Real-Time PCR metod (RQ-PCR)

Real-Time PCR metoda podrazumeva detekciju PCR amplifikacije tokom rane faze reakcije. Merenje kinetike reakcije u ranoj fazi PCR amplifikacije, predstavlja veoma veliku prednost RQ-PCR u odnosu na tradicionalnu PCR detekciju (kojom se detektuje PCRamplifikacija u zavrnoj fazi,pomou agaroznih gelova). Tokom amplifikacije PCR produkata moemo razlikovati 3 faze: Eksponencijalna faza (tokom ove faze u svakom ciklusu koliina DNK se duplo uveava. Amplifikacija se u ovoj fazi najbre deava. Sama reakcija je u ovoj fazi visoko specifina i precizna) Linarna faza (amplifikacija se usporava, troe se komponente reakcionog sistema, mogua je i degradacija produkata) Plato (reakcija se zaustavlja, nema amplifikacije i stvaranja novih DNK produkata, dok je degradacija produkata sve vea)

Plato Linearna f. naphase Exponencijalna f. phase

Broj ciklusa
Rezultati dobijeni detekcijom PCR produkata pomou agaroznih gelova (tradicionalnom PCR metodom), nisu dovoljno pouzdani zbog toga to se

detekcija vri u zavrnoj fazi (nakon platoa), kada je ve istroen veliki deo reakcionih komponenata sistema i kada je veliki deo nastalih PCR produkata zahvaen degradacionim procesima. RQ-PCR metodom detekcija PCR amplifikacije vri se u eksponencijalnoj fazi, u kojoj se amplifikacija najbre deava, a reakcija je u ovoj fazi visoko specifina i precizna Takoe, RQ-PCR pouzdaniji je od tradicionalnog PCR-a jer omoguava detekciju razlike u amplifikaciji ispitivanih uzoraka od samo 2X, dok obian PCR detektuje razliku u amplifikaciji tek ako je ona 50X ili vea. Teoretski postoji kvantitativni odnos izmeu startne koliine ciljnog uzorka i koliine PCR produkta koji nastaje u odreenom broju ciklusa tj. ako je koliina ciljnog uzorka koji se ubacuje u reakciju VEA, to e se i na odreenom broju ciklusa pojaviti vei broj kopija datog uzorka (ne mora reakcija da dostigne plato da bi detekcija bila pouzdana, ak naprotiv...). Tako da se detekcija putem RQPCR-a vri na nekom od ciklusa, koji su sastavni deo eksponencijalne faze, a podrazumeva detekciju fluorescencije, emitovane od strane fluorescentne probe, koja se koristi kao sistem za detekciju. THRESHOLD je vrednost koja se zadaje RQ-PCR aparatu, kao nivo fluorescencije koju treba da detektuje za pojedinaan uzorak (UVEK se postavlja u EKSPONENCIJALNOJ fazi) UZORCI se meusobno razlikuju po BROJU CIKLUSA AMPLIFIKACIJE koji im je potreban da dostignu zadatu vrednost fluorescencije, a to je Ct VREDNOST (to je VEA poetna koliina nekog gena u uzorku, to mu je potrebno MANJE CIKLUSA da dostigne zadatu fluorescenciju tj. MANJA JE Ct VREDNOST)

Ct vrednost Rn Threshold

Baseline

Broj ciklusa

Fluorescentne probe koje se koriste za detekciju amplifikacije u RQ-PCR sistemu

1. SYBR Green boja nakon vezivanja za dvolananu DNK, emituje karakteristian fluorescentni signal, koji se detektuje pomou RQ-PCR aparata. Kako broj dvolananih amplikona raste u svakom ciklusu, tako se i fluorescentni signal SYBR Green boje pojaava. SYBR Green boja vezuje se za dvolananu DNK i emituje se fluorescencija, dok u fazi denaturacije (kada je DNK jednolanana) SYBR Green boja pliva slobodno i nema emisije fluorescencije.

2. Molekularni svetionik (Molecular beacon) je kratak segment jednolanane DNK. Sekvenca svakog molekularnog svetionika mora biti takva da omoguava detekciju PCR produkta od interesa. Kako je prikazano na slici (dole) 9 baza na jednom kraju strukture formira bazne parove sa 9 baza na drugom kraju strukture molekularnog svetionika. Tako da u slobodnom stanju molekularni svetionik ima oblik ukosnice, sa petljom izgraenom od baza, koje su komplementarne jednom od lanaca ciljne DNK iz uzorka.

Za jedan kraj molekularnog svetionika prikaena je reporterska fluorescentna boja (R- reporter), a za drugi kraj boja priguiva (Q- quencher). Kada molekularni svetionik nije vezan ta DNK (ve je prisutan u formi ukosnice) svaka fluorescencija emitovana od strane reporterske boje, apsorbuje se priguivakom bojom, tako da nema detekcije fluorescencije. Nakon denaturacije PCR produkata odvaja se dvolanana struktura DNK, a takoe, dolazi do denaturacije molekularnog svetionika i naruava se forma ukosnice. U narednoj fazi, na neto nioj temperaturi dolazi do anilovanja prajmera, a molekularni svetionik u svom denaturisanom stanju formirae bazne parove sa komplementarnim lancem PCR produkta. Svaki molekularni svetionik koji se nije vezao za PCR produkt formirae strukturu ukosnice, te nee odavati fluorescenciju. Dok svaki molekularni svetionik koji se vezao za PCR produkt odaje fluorescenciju, zbog toga to se reporterska i priguivaka boja nalaze na veoj udaljenosti, tako da priguivaka boja ne moe da blokira fluorescenciju emitovanu od strane reporterske boje. Na ovaj nain kako se akumuliraju PCR produkti, tako dolazi do linearnog poveanja fluorescencije.

RQ-PCR moe se izvesti i u multiplex formatu, to znai da vie od jednog PCR produkta moe biti detektovano u pojedinanoj reakcionoj tubici. Za svaku sekvencu postoji jedinstvena fluorescentna boja, te se stoga svaki PCR produkt asociran sa sopstvenom bojom moe detektovati pomou RQ-PCR maine. 3. TaqMan proba slino molekularnom svetioniku na svojim krajevima ima prikaenu reportersku i priguivaku boju.

Kada je TaqMan proba slobodna ili vezana za DNK molekul, prigusivacka boja blokira emisiju fluorescencije sa reporterske boje. Reporterska boja vezana je za 5' kraj TaqMan probe, dok je priguivaka boja vezana za 3' kraj. Nakon denaturacije DNK (na visokoj temperaturi) u fazi hlaenja kada se za DNK matricu aniluju prajmeri, dolazi do vezivanja i TaqMan probe za specifian region na DNK (jedna TaqMan proba po jednom molekulu DNK matrice).

Nakon toga u fazi u kojoj Taq polimeraza dodaje nukleotide (3'-5' polimeraznom aktivnou), istovremeno dolazi i do uklanjanja TaqMan probe sa DNK matrice (5'-3' egzonukleaznom aktivnou). Ovim procesom udaljava se priguiva od reportera i emituje se fluorescencija od strane reporterske boje (jer se priguivaka boja vie ne nalazi na odgovarajuoj udaljenosti od reportera i nema blokade emisije).

RQ-PCR kvantifikacija Moe biti: Apsolutna (kada se odreuje taan poetni broj kopija tj. tana koncentracija DNK) i Relativna (kada se na uzorak od interesa poredi sa nekim drugim uzorkom)

APSOLUTNA kvantifikacija podrazumeva formiranje standardne krive, korienjem standarda poznate koncentracije DNK. Standardna kriva je oblika y=ax+b, gde je a-nagib krive tj. slope. Nagib krive (a) je dobar pokazatelj efikasnosti PCR-a i pipetiranja. Idealan nagib je oko -3.3 Standardna kriva pokazuje zavisnost Ct vrednosti od log broja kopija, te se za nepoznati uzorak, na osnovu njegove Ct vrednosti (koja se oitava automatski) moe odrediti logaritamski broj kopija.

Ct

Log broj kopija

RELATIVNA kvantifikacija ne meri tanu koncentraciju DNK naeg uzorka, ve poveanje ili smanjenje koje se izraava u odnosu na neki drugi uzorak (relativno). Ovo je tzv. Komparativni Ct metod. Relativna kvantifikacija uvek podrazumeva postojanje endogene kontrole i kalibratora.

Endogena kontrola je normalizator koliine DNK u uzorku, to je uvek neki gen koji se ekspresuje u svim elijama ( RS-16, actin i sl.). Kalibrator je uzorak u odnosu na koji se poredi (u sluaju kada imamo uzorke gena iz eksperimentalnih grupa, koje su na neki nain tretirane, to je uvek kontrolna- netretirana grupa). Relativna kvantifikacija podrazumeva najpre poreenje Ct vrednosti target gena (i uzoraka i kalibratora) sa endogenom kontrolom (to je tzv. normalizacija target gena): Ct= Ct target gena Ct endog. Kontrole Nakon toga poredi se Ct uzorka sa Ct kalibratora tj: Ct=Ct uzorka - Ct kalibratora Sva ova poreenja radi sam softver, a na nama je samo analiza rezultata.

SNP (Single Nucleotide Polymorphisam)

Polimorfizam koji potie od razlike u jednom jedinom nukleotidu, izmeu dve alelne forme moe se dektovati korienjem RQ-PCR metode. U tu svrhu obino se koriste 2 TaqMan probe koje se razlikuju u jednoj bazi od interesa i obeleene su razliitim bojama, te emitutju razliitu fluorescenciju. Ukoliko aparat detektuje jednu boju prisutan je jedan alel; ukoliko detektuje drugu boju prisutan je drugi alel; dok detekcija smee ovih boja oznaava prisustvo heterozigota. Metoda je znaajna za detekciju mononukleotidnih mutacija.