Kloniranje gena preko lanane polimerazne reakcije

ukovi Katarina M426/10 PCR (Polymerase Chain Reaction Lanana reakcija polimeraze) predstavlja jedno od najznaajnijih otkria na polju molekularne biologije u poslednjih 20 godina. U osnovi PCR metode je in vitro amplifikacija definisane DNK i predstavlja imitaciju procesa replikacije DNK koja se normalno odvija u svim ivim biima. Principi izvoenja PCR metode Osnovni princip PCR metode je selektivna amplifikacija jedne eljene sekvence DNK molekula gen ili deo gena milion do milijardu puta bez prethodnog izolovanja iz mase DNK molekula. Takva sekvenca se zove ciljna sekvenca. Proces izvoenja se moe podeliti u 3 koraka: izolacija DNK ili RNK iz uzorka i priprema PCR smee, zatim PCR reakcija, i na kraju identifikacija PCR produkta. Izolacija DNK ili RNK molekula iz uzorka i priprema PCR smee Najpre je potrebno izvriti izolovanje molekula DNK ili RNK iz uzorka koji sadri ciljne sekvence. Bioloki materijal koji se koristi moe biti bilo koje tkivo ili elija (periferna krv, bris bukalne sluznice, likvor...). Pre izolovanja vri se preiavanje i koncentrovanje elija. Najee koriene metode su ekstrakcija fenolhloroformom i kisela ekstrakcija koje omoguavaju da istoa, homogenost i sadraj DNK budu optimalni. Posle izolovanja DNK potrebno je pripremiti PCR reakcionu smeu, koja je volumena od 5 do 100L i sadri: DNK uzorak - matrica koja se kopira, prajmere oligonukleotide komplementarne krajevima sekvence koja se kopira, gradivne blokove nukleotidi (dNTP), taq polimerazu koja katalizuje ugradnju nukleotida, jone Mg2+ koji su neophodni za aktivnost polimeraze i sintezu DNK, pufer i dejonizovanu sterilnu vodu. Kritian korak u sintezi DNK je izbor prajmera. Prajmeri, dva oligonuleotida, su neophodni za otpoinjanje sinteze DNK. Pri odabiru prajmera treba voditi rauna o tome da 3 krajevi ne budu meusobno komplementarni da ne bi dolo do meusobne hibridizacije i tada bi nastao prajmer dajmer artefakt koji se na agaraznom gelu detektuje kao nespecifina traka. Prajmeri u optimalno dizajniranoj PCR reakciji su duine 18-22 nukleotida sa balansiranim GC sastavom i temperaturom topljenja u granicama 5565C. Taq polimeraza je termostabilna DNK polimeraza, izolovana iz Archaea Thermus aquaticus i optimalna temperatura za njenu aktivnost je 72-75C. Joni Mg 2+ se vezuju za nukleotide koji se jedino u ovakvoj formi mogu ugraditi u rastui lanac tokom elongacije. Pufer odrava pH 7 sredinu u smei.

PCR reakcija PCR reakcija se izvodi u mikrotubi zapremine 0.2 ml gde se u PCR mainama podvrgava brzim, preciznim i ciklinim promenama temperature od 25-40 ponovljenih ciklusa sinteze DNK. Proces izvoenja reakcije je podloan kontaminaciji spoljanjim DNK lancima pa je neophodno preduzeti odreene korake kao to je noenje rukavica pri radu. Jedan ciklus PCR reakcije ine faza termalne denaturacije DNK, faza hibridizacije prajmera i faza elongacije. U fazi denaturacije se raskidaju vodonine veze izmeu dva DNK lanca i izvodi se inkubacijom PCR smee na 95C. Hibridizacija prajmera sa matricom predstavlja uspostavljanje vodoninih veza izmeu prajmera koji se vezuje svojim 5 krajem za ciljnu sekvencu na odgovarajuem DNK lancu, i gde oni predstavljaju graninike koji definiu sekvencu koja se kopira. U fazi elongacije enzim sintetie komplementaran lanac za svaki lanac ciljne sekvence koristei slobodne nukleotide iz smee. Sinteza se vri u pravcu 3-5 i to od mesta gde se nalazi prajmer u jednom smeru na jednom lancu i u drugom smeru na drugom lancu DNK. Optimalna temperatura za termostabilnu Taq polimerazu je 72C. Pre otpoinjanja prvog ciklusa PCR reakcije, PCR smee se inkubiraju 5 minuta na 95C da bi se izvrila inicijalna denaturacija molekula DNK matrice. Na kraju prvog ciklusa dobijaju se 2 parcijalno duplirana lanca DNK koja sadre ciljnu sekvencu, ali i dodatnu DNK. Na kraju drugog ciklusa formiraju se 4 parcijalno duplirana lanca DNK dok se na kraju treeg ciklusa dobijaju 2 molekula DNK koji sadre samo ciljnu sekvencu i 6 molekula DNK koja sadre i dodatu DNK. Tokom daljih ciklusa broj molekula DNK sa ciljnom sekvencom raste eksponencijalno jer svaki novosintetisani lanac u sledeem ciklusu slui kao matrica za sintezu DNK. Nakon 30 ciklusa kao konani produkt PCR reakcije dobija se preko milijardu istih ciljnih sekvenci. Nakon poslednjeg ciklusa vri se inkubacija 5-15 min na 72C kako bi dolo do kompletiranja parcijalno elongiranih produkata i ovaj korak se naziva finalna elongacija, posle ega se smea spremna za analizu. Identifikacija PCR produkata Posle PCR reakcije vri se identifikacija amplifikovanog produkta procesom elektroforeze na agaroznom ili na poliamidakrilnom gelu. Prilikom pripreme gela odreuje se njegova gustina, odnosno veliina pora (bunaria), od ije veliine zavisi razdvajanje molekula DNK razliitih duina. Pripljemljeni gel se potapa u kadicu za elektroforezu u kojoj se nalazi odgovarajui pufer. Uzorci koji se analiziraju prvo se pomeaju sa puferom za nalivanje uzoraka, koji poveava gustinu uzorka, boje uzorak i omoguavaju praenje elektorforeze. Zatim se uzorci sipaju u bunarie na gelu i ukljuuje se struja odgovarajueg konstantnog intenziteta. Pored uzoraka, u posebne bunarie, nalivaju se i pozitivna i negativna kontrola i tzv. DNK markeri (lenjiri) koji predstavljaju iseene sekvence DNK poznatih duina (broja baznih parova). Poreenjem brzine kretanja molekula DNK koji ispitujemo sa brzinom kretanja DNK poznatih duina, elektroforezom procenjujemo veliinu DNK ciljne sekvence koja je predmet identifikacije, to nam govori da li je ciljna sekvenca prisutna u ispitivanom uzorku ili ne.