliferacije) koje imaju klju~nu ulogu u zbivanjima poput cijeljenja rane ili embrionalnoga razvoja. U 11. poglavlju objasnili smo kako stani~na pokretljivost i oblik ovise poglavito o aktinskom citoskeletu. Podrobnije, mnogi oblici stani~noga kretanja zasnivaju se na dinami~kom spajanju i odvajanju aktinskih vlakna koja se nalaze pod stani~nom membranom. Stoga, preoblikovanje aktinskoga citoskeleta predstavlja klju~ni dio stani~nog odgovora na faktore rasta i ostale izvanstani~ne poticaje. ^lanovi Rho-podskupine malih proteina koji veù GTP (poput Rho, Rac i Cdc42) imaju klju~nu ulogu u nadzoru nad organizacijom aktinskoga citoskeleta, a tako i nad razli~itim stani~nim zbivanjima, kao {to su pokreti, adhezija i citokineza. Uloga ~lanova porodice Rho u regulaciji preoblikovanja aktina prvi je put otkrivena tijekom prou~avanja fibroblastnog odgovora na podraìvanje s pomo}u faktora rasta (sl. 13-40). Promjene citoskeleta koje nastaju zbog podraìvanja faktorom rasta uklju~uju nastanak izbo~ina na stani~noj povr{ini (filopodija, lamelipodija i nabora membrane), kao i nastanak fokalnih adhezija i stresnih vlakna. Pokusi u kojima su stanicama ubrizgani mutirani oblici razli~itih ~lanova porodice Rho, pokazali su da Cdc42 poti~e stvaranje filopodija, Rac posreduje stvaranje lamelipodija, a Rho je odgovoran za formiranje stresnih vlakana.
Slika 13-40. Regulacija preoblikovanja aktina s pomo}u proteina porodice Rho.

Razli~iti ~lanovi porodice Rho nadziru polimerizaciju aktina i tvorbu filopodija (Cdc42), lamelipodija (Rac) i stresnih vlakna (Rho). Slike dobivene s pomo}u fluorescentne mikroskopije pokazuju razdiobu aktina nakon mikroubrizgsvsnjs molekula Cdc42, Rac i Rho u fibroblaste (Iz: C. D. Nobes i A. Hall, 1995. Cell 81:53.)
Cdc42
Rac
Rho
filopodije
lamelipodije
fokalne adhezije, stresna vlakna
20 mm
20 mm
20 mm
575
Susljedne su studije pokazale da u~inci ~lanova porodice Rho nisu ograni~eni samo na fibroblaste, ve} da Rho ima sli~nu ulogu u regulaciji aktinskoga citoskeleta u svim vrstama eukariotskih stanica. Primjerice, Rho je potreban za citokinezu (stani~nu podjelu nakon mitoze), koja je posredovana kontraktilnim prstenom aktin-miozina (vidi sliku 11-28). U neuronima, Rac, Cdc42 i Rho nadziru ekstenziju i retrakciju aksona tijekom razvoja ìv~anoga sustava. U glatkim mi{i}nim stanicama, Rho pridonosi nadzoru nad kontrakcijom. U epitelnim stanicama, ~lanovi porodice Rho nadziru nastanak adherentnih spojeva, koji uklju~uju vezu kadherina i aktinskoga citoskeleta (vidi sliku 12-64). Tako ~lanovi porodice Rho sluè kao univerzalni regulatori aktinskoga citoskeleta, koji povezuju izvanstani~ne signale s promjenama stani~nog oblika i pokretanja. Dodatno, ~lanovi porodice Rho mogu aktivirati signalne putove MAP-kinaza, {to uzrokoje promjene u genskoj ekspresiji, te utje~e na ostale stani~ne aktivnosti, kao {to su promet mjehuri}a i stani~na polarnost. Dosad je otkriveno podosta mogu}ih ciljnih proteina za ~lanove porodice Rho, Rac i Cdc42, ali je uloga tih kandidata u stanici zasad nepoznata. Protein-serin/treonin-kinaza PKN jedan je od klju~nih ciljeva Rho-proteina u regulaciji citoskeleta (slika 13-41). Aktivacija kinaze PKN pove}ava fosforilaciju lakoga lanca miozina II s pomo}u dvaju mehanizama jer PKN ne samo da izravno fosforilira miozinski laki lanac, ve} istodobno fosforilira i ko~i fosfatazu miozinskoga lakoga lanca. Tako se znatno fosforilira miozinski laki lanac i aktivira miozin, a to uzrokuje sklapanje aktinskih i miozinskih vlakna, te promjene citoskeleta, kao {to su nastanak stresnih vlakana i fokalnih adhezija, adherentnih spoji{ta i citokineza. I Rac i cdc42 poti~u polimerizaciju aktina i tako stvaraju izbo~ine na stani~noj povr{ini (filopodije i lamelipodije). îni se da je ovaj u~inak Rac i Cdc42 posredovan s ciljnim molekulama koje se mogu povezati s kompleksom Arp2/3 (vidi sliku 11-5) kako bi potakle stvaranje aktinskih vlakana, ali podrobnosti ovih me|usobnih djelovanja jo{ nisu poznate.
Rho
protein-kinaza PKN
fosfataza miozinskoga lakog lanca
inaktivni miozin
aktivni miozin
P regulacijski laki lanac
stresna vlakna
Slika 13-41. Regulacija fosforilacije miozinskoga lakoga lanca s pomo}u Rho.

Rho poti~e protein-kinazu PKN, koja fosforilira regulacijski laki lanac miozina II i ko~i fosfatazu miozinskoga lakoga lanca. Tako se pove}ava fosforilacija lakoga lanca i pobu|uje miozin II, a to uzrokuje sklapanje vlakana aktina te miozina i nastanak stresnih vlakana.
Signaliziranje u razvoju i diferencijaciji

Poznavanje molekularnih mehanizama koji su odgovorni za animalni razvoj jedan je od glavnih izazova dana{nje stani~ne i molekularne biologije. Iz samo jedne stanice, a to je oplo|eno jaja{ce, nastaju sve vrste stanica u tijelu i organiziraju se u tkiva i organe. Stani~na diferencijacija i razvoj tjelesnih struktura regulirani su sloènim putevima me|ustani~noga signaliziranja {to uskla|uju aktivnost svake pojedine stanice, te u kona~nici dovode do nastanka tako sloènih organizama kao {to su ljudska bi}a. Iako je opse`ni opis razvojne biologije izvan okvira ovog ud`benika, valja primijetiti da je postignut znatan napredak u otkrivanju signalnih puteva koji su odgovorni za razvoj i diferencijaciju. Podrobnije }emo opisati tri primjera takvih signalnih putova.
Receptorska tirozin-kinaza/Ras/Raf/ERK put u vinske mu{ice i C. elegans

Razvoj i diferencijacija mnogih stanica nadzire se s pomo}u receptorskih tirozin-kinaza koje poti~u aktivnost signalnoga puta Ras/Raf/ERK. Model diferencijacije neurona jedan je od podrobno prou~enih primjera u kralje`njaka u kojem je diferencijacija posredovana aktivacijom receptora za neuronski faktor rasta (receptor je jedna receptorska tirozin-kinaza) i susljednim poticanjem Ras/Raf/ERK-puta. Me|utim, klju~na uloga ovoga signalnog puta u razvoju najjasnije je pokazana tijekom genske analize modela kao {to su D. melanogaster i C. elegans.
576
(A)
Poglavlje 13
(B) R7 R6 R8 R2 R4 R3 R1
Slika 13-42. Sloèno oko D. melanogaster.

(A) Slika sloènog oka dobivena s pomo}u pretra`ne elektronske mikroskopije. Oko se sastoji od pribli`no 800 jedinica. (B) Svaka jedinica sadràva osam fotoreceptorskih neurona (ozna~eni kao R1 R8), a redoslijed i obrazac razvoja neurona precizno su odre|eni. (A, ljubazno{}u T. Venkatesh, City College of New York.)
R5
stanica R8 boss stani~na membrana
stani~na membrana
Signaliziranje s pomo}u Ras/Raf/ERK-puta ima klju~nu ulogu u razvoju sloènog oka D. melanogaster, te dobro ocrtava ulogu izravnog signaliziranja izme|u dviju stanica u diferencijaciji. Sloèno oko D. melanogaster sastoji se od otprilike 800 jedinica, a svaka od tih jedinica sadràva osam fotoreceptorskih neurona (od R1 do R8) i dvanaest stanica le}e (slika 13-42). Fotoreceptorski se neuroni razvijaju to~no odre|enim slijedom. Najprije se diferencira neuron R8. Potom, R8 poti~e dvije susjedne stanice da postanu fotoreceptorski neuroni R2 i R5. Sljede}e, R2 poti~e susjedne stanice da postanu neuroni R1 i R3, a R5 poti~e susjedne stanice da postanu neuroni R4 i R6. Zavr{ni je korak diferencijacija neurona R7, koja je potaknuta me|usobnim djelovanjem s neuronom R8. Stanice le}e zatim se razvijaju iz onih stanica koje se ne diferenciraju u fotoreceptore. Signalni put diferencijacije stanica R7 podrobno je opisan zahvaljuju}i izolaciji mutiranih mu{ica u kojima izostaje razvoj neurona R7 (slika 13-43). Jedan od tih mutiranih oblika (engl. sevenless bez sedam ili onaj s manjkom 7) nastaje zbog manjkavosti gena koji nosi uputu za sintezu receptorske protein-tirozin-kinaze, koja je izraèna na prete~ama stanica R7. Druga mutanta (naziva se boss, {to je kratica za engl. bride-of sevenless mlada onoga s manjkom 7) posljedica je manjkavosti gena koji nosi uputu za sintezu proteina stani~ne membrane, koji je izraèn na stanicama R8. Boss je ligand za sevenless, tako da izravna interakcija dviju stanica, R8 i stanice-prete~e R7, poti~e aktivnost protein-tirozin-kinaze sevenless. Susljedne su studije pokazale da stani~na diferencijacija, koja je potaknuta signaliziranjem s pomo}u kinaze Sevenless, uklju~uje jo{ Ras i Raf, a to pak dovodi do aktivacije MAP-kinaze ERK i susljedne fosforilacije transkripcijskih faktora koji posreduju diferencijaciju R7. Drugi primjer otkri}a uloge Ras/Raf/ERK-puta s pomo}u genske analize jest model razvoja stidnice ili vulve u nematode C. elegans. U tom se sustavu jedna stanica najprije diferencira u gonadalnu usidrenu stanicu, koja pri~vr{}uje stidnicu za uterus. Usidrena stanica potom poti~e diferencijaciju triju stanica-prete~a, koje se dijele u 22 stanice stidnice. Izolacija mutiranih nematoda, u kojima izostaje razvoj stidnice, omogu}ila je karakterizaciju nekoliko gena koji su nu`ni za indukciju stidnice, te otkrila signalni put kojim usidrena stanica prenosi poruku za nastanak stanica-prete~a stidnice (slika 13-44). Jedan od tih gena, lin-3, nosi uputu za
sevenles
Slika 13-43. Indukcija diferencijacije R7.

ERK stanica R7
Diferencijacija fotoreceptorskog neurona R7 potaknuta je dodirom stanice-prete~e sa stanicom R8. Protein Boss na povr{ini stanice R8 je ligand za receptorsku proteintirozin-kinazu sevenless, koja je izraèna na stanici-prete~i R7. Pobu|ivanje kinaze sevenless aktivira signalni put Ras/Raf/ERK.
577
C. elegans
jaja{ca
gonada
Slika 13-44. Indukcija stidnice u C. elegans.

Usidrena stanica gonada lu~i molekulu Lin-3, koja je srodna faktoru EGF. Lin-3 poti~e receptorsku protein-tirozin-kinazu Let-23, koja je izraèna na prekursorskim stanicama stidnice. Aktivirani Let-23 pobu|uje signalni put Ras/Raf/ ERK. ERK fosforilira dva transkripcijska faktora (Lin-1 i Lin-31), koji poti~u proliferaciju i diferencijaciju triju prekursorskih stanica stidnice, tako da nastaju 22 stanice stidnice.
stidnica usidrena stanica
Lin-3 stani~na membrana Let-23
stanica-prete~a stidnice proliferac diferencijacija ERK ERK ERK
Lin-1/Lin-31
Lin-1/Lin-31
Lin-1/Lin-31
22 stanice stidnice
protein koji je srodan faktoru rasta EGF u sisavaca. Usidrene stanice izlu~uju protein Lin-3, koji se veè za receptor (Let-23) na povr{ini stanica-prete~a stidnice. Let-23 je receptorska protein-tirozin-kinaza, koja je srodna EGF-receptoru u sisavaca. Ostali geni, koji su nu`ni za indukciju stidnice, jesu gen let-60, koji nosi uputu za sintezu C. elegans Ras-a, i gen lin-45, koji nosi uputu za protein Raf. Dakle, razvoj stidnice u C. elegans uklju~uje poticanje receptorske protein-tirozin-kinaze s pomo}u faktora rasta i susljednu aktivaciju Ras/Raf-signalnoga puta. To uzrokuje aktivaciju MAP-kinaze ERK, koja fosforilira dva transkripcijska faktora (Lin-1 i Lin-31), a ti su faktori odgovorni za indukciju stidnice.
Hedgehog i Wnt
Putevi Hedgehog i Wnt usko su povezani signalni sustavi, koji imaju klju~nu ulogu u odre|ivanju sudbine neke stanice tijekom embrionalnoga razvoja. Oba su puta prvotno opisani u D. melanogaster, a potom je otkriveno da ~lanovi porodice Hedgehog i Wnt sudjeluju u {irokom rasponu zbiva-
578
Poglavlje 13
Hedgehog Smoothened Patched
stani~na ~ membrana mikrotubul Coastal Fused kidanje Ci 75 Ci155 citoplazma Ci155
jezgra
Ci155
Ci155
Slika 13-45. Signaliziranje s pomo}u peptida Hedgehog.

Polipeptid Hedgehog modificira se do datkom lipida i veè za molekulu Patched na povr{ini ciljne stanice. Tim se vezanjem ukida inhibicijski u~inak molekule Patched na molekulu Smoothened, pa Smoothened moè slobodno prenositi unutarstani~ni signal. Signaliziranje s pomo}u molekule Smoothened raskida kompleks u kojem je transkripcijski faktor Cubitus inter ruptus (Ci) vezan za protein-kinazu Fused i usidren na mikrotubulima s pomo}u proteina srodnog kinezinu Coastal. Unutar tog kompleksa, Ci se kida i nastaje transkripcijski represor Ci75. Razbijanje kompleksa omogu}uje cjelovitom faktoru Ci (Ci155) premje{tanje u jezgru, gdje poti~e transkripciju ciljnih gena.
nja, koji odre|uju raspored stanica tijekom embrionalnoga razvoja u kralje`njaka i beskralje`njaka. Primjeri procesa, koji su regulirani tim signalnim putevima, uklju~uju odre|ivanje stani~nih vrsta i oblikovanje rasporeda stanica tijekom razvoja udova, ìv~anoga sustava, kostiju, plu}a, kose, zubi i spolnih `lijezda. Geni hedgehog (jedan u D. melanogaster i tri u sisavaca) nose uputu za proteine koji se izlu~uju i modificiraju dodatkom lipida. Funkcionalni receptor za Hedgehog sastoji se kod dvaju transmembranskih proteina, koji se nazivaju Patched i Smoothened (slika 13-45). Hedgehog se veè za Patched, a Patched djeluje kao negativni regulator Smoothened. Jednom kad se Hedgehog veè za Patched, Smoothened moè dalje {iriti unutarstani~ni signal. Smoothened je gra|om nalik na receptore povezane s G-proteinom jer ima sedam transmembranskih -uzvojnica (vidi sliku 13-10). Me|utim, nije opisano da je Smoothened povezan s G-proteinom, a ne zna se ni mehanizam kojim Smoothened prenosi signal u stanicu. Ciljna molekula signaliziranja s pomo}u proteina Smoothened je transkripcijski faktor koji se zove Cubitus interruptus (Ci) u D. melanogaster (Gli u sisavaca), a nalazi se u spoju s protein-kinazom Fused i jednim proteinom koji je nalik kinezinu, a naziva se Coastal. Ako se ne poti~e signaliziranje s pomo}u proteina Smoothened, taj je kompleks zdruèn s mikrotubulima, vjerojatno s pomo}u me|usobnog djelovanja proteina Coastal i tubulina, a transkripcijski faktor Ci se kida, kako bi nastao transkripcijski represor (Ci75). Jednom kad se pobudi protein Smoothened, kompleks se odvaja od mikrotubula, a cjeloviti faktor Ci (Ci155) se premje{ta u jezgru, gdje poti~e prepisivanje ciljnih gena. Zanimljivo je da ti ciljni geni za faktor Ci uklju~uju i gene koji nose uputu za proteine porodice Wnt, a to omogu}uje izravnu povezanost signalnih puteva Hedgehog i Wnt. Proteini Wnt ~ine porodicu izlu~enih faktora rasta, koji se veù za receptore iz porodice Frizzled (slika 13-46). Receptori Frizzled sli~ni su proteinima Smoothened jer imaju sedam transmembranskih a-uzvojnica, a da se pritom ne zna se jesu li povezani s G-proteinima. Signaliziranje potaknuto s pomo}u receptora Frizzled poti~e fosforilaciju citoplazmatskog proteina, koji se naziva Dishevelled, te ko~i aktivnost protein-kinaze GSK-3 (glikogen-sintaza-kinaza 3). GSK-3 fosforilira i poti~e razgradnju b-katenina, a bkatenin smo upoznali u 11. poglavlju kao transmembranski protein koji povezuje kadherin i aktin u adherentnim spoji{tima (vidi sliku 11-15). Me|utim, zdruìvanje kadherina s aktinom samo je jedna od uloga b-katenina. U signaliziranju s pomo}u Wnt, b-katenin djeluje kao izravni regulator genske ekspresije jer stvara kompleks s ~lanovima porodice transkripcijskih faktora Tcf/LEF. Jednom kad se ~lanovi porodice Tcf/LEF poveù s b-kateninom, pretvaraju se iz transkripcijskih represora u aktivatore transkripcije, a to poja~ava ekspresiju ciljnih gena koji nose uputu za ostale signalne molekule i razli~ite transkripcijske faktore koji nadziru stani~nu sudbinu.
Notch-signaliziranje
Notch-put je jo{ jedan primjer evolucijski o~uvanoga signalnoga puta koji nadzire stani~nu sudbinu tijekom animalnoga razvoja. Poput signalnoga puta koji dovodi do diferencijacije fotoreceptorskoga neurona R7 u D. melanogaster, Notch-signaliziranje je primjer izravnoga me|usobnog djelovanja dviju stanica tijekom razvoja. Notch nadzire stani~nu proliferaciju, preìvljenje i diferencijaciju u svim fazama razvoja razli~itih organizama, od D. melanogaster i C. elegans, pa sve do ljudi. Notch je veliki protein s jednom transmembranskom domenom, koja sluì kao receptor za signaliziranje s pomo}u transmembranskih proteina
579
Slika 13-46. Signalni put polipeptida Wnt.

Polipeptidi Wnt se veù za membranske receptore iz porodice Frizzled. Signaliziranje koje zapo~inje Frizzled ko~i aktivnost protein-kinaze GSK-3, a time se stabilizira b-katenin, koji stvara kompleks s transkripcijskim faktorima Tcf/LEF. To uzrokuje pretvorbu ~lanova porodice Tcf/LEF iz represora u aktivatore, koji poti~u ekspresiju ciljnih gena.
Frizzled stani~na membrana
Wnt
citoplazma
na susjednim stanicama (primjerice, protein Delta) (slika 13-47). Podraìvanjem proteina Notch otpo~inje novi i izravni put aktivacije transkripcije. Vezanje liganda uzrokuje proteoliti~ko kidanje Notch, a unutarstani~na domena se potom premje{ta u jezgru. U jezgri, unutarstani~na domena proteina Notch me|usobno djeluje s transkripcijskim faktorom (koji se zove Su(H) u D. melanogaster ili CSL u sisavaca), te ga pretvara iz represora u aktivator transkripcije ciljnih gena. Sli~no Wnt-signalnom putu, ciljni geni proteina Notch uklju~uju gene koji nose uputu za sintezu drugih transkripcijskih regulatora, koji djeluju tako da odre|uju stani~nu sudbinu.
Dishevelled aksin APC
b-katenin
b-katenin
Regulacija programirane stani~ne smrti

Programirana stani~na smrt je normalan, fiziolo{ki oblik stani~ne smrti, koji ima klju~nu ulogu tijekom embrionalnoga razvoja i u odràvanju odraslih tkiva. U odraslih, programirana stani~na smrt je u ravnoteì sa stani~nom proliferacijom i odràva konstantnim broj stanica u tijelu. Primjerice, u ljudi se dnevno uklanja oko 5 1011 krvnih stanica s pomo}u programirane stani~ne smrti, kako bi se odràla ravnoteà sa stalnom produkcijom stanica u ko{tanoj srì. Dodatno, programirana stani~na smrt predstavlja obrambeni mehanizam kojim se o{te}ene i potencijalno opasne stanice mogu ukloniti za dobrobit cijelog organizma. Stanice zaraène virusom ~esto podlijeù programiranoj stani~noj smrti, kako bi se sprije~ilo stvaranje novih virusnih ~estica i ograni~ilo {irenje virusa po organizmu doma}ina. I drugi oblici o{te}enja, poput o{te}enja DNA, pobu|uju programiranu stani~nu smrt. U slu~aju o{te}enja DNA, programirana stani~na smrt moè ukloniti stanice koje nose potencijalno {tetne mutacije, {to uklju~uje i stanice s mutacijama koje mogu dovesti do nastanka karcinoma. Tijekom embrionalnoga razvoja, programirana stani~na smrt ima klju~nu ulogu u uklanjanju neèljenih stanica iz mno{tva tkiva. Primjerice, programirana stani~na smrt odgovorna je za uklanjanje tkiva li~inke tijekom metamorfoze vodozemaca i kukaca, kao i za uklanjanje tkiva izme|u prstiju tijekom formiranja prstiju ruku i nogu. Drugi, dobro poznati primjer programirane stani~ne smrti je razvoj ìv~anoga sustava u sisavaca. Neuroni se stvaraju u suvi{ku, te se ~ak do 50% neurona u razvoju ukloni s pomo}u programirane stani~ne smrti. Preìve samo probrani neuroni, a to su oni koji su stvorili pravilne veze sa svojim ciljnim stanicama, tako da im te stanice mogu lu~iti faktore rasta koji nose poruku preìvljenja i ko~e programiranu stani~nu smrt neurona. Sli~no tomu, opstanak mnogih drugih stanica u organizmu ovisi o faktorima rasta ili o dodiru sa susjednim stanicama ili izvanstani~nom tvari, pa se stoga smatra da programirana stani~na smrt ima va`nu ulogu u regulaciji me|usobne povezanosti stanica u tkivu. ProgramiSlika 13-47. Signaliziranje s pomo}u molekule Notch.
Notch sluì kao receptor za izravno signaliziranje izme|u dviju susjednih stanica s pomo}u transmembranskih proteina (primjerice, proteina Delta). Vezanje proteina Delta uzrokuje proteoliti~ko kidanje molekule Notch i otpu{tanje unutarstani~ne domene, koja se premje{ta u jezgru i, zajedno s transkripcijskim faktorom (Su(H) ili CSL), inducira gensku ekspresiju.
jezgra
stani~na membrana Delta Notched
citoplazma
jezgra
580
(A)
Poglavlje 13
rana stani~na smrt nadzire se s pomo}u integrirane aktivnosti razli~itih signalnih putova, od kojih neki djeluju tako da poti~u stani~nu smrt, a neki tako da poti~u stani~no preìvljenje.
Kaspaze i apoptoza
fragmentacija DNA kondenzacija kromatina
fragmentacija jezgre
fragmentacija stanice
(B)
normalna stanica
Nasuprot slu~ajnoj smrti stanice koja nastaje kao posljedica akutne ozljede, programirana stani~na smrt je aktivni proces, koji je obiljeèn razli~itim morfolo{kim promjenama poznatim kao apoptoza (slika 13-48). Tijekom apoptoze, kromosomska DNA obi~no je fragmentirana zbog kidanja izme|u nukleosoma. Kromatin se kondenzira i jezgra se raspada u male komadi}e. U kona~nici se i sama stanica skvr~i i raspadne u komadi}e okruène membranom, koje nazivamo apoptoti~kim tjele{cima. Makrofagi i susjedne stanice odmah prepoznaju i fagocitiraju takve apoptoti~ke stanice i stani~ne fragmente, tako da se stanice koje umru apoptozom u~inkovito uklanjaju iz tkiva. Nasuprot tomu, stanice koje umiru zbog akutne ozljede najprije nateknu, potom se liziraju i otpu{taju svoj sadràj u izvanstani~ni prostor, {to uzrokuje upalu. Tijekom prou~avanja programirane stani~ne smrti u razvoju C. elegans, otkrivena su tri gena koja imaju klju~nu ulogu u regulaciji i izvr{avanju apoptoze. Tijekom normalnoga razvoja nematoda, 131 od ukupno 1.090 somatskih stanica odstranjuje se programiranom stani~nom smr}u. Dva su gena nu`na da bi se zbila apoptoza; ced-3 i ced-4. Ako je bilo koji od ta dva gena inaktivan, izostat }e normalna programirana stani~na smrt. Tre}i gen, gen ced-9, djeluje kao negativni regulator apoptoze. Ako se ced-9 inaktivira zbog mutacije, stanice, koje bi ina~e normalno preìvjele, umiru apoptozom, a to uzrokuje smrt nematode u razvoju. Obratno, ako je ced-9 prekomjerno izraèn, izostat }e normalna programirana stani~na smrt. U sisavaca su otkriveni geni koji su srodni genima ced-3, ced-4 i ced-9, a ti geni nose upute za sintezu proteina koji predstavljaju evolucijski o~uvane efektore i regulatore apoptoze u odgovoru na razli~ite podraàje. Ced-3 je prototip porodice koja sadràva vi{e od desetine proteaza, poznate kao kaspaze, jer imaju cisteinske (Cys) ostatke na svojim aktivnim mjestima i kidaju na aspartatnim ostatcima (Asp) svoj proteinski supstrat. Kaspaze su kona~ni efektori ili egzekutori programirane stani~ne smrti, koji uzrokuju apoptozu kidanjem gotovo stotinu razli~itih ciljnih proteina u stanici. Jedan od klju~nih ciljeva kaspaza je inhibitor DNaze, koji je u svom aktivnom obliku odgovoran za fragmentaciju jezgrine DNA. Dodatno, kaspaze kidaju jezgrine lamine, {to uzrokuje fragmentaciju jezgara i citoskeletnih proteina, pa se citoskelet prekida, membrana bubri, a stanica raspada u komadi}e. Kaspaze se sintetiziraju kao inaktivne prete~e, a pretvaraju se u aktivni oblik s pomo}u proteoliti~koga kidanja, koje kataliziraju druge kaspaze. Tako aktivacija po~etne kaspaze zapo~inje lan~anu reakciju koja poti~e aktivaciju dodatnih nizvodnih kaspaza i uzrokuje smrt stanice. Zato je nadzor nad kaspazama klju~an u odre|ivanju stani~noga preìvljenja. Ced-4 i njegov homolog u sisavaca (Apaf-1) veù se na kaspaze i poti~u njihovu aktivaciju. Nasuprot tomu, Ced-9 ko~i aktivaciju kaspaza. Sisavci nose uputu za sintezu cijele porodice proteina (porodica Bcl-2), koja je srodna proteinu
Slika 13-48. Apoptoza.

(A) Shematski prikaz zbivanja tijekom apoptoze. (B) Slika normalne i apoptoti~ne ljudske leukemijske stanice dobivena s pomo}u svjetlosne mikroskopije. Vidi se kondenzacija kromatina i fragmentacija jezgre tijekom apoptoze. (B, ljubazno{}u D. R. Green/La Jolla Institute for Allergy and Immunology.)
apoptoti~na stanica
581
Ced-9. Neki ~lanovi Bcl-2-porodice, {to uklju~uje i sam Bcl-2, djeluju sli~no Ced-9 kao inhibitori aktivacije kaspaza i programirane stani~ne smrti. Me|utim, drugi ~lanovi porodice Bcl-2 poti~u aktivaciju kaspaza i stani~nu smrt. Kaspaze su tako|er regulirane s pomo}u porodice proteina, koja se zove IAP (IAP prema engl., inhibitors of apoptosis proteins). IAP ko~e apopto, zu jer izravno ko~e aktivnost kaspaza. U stanicama sisavaca, ~lanovi Bcl-2-porodice djeluju u mitohondrijima, koji imaju sredi{nju ulogu u nadzoru nad programiranom stani~nom smrti (slika 13-49). Jedna od glavnih inicijacijskih kaspaza u stanicama sisavaca (kaspaza-9) aktivira se, kao i Ced-3 u C. elegans, tako da stvara kompleks s proteinom Apaf-1, koji je homolog molekuli Ced-4. U sisavaca, nastanak kompleksa zahtijeva jo{ i citokrom c, koji se otpu{ta iz mitohondrija u odgovoru na podraàje koji poti~u apoptozu. U normalnim uvjetima, kad stanica preìvljava, citokrom c je smje{ten u me|umembranskom prostoru mitohondrija (vidi sliku 10-8), a Apaf-1 i kaspaza-9 u citosolu, tako da kaspaza-9 ostaje inaktivna. Me|utim, razli~iti podraàji koji poti~u stani~nu smrt, poput o{te}enja DNA ili manjka faktora rasta, uzrokuju o{te}enje mitohondrija i otpu{tanje citokroma c u citosol. U citosolu, citokrom c se veè na Apaf1 i poti~e nastanak sloènoga kompleksa Apaf-1/kaspaza-9 koji se zove apoptosom, gdje je kaspaza-9 aktivirana. Kaspaza-9 potom kida i aktivira ostale nizvodne izvr{ne kaspaze, kao {to je kaspaza-3, a to u kona~nici dovodi do stani~ne smrti. ^lanovi porodice Bcl-2 djeluju u mitohondrijskoj membrani tako da nadziru cjelovitost mitohondrija i otpu{tanje citokroma c. ^lanovi porodice Bcl-2 koji ko~e apoptozu (kao {to je i sam Bcl-2) sprje~avaju otpu{tanje citokroma c, a ~lanovi porodice Bcl-2 koji poti~u stani~nu
signali stani~ne smrti Smac/ Diablo ~lanovi porodice Bcl-2
citokrom c
kaspaza-9
Apaf-1
Slika 13-49. Regulatori i efektori apoptoze.

U stanicama sisavaca, mnogi signali stani~ne smrti induciraju apoptozu tako da o{te}uju mitohondrije, {to uzrokuje otpu{tanje citokroma c i ostalih proapoptoti~kih molekula, poput molekule Smac/Diablo, iz me|umembranskoga prostora. ^lanovi porodice Bcl-2 djeluju na vanjskoj mitohondrijskoj membrani tako da nadziru cjelovitost mitohondrija. Otpu{tanje citokroma c iz mitohondrija uzrokuje nastanak kompleksa (apoptosoma), koji sadràva Apaf-1 i aktiviranu kaspazu-9. Potom, kaspaza-9 proteoliti~ki aktivira nizvodne kaspaze, kao {to je kaspaza-3. Smac/Diablo poti~e stani~nu smrt tako da ometa u~inak molekula IAP koje su inhibitori kaspaza. ,
apoptosom IAPs
s stani~na smrt pro-kaspaza-3
582
Poglavlje 13 smrt djeluju tako da poti~u o{te}enje mitohondrija, otpu{tanje citokroma c i aktivaciju kaspaza. Zanimljivo je da o{te}enje mitohondrija uzrokuje otpu{tanje ne samo citokroma c, ve} i ostalih molekula koje poti~u apoptozu. U te se molekule ubraja i protein (zove se Smac/Diablo) koji poti~e aktivnost kaspaza tako da ometa u~inak IAP Kao {to }emo dalje opisati, kaspaze, ~la. novi porodice Bcl-2 i IAPi kriti~ni su ciljevi signalnih puteva koji nadziru preìvljenje stanica sisavaca.
Receptori stani~ne smrti i aktivacija kaspaza

Neki izlu~eni polipeptidi prenose poruku programirane stani~ne smrti tako da aktiviraju receptore koji izravno poti~u apoptozu u ciljnim stanicama. Ti signali stani~ne smrti su polipeptidi, koji pripadaju porodici faktora tumorske nekroze (TNF). Faktori se veù za ~lanove porodice TNF-receptora, koji prenose apoptoti~ne signale u razli~itim stanicama. Jedan od najpodrobnije opisanih ~lanova te porodice je stani~ni receptor Fas, koji ima va`nu ulogu u regulaciji stani~ne smrti u imunolo{kom sustavu. Primjerice, apoptoza potaknuta aktivacijom Fas odgovorna je za ubijanje ciljnih stanica imunosustava, kao {to su stanice karcinoma ili stanice zaraène virusom, ali i za uklanjanje suvi{ka limfocita na kraju imunoodgovora. Receptori stani~ne smrti prenose apoptoti~ne signale izravnom aktivacijom kaspaza (slika 13-50). TNF i srodni ~lanovi porodice sastoje se od tri istovjetna polipeptidna lanca, a njihovo vezanje poti~e trimerizaciju receptora. Citoplazmatski dio receptora veè adapterske molekule, koje potom veù uzvodnu kaspazu, kaspazu-8. Kaspaza-8 se aktivira autoproteolizom, a jednom aktivirana, kaspaza-8 moè potaknuti sve ostale nizvodne kaspaze i zapo~eti kaskadu koja dovodi do stani~ne smrti. Osim {to kida ostale kaspaze, kaspaza-8 kida i ~lana porodice Bcl-2 koji se zove Bid. Bid je jedan od onih ~lanova porodice Bcl-2 koji djeluje tako da poti~e apoptozu, a ne da je ko~i. Bid se normalno nalazi u inaktivnom obliku u citosolu. Me|utim, kad se pokida kaspazom-8, Bid se premje{ta u mitohondrij gdje razara membrane i otpu{tanje citokroma c u citosol. To pak dovodi do aktivacije kaspaze-9, pa se tako dodatno poja~ava kaskada kaspaza, koja je zapo~ela izravnom aktivacijom kaspaze-8 na receptoru stani~ne smrti.
Fas-ligand
Fas
citoplazma
adapter
Signaliziranje stani~noga preìvljenja

Signaliziranje s pomo}u TNF i srodnih polipeptida aktivan je proces u kojem podraìvanje receptora stani~ne smrti poti~e apoptozu. Drugi signalni putevi djeluju u suprotnom smjeru i poti~u stani~no preìvljenje ko~enjem apoptoze. Ti signalni putevi nadziru opstanak razli~itih stanica, koji ovisi o izvanstani~nim faktorima rasta ili o me|usobnom djelovanju dviju stanica. Uistinu, ako stani~na smrt nije aktivno potisnuta s pomo}u signala preìvljenja podrijetlom iz drugih stanica, stanice vi{ih ìvotinja su, uglavnom, programirane za apoptozu. Prethodno smo spomenuli da je razvoj ìv~anoga sustava u kralje`njaka podrobno opisani primjer programirane stani~ne smrti. Otprilike polovina
kaspaza-9
autoproteoliza
aktivna kaspaza-8
nizvodne kaspaze
Slika 13-50. Receptori stani~ne smrti.

stani~na smrt
Vezanje liganda za receptor Fas poti~e apoptozu izravnom aktivacijom kaspaze-8. Fas-ligand se sastoji od tri polipeptidna lanca, tako da njegovo vezanje uzrokuje trimerizaciju receptora. Kaspaza-8, koja je vezana za receptor preko adapterske molekule, aktivira se tako da samu sebe proteoliti~ki kida, a to uzrokuje aktivaciju nizvodnih kaspaza i stani~nu smrt.
583
neurona umire apoptozom, a preìvjeli su oni koji su primili dovoljnu koli~inu signala preìvljenja od svojih ciljnih stanica. Ti signali opstanka ili preìvljenja su polipeptidni faktori rasta koji su srodni neuronskom faktoru rasta (NGF), a NGF poti~e preìvljenje neurona i diferencijaciju s pomo}u aktivacije receptorskih protein-tirozin-kinaza. Sli~no tomu, druge stanice su ovisne o faktorima rasta ili dodirima stanica, koji poti~u nereceptorske protein-tirozin-kinaze zdruène s integrinima. Jedan od glavnih unutarstani~nih signalnih putova, koji je odgovoran za promicanje stani~noga preìvljenja, pokre}e se s pomo}u enzima PI 3-kinaze, koja se aktivira s pomo}u protein-tirozin-kinaza ili putem receptora povezanih s G-proteinima. PI 3-kinaza fosforilira membranski fosfolipid PIP2, kako bi nastao PIP3, koji aktivira protein-serin/treonin-kinazu Akt (vidi sliku 13-31). Zatim Akt fosforilira brojne proteine koji nadziru apoptozu (slika 13-51). Jedan od supstrata kinaze Akt je ~lan porodice Bcl-2, koji se zove Bad. Bad je jedan od onih ~lanova porodice Bcl-2 (poput Bid) koji poti~e stani~nu smrt jer poti~e otpu{tanje citokroma c iz mitohondrija. Akt fosforilira Bad i tako stvara vezno mjesto za proteine koji mogu zadràti Bad u citosolu i sprije~iti njegovo premje{tanje u mitohondrijsku membranu. Akt tako|er fosforilira mno{tvo transkripcijskih faktora koji nadziru stani~no preìvljenje jer nadziru ekspresiju ciljnih gena, koji uklju~uju i ~lanove porodice Bcl-2. Dodatno, Akt fosforilira drugu protein-kinazu (GSK-3) koja utje~e na apoptozu, time {to nadzire transkripciju i translaciju ciljnih gena. Tako PI 3-kinaza/Akt-put nadzire stani~no preìvljenje putem razli~itih nizvodnih ciljeva, a oni vjerojatno uklju~uju ne samo ~lanove porodice Bcl-2, ve} i IAP i njihove regulatore. Osim signalnoga puta PI 3-kinaza/Akt, i drugi signalni putevi prenose poruku stani~noga preìvljenja, kao {to je Ras/Raf/ERK-put. Jedan od na~i-
Slika 13-51. Signalni put PI 3-kinaze i stani~no preìvljenje.

îmbenici preìvljenja, kao {to je NGF, poti~u aktivnost receptorskih proteintirozin-kinaza i nastanak PIP3. PIP3 privla~i protein-kinazu Akt na stani~nu membranu, a Akt se aktivira fosforilacijom koja je posredovana kinazom PDK1. Akt potom fosforilira brojne proteine koji pridonose preìvljenju stanice. Ciljevi kinaze Akt, koji su opisani u potiskivanju apoptoze, uklju~uju: molekulu Bad iz porodice Bcl-2, razli~ite transkripcijske faktore i protein-kinazu GSK-3. GSK-3 utje~e na stani~ni metabolizam, sintezu proteina i na fosforilaciju dodatnih transkripcijskih faktora.
~imbenik preìvljenja receptorska tirozin-kinaza stani~na membrana PIP2 P P PI 3-kinaza PIP3 Akt PDK1
Bad transkripcijski faktori
GSK-3
metabolizam sinteza proteina transkripcijski faktori
584
Poglavlje 13
na kako Ras/Raf/ERK-put ko~i apoptozu je fosforilacija i aktivacija proteinkinaze RSK s pomo}u kinaze ERK. Poput Akt-a, RSK fosforilira Bad iz porodice Bcl-2, tako da Bad sluì kao sjeci{te puteva PI 3-kinaza/Akt i ERK u preno{enju poruke stani~noga preìvljenja. Dodatno, ERK i RSK fosforiliraju transkripcijske faktore koji utje~u na ekspresiju gena koji nadziru apoptozu. Signali i mehanizmi koji nadziru stani~no preìvljenje aktivno su i uzbudljivo podru~je suvremenih istraìvanja u kojem su mnoga pitanja jo{ bez odgovora.
KLJU^NI POJMOVI
S A @ E TA K SIGNALNE MOLEKULE I NJIHOVI RECEPTORI
endokrino signaliziranje, hormon, parakrino signaliziranje, autokrino signaliziranje
Oblici signaliziranja izme|u dviju stanica: Ve}inu signalnih molekula izlu~uje jedna stanica, a veù se za receptore na ciljnoj stanici. Signaliziranje izme|u dviju stanica podijeljeno je u tri op}enite vrste (endokrino, parakrino i autokrino signaliziranje), a podjela se zasniva na udaljenosti koju premo{}uju signali. Steroidni hor moni i superporodica receptora u jezgri: Steroidni hormoni, tireoidni hormon, vitamin D3 i retinoi~na kiselina su male hidrofobne molekule koje difundiraju kroz stani~nu membranu ciljnih stanica i veù se za unutarstani~ne receptore. ^lanovi superporodice receptora u jezgri djeluju kao transkripcijski faktori, koji izravno nadziru ekspresiju gena u odgovoru na vezanje liganda. Du{ikov oksid i ugljikov monoksid: Jednostavni plinovi, du{ikov oksid i ugljikov monoksid, va`ne su parakrine signalne molekule u ìv~anom sustavu i drugim stanicama. Neurotransmitori: Neurotransmitori su male, hidrofilne molekule koje prenose signale izme|u neurona i drugih ciljnih stanica u sinapsama. Mnogi neurotransmitori veù se za ionske kanale nadzirane ligandom. Peptidni hor moni i faktori rasta: Najrazli~itije signalne molekule u ìvotinja su peptidi, veli~ine od svega nekoliko do vi{e od stotinu aminokiselina. Ova skupina molekula uklju~uje peptidne hormone, neuropeptide i faktore rasta.
steroidni hormon, testosteron, estrogen, progesteron, kortikosteroid, glukokortikoid, mineralokortikoid, ekdison, brasinosteroid, tireoidni hormon, vitamin D3, retinoi~na kiselina, retinoid, superporodica receptora u jezgri
neurotransmitor
peptidni hormon, neuropetid, enkefalin, endorfin, neurohormon, faktor rasta, faktor rasta neurona (NGF), neurotrofin, epidermalni faktor rasta (EGF), trombocitni faktor rasta (PDGF), citokin, faktor rasta usidren u membrani eikozanoid, prostaglandin, prostaciklin, tromboksan, leukotrien biljni hormon, auksin, giberelin citokinin, apscizinska kiselina, etilen
Eikozanoidi: Eikozanoidi su vrsta lipida koja djeluje u parakrinom i autokrinom signaliziranju. Biljni hor moni: Male molekule, poznate kao biljni hormoni, nadziru rast i razvoj biljaka.
585
DJELOVANJE STANI^NIH POVR[INSKIH RECEPTORA

Receptori povezani s G-proteinima: Najve}a porodica receptora na stani~noj povr{ini, uklju~uje receptore za mnoge hormone i neurotransmitore, prenosi signale do unutarstani~nih ciljeva putem G-proteina. Receptorske protein-tirozin-kinaze: Receptori za ve}inu faktora rasta su protein-tirozin-kinaze. Receptori za citokine i nereceptorske protein-tirozin-kinaze: Receptori za mnoge citokine djeluju zdruèno s nereceptorskim protein-tirozin-kinazama. Receptori povezani s drugim enzimskim aktivnostima: Druge vrste receptora na povr{ini stanice uklju~uju protein-tirozin-fosfataze, protein-serin/treonin-kinaze i gvanil-ciklaze.
G-protein, receptori povezani s G-proteinom, heterotrimerni G-protein receptorske protein-tirozinkinaze, autofosforilacija, SH2domena, PTB-domena superporodica receptora za citokine, nereceptorske proteintirozin-kinaze, Janus-kinaze (JAK), Src protein-tirozin-fosfataze, transformiraju}i faktor rasta b (TGF-b), protein-serin/treoninkinaza, gvanil-ciklaza
PUTEVI UNUTARSTANI^NOGA PRIJENOSA SIGNALA

Put cAMP-a. Drugi glasnici i fosforilacija proteina: Cikli~ki AMP je vaàn drugi glasnik u odgovoru animalnih stanica na razli~ite hormone i mirise. Djelovanje cAMP-a uglavnom je posredovano protein-kinazom A, koja fosforilira metaboli~ke enzime i transkripcijski faktor CREB.
unutarstani~ni prijenos signala, cikli~ki AMP (cAMP), drugi glasnik, adenil-ciklaza, cAMP-fosfodiesteraza, protein-kinaza ovisna o cAMP (protein-kinaza A), element odgovora na cAMP (CRE), CREB cikli~ki GMP (cGMP), rodopsin, transducin, cGMPfosfodiesteraza fosfatidil-inozitol-4,5-bisfosfat (PIP2), fosfolipaza C, diacil-glicerol, inozitol-1,4,5-trifosfat (IP3), protein-kinaza C, forbolester, kalmodulin, CaM-kinaza, rajanodinski receptor, fosfatidilinozitol-3-kinaza (PI 3-kinaza), fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfat (IP3), Akt
Cikli~ki GMP: Cikli~ki GMP tako|er je vaàn drugi glasnik u ìvotinjskim stanicama. Njegova uloga najbolje je okarakterizirana pri zamje}ivanju vidnih signala u oku kralje`njaka. Fosfolipidi i Ca2+: Fosfolipidi i Ca2+ jesu uobi~ajeni drugi glasnici koji se aktiviraju nizvodno od receptora povezanih s G-proteinima i nizvodno od protein-tirozin-kinaza. Hidrolizom fosfatidil-inozitol-4,5-bisfosfata (PIP2) nastaje diacil-glicerol, koji aktivira protein-kinazu C, i inozitol1,4,5-trifosfat (IP3), koji mobilizira Ca2+ iz unutarstani~nih spremnika. Povi{enje koncentracije unutarstani~noga Ca2+ potom aktivira razli~ite ciljne proteine, kao {to su protein-kinaze ovisne o kompleksu Ca2+/ kalmodulin. U elektri~ki podra`ljivim stanicama ìvaca i mi{i}a, razina unutarstani~noga Ca2+ pove}ava se otvaranjem Ca2+ kanala reguliranih naponom u stani~noj membrani i rajanodinskih receptora u endoplazmatskom i sarkoplazmatskom retikulu. Osim razgradnje na diacil-glicerol i IP3, PIP2 se moè fosforilirati u razli~iti drugi glasnik, PIP3. To dovodi do aktivacije protein-serin/treonin-kinaze Akt, koja ima klju~nu ulogu u stani~nom preìvljenju. Ras, Raf i signalni put MAP-kinaze: Signalni put MAP-kinaze evolucijski je o~uvan lanac protein-kinaza, koje se aktiviraju nizvodno od razli~itih izvanstani~nih signala. U animalnim stanicama, najvi{e se zna o obliku MAP-kinaze koji je povezan s receptorima faktora rasta preko maloga Ras-proteina koji veè GTP Ras zapo~inje kaskadu protein-kinaza, koja . uzrokuje aktivaciju MAP-kinaze (ERK). ERK potom fosforilira razli~ite proteine u citoplazmi i jezgri, a to uklju~uje i transkripcijske faktore koji posreduju pobu|ivanje gena neposrednog i ranog odgovora. Ostali putevi MAP-kinaze posreduju u sisavaca stani~ni odgovor na upalu i stres. Pojedini su dijelovi signalnoga puta MAP-kinaze organizirani s pomo}u konstrukcijskih proteina, koji imaju va`nu ulogu u odràvanju specifi~nosti signaliziranja s pomo}u MAP-kinaze.
MAP-kinaza, ERK, Ras, Raf, MEK, faktor izmjene gvaninnukleotida, protein koji aktivira GTPazu, mali protein koji veè GTP, neposredno rani gen, element odgovora na serum (SRE), faktor odgovora na serum (SRF), Elk-1, konstrukcijski proteini
586
Poglavlje 13
signalni put JAK/STAT, STAT protein
Signalni put JAK/STAT: STAT proteini transkripcijski su faktori, koji sadrè domene SH2, te se izravno aktiviraju s pomo}u protein-tirozin-kinaza, koje su pridruène receptorima citokina i faktora rasta.
PRIJENOS SIGNALA I CITOSKELET

FAK
Integrini i prijenos signala: Vezanje integrina za izvanstani~nu tvar poti~e nereceptorske protein-tirozin-kinaze FAK i Src. To uzrokuje aktivaciju fosfolipaze C, PI 3-kinaze i signalnih puteva Ras/Raf/ERK. Regulacija aktinskoga citoskeleta: Faktori rasta poti~u promjene stani~ne pokretljivosti i oblika s pomo}u preoblikovanja aktinskoga citoskeleta. Te su promjene citoskeleta posredovane s pomo}u ~lanova Rho-podskupine malih proteina koji veù GTP .
Rho, Rac, Cdc42
SIGNALIZIRANJE U RAZVOJU I DIFERENCIJACIJI

Receptorska tirozin-kinaza/Ras/Raf/ERK-put u D. melanogaster i C. elegans: Uloga signalnoga puta Ras/Raf/ERK u razvoju otkrivena je tijekom prou~avanja diferencijacije fotoreceptorskih neurona u D. melanogaster i indukcije stidnice u C. elegans.
Hedgehog, Wnt
Hedgehog i Wnt: Signalni putevi Hedgehog i Wnt imaju klju~nu ulogu u odre|ivanju oblikovanja i sudbine stanice tijekom embrionalnoga razvoja kralje`njaka i beskralje`njaka. Notch-signaliziranje: Signalni put Notch nadzire sudbinu stanice izravnim me|usobnim djelovanjem dviju stanica tijekom animalnoga razvoja.
Notch
REGULACIJA PROGRAMIRANE STANI^NE SMRTI

programirana stani~na smrt, apoptoza, kaspaza, Bcl-2, IAP, apoptosom
Kaspaze i apoptoza: Programirana stani~na smrt ima klju~nu ulogu u odràvanju odraslih tkiva i u embrionalnom razvoju. Razli~ito od slu~ajne smrti stanice, koja nastaje zbog akutne ozljede, programirana stani~na smrt odvija se aktivnim procesom apoptoze. Geni, koji su odgovorni za nadzor nad apoptozom i za njezino izvr{enje, evolucijski su o~uvani od C. elegans do ljudi. Dijelovi apoptoti~koga stroja uklju~uju porodice proteaza (kaspaza), koje su izvr{ioci stani~ne smrti, kao i proteine koji nadziru aktivaciju kaspaza. U stanicama sisavaca, otpu{tanje citokroma c iz mitohondrija ima klju~nu ulogu u zapo~injanju aktivacije kaspaza. Receptori stani~ne smrti i aktivacija kaspaza: Neki izlu~eni polipeptidi induciraju programiranu stani~nu smrt tako da poti~u receptore koji su izravno povezani s kaspazama. Signaliziranje stani~noga preìvljenja: Mnoge stanice ovise o signalima preìvljenja koji dolaze od izlu~enih faktora ili od izravnoga dodira dviju stanica koji ko~e apoptozu. Signalni put PI-3-kinaza/Akt je glavni signalni put, koji je odgovoran za promicanje stani~noga preìvljenja.
faktor nekroze tumora (TNF)
587
Pitanja
1. Po ~emu se parakrino signaliziranje razlikuje od endokrinoga signaliziranja? 2. Za{to ve}ina stanica ne rabi autokrino signaliziranje za stimulaciju stani~ne proliferacije? 3. Koja je razlika izme|u signaliziranja hidrofobnim molekulama, kao {to su steroidni hormoni, i signaliziranja hidrofilnim signalnim molekulama, kao {to su peptidni hormoni? 4. Kako aspirin djeluje pri smirivanju upale i sprje~avanju zgru{avanja krvi? 5. Proliferacija tireoidnih stanica potaknuta je hormonima koji aktiviraju receptor povezan s Gs. Kako }e inhibitori cAMP-fosfodiesteraze djelovati na proliferaciju ovih stanica? 6. Receptor za adrenalin povezan je s Gs, dok je receptor za acetilkolin (na stanicama sr~anoga mi{i}a) povezan s Gi. Pretpostavite da trebate napraviti rekombinantnu molekulu koja sadràva izvanstani~ni slijed receptora za adrenalin, spojen s unutarstani~nim slijedom receptora za acetilkolin. Kakav bi u~inak imao adrenalin na razinu cAMP-a u stanicama koje izraàvaju ovakav rekombinantni receptor? Kakav bi bio u~inak acetilkolina? 7. Trombocitni faktor rasta (PDGF) je dimer sastavljen od dvaju polipeptidnih lanaca. Kakav bi bio u~inak monomera molekule PDGF na signaliziranje putem PDGF-receptora? 8. Pretpostavimo da poku{avate zako~iti rast tumorskih stanica u kojima je eksprimirana receptorska tirozin-kinaza, ~ija aktivnost ne ovisi o faktoru rasta (tirozin-kinaza je neprestano aktivna u stanici, ~ak i u odsutnosti vezanja izvanstani~noga faktora rasta). Napravili ste skra}eni oblik receptora, kojemu manjka samo tirozin-kinazna domena, a sadràva sve ostale dijelove receptora. Rezultati va{ih pokusa pokazali su da skra}eni oblik receptora nema aktivnosti, ako se eksprimira u nor malnim stanicama. U tumorskim stanicama, ekspresija skra}enog oblika receptora ima dominantno-negativni u~inak, te u potpunosti zaustavlja diobu tumorskih stanica. Objasnite dobivene rezultate. 9. Objasnite kako pove}ana razina cAMP u stanici moè aktivirati gene. 10. Kako bi prekomjerna ekspresija protein-fosfataze 1 utjecala na indukciju gena koji odgovaraju na cAMP u ciljnim stanicama koje se pobude s pomo}u odgovaraju}ega hormona? Bi li protein-fosfataza 1 utjecala na funkciju ionskih kanala reguliranih cAMP koji su uklju~e, ni u zamje}ivanje mirisa? 11. Koja je prednost za vi{estani~ni organizam da ima stanice koje umiru apoptozom, a ne nekrozom ili akutnom ozljedom? 12. Kakav bi u~inak na stanice imalo injektiranje kompleksa koji u vanjskoj mitohondrijskoj membrani stvara pore, koje su dovoljno velike da propu{taju proteine kroz membrane?
Literatura
Signalne molekule i njihovi receptori
Arai, K., F. Lee, A. Miyajima, S. Miyatake, N. Arai and T. Yokota. 1990. Cytokines: Coordinators of immune and inflammatory responses. Ann. Rev. Biochem. 59: 783836. R Baranano, D. E. and S. H. Snyder. 2001. Neural roles for heme oxygenase: contrasts to nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1099611002. R Burgess, W. H. and T. Maciag. 1989. The heparin-binding (fibroblast) growth factor family of proteins. Ann. Rev. Biochem. 58: 575606. R Carpenter, G. and S. Cohen. 1990. Epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 265: 77097712. R Chawla, A., J. J. Repa, R. M. Evans and D. J. Mangelsdorf. 2001. Nuclear receptors and lipid physiology: opening the X-files. Science 294: 18661870. R Denninger, J. W. and M. A. Marletta. 1999. Guanylate cyclase and the NO/cGMP signaling pathway. Biochim. Biophys. Acta 1411: 334350. R Funk, C. D. 2001. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science 294: 18711875. R Jessell, T. M. and E. R. Kandel. 1993. Synaptic transmission: A bidirectional and self-modifiable form of cell-cell communication. Cell 72/Neuron 10 (Suppl.): 130. R Levi-Montalcini, R. 1987. The nerve growth factor 35 years later. Science 237: 11541162. R Mangelsdorf, D. J., C. Thummel, M. Beato, P . Herrlich, G. Schtz, K. Umesono, B. Blumberg, P Kastner, M. Mark, P Chambon and . . R. M. Evans. 1995. The nuclear receptor superfamily: The second decade. Cell 83: 835839. R Massagu, J. and A. Pandiella. 1993. Membrane-anchored growth factors. Ann. Rev. Biochem. 62: 515541. R Mayer, B. and B. Hemmens. 1997. Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian cells. Trends Biochem. Sci. 22: 477481. R McCarty, D. R. and J. Chory. 2000. Conservation and innovation in plant signaling pathways. Cell 103: 201209. P McDonnell, D. P and J. D. Norris. 2002. Con. nections and regulation of the human estrogen receptor. Science 16421644. P McKenna, N. J. and B. W. OMalley. 2002. Combinatorial control of gene expression by nuclear receptors and coregulators. Cell 108: 465474. P Ross, R., E. W. Raines and D. F. Bowen-Pope. 1986. The biology of platelet-derived growth factor. Cell 46: 155169. P Sheen, J. 2002. Phosphorelay and transcriptional control in cytokinin signal transduction. Science 296: 16501652. P Smalley, W. and R. N. DuBois. 1997. Colorectal cancer and nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Adv. Pharmacol. 39: 120. P Snyder, S. H., S. R. Jaffrey and R. Zakhary. 1998. Nitric oxide and carbon monoxide: Parallel roles as neural messengers. Brain Res. Rev. 26: 167175. P
588
Poglavlje 13
Stamler, J. S., S. Lamas and F. C. Fang. 2001. Nitrosylation: the prototypic redox-based signaling mechanism. Cell 106: 675683. P Thummel, C. S. and J. Chory. 2002. Steroid signaling in plants and insects common themes, different pathways. Genes Dev. 16: 31133129. P
transduction and the control of hematopoietic cell development. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 91128. P Wedel, B. and D. Garbers. 2001. The guanylyl cyclase family at Y2K. Ann. Rev. Physiol. 63: 215233. P
Lohmann, S. M., A. B. Vaandrager, A. Smolenski, U. Walter and H. R. De Jonge. 1997. Distinct and specific functions of cGMPdependent protein kinases. Trends Biochem. Sci. 22: 307312. P Lowy, D. R. and B. M. Willumsen. 1993. Function and regulation of Ras. Ann. Rev. Biochem. 62: 851891. P Manning, G., D. B. Whyte, R. Martinez, T. Hunter and S. Sudarsanam. 2002. The protein kinase complement of the human genome. Science 298: 19121934. P Montminy, M. 1997. Transcriptional regulation by cyclic AMP Ann. Rev. Biochem. 66: . 807823. P Neves, S. R., P T. Ram and R. Iyengar. 2002. G . protein pathways. Science 296: 16361639. P Nishizuka, Y. 1992. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science 258: 607614. P OShea, J. J., M. Gadina and R. D. Schreiber. 2002. Cytokine signaling in 2002: New surprises in the Jak/Stat pathway. Cell 109: S121S131. P Pawson, T. and J. D. Scott. 1997. Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins. Science 278: 20752080. P Ree, S. G. and Y. S. Bae. 1997. Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes. J. Biol. Chem. 272: 504515048. P Scheid, M. P and J. R. Woodgett. 2001. PKB/ . Akt: Functional insights from genetic models. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2: 760768. P Shaywitz, A. J. and M. E. Greenberg. 1999. CREB: A stimulus-induced transcription factor activated by a diverse array of extracellular signals. Ann. Rev. Biochem. 68: 821861. P Soderling, T. R. 1999. The Ca2+-calmodulindependent protein kinase cascade. Trends Biochem. Sci. 24: 232236. P Stryer, L. 1991. Visual excitation and recovery. J. Biol. Chem. 266: 1071110714. P Taylor, C. W. 2002. Controlling calcium entry. Cell 111: 767769. P Toker, A. and A. C. Newton. 2000. Cellular signaling: pivoting around PDK-1. Cell 103: 185188. P Venkatachalam, K., D. B. van Rossum, R. L. Patterson, H.-T. Ma and D. L. Gill. 2002. The cellular and molecular basis of storeoperated calcium entry. Nature Cell. Biol. 4: E263272. P Vojtek, A. B. and C. J. Der. 1998. Increasing complexity of the Ras signaling pathway. J. Biol. Chem. 273: 1992519928. P Yarfitz, S. and J. B. Hurley. 1994. Transduction mechanisms of vertebrate and invertebrate photoreceptors. J. Biol. Chem. 269: 14329 14332. P
Djelovanje stani~nih povr{inskih receptora

Aaronson, D. S. and C. M. Horvath. 2002. A road map for those who dont know JAKSTAT. Science 296: 16531655. P Attisano, L. and J. L. Wrana. 2002. Signal transduction by the TGF- superfamily. Science 296: 16461647. P Blume-Jensen, P and T. Hunter. 2001. Onco. genic kinase signaling. Nature 411: 355365. P Burke, D., D. Wilkes, T. L. Blundell and S. Malcolm. 1998. Fibroblast growth factor receptors: Lessons from the genes. Trends Biochem. Sci. 23: 5962. P Hubbard, S. R., M. Mohammadi and J. Schlessinger. 1998. Autoregulatory mechanisms in protein-tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 273: 1198711990. P Hunter, T. and B. M. Sefton. 1980. Transforming gene product of Rous sarcoma virus phosphorylates tyrosine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 13111315. I Massagu, J., S. W. Blain, and R. S. Lo. 2000. TGF- signaling in growth control, cancer, and heritable disorders. Cell 103: 295309. P Mombaerts, P 1999. Seven-transmembrane . proteins as odorant and chemosensory receptors. Science 286: 707711. P Neves, S. R., P T. Ram and R. Iyengar. 2002. G . protein pathways. Science 296: 16361639. P Rodbell, M. 1980. The role of hormone receptors and GTP-regulatory proteins in membrane transduction. Nature 284: 1722. P Sasaki, T., J. Sasaki-Irie and J. M. Penninger. 2001. New insights into the transmembrane protein tyrosine phosphatase CD45. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 10411046. P Schlessinger, J. 2000. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell 103: 211225. P Schlessinger, J. 2002. Ligand-induced, receptor-mediated dimerization and activation of EGF receptor. Cell 110: 669672. P Singer, A. L. and G. A. Koretsky. 2002. Control of T cell function by positive and negative regulators. Science 296: 16391640. P Thomas, S. M. and J. S. Brugge. 1997. Cellular functions regulated by Src family kinases. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 513609. P Watowich, S. S., H. Wu, M. Socolovsky, U. Klingmuller, S. N. Constantinescu and H. F. Lodish. 1998. Cytokine receptor signal
Putevi unutarstani~noga prijenosa signala

Aaronson, D. S. and C. M. Horvath. 2002. A road map for those who dont know JAKSTAT. Science 296: 16531655. P Brivanlou, A. H. and J. E. Darnell Jr. 2002. Signal transduction and the control of gene expression. Science 295: 813818. P Cantley, L. C. 2002. The phosphoinositide 3kinase pathway. Science 296: 16551657. P Chang, L. and M. Karin. 2001. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature 410: 3740. P Clapham, D. E. 1995. Calcium signaling. Cell 80: 259268. P Cohen, P T. W. 1997. Novel protein serine/ . threonine phosphatases: Variety is the spice of life. Trends Biochem. Sci. 22: 245251. P Corcoran, E. E. and A. R. Means. 2001. Defining Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase cascades in transcriptional regulation. J. Biol. Chem. 276: 29752978. P Darnell, J. E. Jr. 1997. STATs and gene regulation. Science 277: 16301635. P Datta, S. R., A. Brunet and M. E. Greenberg. 1999. Cellular survival: A play in three Akts. Genes Dev. 13: 2902927. P Davis, R. J. 2000. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases. Cell 103: 239252. P Dhillon, A. S. and W. Kolch. 2002. Untying the regulation of the Raf-1 kinase. Arch. Biochem. Biophys. 404: 39. P Divecha, N. and R. F. Irvine. 1995. Phospholipid signaling. Cell 80: 269278. P Hill, C. S. and R. Treisman. 1995. Transcriptional regulation by extracellular signals: Mechanisms and specificity. Cell 80: 199211. P Houslay, M. D. and G. Milligan. 1997. Tailoring cAMP-signalling responses through isoform multiplicity. Trends Biochem. Sci. 22: 217224. P Hunter, T. 1995. Protein kinases and phosphatases: The yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell 80: 225236. P Hurley, J. H. 1999. Structure, mechanism, and regulation of mammalian adenylyl cyclase. J. Biol. Chem. 274: 75997602. P Johnson, G. L. and R. Lapadat. 2002. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science 298: 19111912. P
589
Prijenos signala i citoskelet

Giancotti, F G. and E. Ruoslahti. 1999. Integrin signaling. Science 285: 10281032. P Etienne-Manneville, S. and A. Hall. 2002. Rho GTPases in cell biology. Nature 420: 629635. P Hynes, R. O. 2002. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 110: 673687. P Miranti, C. K. and J. S. Brugge. 2002. Sensing the environment: a historical perspective on integrin signal transduction. Nature Cell Biol. 4: E83E90. P Nobles, C. D. and A. Hall. 1995. Rho, Rac, and Cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell 81: 5362. I Ridley, A. J. 2001. Rho family proteins: coordinating cellular responses. Trends Cell Biol. 11: 47147. RP Schwartz, M. A. and M. H. Ginsberg. 2002. Networks and crosstalk: integrin signalling spreads. Nature Cell Biol. 4: E65E68. P
Ingham, P W. 2001. Hedgehog signaling: a tale . of two lipids. Science 294: 18791881. P Kalderon, D. 2002. Similarities between the Hedgehog and Wnt signaling pathways. Trends Cell Biol. 12: 523531. P Moon, R. T., B. Bowerman, M. Boutros and N. Perrimon. 2002. The promise and perils of Wnt signaling through -catenin. Science 296: 16441646. P Simon, M. A. 2000. Receptor tyrosine kinases: specific outcomes from general signals. Cell 103: 1315. P Sternberg, P W. and M. Han. 1998. Genetics of . RAS signaling in C. elegans. Trends Genet. 14: 466472. P Taipale, J. and P A. Beachy. 2001. The Hedge. hog and Wnt signaling pathways in cancer. Nature 411: 349354. P Thomas, B. J. and D. A. Wassarman. 1999. A flys eye view of biology. Trends Genet. 15: 184190. P Wang, M. and P W. Sternberg. 2001. Pattern . formation during C. elegans vulval induction. Curr. Top. Dev. Biol. 51: 189220. P Wodarz, A. and R. Nusse. 1998. Mechanisms of Wnt signaling in development. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 5988. P Zipursky, S. L. and G. M. Rubin. 1994. Determination of neuronal cell fate: Lessons from the R7 neuron of Drosophila. Ann. Rev. Neurosci. 17: 373397. P
Ashkenazi, A. and V. M. Dixit. 1998. Death receptors: Signaling and modulation. Science 281: 13051308. P Brunet, A., S. R. Datta and M. E. Greenberg. 2001. Transcription-dependent and -independent control of neuronal survival by the PI3K-Akt pathway. Curr. Opin. Neurobiol. 11: 297305. P Chen, G. and D. V. Goeddel. 2002. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science 296: 16341635. P Datta, S. R., A. Brunet and M. E. Greenberg. 1999. Cellular survival: A play in three Akts. Genes Dev. 13: 2902927. P Frame, S. and P Cohen. 2001. GSK3 takes . centre stage more than 20 years after its discovery. Biochem. J. 359: 116. P Gross, A., J. M. McDonnell and S. J. Korsmeyer. 1999. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 13: 18991911. P Hengartner, M. O. 2000. The biochemistry of apoptosis. Nature 407: 770776. P Jacobson, M. D., M. Weil and M. C. Raff. 1997. Programmed cell death in animal development. Cell 88: 347354. P Martin, S. J. 2002. Destabilizing influences in apoptosis: sowing the seeds of IAP destruction. Cell 109: 793796. P Nagata, S. 1997. Apoptosis by death factor. Cell 88: 355365. P Shi, Y. 2002. Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol. Cell 9: 459470. P Vaux, D. L. and S. J. Korsmeyer. 1999. Cell death in development. Cell 96: 245254. P Wajant, H. 2002. The Fas signaling pathway: more than a paradigm. Science 296: 1635 1636. P Wang, X. 2001. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15: 2922 2933. P
Signaliziranje u razvoju i diferencijaciji

Allman, D., J. A. Punt, D. J. Izon, J. C. Aster and W. S. Pear. 2002. An invitation to T and more: Notch signaling in lymphopoiesis. Cell 109: S1S11. P Artavanis-Tsakonas, S., M. D. Rand and R. J. Lake. 1999. Notch signaling: Cell fate control and signal integration in development. Science 284: 770776. P Bray, S. and M. Furriois. 2001. Notch pathway: making sense of suppressor of hairless. Curr. Biol. 11: R217R221. P Dickson, B. 1995. Nuclear factors in Sevenless signalling. Trends Genet. 11: 106111. P
Regulacija programirane stani~ne smrti

Adams, J. M. and S. Cory. 2001. Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family. Trends Biochem. Sci. 26: 6166. P Adrain, C. and S. J. Martin. 2001. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas. Trends Biochem. Sci. 26: 390397. P
Poglavlje
14
Stani~ni ciklus
Eukariotski stani~ni ciklus 591 Regulatori napredovanja kroz stani~ni ciklus 599 Doga|aji u M-fazi 608 Mejoza i oplodnja 615 Mati~ne stanice i odràvanje zreloga tkiva 621
MPF-A 600
KLJU^NI POKUS: Kultura
zametnih mati~nih stanica 622
a time i svih ìvih organizama. Sve se stanice razmnoàvaju tako da se podijele na dvije, pa od svake roditeljske stanice nastaju dvije stanice-k}eri po zavr{etku svakoga ciklusa stani~ne diobe. Novonastale stanice-k}eri dalje same rastu i dijele se, te omogu}uju nastajanje mno{tva stanica, a sve proizlaze od jedne roditeljske stanice. Najjednostavniji je primjer bakterija, koja na principu stani~noga rasta i diobe stvara koloniju sastavljenu od milijuna stanica potomstva tijekom samo jedne no}i, ako je na hranjivoj podlozi. Mnogo sloèniji primjer doga|a se kod oplo|ene jajne stanice koja ponavljanjem ciklusa stani~noga rasta i diobe dovodi do stvaranja vi{e od 1013 stanica koje ~ine ljudsko tijelo. Dioba svake stanice mora biti pomno regulirana i koordinirana sa stani~nim rastom i replikacijom DNA da bi se osiguralo nastajanje stanica potomaka, koje sadràvaju neo{te}ene genome. Kod eukariotske stanice, tijek stani~noga ciklusa kontrolira niz protein-kinaza koje su sastavni dio stanice od kvasaca do sisavaca. Kod vi{ih eukariota, stani~ni ciklus reguliraju faktori rasta odgovorni za stani~nu proliferaciju tako da dioba pojedine stanice bude u skladu s potrebama organizma u cjelini. Me|utim, pogrje{ke u regulaciji stani~noga ciklusa vrlo su ~este i uzrok su abnormalnoj proliferaciji u stanice raka pa su studije o stani~nom ciklusu i raku postale me|usobno usko povezane, sli~no kao pri prou~avanju odnosa nastanka tumora i stani~nih signalnih puteva koje smo objasnili u 13. poglavlju.
AMOREPRODUKCIJA JE BITNA I JEDINSTVENA OSOBINA STANICE,
Stani~ni ciklus eukariotske stanice

Diobeni ciklus ve}ine stanica sastoji se od ~etiriju me|usobno povezanih procesa: stani~noga rasta, replikacije DNA, raspodjele udvostru~enih kromosoma stanicama-k}erima i podjele stanica. Kod bakterija, stani~ni rast i replikacija DNA odvijaju se tijekom ve}eg dijela stani~noga ciklusa, a duplicirani kromosomi raspore|uju se u stanice-k}eri povezani sa stani~nom membranom. Me|utim, kod eukariota, stani~ni je ciklus sloèniji i sastoji se od ~etiriju zasebnih faza. Premda je stani~ni rast obi~no neprekidan proces, DNA se sintetizira tijekom samo jedne faze stani~noga ciklusa, a replicirani se kromosomi tada smje{taju u jezgre stanica-k}eri serijom sloènih procesa koji prethode diobi stanice. Napredovanje
592
Poglavlje 14
kroz faze stani~noga ciklusa kontroliraju regulatorni mehanizmi koji koordiniraju razli~ite doga|aje u stani~nom ciklusu, ali tako|er povezuju stani~ni ciklus s izvanstani~nim signalima koji kontroliraju stani~nu proliferaciju.
Faze stani~noga ciklusa

Tipi~an eukariotski stani~ni ciklus koji se odvija pribli`no svaka 24 sata moèmo pratiti na kulturi ljudskih stanica. Kao {to se moè vidjeti pod mikroskopom, stani~ni ciklus ~ine dva osnovna dijela: mitoza i interfaza. Mitoza (dioba stani~ne jezgre) je najdramati~nije razdoblje stani~noga ciklusa u kojem se zbiva odvajanje kromosoma stanica-k}eri i obi~no zavr{ava diobom stanice (citokineza). Me|utim, mitoza i citokineza traju samo oko jedan sat, a preostalo vrijeme, oko 95% stani~noga ciklusa zauzima interfaza razdoblje izme|u dviju mitoza. Tijekom interfaze kromosomi su dekondenzirani i raspore|eni po cijeloj jezgri, tako da ona morfolo{ki izgleda jednoli~no. Na molekularnoj razini interfaza je razdoblje u kojem se odvijaju i stani~ni rast i replikacija DNA kako bi se stanica pripremila za diobu. Tijekom cijele interfaze stanica postupno i pravilno raste te udvostru~uje svoju veli~inu, a DNA se sintetizira samo u jednom dijelu interfaze. [tovi{e, sinteza DNA dijeli ciklus eukariotske stanice u ~etiri zasebne faze (slika 14-1). M-faza ciklusa odgovara mitozi, nakon koje u pravilu slijedi citokineza. Zatim slijedi G1-faza, koja predstavlja interval izme|u mitoze i po~etka replikacije DNA. Tijekom G1-faze stanica je metaboli~ki aktivna i neprestano raste, ali bez replikacije DNA. Na fazu G1 nadovezuje se S-faza (sinteza) u kojoj se odvija replikacija DNA. Dovr{enjem sinteze DNA zapo~inje G2faza u kojoj se nastavlja stani~ni rast i sinteza proteina potrebnih za pripremu mitoze. Trajanje faza stani~noga ciklusa znatno se razlikuje u razli~itih vrsta stanica. Za tipi~nu ljudsku stanicu koja se razmnoàva u vremenskom ciklusu od 24 sata, G1-faza traje oko 11 sati, S-faza oko 8 sati, G2-faza oko 4 sata i M-faza oko 1 sat. Neke druge vrste stanica dijele se mnogo brè. Na primjer, stanice pupaju}eg kvasca prolaze kroz sve ~etiri faze stani~noga ciklusa za oko 90 minuta. âk i kra}e trajanje stani~noga ciklusa (30 minuta i manje), koje se doga|a odmah po oplodnji jajne stanice, uo~eno je kod ranih embrionalnih stanica (slika 14-2). No u ovom slu~aju stani~ni rast izostaje, a stani~ni ciklus po~etnih embrionalnih stanica o~ituje se u vrlo brzoj razdiobi citoplazme jajne stanice u manje novonastale stanice. Faze G1 i G2 izostaju, a replikacija DNA se doga|a vrlo brzo te se na taj na~in vrlo kratka S-faza izmjenjuje s M-fazom. Za razliku od brze proliferacije embrionalnih stanica, neke stanice ìvotinja u odrasloj dobi sasvim prestaju s diobom (npr. ìv~ane stanice), a neke druge G1 stanice dijele se samo povremeno, kad se za to ukaè potreba, kako bi se nadomjestile one stanice koje su izgubljene zbog ozljede ili stani~ne smrti. U ovaj tip stanica ubrajamo ko`ne fibroblaste, kao i stanice nekih unutra{njih organa, kao {to je jetra. Dalje u tekstu objasnit }emo da ove stanice izlaze iz G1-faze i ulaze u fazu mirovanja nazvanu G0, u kojoj ostaju metaboli~ki aktivne, ali nema proliferacije sve dok ih na to ne potaknu odgovaraju}i izvanstani~ni signali.
Slika 14-1. Faze stani~noga ciklusa.

Diobeni ciklus kod ve}ine eukariotskih stanica moè se podijeliti u 4 zasebne faze: M, G1, S i G2-faza. Nakon M-faze (mitoza) slijedi citokineza. Tijekom Sfaze doga|a se replikacija DNA. Stanica raste tijekom interfaze koja uklju~uje G1, S i G2-fazu. Trajanje faza stani~noga ciklusa koji smo ovdje prikazali je tipi~no za stanice sisavaca koje se brzo dijele.
M G2
me|ufaza
Stani~ni ciklus
593
Slika 14-2. Stani~ni ciklus embrionalne stanice.

Kod stani~noga ciklusa ranog embrija citoplazma jaja vrlo se brzo dijeli u manje stanice. Tijekom ovih ciklusa stanice ne rastu, G1 i G2-faza nedostaju te se stani~ni ciklus sastoji od kratkih Sfaza koje se izmjenjuju s M-fazama.
M M M
Analiza stani~noga ciklusa zahtijeva identifikaciju stanica u razli~itim fazama koje smo prije objasnili. Premda se stanice za vrijeme mitoze mogu raspoznati pod mikroskopom, za raspoznavanje ostalih faza stani~noga ciklusa sluìmo se biokemijskim parametrima. Stanice u S-fazi mogu se lako raspoznati s radioaktivno obiljeènim timidinom koji se koristi samo za sintezu DNA (slika 14-3). Na primjer, kulturu ljudskih stanica koje se brzo razmnoàvaju, izloì se djelovanju radioaktivnoga timidina kratko vrijeme (npr. 15 minuta) i nakon autoradiografske analize nalazimo tre}inu stanica radioaktivno ozna~enih, {to odgovara frakciji stanica u S-fazi. Varijante ovakvih pokusa mogu se primijeniti i kod odre|ivanja duljine trajanja razli~itih stadija stani~noga ciklusa. Tako npr., uzmimo u razmatranje pokus u kome su stanice izloène djelovanju radioaktivnoga timidina u trajanju od 15 minuta, nakon ~ega se iste stanice nadalje razli~ito dugo kultiviraju prije autoradiografije. Radioaktivno ozna~ene interfazne stanice koje su bile u S-fazi tijekom izlaganja djelovanju radioaktivnoga timidina bit }e vidljive nekoliko sljede}ih sati dok budu napredovale kroz ostatak Sfaze i G2-fazu. S druge strane, radioaktivno ozna~ene mitoti~ke stanice vidjet }e se tek nakon 4 sata od ozna~ivanja. Ovo razdoblje od 4 sata odgovara trajanju G2-faze to je minimalno vrijeme potrebno stanici da veè radioaktivni timidin pri kraju S-faze i u|e u mitozu. Stanice u razli~itim stadijima stani~noga ciklusa mogu se raspoznati s pomo}u njihova sadràja DNA (slika 14-4). Na primjer, ìvotinjske su stanice
Slika 14-3. Identifikacija stanice u S-fazi inkorporacijom radioaktivnoga timidina.

Stanice se izlaù djelovanju radioaktivnoga timidina i analiziraju autoradiografijom. Obiljeène stanice ozna~ene su strjelicama. (iz D. W. Stacey et al.,1991.Mol.Cell Biol.11:4053.)
594
Poglavlje 14
G1
G2 + M
u G1-fazi diploidne (sadràvaju dvije kopije svakog kromosoma) pa se sadràj njihove DNA ozna~uje kao 2n (gdje n ozna~uje haploidni sadràj DNA genoma). Za vrijeme S-faze procesom replikacije pove}ava se sadràj DNA od 2n na 4n, tako da stanice u S-fazi imaju konstelaciju DNA izme|u 2n i 4n. Nadalje, sadràj DNA ostaje na razini 4n u stanicama koje ulaze u G2fazu i M-fazu, da bi se nakon citokineze smanjio na 2n. Eksperimentalno se stani~na konstelacija DNA moè prikazati inkubacijom stanica s fluorescentnom bojom koja ima afinitet vezanja za DNA, a potom se jakost fluorescencije pojedine stanice analizira proto~nim citometrom te na taj na~in razvrstava stanice koje se nalaze u G1, S i G2/M-fazi stani~noga ciklusa.
broj stanica
Djelovanje stani~noga rasta i izvanstani~nih signala na regulaciju stani~noga ciklusa

Napredovanje stanice kroz diobeni ciklus reguliraju izvanstani~ni signali iz okruènja kao i unutarnji signali koji prate i koordiniraju brojne procese koji se odvijaju tijekom razli~itih faza stani~noga ciklusa. Primjer utjecaja izvanstani~nih signala na regulaciju stani~noga ciklusa vidljiv je u djelovanju faktora rasta kod proliferacije ìvotinjske stanice. Razli~iti stani~ni procesi, kao {to je stani~ni rast, replikacija DNA i mitoza, moraju biti koordinirani tijekom stani~noga ciklusa. Za to je potreban niz kontrolnih to~aka koje reguliraju napredovanje kroz razli~ite faze stani~noga ciklusa. Glavna regulatorna to~ka stani~noga ciklusa, u mnogih vrsta stanica, nalazi se pri kraju G1-faze i kontrolira napredovanje iz G1 u S-fazu. Ova regulatorna to~ka prvi je put prepoznana u ispitivanjima kvasca Saccharomyces cerevisiae, gdje se spominje kao START (slika 14-5). Kad jednom stanica prije|e START, definitivno ulazi u S-fazu i prolazi jedan stani~ni diobeni ciklus. Me|utim, prolazak kroz START je visoko reguliran doga|aj u stani~nom ciklusu kvasca, koji se kontrolira vanjskim signalima, kao {to je dostupnost hranjivim tvarima, ali i veli~inom stanice. Na primjer, ako kvascu nedostaju hranjive tvari, stani~ni se ciklus zaustavlja na START i ulazi u fazu mirovanja umjesto napredovanja prema S-fazi. Tako START predstavlja odlu~uju}u to~ku u kojoj stanica utvr|uje ima li dovoljno hranjivih tvari za napredovanje kroz ostatak diobenoga ciklusa. Polipeptidni faktori koji signaliziraju sparivanje kva{~evih stanica, tako|er mogu zaustaviti stani~ni ciklus na START, {to omogu}uje haploidnim stanicama da se stope, umjesto da prije|u u S-fazu. Osim {to je odlu~uju}a to~ka za motrenje izvanstani~nih signala, START je to~ka na kojoj se koordinira stani~ni rast s replikacijom DNA i diobom stanice. Va`nost ove regulacije posebno je zna~ajna kod pupanja kvasca gdje stani~nom diobom nastaju stanice potomci koje su razli~ite po veli~ini: velika stanica-majka i mala stanica-k}i. Kako bi stanice kvasca zadràle konstantnu veli~inu mala stanica-k}i mora rasti brè od velike stanice-majke prije ponovne diobe. Pra}enjem veli~ine stanice uskla|uje se stani~ni rast s ostalim doga|ajima stani~noga ciklusa. Ovu regulaciju obavlja kontrolni mehanizam kojim se od svake stanice zahtijeva da dostigne minimum veli~ine prije nego prije|e START. Zbog toga, male stanice-k}eri provedu dulje vrijeme u G1-fazi i rastu brè od stanice-majke. Proliferacija ve}ine ìvotinjskih stanica u G1-fazi stani~noga ciklusa odvija se sli~no. Tako se odlu~uju}a to~ka pri kraju G1-faze, kod ìvotinjskih stanica nazvana restrikcijskom to~kom (engl. restriction point) pona{a jednako kao START kod kvasca (slika 14-6). No, kod ìvotinjskih stanica, prolazak kroz stani~ni ciklus kontroliraju poglavito izvanstani~ni faktori rasta koji signaliziraju stani~nu proliferaciju, dok su kod kvasca to hranjive tvari. Prikladni faktori rasta omogu}uju stanici prjelazak restrikcijske to~ke i ulazak
2n 4n koli~ina sadràja DNA po stanici
Slika 14-4. Odre|ivanje stani~noga DNA sadràja.

Populacija stanica ozna~uje se fluorescentnom bojom koja se veè na DNA. Stanice zatim prolaze kroz proto~ni citometar, koji mjeri jakost fluorescencije svake stanice. Podatci su prikazani u odnosu broja stanica prema jakosti fluorescencije, a ona je proporcionalna sadràju DNA. Na grafikonu smo dobili krivulju sa dva vrha koji odgovaraju stanicama sa sadràjem DNA 2n, ili 4n, ovisno o tome da li su u G1 ili G2/Mfazama stani~noga ciklusa. Stanice u S-fazi imaju sadràj DNA izme|u 2n i 4n i na grafikonu su raspodijeljene izme|u dva vrha krivulje.
Stani~ni ciklus
595
(A)
stanica-k}i (B) stanica-majka hranjive tvari M G1 start G2 S veli~ina stanice faktori parenja
1 mm
(A) Stani~ni ciklus kvasca Saccharomyces cerevisiae poglavito je reguliran u to~ki pri kraju G1-faze, nazvanoj START. Prolazak kroz to~ku START kontrolira dostupnost hranjivih tvari, faktori sparivanja (engl. mating factors) i veli~ina stanice. Treba napomenuti da se ove kva{~eve stanice dijele pupanjem. Pupoljci se formiraju odmah nakon prolaska kroz START, te nastavljaju rasti sve dok se ne odvoje od stanice-majke nakon mitoze. Nastala stanica-k}i je manja od stanice-majke te joj je potrebno dulje vrijeme rasta u G1-fazi sljede}ega stani~noga ciklusa. Iako se faze G1 i S odvijaju normalno, diobeno vreteno zapo~inje se oblikovati tijekom S-faze, tako da stani~nom ciklusu kvasca nedostaje G2-faza. (B) Mikrofotografija S. cerevisiae dobivena pretra`nim elektronskim mikroskopom. Veli~ina pupoljka odraàva poziciju stanice u stani~nomu ciklusu. (B, David M. Phillips/Visuals Unlimited.)
Slika 14-5. Regulacija stani~noga ciklusa kvasca Saccharomyces cerevisiae.
u S-fazu. Kad jednom stanica prije|e restrikcijsku to~ku, ulazi u S-fazu i napreduje do kraja stani~noga ciklusa, ~ak i onda ako ne postoji daljnja stimulacija faktorima rasta. S druge strane, ako prikladni faktori rasta nisu prisutni u G1-fazi proces kroz stani~ni ciklus se zaustavlja na restrikcijskoj to~ki. Takve stanice ulaze u fazu mirovanja, nazvanu G0, gdje mogu ostati dulje vrijeme bez proliferacije. Stanice u G0-fazi metaboli~ki su aktivne, iako im je zaustavljen rast i smanjena sinteza proteina. Kako je ve} re~eno, mnoge ìvotinjske stanice ostaju u G0-fazi sve do trenutka pojave prikladnog faktora rasta ili nekih drugih izvanstani~nih signala koji ih potaknu na proliferaciju. Na primjer, ko`ni fibroblasti ostaju u G0-fazi tako dugo dok ih izvanstani~ni signal ne potakne na diobu kako bi popravili {tetu nastalu zbog ozljede. Proliferaciju ovih stanica poti~e trombocitni faktor rasta (PDGF, engl. platelet-derived growth factor), koji se osloba|a za vrijeme zgru{avanja krvi te signalizira proliferaciju fibroblasta u okolini ozlije|enog tkiva. Kod ve}ine stanica regulacija proliferacije uglavnom se doga|a u G1fazi, no kod nekih se to doga|a u G2-fazi. Primjer je za to stani~ni ciklus fisijskoga kvasca Schizosaccharomyces pombe (slika 14-7). Za razliku od Saccharomyces cerevisiae, regulaciju stani~noga ciklusa primarno obavlja kontrola prjelaska iz G2 u M-fazu i to je glavna to~ka na kojoj se provjerava veli~ina stanice i dostupnost hranjivih tvari. Najbolji primjer kontrole stani~noga ciklusa u G2-fazi kod ìvotinja jesu oocite. Oocite kralje`njaka mogu dugo vremena (nekoliko desetlje}a kod ljudi) ostati zaustavljene u G2-fazi, sve dok ih na napredovanje u M-fazu ne potakne hormonska stimulacija. Iz-
G2
G1 S
G0-faza
restrikcijska to~ka
faktori rasta
Slika 14-6. Regulacija stani~noga ciklusa ìvotinjske stanice faktorima rasta.

Dostupnost faktora rasta kontrolira stani~ni ciklus ìvotinjske stanice u to~ki pred kraj G1-faze koja se naziva restrikcijskom to~kom. Ako faktor rasta nije prisutan tijekom G1-faze, stanica ulazi u stanje mirovanja stani~noga ciklusa, nazvano G0-faza.
596
(A)
Poglavlje 14
(B) M G1 G2
5 mm
Slika 14-7. Stani~ni ciklus kidaju}ega kvasca.

A) Kvasac raste produùju}i se jednako s obiju strana i dijeli se tako da oblikuje stijenku po sredini stanice. Za razliku od stani~noga ciklusa kod pupaju}eg kvasca, stani~ni ciklus kidaju}ega kvasca prolazi kroz nor malne faze G1, S, G2 i M. Treba naglasiti da se citokineza odvija u G1-fazi. Duljina stanice upu}uje na njezinu poziciju u stani~nome ciklusu. B) Svjetlosna mikrografija prikaz pokazuje uzastopne faze mitoze i citokinezu u Schizosaccharomyces pombe. (B, dopu{tenjem C. F. Robinow, University of Western Ontario).
vanstani~ni signali tako kontroliraju stani~nu proliferaciju regulacijom napredovanja od G2 do M-faze, kao i od G1 do S-faze stani~noga ciklusa.
Kontrolne to~ke stani~noga ciklusa

Kontrolne to~ke, obja{njene u prethodnom odlomku, reguliraju napredovanje kroz stani~ni ciklus u odnosu na veli~inu stanice i izvanstani~ne signale, kao {to su hranjive tvari i faktori rasta. Nadalje, u razli~itim fazama stani~noga ciklusa, doga|aji se moraju koordinirati jedan s drugim na na~in da se pojavljuju po to~no odre|enom redu. Na primjer, vrlo je va`no da stanica ne zapo~ne mitozu dok replikacija genoma ne bude dovr{ena. U suprotnom, dogodila bi se katastrofalna dioba stanice pri ~emu stanice-k}eri ne bi naslijedile kompletne kopije genskoga materijala. Kod ve}ine stanica je koordinacija izme|u razli~itih faza stani~noga ciklusa ovisna o nizu kontrolnih to~aka stani~noga ciklusa koje ne dopu{taju ulazak u sljede}u fazu ciklusa ako nisu izvr{ene sve radnje iz prethodne faze. Neke kontrolne to~ke stani~noga ciklusa osiguravaju replikaciju samo potpunih i neo{te}enih kromosoma i njihovu predaju stanicama-k}erima (slika 14-8). Ove kontrolne to~ke otkrivaju nereplicirane ili o{te}ene DNA i koordiniraju daljnje napredovanje kroz stani~ni ciklus dovr{enjem replikacije DNA ili njenim popravkom. Na primjer, kontrolna to~ka u G2-fazi ne dopu{ta po~etak mitoze dok se ne obavi replikacija DNA. Ona otkriva nereplicirane dijelove DNA i signalizira mirovanje stani~noga ciklusa. Na taj na~in sprje~ava po~etak M-faze dok se ne zavr{i S-faza, pa stanice ostaju u G2-fazi tako dugo dok se genom potpuno ne replicira. Jedino tada stanica moè zapo~eti mitozu i potpuno replicirane kromosome predati stanicama -k}erima. Osim toga, kontrolna to~ka G2-faze tako|er otkriva o{te}enja DNA molekule nastala zbog zra~enja. Ako je otkriveno o{te}enje DNA, zaustavlja se ciklus na kontrolnoj to~ki i popravlja nastalo o{te}enje, kako se ono ne bi prenijelo na stanice-k}eri.
nereplicirana ili o{te}ena DNA G2
STOP
STOP
nepravilno poredani kromosomi
G1
Slika 14-8. Kontrolne to~ke u stani~nome ciklusu.

S
STOP STOP
o{te}ena DNA
o{te}ena DNA
Odre|ene kontrolne to~ke u stani~nome ciklusu osiguravaju da samo kompletni genomi prelaze u stanice-k}eri. Jedna va`na kontrolna to~ka zaustavlja stani~ni ciklus u fazi G2, kao odgovor na o{te}enu ili nerepliciranu DNA. Zbog o{te}enja DNA tako|er dolazi do zaustavljanja stani~noga ciklusa u kontrolnoj to~ki u G1 i S-fazi. Kontrolna to~ka u M-fazi zaustavlja mitozu u slu~aju kada kromosomi-k}eri nisu pravilno poredani na diobenom vretenu.
Stani~ni ciklus
597
o{te}ena ili nereplicirana DNA
Slika 14-9. Zastoj stani~noga ciklusa na kontrolnim to~kama u G1, S i G2-fazi.
senzorni proteini
Kompleks senzorskih proteina veè se za o{te}enu ili nerepliciranu DNA i aktivira ATM i ATR protein-kinaze. ATM zatim fosforilira i aktivira Chk2 proteinkinazu, a ATR Chk1 protein-kinazu, {to dovodi do zaustavljanja stani~noga ciklusa.
ATR
ATM
ADP P Chk2 Chk1
ADP P
zaustavljanje stani~noga ciklusa
O{te}enja DNA ne zaustavljaju stani~ni ciklus samo u G2-fazi, ve} i na kontrolnim to~kama u G1 i S-fazi. Na kontrolnoj to~ki u G1-fazi moè se popraviti o{te}enje prije ulaska u S-fazu u kojoj bi se dogodila replikacija o{te}ene DNA. Kontrolna to~ka S-faze omogu}uje neprekidno motrenje integriteta DNA kako bi o{te}enje bilo otklonjeno prije replikacije. Na taj na~in, kontrolna to~ka S-faze omogu}uje kvalitetnu kontrolu i popravak bilo kakve pogrje{ke koja se moè dogoditi tijekom replikacije DNA, kao {to je ugradnja pogrje{nih baza ili nepotpuna replikacija segmenata DNA. Zaustavljanje ciklusa na kontrolnim to~kama u G1, S i G2-fazama poti~u proteinski kompleksi koji se veù za o{te}ene ili nereplicirane DNA (slika 14-9). Ti proteini (koji jo{ nisu sasvim prou~eni) djeluju kao senzori za DNA o{te}enja i zatim pokre}u signalne puteve koji vode ne samo ka zaustavljanju stani~noga ciklusa, ve} i aktivaciji popravka DNA, a ponekad i do stani~ne smrti. Proteini senzori djeluju na dvije srodne protein-kinaze, ozna~ene kao ATM i ATR koje se aktiviraju zbog o{te}enja DNA. Ovi su proteini zarana identificirani, jer mutacije u genu za ATM dovode do bolesti ataxia telangiectasia, koja uzrokuje pogrje{ke u ìv~anomu i imunolo{komu sustavu, kao i ~estu pojavu tumora kod takvih bolesnika. Zatim je otkriven ATR koji je bliski srodnik ATM. Kad se jednom aktiviraju, ATM fosforilira i aktivira protein-kinazu Chk2, a ATR protein-kinazu Chk1. Chk1 i Chk2 sada fosforiliraju sastavne dijelove regulatornog aparata stani~noga ciklusa kako bi zaustavile napredovanje stani~noga ciklusa, o ~emu }emo govoriti u nastavku ovoga poglavlja. U stanicama sisavaca, zaustavljanje na kontrolnoj to~ki u G1-fazi postiè se djelovanjem jednoga dodatnog proteina, p53, kojeg fosforilira ATM, no tako|er i Chk2 (slika 14-10). Fosforilacija stabilizira p53, koji se ina~e brzo
598
Poglavlje 14
Slika 14-10. Uloga p53 u zaustavljanju stani~noga ciklusa u G1-fazi.

o{te}enje DNA
Protein p53 ima klju~nu ulogu u zaustavljanju stani~noga ciklusa u kontrolnoj to~ki faze G1. ATM i Chk2 fosforilacijom stabiliziraju p53 dovode}i do brzog povi{enja razine p53 kao odgovor na o{te}enje DNA. Protein p53 zatim poti~e ekspresiju gena {to dovodi do zaustavljanja stani~noga ciklusa.
P ATM Chk2
P razina povi{enja p53 p53
STOP
G1 zastoj u G1-fazi M G2 S
razgra|uje, {to rezultira brzim podizanjem razine p53 u slu~aju o{te}enja DNA. Protein p53 je transkripcijski faktor i njegova povi{ena ekspresija dovodi do indukcije ciljnih gena koji zaustavljaju stani~ni ciklus. Zanimljivo je da je gen za p53 ~esto mutiran u tumorima. Gubitak funkcije p53, kao posljedice ovih mutacija, sprje~ava zastoj u G1-fazi koji nastpa kao odgovor na o{te}enje DNA, tako da se o{te}ena DNA replicira i predaje stanicamak}erima bez prethodnog popravka. Naslje|ivanjem o{te}ene DNA pove}ava se broj mutacija i op}a nestabilnost stani~noga genoma, a sve to pridonosi razvoju tumora. Mutacije gena p53 jesu naj~e{}e genske promjene pri pojavi raka u ljudi (vidi 15. poglavlje) i pokazuju izuzetnu va`nost regulacije stani~noga ciklusa u ìvotu vi{estani~nih organizama. Postoji jo{ jedna kontrolna to~ka stani~noga ciklusa koja nadzire cjelovitost genoma, a smje{tena je pri kraju mitoze (slika 14-8). U toj kontrolnoj to~ki, nazvanoj kontrolna to~ka diobenog vretena, nadgleda se raspore|ivanje kromosoma u diobenom vretenu osiguravaju}i precizan i ispravan raspored kromosoma u stanice-k}eri. Na primjer, ako se jedan ili vi{e kromosoma ne rasporedi ispravno u diobenom vretenu, mitoza se zaustavlja u metafazi i ne dolazi do odvajanja novo repliciranih kromosoma u jezgre-k}eri. Rezultat kontrolne to~ke diobenog vretena je da se kromosomi ne odvajaju sve dok kompletni setovi kromosoma nisu posloèni za podjelu stanicamak}erima.
Ograni~avanje na samo jednu replikaciju DNA tijekom stani~noga ciklusa

Kontrolna to~ka u G2-fazi ne dopu{ta po~etak mitoze ako prije toga nije dovr{ena S-faza i na taj na~in ne dopu{ta distribuciju nepotpuno replicirane DNA u stanice-k}eri. Jednako je va`no da se genom replicira samo jednom u okviru jednoga stani~nog ciklusa. Dakle, kad se jednom segment DNA replicira u S-fazi, mora postojati kontrolni mehanizam koji bi sprije~io ponovnu replikaciju DNA za vrijeme dok stanica ne zavr{i svoj ciklus i pro|e kroz mitozu. Kao {to je obja{njeno u 5. poglavlju, stanice sisavaca koriste na tisu}e ishodi{ta replikacije za vrijeme udvostru~avanja DNA, pa po~etak replikacije na svakom od tih ishodi{ta mora biti pa`ljivo kontroliran kako bi se svaki pojedini segment genoma udvostru~io samo jednom za vrijeme S-faze svakog stani~nog ciklusa. Molekularni mehanizam koji ograni~ava na samo jednu replikaciju DNA tijekom stani~noga ciklusa uklju~uje djelovanje porodice proteina (nazvanih MCM proteini) koji se veù za ishodi{te replikacije zajedno s proteinima kompleksa ishodi{ta replikacije (ORC, engl. origin replication complex) (vidi sliku 5-16). MCM proteini djeluju kao faktori dopu{tenja (engl. licensing factors) koji dopu{taju po~etak replikacije (slika 14-11). Njihovo veSlika 14-11 Ograni~avanje replikacije DNA.
G2
ORC
G1 MCM ORC
MCM
MCM
Replikacija DNA ograni~ena je na samo jednu u jednom stani~nom ciklusu, a to se postiè proteinima MCM koji se veù za ishodi{te replikacije zajedno s proteinima ORC (kompleks replikacijskog ishodi{ta) i potrebni su za pokretanje replikacije DNA. Proteini MCM mogu vezati na DNA jedino u fazi G1 {to omogu}uje inicijaciju replikacije DNA u S-fazi. Kada replikacija zapo~ne, MCM proteini se uklanjaju tako da se sljede}a replikacija moè dogoditi tek nakon mitoze.
Stani~ni ciklus
599
zanje za DNA je regulirano za vrijeme stani~noga ciklusa tako da se MCM proteini mogu vezati za ishodi{te replikacije samo tijekom G1-faze, dopu{taju}i inicijaciju replikacije DNA u trenutku kad stanica u|e u S-fazu. Kad inicijacija jednom zapo~ne, MCM proteini se uklanjaju iz ishodi{ta tako da replikacija ne moè zapo~eti jo{ jednom tako dugo dok stanica ne pro|e kroz mitozu i u|e u G1-fazu sljede}ega stani~noga ciklusa. Protein-kinaze koje reguliraju napredovanje kroz stani~ni ciklus (o ~emu }e biti rije~ u sljede}em odlomku) sprje~avaju spajanje MCM proteina s DNA tijekom S, G2 i M-faze stani~noga ciklusa s pomo}u razli~itih mehanizama ~ije djelovanje jo{ nije potpuno razja{njeno.
Regulatori napredovanja kroz stani~ni ciklus

Jedno od najzanimljivijih otkri}a u suvremenoj stani~noj biologiji jest na~in funkcioniranja molekularnih mehanizama koji kontroliraju napredovanje eukariotske stanice kroz stani~ni ciklus. Na{e sada{nje razumijevanje regulacije stani~noga ciklusa proizlazi iz objedinjavanja rezultata dobivenih eksperimentima provedenima na organizmima razli~itim poput kvasca, jeìnca, àbe i sisavaca. Studije su pokazale da stani~ni ciklus kod svih eukariota kontroliraju o~uvani nizovi protein-kinaza koji su odgovorni za pokretanje glavnih prjelazaka u stani~nom ciklusu.
MPF: Dimer Cdc2 i ciklina

Tri, u po~etku odvojena, eksperimentalna pristupa pridonijela su identifikaciji klju~nih molekula koje sudjeluju u regulaciji stani~noga ciklusa. Prvo istraìvanje zapo~elo je ispitivanjem àbljih oocita (slika 14-12). Oocite su zaustavljene u G2-fazi stani~noga ciklusa i nalazile su se u stanju mirovanja tako dugo dok ih hormonalni stimulans nije pokrenuo u M-fazu mejoze (obja{njenje slijedi dalje u ovom poglavlju). Dva neovisna tima istraìva~a (Yoshio Masui i Clement Markert bili su jedan tim, a ~lanovi drugog tima bili su Dennis Smith i Robert Ecker) 1971. godine otkrili su da se oocite, koje su u stanju mirovanja u G2-fazi, moè potaknuti na ulazak u M-fazu mikroubrizgavanjem citoplazme oocita koje su bile hormonski stimulirane. Dakle, citoplazmatski faktor, prisutan u hormonski tretiranim oocitama bio je dovoljan da potakne prjelazak iz G2 u M-fazu kod oocita koje nisu bile hormonski tretirane. Ulazak oocita u mejozu ~esto se naziva sazrijevanjem oocita pa je zbog toga ovaj citoplazmatski faktor dobio naziv faktor poticanja sazrijevanja MPF (engl. maturation promoting factor). No, daljnje studije pokazuju da aktivnost MPF nije ograni~ena samo na ulazak oocita u mejozu. Naprotiv, MPF je prisutan i u somatskim stanicama gdje poti~e ulazak u M-fazu mitoti~koga ciklusa. Stoga se drì da je MPF glavni regulator prjelaska iz G2 u M-fazu stani~noga ciklusa. Drugo istraìvanje koje je pridonijelo boljem razumijevanju regulacije stani~noga ciklusa odnosi se na geneti~ku analizu kvasca, a predvodio ga je Lee Hartwell sa svojim kolegama ranih 1970-tih godina. Prou~avaju}i pupaju}i kvasac (Saccharomyces cerevisiae) identificirali su mutante, osjetlji-
progesteron
mikroubrizgavanje citoplazme
G2
Slika 14-12. Otkri}e MPF.

@ablje oocite nalaze se zaustavljene u G2-fazi stani~noga ciklusa, a ulazak u M-fazu mejoze potaknut }e hormon progesteron. Na dijagramu je prikazan eksperiment gdje je u oocitu, zaustavljenu u G2-fazi, ubrizgana citoplazma oocite koja je pro{la prjelazak iz G2 u M-fazu. Citoplazmatski transfer pokrenuo je u novoj oociti prjelazak iz G2 u M-fazu bez hormonske stimulacije, dokazuju}i time da je citoplazmatski faktor (MPF) dovoljan za indukciju ulaska u M-fazu mejoze.
M
600
Poglavlje 14
Otkri}e MPF
Cytoplasmic Control of Nuclear Behavior during Meiotic Maturation of Frog Oocytes Yoshio Masui i Clement L. Markert
Yale University, New Haven, CT Journal of Experimental Zoology, 1971, Volume 177, Pages 129146
Kontekst
Eksperimenti transplantacije jezgre i stani~ne fuzije provedeni {ezdesetih godina 20. stolje}a, pokazali su da jezgra prenesena u stanice koje se nalaze u razli~itim fazama mitoti~koga stani~noga ciklusa, u ve}ini slu~ajeva, prihva}a pona{anje stanice doma}ina. Iz toga proizlazi da citoplazma regulira mitoti~ku aktivnost jezgre. Me|utim, postojanje pretpostavljenih citoplazmatskih faktora koji kontroliraju mitoti~ku aktivnost jezgre trebalo je potvrditi eksperimentalno. Dokaz za to pribavili su Masui i Markert u svojoj studiji istraùju}i ulogu citoplazmatskoga faktora u regulaciji pona{anja jezgre tijekom mejoze àbljih oocita. Neka obilje`ja mejoze àbljih oocita pokazivala su da citoplazmatski faktor kontrolira mejozu. Posebice, mejoza àbljih oocita bila je zaustavljena pri kraju profaze mejoze I. Postupak s hor monom progesteronom potaknuo je nastavak procesa mejoze, {to je istozna~na pojava kod somatskih stanica na prjelasku iz G2 u M-fazu. Oocite napreduju do sljede}eg zaustavljanja u metafazi mejoze II te zatim miruju do oplodnje. Masui i Markert su pretpostavili da posljedice djelovanja
Eksperimenti
@ablje oocite, zbog svoje veli~ine i sposobnosti da preìve injekciju staklenim mikropipetama, osobito su pogodne za eksperimentalna testiranja aktivnosti citoplazmatskih faktora. Osnova eksperimenata bila je va|enje citoplazma iz oocite davatelja podvrgnute djelovanju progesterona kako bi se potaknuo nastavak mejoze. Potom se razli~ita koli~ina citplazme unosila u netretiranu oocitu primatelja. Klju~ni je rezultat bio da citoplazma izva|ena nakon {est ili vi{e sati hor monskoga djelovanja u oociti davatelja inducira nastavak mejoze u oociti primatelju (vidi sliku). Suprotno tomu, citoplazma iz kontrolnih oocita koje nisu bile
mejoza (%)
hor mona i oplodnje na mejozu nastaju zbog promjena u citoplazmi koja posredno kontrolira pona{anje jezgre. Svoju su hipotezu izravno provjerili prenose}i citoplazmu iz hor monski stimulirane oocite u drugu oocitu koja nije bila hormonski obra|ena. Eksperimenti su pokazali da je citoplazmatski faktor, koji su Masui i Markert nazvali faktor poticanja dozrijevanja (MPF), odgovoran za indukciju mejoze nakon hormonske obrade.
obra|ene progesteronom, unesena u oocitu primatelja nije izazvala nikakvu
100
80
60
40
20
10 20 30 40 50 ubrizgana citoplazma (nl)
U oocite primatelje ubrizgana je odre|ena koli~ina citoplazme oocita koje su obra|ene progesteronom. Citoplazma-davatelj izvu~ena je iz sredi{njega podru~ja oocite s pomo}u mikropipete (puna crta), ili pripremljena homogenizacijom cijele oocite (isprekidana crta). Rezultati pokazuju postotak oocita primatelja u kojima se nastavila mejoza.
ve na temperaturu i defektne u procesu stani~noga ciklusa (nazvani engl. cdc-cell division cycle mutants/mutanti stani~noga diobenog ciklusa). Njihova je glavna karakteristika u tome {to u odre|enoj to~ki stani~noga ciklusa dolazi do zaustavljanja rasta. Na primjer, posebno vaàn mutant nazvan cdc28 zaustavlja stani~ni ciklus na START, upu}uju}i na va`nost proteina Cdc28, koji omogu}uje prjelazak kroz kriti~nu regulatornu to~ku u G1fazi (slika 14-13). Sli~nu skupinu mutanti stani~noga ciklusa otkrio je kod cijepaju}eg kvasca Schizosaccharomyces pombe, Paul Nurse sa svojim suradnicima. Izme|u ostalih, izolirali su i mutant cdc2 koji zaustavlja stani~ni ciklus S. pombe u G1, ali i u G2fazi pri prjelasku u M-fazu (glavna regulatorna to~ka kod fisij-
Stani~ni ciklus
601
reakciju. Slijedom toga zaklju~ili su da hormonski obra|ene oocite sadràvaju citoplazmatski faktor koji poti~e nastavak mejoze u oociti primatelju koja nikada nije bila izloèna djelovanju progesterona. Kontrolni eksperimenti isklju~ili su mogu}nost da je sam progesteron faktor koji poti~e mejozu u citoplazmi darovatelja. Dapa~e, pokazano je da uno{enje progesterona izravno u oocitu primatelja ne poti~e mejozu. U~inkovita je samo vanjska primjena hor mona, dokazuju}i time da progesteron djeluje na receptor smje{ten na povr{ini stanice koji aktivira odre|eni citoplazmatski faktor. Sli~ne eksperimente neovisno od prethodnih, izvodili su Dennis Smith i Robert Ecker (Interakcija steroida s oocitama Rana pipiens u indukciji sazrijevanja. Dev.Biol. 25:232247,1971) i do{li do istih zaklju~aka. Zanimljivo je, da je djelovanje progesterona u ovom sustavu sasvim razli~ito od djelovanja u ve}ine stanica, u kojima prolazi kroz plazmatsku membranu i veè za unutarstani~ni receptor (13. poglavlje). Me|utim, u oocitama progesteron djeluje na stani~nu povr{inu kako bi
aktivirao odre|eni faktor u citoplazmi. Nastavak mejoze oocita uobi~ajeno se naziva sazrijevanjem oocita pa su Masui i Markert za svoj novootkriveni regulator mejoze skovali termin faktor poticanja sazrijevanja.
Utjecaj
Nakon njihova otkri}a u àbljim oocitama, prisutnost MPF tako|er je prona|ena u somatskim stanicama gdje poti~e prjelazak iz G2 u M-fazu mitoze. Prema tome, MPF je glavni regulator ulaska u M-fazu mitoti~koga, kao i mejoti~koga stani~noga ciklusa. Nakon kona~nog obja{njenja uloge MPF u àbljim oocitama, godine 1988. studije o genetici kvasaca i embrija morskog jeìnca tako|er su obznanile otkri}e identiteta glavnoga regulatora stani~noga ciklusa. Naime, MPF je dimer ciklina B i Cdc2 protein-kinaze. Daljnje su studije dokazale da su ciklin B i Cdc2 ~lanovi velike porodice proteina, koji s razli~itim ciklinima i protein-kinazama srodnim Cdc2, djeluju gotovo jednako kao MPF u regulaciji drugih prjelazaka stani~noga ciklusa. Otkri}e MPF u àbljim oocitama utrlo je put k razumijevanju regulatornog aparata
Yoshio Masui
Clement Markert
stani~noga ciklusa svih eukariotskih stanica.
mutanta cdc28 osjetljiva na temperaturu
povoljna temperatura
stanica-k}i
nepovoljna temperatura stanica-majka
M G1 START G2 S
M G1 START G2 S
Mutanta cdc28 osjetljiva na temperaturu, replicira se normalno na povoljnoj temperaturi. Pri nepovoljnoj temperaturi, me|utim, napredovanje stani~noga ciklusa blokira se na to~ki START.
Slika 14-13. Svojstva mutante cdc28 S. cerevisiae.
602
Poglavlje 14
Slika 14-14. Akumulacija i degradacija ciklina u embriju morskoga jeìnca.

razina ciklina interfaza
Ciklini su identificirani kao proteini koji se akumuliraju tijekom interfaze, a zatim se brzo degradiraju prema kraju mitoze.
mitoza
interfaza
mitoza vrijeme
interfaza
mitoza
MPF
Cdc2 ciklin B
Slika 14-15. Struktura MPF.

MPF je dimer, a sastoji se od ciklina B i Cdc2 protein-kinaze.
skoga kvasca). Daljnje studije pokazuju da su cdc28 S. cerevisiae i cdc2 S. pombe funkcionalno homologni geni potrebni za prjelazak START i za ulazak u mitozu kod obje vrste kvasca. Da bi se izbjegle zabune zbog razli~ite geneti~ke nomenklature izme|u S. cerevisiae i S. pombe, protein koji kodiraju oba gena u daljnjem tekstu bit }e ozna~en kao Cdc2. Novija istraìvanja cdc2 donose dva zna~ajna otkri}a. Prvo, molekularno kloniranje i sekvenciranje nukleotida otkriva da cdc2 kodira protein-kinazu, {to je prva indikacija istaknute uloge fosforilacije proteina u regulaciji stani~noga ciklusa. Drugo, identificiran je ljudski gen srodan cdc2 i pokazano je da on djeluje u kvascu, {to je dramati~na demonstracija o~uvanosti funkcije ovog regulatora stani~noga ciklisa. Tre}e istraìvanje, koje se najvi{e pribliàva prou~avanju MPF i genetike u kvasaca, proizlazi iz prou~avanja sinteze proteina u ranih embrija morskog jeìnca. Nakon oplodnje, embrio prolazi kroz seriju brzih stani~nih dioba. Analize inhibitora sinteze proteina pokazale su da ulazak u M-fazu stani~noga ciklusa ranih embrija zahtijeva novu sintezu proteina. Tim Hunt je sa svojim kolegama 1983. godine identificirao dva proteina, u embriju morskog jeìnca i {koljke, koji se pona{aju po modelu periodi~ke akumulacije i degradacije. Akumulacija se doga|a tijekom interfaze, a brza degradacija slijedi pred kraj svake mitoze (slika 14-14). Ove proteine Hunt je nazvao ciklini (dva proteina ozna~ena su ciklin A i ciklin B) i pretpostavio je njihovu ulogu u induciranju mitoze gdje svojom periodi~kom akumulacijom i degradacijom kontroliraju ulazak i izlazak iz M-faze. Joan Ruderman i suradnici, godine 1986. dokazali su ovu ulogu ciklina. Ubrizgali su ciklin A u àblju oocitu i dokazali da je njegova prisutnost dostatna za zapo~injanje prjelaska iz G2 u M-fazu. Navedena istraìvanja, u po~etku neovisna, usko su se pribliìla 1988. godine, kad je MPF izoliran iz jaja àbe u laboratoriju Jamesa Mallera. Molekularna karakterizacija MPF, provedena u nekoliko laboratorija, pokazala je da se konzervirani regulator stani~noga ciklusa sastoji od dviju podjedinica: Cdc2 i ciklina B (slika 14-15). Ciklin B je regulatorna podjedinica potrebna za kataliti~ko djelovanje Cdc2 protein-kinaze, {to je u skladu sa stajali{tem da aktivnost MPF kontrolira periodi~na akumulacija i degradacija ciklina B za vrijeme procesa stani~noga ciklusa. Mnogobrojne daljnje studije potvrdile su ulogu ciklina B, kao i regulaciju MPF fosforilacijom i defosforilacijom Cdc2 (slika 14-16). U stanicama sisavaca, sinteza ciklina B zapo~inje u S-fazi. Ciklin B tada se akumulira i formira komplekse s Cdc2 tijekom S i G2-faze. Kad su kompleksi oblikovani, fosforilacija Cdc2 odvija se na dva kriti~na regulatorna mjesta. Jedna je fosforilacija na treoninu-161 i potrebna je za aktivnost Cdc2 kinaze. Druga je fosfo-
Stani~ni ciklus
603
ciklin B Thr 14 fosforilacija Cdc2 P P Tyr 15 defosforilacija
ciklin B
Thr 161
ciklin B
Cdc2
mitoza
ciklin B
sinteza ciklina B Cdc2 Cdc2 defosforilacija P razgradnja ciklina B
Slika 14-16. Regulacija MPF.

Cdc2 formira komplekse s ciklinom B tijekom faza S i G2. Zatim slijedi fosforilacija Cdc2 na treoninu-161 {to je potrebno za aktivnost Cdc2, kao i na tirozinu-15 (i tirozinu-14 kod kralje`njaka) {to inhibira aktivnost Cdc2. Defosforilacijom Thr 14 i Tyr 15 aktivira se MPF i poti~e prjelazak iz G2 u M-fazu. Aktivnost MPF prekida se pred kraj mitoze proteoliti~kom degradacijom ciklina B.
rilacija tirozina-15 i susjednoga treonina-14 kod kralje`njaka. Fosforilacija tirozina-15, koju katalizira protein-kinaza nazvana Wee1, sprje~ava aktivnost Cdc2 i dovodi do akumulacije neaktivnog kompleksa Cdc2/ciklin B tijekom S i G2-faze. Prjelazak iz G2 u M-fazu potaknut je aktivacijom kompleksa Cdc2/ciklin B, {to je posljedica defosforilacije treonina-14 i tirozina-15, a koju poti~e protein-fosfataza, nazvana Cdc25C. Jednom aktivirana, Cdc2 protein-kinaza fosforilira mno{tvo ciljnih proteina koji iniciraju zbivanja u M-fazi, {to }emo razmatrati dalje u ovom poglavlju. Nadalje, aktivnost Cdc2 poti~e degradaciju ciklina B, putem proteolize posredovane ubikvitinom. Ta proteoliti~ka degradacija ciklina B zatim inaktivira Cdc2, {to vodi stanicu k izlasku iz mitoze, obavljanje citokineze i ponovno vra}anje u interfazu.
Porodice ciklina i kinaza ovisnih o ciklinima

Struktura i funkcija MPF (Cdc2/ciklin B) pruà, ne samo molekularnu osnovu za razumjevanje ulaska i izlaska iz M-faze, nego obja{njava na~in regulacije drugih prjelazaka u stani~nom ciklusu. Karakterizacijom kompleksa Cdc2/ciklin B protuma~en je njegov veliki utjecaj u regulaciji stani~noga ciklusa. Nadalje, pokazalo se da su Cdc2 i ciklin B ~lanovi velike porodice srodnih proteina s kojima se povezuju i kontroliraju napredovanje kroz pojedine faze stani~noga ciklusa. Kako smo ve} ranije objasnili, Cdc2 kontrolira prolazak kroz START, kao i ulazak u mitozu kod kvasca. No, on to ~ini u vezi s odre|enim ciklinima (slika 14-17). Posebice, prjelazak iz G2 u M-fazu poti~e Cdc2 povezan s mitoti~kim ciklinima B-tipa (Clb1; Clb2; Clb3 i Clb4). Prjelazak kroz START kontrolira Cdc2 u spoju s odre|enom vrstom ciklina nazvanih G1 ciklini ili Cln. Cdc2 se zatim povezuje s razli~itim ciklinima B-tipa (Clb5 i Clb6), koji
604
Poglavlje 14
Cdc2/Clb1, Clb2, Clb3, Clb4 Cdc2/Cln1, Cln2, Cln3 START
M G1 kvasac G2 S Cdc2/Clb5, Clb6 Cdc2/CycB G2 M
Cdk4, 6/CycD ìvotinjska stanica S G1 restrikcijska to~ka Cdk2/CycE
Cdk2/CycA
Slika 14-17. Kompleksi ciklina i kinaza ovisnih o ciklinima.

Kod kvasca prjelazak kroz START kontrolira Cdc2 povezan s G1 ciklinima (Cln1, Cln2 i Cln3). Kompleksi Cdc2 s odre|enim ciklinima B-tipa (Clb) reguliraju napredovanje kroz S-fazu i ulazak u mitozu. Kod ìvotinjske stanice, prolazak restrikcijske to~ke u G1-fazi kontrolira kompleks Cdk4 i Cdk6 s ciklinom D-tipa. Kompleks Cdk2/ciklin E djeluje kasnije u G1-fazi i potreban je kod prjelaska iz G1 u S-fazu. Kompleks Cdk2/ciklin A potreban je za napredovanje kroz S-fazu, a kompleks Cdc2/ciklin B omogu}uje prjelazak iz G2 u M-fazu.
su potrebni za napredovanje kroz S-fazu. Povezivanje Cdc2 s odre|enim ciklinima B-tipa i ciklinima G1 usmjeruje Cdc2 na fosforilaciju razli~itih proteina koji su potrebni u napredovanju kroz specifi~ne faze stani~noga ciklusa. Stani~ni ciklus vi{ih eukariota ne kontroliraju samo mnogobrojni ciklini, ve} i mnogobrojne Cdc2-srodne protein-kinaze. Cdc2-srodne protein-kinaze poznate su kao Cdk (kinaze ovisne o ciklinima, engl. cyclin dependent kinases). Kao prvi ~lan ove porodice, Cdc2 je tako|er poznat kao Cdk1. Mnogobrojni ~lanovi porodice Cdk udruùju se s odre|enim ciklinima kako bi napredovali kroz razli~ite faze stani~noga ciklusa (slika 14-17). Na primjer, napredovanje od G1 do S-faze uglavnom reguliraju Cdk2, Cdk4 i Cdk6 spojeni s ciklinima D i E. Kompleksi Cdk4 i Cdk6 s ciklinima D-tipa (ciklin D1, D2 i D3) imaju va`nu ulogu u napredovanju kroz restrikcijsku to~ku u G1-fazi. Ciklin E se pojavljuje kasnije u G1, a kompleks Cdk2/ciklin E je potreban u prjelasku iz G1 u S-fazu i za inicijaciju sinteze DNA. Kompleksi Cdk2 s ciklinom A imaju funkciju u napredovanju stanice kroz S-fazu. Prjelazak iz G2 u M-fazu pokre}u kompleksi Cdc2 s ciklinom B. Aktivnost Cdk tijekom napredovanja kroz stani~ni ciklus reguliraju najmanje ~etiri molekularna mehanizma (slika 14-18). Kao {to smo ve} objasnili za Cdc2, prvi stupanj regulacije uklju~uje spajanje Cdk sa svojim ciklinskim partnerima. Na taj se na~in formiranjem posebnih kompleksa Cdk/ ciklina kontrolira sinteza i degradacija ciklina. Drugo, aktivacija kompleksa Cdk/ciklin zahtijeva fosforilaciju konzerviranog Cdk treonina oko pozicije 160. Aktiviraju}u fosforilaciju Cdk katalizira enzim nazvan CAK (kinaza koja aktivira Cdk, engl. Cdk-activating kinase), a sam moè biti sastavljen od kompleksa Cdk (Cdk7) s ciklinom H. Kompleksi Cdk7 i ciklina H tako|er se udruùju s transkripcijskim faktorom TFIIH koji je potreban u inicijaciji transkripcije koju obavlja RNA-polimeraza II (vidi 5. poglavlje). Tako izgleda da ovaj ~lan porodice Cdk moè sudjelovati i u transkripciji, kao i u regulaciji stani~noga ciklusa. U suprotnosti s mehanizmom gdje CAK aktivira fosforilaciju, tre}i mehanizam regulacije Cdk uklju~uje inhibitornu fosforilaciju tirozina smje{tenog blizu amino-kraja Cdk, {to katalizira Wee1 protein-kinaza. Kod kralje`njaka su i Cdc2 i Cdk2 inhibirani fosforilacijom tirozina-15 i susjednog treonina-14. Aktivacija ovih Cdk postiè se defosforilacijom tih aminokiselinskih ostataka s pomo}u protein-fosfataza iz obitelji Cdc25.
1. Povezivanje s ciklinima
ciklin
4. Povezivanje s inhibitorima Cdk (CKI).
CKI 2. Aktiviraju}a fosforilacija treonina oko pozicije 160.
Slika 14-18. Mehanizam regulacije Cdk.

Aktivnost Cdk reguliraju ~etiri molekularna mehanizma.
3. Inhibitorna fosforilacija treonina-14 i tirozina-15.
P P
Thr Tyr
Cdk Thr P
Stani~ni ciklus
605
Tablica 14-1. Cdk inhibitori

Inhibitor
Porodica Cip/Kip (p21, p27, p57)
Kompleksi Cdk/ciklin Faza stani~noga ciklusa

Cdk4/ciklin D Cdk6/ciklin D Cdk2/ciklin E Cdk2/ciklin A G1 G1 G1/S S G1 G1
Porodica Ink4 (p15, p16, p18, p19) Cdk4/ciklin D Cdk6/ciklin D
Pored regulacije fosforilacijom, djelovanje Cdk tako|er kontrolira vezanje proteina inhibitora (nazvani Cdk-inhibitori ili CKI) na komplekse Cdk/ ciklini. U stanicama sisavaca postoje dvije porodice Cdk-inhibitora odgovornih za regulaciju razli~itih kompleksa Cdk/ciklina (tablica 14-1). ^lanovi obitelji Ink4 specifi~no veù i inhibiraju Cdk4 i Cdk6, te stoga Ink4 CKI onemogu}avaju napredak kroz restrikcijsku to~ku u G1-fazi. Nasuprot tomu, ~lanovi obitelji Cip/Kip reguliraju sve stadije napredovanja kroz G1 i S-fazu veù}i se za komplekse Cdk2, 4 i 6 s ciklinima A, D i E. Zanimljivo je da ~lanovi porodice Cip/Kip inhibiraju komplekse Cdk2 s ciklinima A i E, ali aktiviraju komplekse Cdk4 i Cdk6 s ciklinom D, tako da porodica Cip/Kip CKI zapravo ima dvostruku ulogu, kao aktivator i kao inhibitor ovisno o fazi stani~noga ciklusa. Na taj na~in, kontrola Cdk-inhibitora pruà i dodatni mehanizam za regulaciju aktivnosti Cdk. Kombinirani u~inci ovih vi{estrukih na~ina regulacije CKI odgovorni su za kontrolu napredovanja kroz stani~ni ciklus, kako u odgovoru na provjere putem kontrolnih to~aka samog ciklusa, tako i u odgovoru na razli~ite izvanstani~ne podraàje koji reguliraju proliferaciju stanica.
Faktori rasta i ciklini tipa D

Kako je ve} re~eno, proliferaciju ìvotinjskih stanica reguliraju razli~iti izvanstani~ni faktori rasta koji kontroliraju napredovanje stanice kroz restrikcijsku to~ku pri kraju G1-faze. U nedostatku faktora rasta, stanice ne mogu prije}i restrikcijsku to~ku i tako prelaze u stanje mirovanja, ozna~eno s G0, iz kojega se mogu ponovno uklju~iti u stani~ni ciklus kao odgovor na stimulaciju faktorima rasta. Kontrola napredovanja kroz stani~ni ciklus izvanstani~nim faktorima rasta podrazumijeva da su unutarstani~ni signalni putevi stimulirani nizvodno od receptora faktora rasta (obja{njefaktori rasta no u prethodnom poglavlju) i ima kona~nu ulogu u regulaciji Ras/Raf/ERK sastavnih dijelova mehanizma stani~noga ciklusa. Kriti~nu vezu izme|u signalizacije faktorima rasta i napredovanja M G2 sinteza kroz stani~ni ciklus omogu}uju ciklini tipa D (slika 14-19). Sintezu cikliciklina tipa D na D poti~e stimulacija faktorima rasta kao rezultat signaliziranja kroz G1 Ras/Raf/ERK signalnoga puta, te se sinteza ciklina tipa D nastavlja tako dugo dok su faktori rasta prisutni. Me|utim, ciklini tipa D tako|er se Cdk4, 6/CycD vrlo brzo razgra|uju pa njihova untarstani~na koncentracija brzo paS restrikcijska to~ka da nakon {to se uklone faktori rasta. Tako dugo dok su faktori rasta prisutni u G1-fazi, kompleksi Cdk4, 6/ciklin D vode stanicu kroz restrikcijsku to~ku. S druge strane, ako se faktori rasta uklone prije ove klju~ne Slika 14-19. Indukcija ciklina tipa D. regulatorne to~ke, razina ciklina D vrlo brzo pada i stanica ne moè Faktori rasta reguliraju napredovanje kroz napredovati od G1 do S-faze te zbog toga ulazi u fazu mirovanja G0. stani~ni ciklus preko restrikcijske to~ke u G1Na taj na~in inducibilnost i brza razgradnja ciklina D ujedinjuje signali-fazi, induciraju}i sintezu ciklina tipa D preko zaciju faktorima rasta sa sustavom stani~noga ciklusa, omogu}uju}i da signalnoga puta Ras/Raf/ERK.
606
Poglavlje 14
dostupnost izvanstani~nih faktora rasta kontrolira napredovanje stanica kroz G1-fazu. Budu}i da je ciklin D klju~na meta signalizacije faktorima rasta, o~ekivalo bi se da pogrje{ke u regulaciji ciklina D mogu biti razlogom gubitka regulacije rasta koji je karakteristi~an za stanice raka. Dosljedno tomu, utvr|eno je da razli~ite vrste raka kod ljudi nastaju kao posljedica pogrje{ke u regulaciji stani~noga ciklusa, kao i zbog nepravilnosti na unutarstani~nim signalnim putevima koje aktiviraju receptori faktora rasta (vidi 13. poglavlje). Na primjer, mutacije koje uzrokuju kontinuiranu nereguliranu ekspresiju ciklina D1 pridonose razvoju razli~itih vrsta ljudskoga raka, kao {to su limfomi i rak dojke. Sli~no tomu, mutacije koje inaktiviraju inhibitore Ink4 Cdk (npr. p16) koji se veù na komplekse Cdk4, 6/ciklin D ~este su u stanicama raka. Povezanost izme|u ciklina D, kontrole rasta i raka, nadalje potvr|uje ~injenica da klju~ni protein u kompleksima Cdk4,6/ciklin D, u~estalo sam mutira u razli~itim vrstama ljudskih tumora. Ovaj protein, nazvan Rb, prvi je put identificiran kao produkt gena koji je odgovoran za retinoblastom, vrlo rijetki nasljedni o~ni tumor u djece (vidi 15. poglavlje). Daljnje studije pokazale se mutacije koje uzrokuju nedostatak funkcionalnoga proteina Rb nisu ograni~ene samo na retinoblastome, ve} pridonose mnogim ve} poznatim ljudskim tumorima. Rb je prototip tumor-supresorskog gena (engl. tumor supressor gene) gen ~ija inaktivacija dovodi do razvoja raka. Dok onkogeni proteini, kao {to je Ras (vidi 13. poglavlje) i ciklin D vode stani~nu proliferaciju, proteini kodirani genima tumor-supresorskim genima djeluju kao ko~nice koje usporuju napredovanje kroz stani~ni ciklus. Daljni primjeri regulatora stani~noga ciklusa koje kodiraju tumor-supresorski geni je inhibitor Ink4 Cdk i vaàn regulator rasta p53, o kojem smo ve} prije govorili. Daljnje studije o Rb utvrdile su njegovu klju~nu ulogu u spajanju mehanizma stani~noga ciklusa i ekspresiju gena potrebnih u napredovanju kroz stani~ni ciklus i sintezu DNA (slika 14-20). Njegova aktivnost tijekom stani~noga ciklusa regulirana je promjenama u njegovoj fosforilaciji. Tako, kompleksi Cdk4, 6/ciklin D fosforiliraju Rb dok stanica prolazi kroz restrikcijsku to~ku u G1-fazi. U nedovoljno fosforiliranom obliku (prisutnom u G0 i u po~etku G1-faze), Rb se veè na ~lanove obitelji E2F transkripcijskih faktora koji reguliraju ekspresiju vi{e gena uklju~enih u stani~ni ciklus, uklju~uju}i i gen koji kodira ciklin E. E2F se veè za svoje ciljne sljedove, bilo da je Rb prisutan ili odsutan. No, Rb djeluje kao represor, tako da kompleks Rb/E2F zaustavlja transkripciju gena reguliranih s E2F. Rezultat fosforilacije Rb kompleksom Cdk4, 6/ciklin D jest njegovo odvajanje od E2F, koje zatim aktivira transkripciju ciljnih gena. Na taj na~in Rb djeluje kao molekularni prekida~, pretvaraju}i E2F od represora u aktivatora gena potrebnih u napredovanju kroz stani~ni ciklus. S druge strane kontrola Rb preko fosforilacije Cdk4, 6/ciklin D povezuju ovu kriti~nu regulaciju genske ekspresije s dostupno{}u faktora rasta u G1-fazi.
Inhibitori napredovanja kroz stani~ni ciklus

Proliferacija stanice nije regulirana samo faktorima rasta, ve} i razli~itim signalima koji inhibiraju napredak kroz stani~ni ciklus. Na primjer, na djelovanje agenasa koji o{te}uju DNA, stanica reagira zaustavljanjem stani~noga ciklusa, kako bi popravila nastalu {tetu. Nadalje me|ustani~ni kontakti i razli~iti izvanstani~ni faktori ne poti~u, ve} inhibiraju proliferaciju ciljnih stanica. U~inci ovakvih inhibitorskih signala tako|er su posredovani regula-
Stani~ni ciklus
607
Rb
Cdk4, 6/ciklin D P
Rb
E2F
E2F
Rb E2F
E2F RNA
transkripcija
gena S-faze
Slika 14-20. Uloga Rb i E2F u regulaciji stani~noga ciklusa.

U svom nedovoljno fosforiliranom obliku Rb se veè za ~lanove porodice E2F sprje~avaju}i transkripciju gena koje regulira E2F. Kompleksi Cdk4, 6 /ciklin D fosforiliraju Rb i zbog toga se Rb odvaja od E2F pri kraju faze G1. E2F tada stimulira ekspresiju svojih ciljnih gena koji kodiraju proteine potrebne za napredovanje kroz stani~ni ciklus.
torima mehanizma stani~noga ciklusa, ~esto preko indukcije inhibitora Cdk. Dobar primjer koji pokazuje djelovanje inhibitora Cdk s pomo}u proteina p53 (obja{njeno ve} prije), nalazimo u kontrolnoj to~ki u fazi G1, gdje dolazi do zaustavljanja stani~noga ciklusa zbog o{te}enja DNA. Protein p53 je transkripcijski regulator koji funkcionira, barem djelomi~no, u stimulaciji ekspresije inhibitora Cdk p21 (slika 14-21). Protein p21 inhibira nekoliko kompleksa Cdk/ciklin, a njegova indukcija s pomo}u p53 predstavlja barem jedan od o p53-ovisnih mehanizama zaustavljanja stani~noga ciklusa nakon o{te}enja DNA. Osim {to inhibira napredovanje kroz stani~ni ciklus putem svoje interakcije s Cdk-ima, p21 moè i direktno sprije~iti replikaciju DNA. Napose, p21 se veè s jezgrenim antigenom proliferiraju}ih stanica (engl. proliferating cell nuclear antigen PCNA), koji je, kako je ve} re~eno u 5. poglavlju, podjedinica DNA-polimeraze d. Na taj na~in p21 ima dvostruku ulogu u zaustavljanju stani~noga ciklusa zbog o{te}enja DNA, ne samo inhibiraju}i Cdk, ve} i izravnom inhibicijom replikacije DNA u S-fazi. Najbolje prou~en izvanstani~ni inhibitor proliferacije ìvotinjskih stanica je TGF-b -polipeptidni faktor koji inhibira proliferaciju razli~itih tipova epitelnih stanica zaustavljaju}i napredovanje kroz stani~ni ciklus u G1-fazi. Njegovo djelovanje postiè se indukcijom inhibitora Cdk p15, koji se veè za komplekse Cdk4,6/ciklin D. U nedostatku aktivnosti Cdk4,6, fosforilacija Rb-a je blokirana i stani~ni se ciklus zaustavlja u G1-fazi. Sasvim je razli~it molekularni mehanizam koji djeluje u kontroli stani~noga ciklusa u kontrolnim to~kama tijekom S i G2-faze te sprje~ava napredovanje kroz stani~ni ciklus kao odgovor na nereplikaciju ili o{te}enje DNA. Kako je ve} ranije obja{njeno u ovom poglavlju, zaustavljanje stani~noga ciklusa na ovim kontrolnim to~kama zbiva se s pomo}u protein-kinaza Chk1 i Chk2 (slika 14-9). Chk1 i Chk2 fosforilacijom inhibiraju proteinfosfatazu Cdc25C, koja je odgovorna za defosforilaciju i aktivaciju kompleksa Cdc2/ciklin B (slika 14-22). Ako se Cdc2 ne aktivira, progresija u mitozu
povi{enje razine p53
p53
p21
Cdk
PCNA
inhibicija inhibicija stani~noga ciklusa replikacije DNA
Slika 14-21. Indukcija p21 zbog o{te}enja DNA.

Zbog o{te}enja DNA pove}ava se unutarstani~na razina p53 koji aktivira transkripciju gena koji kodira Cdk inhibitor p21. Osim {to inhibira napredovanje stani~noga ciklusa veù}i se za komplekse Cdk/ciklin, p21 moè i izravno inhibirati sintezu DNA u uzajamnom djelovanju s PCNA (podjedinica DNA-polimeraze d).
608
Poglavlje 14
zavr{ena replikacija
nereplicirana ili o{te}ena DNA
senzorni proteini senzorni proteini Chk1 Chk2 ATR Chk2 Cdc25C Chk1 ATM
ATM
ATR
aktivan P neaktivan
Cdc25C ciklin B ciklin B ciklin B
Cdc2 P neaktivan MPF
Cdc2
Cdc2 P
aktivan MPF
neaktivan MPF
napredovanje u mitozu
zaustavljanje u G2-fazi
Slika 14-22. Nadzor u kontrolnoj to~ki G2-faze.
Kompleks senzornih proteina prepoznaje nerepliciranu ili o{te}enu DNA i aktivira ATM i ATR protein-kinaze {to dovodi do aktiviranja Chk1 i Chk2. Protein-kinaze Chk1 i Chk2 fosforiliraju i inhibiraju Cdc25C protein-fosfatazu. Inhibiranjem Cdc25C sprje~ava se defosforilacija i aktivacija Cdc2.
se blokira i stanica ostaje zaustavljena u G2-fazi. Jednako tako, Chk1 i Chk2 fosforiliraju srodnog ~lana obitelji Cdc25, Cdc25A. Cdc25A defosforilira i aktivira komplekse Cdk2 s ciklinima A ili E, koji tada pokre}u napredovanje kroz S-fazu. Fosforilacija dovodi do brze degradacije Cdc25A i time zaustavlja stani~ni ciklus kao odgovor na o{te}enje DNA.
Doga|aji u M-fazi
M-faza je najdramati~nije razdoblje stani~noga ciklusa, a uklju~uje veliku reorganizaciju prakti~no svih dijelova stanice. Tijekom mitoze (dioba stani~ne jezgre) kromosomi se zgu{njavaju, jezgrina se ovojnica raspada kod ve}ine stanica, citoskelet se reorganizira kako bi se formiralo diobeno vreteno, a kromosomi putuju na suprotne polove. Nakon odvajanja kromosoma obi~no slijedi dioba stanice (citokineza). Iako smo mnoge od ovih doga|aja ve} objasnili u pro{lim poglavljima, s obzirom na strukturu i funkciju jezgre i citoskeleta, ovdje }emo to ponoviti s obzirom na djelovanje MPF u M-fazi.
Stani~ni ciklus
609
profaza centrosom mikrotubuli prometafaza interfaza sestrinske kromatide
mikrotubuli iz diobenog vretena vezani za kinetohore
metafaza
telofaza anafaza
citokineza
ponovno stvaranje jezgrine ovojnice
Slika 14-23. Faze mitoze u ìvotinjskoj stanici.

Tijekom profaze kromosomi se kondenziraju i centrosomi se kre}u na suprotne strane jezgre poti~u}i formiranje diobenoga vretena. Raspad jezgrine ovojnice dopu{ta mikrotubulima iz diobenoga vretena da se veù za kinetohore kromosoma. Tijekom prometafaze kromosomi se kre}u naprijed-natrag izme|u centrosoma i sredine stanice da bi se na kraju poredali u sredini diobenoga vretena (metafaza). U anafazi sestrinske se kromatide odvajaju i kre}u prema suprotnim polovima diobenoga vretena. Mitoza zavr{ava ponovnim for miranjem jezgrine ovojnice i dekondenzacijom kromosoma tijekom telofaze, a citokinezom nastaju dvije stanice- k}eri. Treba napomenuti da svaka stanica-k}i dobiva jedan centrosom koji se duplicira prije sljede}e mitoze.
Faze mitoze
Iako se mnogi detalji u mitozi razlikuju kod razli~itih organizama, osnovni proces koji osigurava pouzdano odvajanja sestrinskih kromatida zadràn je kod svih eukariota. Temeljna doga|anja u mitozi uklju~uju kondenzaciju kromosoma, formiranje diobenoga vretena i vezanje kromosoma za mikrotubule u diobenom vretenu. Sestrinske se kromatide odvajaju i kre}u na suprotne polove diobenoga vretena te slijedi formiranje dviju jezgarak}eri. Mitozu uobi~ajeno dijelimo u ~etiri faze profaza, metafaza, anafaza i telofaza koje su prikazane na slikama 14-23 i 14-24 (za ìvotinjsku stanicu). Profaza zapo~inje zgu{njavanjem kromosoma, a svaki se sastoji od dviju sestrinskih kromatida (molekule DNA k}eri nastaju u S-fazi). Novorepli-
610
mitoza interfaza
Poglavlje 14
rana profaza
kasna profaza
prometafaza
metafaza
rana anafaza
kasna anafaza
telofaza
Slika 14-24. Fluorescencijskomikroskopske slike kromatina, keratina i mikrotubula tijekom mitoze plu}ne stanice da`devnjaka.
Kromatin je obojen plavo, keratin crveno, a mikrotubuli zeleno (Conly L.Rieder/Biological Photo Service).)
cirane molekule DNA ostaju isprepletene tijekom S i G2-faze, a otpli}u se tijekom procesa kondenzacije kromatina. Zgusnuti sestrinski kromatidi drè se zajedno u podru~ju centromera (obja{njeno u 4. poglavlju), a ona je slijed DNA na koji se veù proteini i formiraju kinetohore mjesto kona~noga spajanja mikrotubula diobenoga vretena. Za vrijeme profaze osim kondenzacije kromosoma, zapo~inju i citoplazmatske promjene koje vode do razvoja diobenoga vretena. Centrosomi (duplicirani u interfazi) se odvajaju i kre}u na suprotne strane jezgre i predstavljaju dva pola diobenoga vretena koje se po~inje formirati u kasnoj profazi. Kod vi{ih eukariota pri kraju profaze dolazi do raspada jezgrine ovojnice. Kako je obja{njeno u 8. poglavlju, raspad jezgrine ovojnice nije op}enita zna~ajka mitoze. Napose, kvasac i mnogi drugi jednostani~ni eukarioti prolaze zatvorenu mitozu kod koje jezgrina ovojnica ostaje nepromijenjena (slika 8-30). U tim stanicama tjele{ca polova diobenoga vretena ugra|ena su u jezgrinu ovojnicu i dioba jezgre odvija se nakon {to se kromosomi k}eri odmaknu na suprotne polove diobenoga vretena. Nakon zavr{etka profaze, stanica ulazi u prometafazu prijelaznu etapu izme|u profaze i metafaze. Tijekom prometafaze mikrotubuli diobe-
Stani~ni ciklus
611
noga vretena veù se na kinetohore kondenziranih kromosoma. Kinetohori sestrinskih kromatida orijentirani su prema suprotnim stranama kromosoma, tako da se veù za mikrotubule izlaze}i iz suprotnih polova diobenoga vretena. Kromosomi se kre}u naprijed-natrag sve dok se kona~no ne poredaju u metafaznoj ravnini u sredini diobenoga vretena. Na ovom stupnju stanica dolazi do metafaze. Mnoge stanice samo nakratko ostaju u metafazi prije no {to nastave u anafazu. Prjelazak iz metafaze u anafazu potaknut je raspadom veze izme|u sestrinskih kromatida koje se odvajaju i kre}u ka suprotnim polovima diobenoga vretena. Mitoza zavr{ava u telofazi kad se ponovno formira jezgra i kromosomi se dekondenziraju. Citokineza obi~no zapo~inje u kasnoj anafazi i skoro je gotova na kraju telofaze stvaraju}i dvije stanice-k}eri tijekom interfaze.
MPF i napredovanje do metafaze

Tijekom mitoze zbivaju se dramati~ne promjene u mnogim stani~nim dijelovima {to dovodi do zna~ajne reorganizacije cjelokupne stani~ne strukture. Kako je ve} ranije u ovom poglavlju re~eno, ova doga|anja pokre}e aktivacija MPF protein-kinaza (Cdc2/ciklin B). îni se da MPF ne djeluje samo kao glavni regulator prelaska u M-fazu fosforiliraju}i i aktiviraju}i druge nizvodne protein-kinaze, ve} tako|er djeluje izravno fosforiliraju}i neke strukturne proteine koji sudjeluju u stani~noj reorganizaciji. Zgu{njavanje interfaznog kromatina u svrhu formiranja kompaktnih kromosoma u mitoti~koj stanici klju~ni je doga|aj u mitozi jer omogu}ava kretanje kromosoma po diobenom vretenu bez njihova lomljenja ili me|usobnog zaplitanja. Kako je re~eno u 4. poglavlju, kromatin se u interfaznoj jezgri zgu{njava skoro tisu}u puta tijekom formiranja metafaznih kromoso-
MPF ciklin B
Cdc2
kondenzacija kromatina fosforilacija kondenzina
raspad jezgrine ovojnice fosforilacija lamina
fragmentacija Golgijeva aparata i ER fosforilacija GM 130
formiranje diobenoga vretena nestabilnost mikrotubula
Slika 14-25. Mjesta djelovanja MPF.

Na po~etku M-faze MPF pokre}e mnoge promjene u jezgri i citoplazmi i to na dva na~ina aktiviraju}i druge protein-kinaze i fosforilacijom proteina, kao {to su kondenzini i nuklearni lamini.
612
Poglavlje 14
0,5 mm
Slika 14-26. Elektronskomikroskopska slika mikrotubula vezanoga na kinetohore kromosoma.

(L. Rieder / Biological Photo Service).
ma. Tako visokokondenzirani kromatin ne moè se prepisivati pa transkripcija prestaje dok je zgu{njavanje kromatina u tijeku. Unato~ temeljnoj va`nosti ovoga procesa, jo{ u potpunosti ne razumijemo ni strukturu metafaznih kromosoma, ni molekularni mehanizam zgu{njavanja kromatina. No, poznato je da zgu{njavanje kromatina poti~u proteinski kompleksi, pod nazivom kondenzini koji uklju~uju ~lanove porodice proteina SMC (strukturnog odràvanja kromatina, engl. structural maintenance of chromatin) o kojima smo govorili u 8. poglavlju. Protein-kinaza Cdc2 izravno fosforilira kondenzine ~ime ih aktivira i poti~e zgu{njavanje kromatina nakon ulaska stanice u mitozu. Molekularna promjena koja redovito prati zgu{njavanje kromosoma je fosforilacija histona H1, a va`no je naglasiti da je histon H1 tako|er supstrat za Cdc2. Me|utim, fosforilacija histona H1 nije neophodna za zgu{njavanje kromosoma u mitozi, pa je zna~enje fosforilacije H1 s pomo}u Cdc2 nejasno. S druge strane, za zgu{njavanje kromosoma potrebna je fosforilacija histona H3 koja mo`da sluì za regrutaciju kondenzina. Mo`da je iznena|uju}e da fosforilaciju histona H3 ne obavlja Cdc2, ve} druga protein-kinaza (aurora B) koja se tako|er aktivira tijekom mitoze. Raspad jezgrine ovojnice, {to je jedan od najdramati~nijih doga|aja u mitozi, predstavlja najbolje definirani cilj djelovanja MPF. U 8. poglavlju, objasnili smo da Cdc2 fosforilira lamine i time dovodi do depolimerizacije jezgrine lamine (slika 8-31). Zatim slijedi fragmentacija jezgrine ovojnice u mjehuri}e koji se kona~no spajaju u telofazi kako bi formirali nove jezgre-k}eri. Endoplazmatski retikul i Golgijev aparat tako|er se fragmentiraju u mjehuri}e kako bi se tijekom citokineze rasporedili u stanice-k}eri. Raspad ovih ovojnica tako|er poti~e MPF, a djelomi~no moè biti posredovan djelovanjem Cdc2 koji fosforilira protein GM130 iz matriksa Golgija, koji je potreban za prihva}anje COPI-obloènih vezikula na Golgijevu ovojnicu. Fosforilacija i inaktivacija GM130 s pomo}u Cdc2 sprje~ava pristajanje i stapanje vezikula te dovodi do fragmentacije Golgijeva aparata. No, Cdc2 moè djelovati i na druge ciljeve, a mehanizam djelovanja MPF koji dovodi do fragmentacije ovojnica jo{ nije u potpunosti razja{njen. Reorganizacija citoskeleta, ~iji je vrhunac formiranje diobenoga vretena, proisti~e iz dinami~ke nestabilnosti mikrotubula (vidi 11. poglavlje). U po~etku profaze centrosomi se odmi~u na suprotne strane jezgre. Pove}anje aktivnosti MPF zatim izaziva dramati~nu promjenu u dinami~kom pona{anju mikrotubula. Prvo, razgradnja mikrotubula se ubrzava {to dovodi do depolimerizacije i skra}enja interfaznih mikrotubula. Vjeruje se da je razgradnja posljedica fosforilacije proteina povezanih s mikrotubulima, bilo od samog MPF ili neke druge protein-kinaze koju aktivira MPF. Drugo, broj mikrotubula koji proizlaze iz centrosoma pove}ava se na na~in da se interfazni mikrotubuli nadomje{taju mno{tvom kratkih mikrotubula koji zrakasto izbijaju iz centrosoma. Raspad jezgrine ovojnice omogu}uje nekim mikrotubulima iz diobenoga vretena da se veù na kinetohore kromosoma (slika 14-26) i tako zapo~inju proces kretanja kromosoma koji je karakteristi~an za prometafazu. Me|u proteinima vezanim na kinetohorama nalaze se i mikrotubularni motori koji kromosome pokre}u prema minus-krajevima mikrotubula diobenog vretena (koji su usidreni u centrosomu). Djelovanju ovih proteina, koji vuku kromosome prema centrosomu, suprotstavljaju se motorni proteini usmjereni prema plus-kraju i produljivanje mikrotubula vretena, {to oboje tjera kromosome od polova vretena. Posljedica toga je da se kromosomi u prometafazi kre}u naprijed-natrag izme|u centrosoma i centra diobenoga vretena.
Stani~ni ciklus
613
Slika 14-27. Diobeno vreteno.

A) Diobeno se vreteno sastoji od triju vrsta mikrotubula. Kinetohorni mikrotubuli vezani su za kromosome, polarni mikrotubuli preklapaju se u sredini stanice i astralni mikrotubuli koji zrakasto izlaze iz centrosoma prema rubnim dijelovima stanice. B) Stanica bijele ribe (losos) u metafazi (B, Michael Abbey / Photo Researchers Inc.).
(A) polarni mikrotubuli
Mikrotubuli koji izviru iz suprotnih polova diobenoga vretena kona~no se veù za dva kinetohora sestrinskih kromatida (koje se nalaze na suprotnim stranama kromosoma) te se uspostavlja ravnoteà sila koje djeluju na kromosome tako da se oni rasporede na metafaznoj ravnini u sredini diobenoga vretena (slika 14-27). U 11. poglavlju objasnili smo da se diobeno vreteno sastoji od kinetohornih mikrotubula koji su vezani na kromosome, polarnih mikrotubula koji se preklapaju u sredini stanice i astralnih mikrotubula koji zrakasto izlaze iz centrosoma prema rubnom dijelu stanice.
astralni mikrotubuli (B)
Proteoliza i deaktivacija MPF: anafaza i telofaza

Ranije smo ve} naglasili va`nost kontrolne to~ke stani~noga ciklusa koja nadzire raspore|ivanje kromosoma u diobenom vretenu u metafazi. Kad je raspore|ivanje zavr{eno, stani~ni se proces nastavlja u anafazi te se zatim zavr{ava mitoza. Napredovanje iz metafaze u anafazu nastaje zbog ubikvitinom posredovane proteolize klju~nih regulatornih proteina, a potaknuto aktivacijom ubikvitin-ligaze (slika 7-41) nazvane kompleks koji poti~e anafazu (engl. anaphase-promoting complex). Aktivaciju kompleksa koji poti~e anafazu pokre}e MPF na po~etku mitoze, tako da MPF u kona~nici pokre}e vlastitu destrukciju. Kompleks koji poti~e anafazu inhibiran je tijekom prolaska stanice kroz kontrolnu to~ku diobenoga vretena, nakon ~ega se aktivira ubikvitinski sustav razgradnje koji pokre}e prjelazak iz metafaze u anafazu i nastavak procesa kroz ostatak mitoze. Kontrolna to~ka diobenoga vretena jedinstvena je po tome {to je prisutnost makar samo jednog neraspore|enog kromosoma dovoljna da zaustavi aktivaciju kompleksa koji poti~e anafazu. Biokemijski mehanizam koji regulira ovu kontrolnu to~ku nije jo{ do sada potpuno rasvijetljen, ali se pretpostavlja da neraspore|eni kromosomi uzrokuju produkciju kompleksa proteina (nazvanih Mad/Bub proteini) koji inhibiraju kompleks koji poti~e anafazu (slika 14-28). Inhibicija prestaje onog trenutka kad su svi kromosomi pravilno raspore|eni, {to vodi do aktivacije kompleksa koji poti~e anafazu i degradacije dvaju klju~nih ciljnih proteina. Anafaza zapo~inje proteoliti~kom razgradnjom proteina, nazvanog Scc1, koji je sastavnica kompleksa proteina nazvanih kohezini, a koji odràvaju veze izme|u sestrinskih kromatida dok se nalaze povezane u metafaznoj ravnini. Razgradnja Scc1 nije katalizirana izravno kompleksom koji poti~e anafazu, ve} kompleks koji poti~e anafazu razgra|uje protein nazvan sekurin koji je regulacijska podjedinica proteaze nazvane separaza. Razgradnja sekurina izaziva aktivaciju separaze koja razgra|uje kohezin Scc1. Razgradnja Scc1 kida veze me|u sestrinskim kromatidima pa sada odvojene kre}u prema
10 mm
kontrolna to~ka diobenoga vretena
Mad Bub
kompleks koji poti~e anafazu
razgradnja sekurina
razgradnja ciklina B
aktivacija separaze
inaktivacija MPF
Slika 14-28. Djelovanje proteoliti~koga sustava ciklina B.

Kompleks koji poti~e anafazu jest ubikvitin-ligaza koju inhibiraju Mad/Bub proteini za vrijeme dok stanica prolazi kroz kontrolnu to~ku diobenoga vretena. Aktiviranjem kompleksa koji poti~e anafazu poti~e se prjelazak iz metafaze u anafazu, {to dovodi do razgradnje kohezina Scc1 i prekida veze izme|u sestrinskih kromatida. Kompleks koji poti~e anafazu tako|er razgra|uje ciklin B {to uzrokuje inaktivaciju MPF, izlazak iz mitoze i citokinezu.
razgradnja kohezina Scc1
izlazak iz mitoze, citokineza
separacija sestrinskih kromatida po~etak anafaze
614
Poglavlje 14
10 mm
suprotnim polovima diobenoga vretena (slika 14-29). Rastavljanje kromosoma tijekom anafaze zatim se nastavlja kao posljedica djelovanja nekoliko vrsta motornih proteina koji su povezani s mikrotubulima u diobenom vretenu (slike 11-51 i 11-52). Drugi klju~ni regulatorni protein na koji djeluje kompleks koji poti~e anafazu jest ciklin B. Razgradnja ciklina B dovodi do inaktivacije MPF, {to je potrebno stanici za izlazak iz mitoze i povratak u interfazu. Mnoge stani~ne promjene koje se zbivaju u ovim prijelaznim razdobljima jednostavno su obrat doga|aja koje izaziva MPF tijekom ulaska u mitozu. Na primjer, ponovno spajanje jezgrine ovojnice, dekondenzacija kromatina, povratak mikrotubula u interfazno stanje, vjerojatno su izravni rezultat gubitka aktivnosti MPF i defosforilacije proteina koje je MPF fosforilirao u po~etku mitoze. Inaktivacija MPF tako|er poti~e citokinezu {to }emo objasniti u nastavku.
Slika 14-29. Stanica bijele ribe u anafazi.

(Michael Abbey / Photo Researchers, Inc.)
Citokineza
Po zavr{etku mitoze uobi~ajeno slijedi citokineza, faza u kojoj nastaju dvije stanice-k}eri. Citokineza zapo~inje odmah nakon po~etka anafaze, a pokre}e ju inaktivacija MPF, koordiniraju}i pri tome diobu jezgre i citoplazme. Kako smo ve} napomenuli u 11. poglavlju, citokineza ìvotinjske stanice odvija se s pomo}u kontraktilnog prstena koji je gra|en od vlakana aktina i miozina II, a formira se ispod membrane (slika 14-30). Pozicija kontraktilnog prstena odre|ena je prema poziciji diobenoga vretena, tako da se kona~no stanica podijeli u ravnini koja prolazi kroz metafaznu ravninu okomito na diobeno vreteno. Odvajanje se nastavlja stezanjem aktinsko -miozinskih vlakana koja vuku stani~nu membranu prema unutra {to na kraju rezultira razdvajanjem stanice po polovini. Most izme|u dviju stanica-k}eri tada se prekida i stani~na se ovojnica ponovno zatvara. Mehanizam je citokineze razli~it u stanicama vi{ih biljaka, jer su one okruène ~vrstom stani~nom stijenkom. Umjesto da kontraktilni prsten svojim stezanjem podijeli stanicu, ove se stanice dijele tako da se unutar stanice formiraju nove stani~ne stijenke i membrane (slika 14-31). Na po~etku telofaze, vezikule iz Golgijeva aparata koje prenose prethodnike stani~ne stijenke spajaju se s mikrotubulima iz diobenog vretena i sakupljaju se na prija{njem mjestu metafazne ravnine. Vezikule se zatim stapaju kako bi
(A)
(B)
kontraktilni prsten
Slika 14-30. Citokineza ìvotinjske stanice.

A) Citokineza nastaje kao posljedica stezanja kontraktilnoga prstena koji je gra|en od vlakana aktina i miozina te dijeli stanicu na dvije. B) Pretra`na elektronskomikroskopska fotografija jajne stanice àbe za vrijeme citokineze (B, David M. Phillips / Visual Unlimited).
1 mm
Stani~ni ciklus
615
Slika 14-31. Citokineza kod vi{ih biljaka.

Vezikule iz Golgijeva aparata koje prenose prete~e stani~ne stijenke veù se na polarne mikrotubule na prija{njem mjestu metafazne ravnine. Fuzijom vezikula nastaje struktura u obliku diska obavijena membranom (stani~na plo~a) koja se {iri prema vanjskim stijenkama i spaja se sa roditeljskom stani~nom membranom.
polarni mikrotubuli
Golgijeve vezikule
stvorile veliku strukturu u obliku diska, okruènu ovojnicom, a od polisaharidnog sadràja nastaje osnova (nazvana stani~na plo~a) za novu stani~nu stijenku. Stani~na se plo~a {iri prema vanjskim stijenkama okomito na diobeno vreteno dok ne dosegne membranu. Membrana koja obavija stani~nu plo~u zatim se spaja s roditeljskom (parentalnom) stani~nom membranom te na taj na~in podijeli stanicu na dvije.
stapanje Golgijevih vezikula rana stani~na plo~a
Mejoza i oplodnja
Kona~ni ishod stani~noga ciklusa somatske stanice, koji smo opisali u ovom poglavlju, jest nastanak diploidnih stanica-k}eri s identi~nim genskim sadràjem. Suprotno tomu, mejoza je posebna vrsta stani~noga ciklusa kojom se broj kromosoma reducira na polovicu i tako nastaju haploidne stanicek}eri. Jednostani~ni eukarioti, kao {to je kvasac, moè se reproducirati mejozom i mitozom. Diploid Saccharomyces cerevisiae, na primjer, stvara spore mejozom u nepovoljnim uvjetima. Me|utim, kod vi{estani~nih biljaka i ìvotinja mejoza je ograni~ena na germinativne stanice koje su bitne u spolnoj reprodukciji. Proliferacija somatskih stanica odvija se mitozom, dok germinativne stanice mejozom stvaraju haploidne gamete (spermij i jajnu stanicu). Razvoj novog organizma potomka zapo~inje spajanjem gameta pri oplodnji.
pro{irivanje rane stani~ne plo~e
nova stani~na stijenka
Proces mejoze
Za razliku od mitoze, u mejozi se diploidna roditeljska stanica dijeli na haploidno potomstvo, a svaka stanica sadràva samo jedan ~lan para homolognih kromosoma koji su bili prisutni u diploidnoj roditeljskoj stanici (slika 14-32). Redukcija broja kromosoma postiè se slijedom dviju uzastopnih dioba jezgre i stanice (nazvane mejoza I i mejoza II) nakon samo jedne replikacije DNA. Kao i kod mitoze, mejoza I zapo~inje nakon dovr{enja S-faze i nakon replikacije roditeljskih kromosoma kojom nastaju identi~ne sestrinske kromatide. Me|utim, u mejozi I obrazac odvajanja kromosoma sasvim je druga~iji od onog u mitozi. Tijekom mejoze I, homologni se kromosomi najprije sparuju jedan s drugim, a zatim odvajaju u razli~ite stanice-k}eri. Sestrinske kromatide ostaju zajedno i dovr{enjem mejoze I nastaju stanice-k}eri koje sadràvaju po jedan ~lan od svakoga kromosomskog para (koji se sastoji od dviju sestrinskih kromatida). Nakon mejoze I slijedi mejoza II koja je sli~na mitozi po tome {to se sestrinske kromatide razdvajaju i prelaze u razli~ite stanice-k}eri. Dovr{enjem mejoze II tako nastaju ~etiri haploidne stanice-k}eri, od kojih svaka sadràva samo jednu kopiju svakoga kromosoma. Sparivanje homolognih kromosoma omogu}ava nakon replikacije DNA rekombinaciju izme|u o~evih i maj~inih kromosoma i na taj je na~in geneti~ka rekombinacija izravno vezana s razdvajanjem kromosoma tijekom mejoze. Rekombinacija izme|u homolognih kromosoma odvija se za vrijeme pro{irene profaze mejoze I, koja je podijeljena u pet podfaza s obzirom na morfologiju kromosoma (leptoten, zigoten, pahiten, diploten i dija-
616
Poglavlje 14
mejoza I
mejoza II
diploidna stanica
replikacija DNA
sparivanje homolognih kromosoma
mitoza
~etiri haploidne stanice
diploidna stanica dvije diploidne stanice DNA
Slika 14-32. Usporedba mejoze i mitoze.

I mejoza i mitoza zapo~inju nakon replikacije DNA, tako da se svaki kromosom sastoji od dviju sestrinskih kromatida. U mejozi I homologni se kromosomi sparuju i zatim odvajaju u razli~ite stanice. Sestrinske se kromatide razdvajaju tijekom mejoze II koja je sli~na normalnoj mitozi. Mejozom tako nastaju ~etiri haploidne stanice - k}eri.
leptoten
zigoten
pahiten
diploten
dijakineza
Slika 14-33. Podfaze profaze mejoze I.

Mikrofotografije koje prikazuju morfologiju kromosoma ljiljana (C. Hasenkampf / Biological Photo Service.)
Stani~ni ciklus
617
kromatin
lateralni element
Slika 14-34. Sinaptonemni kompleks.

Om~e kromatina vezane su na lateralne elemente koji su spojeni jedan s drugim strukturom sli~nom patentnom zatvara~u.
kineza) (slika 14-33). Rekombinacija se u~estalo odvija tijekom mejoze, a poti~u ju dvolan~ani lomovi, {to se doga|a u po~etku mejoti~ke profaze (leptoten) s pomo}u visoko konzervirane endonukleaze nazvane Spo11. Kako je obja{njeno u 5. poglavlju, dvolan~ani lomovi rezultiraju stvaranjem jednolan~anih podru~ja koja napadaju homologni kromosom na osnovi komplementarnog sparivanja baza (slika 5-36). U zigotenu homologni se kromosomi tijesno povezuju (sinapsa). Tijekom ove podfaze zapo~inje formiranje proteinske strukture uzdu` sparenih kromosoma, koja sli~i patentnom-zatvara~u (smi~ku), a naziva se sinaptonemni kompleks (slika 14-34). Ovaj kompleks odràva homologne kromosome tijesno povezanima i poredanima jedan uz drugoga tijekom podfaze pahitena, koja moè trajati i nekoliko dana. Rekombinacija izme|u homolognih kromosoma zavr{ava se na kraju pahitena, a kromosomi ostaju vezani na mjestima na kojima se dogodilo ukrièno povezivanje (engl. crossing-over)(kijazma). Sinaptonemni kompleks nestaje u diplotenu i homologni se kromosomi odvajaju uzdu`no. No, oni ostaju vezani na kijazmama {to je vrlo va`no za njihovo pravilno raspore|ivanje u metafazi. U ovoj fazi, svaki kromosomski par (nazvan bivalent) sastoji se od ~etiriju kromatida s jasno vidljivim kijazmama (slika 14-35). Dijakineza, kona~na podfaza profaze I, predstavlja prjelazak u metafazu u kojoj kromosomi postaju potpuno kondenzirani. U metafazi I, bivalentni kromosomi (bivalenti) poredaju se na vreteno. Za razliku od mitoze (slika 14-27), kinetohori sestrinskih kromatida nalaze se vrlo blizu jedan do drugog i orijentirani su u istom smjeru, dok su kinetohori homolognih kromosoma usmjereni prema suprotnim polovima diobenoga vretena (slika 14-36). Posljedica toga jest da se mikrotubuli iz istoga pola diobenoga vretena spajaju sa sestrinskim kromatidama, dok se mikrotubuli iz nasuprotnih polova spajaju s homolognim kromosomima. Anafaza I zapo~inje razrje{avanjem kijazmi kojima su homologni kromosomi bili povezani. Tada se oni razdvajaju, a sestrinske kromatide ostaju povezane na centromerama. Zavr{etkom mejoze I svaka stanica-k}i dobiva jedan
Slika 14-35. Bivalentni kromosom u fazi diplotena.

Bivalentni kromosom sastoji se od para homolognih kromosoma. Sestrinske kromatide svakoga kromosoma spojene su centromerom. Kromatide homolognih kromosoma vezane su na kijazmama, mjestima na kojima se dogodila geneti~ka rekombinacija. (B. John/Visuals Unlimited.)
618
Poglavlje 14
Slika 14-36. Odvajanje kromosoma u mejozi I.

U metafazi I kinetohori sestrinskih kromatida ili su spojeni ili grani~e jedan s drugim. Mikrotubuli iz istoga pola diobenoga vretena veù se za kinetohore sestrinskih kromatida dok se mikrotubuli iz suprotnih polova veù za kinetohore homolognih kromosoma. U anafazi I kidaju se veze na kijazmama i homologni kromosomi kre}u prema suprotnim polovima diobenoga vretena.
kijazma
metafaza I
mikrotubuli diobenoga vretena anafaza I
kinetohore sestrinskih kromatida
~lan od svakoga homolognoga para koji se sastoji od dviju sestrinskih kromatida. Mejoza II zapo~inje odmah nakon citokineze, obi~no prije nego se kromosomi potpuno dekondenziraju. Nasuprot mejozi I, mejoza II sli~na je mitozi. U metafazi II, kromosomi se poredaju na vretenu tako da su mikrotubuli iz suprotnih polova vretena vezani za kinetohore sestrinskih kromatida. Veza izme|u centromera sestrinskih kromatida prekida se u anafazi II i sestrinske se kromatide odvajaju i pomi~u prema suprotnim polovima. Slijedi zatim citokineza u kojoj se stvaraju haploidne stanice-k}eri.
Regulacija mejoze oocita

Oocite kralje`njaka (jajne stanice u razvoju) posebno su korisni modeli u istraìvanju stani~noga ciklusa, djelomi~no zbog svoje veli~ine, a time i lak{e manipulacije u laboratoriju. Karakteristi~an primjer, ve} prije opisan u ovom poglavlju, bilo je otkri}e i izolacija MPF iz àbljih oocita. Mejoza ovih oocita, kao i kod drugih vrsta, regulirana je dvjema jedinstvenim to~kama stani~noga ciklusa. Prou~avanje mejoze oocita razjasnilo je nove mehanizme kontrole stani~noga ciklusa. Prva regulatorna to~ka kod mejoze oocita nalazi se u diplotenskoj fazi prve mejoti~ke diobe (slika 14-37). U ovoj fazi, oocite mogu ostati zaustavljene kroz vrlo dugo razdoblje kod ~ovjeka ~ak 4050 godina. Tijekom diplotenskog zastoja kromosomi oocita se dekondenziraju i aktivno prepisuju. Transkripcijska aktivnost se o~ituje ogromnim porastom oocita tijekom tog razdoblja. Na primjer, oocite ~ovjeka imaju promjer oko 100 mm i imaju sto puta ve}i volumen od tipi~ne somatske stanice. Oocite àbe su jo{ ve}e, oko 1 mm u promjeru. Tijekom razdoblja stani~noga rasta, oocite akumuliraju zalihe tvari, kao {to su RNA i proteini, prijeko potrebni u ranom razvoju embrija. Ve} je ranije nagla{eno da se u stanicama ranog embrija stani~ni ciklus odvija bez rasta stanice. Oplo|eno se jaje vrlo brzo dijeli u manje stanice (slika 14-2). Oocite razli~itih organizama variraju u pona{anju s obzirom na vremensko razdoblje do ponovnog nastavka mejoze i oplodnje. Kod nekih ìvotinja, oocite ostaju u diplotenu do oplodnje i samo u tom slu~aju mejoza se dovr{ava. Me|utim, oocite ve}ine kralje`njaka (uklju~uju}i i àbe, mi{eve, i ljude) nastavljaju mejozu kao odgovor na hormonalnu stimulaciju te nastavljaju proces mejoze I prije oplodnje. Dioba je stanice u mejozi I asimetri~na, pa se stvori jedno malo polarno tijelo i jedna velika oocita. Oocita zatim ulazi u mejozu II, a da se njezina jezgra nije oblikovala, niti su se kromopolarno tijelo zastoj u metafazi II
rast oocita zastoj u diplotenu
hormonalna stimulacija dovr{enje mejoze I
Slika 14-37. Mejoza oocita kralje`njaka.

Mejoza je zaustavljena u diplotenu gdje oocite rastu do velikih dimenzija. Oocite zatim nastavljaju mejozu potaknute hormonalnom stimulacijom i zavr{avaju prvu mejoti~ku diobu asimetri~nom citokinezom te nastaje malo polarno tijelo. Kod ve}ine kralje`njaka oocite se ponovno zaustavljaju u metafazi II.
Stani~ni ciklus
619
diploten
metafaza I
metafaza II
Slika 14-38. Aktivnost MPF tijekom mejoze oocita.

Hor monalna stimulacija oocita u diplotenu aktivira MPF {to dovodi do napredovanja u metafazu I. Aktivnost MPF smanjuje se samo djelomi~no na prjelasku iz metafaze I u anafazu I, pa oocite ostaju u M-fazi. Nakon dovr{enja mejoze I, aktivnost MPF ponovno raste i ostaje visokom za vrijeme zastoja u metafazi II.
MPF
hormonska stimulacija
citokineza
zastoj u metafazi II
G2
somi dekondenzirali. Kod ve}ine kralje`njaka, razvoj oocita se ponovno zaustavlja na stupnju metafaze II gdje miruju do oplodnje. Kao i M-fazu stani~noga ciklusa somatskih stanica, mejozu oocita kontrolira MPF. Regulacija MPF tijekom mejoze oocita, me|utim, pokazuje jedinstvena obilje`ja koja poti~u napredovanje iz mejoze I u mejozu II i zastoj u metafazi II (slika 14-38). Hormonalna stimulacija u diplotenu zaustavljenih oocita poti~e nastavljanje mejoze aktiviranjem MPF, kao {to se doga|a i kod somatskih stanica na prjelasku iz G2 u M-fazu. Kao i u mitozi, MPF zatim utje~e na kondenzaciju kromosoma, raspad jezgrine ovojnice i formiranje diobenoga vretena. Aktiviranje kompleksa koji poti~e anafazu dovodi do prjelaska iz metafaze u anafazu mejoze I, uz smanjenje aktivnosti MPF. No, nasuprot mitozi, aktivnost MPF smanjuje se samo djelomi~no, tako da oocita ostaje u M-fazi, kromatin ostaje kondenziran, a jezgrina se ovojnica ne formira. Nakon citokineze aktivnost MPF ponovno raste i ostaje na visokoj razini za cijelo vrijeme dok je jaje zaustavljeno u metafazi II. Mehanizam regulacije mejoze oocita jedinstven je po tome {to odràva visoku aktivnost MPF tijekom prjelaska iz metafaze u anafazu mejoze I i zastoja u metafazi II, ne dopu{taju}i deaktivaciju MPF koja bi se dogodila zbog djelovanja proteolize ciklina B tijekom normalne M-faze. Faktor zastoja koji djeluje u metafazi II, otkrili su 1971. godine Yoshio Masui i Clement Markert tijekom eksperimenata s pomo}u kojih su otkrili MPF. U ovom slu~aju, me|utim, citoplazma iz jajne stanice koja je zaustavljena u metafazi II, ubrizgana je u stanicu ranog embrija koja je prolazila
progesteron jajna stanica u metafazi II
mikroubrizgavanje citoplazme dvostani~ni embrij
G2
Slika 14-39. Identifikacija citostati~koga faktora.

Citoplazma iz jajne stanice koja se nalazi u metafazi II, ubrizgana je u jednu stanicu dvostani~nog embrija. Stanica embrija u koju je ubrizgana citoplazma zaustavljena je u metafazi, dok se druga stanica nastavila dijeliti. Faktor koji se nalazi u citoplazmi jajne stanice u metafazi II (citostati~ki faktor) prouzro~io je zastoj u metafazi kod stanice u koju je ubrizgana citoplazma.
stanica u koju je ubrizgana citoplazma zaustavljena je u metafazi M
620
Poglavlje 14
Mos
Slika 14-40. Odràvanje aktivnosti MPF-a Mos protein-kinazom.

Mos protein-kinaza odràva aktivnost MPF-a dvojako stimuliraju}i sintezu ciklina B i inhibiraju}i degradaciju ciklina B kompleksom koji poti~e anafazu. Djelovanje Mos-a odvija se pomo}u MEK, ERK i Rsk protein -kinaze.
MEK
ERK
Rsk
sinteza ciklina B
kompleks koji poti~e anafazu
razgradnja ciklina B
kroz mitoti~ki stani~ni ciklus (slika 14-39). Ubrizgavanje jajne citoplazme prouzro~ilo je zaustavljanje stanice embrija u metafazi pokazuju}i da je zaustavljanje u metafazi potaknuo citoplazmatski faktor prisutan u jaju. Zbog svoje funkcije zaustavljanja mitoze, taj je faktor nazvan citostati~kim faktorom (CSF). Eksperimenti novijega datuma, otkrili su drugu protein-serin/treoninkinazu nazvanu Mos koja je bitna komponenta CSF. Mos se sintetizira na osobit na~in u oociti pri kraju mejoze I i potreban je u odràvanju aktivnosti MPF tijekom prjelaska iz metafaze u anafazu mejoze I, kao i tijekom zastoja u metafazi II. Djelovanje Mos nastaje kao posljedica aktivacije ERK MAP-kinaze koja igra klju~nu ulogu u stani~nim signalnim putevima prikazanim u prethodnom poglavlju. Me|utim, kod oocita ERK ima drugu funkciju; ERK aktivira jednu drugu protein-kinazu, nazvanu Rsk, koja podràva aktivnost MPF-a na dva na~ina: inhibiraju}i razgradnju ciklina B i stimuliraju}i sintezu ciklina B (slika 14-40). Na taj na~in Mos odràva aktivnost MPF tijekom mejoze oocita dovode}i ju do zastoja u metafazi II. U ovoj to~ki mejoti~koga stani~noga ciklusa oocite mogu ostati zaustavljene i nekoliko dana ~ekaju}i oplodnju.
Oplodnja
Kod oplodnje, spermij se veè na receptor koji se nalazi na povr{ini jaja, stapa se s membranom jajne stanice te zapo~inje razvoj novoga diploidnog organizma koji sadràva genske informacije koje potje~u od obaju roditelja (slika 14-41). Oplodnja ne samo da dovodi do mije{anja o~evih i maj~inih kromosoma, ve} tako|er poti~e brojne promjene u jajnoj citoplazmi, koje su bitne u daljnjem razvoju. Ove promjene aktiviraju jaje, dovode do zavr{etka mejoze oocite i zapo~inju mitoti~ki stani~ni ciklus u ranom embriju. Klju~ni signal, koji nastaje zbog vezanja spermija na receptor na membrani jaja, jest pove}anje razine Ca2+ u jajnoj citoplazmi, {to je posljedica stimulacije hidrolize fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfata (PIP2) (slika 13-27). Zbog povi{enja unutarstani~ne razine Ca2+ na povr{ini stanice doga|aju se promjene koje sprje~avaju drugim spermijima ulazak u jaje. Jajna je stanica obi~no izloèna velikom broju spermija u jednom trenutku, pa su ove promjene bitan element koji omogu}uje formiranje normalnoga diploidnog embrija. Pretpostavlja se da su te promjene na povr{ini barem djelomi~no posljedica ionima kalcija potaknute egzocitoze sekretornih vezikula koje se u velikom broju nalaze ispod membrane jajne stanice. Osloba|anje sadràja tih vezikula mijenja izvanstani~ni omota~ jajne stanice tako da on sad onemogu}ava svaki daljnji ulazak spermija. Nakon oplodnje, povi{enje citosolnog Ca2+ ozna~uje zavr{etak mejoze (slika 14-42). U jajnoj stanici zaustavljenoj u metafazi II, prjelazak iz metafaze u anafazu poti~e o Ca2+-ovisna aktivacija kompleksa koji poti~e anafazu. Deaktivacijom MPF zavr{ava se druga mejoti~ka dioba asimetri~nom citokinezom (kao i kod mejoze I) stvaraju}i drugo malo polarno tijelo. Nakon dovr{enja mejoze oocite, oplo|eno jaje (sada nazvano zigota) sadràva dvije haploidne jezgre (nazvane pronukleusi), po jednu od sva-
10 mm
Slika 14-41. Oplodnja

Slika ljudskoga sper mija pri oplodnji jaja (pretra`na elektronska mikroskopija) (David M. Philips / Visuals Unlimited.)
Stani~ni ciklus
621
Slika 14-42. Oplodnja i dovr{enje mejoze.

Oplodnja poti~e prjelazak iz metafaze II u anafazu II, dovr{ava se mejoza oocita i nastaje drugo polarno tijelo (koje obi~no degenerira). Jezgra spermija dekondenzira se tako da oplo|eno jaje (zigota) sadràva dvije haploidne jezgre (mu{ki i ènski pronukleus). Kod sisavaca, pronukleusi repliciraju svoju DNA za vrijeme dok putuju jedan prema drugomu. Zatim zapo~inje mitoza, a mu{ki i ènski kromosomi poslaù se na zajedni~kom diobenom vretenu. Dovr{enjem mitoze i citokinezom nastaje dvostani~ni embrij, gdje svaka stanica sadràva diploidni genom.
jajna stanica u metafazi II
spermij
dovr{enje mejoze II jajne stanice
kog roditelja. Kod sisavaca, dva pronukleusa tada ulaze u S-fazu i dolazi do replikacije DNA dok putuju jedan prema drugom. Kad se susretnu, zigota ulazi u M-fazu prve mitoti~ke diobe. Obje se jezgrine ovojnice raspadaju i kondenzirani kromosomi obaju roditelja poslaù se na zajedni~kom diobenom vretenu. Dovr{enjem mitoze nastaju dvije stanice embrija, od kojih svaka sadràva novi diploidni genom. Stanice zatim zapo~inju seriju stani~nih dioba {to kona~no dovodi do razvitka novog organizma.
zigota drugo polarno tijelo mu{ki i ènski pronukleus
sinteza DNA
Mati~ne stanice i odràvanje odrasloga tkiva

Rani razvoj obiljeàva vrlo brza proliferacijae mbrionalnih stanica koje se zatim diferencijaciraju kako bi stvorile mnoge posebne vrste stanica koje grade tkiva i organe vi{estani~nih ìvotinja. Kako se stanice diferenciraju, njihova se brzina proliferacija smanjuje i ve}ina stanice u odrasle se ìvotinje zaustavlja u G0-fazi stani~noga ciklusa. Neke se vrste diferenciranih stanica vi{e nikada ne dijele i ne mogu biti zamijenjene ako propadnu tijekom ìvota organizma. No, u mnogim se tkivima nalaze stanice koje mogu obnoviti proliferaciju kad je potrebno nadomjestiti stanice koje su izgubljene zbog o{te}enja ili stani~ne smrti. [tovi{e, neka tkiva sadràvaju stanice koje se dijele cijeloga ìvota i zamjenjuju stanice koje brzo propadaju u odrasle ìvotinje. Na taj se na~in pa`ljivo odràva ravnoteà izme|u proliferacije i stani~ne smrti u svrhu odrànja konstantnog broja stanica u odraslim tkivima i organima.
ulazak u M-fazu
o~evi i maj~ini kromosomi poredani na diobenom vretenu
Proliferacija diferenciranih stanica

Stanice odrasle ìvotinje mogu se podijeliti u tri osnovne skupine s obzirom na stani~nu proliferaciju i njihovu zamjenu. Neke vrste diferenciranih stanica, kao stanice sr~anog mi{i}a u ~ovjeka, nemaju sposobnost stani~ne diobe i ne mogu se zamijeniti u slu~aju ozljede ili stani~ne smrti. Ove su stanice nastale tijekom embrionalnoga razvoja, diferencirale su se i takve se zadràvaju tijekom cijeloga ìvota organizma. Druge vrste diferenciranih stanica zadràvaju sposobnost proliferacije. One ulaze u G0-fazu stani~noga ciklusa, ali imaju sposobnost nastavka proliferacije ako je to potrebno zbog zamjene stanica koje su ozlije|ene ili su umrle. U stanice toga tipa ubrajamo ko`ne fibroblaste, stanice glatkih mi{i}a, endotelne stanice koje oblaù krvne ìle i epitelne stanice nekih unutarnjih organa, kao primjerice jetre. Primjer je kontrolirane proliferacije stanica ove skupine, ve} obja{njen u ovom poglavlju, brza proliferacija ko`nih fibroblasta kako bi se popravila {teta nastala zbog povrede. Drugi su primjer stanice jetre koje se normalno dijele vrlo rijetko. Ipak, u okolnostima kad je velik broj stanica uni{ten (npr. zbog kirur{kog uklanjanja dijela jetre) preostale su stanice stimulirane na proliferaciju kako bi nadomjestile tkivo koje nedostaje. Primjerice, kod {takora, nakon kirur{kog uklanjanja 2/3 jetara, dolazi do vrlo brze proliferacije te potpune regeneracije kompletne jetre unutar nekoliko dana.
dvostani~ni embrij
622
Poglavlje 14
K L J U ^ I P O KU S
Kultura embrionalnih mati~nih stanica

Izolation of a Pluripotent Cell Line from Early Mouse Embryos Cultured in Medium Conditioned by Teratocarcinoma Stem Cells Gail R. Martin
University of California, San Francisco, CA Proceedings of the National Academy of Science, USA, 1981, Volume 78, pages 76347638
Kontekst
Stanice ranog embrija jedinstvene su po svojoj sposobnosti proliferacije i diferencijacije u sve tipove stanica koje ~ine sastavni dio tkiva i organa odrasle ìvotinje. Godine 1970. otkriveno je da se rani embrij mi{a ~esto razvija u tumor ako je izva|en iz maternice i premje{ten u neprimjerenu okolinu. Tumori, nazvani teratokarcinomi, sadràvaju stanice koje imaju sposobnost stvaranja mno{tva razli~itih tkiva dok rastu u ìvotinji. [tovi{e, nediferencirane stanice teratokarcinoma (nazvane stanicama embrionalnog karcinoma) mogu se izolirati i uzgajati u kulturi tkiva. One sli~e nor malnim stanicama embrija i u kulturi ih se moè potaknuti
na diferencijaciju u razli~ite tipove stanica. Neke stanice embrionalnog karcinoma mogu tako|er sudjelovati u nor malnom razvoju mi{a, u slu~aju kad su unesene u rani embrij mi{a (blastocitu) koji se zatim implantira u majku-hraniteljicu. Sposobnost stanica embrionalnog karcinoma za diferencijaciju u razli~ite tipove stanica i sudjelovanje u nor malnom razvoju mi{a navodi na pretpostavku da bi od tumora potekle stanice mogle biti vrlo bliske nor malnim mati~nim stanicama embrija. Me|utim, doga|aji koji su se odvijali tijekom razvoja teretokarcinoma u mi{a bili su nepoznati. Gail Martin postavila je hipotezu da su stanice embrionalnog karcinoma pro-
Gail R. Martin
na|ene u teratokarcinomu u su{tini nor malne stanice embrija kod kojih je do{lo do nepravilne proliferacije zbog izmje{tanja iz mater nice u neprikladnu sredinu pa nisu dobile prikladne signale za nor malnu diferencijaciju. Temeljeno na toj pretpostavci, poku{ala je uzgojiti stanice iz embrija mi{a, s ciljem izolacije normalnih linija embrionalnih mati~nih stanica. Njezini eksperimenti, zajedno sa sli~nim radovima Martina Evansa i Matthewa Kaufmana (Establishment in culture of pluripotential
mati~na stanica
dioba stanice
Ve}ina posve diferenciranih stanica nemaju vi{e sposobnost dijeljenja, ali one mogu bit zamjenjene proliferacijom manje diferenciranih stanica, nazvanih mati~nim stanicama, koje su prisutne u tkivima odrasle ìvotinje. Mati~ne stanice imaju odlu~uju}u ulogu u odràvanju odraslog tkiva zbog svoje sposobnosti odràvanja proliferacije i zamjene diferenciranih stanica tijekom cijeloga ìvota ìvotinje.
Mati~ne stanice
Glavno je svojstvo mati~nih stanica da diobom stvaraju stanice-k}eri koje se zatim mogu ili diferencirati ili ostati mati~ne stanice (slika 14-43). Budu}i da mati~ne stanice dijeljenjem stvaraju nove mati~ne stanice kao i diferencirane stanice-k}eri, one su samoobnavljaju}a populacija koja sluì kao izvor za produkciju diferenciranih stanica tijekom ~itavog ìvota. Njihova je ulo-
stani~na diferencijacija
diferencirana stanica
Slika 14-43. Proliferacija mati~ne stanice.

Stani~nom diobom mati~ne stanice nastaje jedna stanica-k}i koja ostaje mati~na stanica, i druga koja se diferencira (primjerice epitelna stanica crijeva).
Stani~ni ciklus
623
(A)
(B)
(C)
cells from mouse embryos, Nature, 1981, 292:154146) pokazali su da se mati~ne stanice mogu uzgojiti izravno od nor malnog embrija mi{a. Izolacija ovakvih embrionalnih stani~nih linija utrla je put geneti~koj manipulaciji i analizama razvoja mi{a, kao i mogu}oj uporabi mati~nih stanica ljudskog embrija u transplantacijskoj terapiji.
Eksperimenti
Temeljeno na premisi da stanice embrionalnog karcinoma potje~u od normalnih mati~nih stanica embrija, Gail Martin poku{ala je uzgojiti stanice od nor malne blastocite mi{a. Po~ev{i sa stanicama od oko 30 embrija, nakon tjedan dana kulture izolirala je ~etiri kolonije stanica. Ove su se stanice mogle opetovano presa|ivati u kulturi, a prilikom ponavljanja eksperimenta s dodatnim brojem embrija reproducibilno su se mogle izdvojiti nove stani~ne linije. Stani~ne linije koje proistje~u od nor malnih embrija (embrionalne mati~ne stanice) vrlo su sli~ne karcinomskim stanicama embrija koje potje~u od tumora. Najva`nije je bilo
da su se mati~ne stanice mogle, u kulturi, potaknuti na diferencijaciju i time nastaju razli~iti tipovi stanica, u koje uklju~ujemo endoder malne stanice, hrskavi~ne stanice i stanice sli~ne neuronima (vidi sliku). [tovi{e, ako su embrionalne mati~ne stanice unesene u mi{a, one formiraju tumore koji sadràvaju nekoliko diferenciranih tipova stanica. Prema tomu, mati~ne stani~ne linije embrija, koje zadràvaju sposobnost diferencijacije u razli~ite tipove stanica, mogu se uzgojiti u kulturi od normalnih embrija mi{a.
Zametne se mati~ne stanice diferenciraju u kulturi u razli~ite tipove stanica, kao {to su stanice sli~ne neuronu (A), endodermalne stanice (B) i stanice hrskavice (C).
Utjecaj
Uspostavljanje embrionalnih mati~nih stani~nih linija izvr{ilo je velik utjecaj na prou~avanje genetike i razvoja mi{a, kao i otvaranje novih mogu}nosti u lije~enju razli~itih ljudskih bolesti. Kasniji eksperimenti pokazali su da mati~ne stanice embrija mogu sudjelovati u nor malnom razvitku mi{a nakon uno{enja u embrij mi{a. Po{to se tehnike genskoga transfera mogu primijeniti kod uvo|enja mutiranih gena u kulturu embrionalnih
mati~nih stanica, one se koriste u istraìvanju uloge raznih gena u razvoju mi{a. Kako smo objasnili u 3. poglavlju, bilo koji gen moè se deaktivirati u embrionalnim mati~nim stanicama homolognom rekombinacijom s kloniranom DNA, a uloga toga gena u razvoju mi{a odrediti uvo|enjem ovako promijenjenih mati~nih stanica embrija u embrij mi{a. Dvije skupine znanstvenika godine 1998. razvile su pr ve linije ljudskih embrionalnih mati~nih stanica. Zbog velike sposobnosti proliferacije i diferencijacije, ove stanice daju nadu u provo|enje novih terapija u lije~enju razli~itih bolesti. Iako postoji jo{ mnogo tehni~kih problema, kao i osjetljivih eti~kih pitanja, transplantacijske terapije bazirane na uporabi embrionalnih mati~nih stanica daju velike mogu}nosti u lije~enju bolesti, kao {to su Parkinsonova, Alzheimerova bolest, dijabetes i ozljede kralje`ni~ne mo`dine.
ga posebno uo~ljiva kod nekih tipova diferenciranih stanica, kao {to su krvne stanice, epitelne stanice koè i epitelne stanice koje oblaù probavni trakt koje imaju kratak ìvotni vijek te se zamjenjuju kontinuiranom stani~nom proliferacijom u odrasle ìvotinje. U svim navedenim slu~ajevima, potpuno diferencirane stanice ne proliferiraju same, ve} se neprestano obnavljaju s pomo}u proliferacije mati~nih stanica koje se zatim diferenciraju i tako odràvaju stabilan broj diferenciranih stanica. Krvne su stanice dobar primjer koji pokazuje ulogu mati~nih stanica u odràvanju diferencirane stani~ne populacije. Postoji nekoliko vrsta krvnih stanica i svaka ima svoju specifi~nu funkciju: eritrociti (crvene krvne stani-
624
Poglavlje 14
Slika 14-44. Formiranje krvnih stanica.

Sve razli~ite vrste krvnih stanica razvijaju se od jedne pluripotentne mati~ne stanice u ko{tanoj srì. Prete~e diferenciranih, stanice prolaze kroz nekoliko ciklusa stani~ne diobe i pri tome sazrijevaju. Stani~na proliferacija prestaje u zavr{noj fazi diferencijacije.
ce) prenose O2 i CO2; granulociti i makrofagi su fagocitne stanice; trombociti (dijelovi megakariocita) imaju ulogu u zgru{avanju krvi, a limfociti sudjeluju u imunoodgovoru. @ivotni vijek ovih krvnih stanica ograni~enog je trajanja, u rasponu od manje od dana, do nekoliko mjeseci. One kontinuirano nastaju diobom jedne zajedni~ke pluripotentne mati~ne stanice u ko{tanoj srì (slika 14-44). Potomci pluripotentne mati~ne stanice zatim prolaze kroz razli~ite diferencijacije. Nastavljaju s proliferacijom i prolaze nekoliko dioba do potpune diferencijacije. Me|utim, kada postanu potpuno diferencirane, prestaju s proliferacijom, tako da odràvanje populacije diferenciranih krvnih stanica ovisi o stalnoj proliferaciji pluripotentne mati~ne stanice.
Medicinska primjena mati~nih stanica
Stani~ni ciklus
625
Slika 14-45. Mogu}a primjena embrionalnih mati~nih stanica u kloniranju za terapijske svrhe.
U kloniranju za terapijske svrhe jezgra bi zrele somatske stanice bila transferirana u oocitu kojoj je izva|ena njezina jezgra te bi se uzgojio rani embrij. Embrionalne bi se mati~ne stanice (ES) derivirale i zatim bi se mogle upotrijebiti za transplantacijsko lije~enje. Budu}i da su ES-stanice genski identi~ne primatelju transplantata (koji je ujedno i donator jezgre zrele somatske stanice) na taj bi na~in bile izbjegnute komplikacije imunolo{kog odbacivanja.
odrasla somatska stanica bolesnika transfer odrasle jezgre u oocitu
Budu}i se mati~ne stanice repliciraju i diferenciraju te na taj na~in stvaraju razli~ite vrste stanica, njihova je velika vrijednost u mogu}oj medicinskoj primjeni. Na primjer, mogu}a je njihova uporaba u lije~enju raznih ljudskih bolesti i obnavljanju o{te}enoga tkiva. Mati~ne stanice s naj{irom sposobno{}u diferencijacije jesu embrionalne mati~ne stanice (ES-stanice) koje se nalaze u ranom embriju i od njih mogu nastati sve vrste diferenciranih stanica odraslog organizma. U 3. poglavlju objasnili smo da se ove stanice mogu uzgojiti iz embrija mi{a te uporabiti za uvo|enje promijenjenih gena u mi{a (slika 3-36). Godine 1998. dvije su skupine istraìva~a izvijestile o postignu}u izolacije ES-stanica iz ljudskog embrija i time otvorile mogu}nost uporabe ljudskih mati~nih stanica u medicinskoj primjeni. To se dogodilo nakon {to su 1997. godine istraìva~i uspjeli dokazati da iz jezgre zrele stanice moè nastati klonirana ìvotinja sposobna za ìvot (u ovom slu~aju janje), nakon transplantacije ove jezgre u citoplazmu oocite. Postupak transfera jezgre somatske stanice odraslog organizma u oocitu kasnije se koristio za stvaranje kloniranog potomstva razli~itih vrsta ìvotinja ovce, mi{evi, svinje, goveda, koze, ze~evi i ma~ke. Kako se embrionalne mati~ne stanice mogu izolirati iz embrija koji je nastao transferom zrele jezgre u oocitu, ovo je dovelo do mogu}nosti terapijskog kloniranja (slika 14-45). U terapijskom kloniranju, jezgra iz odrasle ljudske stanice mogla bi se transferirati u oocitu koja bi se upotrijebila za proizvodnju ranog embrija. Uzgojene ES-stanice iz kloniranog embrija, zatim bi se, u na~elu, mogle dalje razvijati u odre|ene tipove diferenciranih stanica u svrhu transplantacijske terapije. Diferencirane stanice dobivene ovom procedurom bile bi geneti~ki identi~ne primatelju transplantata (koji je ujedno i donator jezgre odrasle somatske stanice) te bi se na taj na~in izbjegle mogu}e komplikacije imunolo{kog odbacivanja. Mogu}nost ovakve transplatacijske terapije nudi nadu u lje~enje razli~itih razornih poreme}aja i bolesti, kao {to je Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest, dijabetes i ozljede kralje`ni~ne mo`dine. Iako su postignuti odre|eni uspjesi kod ìvotinjskih modela, da bi se kloniranje u terapijske svrhe primijenilo na ljude potrebno je svladati jo{ mnoge prepreke. Potrebno je bitno pobolj{ati postupak stvaranja embrija prijenosom jezgre i razviti na~ine koji pouzdano diferenciraju ES-stanice u to~no odre|ene tipove stanica prije transplantacije. Razvoj kloniranja u terapijske svrhe poti~e vrlo va`na eti~ka pitanja, ne samo s obzirom na mogu}nost kloniranja ljudi
kultura ranog embrija
blastocita
kultura embrionalnih mati~nih stanica
diferencijacija u èljenu vrstu stanica za transplantaciju
S A @ E TA K STANI^NI CIKLUS EUKARIOTSKE STANICE

Faze stani~noga ciklusa: Stani~ni ciklus eukariota podijeljen je u ~etiri zasebne faze: M, G1, S i G2. M-faza se sastoji od mitoze, iza koje obi~no slijedi citokineza. U S-fazi doga|a se replikacija DNA.
KLJU^NI POJMOVI
mitoza, interfaza, citokineza, M--faza, G1-faza, S-faza, G2-faza, G0-faza, proto~ni citometar
626
Poglavlje 14
START, restrikcijska to~ka
Djelovanje stani~noga rasta i izvanstani~nih signala u regulaciji stani~noga ciklusa: Izvanstani~ni signali i veli~ina stanice reguliraju napredovanje kroz posebne kontrolne to~ke stani~noga ciklusa. Kontrolne to~ke stani~noga ciklusa: Kontrolne to~ke i povratna kontrola koordiniraju doga|aje tijekom razli~itih faza stani~noga ciklusa i zaustavljaju napredovanje kroz stani~ni ciklus u slu~aju o{te}enja DNA. Ograni~avanje na samo jednu replikaciju DNA tijekom stani~noga ciklusa: Nakon replikacije DNA, po~etak nove S-faze odlaè se dok stanica ne pro|e kroz mitozu.
kontrolna to~ka stani~noga ciklusa, p53
REGULATORI STANI^NOGA NAPREDOVANJA KROZ CIKLUS

faktor poticanja sazrijevanja (MPF), Cdc2, ciklin G1-faza, ciklin, Cln, Cdk inhibitor Cdk (CKI)
MPF: Dimer Cdc2 i ciklina: MPF je klju~na molekula odgovorna za regulaciju prjelaska iz G2 u M-fazu kod svih eukariota. MPF je dimer ciklina B i Cdc2 protein-kinaze. Porodice ciklina i kinaza ovisnih o ciklinima: Odre|eni parovi ciklina i s Cdc2 srodnih protein-kinaza reguliraju napredovanje kroz razli~ite faze stani~noga ciklusa. Aktivnost Cdk regulira se spajanjem s ciklinima, aktiviraju}om i inhibitornom fosforilacijom i vezanjem Cdk inhibitora. Faktori rasta i ciklini D-tipa: Faktori rasta stimuliraju proliferaciju ìvotinjske stanice poticanjem sinteze ciklina tipa D. Kompleksi Cdk4,6/ciklin D zatim vode stanicu kroz restrikcijsku to~ku u G1-fazu. Klju~ni supstrat kompleksa Cdk4,6/ciklin D je tumor-supresorski protein Rb, koji regulira transkripciju gena potrebnih za napredovanje kroz stani~ni ciklus. Inhibitori napredovanja kroz stani~ni ciklus: O{te}enje DNA i razli~iti izvanstani~ni signali inhibiraju napredovanje kroz stani~ni ciklus. Ovi inhibicijski faktori ~esto djeluju tako da induciraju sintezu Cdk-inhibitora.
Rb, tumor-supresorski gen, E2F
DOGA\AJI U M-FAZI
profaza, metafaza, anafaza telofaza, centromera, kinetohore, centrosomi, diobeno vreteno, prometafaza
Faze mitoze: Mitoza se uobi~ajeno razvrstava u ~etiri faze: profaza, metafaza, anafaza, i telofaza. Temeljni doga|aji u mitozi su: kondenzacija kromosoma, formiranje diobenoga vretena, raspad jezgrine ovojnice i povezivanje mikrotubula diobenoga vretena za kromosome na kinetohoru. Sestrinske se kromatide odvajaju i kre}u prema suprotnim polovima diobenoga vretena. Kona~no, jezgra se ponovno formira, kromosomi se dekondenziraju, a stanica se podijeli citokinezom. MPF i napredovanje do metafaze: M-faza zapo~inje aktivacijom MPF, koji fosforilira druge protein-kinaze, kao i jezgrine lamine i kondenzine. Aktivacija MPF poti~e kondenzaciju kromatina, raspad jezgrine ovojnice, fragmentaciju endoplazmatskog retikula i Golgijeva aparata te reorganizaciju mikrotubula za formiranje diobenoga vretena. Povezivanje mikrotubula diobenoga vretena za kinetohore sestrinskih kromatida dovodi do njihova raspore|ivanja u metafaznoj ravnini. Proteoliza i inaktivacija MPF: anafaza i telofaza: Aktivacija ubikvitin-ligaze nazvane kompleks koji poti~e anafazu dovodi do razgradnje klju~noga regulatornog proteina na prjelasku iz metafaze u anafazu. Ubikviti-
kinetohorni mikrotubuli, polarni mikrotubuli, astralni mikrotubuli
kompleks koji poti~e anafazu, kohezin
Stani~ni ciklus
627
nom-posredovana proteoliza, potaknuta aktivacijom kompleksa koji poti~e anafazu, dovodi do razgradnje kohezina, prekidaju}i veze izme|u sestrinskih kromatida na po~etku anafaze. Aktivacija kompleksa koji poti~e anafazu dovodi tako|er do razgradnje ciklina B i inaktivacije MPF zbog ~ega slijedi ponovno formiranje jezgrine ovojnice, dekondenzacija kromatina i povratak mikrotubula u interfazno stanje. Citokineza: Inaktivacija MPF poti~e citokinezu. U ìvotinjskim stanicama, citokineza je posljedica stezanja kontraktilnog prstena koji se sastoji od vlakana aktina i miozina. U stanicama vi{ih biljaka, citokineza se odvija formiranjem nove stani~ne stijenke i membrane unutar stanice.
kontraktilni prsten, stani~na plo~a
MEJOZA I OPLODNJA
Proces mejoze: Mejoza je poseban stani~ni ciklus kojim nastaju haploidne stanice-k}eri. Nakon jednokratne sinteze DNA, slijede dvije uzastopne diobe stanice. Tijekom mejoze I, homologni se kromosomi najprije sparuju, a zatim odvajaju u razli~ite stanice-k}eri. Mejoza II sli~i normalnoj mitozi u kojoj se odvajaju sestrinske kromatide. Regulacija mejoze oocita: Mejoza oocita kralje`njaka regulirana je u dvije jedinstvene to~ke stani~noga ciklusa: diplotenu mejoze I i metafazi mejoze II. Do zastoja u metafazi II dolazi zbog djelovanja protein-kinaze eksprimirane u oocite, a koja inhibira kompleks koji poti~e anafazu. Oplodnja: Oplodnja poti~e nastavak mejoze oocite s pomo}u o Ca2+-ovisne aktivacije kompleksa koji poti~e anafazu. Oplo|eno jaje sadràva dvije haploidne jezgre, koje formiraju novi diploidni genom i zapo~inju stani~ne diobe u zametku.
mejoza, leptoten, zigoten, pahiten, diploten, dijakineza, sinapsa, sinaptonemni kompleks
polarno tijelo, citostati~ki faktor (CSF), Mos
oplodnja, zigota, pronukleus
MATI^NE STANICE I ODR@AVANJE ODRASLOG TKIVA

Proliferacija diferenciranih stanica: Mnoge stanice u odrasle ìvotinje zaustavljene su u G0 -fazi stani~noga ciklusa. Nekoliko tipova diferenciranih stanica nemaju vi{e sposobnost proliferacije i ne mogu se nadomjestiti u slu~aju gubitka. Drugi tipovi diferenciranih stanica imaju sposobnost obnove proliferacije kako bi zamijenile stanice izgubljene zbog ozljede ili stani~ne smrti. Mati~ne stanice: Mnoge diferencirane stanice same ne proliferiraju, ve} se njihova zamjena obavlja proliferacijom mati~nih stanica. Diobom mati~ne stanice nastaje jedna stanica-k}i, koja se diferencira, i druga koja ostaje mati~na stanica. Medicinska primjena mati~nih stanica: Budu}i da proliferacijom i diferencijacijom mati~nih stanica mogu nastati razli~iti tipovi stanica, one mogu biti vrlo korisne kao izvor stanica u transplantacijskoj terapiji. Embrionalne mati~ne stanice imaju najve}i potencijal proliferacije i diferencijacije. U kombinaciji s postupcima prijenosa jezgre somatske stanice u oocite, mati~ne stanice pruàju mogu}nost terapijskog kloniranja u svrhu transplantacijskog lije~enja mnogih razornih bolesti.
mati~na stanica
embrionalne mati~ne stanice (ES stanice), terapijsko kloniranje, reproduktivno kloniranje
628
Poglavlje 14
Pitanja
1. Po ~emu su sli~ne stanice u G0 i G1-fazi? U ~emu se razlikuju? 2. Na primjeru stanice sisavca koja se dijeli svakih 30 sati, mikroskopsko promatranje pokazuje da je 3,3% stanica u mitozi u bilo koje vrijeme. Analize proto~nim citometrom dokazuju da 53,3% stanica imaju DNA sadràj 2n, 16,7% imaju DNA sadràj 4n, i 30% izme|u 2n i 4n. Odredi duljinu trajanja faza G1, S, G2 i M stani~noga ciklusa ovih stanica? 3. Radijacija uni{tava DNA i zaustavlja napredak stani~noga ciklusa u kontrolnim to~kama G1, S, i G2-faze. Zbog ~ega je to povoljno za o{te}ene stanice? 4. Kontrolna to~ka diobenoga vretena odga|a po~etak anafaze dok svi kromosomi nisu pravilno poredani u diobenom vretenu. [to bi se dogodilo u slu~aju propusta na kontrolnoj to~ki kad bi bio dopu{ten po~etak anafaze, iako je jedan kromosom jo{ uvijek vezan za mikrotubul samo jednog centrosoma? 5. Inhibitor Cdk p16 na poseban je na~in vezan za kompleks Cdk4,6/ciklin D. Koje bi bilo o~ekivano djelovanje prekomjerne ekspresije p16 u napredovanju kroz stani~ni ciklus? Bi li prekomjerna ekspresija p16 utjecala na stanice tumora s nedostatkom funkcionalnog proteina Rb? 6. In vitro mutagenezom klonirane laminske cDNAs stvoren je mutant otporan na fosforilaciju s pomo}u MPF. Na koji bi na~in ekspresija mutanta lamina utjecala na raspad jezgrine ovojnice na kraju profaze? 7. [to su supstrati za MPF ~ija fosforilacija ovisna o ciklinu B dovodi do ulaska u mitozu? 8. Stvoreni su mutanti ciklina B otporni na degradaciju kompleksom koji poti~e anafazu. Na koji bi na~in ekspresija ovih mutanata ciklina Bs utjecala na prjelazak iz metafaze u anafazu? 9. Primjenom homologne rekombinacije inaktivira se gen mos kod mi{a. Kakav bi bio o~ekivani rezultat u slu~aju primjene takvog postupka na mejozu oocita? 10. Na koji na~in oplo|eno jaje osigurava dugotrajnu blokadu kako ostala sperma ne bi u{la u jajnu stanicu? 11. [to je mati~na stanica?
Literatura
Eukariotski stani~ni ciklus
Abraham, R. T. 2001. Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes Dev. 15: 21772196. P Blow, J. J. and B. Hodgson. 2002. Replication licensingdefining the proliferative state? Trends Cell Biol. 12: 7278. P Elledge, S. J. 1996. Cell cycle checkpoints: Preventing an identity crisis. Science 274: 16641672. P Forsburg, S. L. and P Nurse. 1991. Cell cycle . regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Ann. Rev. Cell Biol. 7: 227256. P Hartwell, L. H. and T. A. Weinert. 1989. Checkpoints: Controls that ensure the order of cell cycle events. Science 246: 629634. P Levine, A. J. 1997. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88: 323331. P Lownds, N. F. and J. R. Murgia. 2000. Sensing and responding to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 10: 1725. P Norbury, C. and P Nurse. 1992. Animal cell . cycles and their control. Ann. Rev. Biochem. 61: 441470. P Nyberg, K. A., R. J. Michelson, C. W. Putnam and T. A. Weinert. 2002. Toward maintaining the genome: DNA damage and replication checkpoints. Ann. Rev. Genet. 36: 617 656. P Pardee, A. B. 1989. G1 events and the regulation of cell proliferation. Science 246: 603 608. P Paulovich, A. G., D. P Tocyski and L. H. Hart. well. 1997. When checkpoints fail. Cell 88: 315321. P Russell, P 1998. Checkpoints on the road to . mitosis. Trends Biochem. Sci. 23: 399402. P Tye, B. K. 1999. MCM proteins in DNA replication. Ann. Rev. Biochem. 68: 649686. P Vousden, K. H. 2002. Activation of the p53 tumor suppressor protein. Biochim. Biophys. Acta 1602: 4759. P Zhou, B.-B. S. and S. J. Elledge. 2000. The DNA damage response: Putting checkpoints in perspective. Nature 408: 433439. P Evans, T., E. T. Rosenthal, J. Youngbloom, D. Distel and T. Hunt. 1983. Cyclin: A protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell 33: 389396. I Hartwell, L. H., R. K. Mortimer, J. Culotti and M. Culotti. 1973. Genetic control of the cell division cycle in yeast: V. Genetic analysis of cdc mutants. Genetics 74: 267287. I King, R. W., R. J. Deshaies, J.-M. Peters and M. W. Kirschner. 1996. How proteolysis drives the cell cycle. Science 274: 1652 1659. P Koepp, D. M., J. W. Harper and S. J. Elledge. 1999. How the cyclin became a cyclin: Regulated proteolysis in the cell cycle. Cell 97: 431434. P Levine, A. J. 1997. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88: 323331. P Lohka, M. J., M. K. Hayes and J. L. Maller. 1988. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 30093013. I Masui, Y. and C. L. Markert. 1971. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. J. Exp. Zool. 177: 129146. I Millband, D. N., L. Campbell and K. G. Hardwick. 2002. The awesome power of multiple model systems: Interpreting the
Regulatori napredovanja kroz stani~ni ciklus

Abraham, R. T. 2001. Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes Dev. 15: 21772196. P Beach, D., B. Durkacz and P Nurse. 1982. . Functionally homologous cell cycle control genes in budding and fission yeast. Nature 300: 706709. I Dynlacht, B. D. 1997. Regulation of transcription by proteins that control the cell cycle. Nature 389: 149152. P
Stani~ni ciklus
629
complex nature of spindle checkpoint signaling. Trends Cell Biol. 12: 205209. P Morgan, D. O. 1997. Cyclin-dependent kinases: Engines, clocks, and microprocessors. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 261291. P Murray, A. 1995. Cyclin ubiquitination: The destructive end of mitosis. Cell 81: 149152. P Nyberg, K. A., R. J. Michelson, C. W. Putnam and T. A. Weinert. 2002. Toward maintaining the genome: DNA damage and replication checkpoints. Ann. Rev. Genet. 36: 617656. P Roberts, J. M. 1999. Evolving ideas about cyclins. Cell 98: 129132. P Russell, P 1998. Checkpoints on the road to . mitosis. Trends Biochem. Sci. 23: 399402. P Sagata, N. 2002. Untangling checkpoints. Science 298: 19051907. P Sherr, C. J. 1996. Cancer cell cycles. Science 274: 16721677. P Sherr, C. J. and J. M. Roberts. 1999. CDK inhibitors: Positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes Dev. 13: 1501 1512. P Smith, L. D. and R. E. Ecker. 1971. The interaction of steroids with Rana pipiens oocytes in the induction of maturation. Dev. Biol. 25: 232247. I Swenson, K. I., K. M. Farrell and J. V. Ruderman. 1986. The clam embryo protein cyclin A induces entry into M phase and the resumption of meiosis in Xenopus oocytes. Cell 47: 861870. I Vousden, K. H. 2002. Activation of the p53 tumor suppressor protein. Biochim. Biophys. Acta 1602: 4759. P Weinberg, R. A. 1995. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell 81: 323330. P
Hirano, T. 2002. The ABCs of SMC proteins: two-armed ATPases for chromosome condensation, cohesion, and repair. Genes Dev. 16: 399414. P King, R. W., P K. Jackson and M. W. Kirschner. . 1994. Mitosis in transition. Cell 79: 563 571. P McIntosh, J. R., E. L. Grishchuk and R. R. West. 2002. Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 18: 193219. P Murray, A. 1995. Cyclin ubiquitination: The destructive end of mitosis. Cell 81: 149152. P Nasmyth, K. 2002. Segregating sister genomes: The molecular biology of chromosome separation. Science 297: 559565. P Peters, J.-M. 2002. The anaphase-promoting complex: Proteolysis in mitosis and beyond. Mol. Cell 9: 931943. P Rieder, C. L. and E. D. Salmon. 1998. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol. 8: 310318. P Shorter, J. and G. Warren. 2002. Golgi architecture and inheritance. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 18: 379420. P Staehelin, L. A. and P K. Hepler. 1996. Cytoki. nesis in higher plants. Cell 84: 821824. P Wei, Y., L. Yu, J. Bowen, M. A. Gorovsky and C. D. Allis. 1999. Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99109. I
Roeder, G. S. 1997. Meiotic chromosomes: It takes two to tango. Genes Devel. 11: 2600 2621. P Sagata, N. 1996. Meiotic metaphase arrest in animal oocytes: Its mechanisms and biological significance. Trends Cell Biol. 6: 2228. P Tunquist, B. J. and J. L. Maller. 2003. Under arrest: Cytostatic factor (CSF)-mediated metaphase arrest in vertebrate eggs. Genes Dev. 17: 683710. P Villeneuve, A. M. and K. J. Hillers. 2001. Whence meiosis? Cell 106: 647650. P Wassarman, P M. 1999. Mammalian fertiliza. tion: Molecular aspects of gamete adhesion, exocytosis, and fusion. Cell 96: 175183. P
Mati~ne stanice i odràvanje odrasloga tkiva

Metcalf, D. 1992. Hemopoietic regulators. Trends Biochem. Sci. 17: 286289. P Michalopoulos, G. K. and M. C. DeFrances. 1997. Liver regeneration. Science 276: 6066. P Morrison, S. J., N. M. Shah and D. J. Anderson. 1997. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell 88: 287298. P Orkin, S. H. and S. J. Morrison. 2002. Stem-cell competition. Nature 418: 2527. P Shamblott, M. J., J. Axelman, S. Wang, E. M. Bugg, J. W. Littlefield, P J. Donovan, P . . D. Blumenthal, G. R. Huggins and J. D. Gearhart. 1998. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1372613731. I Thompson, J. A., J. Itskovitz-Eldor, S. S. Shapiro, M. A. Waknotz, J. J. Swiergiel, V. S. Marshall and J. M. Jones. 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 11451147. I Wilmut, I., N. Beaujean, P A. de Sousa, A. . Dinnyes, T. J. King, L. A. Paterson, D. N. Wells and L. E. Young. 2002. Somatic cell nuclear transfer. Nature 419: 583586. P Wilmut, I., A. E. Schnieke, J. McWhir, A. J. Kind and K. H. S. Campbell. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810813. I
Mejoza i oplodnja
Champion, M. D. and R. S. Hawley. 2002. Playing for half the deck: The molecular biology of meiosis. Nature Cell Biol. 4: S50 S56. P Evans, J. P and H. M. Florman. 2002. The state . of the union: The cell biology of fertilization. Nature Cell Biol. 4: S57S63. P Gilbert, S. F. 2003. Developmental Biology, 7th ed. Sunderland, MA: Sinauer Associates. Petronczki, M., M. F. Siomos and K. Nasmyth. 2003. Un mnage a quatre: the molecular biology of chromosome segregation in meiosis. Cell 112: 423440. P
Doga|aji u M-fazi
Earnshaw, W. C. and A. F. Pluta. 1994. Mitosis. BioEssays 16: 639643. P Finger, F. P and J. G. White. 2002. Fusion and . fission: Membrane trafficking in animal cytokinesis. Cell 108: 727730. P Glotzer, M. 2001. Animal cell cytokinesis. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 351386. P
Poglavlje
15
Rak
Nastanak i uzroci raka 631 Tumorski virusi 640 Onkogeni 644 Tumorski supresorski geni 657 Primjena molekularne biologije u sprje~avanju i lije~enju raka 664
protoonkogena 648
STI-571: lijek protiv raka usmjeren protiv bcr/abl onkogena 667
ove knjige jer nastaje kao posljedica sloma regulacijskih mehanizama koji upravljaju pona{anjem normalne stanice. Kao {to smo objasnili u prethodnim poglavljima, proliferacija, diferencijacija i preìvljavanje pojedina~ne stanice u vi{estani~nom je organizmu pa`ljivo regulirano tako da zadovoljava interese organizma kao cjeline. U stanicama raka te regulacije nema i one nekontrolirano rastu i dijele se, {ire}i se na posljetku po ~itavom tijelu i ometaju}i funkciju normalnih tkiva i organa. Budu}i da rak nastaje zbog poreme}aja temeljnih regulacijskih stani~nih mehanizama, bolest treba razumjeti na molekularnoj i stani~noj razini. Uistinu, molekularni i stani~ni biolozi ve} godinama poku{avaju razumjeti rak. Osim toga, istraìvanja stanica raka razjasnila su mehanizme koji upravljaju pona{anjem normalnih stanica. Zapravo su mnogi proteini koji imaju klju~nu ulogu u stani~noj signalizaciji, regulaciji stani~noga ciklusa i kontroli programirane stani~ne smrti otkriveni jer poreme}aji u njihovoj aktivnosti dovode do nekontrolirane proliferacije karakteristi~ne za stanice raka. Tako je istraìvanje raka zna~ajno pridonijelo na{em razumijevanju normalne regulacije stanica i obratno.
AK JE POSEBNO POGODNA TEMA ZA ZAVR[NO POGLAVLJE
Nastanak i uzroci raka

Osnovni poreme}aj koji dovodi do nastanka ove bolesti jest trajno poreme}ena proliferacija stanica raka. Umjesto da na odgovaraju}i na~in reagiraju na signale koji kontroliraju pona{anje normalnih stanica, stanice raka nekontrolirano rastu i dijele se, {ire}i se u normalna tkiva i organe i na posljetku po ~itavom tijelu. Generalizirani gubitak kontrole rasta karakteristi~an za stanice raka nastaje zbog nakupljanja poreme}aja razli~itih stani~nih regulacijskih sustava i odraàva se na razli~ite aspekte pona{anja po kojima se stanice raka razlikuju od odgovaraju}ih normalnih stanica.
Vrste raka
Rak moè nastati zbog poreme}aja proliferacije bilo koje vrste stanica u tijelu, tako da postoji vi{e od stotinu vrsta raka koji se jako razlikuju po pona{anju i odgovoru na lije~enje. Najva`nija stvar u patologiji raka jest razlikovati benigne
632
Poglavlje 15
Slika 15-1. Rak gu{tera~e.

Fotografija presjeka kroz gu{tera~u, na kojoj se vidi rak gu{tera~e, dobivena svjetlosnim mikroskopom. Stanice raka imaju tamnoljubi~aste jezgre i {ire se u nor malno tkivo (ruì~asto). (Astrid i Hanns-Frieder Michler/SPL/Photo Researchers, Inc.)
(dobro}udne) od malignih (zlo}udnih) tumora (slika 15-1). Tumor je izraz za svaku nenormalnu proliferaciju stanica u tijelu koja moè biti dobro}udna ili zlo}udna. Dobro}udni tumor, primjerice ko`na bradavica, ostaje ograni~en na mjesto na kojem je nastao, ne {iri se u susjedna normalna tkiva niti u udaljene dijelove tijela. Naprotiv, zlo}udni tumor je u stanju pro{iriti se na susjedna normalna tkiva i ~itavo tijelo preko krvoìlnoga ili limfati~koga sustava (metastaze). Pojam rak odnosi se samo na zlo}udne tumore, a njihova sposobnost da se {ire i metastaziraju ~ini ih tako opasnima. Dok je dobro}udne tumore obi~no mogu}e kirur{ki ukloniti, zlo}udne se tumore zbog {irenja u udaljene dijelove tijela ~esto ne moè izlije~iti ovakvim lokalnim metodama lije~enja. I dobro}udni i zlo}udni tumori klasificiraju se prema vrsti stanica iz kojih nastaju. Ve}ina ih se moè svrstati u jednu od tri glavne skupine: karcinome, sarkome i leukemije ili limfome. Karcinomi, na koje otpada otprilike 90% slu~ajeva raka u ljudi, zlo}udne su bolesti epitelnih stanica. Sarkomi, rijetki u ljudi, solidni su tumori vezivnih tkiva poput mi{i}a, kosti, hrskavi-
Tablica15-1. Naj~e{}e vrste raka u SAD-u

Vrsta raka
prostata dojka plu}a debelo i zavr{no crijevo limfomi mjehur koà (melanom) maternica bubreg gu{tera~a leukemije 11 naj~e{}ih sveukupno
Broj slu~ajeva godi{nje

220.900 (16,6%) 212.600 (15,9%) 171.900 (12,9%) 147.500 (11,1%) 61.000 (4,6%) 57.400 (4,3%) 54.200 (4,1%) 52.300 (3,9%) 31.900 (2,4%) 30.700 (2,3%) 30.600 (2,3%) 1,071.000 (80,3%) 1,334.100 (100%)
Broj umrlih godi{nje

28.900 (5,2%) 40.200 (7,2%) 157.200 (28,2%) 57.100 (10,3%) 24.700 (4,4%) 12.500 (2,2%) 7.600 (1,4%) 10.900 (2,0%) 11.900 (2,1%) 30.000 (5,4%) 21.900 (3,9%) 402.900 (72,4%) 556.500 (100%)
Izvor: Ameri~ko dru{tvo za rak, Cancer Facts and Figures 2003.
Rak
633
Slika 15-2. Klonalnost tumora.

Normalna tkiva su mozaik stanica u kojima su inaktivirani razli~iti X kromosomi (X1 i X2). Tumori nastaju iz jedne promijenjene stanice, tako da je u svim tumorskim stanicama inaktiviran isti X kromosom (X1 inaktivan, X2 aktivan).
X1 X2
X2 X1 X1 X2
X1 X2
inaktivan
aktivan X2 X1
X2
ce i veziva u uèm smislu. Leukemije i limfomi, na koje otpada otprilike 7% zlo}udnih bolesti u ljudi, nastaju iz krvotvornih stanica i iz stanica imunosustava. Tumori se dalje klasificiraju prema tkivu iz kojeg nastaju (primjerice karcinom plu}a ili dojke) i vrsti zahva}enih stanica. Primjerice, fibrosarkomi nastaju iz fibroblasta, a eritroidne leukemije iz prete~a eritrocita (crvenih krvnih stanica). Iako postoji puno razli~itih vrsta raka, samo neke su ~este (tablica 15-1). U SAD-u se godi{nje dijagnosticira vi{e od milijun novih slu~ajeva, a vi{e od 500.000 Amerikanaca umire svake godine od raka. Vi{e od 80% svih novih slu~ajeva potje~e iz 11 razli~itih dijelova tijela. êtiri naj~e{}e vrste raka, na koje otpada preko polovine slu~ajeva, jesu rak prostate, dojke, plu}a i debeloga crijeva. Rak plu}a je najsmrtonosniji i uzrokuje skoro 30% svih smrtnih slu~ajeva.
X1
nastanak tumora
X1 X2
X2 X1 X1 X2
X1 X2
X2 X1
X2 X1 X2 X1 X2 X1
X2 X1 X2 X1
X2 tumorsko tkivo X1
Nastanak raka
Jedno od temeljnih svojstava raka je klonalnost tumora, nastanak tumora iz jedne stanice koja po~inje nenormalno proliferirati. Da mnogi tumori nastaju iz jedne stanice, pokazala je analiza inaktivacije X kromosoma (slika 15-2). Kako je obja{njeno u 6. poglavlju, u ènskim se stanicama jedan od dvaju X kromosoma promijeni u heterokromatin i tako inaktivira. Inaktivacija X kromosoma je slu~ajan doga|aj koji se doga|a tijekom embrionalnoga razvoja, tako je u nekim stanicama inaktiviran jedan, a u drugima drugi X kromosom. Prema tome, ako je èna heterozigot za neki gen s X kromosoma, u razli~itim }e stanicama biti eksprimirani razli~iti aleli. Normalna se tkiva sastoje od mje{avine stanica s razli~itim inaktiviranim X kromosomima pa se u normalnim tkivima heterozigotne ène nalazi ekspresija obaju alela. Za razliku od toga, u tumorskim se tkivima op}enito nalazi ekspresija samo jednog alela heterozigotnih gena s X kromosoma. Iz toga se moè zaklju~iti da su sve tumorske stanice nastale iz jedne, u kojoj je inaktivacija X kromosoma bila zavr{ena prije nego {to je po~eo rast tumora. Klonalno podrijetlo tumora, me|utim, ne implicira da je ishodi{na stanica u po~etku stekla sve zna~ajke stanice raka. Naprotiv, nastanak raka je proces koji se sastoji od vi{e koraka tijekom kojih stanice zbog niza progresivnih promjena postupno postaju zlo}udne. Jedna od naznaka da se radi o procesu koji se sastoji od vi{e koraka jest ~injenica da se ve}ina slu~ajeva raka pojavljuje u kasnijoj ìvotnoj dobi. Primjerice, u~estalost raka debeloga crijeva pove}ava se vi{e od deset puta u razdoblju izme|u 30. i 50. godine ìvota i jo{ deset puta izme|u 50. i 70. (slika 15-3). Takvo dramati~no pove}anje u~estalosti raka pokazuje da ve}ina slu~ajeva raka nastaje nakupljanjem vi{e poreme}aja tijekom dugog niza godina. Na stani~noj razini nastanak raka moèmo promatrati kao proces koji se sastoji od vi{e koraka i uklju~uje mutacije i selekciju stanica sa sve izraènijim mogu}nostima proliferacije, preìvljavanja, {irenja i metastaziranja (slika 15-4). Vjeruje se da je prvi korak u ovom procesu, inicijacija tumora, rezultat geneti~ke promjene koja dovodi do abnormalne proliferacije jedne jedine stanice. Proliferacija stanica zatim dovodi do prekomjernoga rasta monoklonske populacije tumorskih stanica. Progresija tumora se nastavlja
500 godi{nja smrtnost (na milijun stanovnika)
400
300
200
100
20
40 60 dob (godina)
80
100
Slika 15-3. Pove}anje u~estalosti raka debeloga crijeva s dobi.

Godi{nja smrtnost od raka debeloga crijeva u SAD-u (Podatci iz: J. Cairns, 1978. Cancer: Science and Society, New York: W. H. Freeman.)
634
inicijacija
Poglavlje 15
Slika 15-4. Stupnjevi razvoja tumora.

Razvoj tumora zapo~inje poreme}enom proliferacijom jedne mutirane stanice. Dodatne mutacije i selekcija brè rastu}ih stanica u populaciji dovode do progresije tumora koji raste sve brè i postaje sve zlo}udniji.
proliferacija stanica progresija
mutacija
tumorskih stanica
s ve}im potencijalom za rast selekcija brè rastu}ih stanica
populacija promijenjenih stanica mutacija
nakupljanjem dodatnih mutacija u populaciji tumorskih stanica. Neke od njih, poput onih koje rezultiraju brìm rastom, dovode do selektivne prednosti stanice u kojoj su se pojavile i njezini potomci s vremenom postaju dominantna populacija u tumoru. Taj se proces naziva klonskom selekcijom jer novi klon tumorskih stanica nastaje zbog brèg rasta ili nekog drugog svojstva (poput sposobnosti preìvljenja, {irenja ili metastaziranja) koje mu omogu}uje selektivnu prednost pred drugim stanicama. U tumorima je klonska selekcija stalno prisutna, tako da oni postupno rastu sve brè i postaju sve zlo}udniji. Istraìvanja raka debeloga crijeva dala su jasan primjer progresije tijekom razvoja tumora u ljudi (slika 15-5). Najraniji stupanj u nastanku tumora jest pove}ana proliferacija epitelnih stanica debeloga crijeva. Od jedne stanice iz ove populacije koja proliferira nastaje mala dobro}udna novotvorina (adenom ili polip). Dodatne epizode klonske selekcije dovode do nastanka ve}ih adenoma s ve}im proliferativnim potencijalom. Zatim iz dobro}udnih adenoma nastaju zlo}udni karcinomi karakterizirani {irenjem tumorskih stanica kroz bazalnu laminu u susjedno vezivno tkivo. Stanice raka i dalje nastavljaju proliferirati i {ire se kroz vezivo vanjske stijenke debeloga crijeva. Na kraju stanice raka probijaju stijenku debeloga crijeva i {ire se u druge trbu{ne organe poput mokra}noga mjehura ili tankoga crijeva. Osim toga, stanice se raka {ire u krvne i limfne ìle {to im omogu}uje da metastaziraju {irom organizma.
raste jo{ brè
Uzroci raka
Tvari koje uzrokuju rak nazivaju se karcinogeni. Otkrivene su istraìvanjima na pokusnim ìvotinjama i epidemiolo{kom analizom u~estalosti pojedinih vrsta raka u odre|enim populacijama ljudi (primjerice, u~estalost raka plu}a visoka je u osoba koje pu{e cigarete). Budu}i da je nastanak zlo}udne bolesti sloèn proces koji se sastoji od vi{e koraka, mnogi ~imbenici mogu utjecati na vjerojatnost nastanka raka, pa je u ve}ini slu~ajeva pretjerano pojednostavnjeno govoriti o jednom uzroku raka. Bez obzira na to, mnogi agensi, uklju~uju}i zra~enje, kemikalije i viruse, uzrokuju rak u pokusnih ìvotinja i ljudi. Zra~enje i mnogo kemijskih karcinogena (slika 15-6) djeluje tako da o{te}uju DNA i induciraju mutacije. Karcinogeni, koji pridonose pojavi raka u ljudi, su, primjerice, Sun~evo ultraljubi~asto zra~enje (glavni uzrok raka koè), karcinogene kemikalije iz duhanskoga dima i aflatoksin (snaàn jetreni karcinogen koji stvaraju neke plijesni na neodgovaraju}e pohranjenim kikirikijima i drugim vrstama zrnja). Karcinogeni iz duhanskog dima (uklju~uju}i benzo(a)piren, dimetilnitrozamin i spojeve nikla) najva`niji su poznati uzroci raka u ljudi. Nema dvojbi da pu{enje uzrokuje 80 do 90% svih slu~ajeva raka plu}a, a uz to i rak usne {upljine, `drijela, grla, jednjaka i drugih organa. Sveukupno, procjenjuje se da je pu{enje odgovorno za skoro jednu tre}inu svih smrtnih slu~ajeva uzrokovanih rakom impresivna brojka za jedan jedini karcinogen. Drugi karcinogeni ne uzrokuju mutacije, ve} pridonose nastanku raka stimuliraju}i proliferaciju stanica. Takve spojeve nazivamo promotorima
selekcija
populacija promijenjenih stanica koje vrlo brzo rastu
Rak
635
Slika 15-5. Nastanak karcinoma debeloga crijeva.

Iz jedne promijenjene stanice nastaje populacija stanica koje proliferiraju. U toj populaciji dolazi do progresije, prvo u dobro}udni adenom koji polako raste, a potom u zlo}udni karcinom. Stanice raka prodiru u vezivno tkivo, krvne i limfne ìle i tako se {ire ~itavim tijelom.
bazalna lamina
jedna stanica koja proliferira
vezivno tkivo krvna ìla populacija stanica koje proliferiraju
tumora. Uzrokuju pove}anje broja dioba stanica {to omogu}uje stani~noj populaciji koja proliferira da u ranim fazama razvoja tumora preraste ostale stani~ne klonove. Klasi~an primjer su forbolni esteri koji stimuliraju proliferaciju stanica aktiviraju}i protein-kinazu C (vidi sliku 13-26). Na~in je njihova djelovanja razja{njen istraìvanjima kemijski induciranih ko`nih tumora u mi{eva (slika 15-7). U ovom modelu proces tumorogeneze zapo~inje jednim jedinim izlaganjem mi{eva mutagenim karcinogenima. Tumori, me|utim, ne nastaju ako se mi{evi nakon toga ne izloè promotoru tumora (obi~no forbolnom esteru) koji stimulira proliferaciju mutiranih stanica. Hormoni su, pogotovo estrogeni, va`ni promotori nastanka nekih vrsta raka u ljudi. Primjerice, estrogeni stimuliraju proliferaciju stanica endometrija, pa prekomjerno izlaganje estrogenima zna~ajno pove}ava vjerojatnost da }e èna dobiti rak trupa maternice. Tako dugotrajno nadomjesno lije~enje visokim dozama estrogena u postmenopauzi zna~ajno pove}ava rizik nastanka karcinoma trupa maternice. Na sre}u, rizik se moè smanjiti na minimum dodatkom progesterona, koji onemogu}uje stimulativni u~inak estrogena na proliferaciju stanica endometrija. Me|utim, nadomjesno hormonsko lije~enje kombinacijom estrogena i progesterona ipak pove}ava rizik pojave raka dojke. Osim kemikalija i zra~enja, rak u pokusnih ìvotinja i ljudi uzrokuju i neki virusi. U ljudi su naj~e{}e vrste raka , uzrokovane virusima, rak jetre i grli}a maternice koje zajedno ~ine 10 do 20% svih slu~ajeva raka u svijetu. Takvi virusi nisu va`ni samo kao uzro~nici raka; kako je obja{njeno dalje u ovom poglavlju, istraìvanja tumorskih virusa imala su klju~nu ulogu u razja{njavanju molekularnih mehanizama odgovornih za nastanak raka, kako onih induciranih virusima, tako i onih induciranih nevirusnim karcinogenima.
limfna ìla
mali adenom
srednji adenom
Svojstva stanica raka

Nekontrolirani rast stanica raka nastaje kao posljedica nakupljanja razli~itih poreme}aja {to djeluju na mnoge regulacijske stani~ne mehanizme o
veliki adenom i karcinom
O O aflatoksin {irenje u krvne i limfne ìle O O O CH3 dimetilnitrozamin C C Ni C C O O H3C H3C N N O benzo(a)piren
nikal-karbonil O O
Slika 15-6. Gra|a reprezentativnih kemijskih karcinogena.
636
Poglavlje 15
Slika 15-7. Indukcija tumora u koì mi{eva.

Do inicijacije tumora dolazi zbog mutacija uzrokovanih karcinogenom. Za nastanak tumora potrebno je mi{a izloìti tumorskom promotoru koji poti~e proliferaciju mutiranih stanica.
mutirane stanice inicijacija
promocija tumor
kojima je bilo rije~i u prethodnim poglavljima. Ovaj se odnos ogleda u razli~itim aspektima pona{anja po kojima se stanice raka razlikuju od odgovaraju}ih normalnih stanica. U stanica raka obi~no se nalaze poreme}aji u mehanizmima koji reguliraju proliferaciju, diferencijaciju i preìvljenje normalnih stanica. Uzeta zajedno, ta karakteristi~na svojstva stanica raka opisuju zlo}udni tumor na stani~noj razini. Nekontroliranu proliferaciju stanica raka in vivo prati sli~no pona{anje u stani~noj kulturi. Osnovna razlika izme|u stanica raka i normalnih stanica u kulturi jest u tome {to u normalnih stanica dolazi do inhibicije proliferacije stanica ovisne o gusto}i (slika 15-8). Normalne stanice proliferiraju dok ne dostignu odgovaraju}u gusto}u koja dijelom ovisi o raspoloìvosti faktora rasta dodanih u medij (obi~no u obliku seruma). Tada proliferacija prestaje i stanice ulaze u fazu mirovanja, zaustavljene u fazi G0 stani~noga ciklusa (vidi sliku 14-6). Proliferacija ve}ine stanica raka nije, me|utim, osjetljiva na inhibiciju ovisnu o gusto}i. Umjesto da odgovore na signale koji u normalnih stanica dovode do prestanka proliferacije i ulaska u G0, tumorske stanice uglavnom nastavljaju rasti u kulturi postiù}i visoku gusto}u i tako opona{aju}i nekontroliranu proliferaciju in vivo. S tim je povezana ~injenica da mnoge stanice raka imaju smanjenu potrebu za izvanstani~nim faktorima rasta. Kao {to je re~eno u 13. poglavlju, proliferaciju mnogih stanica barem dijelom kontroliraju polipeptidni ~imbenici rasta. Za neke vrste stanica, pogotovo fibroblaste, raspoloìvost serumskih faktora rasta glavni je faktor koji odre|uje njihovu mogu}nost proliferacije u kulturi. Potrebe takvih stanica za faktorima rasta blisko su povezane s fenomenom inhibicije ovisne o gusto}i budu}i da je gusto}a pri kojoj normalni fibroblasti ulaze u fazu mirovanja razmjerna koncentraciji serumskih faktora rasta u mediju.
normalne stanice
proliferacija stanica tumorske stanice
stanice izlaze iz ciklusa
Slika 15-8. Inhibicija ovisna o gusto}i.

Normalne stanice proliferiraju u kulturi dok ne dostignu odre|enu gusto}u stanica, tada izlaze iz stani~noga ciklusa. Tumorske stanice, me|utim, proliferiraju bez obzira na gusto}u stanica.
proliferacija stanica
proliferacija stanica se nastavlja
Rak
637
Slika 15-9. Autokrina stimulacija rasta.

stimulacija receptora
Stanica stvara faktor rasta na koji odgovara {to dovodi do neprekidne stimulacije proliferacije stanica.
stvaranje faktora rasta
Mnoge tumorske stanice imaju manju potrebu za faktorima rasta od odgovaraju}ih normalnih stanica {to pridonosi nereguliranoj proliferaciji tumorskih stanica in vitro i in vivo. U nekim slu~ajevima stanice raka same stvaraju faktore rasta koji stimuliraju njihovu proliferaciju (slika 15-9). Takvo nenormalno stvaranje faktora rasta u stanicama koje su o njemu ovisne dovodi do trajne autostimulacije stani~ne diobe (autokrina stimulacija rasta) pa su stanice raka zato manje ovisne o faktorima rasta iz drugih, fiziolo{ki normalnih izvora. U drugim je slu~ajevima smanjena ovisnost stanica raka o faktorima rasta posljedica poreme}aja unutarstani~noga signalnog sustava, kao {to je neregulirana aktivnost receptora za faktore rasta ili drugih proteina (primjerice, Ras proteina ili protein-kinaza) koji su u 13. poglavlju navedeni kao elementi signalnoga puta {to dovodi do stani~ne proliferacije. Me|ustani~ne interakcije i interakcije izme|u stanica i matriksa tako|er djeluju slabije na stanice raka, nego na normalne stanice. Ve}ina stanica raka slabije adherira od normalnih, ~esto zbog manje ekspresije adhezijskih molekula na povr{ini stanice. Primjerice, gubitak E-kadherina, glavne adhezijske molekule epitelnih stanica, vaàn je korak u nastanku karcinoma (epitelnih tumora). Zbog smanjene ekspresije stani~nih adhezijskih molekula stanice raka su manje ograni~ene interakcijama s drugim stanicama i sastojcima tkiva {to pridonosi njihovoj sposobnosti da se {ire i metastaziraju. Smanjena adhezivnost stanica raka dovodi i do promjena u izgledu i citoskeletu: mnoge su tumorske stanice okruglastije od normalnih, dijelom zbog slabijeg prianjanja za izvanstani~ni matriks ili susjedne stanice. Izrazita razlika izme|u normalnih i stanica raka u interakciji me|u stanicama vidljiva je u fenomenu dodirne inhibicije (slika 15-10). Normalni fibroblasti migriraju po povr{ini posudice za kulturu dok ne do|u u dodir sa susjednom stanicom. Daljnja migracija tada prestaje i normalne stanice adheriraju jedna za drugu stvaraju}i uredan sloj na dnu posudice za kulturu. Za razliku od toga, tumorske se stanice nastavljaju kretati i nakon {to su do{le u dodir sa susjedima, migriraju jedne preko drugih i rastu neuredno u vi{e slojeva. Dodir sa susjednim stanicama ne inhibira samo kretanje, ve}
638
Poglavlje 15
Slika 15-10. Dodirna inhibicija.

Slika dobivena svjetlosnim mikroskopom (lijevo) i pretra`nom elektronskom mikroskopijom (desno) nor malnih fibroblasta i tumorskih stanica. Dodir s drugim stanicama inhibira migraciju nor malnih fibroblasta, pa oni stvaraju uredan sloj na povr{ini posudice za kulturu u kojem su stanice sloène jedna uz drugu. Tumorske stanice, me|utim, nisu osjetljive na dodirnu inhibiciju, pa migriraju jedna preko druge i rastu u vi{e nepravilnih slojeva. (Ljubazno{}u Lan Bo Chen, iz Dana-Farber instituta za rak.)
normalne stanice
tumorske stanice
i proliferaciju mnogih normalnih stanica. Karakteristi~no je za stanice raka da nisu osjetljive na ovu dodirnu inhibiciju rasta. Druge dvije zna~ajke stanica raka utje~u na njihovu sposobnost interakcije s drugim sastojcima tkiva, pa zato igraju va`nu ulogu u {irenju i metastaziranju. Prvo, ve}ina zlo}udnih stanica lu~i proteaze koje razgra|uju sastojke izvanstani~nog matriksa {to omogu}uje stanicama raka da se {ire u susjedna normalna tkiva. Primjerice, ~ini se da je lu~enje kolagenaze va`no za sposobnost karcinoma da razgradi i prodre kroz bazalnu laminu i pro{iri se u susjedno vezivo (vidi sliku 15-5). Drugo, stanice raka lu~e faktore koji stimuliraju stvaranje novih krvnih ìla (angiogeneza). Angiogeneza je nu`na da bi tumor ve}i od otprilike milijun stanica mogao nastaviti rasti, jer mu pri toj veli~ini trebaju nove krvne ìle radi opskrbe proliferiraju}ih tumorskih stanica kisikom i hranjivim tvarima. Te krvne ìle nastaju kao odgovor na faktore rasta koje lu~e tumorske stanice. Oni stimuliraju proliferaciju endotelnih stanica u stijenkama kapilara u tkivu {to okruùje tumor te tako dolazi do urastanja novih kapilara u tumor. Stvaranje novih krvnih ìla nije va`no samo zbog podràvanja rasta tumora, ve} i zbog metastaziranja. Nove kapilare, koje nastaju kao odgovor na angiogeni~ku stimulaciju, aktivno rastu i tumorske stanice lako prodiru kroz njih {to im olak{ava ulazak u krvnoìlni sustav i zapo~injanje procesa metastaziranja. Jo{ jedna zna~ajka koja je zajedni~ka velikoj ve}ini stanica raka jest izostanak normalne diferencijacije. Taj poreme}aj sazrijevanja usko je povezan s poreme}ajem proliferacije jer, kao {to je re~eno u 14. poglavlju, ve}ina se terminalno diferenciranih stanica ne dijeli. Umjesto da nastave s normalnim programom sazrijevanja, stanice raka ostaju zaustavljene u ranoj fazi diferencijacije koja odgovara stalnoj aktivnoj proliferaciji.
Rak
639
Leukemije su posebno dobar primjer odnosa poreme}aja diferencijacije i zlo}udnosti bolesti. Sve zrele krvne stanice nastaju iz zajedni~ke mati~ne stanice u ko{tanoj srì (vidi sliku 14-44). Potomci tih stanica usmjeravaju se u pojedine smjerove diferencijacije. Primjerice, neke stanice sazrijevaju u eritrocite, a iz drugih nastaju limfociti, granulociti ili makrofagi. Tijekom diferencijacije sve se te stanice nekoliko puta dijele, no dioba prestaje nakon {to posve sazriju. Za razliku od toga, leukemijske stanice ne sazrijevaju u potpunosti (slika 15-11). Umjesto toga, one ostaju zaustavljene u ranoj fazi diferencijacije u kojoj su jo{ sposobne dijeliti se i umnaàti. Kao {to je re~eno u 13. poglavlju, programirana stani~na smrt ili apoptoza integralni je dio programa diferencijacije mnogih vrsta stanica, pa tako i krvnih. U mnogih stanica raka ne dolazi do apoptoze, pa one zato ìve dulje od odgovaraju}ih normalnih stanica. Izbjegavanjem programirane stani~ne smrti stanice raka zna~ajno pridonose nastanku tumora. Primjerice, preìvljavanje mnogih normalnih stanica ovisi o signalima faktora rasta ili izvanstani~nog matriksa koji sprje~avaju apoptozu. Za razliku od toga, tumorske stanice ~esto preìvljavaju bez faktora rasta nu`nih za odgovaraju}e normalne stanice. Sposobnost tumorskih stanica da izbjegnu apoptozu kad ostanu bez normalnih signala iz okoli{a mogla bi biti va`na ne samo za nastanak primarnoga tumora, ve} i za preìvljavanje i rast metastaza u za njih nenormalnim tkivima. Normalne stanice tako|er umiru apoptozom nakon o{te}enja DNA, dok mnoge stanice raka to ne ~ine. U tom slu~aju, izostanak apoptoze pove}ava otpornost stanica raka na zra~enje i mnoge citostatike koji djeluju o{te}uju}i DNA. Osim {to su u stanju izbje}i apoptozu, ve}ina stanica raka moè se neograni~eno dijeliti jer eksprimiraju telomerazu potrebnu za odràvanje krajepluripotentna va eukariotskih kromosoma (vidi sliku 5-17). mati~na stanica Prema tome, poreme}eno preìvljavanje stanica, kao i njihova proliferacija, igra va`nu ulogu u nezaustavljivom rastu stanica raka u ìvotinji.
zaustavljena diferencijacija
retikulocit
Slika 15-11. Poreme}aj diferencijacije i leukemija.

Razli~ite vrste krvnih stanica nastaju u ko{tanoj srì iz svestrane (pluripotentne) mati~ne stanice. Predci diferenciranih stanica tijekom sazrijevanja nekoliko se puta podijele, no u zavr{nim fazama diferencijacije dioba stanica prestaje. Diferencijacija leukemijskih stanica zaustavljena je u ranim fazama sazrijevanja {to im omogu}uje da se nastave dijeliti.
eritrocit itd. leukemijske stanice ne diferenciraju, ve} se nastavljaju dijeliti
640
Poglavlje 15
Transformacija stanica u kulturi

Za istraìvanja indukcije tumora zra~enjem, kemikalijama ili virusima potrebni su eksperimentalni modeli u kojima se u~inci karcinogenih agensa mogu reproducibilno promatrati i kvantificirati. Iako se u~inci karcinogena mogu ispitivati u intaktnim ìvotinjama, takve je pokuse te{ko kvantificirati i kontrolirati. Razvoj in vitro testova za otkrivanje pretvorbe normalne stanice u tumorsku stanicu u kulturi, procesa koji se naziva transformacija stanice, stoga je zna~ajno pridonio istraìvanju raka. Takvi su testovi napravljeni tako da, nakon izlaganja kulture normalnih stanica karcinogenom agensu, otkrivaju transformirane stanice sa zna~ajkama in vitro rasta tumorskih stanica. Njihova je primjena omogu}ila da eksperimentalna analiza transformacije stanica dosegne razinu sofisticiranosti koju nikad ne bi mogla dosti}i samo istraìvanjima na ìvim ìvotinjama. Prvi i naj~e{}e upotrebljavan test transformacije stanica jest test àri{ta {to su ga 1958. godine razvili Howard Temin i Harry Rubin. Test àri{ta temelji se na mogu}nosti otkrivanja skupine transformiranih stanica koje ~ine morfolo{ki prepoznatljivo àri{te na pozadini normalnih stanica na dnu posudice za kulturu (slika 15-12). Test àri{ta koristi se trima zna~ajkama transformiranih stanica: promijenjenim izgledom te gubitkom dodirne inhibicije i inhibicije rasta ovisne o gusto}i. Zbog toga nastaju kolonije stanica promijenjenog izgleda koje prerastaju kulturu normalnih stanica u pozadini. Takva àri{ta transformiranih stanica obi~no se mogu otkriti i kvantificirati jedan do dva tjedna nakon izlaganja karcinogenom agensu. Op}enito, stanice transformirane in vitro mogu stvarati tumore nakon inokulacije u osjetljive ìvotinje {to pokazuje da je in vitro transformacija zadovoljavaju}i model nastanka stanica raka.
Slika 15-12. Test àri{ta.

@ari{te fibroblasta iz pile}eg embrija transformiranih Rousovim sarkomskim virusom (Iz H. M. Temin i H. Rubin, 1958. Virology 6:669.)
Tumorski virusi
^lanovi nekoliko porodica ìvotinjskih virusa, nazivamo ih tumorskim virusima, mogu u pokusnih ìvotinja ili ljudi izravno izazvati rak (tablica 152). U viruse koji uzrokuju rak u ljudi spadaju virusi hepatitisa B i C (rak jetre), papilomavirusi (rak grli}a maternice i drugih anogenitalnih organa), Epstein-Barrov virus (Burkittov limfom i karcinom nazofarinksa), herpesvirus povezan s Kaposijevim sarkomom (Kaposijev sarkom) i ljudski T stani~ni limfotropni virus (T stani~na leukemija odraslih). Osim toga HIV, neiz-
Tablica 15-2. Tumorski virusi

Porodica virusa
DNA genomi virus hepatitisa B SV40 i poliomavirus papilomavirusi adenovirusi herpesvirusi
Ljudski tumori
rak jetre ne rak grli}a maternice ne Burkittov limfom, karcinom nazofarinksa, Kaposijev sarkom rak jetre T-stani~na leukemija odraslih
Veli~ina genoma (kb)

3 5 8 35 100200
RNA genomi virus hepatitisa C retrovirusi
10 910
Rak
641
ravno uzrokuje slu~ajeve raka koji nastaju zbog imunodeficijencije u bolesnika s AIDS-om. Kao {to je ve} re~eno, tumorski virusi nisu va`ni samo zato {to uzrokuju bolesti u ljudi, ve} i zato {to su igrali klju~nu ulogu u istraìvanju raka sluè}i kao model u molekularnim i stani~nim istraìvanjima transformacije stanica. Budu}i da su genomi tumorskih virusa mali, bilo ih je mogu}e molekularno analizirati i otkriti virusne gene odgovorne za indukciju raka. To je otvorilo put na{em sada{njem razumijevanju raka na molekularnoj razini.
Virusi hepatitisa B i C
Virus hepatitisa B ima najmanji genom (otprilike 3 kb) od svih ìvotinjskih DNA virusa. Oni specifi~no inficiraju stanice jetre nekoliko ìvotinjskih vrsta uklju~uju}i patke, djetli}e, vjeverice i ljude. Infekcija virusom hepatitisa B obi~no dovodi do akutnog o{te}enja jetre. Me|utim, u 5 do 10% slu~ajeva ne dolazi do izlje~enja akutne infekcije, ve} se pojavljuje kroni~na infekcija jetre. Takva kroni~na infekcija pove}ava opasnost od pojave raka jetre za vi{e od sto puta. Infekcija virusom hepatitisa B posebno je ~esta u dijelovima Azije i Afrike gdje se povezuje s i do milijun slu~ajeva raka jetre godi{nje (otprilike 10% svih novih slu~ajeva raka u svijetu). Transformacija stanica uzrokovana virusom hepatitisa B posredovana je virusnim genom (nazvanim X gen) koji utje~e na ekspresiju niza stani~nih gena i tako dovodi do poreme}ene proliferacije i preìvljavanja stanica. Osim toga, nastanku raka uzrokovana virusom hepatitisa B pogoduje trajna proliferacija jetrenih stanica do koje dolazi zbog kroni~nog o{te}enja tkiva i upale. Virus hepatitisa C je RNA virus ~iji je genom velik otprilike 10 kb. Poput hepatitisa B, i virus hepatitisa C uzrokuje kroni~ne infekcije jetre koje su povezane s velikim rizikom pojave raka. Najve}i doprinos nastanku raka daje proliferacija stanica koja se pojavljuje kao odgovor na kroni~nu upalu. Mogu}e je, me|utim, da i neki virusni proteini izravno stimuliraju proliferaciju zaraènih jetrenih stanica.
SV40
permisivna stanica
nepermisivna stanica
replikacija virusa
zaustavljena replikacija
SV40 i poliomavirus
Iako ni majmunski virus 40 (SV40) niti poliomavirus ne uzrokuju rak u ljudi, bili su vrlo va`ni kao modeli za razumijevanje molekularne osnove transformacije stanica. Ovi virusi bili su posebno pogodni za istraìvanje raka zbog postojanja dobrih testova za mjerenje njihove replikacije i transformacije u kulturi, kao i zbog male veli~ine genoma (otprilike 5 kb). SV40 i poliomavirus ne uzrokuju tumore niti transformiraju stanice svojih prirodnih doma}ina majmuna i mi{eva. U stanicama prirodnih doma}ina (permisivnim stanicama) infekcija dovodi do replikacije virusa, lize stanice i osloba|anja novostvorenih virusnih ~estica (slika 15-13). Budu}i da umnaànje virusa ubija permisivnu stanicu, ne moè do}i do transformacije. Me|utim, sposobnost ovih virusa da izazovu transformaciju dolazi do izraàja u nepermisivnim stanicama u kojima je replikacija virusa zaustavljena. U tom se slu~aju virusni genom ponekad integrira u stani~nu DNA, a ekspresija odre|enih virusnih gena dovodi do transformacije inficirane stanice. Detaljnom molekularnom analizom otkriveni su geni SV40 i poliomavirusa koji dovode do transformacije. Istraìva~i su otkrili potpun redoslijed baza virusnoga genoma i njihove mRNA, izolirali mutirane oblike virusa nesposobne izazvati transformaciju, a testom prijenosa gena utvrdili su sposobnost pojedina~nih virusnih gena da izazovu transformaciju. Tako su na{li da, pri infekciji ovim virusima, transformaciju uzrokuje ekspresija istih onih virusnih gena koji su aktivni u ranim fazama liti~ke infekcije. Geno-
liza stanice
transformacija stanice
Slika 15-13. Replikacija SV40 i transformacija.

Infekcija permisivne stanice dovodi do replikacije virusa, lize stanice i otpu{tanja novonastalih virusnih ~estica. U neper misivnim stanicama virusna je replikacija zaustavljena, zbog ~ega neke stanice postaju trajno transformirane.
642
Poglavlje 15
5' 5' kasno podru~je
ori SV40 DNA rano podru~je
rana pre-mRNA 5' 3'
mRNA za veliki T 5'
prekrajanje 3' translacija
veliki T antigen
rana pre-mRNA 5' prekrajanje mRNA za mali T 5' translacija mali T antigen 3' 3'
mi SV40 i poliomavirusa mogu se podijeliti u rana i kasna podru~ja. Do ekspresije ranoga podru~ja dolazi odmah nakon infekcije i nu`na je za sintezu virusne DNA. Do ekspresije kasnoga podru~ja dolazi tek nakon {to je zapo~ela replikacija virusne DNA. Ovo podru~je sadràva gene koji kodiraju strukturne dijelove virusnih ~estica. Rano podru~je SV40 kodira dva proteina, nazvana mali i veliki T antigen, veli~ine otprilike 17 kd i 94 kd (slika 15-14). Njihove mRNA nastaju alternativnim prekrajanjem istoga primarnog prijepisa ranoga podru~ja. Poliomavirus tako|er kodira mali i veliki T antigen, a uz to i tre}i protein ranoga podru~ja, veli~ine otprilike 55 kd, nazvan srednji T. Transfekcija stanica cDNA pojedina~nih proteina ranoga podru~ja pokazala je da je veliki T iz SV40 dovoljan da izazove transformaciju, dok je srednji T najodgovorniji za transformaciju poliomavirusom. U liti~koj infekciji proteini ranoga podru~ja ispunjavaju razli~ite zada}e povezane s replikacijom virusa. Primjerice, T antigen SV40 veè se na virusno ishodi{te replikacije i tako dovodi do po~etka replikacije virusne DNA (vidi 5. poglavlje). Osim toga, proteini ranoga podru~ja SV40 i poliomavirusa poti~u ekspresiju gena u stanici doma}inu i sintezu DNA. Budu}i da replikacija virusa ovisi o enzimima stanice doma}ina (primjerice, DNA--polimerazi), takva je stimulacija klju~na za pokretanje ìvotnoga ciklusa virusa. Ve}ina stanica u ìvotinjama ne proliferira i mora ih se potaknuti na diobu kako bi se inducirali enzimi potrebni za replikaciju DNA. Ako se virusna DNA stabilno integrira u nepermisivnu stanicu i do|e do njezine ekspresije, produkti ranih gena mogu dovesti do transformacije stanice zbog postojanja trajnoga poticaja na proliferaciju. Kao {to }e biti obja{njeno dalje u ovom poglavlju, proteini ranoga podru~ja SV40 i poliomavirusa dovode do transformacije zbog me|udjelovanja s doma}inovim proteinima koji reguliraju stani~nu proliferaciju. Primjerice, T antigen SV40 virusa u stanici doma}inu veè i inaktivira tumor-supresore, proteine Rb i p53, klju~ne regulatore proliferacije i preìvljavanja stanica.
Papilomavirusi
Papilomavirusi su mali DNA virusi (s genomom od otprilike 8 kb) koji u ljudi i drugih vrsta ìvotinja induciraju dobro}udne i zlo}udne tumore. Poznato je otprilike 60 razli~itih vrsta ljudskih papilomavirusa koji inficiraju epitelne stanice razli~itih vrsta tkiva. Neki virusi uzrokuju samo dobro}udne tumore (poput bradavica), dok su drugi uzro~nici zlo}udnih karcinoma, pogotovo raka grli}a maternice i drugih organa anogenitalne regije. Smrtnost od karcinoma grli}a maternice u Sjedinjenim Ameri~kim Dràvama razmjerno je mala, uvelike zbog Papa-testa koji omogu}uje rano otkrivanje i kurativno lije~enje ove bolesti. Me|utim, u nekim drugim dijelovima svijeta rak grli}a maternice i dalje je ~est; na njega otpada 5 do 10% novodijagnosticiranih slu~ajeva raka diljem svijeta. Transformacija stanice uzrokovana ljudskim papilomavirusima posljedica je ekspresije dvaju gena ranoga podru~ja, E6 i E7 (slika 15-15). Poput T antigena iz SV 40, E6 i E7 proteini dovode do transformacije djeluju}i na proteine stanice doma}ina koji kontroliraju stani~nu proliferaciju i preìvljavanje, uklju~uju}i Rb i p53. E7 se veè na Rb, a E6 stimulira razgradnju p53 proteolizom posredovanom ubikvitinom.
Slika 15-14. Genom SV40.

Genom je podijeljen u rano i kasno podru~je. Veliki i mali T antigeni nastaju alter nativnim prekrajanjem mRNA iz ranoga podru~ja.
Adenovirusi
Adenovirusi su velika porodica DNA virusa s genomom od otprilike 35 kb. Za razliku od papilomavirusa, adenovirusi nisu povezani sa slu~ajevima spontano nastalog raka u ljudi ili drugih ìvotinja. Me|utim, oni su opse`no prou~avan i vaàn model u eksperimentalnoj biologiji raka.
Rak
643
DNA produkti gena E7 E1A E6 E1B E2 E4 E5 L2 L1
Slika 15-15. Genom ljudskoga papilomavirusa.

Produkti gena zovu se E (rani) ili L (kasni). Transformacija nastaje djelovanjem E6 i E7.
Poput SV40 virusa i poliomavirusa, adenovirusi djeluju liti~ki na stanice svoga prirodnoga doma}ina, ali u nepermisivnom doma}inu mogu dovesti do transformacije. Transformacija uzrokovana adenovirusima nastaje zbog ekspresije dvaju gena ranoga podru~ja, E1A i E1B, nu`nih za replikaciju virusa u permisivnim stanicama (slika 15-16). Ovi transformiraju}i proteini inaktiviraju tumorske supresore, proteine Rb i p53. E1A se veè za Rb, a E1B za p53. Dakle, ~ini se da SV40 virus, papilomavirusi i adenovirusi uzrokuju transformaciju na sli~an na~in, pri ~emu ometanje funkcije Rb i p53 igra sredi{nju ulogu.
Herpesvirusi
Herpesvirusi spadaju me|u najsloènije ìvotinjske viruse s genomom od 100 do 200 kb. Nekoliko herpesvirusa uzrokuje tumore u ìvotinjama, me|u ostalim u àbama, koko{ima i majmunima. Osim toga, dva ~lana porodice herpesvirusa, herpesvirus povezan s Kaposijevim sarkomom i EpsteinBar rov virus povezani su s rakom u ljudi. Herpesvirus povezan s Kaposijevim sarkomom ima klju~nu ulogu u nastanku Kaposijeva sarkoma, a za Epstein-Barrov virus se smatra da uzrokuje nekoliko vrsta raka, izme|u ostaloga Burkittov limfom u nekim afri~kim podru~jima, B-stani~ne limfome u bolesnika s AIDS i u drugih imunokompromitiranih osoba te karcinom nazofarinksa u Kini. Osim {to je povezan s ovim vrstama raka u ljudi, Epstein-Barrov virus moè transformirati B limfocite u kulturi. Me|utim, molekularna biologija replikacije i transformacije Epstein-Barrovim virusom nije u potpunosti razja{njena, dijelom zbog sloènosti njegova genoma. îni se da je za transformaciju limfocita potrebno nekoliko virusnih gena. îni se da jedan od ovih transformiraju}ih virusnih proteina (LMP1) opona{a djelovanje jednog proteina sa stani~ne membrane B limfocita koji normalno daje signal za stani~nu proliferaciju, no uloga ostalih jo{ je nepoznata. Herpesvirus povezan s Kaposijevim sarkomom redovito se nalazi u stanicama Kaposijeva sarkoma, a u ovim tumorima dolazi do ekspresije nekoliko virusnih gena koji utje~u na stani~nu proliferaciju i preìvljavanje. Zanimljivo je da jedan od transformiraju}ih proteina iz ovoga herpesvirusa, poput T antigena iz SV40 virusa, djeluje na Rb i p53.
genomska DNA
35 kb
transformiraju}i geni
3.2 kb E1A E1B
Slika 15-16. Adenovirusni genom.

Dva gena iz ranoga podru~ja, E1A i E1B, induciraju transformaciju.
644
Poglavlje 15
Slika 15-17. Tipi~ni retrovirusni genom.

Iz provirusne DNA, integrirane u stani~nu DNA, prepisivanjem nastaje genomska duga RNA. Ovaj primar ni prijepis sluì kao genomska RNA novonastalih virusnih ~estica i kao mRNA za gag i pol gene. Osim toga, iz ~itave RNA prekrajanjem nastaje mRNA za env. Gen gag kodira virusnu proteazu i struktur ne proteine virusne ~estice, pol kodira reverznu-transkriptazu i integrazu, a env kodira glikoproteine ovojnice.
DNA provirusa
doma}in LTR
gag
pol transkripcija
env
LTR doma}in
genomska duga RNA
5' gag pol env
3'
strukturni proteini viriona proteaza
reverzna-transkriptaza integraza
glikoproteini ovojnice
Retrovirusi
Retrovirusi uzrokuju rak niza ìvotinjskih vrsta, uklju~uju}i ~ovjeka. Jedan ljudski retrovirus, ljudski T-stani~ni limfotropni virus tip I (HTLV-I) uzro~nik je T-stani~ne leukemije odraslih, bolesti ~este u dijelovima Japana, Kariba i Afrike. Do transformacije T limfocita HTLV-I virusom dolazi zbog ekspresije virusnoga gena tax. On kodira regulacijski protein koji djeluje na ekspresiju nekoliko stani~nih gena {to kontroliraju rast. AIDS uzrokuje drugi retrovirus, HIV. Za razliku od HTLV-I, HIV ne uzrokuje rak izravnom transformacijom normalne u tumorsku stanicu. Me|utim, u bolesnika s AIDS visoka je u~estalost nekih zlo}udnih bolesti, pogotovo limfoma i Kaposijeva sarkoma. Ove vrste raka, ~este i u drugih imunokompromitiranih osoba, povezane su s infekcijama drugim virusima (primjerice, Epstein-Barrovim virusom i herpesvirusom povezanim s Kaposijevim sarkomom) pa se ~ini da se razvijaju kao sekundarna posljedica imunosupresije u bolesnika s AIDS-om. Razli~iti retrovirusi jako se razlikuju po svojim onkogenim sposobnostima. Ve}ina retrovirusa sadràva samo tri gena (gag, pol i env), nu`na za replikaciju virusa, ali nesposobna transformirati stanice (slika 15-17). Ovakve vrste retrovirusa skoro nikad ne uzrokuju tumore. Ako se tumori i pojave, nastaju kao posljedica mutacija uzrokovanih integracijom provirusne DNA u stani~ne gene ili pokraj njih. Me|utim, drugi su retrovirusi sna`ni karcinogeni jer sadràvaju posebne gene koji mogu inducirati transformaciju stanica. Prototip ovih jako onkogenih retrovirusa je Rousov sarkomski virus (RSV), koji je iz pile}ega sarkoma prvi izolirao Peyton Rous 1911. godine. Vi{e od 50 godina potom, ispitivanja RSV dovela su do otkri}a prvoga virusnog onkogena koji je posluìo kao model za razumijevanje mnogih aspekata razvoja tumora na molekularnoj razini.
Onkogeni
Rak nastaje zbog promjena u najva`nijim regulatornim genima koji kontroliraju stani~nu proliferaciju, diferencijaciju i preìvljenje. Istraìvanja tumorskih virusa pokazala su da odre|eni geni (nazvani onkogeni) mogu dovesti do transformacije stanica i time omogu}ila prvi uvid u molekularne osnove raka. Me|utim, ve}ina (otprilike 80%) slu~ajeva raka u ljudi nije uzrokovana virusima i po svemu sude}i nastaje zbog drugih razloga, poput zra~enja i kemijskih karcinogena. Zbog toga je za na{e sveukupno razumijevanje raka bilo od najve}e va`nosti {to su istraìvanja virusnih onkogena
Rak
645
dovela do otkri}a stani~nih onkogena. Ovi geni sudjeluju u nastanku onih vrsta raka koje nisu izazvane virusima. Klju~na karika koja povezuje virusne i stani~ne onkogene otkrivena je istraìvanjima jako onkogenih retrovirusa.
RSV
ALV
Retrovirusni onkogeni
Virusni su onkogeni prvo na|eni u RSV koji transformira fibroblaste pile}ih embrija u kulturi i dovodi do nastanka velikih sarkoma 1 do 2 tjedna nakon inokulacije u pili}e (slika 15-18). Za razliku od njega, vrlo srodni virus pti~je leukoze (ALV) replicira se u istim stanicama kao i RSV, ali ne izaziva transformaciju. Ova razlika u sposobnosti transformacije govori da RSV mo`da sadràva neku geneti~ku informaciju odgovornu za transformiranje inficiranih stanica. Izravna usporedba RSV i ALV genoma potvrdila je ovu pretpostavku: genomska RNA RSVa ima oko 10 kb, dok je ALV manji, oko 8,5 kb. Ranih sedamdesetih, Peter Vogt i Steven Martin izolirali su delecijske mutante i mutante osjetljive na temperaturu RSV koje nisu mogle izazvati transformaciju. [to je bilo veoma va`no, ove su se mutante normalno replicirale u inficiranim stanicama upu}uju}i na to da je dio geneti~ke informacije RSV potreban za transformaciju, ali ne i za replikaciju virusa. Daljnja ispitivanja delecijskih mutanti i mutanti osjetljivih na temperaturu pokazala su da je jedan gen odgovoran za sposobnost RSV da izaziva tumore u ptica i transformira fibroblaste u kulturi. Budu}i da RSV uzrokuje sarkome, ovaj je onkogen nazvan src. îni se da je src dodatak genomu RSV jer ga u ALV nema (slika 15-19). Kodira 60 kd protein, prvu otkrivenu protein-tirozin-kinazu (vidi ovaj klju~ni pokus u 13. poglavlju). Iz razli~itih ìvotinja, uklju~uju}i koko{i, purane, mi{eve, {takore, ma~ke i majmune, izolirano je vi{e od 40 razli~itih jako onkogenih retrovirusa. Svi ti virusi, poput RSV, sadràvaju najmanje jedan onkogen (u nekim slu~ajevima dva) koji nije potreban za replikaciju virusa, ve} dovodi do stani~ne transformacije. Ponekad razli~iti virusi imaju isti onkogen, no u ovoj je skupini virusa otkriveno vi{e od dvadeset razli~itih onkogena (tablica 15-3). Poput src, mnogi od njih (kao ras i raf) kodiraju proteine za koje danas znamo da su klju~ni dijelovi signalnih puteva za stimulaciju proliferacije stanica (vidi sliku 13-32).
replikacija virusa transformacija stanice
replikacija virusa nema transformacije
Slika 15-18. Transformacija stanica RSV-om i ALV-om.

RSV i ALV inficiraju fibroblaste pile}ih embrija i u njima se repliciraju, ali samo RSV dovodi do transformacije stanica.
DNA ALV DNA RSV
8,5 kb LTR gag pol env LTR 10 kb LTR gag pol env transkripcija src LTR
puna duljina RNA RSV
gag
pol
env
src
virusni strukturni proteini proteaza
reverzna transkriptaza integraza
ovojnice glikoproteini
src protein-tirozin-kinaza
Slika 15-19. Genom RSV.

RSV sadràva dodatni gen, src, kojega nema u ALV, a koji kodira protein-tirozin-kinazu Src.
646
Poglavlje 15
Tablica 15-3. Retrovirusni onkogeni

Onkogen
abl akt cbl crk erbA erbB ets fes fgr fms fos fps jun kit maf mos mpl myb myc p3k qin raf rasH rasK rel ros sea sis ski src yes
Virus
Abelsonov leukemijski AKT8 Cas NS-1 CT10 sarkomski pti~je eritroblastoze ES4 pti~je eritroblastoze ES4 pti~je eritroblastoze ES4 Gardner-Arnsteinov ma~ji sarkomski Gardner-Rasheedov ma~ji sarkomski McDonoughov ma~ji sarkomski mi{jeg osteogenog sarkoma Fujinamijev sarkom pti~ji sarkomski 17 Hardy-Zuckermanov ma~ji sarkomski pti~ji sarkom AS42 Moloneyev sarkomski mijeloproliferativni leukemijski pti~je mijeloblastoze pti~je mijelocitomatoze pti~ji sarkomski 16 pti~ji sarkomski 31 mi{ji sarkomski 3611 Harveyev sarkomski Kirstenov sarkomski retikuloendotelioze UR2 sarkomski pti~je ertroblastoze S13 majmunski sarkomski pti~ji SK Rousov sarkomski Y73 sarkomski
@ivotinjska vrsta
mi{ mi{ mi{ koko{ koko{ koko{ koko{ ma~ka ma~ka ma~ka mi{ koko{ koko{ ma~ka koko{ mi{ mi{ koko{ koko{ koko{ koko{ mi{ {takor {takor puran koko{ koko{ majmun koko{ koko{ koko{
Protoonkogeni
Neobi~no svojstvo retrovirusnih onkogena jest da ne sudjeluju u replikaciji virusa. Budu}i da je ve}ina virusa napravljena tako da se {to u~inkovitije umnaàju, postojanje virusnih onkogena koji nisu sastavni dio ìvotnoga ciklusa virusa doima se paradoksalnim. Znanstvenici su se stoga po~eli pitati otkuda su retrovirusni onkogeni potekli i kako su postali dio virusnoga genoma smjer istraìvanja koji }e na posljetku dovesti do otkri}a stani~nih onkogena u ljudskim tumorima. Prva naznaka podrijetla onkogena potekla je iz na~ina na koji su izolirani jako onkogeni retrovirusi. Tipi~an je primjer izolacija Abelsonova leukemijskog virusa (slika 15-20). Vi{e od 150 mi{eva je inokulirano netransformiraju}im virusom koji je sadràvao samo gag, pol i env gene nu`ne za replikaciju virusa. Jedan od tih mi{eva razvio je limfom iz kojega je izoliran novi, jako onkogeni virus (Abelsonov leukemijski virus) s abl onkogenom. Ovaj scenarij uputio je na mogu}nost da retrovirusni onkogeni potje~u od gena stanice doma}ina, koji ponekad budu ugra|eni u virusni genom. Novi, ja-
Rak
647
Slika 15-20. Izolacija Abelsonova leukemijskoga virusa.

Jako onkogeni Ab-MuLV izoliran je iz rijetkog tumora koji se razvio u mi{a inokuliranoga netransformiraju}im virusom (Moloneyev mi{ji leukemijski virus ili MuLV). MuLV sadràva samo gag, pol i env gene potrebne za replikaciju virusa. Za razliku od toga, Ab-MuLV ima i novi onkogen (abl) koji uzrokuje transformaciju stanica. U Ab-MuLV genomu abl je nadomjestio neke gene potrebne za replikaciju virusa, a do{lo je i do fuzije izme|u abl i dijela gag gena (nazvanog Dgag), dok drugi dio ovog gena nije prisutan.
MuLV
RNA
gag pol env
ko onkogeni virus nastaje kao proizvod rekombinacije izme|u virusa i doma}ina. Klju~na posljedica ove pretpostavke jest da normalne stanice sadràvaju gene vrlo srodne retrovirusnim onkogenima. To su dokazali Harold Varmus, J. Michael Bishop i suradnici 1976. godine, pokazav{i da cDNA sonda za src onkogen RSV hibridizira s vrlo srodnim sljedovima DNA u normalnim koko{jim stanicama. [tovi{e, sljedovi srodni src na|eni su u normalnoj DNA niza drugih kralje`njaka (uklju~uju}i ljude) {to govori da su tijekom evolucije ostali dobro sa~uvani. Sli~ni pokusi sa sondama za onkogene drugih jako onkogenih retrovirusa dali su podjednake rezultate pa je danas ~vrsto dokazano da su retrovirusni onkogeni potekli od vrlo srodnih normalnih stani~nih gena. Normalni stani~ni geni od kojih su potekli retrovirusni onkogeni zovu se protoonkogeni. To su va`ni regulacijski stani~ni geni, koji ~esto kodiraju proteine {to sudjeluju u putevima prijenosa signala kojima se kontrolira proliferacija normalnih stanica (primjerice, src, ras i raf). Onkogeni su nenormalno eksprimirani ili mutirani oblici odgovaraju}ih protoonkogena. Zbog tih promjena, onkogeni dovode do nenormalne proliferacije stanica i nastanka tumora. Onkogen ugra|en u retrovirusni genom se od odgovaraju}eg protoonkogena moè razlikovati na nekoliko na~ina. Prvo, transkripcija virusnog onkogena je pod nadzorom virusnih promotora i poja~iva~a, a ne pod nadzorom normalnih transkripcijskih regulacijskih sljedova protoonkogena. Ekspresija onkogena zato je obi~no puno ja~a od one protoonkogena, a moè se pojaviti i u neodgovaraju}im vrstama stanica. Ponekad su takve promjene genske ekspresije dovoljne da normalni protoonkogen pretvore u onkogen koji dovodi do transformacije stanica. Osim ovih poreme}aja ekspresije gena, onkogeni ~esto kodiraju proteine koji se od normalnih razlikuju po gra|i i funkciji. Mnogi su onkogeni, poput raf, eksprimirani kao fuzijski proteini s virusnim dijelovima na amino-kraju (slika 15-21). Kad retrovirusi uzimaju protoonkogene iz stanica, ~esto dolazi do rekombinacija koje dovode do nastanka ovakvih fuzijskih proteina. Pri tomu ~esto dolazi do gubitka geneti~koga materijala s aminoi karboksi-krajeva protoonkogena. Takve delecije mogu dovesti do gubitka regulacijskih domena koje nadziru aktivnost protoonkogenih proteina {to dovodi do nastanka onkogenih proteina ~ija je funkcija izmakla kontroli. Primjerice, virusni raf onkogen kodira fuzijski protein koji ne sadràva dijelove normalnoga Raf proteina s amino-kraja. Ti dijelovi s amino-kraja nu`ni su za normalnu regulaciju aktivnosti Raf protein-kinaze i njihova delecija dovodi do neregulirane konstitutivne aktivnosti onkogenoga Raf proteina. Takva neregulirana aktivnost Raf dovodi do proliferacije, a na posljetku i do transformacije stanica. Mnogi se drugi onkogeni od odgovaraju}ih protoonkogena razlikuju u to~kastim mutacijama, koje dovode do toga da se onkogeni proteini od nor-
nastanak tumor
RNA
gag
abl
proto-onkogeni protein Raf
regulacijska domena onkogeni protein Raf
kinazna domena
Gag
kinazna domena
Slika 15-21. Onkogeni protein Raf.

Protoonkogeni protein Raf sastoji se od regulacijske domene na amino-kraju i proteinske kinazne domene na karboksi-kraju. Kod virusnog onkogenog Raf proteina do{lo je do delecije regulacijske domene koja je zamijenjena virusnim Gag slijedom. Zbog toga je kinazna domena Raf konstitutivno aktivna i dovodi do transformacije stanica.
648
Poglavlje 15
Otkri}e protoonkogena
DNA Related to the Transforming Gene(s) of Avian Sarcoma Viruses Is Present in Normal Avian DNA Dominique Stehelin, Harold E. Varmus, J. Michael Bishop i Peter K. Vogt
Department of Microbiology, University of California, San Francisco (DS, HEV and JMB) and Department of Microbiology, University of California, Los Angeles (PKV) Nature, volumen 260, 1976, pages 170173 moglo pretpostaviti na temelju veli~ine delecija u mutiranim oblicima RSV, koji ne izazivaju transformaciju, sonda specifi~na za src bila je homologna s otprilike 1,5 kb RNA RSV. Radioaktivna cDNA src gena potom je upotrijebljena kao hibridizacijska sonda za otkrivanje srodnih sljedova DNA u nor malnim pti~jim stanicama. Za~udo, cDNA src gena obilato je hibridizirala s nor malnom koko{jom DNA kao i s DNA drugih vrsta ptica (vidi sliku). Ti su pokusi pokazali da normalne stanice sadràvaju sljedove
Kontekst
Geneti~kom analizom RSV otkriven je pr vi virusni onkogen (src) koji dovodi do stani~ne transfor macije, ali nije potreban za replikaciju virusa. înjenica da se jako onkogeni retrovirusi nalaze u tumorima zaraènih ìvotinja navela je istraìva~e na pretpostavku da retrovirusni onkogeni nastaju od srodnih gena stanice doma}ina. U skladu s tom pretpostavkom, u stanicama nekoliko vrsta ìvotinja, hibridizacijom nukleinskim kiselinama na|eni su sljedovi DNA srodni retrovirusnima. Nije, me|utim, bilo jasno jesu li oni srodni retrovirusnim onkogenima ili genima potrebnim za replikaciju virusa. Harold Var mus, J. Michael Bishop i suradnici odgovorili su na ovo va`no pitanje koriste}i se poznavanjem geneti~kih svojstava src onkogena. Pogotovo je Peter Vogt ve} ranije bio izolirao mutirane oblike RSV, koji nisu dovodili do transfor macije, s delecijama najve}eg dijela ili ~itavoga src gena, veli~ine otprilike 1,5 kb. Stehelin i suradnici su
upotrijebili ove mutante za pripremu cDNA sondi specifi~nih za sljedove baza iz src gena. Kori{tenjem tih sondi uspjeli su pouzdano dokazati da normalne stanice sadràvaju sljedove DNA srodne onima iz src gena.
Eksperimenti
Istraìva~i su prvo s pomo}u reverzne-transkriptaze sintetizirali radioaktivnu cDNA sondu sastavljenu od kratkih jednolan~anih dijelova DNA komplementar nih ~itavoj genomskoj RNA RSV. Ova je sonda potom hibridizirana sa suvi{kom RNA izolirane iz delecijske mutante koja nije dovodila do transformacije. Dijelovi cDNA komplementar ni virusnim replikacijskim genima hibridizirali su s RNA takvog RSV, koji ne izaziva transfor maciju, stvaraju}i dvolan~ane hibride RNA i DNA. Za razliku od toga, dijelovi cDNA komplementar ni src genu nisu mogli hibridizirati i ostali su jednolan~ani. Ova jednolan~ana DNA potom je izolirana i posluìla je kao sonda specifi~na za sljedove baza src onkogena. Kao {to se
50
hibridizirana src cDNA (%)
25
koko{ja DNA prepeli~ja DNA A pa~ja DNA 0 102 C0t (

3
s)
104
Hibridizacija cDNA specifi~ne za src s normalnom koko{jom, prepeli~jom i pa~jom DNA.
malnih razlikuju u pojedina~nim aminokiselinama. Ponekad takve zamjene aminokiselina (poput delecije o kojoj je bilo rije~i prije) dovode do neregulirane aktivacije proteina. Vaàn primjer takvih to~kastih mutacija su ras onkogeni o kojima }e biti rije~ u sljede}em odjeljku, kad }emo govoriti o njihovoj ulozi u nastanku raka u ljudi.
Onkogeni u ljudskim tumorima

Nakon {to su razjasnili podrijetlo retrovirusnih onkogena, istraìva~i su se po~eli pitati sadràvaju li tumori, koji nisu inducirani virusima, stani~ne on-
Rak
649
DNA vrlo srodne src onkogenu i dali potporu pretpostavki da su retrovirusni onkogeni nastali iz stani~nih gena ugra|enih u virusni genom.
Utjecaj
Stehelin i suradnici zavr{avaju svoj ~lanak iz 1976. godine pretpostavkom da stani~ni geni srodni src sudjeluju u nor malnoj regulaciji rasta i razvoja stanica te transfor maciji uzrokovanoj fizikalnim, kemijskim ili virusnim agensima. Ta je pretpostavka u me|uvremenu u velikoj mjeri potvr|ena, a otkri}e stani~nih gena srodnih src otvorilo je vrata na{em razumijevanju regulacije proliferacije nor malnih stanica i molekular nih temelja nastanka
Harold Varmus
J. Michael Bishop
raka u ljudi. Pokazalo se da su istraìvanja onkogenih i protoonkogenih proteina, pa tako i samoga Src, od najve}e va`nosti u razotkrivanju signalnih puteva {to kontroliraju proliferaciju i diferencijaciju nor malnih stanica. Otkri}e src protoonkogena je, nadalje, dovelo do pretpostavke da tumori, koji nisu uzrokovani virusima, mogu nastati zbog mutacija srodnih stani~nih gena {to je izravno dovelo do otkri}a onkogena u ljudskim tumorima. Sjedinjuju}i istraìvanja tumorskih virusa, nor malnih stanica i tumora koji nisu uzrokovani virusima, rezultati Varmusa, Bishopa i njihovih suradnika utjecali su na prakti~ki sve aspekte istraìvanja stani~ne regulacije i raka.
kogene nastale mutacijama ili prestrojavanjem DNA tijekom nastanka raka. Prvi izravan dokaz va`nosti stani~nih onkogena za nastanak ljudskih tumora potje~e iz pokusa prijenosa gena u~injenih u laboratorijima Roberta Weinberga i jednog od autora ove knjige (GMC) 1981. godine. Na|eno je da DNA ljudskoga karcinoma mokra}noga mjehura efikasno transformira mi{je stanice u kulturi {to je upu}ivalo na to da ljudski tumor sadràva biolo{ki aktivan stani~ni onkogen (slika 15-22). Otada su testovi prijenosa gena i drugi eksperimentalni pristupi doveli do otkri}a aktivnih stani~nih onkogena u nizu ljudskih tumora (tablica 15-4). Neki od onkogena otkrivenih u ljudskim tumorima stani~ni su homolozi onkogena ranije na|enih u retrovirusima, dok su drugi prvi put otkriveni u slu~ajevima raka u ljudi. Za ljudski onkogen koji je prvi otkriven testom prijenosa gena kasnije je pokazano da je homologan s rasH onkogenom Harveyeva sarkomskoga virusa (vidi tablicu 15-3). Onkogeni, koji se naj~e{}e susre}u u ljudskim tumorima, tri su vrlo srodna ~lana porodice ras gena (rasH, rasK i rasN). Ovi geni imaju odre|enu ulogu u nastanku otprilike 20% svih ljudskih malignoma uklju~uju}i oko 50% slu~ajeva raka debeloga crijeva i 25% slu~ajeva raka plu}a. Ras onkogena nema u normalnim stanicama; u tumorskim stanicama nastaju zbog mutacija koje se doga|aju tijekom razvoja tumora. Ras onkogeni se od odgovaraju}ih protoonkogena razlikuju po zamjenama pojedina~nih aminokiselina na klju~nim mjestima. Prva otkrivena takva mutacija bila je zamjena glicina valinom na 12. mjestu (slika 15-23). U ljudskim se tumori-
ljudski karcinom mjehura
DNA
onkogen
onkogen
mi{je stanice onkogen iz ljudskoga karcinoma mjehura
Slika 15-22. Otkrivanje ljudskoga tumorskog onkogena prijenosom gena.

DNA izolirana iz ljudskoga karcinoma mokra}noga mjehura dovela je do transformacije mi{jih stanica u kulturi. Do transformacije je do{lo zbog integracije i ekspresije onkogena iz ljudskoga tumora.
transformirane mi{je stanice
650
Poglavlje 15
Tablica 15-4. Onkogeni svojstveni ljudskim tumorima

Onkogen
abl akt bcl-2 D1 D1 E2A/pbx1 erbB-2 gip gli gsp hox-11 lyl c-myc c-myc L-myc N-myc PDGFR PI3K PML/RARa B-raf rasH rasK rasN ret ret SMO
Vrsta raka
kroni~na mijeloi~na leukemija, akutna limfoblasti~na leukemija karcinom dojke, jajnika i gu{tera~e folikularni B stani~ni limfom adenom paratireoidee, B stani~ni limfom planocelularni karcinom, karcinom, mjehura, dojke, jednjaka, jetre i plu}a akutna limfoblasti~na leukemija karcinom dojke i jednjaka karcinom kore nadbubre`ne `lijezde i jajnika glioblastom tumor hipofize i {titnja~e akutna T limfoblasti~na leukemija akutna T limfoblasti~na leukemija Burkittov limfom karcinom dojke i plu}a karcinom plu}a neuroblastom, karcinom plu}a kroni~na mijelomonocitna leukemija karcinom jajnika akutna promijelocitna leukemija melanom, karcinom debeloga crijeva karcinom {titnja~e karcinom debeloga crijeva, plu}a, gu{tera~e i {titnja~e akutna mijeloi~na i limfoblasti~na leukemija karcinom {titnja~e sindrom multiple endokrine neoplazije tip 2A i 2B karcinom {titnja~e bazaliom
Mehanizam aktivacije
translokacija amplifikacija translokacija translokacija amplifikacija translokacija amplifikacija to~kasta mutacija amplifikacija to~kasta mutacija translokacija translokacija translokacija amplifikacija amplifikacija amplifikacija translokacija amplifikacija translokacija to~kasta mutacija to~kasta mutacija to~kasta mutacija to~kasta mutacija to~kasta mutacija preslagivanje DNA to~kasta mutacija
ma ~esto nalaze i druge zamjene aminokiselina na 12., kao i 13. i 61. mjestu ras onkogena. Na ìvotinjskim je modelima pokazano da kemijski karcinogeni mijenjaju ras protoonkogene u onkogene. To je otkri}e potvrdilo da su mutageni u~inci karcinogena i transformacija stanica direktno povezani. Kao {to je obja{njeno u 13. poglavlju, ras geni kodiraju proteine koji veù gvaninske nukleotide i sudjeluju u prijenosu mitogenih signala od razli~itih receptora za faktore rasta. Aktivnost Ras proteina ovisi o vezanju GTP ili GDP tako oni mogu biti u aktivnom (vezan GTP) ili inaktivnom (vezan , GDP) stanju (vidi sliku 13-33). Mutacije karakteristi~ne za ras onkogene odràvaju Ras protein konstitutivno u aktivnoj konformaciji s vezanim GTP . Do toga najve}im dijelom dolazi zato {to GAP (protein koji aktivira GTPazu) ne djeluje na onkogeni Ras protein. GAP stimulira hidrolizu GTP vezanog za normalni Ras. Zbog smanjenja unutarstani~ne GTPazne aktivnosti onkogeni Ras protein ostaje u aktivnom stanju s vezanim GTP i poti~e nekontroliranu proliferaciju stanica. To~kaste mutacije samo su jedan od na~ina na koji iz protoonkogena u ljudskim tumorima nastaju onkogeni. Mnoge stanice raka imaju poreme}e-
Rak
651
10
11
12
13
188 189
normalni gen Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly
ATG ACG GAA TAT AAG CTG GTG GTG GTG GGC GCC GGC GGT GTC
.......
Leu Ser
CTC TCC
Slika 15-23. To~kaste mutacije u ras onkogenima.

Promjena jednog nukleotida u 12. kodonu, iz GGC (Gly) u GTC (Val), dovodi do toga da rasH onkogen, izoliran iz DNA karcinoma mjehura, moè transformirati stanice.
onkogen Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly
.......
Leu Ser
nu gra|u kromosoma, {to uklju~uje translokacije, duplikacije i delecije. Prestrojavanja gena uzrokovana kromosomskim translokacijama ~esto dovode do nastanka onkogena. Istraìvanja kromosomskih promjena u nekim su slu~ajevima pokazala da su za nastanak tumora odgovorni otprije poznati onkogeni. U drugim su slu~ajevima molekularnim kloniranjem i analizom redoslijeda baza promijenjenih dijelova DNA otkriveni novi onkogeni. Prvi dobro opisan primjer aktivacije onkogena do koje dolazi zbog kromosomske translokacije jest uloga c-myc onkogena u ljudskim Burkittovim limfomima i mi{jim plazmocitomima, zlo}udnim bolestima B limfocita koji stvaraju protutijela (slika 15-24). U obje vrste tumora redovito se nalaze kromosomske translokacije koje zahva}aju podru~ja gena za imunoglobuline. Primjerice, u prakti~ki svim Burkittovim limfomima nalazi se translokacija djeli}a 8. kromosoma na jedan od lokusa imunoglobulinskih gena na 2. (l laki lanac), 14. (te{ki lanci) ili 22. kromosomu (l laki lanac). Budu}i da ovi tumori aktivno sintetiziraju imunoglobuline, mogu}e je da translokacija ak-
normalni kromosomi
kromosomski poreme}aj
translokacija
c-myc IgH IgH/c-myc
Slika 15-24. Translokacija c-myc gena.

U Burkittovim limfomima dolazi do translokacije c-myc protoonkogena s 8. kromosoma na lokus imunoglobulinskih te{kih lanaca {to dovodi do poreme}aja u njegovoj ekspresiji.
14
652
Poglavlje 15
DNA c-abl translokacija bcr 22 22 Philadelphia kromosom
1B
1A
2 3
5 6 7 8 9 10
11
DNA bcr
translokacija
bcr/abl
DNA bcr/abl
1A
5 6 7
9 10 11
abl 9 Bcr/Abl mRNA
transkripcija
Bcr/Abl fuzijski protein
Slika 15-25. Translokacija abl gena.

U kroni~noj mijeloi~noj leukemiji Philadelphia kromosom nastaje translokacijom abl onkogena s 9. na 22. kromosom. Time dolazi do spajanja abl protoonkogena, koji ima dva alternativna prva egzona (1A i 1B) i bcr gena s 22. kromosoma. Zbog translokacije dolazi do delecije egzona 1B. Transkripcija hibridnoga gena zapo~inje na promotoru bcr i nastavlja se cijelim tokom abl. Prekrajanjem nastaje hibridna Bcr/Abl mRNA iz koje je izrezan egzon 1A abl gena, a slijed nukleotida iz bcr spojen je s 2. egzonom abl gena. Translacijom iz Bcr/Abl mRNA nastaje rekombinantni Bcr/Abl fuzijski protein.
tivira neki protoonkogen s 8. kromosoma, ume}u}i ga u imunoglobulinske lokuse. Kako bi dokazali ovu pretpostavku, istraìva~i su sondama za poznate onkogene analizirali tumorsku DNA i na{li da se na mjestu loma 8. kromosoma u Burkittovom limfomu nalazi protoonkogen c-myc. Translokacije ume}u c-myc u imunoglobulinski lokus i tako dovode do poreme}aja njegove ekspresije. c-myc kodira transkripcijski faktor, normalno induciran stimulacijom faktorima rasta, a ovakva njegova nekontrolirana ekspresija dovoljna je da potakne izrazitu proliferaciju stanica i pridonese nastanku tumora. Translokacije drugih protoonkogena ~esto dovode do poreme}aja u kodiraju}em redoslijedu baza zbog ~ega nastaju nenormalni genski produkti. Prototip takvih poreme}aja jest translokacija abl protoonkogena s 9. na 22. kromosom u kroni~noj mijeloi~noj leukemiji (slika 15-25). Ova translokacija dovodi do fuzije abl s genom nazvanim bcr s 22. kromosoma. Zbog toga dolazi do stvaranja fuzijskoga Bcr/Abl proteina u kojem je normalni amino-kraj Abl protoonkogenog proteina zamijenjen aminokiselinskim slijedom iz Bcr. Fuzija s Bcr proteinom dovodi do poreme}aja regulacije aktivnosti Abl protein-tirozin-kinaze i transformacije stanica. Poseban mehanizam aktivacije onkogena u ljudskim tumorima jest amplifikacija gena koja dovodi do poja~ane ekspresije gena. Amplifikacija gena (vidi sliku 5-55) ~esta je u tumorskim stanicama, u kojima se pojavljuje vi{e od tisu}u puta ~e{}e nego u normalnima. Amplifikacija onkogena mogla bi igrati ulogu u progresiji mnogih tumora karakteriziranoj brìm rastom i zlo}udnijim pona{anjem. Uistinu, molekularno kloniranje i analiza dijelova DNA amplificiranih u tumorima doveli su do otkri}a novih onkogena. Dobar primjer amplifikacije onkogena je uloga N-myc gena, srodnog cmyc, u neuroblastomima (dje~jim tumorima gra|enim od embrionalnih ìv~anih stanica). Amplificirane kopije N-myc gena ~esto se nalaze u agresiv-
Rak
653
nim i brzo rastu}im tumorima {to upu}uje na mogu}nost da je amplifikacija N-myc povezana s progresijom i pove}anjem zlo}udnosti neuroblastoma. Na sli~an je na~in amplifikacija jednoga drugog onkogena, erbB-2, koji kodira receptorsku protein-tirozin-kinazu, povezana s progresijom karcinoma dojke i jajnika.
faktor rasta (EGF) stani~na
Djelovanje onkogenih proteina

U skupinu virusnih i stani~nih onkogena spada velik broj gena (sveukupno oko 100) koji mogu dovesti do nenormalnoga pona{anja zlo}udnih stanica. Kao {to je ve} re~eno, mnogi protoonkogeni kodiraju proteine koji reguliraju proliferaciju normalnih stanica. U tim slu~ajevima poja~ana ekspresija ili aktivnost odgovaraju}eg onkogenog proteina uzrokuje nekontroliranu proliferaciju stanica raka. Drugi onkogeni proteini djeluju na druge aspekte pona{anja stanica raka, poput poreme}aja diferencijacije i izbjegavanja programirane stani~ne smrti. Ve}ina onkogenih proteina dijelovi su signalnih puteva koji reguliraju proliferaciju i preìvljavanje stanica nakon stimulacije faktorima rasta. Takvi onkogeni proteini mogu biti polipeptidni faktori rasta, receptori za faktore rasta, dijelovi unutarstani~nih signalnih puteva ili transkripcijski faktori (slika 15-26). Faktori rasta mogu postati onkogeni u slu~ajevima poreme}ene ekspresije kada tumorske stanice proizvode faktor rasta na koji i odgovaraju. Tako dolazi do autokrine stimulacije stanica koje proizvode faktor rasta (vidi sliku 15-9) i izrazite proliferacije stanica. îni se da ovaj mehanizam pridonosi nastanku velikog broja ljudskih tumora. Velik broj onkogena kodira receptore za faktore rasta, uglavnom protein-tirozin-kinaze. U ovih se receptora ~esto nalaze promjene u domenama na amino-kraju na koje se obi~no veù izvanstani~ni faktori rasta. Te promjene dovode do toga da receptori postaju onkogeni. Primjerice, u nekim ljudskim leukemijama receptor za faktor rasta iz trombocita (PDGF) postaje onkogen zbog kromosomske translokacije kojom je normalni amino-kraj PDGF receptora zamijenjen slijedom s amino-kraja transkripcijskoga faktora nazvanog Tel (slika 15-27). Neovisno o vezanju faktora rasta, zbog djelovanja slijeda Tel dolazi do dimerizacije hibridnog Tel/PDGFR fuzijskoga proteina, konstitutivne aktivacije unutarstani~ne kinazne domene i prekomjernoga stvaranja signala za proliferaciju stanice. Do aktivacije gena, koji kodiraju receptorske protein-tirozin-kinaze, kao {to je erbB-2, moè do}i zbog amplifikacije gena. Drugi onkogeni (uklju~uju}i src i abl) kodiraju protein-tirozin-kinaze koje nisu receptori, a delecije ili mutacije regulatornih sljedova ih konstitutivno aktiviraju. Proteini Ras igraju klju~nu ulogu u mitogenoj signalizaciji povezuju}i receptore za faktore rasta s aktivacijom protein-serin/treonin-kinaze Raf ~ime zapo~inje kaskada protein-kinaza koja dovodi do aktivacije kinaze ERK MAP (vidi sliku 13-32). Kao {to je ranije re~eno, mutacije koje pretvaraju ras protoonkogene u onkogene dovode do konstitutivne aktivacije proteina Ras {to pak uzrokuje aktivaciju puta ERK. Na sli~an na~in moè se raf gen pretvoriti u onkogen delecijama koje dovode do gubitka regulatornih domena na amino-kraju proteina Raf (vidi sliku 15-21). Zbog takvih delecija dolazi do poreme}aja u aktivnosti protein-kinaze Raf koji tako|er dovode do konstitutivne aktivacije ERK. Druga je mogu}nost da se raf protoonkogen pretvori u onkogen to~kastim mutacijama koje pove}avaju aktivnost Raf-kinaze. ERK put kona~no dovodi do fosforilacije transkripcijskih faktora i promjena u ekspresiji gena. Kao {to bi se na temelju toga moglo i pretpostaviti, mnogi onkogeni kodiraju proteine regulatore transkripcije do ~ije indukci-
citoplazma MEK
ERK
jezgra ERK Elk-1 DNA SRF
Slika 15-26. Onkogeni i prijenos signala.

Onkogeni proteini djeluju kao ~imbenici rasta (primjerice, EGF), receptori za faktore rasta (primjerice, ErbB) i unutarstani~ne signaliziraju}e molekule (Ras i Raf). Ras i Raf aktiviraju ERK MAP kinazni put (vidi slike 13-32 i 13-35) dovode}i do indukcije drugih gena (primjerice, fos) koji kodiraju potencijalno onkogene proteine, regulatore transkripcije. Proteini za koje se zna da imaju onkogeni potencijal osjen~ani su ùto.
654
Poglavlje 15
receptor za PDGF proto-onkogeni protein
PDGF
Tel/PDGF receptor onkogeni protein
slobodni receptor
vezanje PDGF
Tel
stani~na membrana
neaktivna kinaza
aktivna
konstitutivno aktivna kinaza
Slika 15-27. Mehanizam onkogene aktivacije Tel/PDGFR.

Do aktivacije nor malnog receptora za PDGF (PDGFR) dolazi zbog dimerizacije uzrokovane vezanjem PDGF. Tel/ PDGFR onkogen kodira fuzijski protein u kojem je normalna izvanstani~na domena receptora za PDGF zamijenjena slijedom s amino-kraja transkripcijskoga faktora Tel. Taj dio Tel sadràva uzvojnica-om~a-uzvojnica dimerizacijsku domenu (vidi sliku 6-27). Ovaj slijed dimerizira i u odsutnosti PDGF {to dovodi do konstitutivne aktivacije onkogenske protein-kinaze.
AP- 1
Fos
Jun mRNA
Slika 15-28. Transkripcijski faktor AP-1.

Fos i Jun dimeriziraju stvaraju}i AP-1 koji aktivira transkripciju niza gena induciranih faktorima rasta.
je normalno dolazi kao odgovor na stimulaciju faktorima rasta. Primjerice, do indukcije transkripcije fos protoonkogena dolazi zbog fosforilacije Elk-1 ERK-om (vidi sliku 15-26). Fos i produkt jednoga drugog protoonkogena, Jun, dijelovi su transkripcijskog faktora AP-1 koji aktivira transkripciju brojnih ciljnih gena u stanicama nakon stimulacije faktorima rasta (slika 15-28). Konstitutivna aktivnost AP-1, do koje dolazi zbog poreme}ene ekspresije Fos ili Jun onkogenog proteina, dovoljno je snaàn podraàj za proliferaciju stanica da dovede do transformacije. Sli~no je i djelovanje proteina Myc. To su transkripcijski ~imbenici ~ija aktivnost ovisi o mitogenim podraàjima. Poreme}aji u ekspresiji myc onkogena pridonose nastanku razli~itih ljudskih tumora. U ljudskim leukemijama i limfomima kromosomske translokacije ~esto dovode do onkogene aktivacije drugih transkripcijskih faktora. Sastavni dijelovi drugih signalnih puteva, uklju~uju}i Hedgehog, Wnt, Notch i signalne puteve povezane s G proteinima, tako|er mogu postati onkogeni. Primjerice, u tumorima {titnja~e mutacije pretvaraju gen, koji kodira receptor za tireotropin povezan s G proteinom, u onkogen (slika 1529). Tireotropin je hormon hipofize koji stimulira proliferaciju stanica {titnja~e preko receptora {to aktivira adenil-ciklazu, a povezan je s G proteinom. Mutacije tireotropinskog receptora u tumorima {titnja~e dovode do konstitutivne aktivacije receptora koji onda stimulira stani~nu proliferaciju aktivacijom cAMP signalnog puta. Na sli~an na~in mogu u nekim stanicama i geni koji kodiraju G proteine djelovati kao onkogeni. Gsp onkogen, koji kodira a podjedinicu Gs, nastaje to~kastim mutacijama sli~nim onima {to se nalaze u ras onkogenima. Te mutacije dovode do konstitutivne aktivnosti Gsa podjedinice i poreme}aja u stimulaciji adenil-ciklaze. Kao {to bi se moglo i o~ekivati, gsp onkogen je vaàn za nastanak tumora {titnja~e i hipofize, organa u kojima cAMP stimulira proliferaciju stanica. Zbog sli~nih mutacija mogu iz gena koji kodiraju a-podjedinice drugih G proteina nastati onkogeni odgovorni za transformaciju drugih vrsta stanica, poput nadbubre`ne `lijezde i jajnika. Unutarstani~ni signalni putevi aktivirani stimulacijom faktorima rasta na posljetku reguliraju dijelove sustava koji kontrolira stani~ni ciklus i re-
Rak
655
tireotropin
tireotropinski receptor
adenil-ciklaza
bg a
GDP
cAMP
proliferacija stanica
Slika 15-29. Onkogeni u~inak receptora povezanih s G proteinima i G proteina.
zultiraju napredovanjem kroz restrikcijsku to~ku u G1. Indukcija ciklina D tipa nastaje kao odgovor na stimulaciju faktorima rasta. Ovi ciklini igraju klju~nu ulogu u povezivanju signala faktora rasta i napredovanja stani~noga ciklusa (vidi sliku 14-19). Stoga nije ~udno da je gen koji kodira ciklin D1 protoonkogen, a u onkogen (nazvan D1) ga pretvaraju kromosomske translokacije ili amplifikacije gena. Ove promjene uzrokuju konstitutivnu ekspresiju ciklina D1 koja dovodi do proliferacije stanica neovisne o normalnoj stimulaciji faktorima rasta. Iako mnogi onkogeni stimuliraju proliferaciju stanica, onkogeno djelovanje nekih transkripcijskih faktora je posljedica inhibicije diferencijapluripotentna mati~na stanica cije stanica. Kao {to je re~eno u 13. poglavlju, hormoni {titnja~e i retinoi~na kiselina dovode do diferencijacije razli~itih vrsta stanica. Ovi hormoni difundiraju kroz stani~nu membranu i veù se na unutarstani~ne receptore koji djeluju kao regulatori transkripcije. Mutirane ina~ice receptora za hormone {titnja~e mijeloblast
Tireotropinski receptor je preko Gs spojen s adenil-ciklazom. Geni koji kodiraju receptor ili Gsa podjedinicu (Gsa) mogu djelovati kao onkogeni stimuliraju}i proliferaciju stanica {titnja~e.
promijelocit PML/RARa
Slika 15-30. Djelovanje onkogenoga proteina PML/RARa.

granulocit
PML/RARa fuzijski protein sprje~ava diferencijaciju promijelocita u granulocite.
656
Poglavlje 15
Slika 15-31. Onkogeni i preìvljavanje stanica.

Onkogeni proteini ~iji signali dovode do preìvljavanja stanica uklju~uju faktore rasta, receptore za faktore rasta, PI3-kinazu i Akt. Signali iz PI3-kinaza/ Akt puta reguliraju ~lanove Bcl-2 porodice koji pomaù preìvljavanje stanica inhibiraju}i otpu{tanje citokroma c iz mitohondrija. Proteini s onkogenim potencijalom osjen~ani su ùto.
stani~na membrana
PIP2
PIP3
mitohondrij
citokrom c
aktivacija kaspaza
smrt stanice
(ErbA) i retinoi~nu kiselinu (PML/RARa) su onkogeni koko{je eritroleukemije, odnosno ljudske akutne promijelocitne leukemije. U oba slu~aja ~ini se da mutirani onkogeni receptori ometaju djelovanje svojih normalnih homologa te tako onemogu}uju sazrijevanje stanica i zaustavljaju leukemijske stanice u stanju aktivne proliferacije (slika 15-30). U slu~aju akutne promijelocitne leukemije mogu}e je visokim dozama retinoi~ne kiseline prevladati u~inak PML/RARa onkogenog proteina i dovesti do diferencijacije leukemijskih stanica. Ova biolo{ka ~injenica ima direktne klini~ke posljedice: bolesnike s akutnom promijelocitnom leukemijom moè se uspje{no lije~iti retinoi~nom kiselinom koja dovodi do diferencijacije i zaustavlja trajnu proliferaciju stanica. Kao {to je re~eno ranije u ovom poglavlju, najve}u va`nost za nastanak tumora ima ~injenica da su stanice raka otporne na programiranu stani~nu smrt ili apoptozu. Nekoliko onkogena kodira proteine koji djeluju pove}avaju}i preìvljavanje stanica (slika 15-31). Preìvljavanje ve}ine ìvotinjskih stanica ovisi o stimulaciji faktorima rasta, tako da onkogeni koji kodiraju faktore rasta, receptore za faktore rasta i signalne proteine poput Ras ne djeluju samo poti~u}i proliferaciju stanica, ve} i sprje~avaju}i stani~nu
Rak
657
normalna stanica
tumorska stanica
Slika 15-32. Supresija sposobnosti stvaranja tumora fuzijom stanica.

Fuzijom tumorskih i normalnih stanica nastaju hibridi s kromosomima obaju roditelja. Iz takvih hibrida obi~no ne nastaju tumori.
fuzija stanica
hibridna stanica iz koje ne nastaje tumor
smrt. Kao {to je re~eno u 13. poglavlju, PI3-kinaza i Akt signalni put igraju klju~nu ulogu u sprje~avanju apoptoze mnogih stanica ovisnih o faktorima rasta, a geni koji kodiraju PI3-kinazu i Akt mogu biti onkogeni u retrovirusnim i ljudskim tumorima. Signali iz PI3-kinaze i Akt proteina dolaze do ~lanova Bcl-2 porodice (Bad). Zanimljivo je da je Bcl-2 prvo otkriven kao onkogen u ljudskim limfomima. Bcl-2 onkogen nastaje zbog kromosomske translokacije koja dovodi do poja~ane ekspresije Bcl-2, sprje~ava apoptozu i omogu}uje preìvljavanje stanica u uvjetima koje normalno dovode do stani~ne smrti. Otkri}e onkogenoga djelovanja bcl-2 nije bilo samo prvi dokaz zna~aja programirane stani~ne smrti za nastanak raka, ve} je i omogu}ilo prepoznavanje sredi{nje uloge bcl-2 i srodnih gena u regulaciji apoptoze u tako razli~itim organizmima kao {to su C. elegans i ~ovjek.
Tumor-supresorski geni
Aktivacija stani~nih onkogena samo je jedna od dviju razli~itih vrsta genskih promjena va`nih za nastanak tumora; druga je inaktivacija tumor-supresorskih gena. Onkogeni dovode do poreme}aja u stani~noj proliferaciji, bilo zbog poja~ane ekspresije gena, bilo zbog nekontrolirane aktivacije onkogenih proteina. Tumor-supresorski geni imaju suprotnu ulogu u kontroli stani~noga rasta; oni normalno inhibiraju stani~nu proliferaciju i nastanak tumora. U mnogih su tumora ovi geni nestali ili inaktivirani, zbog ~ega prestaje funkcionirati negativna regulacija stani~ne proliferacije {to pridonosi nastanku poreme}aja proliferacije karakteristi~nom za tumorske stanice.
ènsko
mu{ko
Otkri}e tumor-supresorskih gena

Prve naznake o djelovanju tumor-supresorskih gena dali su pokusi hibridizacije somatskih stanica koje su Henry Harris i suradnici potaknuli 1969. godine. Fuzijom normalnih i tumorskih stanica nastale su hibridne stanice koje su sadràvale kromosome obaju roditelja (slika 15-32). Takve hibridne stanice nisu, u ve}ini slu~ajeva, mogle stvarati tumore u ìvotinjama. Prema tome, ~inilo se da geni iz normalne roditeljske stanice sprje~avaju (ili suprimiraju) nastanak tumora. Me|utim, prepoznavanje ovih gena na molekularnoj razini omogu}io je jedan drugi pristup analiza rijetkih nasljednih oblika raka u ljudi. Do otkri}a prvoga tumorskog supresorskog gena dovela su istraìvanja retinoblastoma, rijetkoga dje~jeg tumora oka. Ako se bolest rano otkrije, re-
Slika 15-33. Naslje|ivanje retinoblastoma.

Otprilike 50% potomaka naslje|uje sklonost nastanku retinoblastoma od roditelja. Zahva}ene su osobe ozna~ene ljubi~astom, a normalne zelenom bojom.
658
Poglavlje 15
nasljedni jaja{ce Rb+ spermij Rb jaja{ce Rb+
sporadi~ni spermij Rb+
jedna mutacija je ve} prisutna u zametku
Rb+ Rb
Rb+
Rb+
prva somatska mutacija
Rb+ Rb Rb
Rb+ Rb+
Rb+ Rb
Rb+
druga somatska mutacija
druga somatska mutacija
Rb+ Rb Rb
Rb+ Rb+
Rb+ Rb
Rb+
Rb+ Rb Rb
Rb Rb+
Rb+ Rb
Rb
nastanak tumora
nastanak tumora
Rb Rb Rb
Rb Rb
Rb Rb
Rb Rb
Rb Rb
Rb
Slika 15-34. Mutacije Rb gena tijekom nastanka retinoblastoma.

Dijete s nasljednim retinoblastomom je od zahva}enog roditelja naslijedilo defektnu kopiju Rb gena (Rb). Druga somatska mutacija, koja inaktivira jedinu preostalu normalnu kopiju Rb+ u stanici retine, dovodi do nastanka retinoblastoma. U sporadi~nim slu~ajevima, bolesnici su naslijedili dva normalna Rb+ gena pa retinoblastom nastaje samo ako dvije somatske mutacije inaktiviraju obje kopije Rb gena u istoj stanici.
Rak
659
tinoblastom se moè uspje{no lije~iti i mnogi bolesnici preìve dovoljno dugo da osnuju vlastite obitelji. To je omogu}ilo da se prepoznaju nasljedni oblici retinoblastoma. U tim slu~ajevima, retinoblastomi se pojavljuju u otprilike 50% djece takvog roditelja {to govori da je za sklonost nastanku tumora odgovoran jedan gen koji se naslje|uje autosomno dominantno u skladu s Mendelovim pravilima (slika 15-33). Iako se sklonost nastanku retinoblastoma naslje|uje kao autosomno dominantno svojstvo, odgovorni gen nije sam po sebi dostatan za transformaciju normalne retinalne stanice u tumorsku. Sve su retinalne stanice bolesnika naslijedile taj gen, ali }e samo mali broj njih postati tumorske. Prema tome, da bi tumor nastao, uz naslije|enu sklonost potrebni su i drugi doga|aji. Alfred Knudson je 1971. godine objavio pretpostavku prema kojoj su za nastanak retinoblastoma potrebne dvije mutacije za koje danas znamo da odgovaraju gubitku funkcije obaju alela gena odgovornog za sklonost nastanku tumora (tumor-supresorski gen Rb) (slika 15-34). U slu~ajevima nasljednoga retinoblastoma, od roditelja se naslje|uje jedna defektna kopija Rb gena. Gubitak jednoga Rb alela nije dovoljan za nastanak tumora, no u tih osoba skoro uvijek nastaju retinoblastomi zbog somatske mutacije koja dovodi do gubitka preostaloga normalnog Rb alela. Za razliku od toga, sporadi~ni retinoblastom je rijetkost jer, da bi nastao, treba u istoj stanici dvjema neovisnim somatskim mutacijama inaktivirati oba normalna Rb alela. Na ~injenicu da Rb gen funkcionira kao negativni regulator tumorogeneze prvotno su uputila istraìvanja morfologije kromosoma. U nekim retinoblastomima na|ene su vidljive delecije kromosoma 13q14 {to je govorilo da tumori nastaju zbog gubitka (a ne aktivacije) Rb gena (slika 15-35). Istraìvanja kartiranja gena pokazala su da tumor nastaje zbog gubitka normalnih Rb alela u tumorskim stanicama potvrdiv{i pretpostavku da Rb djeluje kao tumor-supresorski gen. Molekularnim kloniranjem i izolacijom Rb, 1986. je godine nedvojbeno dokazano da u retinoblastomima Rb nedostaje ili je mutiran. Pokusi prijenosa gena pokazali su da stanice retinoblastoma, u koje je unesen normalni Rb gen, nisu sposobne stvarati tumore {to je bio izravan dokaz da Rb djeluje kao tumorski supresor. Iako je Rb otkriven u rijetkoj dje~joj vrsti raka, odgovoran je za nastanak i nekih ~e{}ih tumora odraslih. Istraìvanja su pokazala da do nestanka ili inaktivacije Rb dolazi u mnogo slu~ajeva karcinoma mjehura, dojke i plu}a. Prema tome, tumor-supresorski gen Rb nije vaàn samo zbog retinoblastoma, ve} izgleda da pridonosi nastanku i zna~ajnog broja ~e{}ih ljudskih tumora. Osim toga, kako je re~eno ranije u ovom poglavlju, Rb protein je klju~na meta onkogenih proteina nekolicine tumorskih DNA virusa, poput SV40, adenovirusa, ljudskih papilomavirusa i herpesvirusa povezanog s Kaposijevim sindromom, koji veù i tako inhibiraju aktivnost Rba (slika 1536). Transformacija, do koje ovi virusi dovode, barem dijelom nastaje zbog inaktivacije Rb na razini proteina, umjesto inaktivacije Rb gena mutacijama. Opis djelovanja Rb kao tumor-supresorskoga gena posluìo je kao prototip za otkrivanje drugih tumor-supresorskih gena koji pridonose nastanku velikog broja razli~itih vrsta raka u ljudi (tablica 15-5). Neki od tih gena otkriveni su jer uzrokuju rijetke nasljedne vrste raka, sli~no kao {to Rb uzrokuje nasljedni retinoblastom. Drugi su tumor-supresorski geni otkriveni jer obi~no nedostaju ili su mutirani u ~estim sporadi~nim vrstama raka odraslih, poput raka debeloga crijeva. Op}enito, ~ini se da ve}ina tumorskih supresorskih gena igra odre|enu ulogu u nastanku kako nasljednih, tako i sporadi~nih vrsta raka. Zapravo, izgleda da su mutacije nekih tumor- supresorskih gena naj~e{}e molekularne promjene odgovorne za nastanak ljudskih tumora.
Rb+
delecija
Rb
normalno
retinoblastom
Slika 15-35. Delecija Rb gena u retinoblastomu.

Mnogi retinoblastomi imaju delecije kromosomskoga lokusa (13q14) na kojem se nalazi Rb gen.
Rb
infekcija sa SV40
T antigen inaktivira Rb protein transformacija stanice
Slika 15-36. Me|udjelovanje Rb i onkogenih proteina tumorskih DNA virusa.

Onkogeni proteini iz nekoliko tumorskih DNA virusa (primjerice, T antigen iz SV40) dovode do transformacije veù}i i inaktiviraju}i Rb protein.
660
Poglavlje 15
Tablica 15-5. Tumorski supresorski geni

Gen
APC BRCA1 BRCA2 INK4 NF1 NF2 p53 PTC PTEN Rb Smad2 Smad4 TbRII VHL WT1
Drugi otkriveni tumor-supresorski gen je p53, ~esto inaktiviran u nizu ljudVrsta raka skih tumora poput leukemije, limfoma, sarkoma, tumora mozga i karcinoma karcinom debeloga i zavr{noga crijeva razli~itih organa uklju~uju}i dojku, dekarcinom dojke i jajnika belo crijevo i plu}a. Sveukupno, mutacikarcinom dojke je p53 pridonose nastanku otprilike 50% melanom, karcinom plu}a, tumori mozga, leukemije, limfomi svih slu~ajeva raka {to ga ~ini naj~e{}om neurofibrosarkom metom genskih promjena u ljudskim meningeom malignomima. Zanimljivo je da naslijetumori mozga; karcinomi dojke, debeloga i zavr{noga crijeva, |ene mutacije p53 uzrokuju rijedak sinjednjaka, jetre i plu}a; sarkomi; leukemije i limfomi drom nasljedne sklonosti raku u kojem bazaliom se u zahva}enih osoba pojavljuje jedna tumori mozga; melanom; karcinom prostate, trupa maternice, od niz razli~itih vrsta raka. Osim toga je bubrega i plu}a p53 (poput Rb) meta onkogenih proteiretinoblastom; sarkomi; karcinom mjehura, na SV40, adenovirusa, ljudskih papilodojke i plu}a mavirusa i herpesvirusa povezanog s karcinom debeloga i zavr{noga crijeva Kaposijevim sarkomom. karcinom debeloga i zavr{noga crijeva i gu{tera~e Poput p53, tumor-supresorski geni karcinom debeloga i zavr{noga crijeva i èluca INK4 i PTEN vrlo su ~esto mutirani u nekarcinom bubrega koliko ~estih vrsta tumora poput raka Wilmsov tumor plu}a, prostate i melanoma. Drugi tumor-supresorski geni (uklju~uju}i APC, TbRII, Smad2 i Smad4) ~esto su inaktivirani u raku debeloga crijeva. Osim {to su va`ne za nastanak sporadi~nih slu~ajeva ovoga ~estog raka odraslih, naslije|ene mutacije APC gena uzrokuju rijedak nasljedni oblik raka debeloga crijeva nazvan obiteljska adenomatozna polipoza. U osoba s ovom bole{}u razvija se na stotine dobro}udnih adenoma debeloga crijeva (polipa) od kojih }e neki neizbje`no postati zlo}udni. Naslije|ene mutacije drugih dvaju tumor-supresorskih gena, BRCA1 i BRCA2, uzrokuju nasljedni rak dojke na koji otpada 5 do 10% svih slu~ajeva ove bolesti. Sumnja se da drugi tumor-supresorski geni dovode do nastanka tumora mozga, raka gu{tera~e i bazalioma, kao i nekih rijetkih nasljednih oblika raka, poput Wilmsova tumora.
Djelovanje produkata tumor-supresorskih gena

Za razliku od protoonkogenih i onkogenih proteina, proteini koje kodira ve}ina tumor-supresorskih gena inhibiraju stani~nu proliferaciju ili preìvljavanje. Nakon inaktivacije tumor-supresorskih gena tumori nastaju zbog nedostatka negativnih regulacijskih proteina. Tumor-supresorski proteini ~esto inhibiraju upravo one stani~ne regulacijske puteve koje onkogeni produkti stimuliraju. Protein {to ga kodira tumor-supresorski gen PTEN zanimljiv je primjer antagonizma izme|u produkata onkogena i tumor-supresorskih gena (slika 15-37). PTEN protein je fosfataza lipida koja defosforilira fosfatidilinozitide poput fosfatidilinozitol-3,4,5-bisfosfata (PIP3) na 3. poziciji. Defosforiliraju}i PIP3, PTEN se suprotstavlja djelovanju PI3-kinaze i Akt proteina, koji mogu djelovati kao onkogeni stimuliraju}i preìvljavanje stanica. S druge strane, inaktivacija ili gubitak PTEN tumor-supresorskoga proteina moè pridonijeti nastanku tumora pove}anjem razine PIP3, aktivacijom Akt proteina i inhibicijom programirane stani~ne smrti. Proteini koje kodiraju onkogeni i tumor-supresorski geni sudjeluju i u Hedgehog signalnom putu (vidi sliku 13-45). Receptor Smoothened jest onkogen u bazaliomima, dok je Patched (negativni regulator onkogena
Rak
661
unutra{nji sloj stani~ne membrane
Slika 15-37. Supresija preìvljavanja stanice PTEN proteinom.

Tumorski supresorski protein PTEN je fosfataza lipida koja defosforilira PIP3 na 3. poziciji inozitola. Tako nastaje PIP2. Time se PTEN suprotstavlja u~inku onkogenih proteina PI3-kinaze i Akt, koji pove}avaju preìvljavanje stanica.
P PIP2 P
Smoothened) tumor-supresorski gen. Osim toga, Gli proteini (proteini sisavaca homologni transkripcijskom faktoru C vinske mu{ice {to ga aktivira onkogen Smoothened) prvo su otkriveni kao produkti amplifikacije onkogena. Nekoliko tumor-supresorskih gena kodira proteine koji reguliraju transkripciju. Dobar primjer je produkt WT1 ~esto inaktiviran u Wilmsovim tumorima (dje~ji tumor bubrega). WT1 protein je inhibitor koji, izgleda, suprimira transkripciju nekoliko gena induciranih faktorima rasta. Smatra se da je jedna od meta WT1 protein gen koji kodira inzulinu sli~an faktor rasta II. Potonji protein je pretjerano eksprimiran u Wilmsovim tumorima, pa se pretpostavlja da pridonosi njihovu nastanku djeluju}i kao autokrini faktor rasta. Mogu}e je stoga da inaktivacija WT1 uzrokuje poreme}enu ekspresiju faktora rasta {to pak dovodi do proliferacije tumorskih stanica. Dva druga tumor-supresorska gena, Smad2 i Smad4, kodiraju transkripcijske faktore koje aktivira signalni put TGF-b, a dovode do inhibicije stani~ne proliferacije. U skladu s u~inkom TGF-b na inhibiciju proliferacije stanica, jedan tumorski supresorski gen (TbRII) kodira receptor za TGF-b. Produkti tumorskih supresorskih gena Rb i INK4 reguliraju napredovanje stani~nog ciklusa na istoj to~ki na kojoj djeluje i ciklin D1 (slika 15-38). Rb sprje~ava prolazak kroz restrikcijsku to~ku u G1 inhibiraju}i transkripciju niza gena koji sudjeluju u napredovanju stani~noga ciklusa i sintezi DNA (vidi sliku 14-20). U normalnim stanicama prolazak kroz restrikcijsku to~ku regulira Cdk4,6/ciklin D kompleks koji fosforilira i inaktivira Rb. Inaktivacija Rb gena mutacijama tako dovodi do nestanka klju~noga negativnog regulatora napredovanja stani~noga ciklusa iz tumorskih stanica. Tu-
662
Poglavlje 15
Slika 15-38. Proteini Rb i p16 sprje~avaju napredovanje stani~noga ciklusa.

Rb inhibira napredovanje kroz restrikcijsku to~ku u G1. Cdk4,6/ciklin D kompleksi potpomaù prolaz kroz restrikcijsku to~ku fosforiliraju}i i inaktiviraju}i Rb. p16 inhibira aktivnost Cdk4,6/ciklin D kompleksa.
Rb
p16 P Cdk4,6/ciklin D Rb Rb inaktiviran
G1 S M G2 stani~ni ciklus zaustavljen
G1 S M G2 stani~ni ciklus se nastavlja
o{te}ena DNA
p53
zaustavljen stani~ni ciklus
apoptoza
Slika 15-39. Djelovanje p53.

Normalni p53 je potreban za zaustavljanje stani~noga ciklusa i apoptozu izazvanu o{te}enjem DNA.
mor-supresorski gen INK4, koji kodira p16, inhibitor Cdk, tako|er regulira prolaz kroz restrikcijsku to~ku. Kao {to je re~eno u 14. poglavlju, p16 inhibira aktivnost Cdk4,6/ciklin D kompleksa. Inaktivacija INK4 zato uzrokuje pove}anje aktivnosti Cdk4,6/ciklin D kompleksa {to dovodi do nekontrolirane fosforilacije Rb proteina. Produkt p53 gena regulira napredovanje stani~noga ciklusa i apoptozu (slika 15-39). O{te}enje DNA brzo dovodi do indukcije p53 koji aktivira transkripciju p21, inhibitora Cdk proteina (vidi sliku 14-21). Inhibitor p21 zaustavlja napredovanje stani~noga ciklusa tako {to inhibira sve Cdk/ciklin komplekse, a replikaciju DNA inhibira tako {to veè PCNA (jezgreni antigen stanica u proliferaciji). Tako dolazi do zaustavljanja stani~noga ciklusa {to vjerojatno daje stanici vremena za popravak o{te}ene DNA prije replikacije. Ako nema p53, nakon o{te}enja DNA ne dolazi do zaustavljanja stani~noga ciklusa {to dovodi do pove}anja u~estalosti mutacija i nestabilnosti ~itavoga stani~noga genoma. Takva geneti~ka nestabilnost zajedni~ka je zna~ajka svih stanica raka i pridonosi nastanku dodatnih promjena onkogena i tumor-supresorskih gena tijekom napredovanja tumora. Iako im funkcija nije u potpunosti razja{njena, ~ini se da i produkti BRCA1 i BRCA4 gena, odgovornih za nastanak nekih nasljednih oblika raka dojke i jajnika, sudjeluju u kontroli nadzornih to~aka stani~noga ciklusa. Osim {to dovodi do zaustavljanja stani~noga ciklusa, p53 je nuàn za apoptozu induciranu o{te}enjem DNA. U~inak p53 na apoptozu posredovan je aktivacijom transkripcije jednoga ~lana Bcl-2 porodice (PUMA) koji inducira stani~nu smrt. U stanicama sisavaca o{te}enje DNA, koje nije mogu}e popraviti, normalno inducira apoptozu, odgovor vjerojatno koristan za organizam, jer uklanja stanice s mutacijama koje bi mogle biti opasne (primjerice, stanice iz kojih bi mogao nastati rak). Stanice bez p53, nakon izlaganja tvarima {to o{te}uju DNA, poput zra~enja i mnogih lijekova koji se koriste u kemoterapiji raka, ne umiru apoptozom. Ovaj izostanak apoptoze nakon o{te}enja DNA pridonosi otpornosti mnogih tumora na kemoterapiju. Osim toga, izgleda da gubitak p53 ometa apoptozu uzrokovanu drugim podraàjima, kao {to su pomanjkanje faktora rasta ili kisika. Smatra se da su ovi u~inci p53 na preìvljavanje stanica odgovorni za veliku u~estalost mutacija p53 u ljudskim tumorima.
Rak
663
Uloge onkogena i tumor-supresorskih gena u nastanku tumora

Kao {to je prije re~eno, nastanak tumora jest proces od vi{e koraka kojima se normalne stanice postupno pretvaraju u zlo}udne. Za inicijaciju i progresiju tumora nu`ne su i mutacije koje dovode do aktivacije onkogena i one koje dovode do inaktivacije tumor-supresorskih gena. Nakupljanje o{te}enja razli~itih gena kona~no dovodi do pove}anja proliferacije i preìvljavanja te sposobnosti {irenja i metastaziranja karakteristi~nih za stanice raka. Na~in na koji nakupljanje o{te}enja razli~itih gena dovodi do nastanka raka moè se najbolje razjasniti na primjeru raka debeloga crijeva, bolesti koju je najvi{e istraìvao Bert Vogelstein sa suradnicima. U ovim se tumorima ~esto nalaze mutacije onkogena ili tumor-supresorskih gena s ~etiri razli~ita na~ina djelovanja: 1) ras ili raf onkogeni koji djeluju na ERK put, 2) tumorski supresori ili onkogeni, dijelovi Wnt puta, 3) tumorski supresorski proteini, dijelovi signalnoga lanca TGF-b i 4) p53. Kirur{kim se zahvatom mogu dobiti tumori debeloga crijeva u razli~itim stupnjevima progresije pa je bilo mogu}e povezati opisane geneti~ke promjene i pojedine faze nastanka raka (slika 15-40). Ova su istraìvanja pokazala da je inaktivacija APC (dijela Wnt signalnog puta; vidi sliku 13-46) rani doga|aj u nastanku tumora. Prijenos mutiranih APC gena s roditelja na dijete u bolesnika s obiteljskom adenomatoznom polipozom uzrokuje poreme}aj proliferacije stanica debeloga crijeva. Zbog toga se u debelom crijevu zahva}enih osoba pojavljuju brojni adenomi. Mutacije APC su ~este i u bolesnika sa sporadi~nim slu~ajevima raka debeloga crijeva i obi~no se otkrivaju u ranim fazama nastanka bolesti. Ponekad do aktivacije Wnt signala dolazi zbog mutacija u genu koji kodira bkatenin (dio Wnt signalnog puta nizvodno od APC), a ne zbog mutacija APC gena. Nakon toga dolazi do mutacija rasK gena ~iji se onkogeni homolog ~esto nalazi u adenomima debeloga crijeva. U nekim tumorima debeloga crijeva se, umjesto mutacija rasK, nalaze mutacije koje dovode do aktivacije jednog od ~lanova porodice raf onkogena (B-raf). Budu}i da je Raf odmah nizvodno od Ras, aktivacija rasK ili B-raf onkogena dovodi do stimulacije ERK signalnog puta u tumorskim stanicama. Skoro svi tumori debeloga crijeva imaju mutacije u TGF-b signalnom putu koji inhibira stani~nu proliferaciju induciraju}i sintezu p15, ~lana Ink4 porodice inhibitora Cdk proteina. îni se da se i mutacije TGF-b signalnog puta pojavljuju razmjerno rano u procesu nastanka raka debeloga crijeva tako da ih se ~esto nalazi u adenomima. U nekim tumorima mutacije inaktiviraju tumor-supresorski gen TbRII koji kodira receptor za TGF-b. U drugim slu~ajevima mutacije inaktiviraju tumor-supresorske gene koji kodiraju transkripcijske faktore Smad2 ili Smad4, mete TGF-b signalnog puta. Kona~no, obi~no u kasnijoj fazi napredovanja tumora, dolazi do inaktivacije tumor-supresorskoga gena p53. Tako se ~ini da je nastanak raka debeloga crijeva proces koji se odvija u nekoliko stupnjeva, uzrokovan jr nakupljanjem o{te}enja razli~itih onkogena i tumor-supresorskih gena {to dovode do poreme}aja u nekoliko putova koji reguliraju stani~nu proliferaciju i preìvljavanje. îni se da do nastanka drugih vrsta raka, poput raka dojke i plu}a, tako|er dolazi zbog nakupljanja o{te}enja onkogena i tumor-supresorskih gena. Smatra se da je progresivan gubitak kontrole rasta, karakteristi~an za stanice raka, kona~ni rezultat poreme}aja funkcije razli~itih gena koji normalno reguliraju stani~nu proliferaciju, diferencijaciju i preìvljenje.
normalne stanice
APC, b-katenin
rasK, B-raf TbRII, Smad2, Smad4
p53
Slika 15-40. Geneti~ke promjene u karcinomima debeloga crijeva.

Inaktivacija APC proteina (dijela Wnt signalnoga puta) je rani doga|aj u nastanku tumora i dovodi do pojave populacije stanica koje proliferiraju. U nekim slu~ajevima, umjesto toga dolazi do mutacija gena za b-katenin (koji se nalazi nizvodno od APC u Wnt putu). Nastanak adenoma povezan je s mutacijama ras ili raf gena (stimuliraju signaliziranje ERK proteina) i gena koji kodiraju dijelove puta TGF-b (receptor za TGF-b, Smad2 ili Smad4). Mutacije p53 povezane su s kasnijim fazama i progresijom tumora.
664
Poglavlje 15
Primjena molekularne biologije u sprje~avanju i lije~enju raka

Znanstvenici su u detalje razjasnili velik dio molekularnih poreme}aja odgovornih za nastanak razli~itih vrsta raka u ljudi. Me|utim, rak nije tema zanimljiva samo znanstvenicima. To je bolest koja izaziva strah i od koje umire skoro svaki ~etvrti Amerikanac. Stoga je pred sada{njim i budu}im istraìva~ima velik izazov da na temelju napretka u razumijevanju raka {to prije pobolj{aju prakti~ne metode za sprje~avanje i lije~enje raka. Na sre}u, napredak u razumijevanju molekularne biologije raka ve} je po~eo pridonositi razvoju novih pristupa sprje~avanju i lije~enju ovih bolesti {to bi na posljetku moglo dovesti do zna~ajno boljeg ishoda za veliki broj bolesnika.
Sprje~avanje i rano otkrivanje

Naju~inkovitiji pristup raku je sprje~avanje pojave bolesti. Ne tako dobra, ali jo{ uvijek u~inkovita, alternativa jest pouzdano otkrivanje tumora koji su u ranoj, premalignoj fazi nastanka i koje je lako lije~iti. Mnoge slu~ajeve raka moè se izlije~iti lokalnom terapijom, kirur{kim zahvatom ili zra~enjem, ako ih se otkrije prije nego {to do|e do {irenja metastaza po tijelu. Primjerice, ranu, premalignu fazu raka debeloga crijeva (adenom) obi~no je mogu}e potpuno izlije~iti razmjerno malim kirur{kim zahvatom (slika 15-41). Stupanj izlje~enja lokaliziranoga ranoga karcinoma tako|er je visok, oko 90%. Me|utim preìvljenje bolesnika ~iji se rak pro{irio u susjedna tkiva i limfne ~vorove pada na oko 50%, dok je u bolesnika s metastatskim rakom debeloga crijeva manji od 10%. Prema tome, rano otkrivanje raka moè imati najve}u va`nost za ishod bolesti. Osnovna korist od molekularne biologije za sprje~avanje i rano otkrivanje raka vjerojatno leì u prepoznavanju osoba s naslije|enom sklono{}u za nastanak ovih bolesti. Takva naslije|ena sklonost raku moè biti posljedica mutacija tumor-supresorskih gena, najmanje jednog onkogena (ret) i gena za popravak DNA, kao {to su geni za popravak nepodudarnosti, odgovorni za nastanak nasljednog raka debeloga crijeva bez polipoze (vidi odjeljak Molekularna medicina u 5. poglavlju). Mutacije u tim genima mogu se otkriti geneti~kim testiranjem {to omogu}uje otkrivanje osoba s velikim rizikom i prije pojave bolesti. Osim doprinosa planiranju obitelju i redovitim lije~ni~kim kontrolama osoba s velikim rizikom bilo bi mogu}e rano otkriti i u~inkovitije lije~iti neke vrsta raka. Primjerice, adenome kolona mogu}e je kolonoskopski otkriti i ukloniti prije nego {to postanu zlo}udni. U bolesnika s obiteljskom adenomatoznom polipozom (uzrokovanom naslije|enim mutacijama tumor-supresorskoga gena APC) u prvih 20 godina ìvota obi~no nastane na stotine adenoma, tako da je potrebno ukloniti debelo crijevo, prije nego {to neki od polipa postane zlo}udan, a to se neizbje`no doga|a. Me|utim, u bolesnika s nasljednim karcinomom kolona bez polipoze u kasnijoj se ìvotnoj dobi pojavljuje manji broj polipa, pa bi oni mogli imati koristi od redovitih kolonoskopija i lijekova, poput nesteroidnih antireumatika, koji smanjuju rizik nastanka raka debeloga crijeva. Slu~ajevi raka nastali zbog izravno naslije|enog poreme}aja poznatih gena su rijetkost, na njih otpada svega oko 5% novih slu~ajeva. Naj~e{}a nasljedna sklonost za nastanak raka je nasljedni karcinom kolona bez polipoze na koji u Sjedinjenim Dràvama otpada oko 15% svih slu~ajeva raka debeloga crijeva i 1 do 2% svih slu~ajeva raka uop}e. Mutacije u tumor-supresorskim genima BRCA1 i BRCA2 tako|er su razmjerno ~este, na njih otpada 5 do 10% svih slu~ajeva raka dojke. Mogu}e je, me|utim, da jo{ nepre-
100
80 petogodi{nje preìvljenje (%)
60
40
20
0
po
lip lo
izi kal
ran
i d pre
ov
ali m
lo
n kal
ou
zna
s eta
tat
ski
Stadiji raka debeloga crijeva
Slika 15-41. Stope preìvljenja bolesnika s karcinomom debeloga crijeva.

Prikazane su stope petogodi{njega preìvljenja bolesnika s adenomima (polipima), lokaliziranim karcinomima, lokalno uznapredovalim karcinomima i metastatskim karcinomima.
Rak
665
poznani geni, ~ije o{te}enje dovodi do pove}ane sklonosti raku, pridonose nastanku ve}eg broja ~estih tumora odraslih, poput raka dojke, debeloga crijeva i plu}a. Zbog toga je otkrivanje novih gena koji dovode do pove}ane sklonosti raku, va`no i ima jasno prakti~no zna~enje. Nositeljima takvih gena moglo bi se savjetovati da izbjegavaju izlaganje odre|enim karcinogenima (primjerice, duhanskom dimu za rak plu}a) i moglo bi ih se redovito kontrolirati s ciljem otkrivanja tumora dok su jo{ u ranoj fazi i lak{e izlje~ivi. Pouzdano prepoznavanje osoba s velikim rizikom, uz odgovaraju}e preventivne mjere i rano otkrivanje pojave bolesti, moglo bi zna~ajno utjecati na smrtnost od raka.
GC-tip
Act B-tip
Molekularna dijagnostika
Molekularna analiza onkogena i tumor-supresorskih gena, odgovornih za nastanak pojedinih vrsta raka, moè pruìti podatke korisne u dijagnostici i pra}enju u~inka lije~enja. Zapravo se u klini~koj praksi ve} primjenjuju neke od tih metoda. U nekim se slu~ajevima pokazalo da su mutacije onkogena dobar molekularni biljeg tijeka bolesti i odgovora na lije~enje. Dobar primjer za to je translokacija abl gena u kroni~noj mijeloi~noj leukemiji. Kao {to je ranije re~eno, ta translokacija dovodi do fuzije abl i bcr gena i ekspresije Bcr/Abl onkogenog proteina (vidi sliku 15-25). Lan~ana reakcija polimeraze (vidi sliku 3-24) je osjetljiva metoda za otkrivanje rekombinantnoga bcr/abl onkogena u leukemijskim stanicama pa se zato koristi za pra}enje odgovora ovih bolesnika na lije~enje. Osim analize pojedina~nih gena, do va`nih dijagnosti~kih podataka mogu}e je do}i analizom sveukupne ekspresije gena u stanicama raka. Kori{tenjem DNA mikro~ipova mogu}e je istovremeno analizirati ekspresiju desetaka tisu}a gena (vidi sliku 3-27) {to omogu}uje stvaranje molekularne klasifikacije tumora na temelju profila ekspresije njihovih gena. Ovakva istraìvanja pokazuju da se analizom profila ekspresije gena mogu razlikovati ina~e sli~ni tumori i dobiti podatci na temelju kojih je mogu}e predvidjeti klini~ki tijek i odgovor na lije~enje. Primjerice, analizom ekspresije gena mogu se razlikovati dvije vrste difuznih B velikostani~nih limfoma koje se jako razlikuju po odgovoru na uobi~ajeno lije~enje. Otprilike 40% bolesnika s difuznim B velikostani~nim limfomom dobro odgovara na lije~enje, dok ostali imaju lo{u prognozu. Analizom profila genske ekspresije bilo je mogu}e bolesnike s difuznim B velikostani~nim limfomom podijeliti u dvije jasno odvojene skupine ~iji profili ekspresije gena odgovaraju razli~itim stupnjevima razvoja normalnih B stanica (slika 15-42). Bolesnici s limfomima, ~iji profil ekspresije gena odgovara onome B stanica u ranoj fazi razvoja, imali su zna~ajno ve}e preìvljenje, {to pokazuje prognosti~ku vrijednost ovakve klasifikacije limfoma. Na sli~an su se na~in primjenom analize profila ekspresije gena u drugim vrstama raka, poput raka dojke, plu}a i prostate po~eli dobivati podatci korisni za klasifikaciju tumora i prognozu.
Slika 15-42. Profil genske ekspresije difuznih B velikostani~nih limfoma.

Niz difuznih B velikostani~nih limfoma na temelju profila ekspresije gena podijeljen je u dvije podskupine, nazvane podskupina sli~na B stanicama iz germinativnog centra (GC, naran~asto) i podskupina sli~na aktiviranim B stanicama (Act, plavo). Fluorescentne sonde iz pojedinih limfoma hibridizirane su s nizom cDNA klonova na mikro~ipu. Svaki red odgovara jednom cDNA klonu, a svaki stupac fluorescentnoj sondi dobivenoj od mRNA jednoga limfoma. Rezultati su prikazani relativno, u odnosu na hibridizaciju referentne sonde, tako da cr veno zna~i da je limfomska sonda ja~e hibridizirala. Limfomi sli~ni B stanicama iz ger minativnog centra odgovaraju ranijoj fazi razvoja B stanica (Iz: A. Alizadeh i sur., 2000. Nature 403:503.)
Lije~enje
Najva`nije je pitanje, me|utim, ho}e li otkri}e onkogena i tumor-supresorskih gena omogu}iti razvoj novih lijekova koji }e selektivno djelovati na stanice raka. Ve}ina lijekova koji se sada primjenjuju za lije~enje raka o{te}uje DNA ili sprje~ava replikaciju DNA. Prema tome, ti lijekovi nisu {tetni samo za stanice raka, ve} i za normalne stanice, pogotovo one koje se neprekidno nadomje{taju brzim dijeljenjem mati~nih stanica (primjerice, krvne stanice, epitelne stanice probavnoga sustava i stanice folikula dlake). Djelovanje citostatika na te normalne populacije stanica glavni je uzrok njihove toksi~nosti i ograni~ava njihovu u~inkovitost.
666
Poglavlje 15
Jedan od pristupa lije~enju raka, koji puno obe}ava, je uporaba lijekova koji sprje~avaju tumorski rast ometaju}i angiogenezu (stvaranje krvnih ìla), a ne djeluju izravno na zlo}udne stanice. Kao {to je re~eno ranije u ovom poglavlju, da bi tumor mogao rasti, potrebne su mu nove krvne ìle koje ga opskrbljuju kisikom i hranjivim tvarima. Poticanje angiogeneze stoga je od najve}e va`nosti za nastanak tumora pa tumorske stanice lu~e niz faktora rasta koji stimuliraju proliferaciju kapilarnih endotelnih stanica {to dovodi do urastanja novih kapilara u tumor. Va`nost angiogeneze prvi je spoznao Judah Folkman 1971. godine, a stalna istraìvanja Folkmana i suradnika su dovela do razvoja novih lijekova koji inhibiraju angiogenezu sprje~avaju}i proliferaciju endotelnih stanica. Budu}i da ovi lijekovi selektivno inhibiraju stvaranje novih krvnih ìla, manje o{te}uju normalne stanice od uobi~ajenih citostatika. Na ìvotinjskom su modelu inhibitori angiogeneze postigli obe}avaju}e rezultate i trenutno ih se ispituje u klini~kim pokusima kako bi se utvrdio njihov u~inak na ljudske tumore. Alternativna strategija selektivnijeg lije~enja raka temelji se na razvoju lijekova specifi~no usmjerenih protiv onkogena koji poti~u tumorski rast. Na àlost, sa stajali{ta lije~enja raka, onkogeni nisu specifi~ni za tumorske stanice. Budu}i da protoonkogeni igraju va`ne uloge u normalnim stanicama, neselektivni inhibitori ekspresije ili funkcije onkogena najvjerojatnije bi djelovali i na normalne kao i na tumorske stanice. Stoga razvoj lijekova, koji bi ciljano djelovali na pojedine onkogene, nije sasvim jednostavan, ali nekoliko obe}avaju}ih rezultata pokazuje da je ciljano lije~enje usmjereno protiv odre|enih onkogena ipak mogu}e. Prvi takav lijek, koji se rabi u klini~koj praksi, primjenjuje se za lije~enje akutne promijelocitne leukemije. Ta je leukemija karakterizirana kromosomskom translokacijom koja dovodi do fuzije gena koji kodira receptor za retinoi~nu kiselinu (RARa) i jednog drugog gena (PML). Tako nastaje PML/ RARa onkogen. Smatra se da je u~inak PML/RARa proteina barem dijelom posljedica sprje~avanja diferencijacije stanica. Me|utim, ove leukemijske stanice diferenciraju u prisutnosti visokih koncentracija retinoi~ne kiseline koje, izgleda, mogu prevladati inhibitorni u~inak PML/RARa onkogenog proteina. Lije~enje retinoi~nom kiselinom dovodi do povla~enja bolesti u ve}ine bolesnika, no ovakav povoljan odgovor ne traje dugo i bolest se nakon nekog vremena opet pojavljuje. Me|utim, kombinirano lije~enje retinoi~nom kiselinom i uobi~ajenim citostaticima zna~ajno smanjuje u~estalost ponovne pojave bolesti, tako da je retinoi~na kiselina vrlo korisna za lije~enje akutne promijelocitne leukemije. Terapijski u~inak retinoi~ne kiseline opaèn je prije otkri}a PML/RARa onkogena pa je njezin u~inak na leukemijske stanice, koje eksprimiraju taj onkogen, otkriven vi{e zahvaljuju}i sre}i, nego racionalnom dizajniranju lijeka. Bez obzira na to, kori{tenje retinoi~ne kiseline u lije~enju akutne promijelocitne leukemije prvi je primjer klini~ki u~inkovita lijeka usmjerenoga ciljano protiv nekog onkogenog proteina. Herceptin, monoklonsko protutijelo usmjereno protiv ErbB-2 onkogenog proteina prvi je lijek razvijen ciljano protiv nekog odre|enog onkogena ~iju je klini~ku primjenu u lije~enju raka odobrila FDA (Food and Drug Administration, Uprava za hranu i lijekove vlade SAD). Zbog amplifikacije erbB-2 gena u oko 30% slu~ajeva raka dojke poja~ana je ekspresija ErbB-2. Na|eno je da protutijelo usmjereno protiv izvanstani~ne domene ErbB-2 (receptora koji djeluje kao protein-tirozin-kinaza) sprje~ava proliferaciju tumorskih stanica u kojima je poja~ana ekspresija ErbB-2. To opaànje dovelo je do razvoja i klini~kog ispitivanja Herceptina za koji je u klini~kim pokusima, u koje je bilo uklju~eno vi{e od 600 èna s metastatskim rakom dojke s
Rak
667
STI-571: lijek protiv raka usmjeren protiv bcr/abl onkogena

Bolest
Na kroni~nu mijeloi~nu leukemiju (KML) otpada otprilike 20% slu~ajeva leukemije u odraslih. Predvi|a se da }e se 2003. godine u Sjedinjenim Dràvama dijagnosticirati 4.300 slu~ajeva KML i da }e od nje umrijeti oko 1.700 ljudi. KML nastaje iz pluripotentne mati~ne stanice u ko{tanoj srì. Bolest sporo napreduje, a moè se klini~ki podijeliti u dva stupnja: kroni~nu fazu i blasti~nu krizu. Kroni~na faza KML moè trajati godinama i uzrokuje malo simptoma. Na posljetku }e se u bolesnika, me|utim, razviti po ìvot opasna faza bolesti nazvana blasti~nom krizom. Blasti~na kriza je karakterizirana nakupljanjem velikog broja leukemijskih stanica, zvanih blasti, koje brzo proliferiraju. Bolesnike u blasti~noj krizi lije~i se uobi~ajenim citostaticima koji mogu dovesti do povratka kroni~ne faze bolesti. Citostatici se mogu primijeniti u kroni~noj fazi KML, ali obi~no ne uspijevaju eliminirati leukemijske stanice. KML se moè lije~iti i transplantacijom mati~nih stanica iz ko{tane srì ~ime se u kroni~noj fazi bolesti moè izlije~iti oko polovinu bolesnika. kemiju aktiviraju}i nekoliko nizvodnih signalnih puteva. Budu}i da je aktivacija bcr/abl onkogena tako ~esta u KML, postojala je mogu}nost da bi selektivna inhibicija ove tirozin-kinaze mogla biti korisna u lije~enju te bolesti. Takva su istraìvanja dovela do otkri}a STI-571 (Gliveca ili imatiniba), pr voga uspje{noga lijeka dizajniranoga da bude selektivni inhibitor nekog onkogenog proteina. Abl i jo{ dvije protein-tirozin-kinaze: receptora za faktor rasta iz trombocita i c-Kit. Daljnja istraìvanja su pokazala da STI-571 u kulturi selektivno inhibira proliferaciju stanica transfor miranih onkogenom bcr/abl, uklju~uju}i stanice bolesnika s KML. Osim toga, STI-571 je onemogu}ivao stanicama transformiranim bcr/abl onkogenom stvaranje tumora u mi{evima. Za razliku od toga, STI-571 nije djelovao na normalne stanice ili stanice transfor mirane drugim onkogenima {to je govorilo da mu je u~inak specifi~an za Bcr/Abl tirozin-kinazu. Na temelju tih rezultata pr vo klini~ko istraìvanje faze I sa STI-571 po~elo je u lipnju 1998. godine. Rezultati su bili izuzetno dobri. Od 54 bolesnika u kroni~noj fazi, na lijek je povoljno odgovorilo njih 53. Osim toga, odgovorilo je i vi{e od polovine bolesnika u blasti~noj krizi. Ovaj uspjeh doveo je do {irenja istraìvanja faze II na vi{e od 1.000 bolesnika. I ta su istraìvanja potvrdila obe}avaju}e rezultate iz faze I. 95% bolesnika u kroni~noj fazi i oko 50% u blasti~noj krizi odgovorilo je na STI-571. [tovi{e, za razliku od uobi~ajenih citostatika, STI-571 je imao vrlo malo neèljenih u~inaka. Ta su klini~ka istraìvanja jasno pokazala da je STI-571 vrlo u~inkovit u lije~enju KML i navela FDA da ga u svibnju 2001. godine odobri po ubrzanom postupku doga|aj od velike va`nosti za prijenos rezultata temeljnih istraìvanja u klini~ku praksu.
Izum STI-571 po~eo je otkri}em da 2-fenil-aminopirimidin nespecifi~no inhibira protein-kinaze. Sintetiziran je niz srodnih spojeva i ispitano njihovo djelovanje na razli~ite mete, uklju~uju}i tirozin-kinazu Abl. U tom mno{tvu ispitanih spojeva, STI-571 pokazao se kao snaàn i specifi~an inhibitor

Aktivacija abl onkogena, do koje dolazi zbog translokacije s 9. na 22. kromosom, vrlo je ~esta u KML i nalazi je se u oko 95% slu~ajeva ove leukemije. Ta translokacija dovodi do fuzije abl gena i bcr gena s 22. kromosoma ~ime nastaje bcr/abl onkogen. Onkogen stvara fuzijski Bcr/Abl protein u kojem je pr vi egzon Abl zamijenjen slijedom aminokiselina iz Bcr (vidi sliku 15-25). Bcr/Abl protein je konstitutivno aktivna protein-tirozin-kinaza koja uzrokuje leu-
Literatura
Kristalna struktura kataliti~ke domene Abl proteina na koju je vezan metabolit STI-571. (Iz: T. Schindler, W. Bornmann, P Pellicena, . W. T. Miller, B. Clarkson i J. Kuriyan. 2000. Science 289:1938.)
Druker, B. J. 2002. Inhibition of the Bcr-Abl tyrosine kinase as a therapeutic strategy for CML. Oncogene 21: 85418546.
668
Poglavlje 15
poja~anom ekspresijom ErbB-2, utvr|eno da zna~ajno usporava rast tumora i produljuje preìvljavanje bolesnica. Na temelju tih rezultata FDA je 1998. godine odobrila uporabu Herceptina za lije~enje metastatskog raka dojke s poja~anom ekspresijom ErbB-2. Male molekule, inhibitori onkogenih proteina, pogotovo protein-kinaza koje imaju klju~nu ulogu u preno{enju signala za proliferaciju i preìvljenje tumorskih stanica, mogle bi imati {iroku primjenu u lije~enju raka. Nedavno je u ovom podru~ju postignut zna~ajan napredak otkri}em specifi~nog inhibitora Bcr/Abl protein-tirozin-kinaze koja nastaje u kroni~noj mijeloi~noj leukemiji zbog translokacije na Philadelphia kromosomu (vidi sliku 15-25). Brian Druker i suradnici na~inili su snaàn i specifi~an inhibitor Bcr/ abl protein-kinaze i pokazali da taj spoj (nazvan STI-571, Glivec , ili imatinib) u~inkovito sprje~ava proliferaciju stanica kroni~ne mijeloi~ne leukemije. Na temelju toga je u lipnju 1998. godine zapo~elo klini~ko istraìvanje STI-571. Odgovor na STI-571 bio je odli~an, a lijek je imao vrlo malo neèljenih u~inaka. Zbog izuzetne u~inkovitosti STI-571, pokazane u ovim klini~kim ispitivanjima, FDA ga je ve} u svibnju 2001. godine odobrila za lije~enje kroni~ne mijeloi~ne leukemije. Iako se u nekih bolesnika pojavljuje rezistencija na lijek, nema sumnje da je STI-571 vrlo u~inkovit lijek za ovu vrstu leukemije. Budu}i da je to prvi lijek specifi~no dizajniran za inhibiciju odre|enog onkogena, njegovo otkri}e predstavlja prekretnicu u primjeni rezultata temeljnih istraìvanja na lije~enje raka. Primjer STI-571 jasno pokazuje da bi se ciljanim djelovanjem na onkogene i tumor-supresorske gene mogla stvoriti nova generacija lijekova koja bi djelovala specifi~no na stanice raka. Budu}i da se ras onkogeni ~esto nalaze u ljudskim tumorima, intenzivno se istraùju lijekovi koji bi ciljano djelovali na Ras proteine. Dodatak farnezil-izoprenoida na karboksi-kraj Ras proteina omogu}uje njihov prijenos do stani~ne membrane (vidi sliku 7-32). Kako je ta posttranslacijska modifikacija razmjerno rijetka, inhibitori farnezilacije mogli bi biti od koristi u lije~enju tumora. Klini~ka ispitivanja ovih lijekova na bolesnicima s rakom su u tijeku. Ispituje se i u~inkovitost niza drugih inhibitora protein-kinaza, kao {to su EGF-receptor, Raf, MEK, Akt te PI3-kinaza, u lije~enju raka. Osim inhibitora PI3-kinaze i Akt ispituju se i drugi lijekovi koji bi mogli pove}ati osjetljivost stanica raka na apoptozu, uklju~uju}i one {to veù p53 pa bi mogli reaktivirati mutirani p53 protein. Iako se jo{ ne moè predvidjeti koliki }e biti utjecaj molekularne biologije na lije~enje raka, jasno je da }e racionalno dizajnirani lijekovi, usmjereni protiv odre|enih onkogenih i tumorskih supresorskih proteina, u budu}nosti igrati va`nu ulogu.
Rak
669
S A @ E TA K NASTANAK I UZROCI RAKA

Vrste raka: Rak moè nastati zbog poreme}ene proliferacije bilo koje vrste stanica. Za bolesnika je najva`nije razlikovati dobro}udne tumore, koji ostaju ograni~eni na mjestu na kojem su nastali, od zlo}udnih, koji se mogu pro{iriti u normalne organe {irom tijela. Nastanak raka: Tumori nastaju iz jedne promijenjene stanice koja po~inje nenormalno proliferirati. Dodatne mutacije vode ka odabiru stanica sa sve ve}im rastu}im kapacitetom za proliferaciju, opstanak, invazivnost i metastaziranje. Uzroci raka: Zra~enje i brojni kemijski karcinogeni o{te}uju DNA i uzrokuju mutacije. Drugi kemijski karcinogeni pridonose nastanku raka stimuliraju}i proliferaciju stanica. Virusi tako|er uzrokuju rak u ljudi i drugih vrsta ìvotinja. Svojstva stanica raka: Nekontrolirana proliferacija stanica raka ogleda se u smanjenoj potrebi za faktorima rasta i nepostojanju dodirne inhibicije. U mnogih vrsta raka poreme}ena je i diferencijacija stanica {to vjerojatno pridonosi njihovoj sposobnosti da kontinuirano proliferiraju in vivo. Karakteristi~na otpornost stanica raka na apoptozu tako|er u zna~ajnoj mjeri pridonosi nastanku tumora. Transfor macija stanica u kulturi: Otkri}e testova za transformaciju stanica in vitro omogu}ilo je istraìvanja pretvorbe normalnih stanica u tumorske u stani~noj kulturi.
KLJU^NI POJMOVI
rak,tumor, dobro}udni tumor, zlo}udni tumor, metastaze, karcinom, sarkom, leukemija, limfom inicijacija tumora, progresija tumora, adenom, polip
karcinogeni, promotori tumora
inhibicija ovisna o gusto}i, autokrina stimulacija rasta, dodirna inhibicija, angiogeneza, programirana stani~na smrt, apoptoza
transformacija stanice
TUMORSKI VIRUSI
Virusi hepatitisa B i C: Virusi hepatitisa B i C uzrokuju rak jetre u ljudi. SV40 i poliomavirus: Iako ni SV40 niti poliomavirus ne uzrokuju rak u ljudi, va`ni su kao modeli za istraìvanje molekularne biologije stani~ne transformacije. T antigen iz SV40 dovodi do transformacije djeluju}i na stani~ne tumorske supresorske proteine Rb i p53. Papilomavirusi: Papilomavirusi uzrokuju tumore u razli~itih vrsta ìvotinja, izme|u ostaloga karcinom grli}a maternice u èna. Kao i T antigen iz SV40, transformiraju}i proteini papilomavirusa djeluju na Rb i p53. Adenovirusi: Adenovirusi normalno ne uzrokuju rak ni u ljudi niti u drugih vrsta ìvotinja, ali su vaàn model za istraìvanje raka. Njihovi transformiraju}i proteini tako|er djeluju na Rb i p53. Herpesvirusi: Herpesvirusi, koji spadaju u najsloènije ìvotinjske viruse, uzrokuju rak u nekoliko vrsta ìvotinja uklju~uju}i ljude. Retrovirusi: Retrovirusi mogu uzrokovati rak u ljudi i niz drugih vrsta ìvotinja. Neki virusi sadràvaju specifi~ne gene koji dovode do transformacije stanica pa su istraìvanja tih jako onkogenih retrovirusa dovela do otkri}a virusnih i stani~nih onkogena.
tumorski virusi, virusi hepatitisa B, virus hepatitisa C majmunski virus 40 (SV40), polioma virusi
papilomavirusi
adenovirusi
herpesvirusi, herpesvirus povezan s Kapasijevim sarkomom, Epstein-Barrov virus retrovirus, Rausov sarkomski virus (RSV)
670
Poglavlje 15
ONKOGENI
onkogeni, src, ras, raf
Retrovirusni onkogeni: Prvi otkriveni onkogen bio je src gen iz RSV. Daljnjim istraìvanjima otkriveno je u razli~itim retrovirusima vi{e od dva tuceta razli~itih onkogena. Protoonkogeni: Retrovirusni onkogeni potje~u od vrlo sli~nih normalnih stani~nih gena, nazvanih protoonkogeni. Onkogeni nastaju zbog poreme}ene ekspresije ili mutacije odgovaraju}ih protoonkogena. Onkogeni u ljudskim tumorima: U ljudskim tumorima razli~iti se onkogeni aktiviraju to~kastim mutacijama, preslagivanjem DNA i amplifikacijom gena. Neki su od ovih ljudskih onkogena, kao {to su geni ras i stani~ni homolozi onkogena koji su prvi puta opisani kod retrovirusa. Djelovanje onkogenih produkata: Mnogi onkogeni proteini dijelovi su signalnih putova {to stimuliraju stani~nu proliferaciju. Gen, koji kodira ciklin D1 je tako|er potencijalni onkogen koji stimulira stani~nu proliferaciju. Drugi onkogeni proteini ometaju stani~nu diferencijaciju, a onkogeni koji kodiraju PI3-kinazu, Akt i Bcl-2 sprje~avaju apoptozu.
protoonkogeni
ras, c-myc, abl, N-myc, erbB-2
Fos, Jun, D1, ErbA, PHL/RARa, PI3-kinaza, Akt, Bcl-2
TUMORSKI SUPRESORSKI GENI

tumorski supresorski geni, Rb, p53
Otkri}e tumorskih supresorskih gena: Za razliku od onkogena, tumorski supresorski geni sprje~avaju nastanak tumora. Prototip tumorskih supresorskih gena, Rb, otkriven je zahvaljuju}i istraìvanju naslje|ivanja retinoblastoma. Nestanak ili mutacijska inaktivacija Rb i drugih tumorskih supresorskih gena, uklju~uju}i p53, pridonosi nastanku niza razli~itih vrsta raka u ljudi. Djelovanje produkata tumorskih supresorskih gena: Ve}ina proteina koje kodiraju tumorski supresorski geni inhibitori su stani~ne proliferacije ili preìvljenja. Proteini Rb, INK4 i p53 su negativni regulatori napredovanja stani~noga ciklusa. Osim toga, p53 je potreban za apoptozu uzrokovanu o{te}enjem DNA i drugim podraàjima pa njegova inaktivacija pove}ava preìvljenje tumorskih stanica. Uloga onkogena i tumorskih supresorskih gena u nastanku tumora: Mutacije onkogena i tumorskih supresorskih gena pridonose nastanku i progresiji ljudskih tumora. Smatra se da nakupljanje o{te}enja vi{e takvih gena dovodi do poreme}aja u stani~noj proliferaciji, diferencijaciji i preìvljenju karakteristi~nih za stanice raka.
PTEN
PRIMJENA MOLEKULARNE BIOLOGIJE U SPRJEÂVANJU I LIJEÊNJU RAKA

Sprje~avanje i rano otkrivanje: Velik broj slu~ajeva raka moè se izlije~iti ako ih se otkrije u ranoj fazi nastanka tumora. Geneti~ki testovi za otkrivanje ljudi s naslije|enom sklono{}u nastanku raka mogli bi omogu}iti rano otkrivanje i uspje{nije lije~enje takvih osoba. Molekular na dijagnostika: Otkrivanje mutacija onkogena i tumorskih supresorskih gena moè biti korisno za dijagnostiku i pra}enje odgovora na lije~enje. Analizom ukupne ekspresije gena mo`da bi se mogle razlikovati podskupine tumora s razli~itom klini~kom prognozom.
Rak
671
Lije~enje: Istraìvanja tvari koje ciljano ometaju funkciju odre|enog onkogena ili tumorskoga supresorskoga gena po~ela su dovoditi do otkri}a lijekova {to selektivno djeluju na stanice raka.
Pitanja
1. [to je rak i po ~emu se razlikuje od dobro}udnog tumora? 2. Koja je uloga klonske selekcije u nastanku raka? 3. Kako estrogeni pove}avaju rizik nastanka raka? 4. Za{to je autokrina stimulacija rasta opasna? 5. Adenovirusi, papilomavirusi i SV40 dovode do transfor macije djeluju}i na isti gen ili gene. O kojim genima je rije~? 6. Konstruirali ste mutantni T antigen iz SV40 koji ne dovodi do transfor macije jer ne veè Rb. Ho}e li ovaj mutantni T antigen dovesti do transformacije ako ga se unese u stanice zajedno s papilomavirusnom cDNA koja kodira E7? A s onom koja kodira E6? 7. cAMP obi~no inhibira proliferaciju fibroblasta. Ho}e li gsp u tim stanicama djelovati kao onkogen? 8. Objasnite dva na~ina na koja iz protoonkogena moè nastati onkogen, a da ne do|e do mutacija ili promjena kodiraju}eg redoslijeda baza! 9. [to o~ekujete kakav }e u~inak imati poja~ana ekspresija produkta tumorskog supresorskog gena INK4 na tumorske stanice u kojima je Rb inaktiviran mutacijom? 10. [to mislite koji }e tumori biti osjetljiviji na lije~enje zra~enjem oni s normalnim ili oni s mutiranim p53 genima? 11. Budu}i da se sklonost retinoblastomu naslje|uje kao dominantna osobina, kako to da sve stanice retine djece s tom dominantnom osobinom ne postanu tumorske? 12. Kako djeluje STI-571, prvi lijek ciljano dizajniran za inhibiciju odre|enog onkogena?
Literatura
Op}enita literatura
Cooper, G. M. 1992. Elements of Human Cancer. Boston: Jones and Bartlett. Cooper, G. M. 1995. Oncogenes. 2nd ed. Boston: Jones and Bartlett. Varmus, H. and R. A. Weinberg. 1993. Genes and the Biology of Cancer. New York: Scientific American Library. angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 86: 353364. P Hanahan, D. and R. A. Weinberg. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100: 5770. P Henderson, B. E., R. Ross and L. Bernstein. 1988. Estrogens as a cause of human cancer. Cancer Res. 48: 246253. P Liotta, L. A. and E. C. Kohn. 2001. The microenvironment of the tumour-host interface. Nature 411: 375379. P Nowell, P C. 1986. Mechanisms of tumor . progression. Cancer Res. 46: 22032207. P Peto, J. 2001. Cancer epidemiology in the last century and the next decade. Nature 411: 390395. P Raff, M. C. 1992. Social controls on cell survival and cell death. Nature 356: 397400. P Sawyers, C. L., C. T. Denny and O. N. Witte. 1991. Leukemia and the disruption of normal hematopoiesis. Cell 64: 337350. P Sporn, M. B. and A. B. Roberts. 1985. Autocrine growth factors and cancer. Science 313: 745747. P Temin, H. M. and H. Rubin. 1958. Characteristics of an assay for Rous sarcoma virus and Rous sarcoma cells in culture. Virology 6: 669688. I Tenen, D. G. 2003. Disruption of differentiation in human cancer: AML shows the way. Nature Rev. Cancer 3: 89101. P Thompson, C. B. 1995. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267: 14561462. P Writing Group for the Womens Health Initiative Investigators. 2002. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women. J. Amer. Med. Assoc. 288: 321333. I
Nastanak i uzroci raka

Chambers, A. F., A. C. Groom and I. C. MacDonald. 2002. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Rev. Cancer 2: 563572. P Christofori, G. and H. Semb. 1999. The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-suppressor gene. Trends Biochem. Sci. 24: 7376. P Fialkow, P J. 1979. Clonal origin of human . tumors. Ann. Rev. Med. 30: 135143. P Hanahan, D. and J. Folkman. 1996. Patterns and emerging mechanisms of the
Tumorski virusi
Bishop, G. A. and L. K. Busch. 2002. Molecular mechanisms of B-lymphocyte transformation by Epstein-Barr virus. Microbes and Infection 4: 853857. P Blumberg, B. S. 1997. Hepatitis B virus, the vaccine, and the control of primary cancer
672
Poglavlje 15
of the liver. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 71217125. P Boshoff, C. and R. Weiss, 2002. AIDS-related malignancies. Nature Rev. Cancer 2: 373382. P Coffin, J. M., S. H. Hughes and H. E. Varmus, eds. 1997. Retroviruses. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Fields, B. N., D. M. Knipe, P M. Howley, R. . M. Chanock, J. L. Melnick, T. P Monath, . B. Roizman and S. E. Straus, eds. 1996. Fundamental Virology. 3rd ed. New York: Lippincott-Raven. Flint, S. J., L. W. Enquist, R. M. Krug, V. R. Racaniello and A. M. Skalka. 1999. Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. Washington, DC: ASM Press. Giannini, C. and C. Brechot. 2002. Hepatitis C virus biology. Cell Death Diff. 10: S27S38. P Helt, A.-M. and D. A. Galloway. 2003. Mechanisms by which DNA tumor virus oncoproteins target the Rb family of pocket proteins. Carcinogenesis 24: 159169. P Jenner, R. G. and C. Boshoff. 2002. The molecular pathology of Kaposis sarcoma-associated herpesvirus. Biochim. Biophys. Acta 1602: 122. P Lam, N. and B. Sugden. 2002. CD40 and its viral mimic, LMP1: Similar means to different ends. Cell. Signalling 15: 916. P Mortreux, F., A.-S. Gabet and E. Wattel. 2003. Molecular and cellular aspects of HTLV-1 associated leukemogenesis in vivo. Leukemia 17: 2638. P Saenz-Robles, M. T., C. S. Sullivan and J. M. Pipas. 2001. Transforming functions of simian virus 40. Oncogene 20: 78997907. P Zur Hausen, H. 2002. Papillomaviruses and cancer: From basic studies to clinical application. Nature Rev. Cancer 2: 342350. P
homologous to the ras genes of Harvey and Kirsten sarcoma viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 36373640. I Krontiris, T. G. and G. M. Cooper. 1981. Transforming activity of human tumor DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 11811184. I Leder, P J. Battey, G. Lenoir, C. Moulding, W. ., Murphy, H. Potter, T. Stewart and R. Taub. 1983. Translocations among antibody genes in human cancer. Science 222: 765771. P Legauer, C., K. W. Kinzler and B. Vogelstein. 1998. Genetic instabilities in human cancers. Nature 396: 643649. P Look, A. T. 1997. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science 278: 10591064. P Martin, G. S. 1970. Rous sarcoma virus: A function required for the maintenance of the transformed state. Nature 227: 10211023. I Melnick, A. and J. D. Licht. 1999. Deconstructing a disease: RARa, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia. Blood 93: 3167 3215. P Rajagopalan, H., A. Bardelli, C. Lengauer, K. W. Kinzler, B. Vogelstein and V. E. Velescu. 2002. RAF/RAS oncogenes and mismatchrepair status. Nature 418: 934. I Sherr, C. J. 1996. Cancer cell cycles. Science 274: 16721677. P Shih, C., L. C. Padhy, M. Murray and R. A. Weinberg. 1981. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts. Nature 300: 539542. I Solomon, E., J. Borrow and A. D. Goddard. 1991. Chromosome aberrations and cancer. Science 254: 11531160. P Stehelin, D., H. E. Varmus, J. M. Bishop and P K. Vogt. 1976. DNA related to the trans. forming gene(s) of avian sarcoma viruses is present in normal avian DNA. Nature 260: 170173. I Sugden, B. 1993. How some retroviruses got their oncogenes. Trends Biochem. Sci. 18: 233235. P Tabin, C. J., S. M. Bradley, C. I. Bargmann, R. A. Weinberg, A. G. Papageorge, E. M. Scolnick, R. Dhar, D. R. Lowy and E. H. Chang. 1982. Mechanism of activation of a human oncogene. Nature 300: 143149. I Taipale, J. and P A. Beachy. 2001. The Hedge. hog and Wnt signaling pathways in cancer. Nature 411: 349354. P Testa, J. R. and A. Bellacosa. 2001. Akt plays a central role in tumorigenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1098310985. P Thompson, C. B. 1995. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267: 14561462. P Vivanco, I. and C. L. Sawyers. 2002. The phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway
in human cancer. Nature Rev. Cancer 2: 489 501. P Vogt, P K. 1971. Spontaneous segregation . of nontransforming viruses from cloned sarcoma viruses. Virology 46: 939946. I
Tumorski supresorski geni

Bienz, M. and H. Clevers. 2000. Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell 103: 311320. P Cantley, L. C. and B. G. Neel. 1999. New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3kinase/AKT pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 42404245. P Classon, M. and E. Harlow. 2002. The retinoblastoma tumour suppressor in development and cancer. Nature Rev. Cancer 2: 910917. P Fearon, E. R. 1997. Human cancer syndromes: Clues to the origin and nature of cancer. Science 278: 10431050. P Friend, S. H., R. Bernards, S. Rogelj, R. A. Weinberg, J. M. Rapaport, D. M. Albert and T. P Dryja. 1986. A human DNA segment . with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature 323: 643646. I Harris, H., O. J. Miller, G. Klein, P Worst . and T. Tachibana. 1969. Suppression of malignancy by cell fusion. Nature 223: 363368. I Kinzler, K. W. and B. Vogelstein. 1996. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 87: 159170. P Knudson, A. G. 1976. Mutation and cancer: A statistical study of retinoblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68: 820823. I Lee, W.-H., R. Bookstein, F. Hong, L.-J. Young, J.-Y. Shew and E. Y.-H. P Lee. 1987. Human . retinoblastoma susceptibility gene: Cloning, identification, and sequence. Science 235: 13941399. I Massague, J., S. W. Blain and R. S. Lo. 2000. TGFb signaling in growth control, cancer, and heritable disorders. Cell 103: 295309. P Sherr, C. J. 1996. Cancer cell cycles. Science 274: 16721677. R Taipale, J. and P A. Beachy. 2001. The . Hedgehog and Wnt signaling pathways in cancer. Nature 411: 349354. P Venkitaraman, A. R. 2002. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2. Cell 108: 171182. P Vogelstein, B., D. Lane and A. J. Levine. 2000. Surfing the p53 network. Nature 408: 307310. P Yu, J., Z. Wang, K. W. Kinzler, B. Vogelstein and L. Zhang. 2003. PUMA mediates the apoptotic response to p53 in colorectal cancer cells. I
Onkogeni
Aaronson, S. A. 1991. Growth factors and cancer. Science 254: 11461153. P Adams, J. M. and S. Cory. 2001. Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family. Trends Biochem. Sci. 26: 6166. P Blume-Jensen, P and T. Hunter. 2001. Onco. genic kinase signaling. Nature 411: 355365. P Bos, J. L. 1989. Ras oncogenes in human cancer: A review. Cancer Res. 49: 46824689. P Datta, S. R., Brunet, A. and M. E. Greenberg. 1999. Cellular survival: A play in three Akts. Genes Devel. 13: 29052927. P Davies, H. and 51 others. 2002. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 417: 949954 I Der, C. J., T. G. Krontiris and G. M. Cooper. 1982. Transforming genes of human bladder and lung carcinoma cell lines are
Rak
673
Primjena molekularne biologije u prevenciji i lije~enju raka

Alizadeh, A. A. and 31 others. 2000. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403: 503511. I Balmain, A. 2002. Cancer as a complex genetic trait: Tumor susceptibility in humans and mouse models. Cell 108: 145152. P Dancey, J. and E. A. Sausville. 2003. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nature Rev. Drug Discovery 2: 296313. P Degos, L., H. Dombret, C. Chomienne, M.T. Daniel, J.-M. Miclea, C. Chastang, S. Castaigne and P Fenaux. 1995. All-trans.
retinoic acid as a differentiating agent in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Blood 85: 26432653. P Downward, J. 2002. Targeting Ras signaling pathways in cancer therapy. Nature Rev. Cancer 3: 1122. P Druker, B. J. 2002. Inhibition of the Bcr-Abl tyrosine kinase as a therapeutic strategy for CML. Oncogene 21: 85418546. P Hampton, G. M. and H. F. Frierson, Jr. 2003. Classifying human cancer by analysis of gene expression. Trends Mol. Med. 9: 510. P Harries, M. and I. Smith. 2002. The development and clinical use of trastuzumab (Herceptin). Endocrine-Related Cancer 9: 7585. P
Kerbel, R. and J. Folkman. 2002. Clinical translation of angiogenesis inhibitors. Nature Rev. Cancer 2: 727739. P Oliff, A. 1999. Farnesyltransferase inhibitors: Targeting the molecular basis of cancer. Biochim. Biophys. Acta 1423: C19C30. P Perera, F. P 1997. Environment and cancer: . Who are susceptible? Science 278: 1068 1073. P Ponder, B. 2001. Cancer genetics. Nature 411: 336341. P Thun, M. J., S. J. Henley and C. Patrono. 2002. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs as anticancer agents: Mechanistic, pharmacologic, and clinical issues. J. Natl. Cancer Inst. 94: 252266. P
Odgovori na pitanja
1. poglavlje
1. a) Sve koriste DNA kao svoj geneti~ki materijal. b) Okruène su stani~nom membranom. c) Koriste isti osnovni mehanizam za proizvodnju energije. d) Sve, na istovjetan na~in, koriste ribosome za sintezu proteina. 3. Nukleinske kiseline. 5. Zato {to je stvorila sveobuhvatnu jedinicu koja moè odràvati zajedno zapakovane makromolekule te se reproducirati i evoluirati kao jedinka. 7. Refraktorni indeks zraka je 1,0; refraktorni indeks ulja je pribli`no 1,4. Kako je razlu~ivanje = 0,61l/h sina (h je refraktorni indeks), gledanje objekta kroz zrak umjesto kroz ulje pomi~e granicu razlu~ivanja s oko 0,2 mm na oko 0,3 mm. 9. Centrifugiranje razli~itom brzinom odjeljuje organele s obzirom na njihovu veli~inu i oblik, dok ih ravnote`no centrifugiranje odjeljuje na osnovu gusto}e (neovisno o veli~ini i obliku). 11. Ove su stanice zadràle sposobnost diferencijacije u razli~ite zrele stani~ne tipove, pa zato imaju potencijal pri zamjeni oboljelih stanica u svrhu lije~enja.
3. Glikogen je polimer glukoze koja je u njemu poglavito povezana a(1 4) glikozidnim vezama, a manjim dijelom a(1 6) vezama koje omogu}uju nastajanje ogranaka. Celuloza je ravan, nerazgranat polimer b(1 4) glikozidnim vezama povezanih ostataka glukoze. 5. Masti se u stanici nakupljaju unutar masnih kapljica (posebice u adipocitima) koje su vrlo u~inkovit oblik skladi{tenja energije. Fosfolipidi djeluju kao glavni strukturni sastojak stani~ne membrane. 7. Glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, cistein, metionin, fenilalanin i triptofan. Kako ih voda obi~no odbija, obi~no se nalaze u unutra{njosti enzima topljivih u vodi. 9. Ako se dane vrijednosti uvrste u jednad`bu: G = G + RT ln BC A
2. poglavlje
1. Voda je polarna molekula ~iji vodik i kisik mogu stvarati vodikove veze sa drugim molekulama vode ({to vodu ~ini teku}om u najve}em dijelu raspona temperature na Zemlji) i sluìti kao dobro otapalo polarnih organskih molekula i anorganskih iona. 2. Voda tako|er odbija nepolarne molekule ili nepolarne dijelove molekula te ih tjera na me|usobnu asocijaciju stvaraju}i va`ne strukture kao {to su stani~ne membrane i membrane organela.
Dobiva se slijede}i rezultata: DG = 8.08 kJ/mol. Zato }e reakcija napredovati u smjeru s lijeva u desno, te }e se unutar stanice A pretvarati u B i C. 11. Proteinski nosa~i moraju vezati svaku pojedina~nu molekulu koja se transportira na za to specifi~nom mjestu, promijeniti konformaciju, otpustiti je na drugoj strani i vratiti se u prvotnu konformaciju; ovo traje dulje od prolaska kroz kanal bez ikakvog vezanja i konformacijskih promjena.
3. poglavlje
1. Translacija je sinteza proteina prema RNA-kalupu. 3. Umjesto mRNA u eksperimentu in vivo translacije dodan je poli-U, a rezultat je bio nastanak poli-fenilalanina. Kako je jedini dodani nukleotid bio uracil, a drugi su dokazi govorili u prilog triplet koda, prvi dodijeljeni kodon je bio UUU za fenilalanin.
676
Odgovori na pitanja
5. Dodavanje ili oduzimanje jednog ili dvaju nukleotida pomaknuti }e okvir ~itanja od tog mjesta na dalje, daju}i tako potpuno razli~iti slijed aminokiselina, dok promjena triju nukleotida oduzima ili dodaje samo jednu aminokiselinu. Ovo obi~no ima za posljedicu protein koji funkcionira posve normalno. 7. Ona omogu}uje umnaànje slijeda DNA u milijune kopija, ako su poznati kratki odsje~ci na krajevima tog slijeda. 9. UGC kodira i cistein, pa se ova mutacija ne}e odraziti na funkciju enzima. UGA je, naprotiv, stop kodon, pa }e ova mutacija rezultirati neaktivnim enzimom. 11. Haploidni spermij sadràva jednu po~etnu kopiju slijeda DNA. U svakom se ciklusu lan~ane reakcije polimeraze po~etni materijal udvostru~uje, pa je rezultat 10 ciklusa 210, ili pribli`no tisu}u kopija. Amplifikacija kroz 30 ciklusa daje 230, ili vi{e od milijarde kopija. 13. Mutacija èljene aminokiseline moè se napraviti in vitro mutagenezom. Posljedice ove mutacije za kataliti~ku aktivnost mogu se odrediti nakon ekspresije mutiranoga proteina u bakterijskoj ili eukariotskoj stanici.
5. poglavlje
1. Polimeraza I i II uklju~ene su u popravak o{te}enja DNA. Polimeraza III je glavni enzim uklju~en u replikaciju DNA, premda polimeraza I uklanja RNA po~etnice i popunjava pukotine izme|u Okazakijevih fragmenata zaostaju}ega lanca. 3. Topoizomeraza I kida jedan lanac dvostruke uzvojnice DNA i dopu{ta mu da se obrne oko druge fosfodiesterske veze kako bi se otpustila napetost zavoja. Topoizomeraza II cijepa oba lanca dvostruke uzvojnice DNA i moè propustiti drugu molekulu DNA kroz procijep odmataju}i isprepletene molekule (primjerice za vrijeme mitoze). 5. Genom sisavaca je tisu}u puta ve}i te se replicira znatno sporije tako da zahtijeva vi{e ishodi{ta replikacije kako bi se molekule DNA udvostru~ile kroz nekoliko sati koliko traje tipi~na faza sinteze DNA. 7. Telomeraza je reverzna-transkriptaza koja koristi svoj vlastiti interni slijed RNA za dodavanje kratkih komplementarnih slijedova na 3 kraj DNA. 9. Dvolan~ani lomovi mogu se popraviti rekombinacijskim popravkom. Rekombinacija s homolognim kromosomom, kao {to je sestrinska kromatida, moè omogu}iti kopiranje nedostaju}eg dijela kromosoma s jednog lanca homolognog kromosoma. 11. Visoka u~estalost karcinoma koè rezultat je o{te}enja molekule DNA nastalog djelovanjem sun~evog UV zra~enja. Takvo se o{te}enje popravlja mehanizmom izrezivanja nukleotida. Nepostojanje pove}ane incidencije drugih karcinoma moè sugerirati da sli~ni tipovi o{te}enja nisu u~estali u unutra{njim organima i da ve}ina karcinoma ovih organa rezultira iz drugih tipova mutacija (primjerice ugradnja krivo sparenih baza za vrijeme replikacije DNA). 13. Stani~ne reverzne-transkriptaze koje mogu biti inhibirane djelovanjem ovih lijekova uklju~uju telomerazu i reverznu-transkriptazu kodiranu LINE slijedovima. Inhibicija aktivnosti reverzne-transkriptaze nije letalna za stanicu dok inhibicija telomerazne aktivnosti moè onemogu}iti replikaciju kromosomskih krajeva.
4. poglavlje
1. Organizmi sa genomom koji nadilazi njihovu kompleksnost vjerojatno imaju ve}u koli~ini nekodiraju}e DNA izme|u pojedinih gena ili pojedinih egzona koji kodiraju proteine. 3. Alternativno prekrajanje omogu}uje jednom genu da kodira vi{e od jednoga proteina. Ovo pove}ava broj razli~itih proteina koje jedan organizam moè napraviti bez da istovremeno pove}a broj gena. 5. Centromera je onaj dio eukariotskoga kromosoma koji sluì pri povezivanju sestrinskih kromatida te kao mjesto pri~vr{}ivanja vlakana diobenoga vretena tijekom mitoze. Kinetohora je struktura koja se oblikuje na centromeri tijekom mitoze, a na koju s pri~vr{}uju mikrotubuli diobenoga vretena. 7. a) Sprje~ava krajeve kromosoma da se razgrade ili me|usobno poveù. b) Omogu}uje dovr{etak replikacije krajeva kromosoma. 9. Otvoreni okvir ~itanja je dugi slijed nukleotida u kojemu nema stop-kodona (UAA, UAG, UGA). Njihovo zna~enje je da su otvoreni okviri ~itanja obi~no funkcionalni geni. 11. Reasocijacija DNA je bimolekularna reakcija, pa je brzina reakcije razmjerna kvadratu koncentracije molekula DNA. Tako }e slijedovi koji se ponavljaju 1.000 puta zdruìvati brzinom 106 puta ve}om od slijeda koji se jednom ponavlja.
6. poglavlje
1. Laktoza se veè na represorski protein koji nastaje prepisivanjem gena i te tako onemogu}uje represor da se veè na operatorsku regiju lac operona. Ovo omogu}uje RNA-polimerazi pomicanje kroz operator i ~itanje regije koja kodira proteine kao jedne duge policistronske poruke. 3. Divlji tip gena bit }e normalno reguliran, a gen koji je osjetljiv na temperaturu bit }e konstitutivno eksprimiran. Zato }e se b-galaktozidaza eksprimira-
Odgovori na pitanja
677
ti na permisivnim, ali ne i na nepermisivnim temperaturama. 5. Sigma faktor se veè na sljedove koji su 35 i 10 parova baza uzvodno od startnog mjesta u promotorskoj regiji i usmjeruje RNA-polimerazu na vezanje za promotor i inicijaciju transkripcije od startnog mjesta. Nakon {to se doda desetak nukleotida, s faktor se uklanja. 7. RNA-polimeraza I prepisuje samo veliku 45S prerRNA. RNA-polimeraza II prepisuje sve mRNA i neke male jezgrine RNA. RNA-polimeraza III prepisuje tRNA, 5S rRNA i neke druge male RNA. 9. Poja~iva~i mogu djelovati daleko od kodiraju}ih slijedova dok promotori djeluju samo u blizini kodiraju}ih slijedova. 11. Dvije razli~ite domene koje veù DNA mogu biti spojene na aktivacijsku domenu faktora pomo}u tkivno -specifi~nog alternativnog prekrajanja. 13. Jedan od dvaju X kromosoma inaktivira se rano tijekom razvoja ène (ili XXY mu{karca). RNA zvana Xist nastaje prepisivanjem Xist gena sa jednog od dvaju kromosoma i veè se na ve}inu gena istog kromosoma. Xist RNA koristi proteine koji potiskuju X kromatin, vjerojatno uz pomo} metilacije histona {to dovodi do stvaranja heterokromatina.
sposobnosti da budu transportirani kroz jezgrine pore. 3. Da, u}i }e protein od 15 kDa, ali ne i protein od 150 kDa. Proteini koji su do 20 kDa mogu slobodno u}i u jezgru kroz otvorene vodene kanale. 5. Dobar primjer je NF-B, regulator gena za kapa lake lance imunoglobulina B limfocita. U nestimuliranim stanicama, IB je vezan na NF-B, a kompleks se ne moè transportirati u jezgru. Nakon stimulacije, IB se fosforilira i razgradi ubikvitinom-posredovanom proteolizom. Ovo izlaè jezgreni lokalizacijski signal NF-B {to ga usmjerava u jezgru i omogu}ava aktiviranje transkripcije ciljnih gena. 7. Inaktiviranje jezgrinog izlaznog signala zadràt }e protein u jezgri. 9. Jezgreni lokalizacijski signali ostaju na proteinima jezgre te se oni ponovno unose u jezgru nakon {to se ponovno formira jezgrina ovojnica u telofazi mitoze. Oni jezgrini proteini koji nisu dio mitoti~kog ustroja otpu{taju se u smjesu citoplazme i nukleoplazme koja nastaje nakon raspada jezgre.
9. poglavlje
1. Palade i suradnici su tretirali stanice pankreati~nih acinusa jednim pulsom radioaktivnih aminokiselina, koje su se ugradile u proteine. Na autoradiografiji se vidjelo da se su se ozna~eni proteini prvo pojavili na hrapavom ER. Nakon kratke potjere sa neradioaktivnim aminokiselinama, ozna~eni su se proteini pojavili u Golgijevom aparatu, a nakon duèg vremena ozna~eni su se proteini na{li u sekretornim vezikulama i izvan stanice. Ovako je pokazano da je sekretorni put hrapavi ERGolgijev aparatsekretorne vezikuleizlu~eni proteini. 3. Kotranslacijska translokacija obuhva}a vezanje ~estice koja prepoznaje signal i translokaciju kroz translokon procesom kojega tjera sinteza proteina na ribosomu. Postranslacijska translokacija usmjeruje polipeptid prema ER po zavr{etku sinteze i ne zahtijeva SRP Polipeptid kojeg treba prenijeti prepoznaje . kompleks Sec 62/63 i ume}e ga u translokon. Polipeptid u lumen ER provla~i {aperon koji se zove BiP . 5. Skupine ugljikohidrata dodaju se unutar lumena ER i Golgijeva aparata, koji topolo{ki odgovaraju vanj{tini stanice. 7. U po~etku, signalni slijed usmjeruje nastaju}i lizosomski polipeptid ili pre-lizosomski protein u hrapavi ER, a po{to u|e dodaje mu se N-vezani oligosaharid. Nakon {to se pomakne prema Golgi aparatu, tri manoze koje se obi~no uklanjaju, na njemu ostaju i mijenjaju se u manoza-6-fosfat u procesu koji se sastoji iz dva koraka (koji se doga|aju u cis Golgiju). Ove manoza-6-fosfate prepoznaje i veè receptor u
7. poglavlje
1. Mnoge tRNA mogu stvarati vodikove veze sa vi{e od jednim kodonom zato {to se tre}a baza kodona moè kolebati, tj. sparivati se na nestandardni na~in sa nukleotidima koji su druga~iji od njihovih uobi~ajenih komplementarnih parova. 3. Potrebno je dodati Shine-Delgarnov slijed. 5. Poliadenilacija je vaàn regulatorni mehanizam translacije tijekom ranog razvoja. Njena bi inhibicija onemogu}ila translaciju mnogih mRNA oocite nakon oplodnje. 7. Povi{ena temperatura moè denaturirati proteine. [aperoni su proteini toplinskog {oka koji potpomaù smatanje denaturiranih proteina u prirodni oblik, te na taj na~in obnavljaju izgubljenu funkciju proteina. 9. Tretman fosfolipazom bi sa stani~ne povr{ine oslobodio GPI-usidrene proteine, ali ne i transmembranske proteine.
8. poglavlje
1. Prepisane RNA se u eukariota dalje obra|uju prekrajanjem, a njihov se izlazak iz jezgre moè regulirati. Tako|er je prilaz transkripcijskih faktora genima koje reguliraju ~esto reguliran mijenjanjem njihove
678
Odgovori na pitanja
trans Golgi mreì, koji usmjeruje transport ovih proteina u lizosome. 9. U slu~aju ne nastajanja manoza-6-fosfata u Golgi aparatu, normalni lizosomski proteini }e biti izlu~eni. 11. Transportni sustav bez stanica koristio je Rotham sa suradnicima kako bi pokazali vezikularni transport proteina izme|u cisterni Golgijeva aparata. Golgijev aparat su izolirali iz virusom inficiranih stani~nih linija kojima je nedostajao enzim koji prebacuje Nacetilglukozamin na glikoproteine i pomije{ali ga sa Golgijevim stogom iz normalnih, neinficiranih stanica. U mje{ovitom Golgijevu sustavu virusni su proteini imali N-acetilglukozamin, ~ime je dokazano da se proteini mogu pomicati iz jednog Golgijeva stoga u drugi uz pomo} vezikularnog transporta.
11. poglavlje
1. Kako se formiraju aktinska vlakna, tako se nove asimetri~ne podjedinice G aktina dodaju u istoj orijentaciji {to oblikuje dva razli~ita kraja vlakna. 3. Citohalazini se veù na plus kraj aktinskih vlakana i zaustavljaju njihovu elongaciju, te }e se stoga mikrofilamenti koji hodaju u mjestu depolimerizirati. Faloidin se veè na aktinske filamente i inhibira njihov raspad. Mikrofilamenti }e prestati hodati u mjestu, ali }e i dalje postojati i mogu se produljivati. 5. Najvjerojatnija dijagnoza je Duchenn-ova muskularna distrofija. Uzrok bolesti je mutacija u genu koji kodira distrofin, proteinu koji povezuje aktinska vlakna s glikoproteinom na stani~noj membrani koji povezuje mi{i}nu stanicu sa izvanstani~nim matriksom. 7. Polarnost aktinskih vlakana odre|uje smjer kretanja miozina. Kad aktinska vlakna ne bi bila polarna ne bi dolazilo do klizanja aktinskih i miozinskih vlakana koje je posljedica pomicanja miozina u samo jednom smjeru. 9. Ne. Keratini su eksprimirani samo u epitelnim stanicama. 11. Povezivanjem dvostrukih mikrotubula trepetljika, neksin pretvara klizanje pojedina~nih mikrotubula u pokret savijanja i kona~no udaranje trepetljika. Kad bi ovo uklonili, mikrotubuli bi samo klizili jedni pored drugih.
10. poglavlje
1. Unutra{nja membrana mitohondrija ima veliku povr{inu zahvaljuju}i kristama. Tako|er, sadràj proteina u ovoj membrani je neobi~no visok (>70%), a uklju~uje mnoge enzime i nosa~e elektrona. 3. Pod ovim uvjetima, DG je pribli`no 1,4 kcal/mol. 5. Prvi pozitivno nabijeni ulazni signal dovodi do unosa u matriks mitohondrija, gdje se ovaj pre-slijed uklanja, a drugi, hidrofobni slijed usmjeruje polipeptid prema Oxa1, translokazi unutar unutra{nje membrane koja omogu}uje citokromu b2 ulaz u me|umembranski prostor. 7. F0 premo{}uje unutra{nju membranu mitohondrija i tilakoidnih membrana kloroplasta. F1 je s pomo}u stapke povezan s F0 i pruà se u matriks mitohondrija i stromu kloroplasta. F0 kompleks je kanal kroz koji protoni utje~u nazad u matriks ili stromu. Mehani~ko povezivanje stapke tjera rotaciju unutar F1 kompleksa, {to uzrokuje sintezu ATP . 9. Dva elektrona velike energije potrebna su za kidanje jedne molekule H2O, zato treba 24 elektrona velike energije za sintezu jedne molekule glukoze. Prolaz ovih elektrona kroz dva fotosustava stvara 12 molekula NADPH i 12 do 18 molekula ATP ovisno o , stehiometriji crpljenja protona u kompleksu bf citokroma. Kako je 18 molekula ATP potrebno za Calvin ciklus, za sintezu glukoze moè biti potrebno jo{ molekula ATP koje proizvodi cikli~ki tok elektrona. 11. Proteini peroksisoma sintetiziraju se na slobodnim ribosomima u citosolu i usmjeruju u peroksisome ili s pomo}u signalnog slijeda Ser-Lys-Leu na karboksilnom kraju ili slijedom od devet aminokiselina na amino -kraju. Ove prepoznaju receptori i unose putem transportera kroz jednostruku membranu peroksisoma.
12. poglavlje
1. Na visokim temperaturama, struktura prstena kolesterola onemogu}uje kretanje fosfolipida u dvosloju, smanjuju}i tako fluidnost membrane i pove}avaju}i njezinu stabilnost. Na niskim temperaturama, struktura kolesterola ometa me|usobne interakcije lanaca masnih kiselina i odràva fluidnost membrane. 3. Prisutnost porina u stani~noj membrani omogu}ila bi slobodnu difuziju iona i malih molekula izme|u citosola i izvanstani~ne teku}ine {to bi bilo katastrofa za stanicu. 5. Prvo, glikokaliks {titi stanicu (primjerice, od proteaza u probavnom traktu). Drugo, glikokaliks sudjeluje u me|ustani~nim interakcijama (primjerice, vezanjem na selektine). 7. Biljne stani~ne stijenke onemogu}uju bubrenje stanice i omogu}uju nastanak turgora. 9. Gram-pozitivne bakterije imaju samo jednu membranu, stani~nu membranu, okruènu debelim stani~nim zidom od peptidoglikana. Gram-negativne bakterije, imaju stani~nu membranu i vanjsku membranu, a izme|u njih se nalazi tanki stani~ni zid od peptidoglikana.
Odgovori na pitanja
679
11. Za polarizirane funkcije epitelnih stanica pri transportu glukoze iz lumena crijeva u krvni optok vaàn je ispravan smje{taj transportera koji posreduju u aktivnom transportu i ubrzavaju difuziju. ^vrsti spojevi onemogu}uju difuziju ovih transportera izme|u domena stani~ne membrane i brtve prostor izme|u epitelnih stanica.
13. poglavlje
1. Kad molekule otpu{tene iz jedne ili vi{e stanica djeluju samo na susjedne stanice signalizacija je parakrina, dok je endokrina signalizacija otpu{tanje hormona iz endokrinih `ljezda. Ovi se hormoni prenose kroz organizam i djeluju na sve ciljne stanice koje imaju receptor za ovaj hormon. 3. Hidrofobne signalne molekule mogu difundirati kroz stani~nu membranu i vezati se na citoplazmatske ili jezgrine receptore. Hidrofilne signalne molekule, kakvi su proteinski hormoni, ne mogu difundirati kroz stani~nu membranu pa se zato veù samo na stani~ne receptore. 5. Inhibicijom cAMP-fosfodiesteraze podigla bi se razina cAMP {to bi stimuliralo proliferaciju stanica. 7. Monomeri PDGF ne bi inducirali dimerizaciju receptora. Kako je to prvi kriti~ni korak u signalizaciji putem receptorskih tirozin-kinaza, monomeri ne bi mogli stimulirati PDGF receptore. 9. cAMP se veè na regulatornu podjedinicu proteinkinaze A, otpu{taju}i dvije manje kataliti~ke podjedinice protein-kinaze A, koje mogu u}i u jezgru kroz jezgrine pore. U jezgri, PKA fosforilira CREB, koji se veè na proteine CRE i aktivira gene koje inducira cAMP . 11. Kad stanica umre uslijed akutnog o{te}enja ili nekroze, do|e do lize a sadràj se na|e u izvanstani~nom prostoru {to uzrokuje upalni odgovor (a moè izazvati i autoimuni odgovor). Kad stanice umru uslijed apoptoze, prolaze kroz programirani niz promjena u kojima se razgra|uju stani~ni proteini i DNA. Kona~no se stanica raspada u komadi}e ome|ene membranom koji se u~inkovito mogu ukloniti makrofagima i drugim fagocitnim stanicama.
3. Inhibicijom kontrolnih to~aka u G1 i S fazi smanjuje se vjerojatnost popravka o{te}ene DNA prije njene replikacije, {to moè dovesti do propagiranja pogre{aka. Inhibicijom G2 kontrolne to~ke dobit }e se na vremenu da se lomovi u DNA ili druge pogre{ke poprave prije no zapo~ne mitoza, sprje~avaju}i tako da o{te}ena DNA bude prenesena stanicama k}erima. 5. U normalnoj stanici, pretjerana ekspresija p16 inhibirati }e progresiju kroz stani~ni ciklus u kontrolnoj to~ki G1 faze. Kako je Rb glavna meta Cdk4,6/ciklin kompleksa, tumorske stanice kojima nedostaje funkcionalni Rb ne}e biti pogo|ene pretjeranom ekspresijom p16. 7. MPF izravno fosforilira nekoliko strukturnih proteina mijenjaju}i im osobine i zapo~inju}i mitozu. Me|u njima su kondenzini (odgovorni za kondenzaciju kromosoma), histon H1, jezgrini lamini, protein matriksa Golgija GMI 30 i mikrotubulima pridruèni proteini. MPF, tako|er, pokre}e kaskadu proteinkinaza koje vode napredovanju kroz M fazu. 9. Oocite mi{a bi propustile zastoj u metafazi II. 11. Mati~ne stanice su stanice koje diobama produciraju stanice k}eri koje se mogu ili diferencirati ili ostati kao mati~ne stanice.
15. poglavlje
1. Rak je zlo}udni tumor. Zlo}udni tumori nekontrolirano rastu i dijele se i mogu metastazirati ili se {iriti u druge dijelove tijela. 3. Estrogeni djeluju kao promotori tumora pove}avaju}i proliferaciju stanica osjetljivih na estrogene, poput stanica dojke i endometrija. 5. Sva tri navedena virusa transformiraju stanice inaktiviraju}i tumorske supresorske proteine Rb i p53. 7. gsp kodira podjedinicu Gs proteina koji stimulira adenil-ciklazu. Prema tome, gsp ne}e djelovati kao onkogen u stanicama ~iju proliferaciju inhibira cAMP . 9. INK4 kodira inhibitor Cdk, protein p16, koji inhibira komplekse Cdk4,6/ciklin D. Budu}i da je fosforilacija Rb proteina klju~na za u~inak Cdk4,6/ciklin D kompleksa, poja~ana ekspresija p16 ne}e djelovati na stanice u kojima je Rb ve} inaktiviran. 11. Iako se sklonost naslje|uje dominantno, heterozigoti imaju jedan normalan Rb gen koji stvara dovoljno Rb proteina da sprije~i nastanak tumora. Tumor nastaje tek nakon {to do|e do mutacije tog normalnog Rb gena (doga|aj do kojeg dolazi s velikom vjerojatno{}u obzirom na velik broj stanica retine stvorenih tijekom prenatalnog razvoja).
14. poglavlje
1. Stanica i u G0 i u G1 fazi ima istu koli~inu DNA (primjerice, diploidna je u ve}ine humanih stanica) te je u obje faze metaboli~ki aktivna. Stanice u G0 razlikuju se od stanica u G1 po tomu {to ne proliferiraju osim ako nisu stimulirane da ponovno u|u u stani~ni ciklus (primjerice, visokim razinama specifi~nog faktora rasta).
Pojmovnik
2'-deoksiriboza {e}er s pet ugljikovih atoma u DNA. 3'-neprevedeno podru~je nekodiraju}e podru~je na 3'-kraju mRNA. 5'-metilgvanozinska kapa tvorba koja se sastoji od GTP i metiliranih {e}era koja se dodaje na 5' kraj eukariotskih mRNA. 5'-neprevedeno podru~je nekodiraju}e podru~je na 5'-kraju mRNA. a-aktinin protein koji se veè za aktin i povezuje aktinska vlakna u kontraktilne snopove. a-uzvojnica zavijena sekundarna struktura polipeptidnoga lanca koju stvaraju vodikove veze izme|u aminokiselina me|usobno razdvojenih s po ~etiri aminokiselinska ostatka. ABC-transoorteri velika porodica membranskih transportnih proteina koji sadràvauu konzerviranu domenu koja veè ATP . abl proto-onkogen {to kodira protein-tirozin-kinazu, a kojeg u kroni~noj mijeloi~noj leukemiji aktivira kromosomska translokacija. adaptin protein koji se veè na membranske receptore i poti~e stvaranje vezikula obloènih klatrinom. adenil-ciklaza enzim koji katalizira stvaranje cikli~nog AMP iz ATP . adenin purin koji tvori par s timinom ili uracilom. adenom dobro}udni tumor koji nastaje iz `ljezdanog epitela. ADF/kofilin porodica proteina koji veù aktin i razdruùju aktinska vlakna. adhezijski pojas tvorba pojasasta oblika oko epitelnih stanica u kojoj su kontraktilni snopovi aktinskih vlakana vezani na stani~nu membranu. aksonema temeljna tvorba stani~nih trepetljika i bi~eva, sastavljena od sredi{njega para mikrotubula okruènih s devet parova mikrotubula.
aksonemalni dinein vrsta dineina u stani~nim trepetljikama i bi~evima. Akt serin/treonin-kinaza koja ima klju~nu ulogu u signaliziranju stani~noga preìvljenja, a aktivira je PIP3. aktin protein molekularne mase 43 kd koji polimerizira u citoskeletna vlakna. aktinska mreà ukrièna aktinska vlakna povezana u labave trodimenzionalne mreè. aktinski snop aktinska vlakna povezana u ~vrste tvorbe. aktivni prijenos prijenos molekula kroz membranu u energetski nepovoljnom smjeru, zdruèn s hidrolizom ATP ili drugih izvora energije. aktivno mjesto mjesto na enzimu na koje se veè supstrat i koje katalizira enzimsku reakciju. alel jedna od ina~ica istoga gena. alosteri~ka regulacija regulacija enzima s pomo}u malih molekula koje se veù na mjesto razli~ito od aktivnog mjesta enzima, mijenjaju}i konformaciju i kataliti~ku aktivnost enzima. alternativno prekrajanje (engl. alternative splicing) stvaranje razli~itih mRNA mijenjanjem uzorka prekrajanja pre-mRNA. amfipati~an molekula koja ima i hidrofobno i hidrofilno podru~je. amiloplast plastid u kojemu se pohranjuje {krob. aminoacil-tRNA-sintetaza enzim koji spaja specifi~nu aminokiselinu za molekulu tRNA koja ima odgovaraju}i antikodonski slijed. aminokiselina monomerna gradbena jedinica proteina koja se sastoji od a-karboksilne skupine, a-amino skupine, i specifi~noga bo~nog ogranka. amplifikacija gena pove}anje broja kopija nekoga gena zbog ponovljenog umnoàvanja odre|enog dijela DNA.
682
Pojmovnik
anafaza razdoblje stani~ne diobe tijekom kojeg se razdvajaju sestrinske kromatide i odlaze na suprotne polove diobenoga vretena. anafaza A gibanje sestrinskih kromatida prema polovima diobenoga vretena tijekom mitoze. anafaza B odvajanje polova diobenoga vretena tijekom mitoze. angiogeneza stvaranje novih krvnih ìla. ankirin protein koji veè spektrin i povezuje aktinski citoskelet na stani~nu membranu. antigen molekula koju specifi~no prepoznaje protutijelo. antikodon slijed nukleotida u transportnoj RNA koji stvara komplementarne parove baza s kodonskim slijedom na glasni~koj RNA. antiport prijenos dviju molekula u suprotnim smjerovima preko membrane. AP-endonukleaza enzim popravka DNA koji kida fosfodiestersku vezu u molekuli DNA pokraj apirimidinskog ili apurinskog mjesta. apikalno podru~je izloèna slobodna povr{ina polarizirane epitelne stanice. apoptosom proteinski sustav u kojemu se kaspaza-9 aktivira da bi pokrenula apoptozu nakon osloba|anja citokroma c iz mitohondrija. apoptoza aktivno zbivanje programirane stani~ne smrti, koje obiljeàva razlaganje kromosomske DNA, zgu{njavanje kromatina i fragmentacija jezgre i stanice. apscizinska kiselina biljni hormon. Arabidopsis thaliana uro~jak, mala cvjetnica koja se rabi kao model u prou~avanju biljne molekularne biologije i razvoja. ARF protein koji veè GTP nuàn za pupanje vezikula iz , trans-Golgijeve mreè. arhebakterije jedna od dviju glavnih skupina prokariota; mnoge vrste arhebakterija ìve u ekstremnim uvjetima sli~nim onima tijekom ranog razdoblja stvaranja Zemlje. ARP 2/3-kompleks proteinski sustav koji se veè na aktinska vlakna i zapo~inje stvaranje grana. astralne cjev~ice (mikrotubuli) cjev~ice mitoti~koga vretena koje se produljuju na krajeve stanice. ATP (adenozin-5'-trifosfat) nukleozid-trifosfat koji sadràva adenin i sluì kao spremi{te slobodne energije u stanici. ATP-sintaza proteinski kompleks koji prolazi kroz unutra{nju membranu mitohondrija, a zdruùje energetski povoljan prijenos protona kroz membranu sa sintezom ATP . auksin biljni hormon koji odre|uje mnoge stadije razvoja biljke. autofagija razgradnja citoplazmatskih proteina i organela u kojoj se te tvorbe okruùju vezikulama endoplazmatskog retikula i stapaju s lizosomima. autofagosom vezikula koji sadràva unutarnje organele okruène dijelovima membrane endoplazmatskoga retikula spojene s lizosomima.
autofosforilacija reakcija u kojoj protein kinaza katalizira vlastitu fosforilaciju. autokrina signalizacija vrsta stani~ne signalizacije u kojoj stanica izlu~uje ~imbenik rasta na koji i sama reagira. autokrino poticanje rasta poticanje stani~nog umnoàvanja nakon osloba|anja ~imbenika rasta iz iste podraène stanice. autonomno repliciraju}i slijed (ARS) slijed nukleotida na kojem zapo~inje replikacija DNA u kvascu. autoradiografija otkrivanje molekula obiljeènih radioizotopom s pomo}u rentgenskog filma. b-ba~va transmembransko podru~je (domena) koje nastaje preklapanjem b-plo~a u tvorbu nalik ba~vi. b-nabrana plo~a sekundarna struktura polipeptidnoga lanca u obliku nabrane plo~e koju stabiliziraju vodikove veze izme|u aminokiselina smje{tenih u razli~itim dijelovima polipeptidnog lanca. bakterijski umjetni kromosom (BAC, od engl. bacterial articifial chromosome) vrsta vektora koji se rabi za kloniranje velikih fragmenata DNA u bakterijama. bakteriofag bakterijski virus. bakulovirus virus koji se ~esto rabi kao ekspresijski vektor za proizvodnju eukariotskih proteina u insktnim stanicama. bazalna lamina tankoslojna me|ustani~na tvar koja podupire epitelne stanice i okruùje mi{i}ne i masne stanice, te periferne ìvce. bazalna membrana v. bazalna lamina. bazalno tijelo tvorba nalik centriolu, koja zapo~inje rast aksonemalnih mikrotubula i ukotvljuje stani~ne trepetljike i bi~eve uz povr{inu stanice. bazolateralno podru~je (domena) povr{inski dio polarizirane epitelne stanice koji je u dodiru sa susjednom stanicom ili me|ustani~nom tvari. Bcl-2 ~lan porodice proteina koji reguliraju programiranu stani~nu smrt. benigni tumor dobro}udni tumor, koji ostaje ograni~en na mjesto nastanka. bi~ izdanak stani~ne membrane proèt mikrotubulima, zaduèn za pokretanje stanice. biljni hor moni skupina malih molekula koje upravljaju odgovorima biljnih tkiva na signale iz okoli{a. bioinformatika uporaba ra~unalnih postupaka za analizu velikih koli~ina biolo{kih podataka, primjerice genomskog slijeda. brasinosteroid biljni steroidni hormon. brzinsko centrifugiranje razdvajanje ~estica ovisno o njihovoj brzini slijeganja (sedimentacije). Caenorhabditis elegans obii} koji se rabi kao jednostavan vi{estani~ni razvojni model. Calvinov ciklus niz kemijskih reakcija kojima se {est molekula CO2 pretvara u glukozu. CaM-kinaza ~lan porodice protein-kinaza koje se aktiviraju vezanjem Ca2+/kalmodulina. cAMP-fosfodiesteraza enzim koji razgra|uje cikli~ki AMP .
Pojmovnik
683
Cdc2 protein-serin/treonin-kinaza koja je klju~ni enzim u regulaciji mitoze eukariotskih stanica. Cdc42 ~lan Rho-potporodice malih proteina koji veù GTP . Cdk-inhibitori (CKI) porodica proteina koji veù Cdk molekule i inhibiraju njihovo djelovanje. Cdk protein-kinaze ovisne o ciklinu koje upravljaju stani~nim ciklusom u eukariota. V. i Cdc2. cDNA v. komplementarna DNA. cDNA- knji`nica zbirka rekombinantnih klonova koji sadràvaju cDNA. celuloza temeljna gradbena tvar stani~nih stijenki, linearni polimer glukoznih ostataka povezanih b(14) glikozidnim vezama. celulozna mikrovlakna vlakna u stani~nim stijenkama biljnih stanica koja nastaju udruìvanjem nekoliko desetaka usporednih celuloznih lanaca. celuloza-sintaza enzim koji katalizira sintezu celuloze. centrifugiranje u gradijentu gusto}e na~in razdvajanja ~estica centrifugiranjem kroz gradijent guste tvari, primjerice saharoze ili cezijeva klorida. centriol valjkasta tvorba koja se sastoji od devet tripleta mikrotubula u centrosomima ve}ine ìvotinjskih stanica. centromera posebno podru~je kromosoma koje spaja sestrinske kromatide i pri~vr{}uje ih za mitoti~ko vreteno. centrosom organizacijski centar mikrotubula u ìvotinjskim stanicama. cGMP-fosfodiesteraza enzim koji razgra|uje cGMP . cijanobakterije najve}i i najsloèniji prokarioti, u kojima se vjerojatno razvila fotosinteza. cikli~ki AMP (cAMP) adenozin-monofosfat u kojemu je fosfatna skupina kovalentno vezana i na 3' i na 5' atom ugljika te tako tvori kru`nu tvorbu; vaàn drugi glasnik u stani~nom odgovoru na razli~ite hormone. cikli~ki GMP (cGMP) gvanozin-monofosfat u kojem je fosfatna skupina kovalentno vezana i na 3' i na 5' atom ugljika te tako tvori kru`nu strukturu; vaàn drugi glasnik u stani~nom odgovoru na razli~ite hormone, a posebice u osjeta vida. ciklini porodica proteina koji odre|uju aktivnost Cdk i napredovanje kroz stani~ni ciklus. ciklus limunske kiseline niz reakcija kojima se acetil CoA oksidira u CO2. Sredi{nji put oksidativnog metabolizma. cis-djeluju}i kontrolni element slijed nukleotida u DNA koji sluì kao vezno mjesto za regulatorne proteine i tako kontrolira prepisivanje susjednih gena. cis-Golgijeva mreà podru~je Golgijeva tijela u koji proteini ulaze iz endoplazmatskog retikula. citohalazin lijek koji inhibira produljivanje aktinskih vlakana. citokineza dioba stanica nakon mitoze ili mejoze.
citokini faktori rasta koji reguliraju krvne stanice i limfocite. citokinin biljni hormon koji odre|uje stani~nu diobu. citokinska receptorska superporodica porodica receptora na stani~noj povr{ini koji djeluju poticanjem aktivnosti unutarstani~nih protein-tirozin-kinaza. citokrom bf-kompleks proteinski kompleks u tilakoidnoj membrani koji prenosi elektrone tijekom fotosinteze. citokrom c mitohondrijski periferni membranski protein koji prenosi elektrone tijekom oksidativne fosforilacije. citokrom-oksidaza proteinski sustav u lancu prijenosa elektrona koji prihva}a elektrone od citokroma c i prenosi ih na O2. citoplazmatski dinein oblik dineina vezan uz mikrotubule u citoplazmi. citoskelet mreà proteinskih vlakana koja se pruà kroz citoplazmu eukariotskih stanica. Daje gradbenu osnovu stanici i odgovorna je za stani~ne pokrete. citostati~ki faktor (CSF) citoplazmatski ~imbenik koji zaustavlja mejozu jajne stanice u metafazi II. citozin pirimidin koji se specifi~no sparuje s gvaninom. c-myc protoonkogen koji kodira transkripcijski ~imbenik i koji se ~esto aktivira kromosomskim translokacijama ili umnoàvanjem gena u ljudskim tumorima. CRE, element koji odgovara na cAMP (engl. cAMP responsive element) regulacijski slijed koji prenosi transkripcijski odgovor ciljnih gena za cAMP . CREB protein koja se veè na element koji odgovara na cAMP; transkripcijski faktor koji se aktivira protein-kinazom ovisnom o cAMP . ~estica za prepoznavanje signala (SRP engl. signal recogni, tion particle) ~estica sastavljena od proteina i 7S-RNA, koja se veè na signalni slijed i donosi polipeptidne lance na endoplazmatski retikul. ~etkasta prevlaka povr{ina stanice sa slojem mikroresica (primjerice u crijevnom epitelu). ~vrsti spoj (engl. tight junction) neprekinuta mreà proteina cijelim opsegom epitelnih stanica; ~vrsto zatvara prostor izme|u stanica i tako stvara pregradu izme|u vr{nih i bazolateralnih dijelova stanice. deoksiribonukleinska kiselina (DNA) genska tvar stanice. dezmin intermedijarni vlaknasti protein u mi{i}nim stanicama. dezmosom podru~je dodira epitelnih stanica u kojemu su keratinska vlakna ukotvljena u stani~nu membranu. V. i hemidezmosom. diacilglicerol drugi glasnik koji nastaje hidrolizom PIP2 te aktivira protein-kinazu C. Dictyostelium discoideum jednostani~ni eukariot koji se rabi za prou~avanje stani~noga kretanja i me|ustani~ne signalizacije. dideoksinukleotidi nukleotidi koji nemaju normalnu 3'-hidroksilnu skupinu deoksiriboze i koji se rabe za prekidanje sinteze lanca tijekom sekvenciranja DNA.
684
Pojmovnik
diferencijalna interferencijsko-kontrastna mikroskopija vrsta mikroskopije u kojoj se razlike u gusto}i ili debljini dijelova stanice pretvaraju u razlike u kontrastu kona~ne slike. diferencijalno centrifugiranje postupak kojim se razdvajaju dijelovi stanice na osnovi njihove veli~ine i gusto}e. dijakineza zavr{ni stadij profaze mejoze I, tijekom kojeg se kromosomi kona~no potpuno kondenziraju i stanica prelazi u metafazu. dinami~ka nestabilnost izmjenjivanje mikrotubula izme|u ciklusa njihova rasta i smanjenja. dinein proteinski motor koji se kre}e niz mikrotubule prema minus-kraju. diobeno vreteno sustav mikrotubula koji se pruàju od polova vretena; odgovoran je za razdvajanje sestrinskih kromosoma tijekom mitoze. V. i kinetohorni mikrotubuli, polarni mikrotubuli i astralni mikrotubuli. diploidan organizam ili stanica koja ima dvije kopije svakoga kromosoma. diploten razdoblje mejoze I tijekom kojeg se razdvajaju homologni kromosomi po duljini, ali ostaju povezani na mjestima kijazmi. distrofin citoskeletni protein mi{i}nih stanica. DNA-afinitetna kromatografija postupak kojim se izdvajaju proteini koji veù DNA na osnovi njihova svojstva vezanja na specifi~ne sljedove DNA. DNA-glikozilaza enzim popravka DNA koji kida vezu izme|u purina ili pirimidina i deoksiriboze u lancu molekule DNA. DNA-ligaza enzim koji sljepljuje prekide u lancima DNA. DNA-mikro~ip (engl. DNA microarray) staklena plo~a ili membranski filtar na koji su utisnuti nukleotidi ili odsje~ci DNA u gustom uzorku, omogu}uju}i tako istodobnu analizu tisu}a gena hibridizacijom odsje~aka DNA s fluorescentnim sondama. DNA-polimeraza enzim koji katalizira sintezu DNA. DNA-transpozoni prijenosni elementi koji se kre}u s pomo}u DNA-posrednika. dodir na inhibicija onemogu}ivanje kretanja ili umnoàvanja normalnih stanica do ~ega dolazi prilikom me|ustani~nog dodira. dolikol-fosfat lipidna molekula u endoplazmatskom retikulu na kojoj se sintetiziraju oligosaharidi kod glikozilacije proteina. domena cinkova prsta vrsta domene koja veè DNA; sastoji se od petlji s cisteinskim i histidinskim ostatcima koji veù cinkove ione. domene cjelovita globularna podru~ja koja su temeljne gradbene jedinice tercijarne strukture proteina. dominantan gen alel koji odre|uje fenotip organizma kad gen ima vi{e od jednog alela. dominantna inhibicijska mutacija mutacija koja remeti djelovanje normalnog alela.
dora|eni pseudogen pseudogen koji nastaje obrnutim prepisivanjem mRNA. Drosophila melanogaster vrsta vinske mu{ice koja se obi~no rabi za prou~avanje animalne genetike i razvoja. drugi glasnik tvar ~iji se metabolizam mijenja nakon reakcije receptora i liganda; djeluje kao prijenosnik signala time {to odre|uje druga unutarstani~na zbivanja. duga terminalna ponavljanja sljedovi DNA koji se nalaze na krajevima retrovirusne i retrotranspozonske DNA, a sastoje se od neposrednih ponavljanja nekoliko stotina nukleotida nastalih aktivno{}u reverzne-transkriptaze. E2F porodica ~imbenika transkripcije koji reguliraju ekspresiju gena uklju~enih u progresiju stani~noga ciklusa i umnaànje DNA. egzonukleaza enzim koji hidrolizira molekulu DNA po~ev{i od krajnjeg nukleotida u smjeru 5' prema 3' ili 3' prema 5'. eikozanoidi skupina lipida koji sudjeluju u autokrinoj i parakrinoj signalizaciji; uklju~uje prostaglandine, prostacikline, tromboksane i leukotriene. ekdison steroidni hormon kukaca koji pokre}e metamorfozu. ekscinukleaza proteinski kompleks koji izrezuje o{te}enu DNA u bakterijama tijekom popravka izrezivanjem. ekscizijski popravak v. popravak izrezivanjem. egzon dio gena koji sadràva kodiraju}i slijed nukleotida. eksportin receptor koji prepoznaje signal za izlaz iz jezgre i usmjeruje prijenos molekula iz jezgre u citosol. ekspresijski vektor vektor koji omogu}uje i regulira ekspresiju kloniranog dijela DNA u doma}inskoj stanici. ektoderm vanjski zametni listi} od kojeg nastaju tkiva poput koè i ìv~anoga sustava. elaioplasti plastidi koji sadràvaju masti. elasti~na vlakna proteinska vlakna koja se nalaze u izvanstani~noj tvari vezivnoga tkiva u organima koji se rasteù i potom ponovno vra}aju u izvorni oblik. elastin glavni sastojak elasti~nih vlakana. elektrokemijski gradijent razlika u koncentraciji iona i elektri~nom potencijalu kroz stani~nu membranu. elektronska mikroskopija vrsta mikroskopije koja za stvaranje slike rabi snop elektrona. U transmisijskoj elektronskoj mikroskopiji snop elektrona prolazi kroz uzorak obojen te{kim metalima. U pretra`noj (engl. scanning) elektronskoj mikroskopiji, analiziraju se elektroni koji se odbijaju od povr{ine i tako se dobiva trodimenzionalna slika. elektroporacija uvo|enje DNA u stanice njihovim izlaganjem kratkom elektri~nom pulsu. element nalik retrovirusu retrotranspozon koji je strukturno sli~an retrovirusu.
Pojmovnik
685
element serumskog odgovora (SRE) regulacijski slijed {to ga prepoznaje faktor serumskog odgovora i posreduje transkripcijsku pobudu mnogih neposredno-ranih gena kao odgovor na poticanje ~imbenikom rasta. Elk-1 transkripcijski ~imbenik koji se aktivira ERK-fosforilacijom i izaziva ekspresiju neposredno-ranih gena. elongacijski faktor protein uklju~en u elongacijsko razdoblje transkripcije ili translacije. embrionalne mati~ne stanice stanice uzgojene iz ranih zametaka. endocitoza uno{enje izvanstani~ne tvari u mjehuri}e koji nastaju od stani~ne membrane. endocitoza posredovana receptorom selektivno uzimanje makromolekula vezanih za receptore na stani~noj povr{ini; receptori se skupljaju u udubinama obloènim klatrinom. endocitoza teku}e faze neselektivno uzimanje izvanstani~ne teku}ine tijekom endocitoze. endoderm unutarnji zametni listi} od kojeg nastaju unutarnji organi. endokrina signalizacija vrsta me|ustani~ne signalizacije u kojoj endokrine stanice izlu~uju hormone koje krvotok odnosi do udaljenih ciljnih stanica. endoplazmatski retikul opse`na mreà cjev~ica i vre}ica obloènih membranom, koja sudjeluje u razvrstavanju i doradi proteina te sintezi masti. endorfin neuropeptid koji djeluje kao prirodni ublaìva~ boli (analgetik). endosimbioza simbioti~ki odnos u kojem manja stanica ìvi u ve}oj. endosom odjeljak stanice uklju~en u razvrstavanje i prijenos tvari unesenih endocitozom do lizosoma. energija aktivacije energija potrebna da molekula prije|e u prijelazno stanje potrebno za kemijsku reakciju. enkefalin neuropeptid koji djeluje kao prirodni ublaìva~ boli (analgetik). entaktin protein izvanstani~ne tvari koja se udruùje s lamininima i kolagenom tipa IV u bazalnoj lamini. enzim protein ili RNA koji katalizira biolo{ke reakcije. epider malne stanice stanice koje tvore za{titni sloj na povr{ini biljaka i ìvotinja. epidermalni faktor rasta (EGF) ~imbenik rasta koji poti~e umnaànje stanica. epitelne stanice stanice koje tvore slojeve (epitelno tkivo) {to oblaù tjelesnu povr{inu i unutarnje organe. Epstein-Bar rov virus humani herpes virus koji izaziva limfom limfocita B. erbA protoonkogen koji odre|uje receptor tireoidnoga hormona. erbB-2 protoonkogen koji odre|uje receptorski proteintirozin-kinazu, a koji je ~esto umnoèn u karcinomu dojke ili jajnika. eritrociti crvene krvne stanice. ERK ~lan porodice MAP-kinaza koji ima sredi{nju ulogu u stani~nom umnoàvanju potaknutom ~imbenikom rasta.
ERM-protein porodica proteina koji povezuju aktinska vlakna na membrani razli~itih vrsta stanica. Escherichia coli vrsta bakterije koja se rabi kao model u biokemiji i molekularnoj biologiji. estrogen steroidni hormon koji se sintetizira u jajnicima. etilen biljni hormon odgovoran za zrenje vo}a. etioplast me|ustadij razvoja kloroplasta u kojemu se ne sintetizira klorofil. eubakterije jedna od dviju glavnih skupina prokariota; uklju~uje najve}i broj {iroko rasprostranjenih bakterija. eukariotske stanice stanice koje imaju ovojnicu oko jezgre, citoplazmatske organele i citoskelet. eukromatin nekondenzirani, transkripcijski aktivni interfazni kromatin. fagocitoza stani~no uvla~enje velikih ~estica, primjerice bakterija. fagolizosom lizosom koji se stopio s fagosomom ili autofagosomom. fagosom vakuola koja sadràva ~estice preuzete fagocitozom. FAK (fokalna adhezijska kinaza) nereceptorska protein-tirozin-kinaza koja igra glavnu ulogu u signalizaciji integrinima. faktor tumorske nekroze (TNF, engl. tumor necrosis factor) polipeptidni ~imbenik rasta koji izaziva programiranu stani~nu smrt. faktor poticanja sazrijevanja (MPF, engl. maturation promoting factor) spoj Cdc2 i ciklina B koji poti~e ulazak stanice u M fazu mitoze ili mejoze. faktor serumskog odgovora (SRF, od engl. serum response factor) transkripcijski ~imbenik koji se veè na element serumskog odgovora. faktori (~imbenici) rasta polipeptidi koji upravljaju rastom i diferencijacijom animalnih stanica. faktori povezani s TBP (TAF, od engl. TBP-associated factors) polipeptidi povezani s TBP u op}em transkripcijskom ~imbeniku TFIID. faktori pregradnje nukleosoma proteini koji razgra|uju kromatin, omogu}uju}i transkripcijskim ~imbenicima vezanje na nukleosomnu DNA. faktori rasta usidreni u stani~noj membrani ~imbenici rasta povezani sa stani~nom membranom; djeluju kao signalne molekule tijekom me|ustani~nih dodira. faloidin lijek koji se veè na aktinska vlakna i sprje~ava njihovo razdvajanje. faza G0 mirno stani~no razdoblje u kome je stanica metaboli~ki aktivna, ali se ne umnoàva. faza G1 razdoblje stani~noga ciklusa izme|u kraja mitoze i po~etka sinteze DNA. faza G2 razdoblje stani~noga ciklusa od dovr{etka sinteze DNA (faza S) do po~etka mitoze. faza M razdoblje mitoze u stani~nom ciklusu. faza S razdoblje stani~noga ciklusa u kojemu se zbiva umnoàvanje DNA.
686
Pojmovnik
fazno-kontrastna mikroskopija vrsta mikroskopije u kojoj se razlike u debljini ili gusto}i dijelova stanica prevode u razlike u kontrastu u kona~noj slici. fenomen hoda u mjestu (engl. treadmilling) dinami~ko pona{anje aktinskih vlakana i mikrotubula u kojemu se gubitak podjedinica s jednog kraja vlakna uravnoteùje dodavanjem podjedinica na drugom kraju. fenotip tjelesni izgled nekog organizma. fibroblast vrsta stanice koju nalazimo u vezivnom tkivu. fibronektin glavni adhezijski protein me|ustani~ne tvari. fiksiranje du{ika (nitrofiksacija) redukcija atmosferskoga du{ika (N2) u NH3. filamin protein koja veè aktin i povezuje aktinska vlakna u mreè. filopodij tanki izdanak stani~ne membrane {to ga podràvaju aktinski snopovi. flavin-adenin-dinukleotid (FADH2) koenzim koji djeluje kao elektronski nosa~ u oksidacijsko/redukcijskim reakcijama. fluorescentna hibridizacija in situ (FISH) postupak kojim se odre|uje mjesto gena na kromosomu s pomo}u fluorescentno obiljeènih sondi. fluorescentna mikroskopija vrsta mikroskopije u kojoj se molekule otkrivaju pra}enjem emisije fluorescentnoga svjetla. fodrin neeritroidni spektrin. forbolni esteri vrsta tumorskih promotora koji poti~u proteinsku kinazu C tako da djeluju kao analozi diacilglicerola. Fos transkripcijski ~imbenik, odre|en protoonkogenom, koji se inducira kao odgovor na podraàj ~imbenikom rasta. fosfatidiletanolamin glicerolni fosfolipid s ~eonom skupinom napravljenom od etanolamina. fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfat (PIP3) drugi glasnik nastao fosforilacijom PIP2. fosfatidilinozitol-3-kinaza (PI-3-kinaza) enzim koji fosforilira PIP2, stvaraju}i fosfatidilinozitol 3,4,5-trifosfat (PIP3) koji djeluje kao drugi glasnik. fosfatidilinozitol-4,5-difosfat (PIP2) fosfolipid zastupljen u maloj koncentraciji na unutarnjoj strani stani~ne membrane. Hormoni i ~imbenici rasta poti~u njegovu hidrolizu fosfolipazom C, tako da nastaju drugi glasnici diacilglicerol i inozitol-trifosfat. fosfatidilkolin glicerolni fosfolipid s ~eonom skupinom napravljenom od kolina. fosfatidilserin glicerolni fosfolipid s ~eonom skupinom napravljenom od serina. fosfodiesterska veza veza izme|u 5'-fosfatne skupine na jednom nukleotidu i 3'-hidroksilne skupine na drugom. fosfolipaza C enzim koji hidrolizira PIP2 tako da nastaju drugi glasnici diacilglicerol i inozitol-trifosfat.
fosfolipidi temeljni sastojci stani~nih membrana; gra|eni su od dva ugljikovodi~na lanca (obi~no masne kiseline) povezana za polarnu skupinu koja sadràva fosfat. fosfolipidni dvosloj temeljna tvorba biolo{kih membrana, u kojima su hidrofobni repovi fosfolipida uronjeni u unutra{njost membrane, a njihove polarne skupine izloène su vodenoj otopini na jednoj ili drugoj strani membrane. fosforilacija dodavanje fosfatne skupine nekoj molekuli. fotoreaktivacija na~in popravka DNA u kome se Sun~eva energija rabi za razlaganje pirimidinskih dimera. fotosinteti~ki pigmenti molekule koje hvataju energiju Sun~evih zraka apsorbiraju}i protone. fotosinteza zbivanje u kojemu stanica rabi energiju Sun~evih zraka za sintezu glukoze iz CO2 i vode. fotosustav I proteinski kompleks u tilakoidnoj membrani koji rabi energiju apsorbiranu iz Sun~eva svjetla za sintezu NADPH. fotosustav II - proteinski kompleks u tilakoidnoj membrani koji rabi energiju apsorbiranu iz Sun~eva svjetla za sintezu ATP . gel-elektroforeza postupak u kojem se molekule razdvajaju na osnovi njihova kretanja u elektri~nom polju. gen dio DNA koji kodira polipeptidni lanac ili molekulu RNA. geneti~ki kod skup pravila koji odre|uje kako }e se slijed tripleta nukleotida u mRNA prevesti u slijed aminokiselina u proteinu. genomska knji`nica zbirka rekombinantnih klonova DNA koji zajedno sadràvaju genom jednog organizma. genomsko utiskivanje regulacija gena ~ija se ekspresija razlikuje ovisno o tome jesu li naslije|eni s maj~ine ili o~eve strane; vjerojatni mehanizam ove regulacije je metilacija DNA. genotip geneti~ki sastav nekog organizma. Gibbsova slobodna energija (G) termodinami~ka funkcija koja iz zdruènih u~inaka entalpije i entropije predvi|a energijski povoljan smjer kemijske reakcije. giberelin biljni hormon. glasni~ka RNA (mRNA) molekula RNA koja sadràva poruku za sintezu proteina. glatki endoplazmatski retikul glavno mjesto sinteze lipida u eukariotskim stanicama. glicerofosfolipidi fosfolipidi u kojima su dvije masne kiseline vezane na molekulu glicerola. glikogen polimer glukoze koji je osnovni skladi{ni oblik ugljikohidrata u ìvotinja. glikokaliks ugljikohidratni pokrov na povr{ini stanice. glikolipid lipid {to ga tvore dva lanca ugljikovodika vezana na polarnu skupinu sastavljenu od ugljikohidrata. glikoliza metaboli~ki put kojim se anaerobno razgra|uje glukoza. glikoprotein protein na koji su vezani oligosaharidi.
Pojmovnik
687
glikozaminoglikan (GAG) polisaharid me|ustani~ne tvari; tvori gel. glikozidna veza veza izme|u {e}ernih ostataka oligosaharida ili polisaharida. glikozilacija dodavanje ugljikohidrata na proteine. glikozilfosfatidilinozitolno (GPI) sidro glikolipid s fosfatidilinozitolom koji sidri protein na vanjski sloj stani~ne membrane. glioksilatni ciklus metaboli~ki put za pretvorbu masnih kiselina u ugljikohidrate kod biljaka. glioksisom peroksisom u kojem se odvijaju reakcije glioksilacije. globularni G aktin monomeri aktina koji se nisu udruìli u vlakna. glukokortikoid steroid {to ga proizvodi nadbubre`na `lijezda i koji poti~e proizvodnju glukoze. glukoneogeneza metaboli~ki put sinteze glukoze. Golgijeva cisterna (stog) odjeljci Golgijeva tjele{ca u kojemu se odvija ve}ina metaboli~kih zbivanja. Golgijevo tijelo citoplazmatski organel uklju~en u doradu i raspodjelu proteina i lipida. Kod biljnih stanica, to je ujedno mjesto sinteze polisaharida stani~ne stijenke. G-protein porodica proteina stani~ne signalizacije koji reguliraju vezanje gvaninskih nukleotida. granulociti krvne stanice uklju~ene u upalna zbivanja. gvanil-ciklaza enzim koji katalizira stvaranje cikli~koga GMP iz GTP . gvanin purin koji se sparuje s citozinom. haploidan organizam ili stanica koji imaju samo jednu kopiju svakoga kromosoma. helikaza enzim koji katalizira razmotavanje molekule DNA. hemiceluloza polisaharid koji umnoùje celulozne mikrofibrile u stijenci biljnih stanica. hemidezmosom podru~je spoja izme|u stanica i me|ustani~ne tvari u kojemu se keratinski filamenti veù na integrin. herpesvirus povezan s Kaposijevim sarkomom humani herpesvirus koji izaziva Kaposijev sarkom. herpesvirusi porodica DNA-virusa ~iji neki ~lanovi mogu izazvati rak. heterofilna interakcija interakcije izme|u dviju razli~itih vrsta stani~nih adhezijskih molekula. heterokromatin kondenzirani, transkripcijski inaktivni kromatin. heterotrimerni G-protein protein koji veè gvaninski nukleotid; sastoji se od tri podjedinice. hibridizacija in situ uporaba radioaktivnih ili fluorescentnih sondi za otkrivanje sljedova RNA ili DNA u ekstraktima stanica, na kromosomima ili u cijelim stanicama. hibridizacija nukleinskih kiselina stvaranje dvostrukih uzvojnica DNA i/ili RNA sparivanjem komplementarnih baza.
hidrofilan topljiv u vodi. hidrofoban netopljiv u vodi. hipoteza SNARE hipoteza da je stapanje vezikula posredovana parovima transmembranskih proteina (SNARE) na vezikulama i ciljnim membranama. histoni proteini koji pakiraju DNA u eukariotske kromosome. histonska acetilacija modifikacija histona dodavanjem acetilne skupine na pojedine lizinske ostatke. histonski kod kombinacija specifi~nih histonskih modifikacija za koje se drì da reguliraju transkripcijsku aktivnost kromatina. hitin polimer N-acetilglukozaminskih ostataka, glavni sastojak stani~ne stijenke gljiva, kukaca i ~lankono{aca. HMGN-proteini nehistonski kromosomski proteini zdruèni s razmotanim, transkripcijski aktivnim kromatinom. Hollidayev model molekularni model rekombinacije gena koji uklju~uje stvaranje regija heterodupleksa. Hollidayeva veza sredi{nji me|uspoj pri rekombinaciji kojeg ~ine ukrièni lanci nastali homolognim sparivanjem baza lanaca dvaju molekula DNA. homeodomene vrsta domena koje veù DNA, a nalazimo ih kod faktora transkripcije koji upravljaju ekspresijom gena tijekom embrionalnog razvoja. homeoslog o~uvani slijed DNA od 180 parova baza koji kodira homeodomene. homofilna interakcija interakcija izme|u dijelova DNA s homolognim nukleotidnim sljedovima. homologna rekombinacija rekombinacija izme|u dijelova DNA s homolognim slijedom nukleotida. hor moni signalne molekule koje nastaju u endokrinim `lijezdama i djeluju na udaljene stanice u tijelu. hrapavi endoplazmatski retikul dio endoplazmatskog retikula pokriven ribosomima; na njemu se odvija sinteza proteina. importin receptorski protein koja prepoznaje jezgrine lokalizacijske signale i upravlja ulaskom u jezgru. imunoblot postupak koji rabi protutijela za dokazivanje proteina razdvojenih elektroforezom u SDS-poliakrilamidnom gelu. imunoglobulin v. protutijelo. imunoglobulinska (Ig) superporodica porodica stani~nih adhezijskih molekula koje sadràvaju gradbene domene sli~ne imunoglobulinima. imunoprecipitacija uporaba protutijela za razdvajanje proteina. inaktivacija X-kromosoma kompenzacijski mehanizam u kojemu se ve}ina gena jednog X-kromosoma inaktivira u ènskim stanicama. inducirana prilagodba model enzimskog djelovanja u kojemu se vezanjem supstrata mijenja konfiguracija i enzima i supstrata.
688
Pojmovnik
inhibicija ovisna o gusto}i zaustavljanje umnoàvanja normalnih stanica u kulturi pri odre|enoj stani~noj gusto}i. inhibicija povratnom spregom vrsta alosteri~ke regulacije u kojoj krajnji proizvod metaboli~koga puta inhibira aktivnost enzima uklju~enih u svoju sintezu. inozitol-1,4,5,-trifosfat (IP3) drugi glasnik; nastaje hidrolizom PIP3 i signalizira osloba|anje iona kalcija iz endoplazmatskog retikula. integralni membranski proteini proteini uloèni u lipidni dvosloj stani~nih membrana. integrin transmembranski protein koji posreduje prianjanje stanica za me|ustani~ni matriks. interfaza razdoblje stani~nog ciklusa izme|u mitoza; uklju~uje faze G1, S i G2. intermedijarna vlakna citoskeletno vlakno promjera oko 10 nm koje daje mehani~ku ~vrsto}u stanicama u tkivima. V. i keratin i neurofilament. intron nekodiraju}i slijed umetnut izme|u egzona u genu. ionska crpka protein koji zdruùje hidrolizu ATP i prijenos iona preko stani~ne membrane. ionski kanal protein koji posreduje brzi prolazak iona kroz stani~nu membranu tako da stvara otvore u fosfolipidnom dvosloju. ishodi{te replikacije specifi~ni slijed DNA koji sluì kao vezno mjesto za proteine koji zapo~inju replikaciju. JAK/STAT-put signalni put u kome se aktiviraju transkripcijski ~imbenici STAT zbog fosforilacije ~lanova porodica JAK protein-kinaza. Janus-kinaza (JAK) porodica nereceptorskih protein-tirozin-kinaza povezanih s citokinskim receptorima. jezgra najve}a organela eukariotskih stanica; sadràva genski materijal. jezgrin izlazni signal aminokiselinski slijed koji obiljeàva proteine za prijenos iz jezgre u citoplazmu. jezgrin lokalizacijski signal aminokiselinski slijed koji obiljeàva proteine za prijenos iz citoplazme u jezgru. jezgrin omota~ omota~ koji odvaja jezgru od citoplazme; sastavljen je od unutarnje i vanjske membrane, jezgrine lamine i sustava jezgrinih pora. jezgrina lamina mreà laminskih vlakana koja daje gradbenu potporu jezgri. jezgrine membrane membrane koje tvore jezgrinu ovojnicu; vanjska se jezgrina membrana nastavlja na endoplazmatski retikul, a unutarnja se nalazi uz jezgrinu laminu. Jun transkripcijski ~imbenik {to ga odre|uje protoonkogen i koji se aktivira kao odgovor na poticanje ~imbenikom rasta. kadherini skupina stani~nih adhezijskih molekula koje tvore stabilne sveze izme|u stanica na mjestima pri~vrsnih spojeva i dezmosoma. kalmodulin protein koji veè kalcij. kalus nediferencirana nakupina biljnih stanica u kulturi.
kanal nadziran naponom ionski kanali koji se otvaraju kao odgovor na promjene elektri~noga potencijala. kanali nadzirani ligandom ionski kanali koji se otvaraju kao odgovor na vezanje signalne molekule. kanalni proteini proteini koji tvore otvore (pore) u membranama. karcinogen tvar koja izaziva rak. karcinom rak epitelnih stanica. kardiolipin fosfolipid s ~etiri ugljikovodi~na lanca. karioferin jezgrin transportni protein. kaspaze porodica proteaza koje izazivaju programiranu stani~nu smrt, apoptozu. katalaza enzim koji razgra|uje vodikov peroksid. kaveole mala udubljenja stani~ne membrane koja sudjeluju u endocitozi. kemiosmoti~ko zdruìvanje stvaranje ATP iz energije spremljene u protonski gradijent kroz unutra{nju membranu mitohondrija. keratin vrsta intermedijarnih vlaknastih proteina epitelnih stanica. kijazma mjesto rekombinacije koje povezuje homologne kromosome tijekom mejoze. kilobaza (kb) tisu}u nukleotida ili nukleotidnih parova baza. kinaza lakoga lanca miozina protein-kinaza koja aktivira miozin fosforilacijom njegova regulacijskoga lakoga lanca. kinetohora specijalizirana tvorba koja se sastoji od proteina pri~vr{}enih za centromera; posreduje prianjanje i gibanje kromosoma du` mitoti~koga vretena. kinetohorni mikrotubuli mikrotubuli diobenoga vretena koji se veù na centromeru kondenziranih kromosoma. kinezin proteinski motor koji se kre}e niz mikrotubule prema njihovu plus-kraju. klatrin protein koji oblaè citoplazmatsku povr{inu stani~ne membrane i slaè se u mreè nalik na ko{aru {to poti~e pupanje membranskih vezikula. klatrinom obloèna jaìca specijalizirano podru~je stani~ne membrane koje sadràva receptore za makromolekule koje }e u}i u endocitozu. klorofil glavni fotosinteti~ki pigment biljnih stanica. kloroplast organel odgovoran za fotosintezu u stanicama biljaka i zelenih algi. kodon temeljna jedinica geneti~koga koda, jedan od 64 tripleta nukleotida koji odre|uju aminokiselinu ili zaustavni slijed. koenzim A (CoA) koenzim koji sluì kao nosa~ acilnih skupina u metaboli~kim reakcijama. koenzim Q mala lipofilna molekula koja prenosi elektrone izme|u proteinskih kompleksa u mitohondrijskom transportnom lancu elektrona. koenzimi male organske molekule koje u kompleksu s enzimima kataliziraju biolo{ke reakcije.
Pojmovnik
689
kohezini sustav proteina koji odràvaju spoj izme|u sestrinskih kromatida. kolagen glavni gradbeni protein me|ustani~ne tvari. kolagena vlakna vlakna nastala udruìvanjem kolagenskih molekula u uzorak s pravilnim pomakom. kolcemid kemikalija koja inhibira polimerizaciju mikrotubula. kolenhim biljne stanice s debelom stani~nom stijenkom; daju gradbenu potporu biljkama. kolesterol lipid s ~etiri ugljikovodi~na prstena; glavni sastojak ìvotinjskih stani~nih membrana i prete~a u sintezi steroidnih hormona. kolhicin kemikalija koja inhibira polimerizaciju mikrotubula. kompleks ishodi{ta replikacije (ORC) sklop proteina koji zapo~inje umnaànje DNA u kvascu. kompleks jezgrine pore velika tvorba koja tvori prijenosne kanale kroz jezgrinu membranu. kompleks koji poti~e anafazu ubikvitin-ligaza koja zapo~inje prjelazak iz metafaze u anafazu signaliziraju}i razgradnju ciklina B i kohezina. komplementar na DNA (cDNA) molekula DNA koja je komplementarna nekoj molekuli mRNA; sintetizirana in vitro s pomo}u reverzne-transkriptaze. koneksin ~lan porodice transmembranskih proteina koji tvore premosnicu. konfokalna mikroskopija oblik mikroskopije u kojem se fluorescentna mikroskopija kombinira s elektroni~kom slikovnom ra{~lambom kako bi se dobile slike poja~anoga kontrasta i detalja. konstrukcijski proteini (engl. scaffold proteins) proteini koji se veù na dijelove signalnih puteva, organiziraju}i ih tako u specifi~ne signalne sklopove. kontrolne to~ke stani~noga ciklusa regulacijski mehanizmi koji sprje~avaju ulazak u sljede}e razdoblje stani~noga ciklusa dok se ne dovr{e zbivanja iz prethodnoga razdoblja. korektivna aktivnost (engl. proofreading) selektivno uklanjanje pogrje{no ugra|enih baza s pomo}u DNA-polimeraze. korepresor protein koja se udruùje s represorima u inhibiciji ekspresije gena, naj~e{}e tako da mijenja kromatinsku gra|u. kortikosteroidi steroidni hormoni koji nastaju u nadbubre`noj `lijezdi. kozmid vektor koji sadràva sljedove bakteriofaga l, sljedove otpornosti na antibiotike i ishodi{te replikacije. U njega se moè smjestiti umetak DNA veli~ine do 45 kb. Krebsov ciklus v. ciklus limunske kiseline. krista nabor u unutra{njoj mitohondrijskoj membrani koji se pruà u unutra{njost mitohondrija. kromatin sustav eukariotske DNA i histonskih proteina. V. histon, nukleosom i kromatosom.
kromatosom kromatinska podjedinica od 166 parova baza DNA ovijenih oko histonske jezgre i u~vr{}enih veznim histonom. kromoplast plastid koji sadràva karotenoide. kromosomi nosa~i gena, sastoje se od duga~kih molekula DNA i pridruènih proteina. kru`ni elektronski tok put prijenosa elektrona zdruèn s fotosustavom I koji proizvodi ATP bez sinteze NADPH. kva{~ev umjetni kromosom (YAC, engl. yeast articifial chromosome) vektor koji se moè umnaàti kao kromosom u stanicama kvasca i koji moè sadràvati velike ulomke DNA (tisu}e kb). kvarterna gra|a prostorna gra|a (struktura) proteina koja se sastoji od vi{e polipeptida. kvasci najjednostavniji eukarioti; va`ni su modeli u prou~avanju eukariotskih stanica. lamelipodij {iroki izdanak stani~ne membrane s aktinskom osnovom koji se pojavljuje prigodom stani~noga pokretanja fibroblasta. lamini intermedijarni vlaknasti proteini koji stvaraju jezgrenu laminu. laminin glavni adhezijski protein bazalne lamine. lan~ana reakcija polimeraze (PCR) postupak umnaànja dijela molekule DNA ponavljanjem ciklusa sinteze DNA in vitro. leptoten po~etno razdoblje produljene profaze mejoze I tijekom kojeg se sparuju homologni kromosomi prije kondenzacije. leucinski zatvara~ dimerizacijsko podru~je (domena) proteina koje sadràva opetovane leucinske ostatke; nalazi se u mnogim transkripcijskim ~imbenicima. leukemija rak koji nastaje od prete~a cirkuliraju}ih bijelih krvnih stanica. leukoplast plastid koji sprema energijske izvore u nefotosinteti~nim biljnim tkivima. leukotrien eikozanoid koji se sintetizira iz arahidonske kiseline. ligand molekula koja se veè na receptor. lignin polimer fenolnih ostataka koji u~vr{}uje sekundarnu stani~nu stijenku. limfocit krvna stanica koja sudjeluje u imunolo{kom odgovoru. Limfociti B stvaraju protutijela, a limfociti T odgovorni su za imunost posredovanu stanicama. limfom rak limfoidnih stanica. LINE dugi raspr{eni elementi (engl. long interspersed elements) porodica ponavljaju}ih retrotranspozona u genomima sisavaca. lipidi hidrofobne molekule koje sluè kao zaliha energije, signalne molekule i glavni sastojci stani~nih membrana. lipoprotein male gusto}e (LDL) lipoproteinska ~estica koja prenosi kolesterol u krvni optjecaj. liposom lipidna vezikula kojom se DNA moè uvesti u stanice sisavaca.
690
Pojmovnik
lizogenija virusna zaraza koja dovodi do uklapanja inaktivne kopije virusne DNA u stani~ni genom. lizosom citoplazmatska organela koja sadràva enzime koji razgra|uju biolo{ke polimere. majmunski (simijski) virus 40 (SV40) dobro prou~eni tumorski DNA-virus. makrofag vrsta bijele krvne stanice sa sposobno{}u fagocitoze. makropinocitoza uzimanje teku}ine u velike vezikule. male jezgrene ribonukleoproteinske ~estice (snRNP, od engl. small nuclear ribonucleoprotein particles) kompleksi snRNA i proteina. male jezgrene RNA (snRNA, od engl. small nuclear RNAs) jezgrene RNA veli~ine 50 do 200 baza. mali proteini koji veù GTP velika porodica monomernih proteina koje veù GTP uklju~uju}i proteine Ras, , Rab, Rho i Ran. MAP-kinaza porodica protein-serin/treonin-kinaza koje aktiviraju mitogeni; sveprisutni su regulatori stani~noga rasta i razvoja. masne kiseline dugi ugljikovodi~ni lanci obi~no vezani na karboksilnu skupinu. masti v. triacilgliceroli. mati~na stanica stanica koja se (trajno) dijeli na stanice koje mogu diferencirati ili ostati mati~ne stanice. matriks unutarnji mitohondrijski prostor. matriksna-procesiraju}a-peptidaza (MPP) proteaza koja uklanja pre-sljedove proteina unesenih u mitohondrijski matriks. me|ustani~ni matriks izlu~eni proteini i polisaharidi koji ispunjaju prostor izme|u stanica i povezuju stanice i tkiva. mediator proteinski kompleks koji omogu}uje eukariotskim genima da reagiraju na regulatore specifi~ne za pojedine gene. megabaza (Mb) milijun nukleotida ili nukleotidnih parova baza. mejoza dioba diploidnih stanica na haploidne potomke; sastoji se od dvaju uzastopnih ciklusa jezgrine i stani~ne diobe. meki keratin keratin u citoplazmi epitelnih stanica. metafaza razdoblje mitoze tijekom kojega se kromosomi slaù u metafaznu plo~u u sredini stanice. metastaza {irenje tumorskih stanica krvlju ili limfom u druge organe. metoda stezaljke istaknute povr{ine (engl. patch-clamp technique) postupak kojim se izdvaja i prou~ava aktivnost pojedina~nih ionskih kanala. mezoderm srednji zametni listi}; od njega nastaje vezivno tkivo i krvne stanice. mikro{iljak (engl. microspike) v. filopodij. mikrofilament (vlakance) citoskeletno vlakno sastavljeno od aktina.
mikroskopija svijetlog polja najjednostavniji oblik svjetlosne mikroskopije u kojoj svjetlo neposredno prolazi kroz stanicu. mikrosom vezikula endoplazmatskog retikula nakon raspada stanice. mikrotubul dio citoskeleta koja nastaje polimerizacijom tubulina u ~vrste {uplje {tapi}aste tvorbe promjera oko 25 nm. mineralokortikoidi steroidni hormoni koje proizvodi nadbubre`na `lijezda i koje djeluju na bubrege odre|uju}i ravnoteù soli i vode. miofibril snop aktinskih i miozinskih vlakana u mi{i}noj stanici. miozin protein koji zajedno s aktinom tvori molekularni motor. miozin I vrsta miozina koji prenosi teret niz aktinska vlakna. miozin II vrsta miozina koji proizvodi stezanje klizanjem aktinskih vlakana. mi{i}na vlakna velike stanice skeletnih mi{i}a koje nastaju stapanjem ve}eg broja pojedina~nih stanica tijekom razvoja. mitohondrij citoplazmatska organela odgovorna za sintezu najve}eg dijela ATP oksidativnom fosforilacijom u eukariotskim stanicama. mitoza dioba jezgre. mjesno-specifi~na rekombinacija rekombinacija posredovana proteinima koji prepoznaju specifi~ne sljedove DNA. model kliznoga vlakna model mi{i}ne kontrakcije u kojoj se stezanje zbiva kao posljedica klizanja aktinskih i miozinskih vlakana u odnosu jednih prema drugima. model klju~a i brave model enzimske akcije gdje supstrat to~no odgovara aktivnom mjestu enzima. model teku}ega mozaika model gra|e stani~ne membrane u kojem su proteini uronjeni u teku}i fosfolipidni dvosloj. molekularni klon v. rekombinantna molekula. molekularni motor protein koji stvara snagu i pokret pretvorbom kemijske u mehani~ku energiju. molekularno kloniranje umetanje èljenog DNA-ulomka u molekulu DNA (vektor) koji se moè neovisno umnaàti u doma}inskoj stanici. monocistronska mRNA glasni~ka RNA koja kodira jedan polipeptidni lanac. monocit vrsta krvne stanice koja sudjeluje u upalnim reakcijama. monoklonsko protutijelo protutijelo koje proizvodi jedan klon (potomci jedne stanice) limfocita B. monosaharid jednostavan {e}er s temeljnom formulom (CH2O)n. Mos protein-kinaza nu`na za prijelazak iz mejoze I u mejozu II te odràvanje zastoja metafaze II u jajnim stanicama kralje`njaka.
Pojmovnik
691
multifotonska ekscitacijska mikroskopija vrsta fluorescentne mikroskopije u kojoj se uzorak osvjetljava svjetlom takve valne duljine da pobu|ivanje fluorescentne boje zahtijeva istodobnu apsorpciju dvaju ili vi{e fotona. mutacija promjena gena. mutagen kemikalija koja izaziva mutacije. mutageneza in vitro in vitro uvo|enje mutacija u kloniranu DNA. mutanta osjetljiva na temperaturu stanica koja eksprimira protein koji je aktivan samo na jednoj temperaturi od dviju na kojima je aktivan normalni protein. Na+-K+-ATPaza v. Na+-K+ crpka. Na+-K+-crpka ionska crpka koja prenosi Na+ izvan stanice a K+ u stanicu. NADP-reduktaza enzim koji prenosi elektrone s ferodoksina na NADP+, daju}i NADPH. nebulin protein koji odre|uje duljinu aktinskih vlakana u mi{i}nim stanicama. neksin protein koji me|usobno povezuje parove mikrotubula u aksonemi. neposredno-rani geni porodica gena ~ija se transkripcija brzo inducira kao odgovor na poticanje faktorom rasta. nereceptorska protein-tirozin-kinaza unutarstani~na protein-tirozin-kinaza. Nernstova jednad`ba jednad`ba koja definira odnos izme|u koncentracije iona i membranskog potencijala. nesmislenim-posredovana razgradnja mRNA mehanizam razgradnje mRNA kojima nedostaje potpuni okvir otvorenog ~itanja. neuralni faktor rasta (NGF) polipeptidni ~imbenik rasta koji odre|uje razvoj i preìvljenje neurona. neurofilament vrsta intermedijarnoga vlakna koje podràva aksone ìv~anih stanica. neurofilamentni (NF) proteini glavni intermedijarni vlaknasti proteini u mnogim vrstama zrelih ìv~anih stanica. neurohormoni peptidi koje lu~e neuroni i koji djeluju na udaljene stanice. neuron ìv~ana stanica specijalizirana za primanje i prijenos signala u tijelu. neuropeptidi peptidne signalne molekule koje lu~e neuroni. neurotransmitor mala hidrofilna molekula koja na sinapsi prenosi signal izme|u podraènoga neurona i ciljne stanice. neurotrofin ~lan porodice polipeptida koji odre|uju razvoj i preìvljenje neurona. nidogen v. entaktin. nikotinamid-adenin dinukleotid (NAD+) koenzim koji djeluje kao nosa~ elektrona u oksidacijsko/ redukcijskim reakcijama.
N-miristilacija dodavanje miristinske kiseline (masna kiselina s 14 ugljikovih atoma) N-terminalnom glicinskom ostatku polipeptidnog lanca. N-myc protoonkogen koji odre|uje transkripcijski faktor i koji se ~esto aktivira umnaànjem u neuroblastomima. Norther n-blot postupak u kome se mRNA razdvajaju elektroforezom u gelu i prikazuju vezanjem specifi~nih sondi. nukleolar na organizacijska regija dio kromosoma u kojem se nalaze geni za ribosomske RNA. nukleolus (jezgrica) jezgrino mjesto transkripcije rRNA, dorade i sklapanja ribosoma. nukleosom temeljna gradbena jedinica kromatina; sastoji se od DNA ovijene oko histonske jezgre. nukleosomne sr`ne ~estice ~estice s 146 parova baza DNA omotane oko oktamera od po dvije molekule histona H2A, H2B, H3 i H4. nukleotid fosforilirani nukleozid. nukleozid purinska ili pirimidinska baza vezana na {e}er (ribozu ili deoksiribozu). obrnuta genetika analiza funkcije gena uno{enjem mutacija u klonirani gen. Okazakijevi fragmenti kratki ulomci DNA koji se udruùju u zaostaju}i lanac DNA. oksidativna fosforilacija proces sinteze ATP iz ADP koji kao izvor energije koristi energijski povoljan prijenos elektrona s reduciranih nukleotidnih koenzima na molekularni kisik. oksidativni metabolizam uporaba molekularnog kisika kao primatelja elektrona u razgradnji organskih molekula. olak{ana difuzija prijenos molekula kroz stani~nu membranu s pomo}u nosa~a ili kanalnih proteina. oligonukleotid kratki polimer od nekoliko nukleotida. oligosaharid kratki polimer nekoliko {e}era. onkogen gen koji moè izazvati jedno ili vi{e obilje`ja tumorske stanice. op}a homologna rekombinacija razmjena dijelova izme|u dviju molekula DNA s velikom homologijom (podudarno{}u) slijeda baza. operator regulacijski slijed DNA koji regulira transkripciju operona. operon skupina susjednih gena koja se prepisuje kao jedinstvena mRNA. otvoreni okvir ~itanja dio nukleotidnoga slijeda koji ne sadràva stop-kodone i koji moè odre|ivati polipeptid. P1-umjetni kromosom (PAC) vektor koji se rabi za kloniranje velikih fragmenata DNA u E. coli. p53 transkripcijski ~imbenik kodiran genom tumorskog inhibitora p53; zaustavlja stani~ni ciklus u fazi G1 kao odgovor na o{te}enje DNA, te je nuàn za apoptozu izazvanu razli~itim signalima.
692
Pojmovnik
pahiten razdoblje mejoze I tijekom kojeg se odvija rekombinacija izme|u homolognih kromosoma. palmitoilacija dodavanje palmitinske kiseline (masna kiselina sa 16 ugljikovih atoma) na cisteinske ostatke polipeptidnog lanca. papiloma-virus ~lan porodice DNA-virusa, od kojih neki uzrokuju karcinom cerviksa i drugih anogenitalnih tvorbi u ljudi. parakrina signalizacija lokalna me|ustani~na signalizacija u kojoj molekula koju otpu{ta jedna stanica djeluje na susjednu ciljnu stanicu. parenhimska stanica vrsta biljne stanice odgovorne za ve}inu metaboli~kih aktivnosti. pasivna difuzija difuzija malih hidrofobnih molekula kroz fosfolipidni dvosloj. pasivni prijenos prijenos molekula kroz stani~nu membranu niz koncentracijski gradijent. pektin polisaharid iz biljnih stani~nih stijenki; ima sposobnost stvaranja gela. peptidil-prolil-izomeraza enzim koji olak{ava smatanje proteina tako da katalizira cis-trans izomerizaciju peptidne veze izme|u prolina i neke druge aminokiseline. peptidna veza tip kemijske veze kojom su povezane aminokiseline u polipeptidnom lancu. peptidni hormon signalna molekula sastavljena od aminokiselina. peptidoglikan glavni sastojak bakterijske stani~ne stijenke; sastoji se od linearnih polisaharidnih lanaca ukrièno povezanih kratkim peptidima. pericentriolna tvar tvar u centrosomu koja otpo~inje slaganje mikrotubula. periferni membranski proteini proteini povezani sa stani~nom membranom s pomo}u nekovalentnih interakcija s membranskim proteinima ili lipidima. peroksisom citoplazmatski organel specijaliziran za oksidacijske reakcije. pinocitoza uvla~enje teku}ine ili molekula u stanicu s pomo}u stani~nih vezikula. pirimidinski dimer uobi~ajeni oblik o{te}enja DNA ultraljubi~astim svjetlom, u kojem dolazi do kovalentnog povezivanja dvaju susjednih pirimidina. plastidi porodica biljnih organela, uklju~uju}i kloroplaste, kromoplaste, leukoplaste, amiloplaste i elaioplaste. plazmalogeni porodica fosfolipida koji imaju jednu etersku i jednu estersku vezu. plazmid mala kru`na molekula DNA koja se moè samostalno umnoàvati u doma}inskoj stanici. plazmodezma citoplazmatski spoj izme|u susjednih biljnih stanica, stvoren podru~jem stani~nih membrana koje prelaze jedna u drugu. PML/RARa onkogen koji nastaje translokacijom receptora retinoi~ne kiseline u akutnoj promijelocitnoj leukemiji. poja~iva~ slijed nukleotida koji regulira transkripciju, a nalazi se na mjestu udaljenom od promotora.
pokretni element v. transpozon. polar ni mikrotubuli mikrotubuli diobenoga vretena koji se preklapaju u sredini stanice i razmi~u polove vretena. polarno tijelo mala stanica koja nastaje asimetri~nom diobom nakon mejoze jajne stanice. poli-A kraj (rep) slijed od oko 200 adeninskih nukleotida koji se dodaje na 3' kraj eukariotskih mRNA. poliadenilacija dodavanje poli-A kraja na pre-mRNA. policistronska mRNA glasni~ka RNA koja kodira vi{e polipeptidnih lanaca. polinukleotid polimer koji sadràva i do nekoliko milijuna nukleotida. polioma-virus dobro prou~en tumorski DNA-virus. polip dobro}udni tumor koji se izbo~uje s epitelne povr{ine. polipeptid polimer aminokiselina. polisaharid polimer koji sadrì stotine ili tisu}e molekula {e}era. polisom niz ribosoma koji prevode glasni~ku RNA. politenski kromosom divovski kromosom koji se nalazi u nekim tkivima drozofile, a nastaje ponavljanim umnaànjima lanaca DNA koji se ne odvoje jedan od drugoga. ponavljanja jednostavnoga slijeda (engl. simple-sequence repeats) vrsta ponavljaju}ih sljedova DNA koji se sastoje od tisu}a tandemskih kopija kratkih sljedova. popravak izrezivanjem nukleotida na~in popravka DNA u kojemu se oligonukleotidi s o{te}enim bazama uklanjaju iz molekule DNA. popravak krivo sparenih baza sustav popravka DNA kojim se iz novosintetizirane DNA uklanjaju nepodudarne baze. popravak sklon pogrje{kama oblik popravka u kojem posebne DNA-polimeraze repliciraju DNA preko mjesta o{te}enja. popravak udruèn s transkripcijom mehanizam koji popravlja o{te}enja DNA poglavito u onoj niti koja se prepisuje. poreme}aj odlaganja u lizosomima skupina poreme}aja koje obiljeùje nakupljanje nerazgra|ene tvari u lizosomima bolesnih osoba. porin ~lan vrste proteina koji prolaze kroz membrane kao b-ba~ve i tvore kanale u vanjskoj membrani nekih bakterija, mitohondrija i kloroplasta. porodica gena skupina srodnih gena koji su nastali udvajanjem zajedni~koga pretka. prekrajanje (engl. splicing) povezivanje egzona u molekuli pre-RNA. premosnica kanal stani~ne membrane koji tvori neposredan citoplazmatski spoj dviju susjednih stanica. pre-mRNA primarni prijepis koji se obra|uje do glasni~ke RNA u eukariotskim stanicama.
Pojmovnik
693
prenilacija dodavanje specifi~nih vrsta lipida (prenilnih skupina) na C-terminalne cisteinske ostatke polipeptidnih lanaca. pre-rRNA primarni prijepis koji se razlaè u pojedina~ne ribosomske podjedinice, 28S, 18S i 5,8S rRNA u eukariotskim stanicama. pretra`na elektronska mikroskopija (engl. scanning electron micriscopy) v. elektronska mikroskopija. pre-tRNA primarni prijepis (transkript) koji se razlaè u transportnu RNA. pri~vrsni spoj (engl. adherens junction) podru~je spoja dviju stanica u kojemu je aktinski citoskelet usidren u stani~nu membranu. prijelazni endoplazmatski retikul dio endoplazmatskog retikula iz kojeg proteini odlaze prema Golgijevu tijelu. prijelazno stanje visokoenergetsko stanje kroz koje mora pro}i supstrat tijekom enzimske reakcije. prijenos gena uno{enje strane DNA u stanicu. primarna kultura stani~na kultura uspostavljena iz nekog tkiva. primar na stani~na stijenka stijenka rastu}ih biljnih stanica. primarna struktura proteina slijed aminokiselina u polipeptidnom lancu. primaza RNA-polimeraza koja po~inje sintezu DNA. produkt spoj nastao kemijskom reakcijom. profaza po~etno razdoblje mitoze koje obiljeùje pojava kondenziranih kromosoma i nastanak diobenoga vretena. profilin protein koja se veè na aktin i poti~e udruìvanje aktinskih monomera u vlakna. progesteron steroidni hormon koji proizvode jajnici. programirana stani~na smrt (apoptoza) normalni fiziolo{ki oblik stani~ne smrti {to ga obiljeùje apoptoza. prokariotska stanica stanica koja nema jezgrenu membranu, citoplazmatske organele i citoskelet (primjer su bakterije). prokolageni topljive prete~e kolagena koji stvaraju kolagena vlakna. prolazna ekspresija ekspresija neintegrirane plazmidne DNA koja je unesena u stanice u kulturi. prometafaza prijelazno razdoblje izme|u profaze i metafaze, tijekom kojega se mikrotubuli diobenoga vretena pri~vr{}uju za kinetohore a kromosomi izmije{aju prije postrojavanja u stani~nom sredi{tu. promotor slijed DNA za koji se veè RNA-polimeraza kako bi zapo~ela prepisivanje. pronukleusi dvije haploidne jezgre u upravo oplo|enoj jajnoj stanici. prostaciklin eikozanoid koji nastaje iz prostaglandina H2. prostaglandin porodica eikozanoidnih lipida koji su uklju~eni u posredovanje upale. prosteti~ke skupine male molekule vezane na proteine.
proteasom veliki proteinski sustav koji razgra|uje proteine obiljeène ubikvitinom. protein koji se veè na TATA-slog (TBP, engl. TATA-binding protein) temeljni transkripcijski ~imbenik koji se veè neposredno na TATA-slog. protein prijenosnik fosfolipida protein koji prenosi molekule fosfolipida izme|u stani~nih membrana. protein-fosfataza enzim koji djeluje suprotno od protein-kinaza tako da uklanja fosfatne skupine s fosforiliranih aminokiselinskih ostataka. proteini polipeptidi jedinstvenoga, to~no odre|enoga slijeda aminokiselina. proteini koji veù aktin proteini koji veù aktin i reguliraju zdruìvanje, razdruìvanje i ustroj aktinskih vlakana. proteini koji aktiviraju GTPazu proteini koje poti~u hidrolizu GTP malim proteinima koji veù GTP . proteini koji usnopljuju aktin (engl. acting-bundling proteins) proteini koji povezuju aktinska vlakna u snopove. proteini koji veù jednolan~anu DNA proteini koji stabiliziraju razmotanu DNA veù}i se na jednolan~ana podru~ja. proteini-nosa~i proteini koji selektivno veù i prenose male molekule. proteini toplinskoga {oka dobro o~uvana skupina ure|iva~kih proteina ({aperona) eksprimiranih u stanicama koje su izloène visokim temperaturama ili drugim oblicima stresa iz okoli{a. proteini vezani uz mikrotubule (MAP, od engl. microtubule-associated proteins) proteini koji se veù na mikrotubule i mijenjaju njihovu stabilnost. protein-kinaza enzim koji fosforilira proteine prijenosom fosfatne skupine s ATP . protein-kinaza A protein-kinaza koju regulira cikli~ki AMP . protein-kinaza C porodica protein-serin/treonin-kinaza koje aktivira diacilglicerol i Ca2+ i koje sudjeluju u unutarstani~nom prijenosu signala. protein-kinaza ovisna o cAMP (engl. cAMP-dependent protein kinase) v. protein-kinaza A. protein-serin/treonin-kinaza protein-kinaza koja fosforilira serinske i treoninske ostatke. protein-disulfid-izomeraza enzim koji katalizira stvaranje i razgradnju disulfidnih (S-S) veza. protein-tirozin-fosfataza enzim koji uklanja fosfatne skupine s fosfotirozinskih ostataka. protein-tirozin-kinaza protein-kinaza koja fosforilira tirozinske ostatke. proteoglikan protein na koji su vezani glikozaminoglikani. proteoliza razgradnja polipeptidnih lanaca. proto~na citometrija postupak koji mjeri jakost fluorescencije pojedina~nih stanica (koje teku u nizu).
694
Pojmovnik
protoonkogen normalan stani~ni gen koji moè prije}i u onkogen. protusmislena nukleinska kiselina (engl. antisense nucleic acid) nukleinska kiselina (RNA ili DNA) komplementarna nekoj molekuli mRNA koja se rabi za blokiranje ekspresije toga gena. protutijelo protein koji izlu~uju limfociti B i koji prepoznaje strane molekule (antigene). pseudogen nefunkcionalna kopija gena u genomu. pseudopodij izdanak stani~ne membrane s aktinskom osnovom koji je odgovoran za fagocitozu i ameboidno gibanje. PTB-podru~je (PTB-domena) proteinsko podru~je koje veè peptide s fosfotirozinom. PTEN lipidna fosfataza koja defosforilira PIP3 i djeluje kao tumorski supresor. Rab porodica malih protein koji se veù na GTP i imaju va`nu ulogu u vezikularnom prijenosu. Rac mali protein koji se veè na GTP i sudjeluje u regulaciji aktinskoga citoskeleta. Raf protein-serin/treonin-kinaza koju kodira onkogen raf i koju aktivira Ras, a u kona~nici aktivira MAP-kinazu. rajonidinski receptori kalcijski kanali u mi{i}nim i ìv~anim stanicama koji se otvaraju kao odgovor na promjene membranskoga potencijala. rak zlo}udni tumor. Ran mali protein koji veè GTP a sudjeluje u prijenosu u , jezgru i iz jezgre. Ras porodica malih proteina koji veù GTP a koje kodi, ra onkogen ras; zdruùju receptore za faktore rasta s unutarstani~nim ciljnim molekulama kao {to su signalizacijski put Raf protein-serin/treonin-kinaze i MAP-kinaze. ravnote`no centrifugiranje razdvajanje ~estica na temelju njihove gusto}e centrifugiranjem do ravnoteè u gradijentu gusto}e. razdvaja~ stanica aktiviran fluorescencijom (FACS) stroj koji razdvaja pojedina~ne stanice na temelju njihove fluorescencije. razlu~ivanje mogu}nost mikroskopa da razazna tvorbe na maloj udaljenosti. razvojni slijed slijed DNA izme|u gena. Rb transkripcijski regulacijski protein {to ga kodira gen supresor tumora, otkriven geneti~kom analizom retinoblastoma. reakcije na svjetlu reakcija fotosinteze u kojoj Sun~eva energija omogu}uje sintezu ATP i NADPH. reakcije u tami slijed reakcija koje prevode ugljikov dioksid i vodu u ugljikovodike tijekom fotosinteze. V. Calvinov ciklus. RecA protein koji poti~e izmjenu lanaca izme|u homolognih molekula DNA tijekom rekombinacije. receptor zdruèn s G-proteinima receptor sa sedam a-uzvojnica koje prolaze kroz stani~nu membranu. Vezanje liganda uzrokuje konformacijsku promjenu koja aktivira G-proteine.
receptorska protein-tirozin-kinaza protein-tirozin-kinaza koja prolazi kroz cijelu stani~nu membranu i sluì kao receptor za izvanstani~ne ligande. recesivan alel alel {to ga nadvladava dominantni alel. regulacijsko smanjenje broja receptora (engl. receptor downregulation) nestanak receptora sa stani~ne povr{ine zbog njihove internalizacije endocitozom nakon vezanja liganda. rekombinacija razmjena genske tvari. rekombinacijski popravak popravak o{te}ene DNA rekombinacijom s neo{te}enim homolognim molekulama DNA. rekombinantna knji`nica DNA zbirka genomskih ili cDNA klonova. rekombinantna molekula DNA molekula DNA promijenjenoga slijeda, primjerice vektor s uloènim stranim genom. rentgenska kristalografija postupak u kojem se difrakcijskim uzorkom rentgenskih zraka odre|uje prostorni raspored atoma u molekuli. replikacijske ra{lje podru~je sinteze DNA gdje se roditeljske niti DNA razdvajaju, a dvije nove niti DNA sintetiziraju. represor regulacijska molekula koja zaustavlja prepisivanje DNA. reproduktivno kloniranje uporaba nuklearnoga prijenosa za stvaranje kloniranih organizama. resica izdanak stani~ne membrane podbo~en aktinom; ima ih mnogo na povr{ini stanica koje su uklju~ene u resorpciju. restrikcijska endonukleaza enzim koji kida DNA na specifi~nom mjestu. restrikcijska karta karta poloàja mjesta kidanja molekule DNA restrikcijskom endonukleazom. restrikcijska to~ka regulacijska to~ka u animalnom stani~nom ciklusu koja se zbiva kasno u fazi G1; nakon te to~ke stanica je usmjerena na ulazak u fazu S i diobeni ciklus. retinoi~na kiselina signalna molekula koja nastaje iz vitamina A. retinoid molekula srodna retinoi~noj kiselini. retrotranspozon pokretni (transpozabilni) element koji se premje{ta reverznom transkripcijom RNA-posrednika. retrovirus virus koji se umnoàva stvaraju}i DNA kopiju svojega RNA-genoma putem obrnutoga prepisivanja. reverzna transkripcija sinteza DNA na osnovi RNA-kalupa. reverzna transkriptaza DNA-polimeraza koja rabi molekulu RNA kao kalup za sintezu DNA. ribonukleinska kiselina (RNA) polimer ribonukleotida. ribosomi ~estice sastavljene od RNA i proteina, sluè kao mjesta sinteze proteina. ribosomna RNA (rRNA) ribonukleinski dio ribosoma.
Pojmovnik
695
riboza {e}er s pet atoma ugljika u RNA. ribozim RNA-enzim. RNA-interferencija (RNAi) degradacija mRNA kratkim komplementarnim molekulama RNA. RNA-polimeraze enzimi koji kataliziraju sintezu RNA. RNaza H enzim koji razgra|uje lance RNA u RNA-DNA hibridnim molekulama. RNaza P ribozim koji kida 5' kraj pre-tRNA. RNA-ure|ivanje zbivanja dorade RNA (osim prekrajanja) koja mijenjaju slijed nukleotida u kodiraju}oj regiji mRNA. rodopsin fotoreceptor vezan uz G-protein u {tapi}ima mre`nice; aktivira transducin kao odgovor na apsorpciju svjetla. Rousov sarkomski virus (RSV) akutni transformiraju}i virus u kojem je otkriven prvi onkogen. Saccharomyces cerevisiae ~esto prou~avani pupaju}i kvasac. samoprekrajanje sposobnost nekih RNA da kataliziraju uklanjanje vlastitih introna. sarkom zlo}udni tumor vezivnoga tkiva. sarkomera kontraktilna jedinica mi{i}ne stanice, sastavljena od miozinskih i aktinskih vlakana. sarkoplazmatski retikul specijalizirana mreà membrana u mi{i}nim stanicama; pohranjuje visoku koncentraciju Ca2+. satelitna DNA ponavljaju}a DNA jednostavnog slijeda; gusto}a joj se razlikuje od ostalog dijela genomske DNA. SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza (SDS-PAGE) uobi~ajeni postupak razdvajanja proteina elektroforezom u gelu prema razlici u veli~ini molekule. sekrecijski put kretanje izlu~enih proteina iz endoplazmatskog retikula u Golgijevo tijelo, te potom sekretornim vezikulama do stani~ne povr{ine. sekretorne vezikule vre}ice okruène membranom koje prenose proteine s Golgijeva tijela na stani~nu povr{inu. sekundar na stani~na stijenka debela stani~na stijenka izme|u stani~ne membrane i primarne stani~ne stijenke biljnih stanica koje su prestale rasti. sekundarna struktura prostorna organizacija aminokiselina unutar pojedinih dijelova polipeptidnoga lanca. V. a-uzvojnica i b-nabrana plo~a. selektini stani~ne adhezijske molekule koje prepoznaju oligosaharide na stani~noj povr{ini. semikonzer vativna replikacija replikacija DNA u kojoj se dva roditeljska lanca odvajaju i sluè kao kalupi za sintezu novih lanaca. sfingomijelin fosfolipid koji se sastoji od dva ugljikovodi~na lanca vezana na ~eonu skupinu koja sadràva serin. SH2-domena dio proteina (domena) od oko 100 aminokiselina koje veù proteine s fosfotirozininom.
signalna peptidaza enzim koji proteolizom uklanja signalni slijed polipeptidnoga lanca. signalni odsje~ak odrednica prepoznavanja proteina; nastaje trodimenzionalnim smatanjem polipeptidnoga lanca. signalni slijed hidrofobni slijed na amino-kraju polipeptidnoga lanca koji ga odre|uje za izlu~ivanje u bakterija, ili za prolazak kroz ili ugradnju u endoplazmatski retikul u eukariotskim stanicama. simport prijenos dviju molekula u istom smjeru preko stani~ne membrane. sinapsa spoj izme|u neurona i druge stanice, preko kojega se neurotransmitorom prenosi obavijest. sinapsa veza dvaju homolognih kromosoma tijekom mejoze. sinapti~ka vezikula sekretorni mjehuri} (vezikula) koja otpu{ta neurotransmitor na sinapsi. sinaptomenalni sustav proteinska tvorba nalik zatvara~u, koja se stvara du` sparenih homolognih kromosoma tijekom mejoze. SINE kratki raspr{eni elementi (od engl. short interspersed elements) porodica ponavljaju}ih retrotranspozona u genomima sisavaca. sjen~anje metalom elektronskomikroskopski postupak u kojem se povr{ina uzorka oblaè tankim slojem metalne pare. sklerenhimske stanice biljne stanice s debelim stani~nim stijenkama koje daju gradbenu potporu biljkama. slijed Shine-Delgarno slijed prije mjesta po~etka prevo|enja bakterijske mRNA u polipeptidni lanac; pravilno namje{ta mRNA na ribosomu. smrzavanje i lomljenje (engl. freeze fracture) postupak priprave preparata za elektronsku mikroskopiju u kojoj se uzorak smrzne u teku}em du{iku i onda lomi da bi se razdvojio lipidni dvosloj stani~ne membrane; tako se prikazuju unutra{nje strane stani~ne membrane. sonda reagencija koja moè selektivno prepoznati specifi~nu nukleinsku kiselinu ili protein. Souther n-blot postupak kojim se radioaktivne sonde rabe za otkrivanje specifi~nih fragmenata DNA razdvojenih elektroforezom u gelu. spektrin glavni protein koji veè aktin u stani~noj kori. spojni kompleks (engl. junctional complex) podru~je dodira izme|u dviju stanica koje sadràva tijesni spoj, pri~vrsni spoj i dezmosom. Src nereceptorska protein-tirozin-kinaza koju odre|uje onkogen (src) iz Rousova sarkomskoga virusa. sredi{nja dogma uvjerenje da se geneti~ka informacija prenosi s DNA na RNA i zatim na proteine. sredi{te sklapanja mikrotubula mjesto ukotvljenja blizu sredi{ta stanice iz kojega se pruà ve}ina mikrotubula. srednja lamela dio biljne stani~ne stijenke koji sluì kao ljepilo za susjedne stanice.
696
Pojmovnik
SRP-receptor protein na membrani endoplazmatskoga retikula koji veè ~estice za prepoznavanje signala (SRP). srpRNA mali citoplazmatski RNA dio SRP . stani~na kora aktinska mreà ispod stani~ne membrane. stani~na membrana fosfolipidni dvosloj s pridruènim proteinima koji okruùje stanicu. stani~na plo~a tvorba nalik disku, okruèna membranom; tvori nove stani~ne stijenke tijekom citokineze vi{ih biljaka. stani~na stijenka ~vrst propusni vanjski sloj koji u~vr{}uje bakterijske i biljne stanice, te stanice gljiva. stani~na transfor macija pretvorba normalnih stanica u tumorske stanice u kulturi. stani~ne adhezijske molekule transmembranski proteini koji posreduju u me|ustani~nim interakcijama. stani~ne linije stanice koje se mogu beskona~no umnoàvati u kulturi. START regulacijska to~ka u stani~nom ciklusu kvasca; zbiva se kasno u fazi G1. Nakon te to~ke stanica mora prije}i u fazu S i pro}i jednu stani~nu diobu. STAT-proteini transkripcijski faktori s SH2-domenom aktivirani fosforilacijom tirozina koja poti~e njihovo premje{tanje iz citoplazme u jezgru. stereocilija specijalizirana stani~na trepetljika (mikrovilus) slu{nih vlasastih stanica (engl. auditory hair cells). steroidni hor moni skupina hidrofobnih hormona, derivata kolesterola. stezni prsten tvorba gra|ena od aktina i miozina II koja nastaje ispod stani~ne membrane tijekom mitoze i posreduje citokinezu. stezni snopovi snopovi aktinskih vlakana koji se udruùju s miozinom II i mogu se stezati. stroma dio kloroplasta koji leì izme|u vanjske membrane kloroplasta i tilakoidne membrane. stromalna-procesiraju}a-peptidaza (SPP) proteaza koja uklanja tranzitne peptide s proteina uvedenih u stromu kloroplasta. superporodica jezgrinih receptora porodica transkripcijskih faktora koja uklju~uje receptore za steroidne hormone, tireoidni hormon, retinoi~nu kiselinu i vitamin D3. supstrat molekula na koju djeluje enzim. {aperon protein koji omogu}uje pravilno smatanje ili zdruìvanje drugih proteina. {aperonin porodica proteina toplinskoga {oka unutar kojih se odvija smatanje proteinskih lanaca. {krob polimer glukoze, glavni oblik pohrane ugljikohidrata u biljkama. taksol tvar koja se veè na mikrotubule i tako ih u~vr{}uje. talin protein koji posreduje udruìvanje aktinskih vlakana s integrinima u àri{noj adheziji.
TATA-slog (engl. TATA box) regulacijski slijed DNA koji se nalazi u promotorima mnogih eukariotskih gena koje prepisuje RNA-polimeraza II. telofaza zavr{no razdoblje mitoze tijekom kojega se ponovno oblikuju jezgre i dekondenziraju kromosomi. telomeraza reverzna-transkriptaza koja s pomo}u vlastitog RNA-kalupa sintetizira ponavljaju}e sljedove na krajevima kromosoma. telomere ponovljeni jednostavni sljedovi DNA koji odràvaju krajeve kromosoma. terapijsko kloniranje postupak prijenosa jezgre u oocite koji sluì za proizvodnju embrionalnih mati~nih stanica za transplantaciju. tercijarna struktura proteina trodimenzionalna struktura polipeptidnoga lanca koja proteinu daje aktivni oblik. test pomaka elektroforeti~ke pokretljivosti metoda ko jom se ispituje vezanje proteina na specifi~ni slijed DNA. testosteron steroidni hormon {to ga izlu~uju testisi. Tic-kompleks sustav za translokaciju proteina unutarnje membrane kloroplasta. tijesni spoj v. premosnica. tilakoidna membrana prva unutra{nja membrana kloroplasta, na kojoj se odvija prijenos elektrona i sinteza ATP . timin pirimidin koji se u molekuli DNA sparuje s adeninom. Tim-kompleks sustav za translokaciju proteina unutra{nje membrane mitohondrija. Ti-plazmid plazmid koji se rabi za prijenos gena u biljkama. tireoidni hormon hormon koji se sintetizira iz tirozina u {titnja~i. titin veliki protein koji djeluje kao opruga i drì miozinska vlakna u sredi{tu mi{i}ne sarkomere. tjele{ce za prekrajanje RNA (engl. spliceosome) veliki sklop snRNA i proteina koji katalizira prekrajanje pre-mRNA. Toc-kompleks sustav za translokaciju proteina vanjske membrane kloroplasta. Tom-kompleks - sustav za translokaciju proteina vanjske membrane mitohondrija. topoizomeraza enzim koji katalizira reverzibilno kidanje i ponovno uspostavljanje fosfodiesterskih veza u jednom od lanaca dvostruke uzvojnice DNA. transcitoza raspore|ivanje i prijenos proteina u razli~ita podru~ja stani~ne membrane nakon endocitoze. trans-djeluju}i faktor transkripcijski regulatorni proteini. transducin G-protein koji, nakon aktivacije rodopsinom, poti~e cGMP-fosfodiesterazu. transfekcija uvo|enje tu|ega gena u eukariotsku stanicu.
Pojmovnik
697
transformacija prijenos DNA izme|u geneti~ki razli~itih bakterija. V. stani~na transformacija. transfor miraju}i faktor rasta b (TGF-b, engl. transforming growth factor-b) polipeptidni faktor rasta koji inhibira umnoàvanje animalnih stanica. transgeni~ni mi{ mi{ koji nosi tu|e gene ugra|ene u zametne stanice. trans-Golgijeva mreà odjeljci Golgijeva tijela u kojima se razvrstavaju proteini i slaù za izlazak iz Golgijeva tijela. transkripcija prepisivanje; sinteza molekule RNA prema DNA--kalupu. transkripcijski aktivatori transkripcijski faktori koji poti~u transkripciju. transkripcijski faktor protein koji regulira aktivnost RNA-polimeraze. translacija prevo|enje; sinteza polipeptidnoga lanca prema informaciji kodiranoj u slijedu nukleotida molekule mRNA. translacija in vitro in vitro sinteza proteina, obi~no uporabom stani~nih ekstrakata. translokon membranski kanal kroz koji se polipeptidni lanci prenose u endoplazmatski retikul. transmembranski protein membranski protein koji se pruà kroz cijeli lipidni dvosloj i izviruje s obiju strana stani~ne membrane. transmisijska elektronska mikroskopija v. elektronska mikroskopija. transportna RNA (tRNA) molekula RNA koja sluì kao adaptor izme|u aminokiselina i mRNA tijekom sinteze proteina. transportni lanac elektrona niz nosa~a kojima se elektroni prenose iz vi{ega u niè energijsko stanje. transpozicija premje{tanje slijeda DNA s jednoga na drugo mjestu u genomu. transpozon slijed DNA koji moè promijeniti svoj poloàj u genomu. trepetljika pokretni stani~ni izdanak kojemu osnovu ~ine mikrotubuli; pokre}e stanicu kroz teku}inu ili teku}inu preko stani~ne povr{ine. triacilglicerol tri masne kiseline vezane za molekulu glicerola. trombocitni faktor rasta (PDGF, engl. platelet-derived growth factor) faktor rasta koji se osloba|a iz trombocita tijekom zgru{avanja krvi i koji potom poti~e proliferaciju fibroblasta. tromboksan eikozanoid vaàn za zgru{avanje krvi. tropomiozin vlaknasti protein koji veè aktinska vlakna i regulira kontrakciju tako da sprje~ava reakciju aktina i miozina. troponin proteinski sustav koji se veè za aktinska vlakna i regulira kontrakciju skeletnoga mi{i}a. T-stani~ni receptor povr{inski protein T-limfocita koji prepoznaje antigene na povr{ini drugih stanica.
tubulin citoskeletni protein koji se polimerizira u mikrotubule. tumor bilo koje nenormalno umnoàvanje stanica. tumorska inicijacija prvi korak u razvoju tumora, nastaje prekomjernim umnoàvanjem stanica. tumorska progresija nakupljanje mutacija u tumorskim stanicama, {to uzrokuje sve ja~i rast i zlo}udnost (malignost) tumora. tumorski promotor tvar koja izaziva nastanak tumora poticanjem stani~nog umnaànja. tumorski supresorski gen gen ~ija inaktivacija omogu}uje razvoj tumora. tumorski virus virus koji moè izazvati rak u ìvotinja ili ljudi. turgorski tlak unutarnji hidrostati~ki tlak u biljnim stanicama. tvrdi keratin keratin koji se nalazi u tvorbama kao {to su kosa, nokti i rogovi. ubikinon v. koenzim Q. ubikvitin evolucijski jako o~uvan protein kojim se obiljeùju drugi stani~ni proteini za brzu razgradnju u stanici. ugljikohidrat molekula formule (CH2O)n. Ugljikohidrati uklju~uju i oligosaharide i polisaharide. ultracentrifuga centrifuga koja okre}e uzorke velikim brzinama. uniport prijenos jedne molekule preko stani~ne membrane. unutarstani~ni prijenos signala slijed kemijskih reakcija koje prenose kemijske signale iz stani~ne okoline na unutarstani~ne ciljne molekule. uracil pirimidin koji se sparuje s adeninom u molekuli RNA. uzvojnica-okret-uzvojnica domena za vezanje DNA ~imbenika transkripcije u kojoj tri ili ~etiri zavijena podru~ja dodiruju DNA. uzvojnica-om~a-uzvojnica domena za vezanje DNA ~imbenika transkripcije koja nastaje dimerizacijom dvaju polipeptidnih lanaca. Dimerizacijska se podru~ja tih proteina sastoje od dva zavijena dijela odvojena om~om. vakuola velika vre}ica okruèna membranom u citoplazmi eukariotskih stanica. U biljnim stanicama vakuole sluè za odlaganje hranidbenih ili otpadnih tvari, za razgradnju makromolekula i za odràvanje turgorskoga tlaka. vektor molekula DNA koja omogu}uje umnoàvanje kloniranoga fragmenta DNA u doma}inskoj stanici. vezikula obloèna COP transportna vezikula obloèna proteinima koje nisu klatrini. vezikula obloèna klatrinom prijenosna vezikula obloèna klatrinom. videom-pobolj{ana mikroskopija (engl. video-enhanced microscopy) zdruèna uporaba video-kamere i svjetlosnoga mikroskopa za prikazivanje malih predmeta.
698
Pojmovnik
vilin glavni protein za usnopljivanje aktina u crijevnim mikroresicama. vimentin indermedijarni vlaknasti protein u razli~itim vrstama stanica. vinblastin lijek koji inhibira polimerizaciju mikrotubula. vinkristin lijek koji inhibira polimerizaciju mikrotubula. vinkulin protein koji posreduje udruìvanje aktinskih vlakana s integrinima na àri{noj adheziji. virus hepatitisa B porodica DNA-virusa koja inficira jetrene stanice i moè uzrokovati rak jetre. virus hepatitisa C porodica RNA-virusa koja inficira jetrene stanice i moè uzrokovati rak jetre. visokoenergetske veze kemijske veze ~ijom se hidrolizom osloba|a velika koli~ina energije. vlaknasti (filamentozni) F aktin aktinski monomeri polimerizirani u vlakna. vode}i lanac lanac DNA koji se neprekidno sintetizira u smjeru napredovanja replikacijskih ra{lji. Western-blot v. imunoblot
Xenopus laevis afri~ka àba koja se rabi kao model u razvojnoj biologiji. zaostaju}i (tromi) lanac lanac DNA koji se sintetizira suprotno smjeru napredovanja replikacijskih ra{lji; nastaje povezivanjem Okazakijevih fragmenata. zebrasta ribica (engl. zebrafish) vrsta male ribe koja se rabi za prou~avanje genetike razvoja kralje`njaka. zeleni fluorescentni protein (GFP) protein meduza koji se obi~no koristi za obiljeàvanje u fluorescentnoj mikroskopiji. zigota oplo|ena jajna stanica. zigoten razdoblje mejoze I tijekom kojega se sparuju homologni kromosomi. zlo}udni (maligni) tumor tumor koji prorasta normalno tkivo i {iri se po tijelu. àri{na adhezija mjesto prianjanja stanice za me|ustani~nu tvar; u njemu su integrini vezani na snopove aktinskih vlakana.
Kazalo
A
a-aktinin, 441, 442, 448 -benzopireni, 634, 635 a-interneksin, 456 a-uzvojnice, 54, 55, 362363, 365, 487 2'-deoksiriboza, 48 3' podru~je koje se ne prevodi, 290 5' podru~je koje se ne prevodi, 289 7-metilgvanozinska kapa, 265 A pruge, 448, 449 ABC-transporteri, 506 Abelsonov leukemijski virus, 646647 abl onkogen, 652, 665 acetiliranje histona, 257258 acetiliranje, 257258 acetilkolin, 500, 546 acetilkolinski receptor, nikotinski, 500 adenil-ciklaze, 551552, 559, 564, 654 adenin (A), 48, 194 adenom, 634 adenovirusi, 141, 143, 642643 adenozin-5'-trifosfat (ATP) hidroliza, 503507 i aktivni transport, 8485 i Gibbsova slobodna energija, 6365 i metaboli~ka energija, 7 nastajanje iz glukoze, 6569 sinteza, 412413, 424, 426, 506 skladi{te energije, 49, 66 vezan na aktin, 438 ADF/kofilin, 439, 454 adrenalin, 312, 546, 559 aflatoksin, 634, 635 agrekan, 526 Agrobacterium tumefaciens, 127 akcijski potencijal, 499 aksoneme, 475476 aksoni, 468, 498 aktin kontraktilni prsten, 614 mreè, 440441 nemi{i}ne stanice, 451452 polimerizacija, 436437 proteini koji veù aktin, 438, 440 regulacija citoskeleta, 574575 snopovi, 440441, 530 u membrani eritrocita, 488 aktinska vlakna i tropomiozin, 451 i troponini, 451 izgradnja, 436 organizacija, 440441 razgradnja, 436440 struktura, 435446 vezanje na adherentne spojeve, 445 aktivni transport, 8485, 503507, 507508 aktivno sredi{te (mjesto), 57 Akt-kinaze, 565, 566, 583 akutna promijelocitna leukemija, 656, 666 akvaporini, 496 alanin (Ala) (A), 51 Albers, Kathryn, 460461 aldosteron, 543 aleli, naslje|ivanje, 90 alkiliranje, 195 Allen, Robert, 469 alosteri~ka regulacija, 6263, 310 alternativno prekrajanje, 144, 145, 171, 272273 Altman, Sid, 6 amfipati~ne molekule, 6, 45 amiloplasti, 421 aminoacil-tRNA-sintetaza, 282 aminokiseline bazi~ni bo~ni ogranci, 50 biosinteza, 7577 esencijalne, 77 hidrofilni bo~ni ogranci, 50 hidrofobni bo~ni ogranci, 50 kiseli bo~ni ogranci, 51 peptidna veza, 5152 polarni bo~ni ogranci, 50 sastav proteina, 50 slijed inzulina, 53 vezanje na tRNA, 283 amiotrofi~na lateralna skleroza (ALS), 461 Amoeba proteus, 1213 amonijak (NH3), 7577 ampicilin, gen za rezistenciju (Ampr), 124 ampicilin, rezistencija na , 110 amplifikacija gena, 225226, 652 anaboli~ki put, 74 anafaza anafaza A, 474 anafaza B, 474 animalne stanice, 609 jezgre, promjene, 346 mikrofotografija, 610 MPF inaktivacija, 613614 zapo~injanje, 617 Anfinsen, Christian, 5253, 299 angiogeneza, 638, 666 animalne stanice, 10, 1415, 125127, 614 (v. i sisavci, kralje`njaci) ankirin, 443, 488 Antennapedia mutante, 253, 254 antibiotici, 292, 518 antigeni, 119, 214 antikodonska petlja, 282 antiport, 508 AP-1 transkripcijski faktor, 654 Apaf-1, 581 APC gen, 660, 663 AP-endonukleaze, 197 apertura, numeri~ka, 21, 22 apikalna domena, 381, 491, 515 apolipoprotein B, 274 apoptosom, 581 apoptoza, 580582, 639, 662. vidi tako|er programirana stani~na smrt apscizinska kiselina, 549, 550 Arabidopsis thaliana centromere, 157 genom, 149, 166167 haploidna DNA, 12 kao eksperimentalni model, 18 mitohondrijski genom, 402 odgovor na etilen, 550 translacija, 298 arahidonska kiselina, 548549 ARF1, 385, 386387 arginin (Arg) (R), 51 arhebakterije, 8 Arp2/3 kompleks, 438, 454 ARS (autonomno repliciraju}i sljedovi), 190 asparagin (Asn) (N), 51 asparaginska kiselina (Asp) (D), 51 aspirin, 548549 astralni mikrotubuli, 467, 613 ATM-kinaza, 597 ATP (v. adenozin-5'-trifosfat) ATP-sintaza, 413, 414
700
Kazalo
ATR-kinaza, 597 auksini, 521, 549 aurora B, 612 autofagi, 315316, 393394, 394 autofagosom, 394 autofosforilacija, 555, 573 autokrina signalizacija, 542 autokrina stimulacija rasta, 637 autonomno repliciraju}i slijedovi (ARS), 190 autoradiografija, 112 Avery, Oswald, 93
B
b-ba~ve, 83, 489 b-galaktozidaza, 237 b-globinski gen, 144 b-katenin, 530, 578, 663 b-nabrana plo~a, 55, 83 B limfociti imunoglobulinski geni, 248 mati~ne stanice i, 623624 stvaranje protutijela, 119, 214 virusom izazvana transformacija, 643 Bad protein, 583 bakterije bakterijski umjetni kromosomi (BAC), 111, 165 ekspresija kloniranoga gena u, 114 kapsule, 93 stani~ni zid, 518519 vanjske membrane, 489 bakteriofagi l, 104105, 109, 122, 211214 P1, 111 T4, 36, 98, 99100 Baltimore, David, 101103 BamHI endonukleaze, 218 bazalne lamine, 522523, 525, 526 bazalno tijelo, 465, 477 bazolateralne domene, 381, 491, 515 Bcl-2 porodica proteina, 581, 582, 656 bcr geni, 652 bcr/abl onkogen, 667 Beadle, George, 9293 Beckerova mi{i}na distrofija, 443 Berget, Susan M., 142143 bi~evi, 465, 474478 Bid, 582 bijele krvne stanice. vidi leukociti; makrofagi; neutriofili biljke citokineza, 615 elongacija, 522 genom, 166167 glukoneogeneza, 75 Golgijev aparat, 382 hormoni, 549550 mikrofotografija, 13 stani~na adhezija, 532533 stani~ne kulture, 34
stani~ne stijenke, 14, 519522 struktura, 11 vakuole, 382 bioinformatika, 159 BiP 362 , Bishop, J. Michael, 648649 Blobel, Gnther, 330, 358, 360361 bojanje, 2627 boss mutante, 576 Boveri, Theodore, 463 Brady, Scott, 469 brasinosteroidi, 543 BRCA geni, 203, 660 Brenner, Sidney, 98 bride-of-sevenless mutante, 576 Britten, Roy, 145 Broker, Tom, 142 Brown, Michael, 511, 512513 B-stani~ni limfomi, 643 Burkittov limfom, 643, 651 Butel, Janet, 330
C
Caenorhabditis elegans geni za ionske kanale, 502 genom, 149, 163165 kao eksperimentalni model, 1718 kinezin, 472 Ras/Raf/ERK put, 575577 stani~na smrt, 580 stidnica, 577 strukture, 17 Cairns, John, 182 Cajalova tjele{ca, 339 CAK (Cdk-aktiviraju}e kinaze), 604 Calvinov ciklus, 74, 418, 429 CaM kinaze, 564 cAMP-fosfodiesteraze, 559 cAMP-ovisne protein kinaze, 313, 559 CD45, 558 Cdc2, 314315, 347, 349, 599605, 601 Cdc25, 603, 607608 Cdc28, 600601 Cdc42, 574575 Cdk (kinaze ovisne o ciklinima), 604, 605 cDNA knji`nice, 123 cDNA, proizvodnja, 108 Cech, Tom, 6, 288 ced gen, 580 Celera Genomics, 169, 170 celuloza, 43, 379, 519520, 521, 522 celuloza-sintetaza, 521522 centrifugiranje temeljeno na brzini sedimentacije, 29, 31 centrifugiranje u gradijentu gusto}e, 29, 96 centrioli, 464466 centromere, 154157, 156, 609 centrosomi, 463464, 465, 610 ceramid, 372, 373 cervikalni karcinomi, 635
cGMP-fosfodiesteraze, 561562 Charcot-Marie-Tooth bolest tip 2B1, 340 Chargaff, Erwin, 95 Chk1-kinaze, 597, 607608 Chk2-kinaze, 597, 607608 Chow, Louise, 142 cijanobakterije, 8 cijepaju}i kvasac. vidi Schizosaccharomyces pombe cikli~ki AMP (cAMP), putovi, 559 cikli~ki GMP (cGMP), 561562 ciklin B, 314315, 602603, 613 ciklini, 599603, 602, 605606 cikloheksamid, 292 ciklooksigenaze, 548549 ciklus limunske kiseline, 6770, 401 cis-Golgi mreà, 377 cis-djeluju}i kontrolni element, 238 cis-djeluju}i regulatorni sljedovi, 245249 cistein (Cys) (C), 51 cisti~na fibroza, 506, 509 citohalazini, 438, 454 citokineza, 452, 592, 614615, 617 citokini, 548 citokinini, 549 citokrom b, 406 citokrom bc kompleks, 423 citokrom bf kompleks, 418, 424 citokrom c, 409, 581 citokromi, 489 citokrom-oksidaze, 409 citoplazmatski dinein, 470471 citoskelet izvanstani~ni matriks i, 528 opis, 910 prijenos signala i, 571575 proteinska vlakna, 435 regulacija, 574575 stani~no kretanje i, 435482 citostati~ki faktor (CSF), 619620 citozin (C), 48, 194 Claude, Albert, 25, 28 Cln (G1 ciklini), 604 c-myc onkogen, 651652 Coastal protein, 578 Cockayneov sindrom, 199, 200 Cohen, Stanley, 547, 553 Collins, Frances, 170 COP-obloène vezikule, 386387 COPI-obloène vezikule, 612 Corey, Robert, 54 Coulombe, Pierre A., 460461 CpG dinukleotidi, 260 CRE (elementi odgovora na cAMP), 560 CREB (protein koji veè CRE), 560, 564 Crick, Francis, 94, 180 crvene krvne stanice. vidi eritrociti CSA protein, 200 CSB proteini, 200 CSF (citostati~ki faktor), 619620 CSL, 579 Cubitus interruptus (Ci), 578
Kazalo
701
^
~estica za prepoznavanje signala (SRP), 359361, 420 ~estice nukleosomske srì, 152 ~etkaste membrane, 445 ~vrsti keratini, 456 ~vrsti spoj, 491, 492, 531
D
D1 onkogeni, 655 Darwin, Charles, 549 de Duve, Christian, 28, 392, 510 deaminacija, 194 debela vlakna, 450 Degenstein, Linda, 460 Deisenhofer, Johann, 423 DeLisi, Charles, 170 dendriti, 468 deoksiribonukleinske kiseline. vidi DNA depurinacija, 194 detergenti, 487 dezmin, 456 dezmogleini, 530 dezmokolini, 530 dezmoplakin, 458, 530 dezmosomi, 458, 530 diacil-glicerol, 562563, 565 Dictyostelium discoideum, 12, 17, 455 dideoksinukleotidi, 112 diferencijacija, signalizacija u, 575579 diferencijalna interferencijsko-kontrastna mikroskopija, 22 diferencijalno centrifugiranje, 2829 difrakcija X-zraka, kristalografija, 54, 285 difuzija olak{ana, 494496, 496 pasivna, 494 tijesni spoj ili premosnica, 532 difuzni B velikostani~ni limfom, 665 dihidrofolat-reduktaza, 226 dihidroksiaceton, 43 dijakineza, 615617 dimetilnitrozamin, 634, 635 dinami~ka nestabilnost, 462463 dinamin, 514 dineini, 468, 470471 diobeno vreteno, 613 diploidne stanice, 90 diploidni stadij, 615, 617 Dishevelled protein, 578 distrofini, 443 disulfidne veze, 5253 DNA mikro~ipovi, 118,119 DNA o{te}enje apoptoza i, 662 depurinacija, 194 inhibicija stani~noga ciklusa, 607 izravni obrat, 194197 karcinom i, 639 programirana stani~na smrt, 579584 DNA-polimeraze
E. coli, 96 inhibicija stani~noga ciklusa, 607 korektivna aktivnost, 188 pomo}ni proteini i, 185186 pregledno, 180182 sklona pogrje{kama, 201 Thermus aquaticus, 115 DNA transpozoni, 147 DNA. (v. i cDNA; rekombinantna DNA ishodi{te replikacije, 189 kloroplast, 418 metiliranje, 260261 mitohondrijska, 12, 401403 mjesta replikacije, 338 naslje|ivanje i, 93 nekodiraju}a, 139, 141 organizacija u jezgri, 335339 otisak stopala, 233 pakiranje, 152153 PCR amplifikacija, 115117 ponovljeni sljedovi, 145147 popravak, 192203 povezivanje molekula, 108 preslagivanje, 211226 rekombinacija, 204211 rekombinantna, 104117 replikacija, 9596, 179193, 598 retrovirusna, 220 RNA sinteza i, 98 satelitna, 146 sekvenciranje, 111113, 170171 semikonzervativna replikacija, 9697 sinteza, 112 stani~ni sadràj, 12, 594 struktura, 9495 stvaranje om~e, 248 TBP-TFIIB kompleks i, 242 telomerna, 158 vektori za kloniranje, 111 virusna, 93, 141 vjernost replikacije, 188189 DNA-afinitetna kromatografija, 250, 251 DNA-glikozilaze, 197 DNA-ligaze, 107, 182 DNaza, 233 Dobberstein, Bernhard, 360361 dobro}udni tumori, 632 dodirna inhibicija, 637638 dolikol, 367 dolikol-fosfat, 306 domene cinkovih prstiju, 252, 253 domene koje se veù na DNA, 253 domene proteina, 55 dominantni geni, 90 dominantni inhibiraju}i mutanti, 132 dopamin, 546 Drosophila melanogaster Antennapedia mutanta, 253, 254 centromere, 157 geneti~ke studije koje koriste, 91 genom, 149, 163165 haploidna DNA, 12
homeotska mutanta, 253 ishodi{ta replikacije, 191 kao eksperimentalni model, 18 kromosomi, 336337 Krppel mutacija, 255 politeni kromosomi, 164 programirana amplifikacija gena, 225 Ras/Raf/ERK put, 575577 sloènost oka, 576 transformiraju}i gen, 273 drugi glasnici, 559565 Druker, Brian, 668 Duchennova muskularna distrofija, 443 duga terminalna ponavljanja (LTR), 220, 222 duhanski dim, 634 Dunniganova parcijalna lipodistrofija, 340 du{i~ne baze, 49, 9495 du{ikov oksid (NO), 545546, 546, 561 dvofotonska ekscitacijska mikroskopija, 26 Dynan, William, 251
E
E2F obitelj, 606 Eagle, Harry, 3132 Ecker, Robert, 599, 601 Eckhardt, Walter, 554 EcoRI, 104, 106 Edidin, Michael, 490 EF-Tu/GTP 295 , egzonukleaze, 184 eikozanoidi, 548549 ekdison, 543 ekscinukleaza, 198, 200 ekscizijski popravak, 197201 eksportini, 329 ekspresijski vektori, 114 elaioplasti, 421 elasti~na vlakna, 525 elastin, 525 elektrokemijski gradijent, 412413 elektroni, tok, 422425, 425426 elektronska mikroskopija, 2528, 327, 487 elektroporacija, 126 element odgovora na serum (SRE), 569 element odgovora na èljezo (IRE), 275, 296298 elementi odgovora na cAMP (CRE), 560 elementi ìle, 13 eleongacija, translacije, 295 Elk-1, 569, 654 elongacijski faktori, 259 embrionalne mati~ne stanice (ES), 31, 127, 621625 embrionalne stanice, 593 Emery-Dreifuss mi{i}na distrofija, 340341 endocitoza teku}e faze, 515 endocitoza, 390391, 393 fagocitoza, 510511
702
Kazalo
klatrin-ovisna, 511 posredovana receptorima, 511515 promet proteina, 515518 teku}e faze, 515 endokrina signalizacija, 542 endonukleaze, 218, 615 endoplazmatski retikul (ER) eksport iz, 372374 elektronskomikroskopski, 362 funkcija, 356374 mikrotubuli i, 473 opis, 9 prijenos fosfolipida, 372 sinteza lipida, 369372 smatanje proteina, 366369 smje{taj, 1011, 324 ugradnja proteina u, 362 usmjerivanje proteina prema, 357362 vezikularni transport iz, 374 endorfini, 547 endosimbioza, 10, 12, 401 endosomi, 515, 516 endotelne stanice, 529 energija aktivacije, 57 energija fotosinteza i, 7273, 422426 hvatanje, 423 metaboli~ka, 78 mitohondriji i, 399408 skladi{tenje, 4344, 49 energija, reakcije, 5758 enkefalini, 547 entaktini, 527 enzim koji konjugira ubikvitin (E2), 314 enzimi. vidi tako|er specifi~ne enzime fosforilacija, 63 geni i, 9193 histidin i, 5051 homologna rekombinacija, 209211 inhibicija povratnom spregom i, 62 kataliti~ka aktivnost, 5659 kisele hidrolaze, 389 smatanje proteina i, 303 epidermalni faktor rasta (EGF), 547, 548 epidermalni faktor rasta (EGF), receptor, 553 epidermolysis bullosa simplex (EBS), 461 epitelne stanice cisti~na fibriza i, 509 ~vrsti spojevi i, 531 funkcija, 15 intermedijarna vlakna, 460461 intestinalne, 507 kloridni ionski kanali, 506507 mikrofotografija, 13, 14 stani~ne membrane, 381, 491 transporteri za glukozu, 508 trepetljike, 476 Epstein-Barr virus, 35, 640, 643 ErbA, 655 ErbB-2 onkogen, 652653, 666 ERCC1, 199
Erikson, Ray, 554 eritrociti funkcija, 15 integralni membranski proteini, 487488 mati~ne stanice i, 623, 624 mikrofotografija, 14 morfologija, 442 periferni membranski proteini, 487488 stani~na membrana, 484 eritroleukemija, koko{ja, 655 eritromicin, 292 ERK (regulirane izvanstani~nim signalom) kinaze, 565, 566570, 620, 653 ERM proteini, 443 Escherichia coli genom, 161 genomska replikacija, 189 haploidna DNA, 12 izolacija mutanti, 180 kao eksperimentalni model, 1516 kolonije, 16 lac operon, 289 medij, 96 model replikacijskih ra{lji, 187 peptidoglikani, 519 popravak izrezivanjem nukleotida, 198 promotorski sljedovi, 232 replikacija DNA, 180, 182 RNA-polimeraze, 232 stani~na membrana, 80 strukture, 89 sustav popravka krivo sparenih baza, 201 tRNA, 283 veli~ina genoma, 149 estradiol, 47, 543 estrogen, 542, 543, 544, 635 estrogenski receptori, 544 etanolamin, 46 etilen, 549, 550 etioplasti, 421, 422 eubakterije, 89 Euglena, 12 eukarioti bi~evi, 475 broj kromosoma, 150 DNA-polimeraze, 180182 faktori translacije, 291296 funkcija gena u, 123133 genomi, 149150 inicijacija translacije, 294 izvori{ta replikacije, 190 jezgre za vrijeme mitoze, 345, 347 karakteristike, 4 kompleksnost genoma, 139150 mRNA, 289 op}i faktori transkripcije, 240243 promotori, 246
represori, 254256 RNA-polimeraze, 239240 sastav kromatina, 150 stani~ni ciklus, 591599 strukture ribosoma, 283, 285 strukture, 912 sustav popravka krivo sparenih baza, 201 {aperonski proteini, 301 transkripcija, 244261 trepetljike, 475 eukromatin, 153, 335337 Evans, Martin, 622 evolucija introni i, 144145 metabolizma, 78 mije{anje egzona, 144 stanica, 415, 11 vremenska skala, 5 FADH2, 400, 410
F
fagocitoza, 393394 fagolizosom, 394, 510 fagosomi, 393394, 510 FAK-kinaze (kinaze fokalne adhezije), 573574 faktor koji poti~e maturaciju. vidi MPF faktor koji se veè uzvodno (UBF), 244 faktor odgovora na serum (SRF), 569 faktor tumorske nekroze (TNF), 558, 582 faktori dopu{tenja, 598 faktori izmjene gvaninskih nukleotida, 567 faktori rasta usidreni u membrani, 548 faktori rasta, 546548, 595, 605606 faktori za otpu{tanje, 296 faktori zdruèni s TBP (TAF), 241 faloidin, 438 Fas ligand, 582 Fas, 582 fazno-kontrastni mikroskop, 22 fenilalanin (Phe) (F), 51, 79 fenilketonurija, 79, 92 fenotip, 90 feofitin, 423 feritin, 296298 ferodoksin (Fd), 424 fibrilin, 339 fibroblasti, 14, 15, 523 fibronektin, 526 fibrosarkomi, 633 fiksacija du{ika, 7677 filamin, 441, 442 filopodije, 446, 454, 574 fimbrin, 440, 445 Fisher, Ed, 312 flavin-adenin-dinukleotid (FADH2) 6771 flipaze, 372 fluorescencijom aktivirano sortiranje stanica, 594
Kazalo
703
fluorescentna in situ hibridizacija (FISH), 119, 169 fluorescentna mikroskopija, 2324 fodrin, 443 folikulostimulacijski hormon, 547 Folkman, Judah, 666668 forbol-esteri, 563, 635) fosfatidiletanolamin, 46, 484 fosfatidil-inozitol(PI)-3-kinaza, 565, 583584, 656 fosfatidilinozitol, 46, 484 fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat (PIP2), 562563 fosfatidilkolin, 46, 484 fosfatidilserin, 46, 484 fosfatidna kiselina, 46 fosfodiesteraze, 564 fosfodiesterska veza, 49 fosfolipaze C, 562563 fosfolipidi kalcijski ioni i, 562565 sastav, 45 sinteza, 371 stani~na evolucija i, 67 translokacija, 372 fosfolipidni dvosloj. (v. i membrane) plazma membrana, 483486 propusnost, 83, 494 stapanje, 387 struktura, 80 usa|ivanje kolesterola, 81 fosforilacija, 456 autofosforilacija, 555 cAMP put, 559 histona, 258259 miozina, 449,450 oksidativna, 67, 400, 408414 proteina intermedijarnih filamenata, 457 proteina, 63, 311313 receptorske protein-tirozin-kinaze, 555 regulacija miozina, 452453 regulacija translacije s pomo}u, 299 fosforilaza-kinaza, 560 fotocentar, 422423 fotoreaktivacija, 196 fotoreceptori, 561562, 576 fotorespiracija, 428429 fotosinteti~ki reakcijski centar, 423, 489 fotosinteza, 7, 8, 7273, 422426 fotosustav I, 418, 424 fotosustav II, 418, 424 frakcioniranje stanica, 2829, 30 Franklin, Rosalind, 94 Frizzled protein, 578, 579 Frye, Larry, 490 Fuchs, Elaine, 459, 460461 Fused protein, 578
G
g-aminomasla~na kiselina (GABA), 546
G proteini, 546, 550552 G0 faza, 595. (v. i stani~ni ciklus) G1 ciklini (C1n), 604 G1 faza, 592, 594. (v. i stani~ni ciklus) G2 faza 592, 594. (v. i stani~ni ciklus) G2 kontrolna to~ka, 608 GABA (g-aminomasla~na kiselina), 546 Gallo, Robert, 105 GAP (protein koji aktivira GTPazu), 650 Gaucherova bolest, 389, 392 Gcn5p, 258 GC-slogovi, 249 gel elektroforeza, 104106 Gelinas, Richard, 142 gen za transmembranski regulator provodnosti u cisti~noj fibrozi (CFTR), 506, 509 geneti~ki kod mitohondrijski, 402 prijenos informacija, 99101 redundancija, 283 geni rane regije, 642 geni definicija, 141 duplikacija, 148149 ekspresija, 96103, 113115 enzimi i, 9193 eukariota, 141 funkcija u eukariota, 123133 inaktivacija, 129 kolinearnost proteina s, 9798 naslje|ivanje i, 9091 razdvajanje, segregacija, 92 uno{enje mutacija, 128133 vezanost, 92 genom riè, 166167 genomi adenovirus, 643 biljni, 166167 E. coli, 145 eukariotski, 139150 humani, 121, 140, 147, 167173 kloroplasta, 417418 kva{~evi, 161163 mitohondrijski, 401403 prokariotskih stanica, 159161 retrovirusa, 644 RSV, 645 sekvenciranje DNA, 111113 sljedovi, 158173 stani~ni, 139177 virusni, 36, 106107 vi{ih eukariota, 149150 genomske knji`nice, 121122 genomsko utiskivanje (imprinting), 261 genotip, 90 genska terapija, 509 Gibbons, Ian, 469 Gibbs, Josiah Willard, 64 Gibbsova slobodna energija (G), 6466 giberelin, 549, 550 Gilbert, Walter, 238
glatki endoplazmatski retikul, 369374 glatki mi{i}i, 447 Gli proteini, 661 gliceraldehid, 43 glicerolski fosfolipidi, 45 glicin (Gly) (G), 50, 51, 546 glikoforin, 443, 488 glikogen 43, 312, 559560 glikogen-sintaza, 560 glikogen-sintaza-kinaza 3 (GSK-3), 578 glikokaliks, 492493 glikolipidi, 47, 379, 485 glikoliza, 7, 8, 6671. (v. i glukoza) glikoproteini, 305306, 370, 487 glikozaminoglikani (GAG), 525 glikozidna veza, 42, 43 glikozilacija, 305, 367, 377379, 379 glikozilfosfatidilinozitolno sidro (GPI), 309, 368, 369, 489490 glioksilatni ciklus, 427428 glioksisomi, 428 Glivec (STI 571), 667, 668 globini, 148 globularni (G) aktin, 436437 glukagon, 547 glukocerebrozidi, 392 glukoneogeneza, 74 glukoza aktivni transport, 507508 olak{ana difuzija, 496 represija, 238239 struktura, 43 stvaranje ATP 6671 , glutamat, 546 glutamin (Gln) (Q), 51 glutaminska kiselina (Glu)(E), 51 gljive, stani~na stijenka, 520 GM130, 612 Goldstein, Joseph, 511, 512513 Golgijev aparat citoplazmatski dineini i, 473 funkcija, 374382 glikozilacija proteina, 377379 glikozilacija, 306 izlazak proteina i, 373, 380382 mikrofotografija, 376 opis, 9 organizacija, 375377 razvrstavanje proteina, 380382 sidrenje vezikula, 612 sinteza hemiceluloze, 521 sinteza pektina, 521 smje{taj, 1011 vezikularni transport u, 374 Golgijev kompleks. v. Golgijev aparat Golgijev matriks, 612 Golgijev stog, 377, 383 Golgijeva mreà, cis ,377 Gram, Christian, 518 Gramovo bojenje, 518 granulociti, 14, 15, 623, 624 Grb2, 568, 569
704
Kazalo
GroEl, 302 GSK-3 kinaza, 583 gsp onkogen, 654 GTP funkcija, 462463 , gvanil-ciklaza, 545, 558, 561562 gvanin (G), 48, 194
H
H+. vidi protoni H19 gen, 261 Haemophilus influenzae, 159160 Hanson, Jean, 449 haploidne stanice, 9091 Harris, Henry, 657 Hartwell, Lee, 599 Harveyev sarkomski virus, 649 Hawking, Stephen, 461 Hedgehog signalni put, 654, 660661 hedgehog geni, 577578 HeLa stanice, 32 helikaze, 186, 189 hemiceluloza, 379, 520, 521 hemidezmosom, 458, 527, 528 hemoglobin, 56, 59 heparan-sulfat, 525 hepatitis B, virus, 35, 640, 641 hepatitis C, virus 640, 641 Herceptin, 668 herpesvirus povezan sa Kaposijevim sarkomom, 640, 643 herpesvirusi, 643 heterofilne interakcije, 529 heterokromatin, 153, 335337 heterotrimerni G proteini, 551 hHR23B,199 hidrofilne molekule, 6, 494495 hidrofobne molekule, 6, 494495 hidroksilizin, 523 hidroksiprolin, 523 hijaluronan, 526 hijazme, 617 hipofiza, 547 hipoteza jedan gen jedan enzim, 93 histamin, 546 histidin (His) (H), 5051, 51 histoni glavni proteini, 151 kondenzacija kromosoma i, 348349, 612 metilacija, 260 modifikacija, 257259 u kromatinu, 150 histonska deacetilaza (HDAC), 257 histonske acetil-transferaza (HAT), 257258 histonski kod, 258 hitin, 519 HMGN proteini, 256257 Hoagland, Mahlon, 282 'hod u mjestu' (engl. treadmilling), 437438 Hodgkin, Alan, 497
Hoffarth, Vernita, 288289 Hollidayev model, 207209 Hollidayeva veza, 207209 Holmes, Kenneth, 436 homeodomene,254 homeoslogovi, 254 homofilne interakcije, 529, 530 homogenizacija, 28 homologna rekombinacija, 129130, 204 211 hormon rasta, 359 hormoni biljaka, 549550 hipofize, 547 signalizacija i, 542 steroidi, 543545 Hozumi, Nobumichi, 218219 hrapavi endolazmatski retikul, 358, 362 hrskavica, 526 Hsp100 proteini, 419 Hsp60 porodica, 301303, 418419 Hsp70 porodica, 301303, 387, 403404, 418420, 430 Hsp90 porodica, 301303, 544 Huber, Robert, 423 humani genom, 167173, 170171 haploidna DNA, 12 kromosom 1, 169, 172 mitohondrijski genom, 402 ponavljaju}i genomski sljedovi, 146 veli~ina genoma, 149 humani papilloma virus, 35, 36 humani T-limfotropni virus (HLTV-1), 35, 640, 644 Hunt, Tim, 602 Hunter, Tony, 553, 554555 Huxley, Andrew, 449, 497 Huxley, Hugh, 449
I
i gen, 237 IAP (proteini inhibitori apoptoze), 581 importini, 329331 imunoblot, 120 imunoglobulini Ig superporodica, 528 I-kB, 333 poja~iva~i, 248 preslagivanje gena, 215, 218219 strukture, 214 imunoglobulinski geni, 247248, 360 imunolo{ki sustav, 214 imunoprecipitacija, 120121, 268 in situ hibridizacija, 119, 165 in vitro mutageneza, 128 in vitro prekrajanje, 266 in vitro translacija, 100 indeks loma svjetlosti, 21 inducirana prilagodba, 57 influenca virus, 101
inhibicija ovisna o gusto}i, 636 inhibicija povratnom spregom, 62, 310 inhibitori disocijacije GDP (GDI), 388 inicijacijski faktori, 290296 INK4 gen, 660, 661662 Ink4 porodica, 605 Inou, Shinya, 469 inozitol, 46 inozitol-1,4,5-trifosfat (IP3), 562563, 564 insercijski sljedovi (IS), 217 integralni membranski proteini, 81, 486 487 integraze (int), 213 integrini me|ustani~ne interakcije i, 528 prijanjanje fibroblasta i, 444 prijenos signala, 571574, 573 strukture, 527 interfaza, 467, 592, 610 intermedijarna vlakna, 455462 epitelne stanice, 460461 izgradnja, 456457 organizacija, 457459 sli~ni kadherinu, 530 Internacionalni konzorcij za sekvenciranje humanoga genoma, 169 introni humani genom, 149 otkri}e, 142143 inzulin, 53, 304, 547 inzulinu-sli~an faktor rasta II, 661 ionske crpke, 497508, 498, 503, 505508 ionski gradijent, 507508 ionski kanali, 496503, 501, 503. (v. i specifi~ni kanali) ishodi{ta replikacije, 189 promotor, 249 ishodi{te replikacije (ori), 110111, 124, 189191 izolator, 248 izoleucin (Ile) (I), 51, 62 izvanstani~ni matriks, 518528, 522528, 528
J
Jacob, Franois, 98, 236 JAK/STAT put, 570571 Janus -kinaze (JAK), 557 jezgra, 323353 funkcionalne domene, 337339 interfaza, 335337 mitoza i, 345350 opis, 9 ponovno formiranje u interfazi, 349 350 promet izme|u citoplazme i, 323335 sisavci, 337 smje{taj, 1011 transplantacija, 600601 unutarnja organizacija, 335339
Kazalo
705
jezgreni antigen proliferiraju}ih stanica (PCNA), 186, 607 jezgrice rRNA geni i, 339342 smje{taj, 1011, 324 struktura, 342 jezgrin faktor-k B, 333 jezgrina lamina, 324326, 340341 347348, 350 jezgrina ovojnica ponovno formiranje, 350 promet kroz, 323335 raspad, 345348, 612 struktura, 324326 jezgrine pjege, 338 jezgrini lokalizacijski signali, 328 jun protoonkogen, 654
K
Kabsch, Wolfgang, 436 kadherini, 445, 528, 530 Kadonaga, James T., 251 kalcijski ioni crpke, 505508 fosfolipidi i, 562565 skladi{te, 564 stani~na adhezija i, 528 unutarstani~ni, 564 kalcijski kanali, 564 Kalderon, Daniel, 330 kalijev ion, 497 kalijski kanali, 501, 503 kalmodulin, 446, 452, 564 kalneksin, 370 kalponini, 454 kalretikulin, 370 kalusi, kulture, 34 kanali nadzirani ligandom, 497 kanali nadzirani naponom, 497, 501, 502 kanalni proteini, 83, 84, 304, 495 Kaposijev sarkom, 105 karcinogeni, 195, 634635 karcinom debelog crijeva, 201, 203, 635, 663 karcinom dojke, 203, 226, 653, 660 karcinom jetre, 634, 641 karcinom ovarija, 653 karcinomi, 632 kardiolipin, 408 karioferini, 329332 karotenoidi, 420421 kaspaze, 580582, 582 kataboli~ki putovi, 73 katalaze, 427 kataliza, 5659, 288289 Kaufman, Matthew, 622 kaveole, 492, 515 kaveolin, 492 KDEL sljedovi, 374, 386 kemiosmoti~ko zdruìvanje, 410414, 416417
kemoterapija, 463, 572573, 667 Kendrew, John, 54 keratini, 456459, 460461, 610 kilobaze (kb), 144 kimotripsin, 58, 60 kinaza miozinskoga lakoga lanca (MLCK), 452 kinaze ovisne o ciklinima (Cdk), 604605 kinetohore, 155, 610, 612, 617 kinetohorni mikrotubuli, 466, 475, 613 kinezin, 455, 468, 470471 kinoni, 423 Kirschner, Marc, 463, 466 kisele hidrolaze, 389 kisik, fotosinteza i, 8 KKXX sljedovi, 374, 386 klatrin, 387, 513 klatrinom obloène jaìce, 511, 514 klaudini, 531 kloniranje, 107108, 110, 124, 625 kloramfenikol, 292 kloridni kanali, 507, 509 klorofil, 73, 422 kloroplasti funkcija, 415417 genom, 417418 lokacija, 11 mitohondriji i, 12, 416417 opis, 9 razvoj, 422 struktura, 415417 Knudson, Alfred, 659 koaktivatori, 254 kodoni, 100, 284 koenzim Q, 409, 411 koenzimi, 5961, 6768, 409, 411 kohezini, 613 Kohne, David, 145 koilin, 339 kolagena vlakna, 523 kolageni, 523525 kolcemid, 463 kolebanje, 283, 402 kolenhimske stanice, 13, 14 kolesterol biosinteza, 512 lipidne splavi i, 372 membranska fluidnost i, 81 primanje u stanice, 511, 513 strukture, 47, 373 u membrani, 485 kolhicin, 463 kolin, 46 kompleks ishodi{ta replikacije (ORC), 190191, 598 kompleks jezgrine pore, 324, 326328, 332 kompleks koji poti~e anafazu, 613 kondenzini, 612 kondroitin-sulfat, 526 koneksini, 532 konfokalna mikroskopija, 2425 konstrukcijski proteini, 570
kontaktin, 455 kontraktilni prsten, 452, 614 kontraktilni snopovi, 441 kontrolna to~ka diobenoga vretena, 598 kontrolne to~ke, stani~ni ciklus, 596598 kontrolni elementi, cis-djeluju}i, 238 korektivna aktivnost, 188 korepresori, 256, 544545 Kornberg, Arthur, 180 Kornberg, Roger, 151 kortikosteroidi, 543 kortizol, 543 kozmidi, 111 koà, 15, 460461, 636 kralje`njaci, 19. (v. i animalne stanice, humani; sisavci) Krebs, Ed, 312, 559 Krebsov ciklus. v. ciklus limunske kiseline kriste, 400 kromatide, 617 kromatin domene petlji, 338 kondenzacija, 153 lokacija, 324 mikroskopske slike, 610 organizacija, 151, 326, 335337 sastav, 150 transkripcija i, 256259 vlakna, 152 kromatosomi, 152 kromoplast, 420421 kromosomi kromatin i, 150154 kondenzacija, 348349 dekondenzacija, 257 DNA i, 93 eukariotske stanice, 150 geni i, 90 ljudski kromosomi, 1, 169, 172 mejoza, 91, 615621 metafaza, 154 mitoza, 153, 346, 474, 608611 organizacija, 335337 replikacija krajeva, 192193 translokacija, 651 kroni~na mijeloi~na leukemija (KML), 667 Krppel protein, 256 kru`ni tok elektrona, 425426 krvne stanice, 623624 krvne ìle, 545, 638 kulture tkiva, 32 kvarterna struktura, 56 kvasci. (v. i Saccharomyces cerevisiae; Saccharomyces pombe) centromere, 156 DNA-polimeraze, 181 geneti~ka analiza, 123125 genom, 149, 161162 Golgijev aparat, 381 kao eksperimentalni model, 1617 kromosom III, 162
706
Kazalo
Mutante osjetljive na temperaturu, 124 nesmisleno-posredovana razgradnja mRNA, 274275 popravak DNA, 198199 RNA-polimeraza II, 240 sloènost, 12 transkripcijski koaktivatori, 258
L
lac operon, 238239, 289 laktoza, metabolizam, 236237 lamelipodija, 446, 454, 574 lamini MPF i, 611 ponovno formiranje u interfazi, 349350 raspadanje jezgrine lamine i, 347348 sastavljanje, 326 laminini, 526 lanac prijenosa elektrona, 6971, 408410, 412413, 424 lan~ana reakcija polimeraze (PCR), 115117, 119 Lander, Eric, 170171 Lasek, Ray, 469, 470471 Laskey, Ron, 299 Leberova hereditarna opti~ka neuropatija (LHON), 402, 406407 leptoten, stadij, 615 Lerner, Michael R., 268269 Let-23 protein, 577 let-60 gen, 577 LEU2 gen, 124, 191 leucin (Leu) (L), 51 leucinski zatvara~i, proteini, 253, 254 leukemije, 632633, 639, 667 leukociti, 493, 529 leukoplasti, 421 leukotrieni, 548549 Levy-Montalcini, Rita, 547 Lewis, Ed, 253 ligandi, 511, 544 lignin, 521 lijekovi, metabolizam, 372 lijekovi, rezistencija na, 506 limfociti, 14, 15, 623, 624. (v. i B limfociti; T limfociti) limfomi, 105, 632, 643, 657 lin-3 gen, 576 lin-45 gen, 577 LINE (kratki razbacani elementi), 146147, 223225 lipidi biosinteza, 7576, 427 Golgi, metabolizam, 379380 povezivanje sa proteinima, 307309 pregledno, 4447 sinteza, 369372 skladi{te energije, 7071 u stani~noj membrani, 484485
uloga, 44 lipidne splavi, 372, 486, 492 lipidni dvosloj. vidi fosfolipidni dvosloj lipoproteini male gusto}e (LDL), 511, 512514, 516517 lipoproteini, 511 liposomi, 126 lizat, 28 lizin (Lys) (K), 51 lizogeni, ciklus, 212 lizosomi funkcija, 389394 membranski proteini, 381382 mikrofotografija, 390 nastanak, 390391, 393 organizacija, 390 proteoliza, 315317 smje{taj, 10 transport protona, 506 usmjeravanje proteina, 385 lizosomske bolesti nakupljanja, 389390, 392 LMNA gen, 340, 341 LMP1, 643 Lou Gehrigova bolest, 461
M
M faza, 592, 608615 M pruge, 448, 449 MacLeod, Colim, 93 Mad/Bub protein, 613 magnezij, 528 majmunski virus 40. vidi SV40 makrofagi fagocitoza, 510 funkcija, 15 mati~ne stanice i, 623, 624 mikrofotografija, 28 receptor manoza-6-fosfata, 386 makromolekule, 45, 42 makropinocitoza, 515 male nuklearne ribonukleoproteinske ~estice (snRNP), 268269, 271, 334335, 344 male nuklearne RNA (snRNA), 267272, 343344 mali proteini koji veù GTP 567568 , Maller, James, 602 manoza-6-fosfat, 377, 378, 381, 393 MAP-kinaze (protein-kinaze aktivirane mitogenom), 565 Markert, Clement L., 599, 600601, 619 Martin, Gail R., 622623 Martin, Steven, 645 masne kiseline, 4445, 72, 308, 427 masti. v. triacilgliceroli Masui, Yoshio, 599, 600601, 619 mati~ne stanice, 31, 127, 621625 matriks, mitohondrija, 400 matriksna-procesiraju}a-peptidaza (MPP), 404
Matthaei, Heinrich, 100 McCarty, Maclyn, 93 McClintock, Barbara, 211, 216 McKnight, Steven, 251 MCM proteini, 598599 mdr gen (gen za rezistenciju na lijekove), 506 MDR transporteri, 506 medij E. coli, 96 HeLa stanice, 32 Neurospora crassa, 93 stani~ne kulture, 16 me|ustani~ne adhezijske molekule (ICAM), 530 megabaze (Mb), 159 mejoza mitoza i, 616 oocite i, 618620 opis, 90 oplodnja i, 615621 procesi u, 615618 ulazak u, 599 meki keratini, 456 MEK-kinaze (Map-kinaze/ERK-kinaze), 566570 membrane. (v. i fosfolipidni dvosloj) ER, 362 gradijent protona, 411414 mitohondrijske, 400401, 414 mobilnost proteina, 491 potencijal, 498499 pregledno, 8085 sidrenje proteina, 82 stani~ne, 8085 translokacija proteina, 304, 403408, 406, 420 usmjerenost proteina, 363 isporuka Rab u, 388 Mendel, Gregor, 90 Messelson, Matthew, 96, 98 metaboli~ka energija fotosinteza i, 422426 mitohondriji i, 399408 pregledno, 6374 metabolizam, evolucija, 78 metafaza animalne stanice, 609 centrosomi u, 467 jezgra u, 346 kromosomi u, 153154, 617 mikrofotografija, 610 MPF i, 611613 metastaze, 632 Methanococcus jannaschii, 160 metiliranje DNA, 196, 260261 histona, 258259, 260 Metionin (Met) (M), 50, 51 metotreksat, 226 Michel, Harmut, 423 mijelomi, 360
Kazalo
707
mije{anje egzona, 144 mikrofilamenti. vidi aktinska vlakna mikroskopija svijetlog polja, 22 mikrosomi, 357, 359 mikro{iljci. v. filopodije mikrotubuli dinami~ka nestabilnost, 462 izgradnja, 462 mejoza i, 617 mikrofotografija, 610 motorni proteini, 468472 pri~vr{}ivanje kinetohora, 612 stani~na polarnost i, 467468 strukture, 462 tijekom mitoze, 155, 466467 unutarstani~na organizacija, 464 ìv~ane stanice, 468 mikrovili, 445, 446, 491 Milestein, Cesar, 360 Miller, Stanley, 5 mineralokortikoidi, 543 miofibrile, kontrakcija, 447 mioglobin, 54, 59 miozin I porodica, 446, 453 miozin II, 449, 452 miozin V, 453454, 455 miozini debela vlakna, 450 model djelovanja, 450 nemi{i}ne stanice, 451452 stani~no pokretanje i, 447 miristilna kiselina, 490 mi{, 12, 19 mi{i}i, kontrakcija, 447451 mi{i}ne distrofije, 340341, 443 Mitchell, Peter, 410, 412413 Mitchison, Tim, 463, 466 mitohondriji funkcija, 400401 geneti~ki sustav, 401403 kloroplasti i, 416417 mikrofotografija, 390 opis, 9 smje{taj, 1011 struktura, 400 translacija, 403408 transport metabolita, 414 unutra{nja membrana, 80, 414 mitoti~ko vreteno, 155, 466, 610 mitoza faze, 608611 jezgra za vrijeme, 345350 kondenzacija kromatina, 153154 kromosomi tijekom, 153, 474 mejoza i, 616 mikrofotografija, 610 mikrotubuli tijekom, 463, 466467 opis, 592 otvorena, 345, 346 zatvorena, 345, 346 Mizutani, Satoshi, 103 mjesno-specifi~na rekombinacija, 211216
mjesto pri~vr{}ivanja (engl. attachment sites) (att), 213214 MKK7, 570 mlije~na kiselina, 8 model kliù}ih vlakana, 449 model klju~a i brave, 5758, 58 model pokretnoga popre~noga mosta, 450 model teku}eg mozaika, 81, 82, 486 molekularna biologija osnove, 89136 sredi{nja dogma, 98 molekularni motori, 155, 447 molekularno kloniranje, 107108 monocistronska mRNA, 290 monociti, 14, 15 Monod, Jacques, 236 monoklonska protutijela, 120 monosaharidi, 4243 Montagnier, Luc, 105 Moore, Claire, 142143 Moore, Peter, 287 morski jeìnac, embrio, 602 morski jeìnac, spermij, 476 MPF (maturacijski promocijski faktor) Cdc2 i, 602605 deaktivacija, 613614 mejoza i, 619 metafaza i, 611613 mjesta djelovanja, 611 napredovanje stani~noga ciklusa i, 599603 otkri}e, 600601 MreB, 436 mRNA (glasni~ka RNA) 3'-kraj, 365 dorada, 264266 hekson, 142142 kod kloroplasta, 417418 monocistronska, 290 prekrajanje, 141 razgradnja, 274276 transport, 334335 uloga, 48, 9899 Mullis, Kary, 115 multifotonska ekscitacijska mikroskopija, 25 Mut proteini, 200 mutacije. vidi tako|er specifi~ne mutacije definicija, 91 karcinomi i, 201 sljedovi DNA i, 97 uno{enje u gene, 128133 mutageneza, 128129 mutageni, 180, 224 mutante osjetljive na temperaturu, 124 MutL gen, 201, 203 MutS gen, 201 Myc proteini, 654 Mycoplasma sp., 12, 160
N
Na+/K+-crpka (Na+/K+-ATPaza), 503508 N-acetilglukozamin (NAG), 377, 383, 519 N-acetilmuraminska kiselina (NAM), 519 NADH, 400, 409 NADH-dehidrogenaza, 406407 NADPH, sinteza, 424 NADP-reduktaza, 425 NAG (N-acetilglukozamini), 377, 383, 519 NAM (N-acetilmuraminska kiselina), 519 namotana tjele{ca. v. Cajalova tjele{ca nasljedni nepolipozni kolorektalni karcinom (HNPCC), 201, 203 naslje|ivanje, 9091, 93 National Institutes of Health, 170 natrij, ioni, 497508, 507 natrijski kanali, 501, 503, 561 nebulin, 448 Neher, Erwin, 497 neksin, 477 neposredni rani geni, 569 nereceptorske protein-tirozin-kinaze, 557, 571572 Nernstova jednad`ba, 498 nesmislenim-posredovana razgradnja mRNA, 274275 nesteroidni protuupalni lijekovi, 549 nestin, 455 neuroblastomi, 652 neurofilamenti (NF), proteini, 456, 461 neurofilamenti, 459 neurohormoni, 547 neuroni, (v. i aksoni) akcijski potencijal, 498 fotoreceptori, 576 funkcija, 15 mikrotubuli, 468 opti~ki ìvac, 406407 otpu{tanje neurotransmitora, 500 neuronske stani~ne adhezijske molekule (N-CAM), 529,530 neuropeptidi, 547 Neurospora crassa, 93 neurotransmitori, 500, 517, 546 neutrofili, 510 NGF (faktor rasta neurona), 547, 555, 575 577 Nicolson, Garth, 81, 486 nidogen, 527 Niedergerk, Ralph, 449 nikal-karbonil, 634, 635 nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+), 61, 67 nikotinski receptor za acetilkolin, 500 Nirenberg, Marshall, 100 nitroglicerin, 545 nitrozilacija, 312313, 545 N-miristilacija, 307308 N-myc gen, 652 Noller, Harry F., 287, 288289 Nomura, Masayasu, 285
708
Kazalo
noradrenalin, 546 Northern blot, 117 NOS (sintetaza du{ikova oksida), 545, 546 Notch signalizacija, 578579, 654 NSF/SNAP signalizacija, 389 nukleacija, aktin, 436 nukleinske kiseline biosinteza, 80 detekcija, 117119 hibridizacija, 117119 komponente, 48 pregledno, 4750 nukleoplazmin, 299, 328329 nukleosomi, 151152 nukleosomni remodeliraju}i faktori, 259 nukleotidi polimerizacija, 6,49 razgradnja, 61 sastav, 48 struktura, 48 nukleozidi, 48, 49 Nurse, Paul, 600
napredovanje kroz stani~ni ciklus, 599, 600601 u oplodnji, 620621 vodozemaca, 225226 op}i faktori transkripcije, 240243 operator, 237 operon, 237 oplodnja mejoza i, 91, 615621 metiliranje DNA i, 261 opis, 620621 opti~ki ìvac, 406407 organske molekule, 5 oru|a stani~ne biologije, 2037 otisak stopala, DNA, 233 otvoreni okvir ~itanja, 159 Oxa1, 407
P
P1 umjetni kromosomi (PAC), 111 p15 protein, 607 p16 protein, 662 p21 protein, 607, 662 p38 MAP-kinaza, 569, 570 p53 gen, 660 p53 protein, 597598, 607, 642, 662663, 668 pahiten, 615 Palade, George, 25, 356 palmitacija, 309 palmitinska kiselina, 490 papilomavirusi, 642 parakrina signalizacija, 542 Paramecium, 475, 476 paraziti, 401 parenhimske stanice, 13, 14 pasivna difuzija, 494 pasivni transport, 84 Patched protein, 578, 660 Pauling, Linus, 54, 94 PDK1, 565566, 583 pektini, 379, 520, 521 Pelger-Hutova anomalija, 340 penicilin, 518 pentoze, {e}eri, 43 peptidil-propil-izomeraza, 303 peptidna veza, 5152, 52, 78 peptidni hormoni, 546548 peptidoglikani, 518519 pericentriolarna tvar, 464465 periferni membranski proteini, 81, 486 perlekan, 526 peroksisomi funkcija, 427429 mikrofotografija, 426 nastajanje, 429430 pregledno, 426427 smje{taj, 1011 Philadelphia kromosom, 652 pigmenti, 20. vidi tako|er klorofil pinocitoza, 510
O
O6-metilgvanin, 196 obitelj ciklina, 603605 obiteljska adenomatozna polipoza, 660 obiteljska hiperkolesterolemija (FH), 512513 obrnuta genetika, 128 obrnuto prepisivanje, 100103 Odjel za energetiku, 170 Okazakijevi fragmenti, 182187 okludini, 531 oksidativna fosforilacija, 67, 408414 oksidativni metabolizam, 7,8 oksido-redukcijske reakcije, 61 olak{ana difuzija, 494496, 508 oligonukleotidi, 49, 129 oligosaharidi definicija, 42 N-vezani, 306, 377, 378 O-vezani, 307 stani~ne interakcije i, 43 vezanje selektina, 493 oligosaharil-transferaza, 367 onkogeni abl, 652 bcr, 652 c-myc, 651652 definicija, 35 erbB-2, 226 humani tumori, 648653 karcinom i, 644657, 649653 nastanak tumora, 663 produkti, 653657 ras, 572573 retrovirusni, 645646 oocite mejoza i, 615621 mitohondrijska DNA, 402
PIP2 (fosfatidil-inozitol-4,5-bisfosfat), 562 563, 565, 583, 620 pirimidini, 48 pirimidinski dimeri, 195196, 196 piruvat, 69, 401 PKN-kinaze, 575 plakini, 458 plastidi, 415, 420421 plastocijanin (PC), 425 plastokinon (PQ), 424 plazmalogeni, 427 plazmidi, 109110 plazmodezma, 532533 plektini, 458459 pluripotentne mati~ne stanice, 624 pluto, 21 PML/RARa, 655656, 666 Pneumococcus, 9394 po~etnice, fluorescentno ozna~ene, 113 podru~je koje se ne prevodi, 289, 290 poja~iva~i, 256, 247, 248 pokretni elementi, 216 polarna tijela, 618 polarni mikrotubuli, 467, 613 poli-A rep, 265266 poliadenilacija, 265 policistronska mRNA, 289290 polimerizacija aktin, 436 molekula, 5 nukleotida, 6, 49 polinukleotidi, 49, 80 poliomavirusi, 641 poliovirus, 101 polipeptidi, 5154 polipi, 634 polisaharidi biosinteza, 76 definicija, 42 Golgijev aparat, metabolizam, 379380 me|ustani~ne interakcije i, 43 razgradnja, 71 skladi{ta glukoze, 75 struktura, 44 polisomi, 297 politeni kromosomi, 164, 336 Pollard, Tom, 438 polovi diobenoga vretena, 474475 ponavljanja jednostavnih sljedova, 146 popravak izrezivanjem baza, 197201 popravak izrezivanjem nukleotida, 197, 199 popravak krivo sparenih baza, 200 popravak sklon pogrje{kama, 201202 popravak udruèn sa transkripcijom, 200201 porini, 401, 489, 496 porodica ras onkogena, 572573, 645, 649650 porodice gena, 148 Porter, Keith, 25
Kazalo
709
posredni~ki proteini, 242, 256 prehrana, aminokiseline, 77 prekrajanje, 266272 premosnica (tijesni spoj), 496, 532 pre-mRNA, 264266, 266267, 269272 prenilacija, 308 prenilacija, 308 pre-rRNA, 262, 343344 presljedovi, 403 pretpostavka DNA provirusa, 102103 pre-tRNA, 263264 prianjaju}i (adhezivni) pojas, 444, 452 prianjaju}i (adhezivni) spojevi, 444, 530, 575 prijelazni endoplazmatski retikul, 356 prijelazno stanje, 57 prijenos gena, 125128, 649 primarna struktura, 54 primarne stani~ne kulture, 33 primarne stani~ne stijenke, 521 primaza, 183 produkt, enzimski, , 56 profaza, 346, 467, 609, 616 profili genskog izraàja, 665 profilin, 439 progesteron, 543, 599, 600601 programirana stani~na smrt, 579584, 639, 656. (v. i apoptoza) prokarioti dana{nji, 89 DNA replikacija, 184 faktori translacije, 291 genom, 159161 mRNA, 289 stani~na obilje`ja, 4 strukture ribosoma, 283, 285 {aperonski proteini, 301 transkripcija u, 232239 pro-kolageni, 524 prolaktin, 547 prolin (Pro) (P), 51 prometafaza, 346, 610611 promotori, 232, 246 pronukleus, 620 proplastidi, 421, 422 prostaciklini, 548549 prostaglandini, 548549 prosteti~ke skupine, 59 proteasom, 314 proteaze, 638 protein 4.1 , 443 protein aktivator katabolizma (CAP), 253 protein koji aktivira GTPazu (GAP), 567, 650 protein koji se veè na TATA-slog (TBP), 241, 243, 244 protein-disulfid-izomeraza, 303, 367 protein-fosfataze, 311, 312, 561 proteini adaptori, 513514 proteini kliù}e stezaljke, 185186 proteini koji veù GTP 385, 388, 454, 492 ,
proteini koji veù jednolan~anu DNA, 186, 189 proteini povezani s mikrotubulima (MAP), 467, 470 proteini prijenosnici fosfolipida, 408 proteini toplinskoga {oka, 300303 proteini za stavljanje stezaljke, 185186 proteini za strukturno odràvanje kromosoma (SMC), 349, 612 proteini antibiotici i sinteza, 292 biosinteza, 7577 denaturacija, 5254 detekcija, 119123 domene, 55 ER i sekrecija, 356357 fosforilacija, 63, 559 glikozilacija, 368, 377379 kidanje, 303305 kolinearnost sa genima, 9798 kvarterna struktura, 56 pakiranje, 373 posttranslacijska translokacija, 361 pregledno, 5056 procesiranje, 298309 razgradnja, 313317, 516517 razvrstavanje u endosome, 516 razvrstavanje u kloroplastima, 418420 razvrstavanje, 380382, 407 regulacija funkcije, 309313 sekrecijski, 358359, 361 sekundarna struktura, 54 sidrenje, 489 sinteza, 283 smatanje, 298309 strukture, 5455 tercijarna struktura, 55 transport, 328332 unos u jezgru, 332334 unos u kloroplaste, 418420 unos u mitohondrije, 403408 vezanje na lipide, 307309 proteini, smatanje. vidi smatanje protein-kinaze, 311, 559560, 561, 563, 635 protein-protein interakcije, 313 protein-serin/treonin-kinaze, 312, 558, 565, 566 proteinski nosa~i, 83, 84, 495 protein-tirozin-fosfataze, 557558 protein-tirozin-kinaze, 312 proteoglikani, 526 proteoliza, 303305, 315317 proto~na citometrija, 594 protoni, 403, 506 protonske crpke, 506, 515516 protonski gradijent, 410, 411414 proto-onkogeni, 646648, 648649 protusmislene nukleinske kiseline, 130 protutijela, monoklonska, 120 provirusi, 102103 pseudogeni, 148149, 149
pseudogeni, dora|eni, 149, 223224 pseudopodia, 13, 446, 454 PTB domena (domena za vezanje fosfotirozina), 556 PTEN gen, 660 PUMA, 662 pupaju}i kvasac, v. Saccharomyces cerevisiae purini, 48 puromicin, 292
R
R7 diferencijacija, 576 Rab porodica proteina, 385, 387, 388389, 568 Rabl, C., 335 Rac, 574575 RAD geni, 198199 Rad23 protein, 199 RAD51, 211 raf gen, 645 Raf protein, 653 Raf proto-onkogen, 647 Raf-kinaze, 566570, 568569 RAG1 protein, 216 RAG2 protein, 216 rajanodinski receptori, 564 rak. (v. i tumor, karcinom) autokrina signalizacija, 542 detekcija, 664665 HIV i, 105 humani onkogeni, 646653 kemoterapija, 463 MDR transporteri, 506 molekularna biologija i , 664668 prevencija, 664665 prijenos signala i, 572573 rana dijagnoza, 664, 665 ras geni i, 647 razvoj, 633640 smrtnost od, 633 svojstva stanica, 635640 terapija, 665668 teratokarcinomi, 622623 tumor supresorski geni, 657660 uzroci, 634635 virusi i, 35 vrste, 631633 Ran proteini, 329332, 333, 568 Ras proteini, 490, 566570, 650, 653, 668 Ras/Raf/ERK put, 605606 Rausov sarkomski virus (RSV), 35, 102 103, 553555, 640, 644, 648649 ravnote`no centrifugiranje, 29 Rayment, Ivan, 450 razdvojni sljedovi, 141 razlu~ivanje (rezolucija), definicija 2122 razvrstavanje endosomsko, 515 proteina, 358, 407 Rb geni, 657660, 661 Rb protein, 606
710
Kazalo
struktura, 285 u translaciji mRNA, 283289 ribosomna RNA (rRNA) 16S, 286 dorada, 262, 343344 funkcija, 99 geni, 243 kataliti~ka uloga, 288289 kodoni kloroplasta za, 417418 organizacija jezgrica i, 339342 struktura gena, 340 transkripcija, 342344 transport, 334335 uloge, 48 riboza, 43, 48 ribozimi, 263 ribuloza-1,5-bisfosfat, 428 ribuloza-bisfosfat-karboksilaza (rubisko), 418, 428 Richardson, William D., 330 Rickettsia prowazekii, 401 rII gen, 99100 RNA interferencija (RNAi), 130131 RNA svijet, 6 RNA tumorski virusi. vidi retrovirusi RNA virusi, 100103 RNA. (v. i glasni~ka RNA, ribosomna RNA, transportna RNA) dorada, 261266 intermedijari, 220225 kodoni kloroplasta za, 417418 nekodiraju}a, 259260 po~etnice, 183184 prekrajanje, 141 razgradnja, 274276 samoumnoàvanje, 6 sinteza, 98, 232 telomeraze, 192193 ure|ivanje, 273274 RNA-DNA hibridi, 141143 RNA-polimeraze E. coli, 232 eukariotske, 239240 funkcija, 99 I, 243244 II, 241242, 604 III, 243244, 339 kloroplasta, 417418 popravak udruèn s transkripcijom i, 199, 200 struktura, 235 transkripcija sa, 234, 243244 Rnaza H, 184, 221 Rnaza P 263,287, 288 , Roberts, Bruce L., 330 Roberts, Richard, 141, 142 Rodbell, Martin, 551 rodopsin, 561562 Roeder, Robert, 240 Rothman, James, 383, 387 Rous, Peyton, 35, 644 Rsk, 584, 620
reakcija peptidil-transferaze, 287 reakcije na svjetlu, 72 reakcije u tami, 72, 422 RecA, 210211 receptor faktora rasta neurona, 553 receptor trombocitnoga faktora rasta, 553, 653, 654 receptor za tireoidni hormon, 544, 545 receptori reinoi~ne kiseline, 655, 666 receptori stani~ne povr{ine, 550558 receptori steroidnih hormona, 253 receptori T stanica, 214, 216 receptori za prepoznavanje mirisa, 561 receptori zdruèni sa G proteinima, 550552, 561562, 654 receptori, 541550, 561 receptorske protein-tirozin-kinaze, 553556, 563, 575577 recesivni geni, 90 Reclinomonas americana, 402 Reese, Thomas S., 469, 470471 regulacijski laki lanac, 452 regulacijsko sniàvanje razine receptora, 517 regulatorni sljedovi, cis-djeluju}i, 245249 rekombinacijski popravak, 202204 rekombinacijski signal (RS), 216217 rekombinantna DNA, 104117, 121123. (v. i DNA) replikacijske ra{lje, 182187 replikacijski faktor C (RFC), 185186 represori, eukariotski, 255256 reprodukcija, 89, 91 reproduktivno kloniranje, 625 restrikcijska karta, 106107 restrikcijska to~ka, 594 restrikcijske endonukleaze, 104107 ret onkogen, 664 retinoblastom, 657660 retinoi~na kiselina, 543, 544, 655656, retinoidi, sinteza, 544 retrotranspozoni, 147, 220, 222, 223, 225 retrovirusi HIV, 105 onkogeni, 644, 645646 organizacija DNA, 220 replikacija, 103, 220 RNA genomi, 36 retrovirusni vektori, 126 retrovirusu sli~ni elementi, 147 reverzne transkriptaze, 102103, 192193, 220, 222 Rho porodica proteina, 13, 37, 454, 574575 Rhodopseudomonas viridis, 423, 488 ribonukleaze (Rnaze), 5254 ribonukleinska kiselina (RNA), 48 ribonukleoproteini (RNP), 268, 334 ribosomi RNA-geni, 243 sastavljanje, 344345 smje{taj, 1011, 324
Rubin, Harry, 640 rubisko (ribuloza-bisfosfat-karboksilaza), 418, 428 Ruderman, Joan, 602 Ruv proteini, 211
S
S faza, 592, 593 Sabatini, David, 358 Saccharomyces cerevisiae cdc28 mutanta, 600601 centromere, 156 geneti~ka analiza, 123124 genom, 161162 haploidna DNA, 12 introni i, 149 kao eksperimentalni model, 16 mejoza, 615 mikrofotografija, 12, 16 putevi aktivacije MAP-kinaze, 569 regulacija stani~noga ciklusa, 594596, 599608 replikacija DNA, 189191 veli~ina, 12 Sakmann, Bert, 497 samoprekrajanje, 269, 271272 samoprekrajanje, 271, 287, 289 Sangerova metoda, 112 Sar1, 385 sarkomere, 447, 448 sarkomi, 632 satelitna DNA, 146, 157 Scc1, 613 Schatz, Gottfried, 403 Schekman, Randy, 383 Schitzosaccharomyces pombe cdc2 mutanta, 600602 centromere, 155156, 157 genom, 162 ishodi{ta replikacije, 189191 nekodiraju}a RNA u, 260 stani~ni ciklus, 595, 596 Schleiden, Matthias, 21 Schwann, Theodor, 21 SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza (SDS-PAGE), 120 sec gen, mutante, 383 Sec61, 383 Sec62/63 kompleks, 362 Sefton, Bartholomew M., 553, 554555 segregacija, geneti~ka, 90 Seitz, Thomas, 287 sekrecijske vezikule, 356 sekrecijski put, 356, 364, 380381, 385387 sekundarne stani~ne stijenke, 521 sekundarne strukture, 5455 sekurin, 613 sekvenciranje, DNA, 111113 Sela, Michael, 5253 selektini, 493, 528, 529 semikonzervativna replikacija, 9597
Kazalo
711
separaze, 613 serin (Ser) (S), 46, 51, 429 serinske proteaze, 59 serotonin, 546 sevenless mutant, 576 sfingomijelin, 45, 46, 372, 379, 484 SH2 (engl. Src homology 2) domene, 556, 571572 Sharp, Phillip A., 141, 142143, 251 Sheetz, Michael P 450, 469, 470471 ., Shine-Delgarno (SD) slijed, 290 signal za izlazak iz jezgre, 331, 333 signal za usmjeravanje u peroksisome (PTS), 430 signalizacija, stani~na, 541589 signalna hipoteza, 360361 signalna ploha, 381 signalna transdukcija citoskelet i, 571575 karcinomi i, 572573 onkogeni i, 653657 unutarstani~na, 558571 signalne-peptidaze, 304, 361 signalni sljedovi, 304, 357, 359, 366 simport, 508 sinapsa, 500, 617 sinapti~ka vezikula, 385, 517 sinaptonemni kompleks, 617 sindekan, 526 sindrom ste~ene imunodeficijencije (AIDS), 105, 644 SINE (visokoponavljaju}i kratki raspr{eni elementi), 146147, 223, 224225 Singer, Jonathan, 81, 486 sisavci kaskada MAP-kinaza, 570 stani~ne jezgre, 337 uno{enje kolesterola u stanice, 511, 513 sistemski eritematozni lupus, 268 sjen~anje metalima, 27 skeletni mi{i}i, 447 sklerenhimske stanice, 14 slobodna energija, 6466 Sm, karakterizacija, 268 Smac/Diablo protein, 582 SMAD, 558 Smad2 gen, 660, 661, 663 Smad4 gen, 660, 661, 663 smatanje enzimi i, 303 ER i, 366369 glikoproteina, 370 polipeptidnih lanaca, 5254 proteina, 298309, 303, 366369 RNaze, 5254 SMC (strukturno odràvanje kromatina) proteini, 349, 612 Smith, Alan E., 328, 330 Smith, Dennis, 599, 601 Smoothened protein, 578, 660661 smrzavanje i lomljenje, 2728, 487
SNARE pretpostavka, 387 sonde, hibridizacijske 117, 119121 sonikacija, 28 SOS, 569 Southern blot, 117, 118 sparivanje baza, 284 specifi~ni protein 1 (Sp1), 249250, 251 spektrin, 442, 488 spermij, 620621 Spo11, 615 spojni kompleksi, 531 spolna reprodukcija, 615 Spudich, James, 450 src gen, 554555, 572, 645 Src porodica kinaza, 557 Src protein, 490 Src protein-tirozin-kinaza, 554555, 571574 sr~ani mi{i}, 447 sredi{nja dogma, 98, 101 sredi{nja lamela, 533 sredi{te mikrotubularnog ustrojavanja, 463 SRP receptor, 359, 361 srpRNA, 359 Stahl, Frank, 96 stanica-stanica interakcije, 43, 493, 528533 dodirna inhibicija, 637638 komunikacija, 541589 oblici signalizacije, 542543 stanice diferencirane, 621622 dioba, 9091, 180, 466 DNA sastav, 12 evolucija, 415, 11 izbo~enja stani~ne povr{ine, 445446 izvanstani~ni matriks i, 528 kao eksperimentalni model, 1520 linije, 33 migracija, 454455 mikroskopija, 23 molekularni sastav, 4156 pokretanje, 435482 polarnost, 467468, 491, 515 signaliziranje, 541589 transformacija, 640 stani~na adhezija, molekule, 528531 stani~na kora, 442 stani~na membrana apikalno podru~je, 381 bazolateralno podru~je, 381 citoskelet kore eritrocita i, 443 ~vrsti spoj, 531 elektroporacija, 126 glikokaliks, 492493 ionski gradijent, 505 kalcijski ioni i, 562563 kaveole, 515 opis, 9 sastav, 80 smrzavanje i lomljenje, 2728
struktura, 483493 àri{ne adhezije i, 444 stani~na smrt, 558. v. i apoptoza, programirana stani~na smrt stani~ne kulture animalne stanice, 2933 mati~ne stanice, 622623 mediji, 16 stanice sisavaca, 32 transformacija stanica, 640 stani~ne membrane. vidi membrane stani~ne plo~e, 614615 stani~ne stijenke bakterijske, 518519 biljke, 519522 biljne stanice, 13 E. coli, 8 gljive, 520 izvanstani~ni matriks i, 518528 primarne, 521 sekundarne, 521 stani~ni ciklus, 591631 citokineza, 614615 DNA replikacija, 598 embrionalne stanice, 592 eukariotske stanice, 591599 faze, 592594 inhibitori napredovanja kroz, 606608 interfazna jezgra, 336 jezgra za vrijeme mitoze, 345350 kontrolne to~ke, 596598 metafaza, 154155 mitoza, 153154, 608611 napredovanje kroz, 599608 regulacija, 594596 zaustavljanje, 596598 stani~ni rast, 594596 START, 594595, 600601, 603604 STAT (engl. signal transducers and activators of transcription) proteini, 570571 Stehelin, Dominique, 648649 Steitz, Joan A., 268269 stereocilije, 445 steroidni hormoni, 47, 543545, 601 stezaljka istaknute povr{ine, 497 STI-571, 667 stratmin, 467 streptomicin, 292 stresna vlakna, vidi tla~na vlakna stroma, 415, 422 stromalne-procesiraju}e-peptidaze (SPP), 419 Su(H) transkripcijski faktor, 579 SUMO (mali ubikvitinu sli~an modifikator) 314 superporodica receptora u jezgri, 544 superporodica receptora za citokine, 557 supstrat, enzimski, 56, 5859 Sutherland, Earl, 559 SV40 T antigen, 330331, 642 SV40 poja~iva~, 247
712
Kazalo
replikacija DNA, 181 svjetlosna mikroskopija, 2125 svjetlost, 7273, 422426 SWI5, 333334
[
{aperoni, 298303, 299, 403404, 544. (v. i specifi~ni {aperoni) {aperonini, 419420 {arenilo, 20 {e}eri heksoze, 43 {e}eri, 48 {krob, 4244
T
T antigen, 328, 330331, 642, 659 T limfociti, 214, 542, 624 T4 limfociti, 105 taksol, 463 talin, 444, 454 Taq-polimeraza, 116 TATA slog, 241, 244 Tatum, Edward, 9293 tau protein, 468 tax gen, 644 TbRII gen, 660, 661 Tcf/LEF porodica, 578 Tel transkripcijski faktor, 653, 654 telofaza, 346, 349350, 609, 610, 613614 telomeraze, 191192 telomere, 157158, 158, 191192 Temin, Howard, 101103, 640 terapijsko kloniranje, 625 teratokarcinomi, 622623 tercijarna struktura, 55 terminacijski signal, 235 termoacidofili, 8 test pomaka u elektri~nom polju, 249 test àri{ta, 640 testosteron, 47, 543 tetraciklin, 292 Tetrahymena 28S rRNA, 269 histonska acetil-transferaza, 258 rRNA ribozim, 288289 samoprekrajanje, 269 telomeraze, 192 telomere, 157, 158 TFIIE, 241 TFIIH, 199, 241, 604 TFIIIA, 244 Thermus aquaticus, 115, 288 Ti plazmid, 127 Tic kompleks, 419 tijesni spoj (premosnica), 496, 532 tilakoidne membrane, 415, 416, 420, 422 423 Tim kompleksi, 403405, 407 timin (T), 48 tireoidni hormoni, 543, 544 tireotropin, 654
tirozin (Tyr) (T), 51 titin, 448 tjele{ca za prekrajanje, 267, 269270, 272 Tjian, Robert, 249, 251 tla~na (stresna) vlakna, 444, 452, 574 Toc kompleksi, 418419 Tom kompleksi, 403405, 407 Tonegawa, Susumu, 218219 topoizomeraze, 186187 torpedo raà, 500 traheide, 13 trans Golgijeva mreà, 377, 380381, 386, 393, 513514 transcitoza, 517518 trans-djeluju}i ~initelji, 238 transducini, 561562 transfekcija, 125128 transferinski receptor, 275 transformacija, geneti~ka, 93 transformiraju}i faktor rasta b (TGF-b), 558, 607, 663 transformiraju}i gen, 273 transgeni~ni mi{evi, 126127 transkripcija definicija, 98 eukarioti, 244261 kromatinske strukture i, 256259 nekodiraju}e RNA i, 259260 pozitivna kontrola, 238239 prokarioti, 231239 terminacija, 235236 transkripcijski aktivatori, 252, 254 transkripcijski faktori, 240, 250252 translacija definicija, 98 in vitro, 358359 inicijacijski signali, 290 kod bakterija, 293 mitohondrijska, 403408 mRNA, 281298 proces, 290296 regulacija, 296298 sinteza proteina i, 77 stupanj elongacije, 295 terminacija, 296 translokaze, 405 translokon, 359 transmembranski proteini, 81, 486 transmisijska elektronska mikroskopija, 26 transporter glukoze, 495 transportna RNA (tRNA) funkcija, 99 genom kloroplasta za, 417418 mitohondrijski genom, 402 obrada, 263264 razgradnja, 221 strukture, 282 transport, 334335 u prevo|enju mRNA, 282283 uloga, 48 transportne vezikule, 373, 385387
transpozaza, 216, 219 transpozicija, 216, 221225 transpozoni, 220 tranzitni peptidi, 418 treonin (Thr) (T), 51, 62 treonin-deaminaza, 6263 trepetljike, 465, 474478 triacilgliceroli, 45, 70 trihotiodistrofija, 199 trioze, {e}eri, 43 triptofan (Trp) (W), 51 trombociti, 529, 548549, 624 trombocitni faktor rasta (PDGF), 548, 555 tromboksan, 548549 tropomiozinska porodica gena, 441, 450 troponini, 451 t-SNARES, 388389 tubulini, 462465 tumori. (v. i karcinomi) definicija, 632 inicijacija, 633634 klonalnost, 633 koè, 636 nastanak, 663 onkogeni, 646 progresija, 634 promotori, 635 supresorski geni, 606, 657660, 663 virusni, 640644 tumor-supresorski geni, 606, 657660, 663 turgor, pritisak, 521
U
ubikvinon. vidi koenzim Q ubikvitin, 313314 ubikvitin-ligaza (E3), 314 ugljikohidrati, 4244, 7475 ugljikov dioksid, 8 ugljikov monoksid, 545546, ukrièno vezanje, 440, ultracentrifuga, 2829 ultravioletno svjetlo, 194195, 634 umjetni kromosom kvasca (YAC), 111, 163 uniport, 508 unutarnje prepisane razmaknice (ITS), 343 unutarstani~ni prijenos signala, 558571 upala, 15 uracil (U), 48, 100 uridin 5'-monofosfat (UMP), 48 uridin, 48 Uvr gen, 198 UvrABC-ekscinukleaza, 200 uzvojnica-okret-uzvojnica motiv, 253 uzvojnica-om~a-uzvojnica motiv, 253 uzvojnica-om~a-uzvojnica proteini, 254
V
vakuole, 9, 1011, 382 Vale, Ronald D., 469, 470471 valin (Val) (V), 51
Kazalo
713
Van Leeuwenhoek, Antony, 21 vanjske prepisane razmaknice (ETS), 343 Varmus, Harold E., 647, 648649 Vassar, Robert, 460461 VDJ rekombinacija, 214217 vektori bakulovirusa, 115 vektori bakteriofaga P1, 111 bakulovirus, 115 kloniranje u, 109 kozmidi, 111 za DNA kloniranje, 111 Venter, J. Craig, 159, 169, 170171 vezanost, gena, 92 vezikularni transport, 382389 vezikule obloène klatrinom, 386387, 511 vezikule, 387388, 472473 vezivno tkivo, 15 videokamerom poja~ana mikroskopija, 469 videokamerom unaprije|ena diferencijalna interferencijskokontrastna mikroskopija, 23 vilin, 446 vimentin, 456 vinblastin, 463 vinkristin, 463 vinkulin, 444, 454 virus humane imunodeficijencije (HIV), 105, 644 virus mozai~ne bolesti duhana, 101 virus pti~je leukoze (ALV), 645 virusi animalni, 3637 genom, 106107 kultura, 3437
onkogeni, 645646 pretpostavka provirusa DNA, 102103 RNA, 100103 stimulacija tumora, 635 strukture, 34 tumorski, 640644 virusni genom, 141 visoko-energijske veze, 65 vitamin D3, 543, 544 vlaknasti (F) aktin, 436437 voda, svojstva, 4142 vode}i lanac, 182183 Vogelstein, Bert, 663 Vogt, Peter K., 645, 648649 Volvox, 13 vrpca 3, 488 vrpca 4.1, 488
Xist, 260 X-kromosom vezane bolesti, 340341 X-kromosom, inaktivacija, 260 XPB proteini, 241 XPD proteini, 241
Y
Yanofsky, Charles, 97
Z
Zamecnik, Paul, 282 zametne stanice, 615 zaostaju}i lanac, 182183 zaustavni slijed, 363, 365, 367 zavr{na mreà, 446 Zea mays (kukuruz), 12 zeatin, 550 zebrasta riba, 12, 1920, 20 zeleni fluorescentni protein (GFP), 23 Zellwegerov sindrom, 430 zigote, 620 zigoten stadij, 615 Zimniak, Ludwika, 288289 zlo}udni tumori, 632 Z-plo~a, 448, 449 zra~enje,195, 634
W
Wallace, Douglas, 406 Walsh, Donal, 559 Watson, James, 94, 170, 180 Wee1 protein-kinaza, 604 Weinberg, Robert, 649 Western blot, 120 White, Frederick H., 5253 Wilimsov tumor, 660 Wilkins, Maurice, 94 Wnt put, 577578, 654 WT1 gen, 661
@
àri{na adhezija, 444, 454, 527 ìv~ane stanice. vidi neuroni
X
Xenopus laevis, 19 Xenopus oocite, 341 Xeroderma pigmentosum (XP), 199
O autorima
GEOFFREY M. COOPER je profesor i predstojnik Zavoda za biologiju Sveu~ili{ta u Bostonu. Magistrirao je 1969. godine na Massachusetts institutu za tehnologiju, a obranio doktorat iz podru~ja biokemije 1973. godine na Sveu~ili{tu Miami. Poslijedoktorski rad nastavio je na Sveu~ili{tu Wisconsin u timu Howarda Temina gdje je razvio esej za prijenos gena kako bi odredio provirusnu DNA virusa Rausova sarkoma i njemu srodnih retrovirusa. Dr. Cooper se tijekom 1975. godine pridruìo Dana-Farber institutu za tumore i Medicinskom fakultetu Har vard, gdje je nastavio svoj istraìva~ki rad na identifikaciji humanih tumorskih onkogena. Od svog premje{taja na Bostonsko sveu~ili{te 1998. godine, nastavio je istraìva~ki rad i sudjelovao u velikom pove}anju obima sveu~ili{nog programa za znanosti o ìvotu. Sada{nja istraìvanja Dr. Coopera usmjerena su ka razumijevanju uloge onkogenih proteina u signalnim putovima koji reguliraju stani~nu proliferaciju, diferencijaciju i programiranu stani~nu smrt. Objavio je vi{e od stotinu istraìva~kih ~lanaka u znanstvenim ~asopisima kao {to su Science, Nature i Cell, a 1984. godine je primio US Steel Award Nacionalne akademije znanosti Sjedinjenih Ameri~kih Dràva za identifikaciju i karakterizaciju stani~nih onkogena. Dr. Cooper je autor dvaju ud`benika o tumorima, Elements of Human Cancer i Oncogenes, kao i The Cancer Book, napisane za {iru javnost. Uz Raylu Greenberg Temin i Billa Sugdena bio je urednik komemorativnog izdanja The DNA Provirus: Howard Temins Scientific Legacy. ROBERT E. HAUSMAN je profesor i direktor za poslijediplomske studije Zavoda za biologiju Sveu~ili{ta u Bostonu. Po obrani doktorata iz biolo{kih znanosti 1971. godine na Northwestern sveu~ili{tu, nastavio je poslijedoktorski rad sa Aronom Mosconaom na Sveu~ili{tu Chicago, gdje je istraìvao me|ustani~ne interakcije tijekom ranog embrionalnog razvoja i karakterizirao jednu od prvih molekula stani~ne adhezije. Profesorom Bostonskog sveu~ili{ta postao je 1978. godine, pro{iruju}i svoja istraìvanja me|udjelovanja stani~ne povr{ine na razvoj mi{i}a i regulaciju ekspresije gena me|ustani~nim dodirima u razvoju ìv~anog sustava. Dr. Hausman je predavao dodiplomsku stani~nu biologiju i nekoliko poslijediplomskih predmeta o razvoju na Bostonskom sveu~ili{tu, a trenutno dr. Cooper i dr. Hausman zajedno predaju stani~nu biologiju. Njegov je istraìva~ki rad sada usmjeren na razumijevanje kako interakcije me|u stanicama, i interakcije stanica sa izvanstani~nim matriksom djeluju na diferencijaciju i morfogenezu.
O knjizi (u engleskom izdanju)

Glavni urednik: Andrew D. Sinauer Urednik projekta: Chelsea D. Holabird Izvedbeni urednik: Christopher Small Izvedba knjige: Janice Holabird Ilustracije: Dragonfly Media Group Istraìva~ke fotografije: David McIntyre Dizajn knjige: Jefferson Johnson Dizajn korica: Joan Gemme Izbor boja: Burt Russell Litho Izdavanje knjige i korica: Courier Companies, Inc.
Geoffrey M. Cooper i Robert E. Hausman / STANICA MOLEKULARNI PRISTUP
Izdava~ MEDICINSKA NAKLADA 10000 ZAGREB, Vla{ka 69
Za izdava~a AN\A RAI^, prof.
Urednica AN\A RAI^
Lektura AN\A RAI^ JASENKA LESNIK GA[PI]
Korektorica JASENKA LESNIK GA[PI]
Slog i prijelom
Tisak: ZRINSKI d. d. âkovec, listopad 2004.

Cooper - Stanica, 3. Izdanje

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Cooper - Stanica, 3. Izdanje

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UD@BENICI SVEU^ILI[TA U OSIJEKU, RIJECI, SPLITU I ZAGREBU

MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB

Stru~ni urednik hrvatskoga izdanja: prof. dr. sc. GORDAN LAUC

GEOFFREY M. COOPER ROBERT E. HAUSMAN

MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB, 2004.

Pregledno o stanicama i istra`ivanju stanica 3 Stani~na kemija 41 Osnove molekularne biologije 89

Dio II. Protok geneti~kih informacija

Dio III. Struktura i funkcija stanice 321

Dio IV. Stani~na regulacija 539

Kultura animalnih stanica 32

BIOSINTEZA STANI^NIH SASTOJAKA 74

Membranski lipidi 80 Membranski proteini 81 Transport kroz stani~ne membrane 82

STANICE KAO EKSPERIMENTALNI MODELI 15

SREDI[NJA ULOGA ENZIMA KAO BIOLO[KIH KATALIZATORA 56

ORU\A STANI^NE BIOLOGIJE

EKSPRESIJA GENETI^KE INFORMACIJE 96

FUNKCIJA EUKARIOTSKIH GENA 123

DETEKCIJA NUKLEINSKIH KISELINA I PROTEINA 117

Protok geneti~kih informacija

Modeli homologne rekombinacije 207 Enzimi uklju~eni u homolognu rekombinaciju 209

imunoglobulinskih gena 218

KROMOSOMI I KROMATIN 150

debeloga crijeva i popravak DNA 203

SLJEDOVI ^ITAVIH GENOMA 158

REKOMBINACIJA IZME\U HOMOLOGNIH SLJEDOVA DNA 204

EUKARIOTSKE RNA-POLIMERAZE I TRANSKRIPCIJSKI FAKTORI 239

SMATANJE I DORADA PROTEINA 298

REGULACIJA TRANSKRIPCIJE U EUKARIOTA 244

REGULACIJA FUNKCIJE PROTEINA 309

RAZGRADNJA PROTEINA 313

ribosomne RNA 288

i sinteza proteina 292

DORADA I PROMET RNA 261

Struktura i funkcija stanice

jezgrinih lokalizacijskih signala 330

jezgrinih lamina 340

JEZGRA ZA VRIJEME MITOZE 345

MEHANIZAM OKSIDATIVNE FOSFORILACIJE 408

AKTIN, MIOZIN I STANI^NO KRETANJE 447

KLOROPLASTI I OSTALI PLASTIDI 415

INTERMEDIJARNA VLAKNA 455

MEHANIZAM VEZIKULARNOGA TRANSPORTA 382

Funkcije peroksisoma 427 Nastajanje peroksisoma 429

MIKROTUBULARNI MOTORI I KRETANJA 468

keratina uzrokuje nenormalan razvitak ko`e 460

PITANJA 480 LITERATURA 481

Stani~ne stijenke biljnih stanica 519 Izvanstani~ni matriks 522

ME\USTANI^NE INTERAKCIJE 528

TRANSPORT MALIH MOLEKULA 493

STANI^NA STIJENKA I IZVANSTANI^NI MATRIKS

Bakterijska stani~na stijenka 518

PRIJENOS SIGNALA I CITOSKELET 571

SIGNALIZACIJA U RAZVOJU I DIFERENCIAJACIJI 575

DJELOVANJE STANI^NIH POVR[INSKIH RECEPTORA 550

REGULACIJA PROGRAMIRANE STANI^NE SMRTI 579

REGULATORI NAPREDOVANJA KROZ STANI^NI CIKLUS 599

PUTEVI UNUTARSTANI^NOGA PRIJENOSA SIGNALA 558

Prijenos signala i onkogen ras 572

TUMORSKI SUPRESORSKI GENI 657

Proces mejoze 615 Regulacija mejoze oocita 618 Oplodnja 620

MATI^NE STANICE I ODR@AVANJE ODRASLOGA TKIVA 621

PRIMJENA MOLEKULARNE BIOLOGIJE U SPRJE^AVANJU I LIJE^ENJU RAKA 664

TUMORSKI VIRUSI 640

mati~nih stanica 622