ODREIVANJE

KATEHOLAMINA U URINU

2 UVOD
Kateholamini adrenalin, noradrenalin i dopamin sintetiu se iz L-fenilalanina ili L- 3,4
dihidroksifenilalanina i igraju centralnu ulogu u organizmu kao hormoni i neurotransmiteri.

Tyrosine

3-Methoxytyramine
DOPA
Homovanillic acid
3,4-Dihydroxyphenyl acetic acid
Dopamine

Normetanephrine
Noradrenaline
Vanillylmandelic acid
3,4-Dihydroxymandelic acid
Adrenaline

Metanephrine

Sl. 1

Metabolizam kateholamina

Odreivanje nivoa kateholamina u plazmi, urinu i tkivima ima kliniki znaaj u dijagnostici
feohromocitoma i nekih drugih tumora nervnog sistema (2-5). Ova oboljenja karakterie viestruko
poveana proizvodnja kateholamina u odgovarajuim tkivima, to dovodi do poveanja njihove
koncentracije u cirkulaciji i izluivanja kateholamina urinom. Koncentracija kateholamina u urinu i plazmi
moe biti viestruko iznad gornjeg referentnog nivoa (6). Poeljno je da se skrining tumora koji produkuju
kateholamine obavi kvantitativnim odreivanjem 24-asovne ekskrecije kateholamina urinom. Za
lokalizaciju tumora ili u farmakolokim funkcionalnim testovima neophodno je odreivanje njihovog nivoa
u plazmi (3, 7). Kvantitativno odreivanje sadraja kateholamina u urinu i plazmi nije samo vajno za
diferencijalnu dijagnostiku hipertenzije ve i za brojne klinike i farmakoloke aspekte. Koncentracija
noradrenalina i adrenalina je znaajan pokazatelj aktivnosti simpatikog nervnog sistema (8,9) i predstavlja
znaajan pokazatelj zastojne srane induficijencije, oboljenja sranih krvnih sudova, eerne bolesti,
atersokleroze, akutne astme itd (10-18). Sa naunoistraivakog aspekta odreivanje nivoa kateholamina
daje korisne informacije u oblasti ispitivanja stresa i u sportskoj medicini (19-22). Brzi razvoj tene

hromatografije (HPLC) sa elektrohemijskom detekcijom nudi pouzdanu i brzu metodu za odreivanje

kateholamina. Pomou kompleta kateholamini adrenalin, noradrenalin i dopamin se ekstrahuju iz urina
pomou jonoizmenjivake kolone pre HPLC analize. Priprema uzoraka je jednostavna, jer nije potrebno
podeavanje pH vrednosti urina. Pored toga, priprema uzoraka zahteva samo dva korak ispiranja pomou
vode. Izabrana HPLC kolona u kombinaciji sa mobilnom fazom, optimiovanom za odvajanje estica,
omoguava tanu i pouzdanu hromatografsku kvantifikaciju. Uz Chromsystem HPLC komplet jedna osoba
moe dnevno da analizira do 100 uzoraka plazme dnevno. Analitika metoda daje brze i pouzdane rezultate.

3 Teorija elektrohemijske detekcije

3.1 Opti princip

Najea tehnika elektrohemijskog merenja u tenoj hromatografiji je amperometrija pri konstantnom
radnom potencijalu. Konvencionalni amperometrijski detektori koriste tro - elektrodnu eliju koja se
sastoji od radne elektrode, referentne elektrode i pomone elektrode. Potencijal koji je potreban za
reakcije oksidacije ili redukcije (potencijal polarizacije) se primenjuje izmeu referentne elektrode
(obino Ag/ AgCl) i radne elektrode. Pomona elektroda
slui za odravanje potencijala i za spreavanje protoka struje na
referentnoj elektrodi.
Elektrohemijski aktivna supstanca koja prolazi kroz eliju detektora
bie oksidisana ili
redukovana. Bilo koja od ove dve transformacije ove supstance dovodi do smanjenja ili poveanja
broja elektrona; merni instrument detektuje rezultirajuu struju, koja se amplifikuje i pojavljuje na
displeju kao hromatografski signal. Poto je samo ogranieni broj funkcionalnih grupa i hemijskih
struktura podloan redoks procesima (oksidaciji ili redukciji) pri odreenom radnom potencijalu,
elektrohemijska detekcija se odlikuje ne samo visokom osetljivou ve i visokom selektivnou.

3.2 Uticaj radnog potencijala na elektrohemijsku detekciju

Izbor odgovarajueg radnog potencijala je izuzetno vana za selektivnost analize. To znai, da bi
idealno trebalo odabrati radni potencijal koji obezbeuje maksimalni signal detekcije za eljenu
supstancu, ali pri kome se ne detektuje ni jedna od drugih supstanci koje bi se mogle umeati u proces
(supstanci koje su obino takoe prisutne u matrici uzorka). Odnos izmeu signala detektora i
potencijala na radnoj elektrodi je prikazan na slici 2 .

Slika 2 Korelacija izmeu radnog potencijala i signala detektora

Pri potencijalu ispod P1 ne dobija se dovoljno energije za elektrohemijsku transformaciju molekula na
povrini radne elektrode. Podizanjem potencijala na P2 poveava se dostupna energija tako da se ve
sada proporcionalno znaajan broj molekula koji dolaze do radne elektrode konvertuje. Daljim
podizanjem potencijala do P3, obezbeuje se dovoljno energije za transformaciju svih molekula koji
dou u kontakt sa radnom elektrodom. Daljim poveavanjem potencijala ne postie se pojaavanje
signala detektora. Jaina signala sada zavisi samo od koncentracije same supstance (difuzijom
kontrolisani plato). Poto, po dostizanju platoa nije mogue dalje pojaavanje signala, nije potrebno
vriti merenja iznad potencijala P3. Ustvari, pri viim potencijalima izgubila bi se selektivnost, jer, to
je vea energija, to je vei i broj supstanci koje e se elektrohemijski transformisati.

3.3 Optimizacija radnog potencijala

Iskustvo pokazuje da se kriva-pokazatelj signala/radnog potencijala (videti sliku 2) za datu supstancu
razlikuje od detektora do detektora. To je zbog in jenice da referentni sistemi (referentne elektrode) u
razliitim detektorima nisu potpuno identini pa tako odaju i razliite referentne potencijale. To znai
da optimalni radni potencijal za neki HPLC sistem sa elektrohemijskom detekcijom mora biti odreen
empirijski, ubrizgavanjem standardne meavine pri razliitim radnim potencijalima. Za optimizaciju
kateholaminske analize koristi se maksimalna vrednost internog standardnog dihidroksibenzilamina
(DHBA) u vodenom kalibracionom standardu (porudbinabr. 5003), jer njegova elektrohemijska
transformacija zahteva najvii radni potencijal.
Preporuuje se sledea jednostavna procedura (videti sliku 3):
1. Podesite radni potencijal na +360 mV i ubrizgajte kalibracioni standard (porudbina5003).
Utvrdite najviu zonu ili pik za DHBA.
2. Poveajte radni potencijal za 40 mV. Ubrizgajte kalibracioni standard (porudbina5003).
Utvrdite najviu zonu ili pik za DHBA.
3. Ukoliko se najvia zona/pik povea za vie 15% , onda ponovite postupak iz take 2..
Ukoliko se najvia zona/pik ne promeni znaajnije, onda smanjite potencijal za 40
mV.
Optimalni radni potencijal koji se ovim metodom obino utvrdi je +400 to +500 mV (naspram. Ag/
AgCl referentne elektrode) i na njega ne utie redovno odravanje me rne elije (na pr., zamena KCl
rastvora, aktiviranje radne elektrode). Ipak, posle veih intervencija na mernoj eliji (na pr. zamene
referentne elektrode) potrebno je ponovo izvriti optimizaciju radnog potencijala.

Slika 3. Optimizacija radnog potencijala

4 HPLC sistem
Panja: Pre korienja reagensa, molimo vas da prouite informacije o rizicima u poglavlju 10

4.1 Instalacija i putanje u rad

Prikljuite analitiku kolonu, u pravcu protoka, na HPLC pumpu. Dozvolite da priblino 20 ml
mobilne faze proe kroz kolona brzinom od 1 ml/min. Zatim prikljuite kapilarnu cev sa izlaza kolone
na ulaz elije detektora. Podesite brzinu protoka na odgovarajuu vrednost hromatografske separacije,
obino 0.8- 1.3 ml/min.
Napomena:
Neznatne varijacije u vremenu retencije mogu se kompenzovati adekvatnim podeavanjem brzine
protoka. Novi HPLC kolona e moda inicijalno zahtevati veu brzinu protoka. Sa starou kolonaa
brzina protoka se mora smanjiti na priblino 0.8 ml/min kako bi se postigla ispravna vremena
retencije.
im se uspostavi ravnotea sistema a struja bude ispod 3.0 nA, moe se pristupiti recirkulaciji
mobilne faze. Za ispiranje igle za ubrizgavanje preporuuje se rastvor - meavina destilovane
vode i 5% metanola . Detaljne informacije za uputanje pojedinih komponenti vaeg HPLC sistema
moete nai u odgovarajuem uputstvu za upotrebu.

4.2 HPLC parametri

Detektor:
Za elektrohemijsku detekciju kateholamina odaberite radni potencijal koji odgovara utvrenoj
vrednosti platoa (videti odeljak 3.2). Za detekciju kateholamima i DHBA (interni standard) taj
potencijal e obino biti 400 -500 mV (naspram Ag/AgCI kao referentne elektrode). Po uspostavljanju
ravnotee, struja u sistemu za detekciju ne bi smela da prelazi 3 nA.
Hromatografska separacija :
Podesite brzinu protoka na 0.8- 1.3 ml/min. Povratni pritisak na koloni ne bi trebalo da pree 3000 psi
(priblino 200 bar). Separacija se moe sprovesti na sobnoj temperaturi, ali bi ta temperatura trebalo
da bude to konstantnija. Varijacije temperature (i konsekventne varijacije vremena zadravanja)
mogu se izbei korienjem termostatiranjemi kolone. Nije neophodno izvriti degasifikaciju mobilne
faze pre upotrebe. Mobilna faza moe da se koristi u reimu recirkulacije kada je sistem u ravnotei.
Napomena:
Degasacija mobilne faze umanjuje organski sadraj eluenta. To menja hromatografsku separaciju
kateholamina i vodi ka uoljivom poveanju retencionog vremena.
Vremena retencije:
(pri brzini protoka od 1 ml/min)
Noradrenalin:
Adrenalin:
Interni standard (DHBA):
Dopamin:

priblino 5,5 min

priblino 7,0 min
priblino 11,0 min
priblino 17,0 min

Ukupno vreme trajanja analize je oko 20 minuta. Varijacija retencionog vremena: 10 %

Provera efikasnosti separacije:

Za praenje efikasnosti separacije sistema preporuuje se vrenje test analize pre same analize
uzoraka plazme. Za ovu spiku se ponavlja ubrizgavanje odreenog dela (alikvota) kalibracionog
standarda. Integracione parametre (na pr. markere poetka i kraja pika) moete podesiti na osnovu
hromatograma koje ste na ovaj nain dobili.

4.3 HPLC kolona

HPLC kolona za analizu kateholamina se isporuuje uravnoteena i testirana, odnosno spremna za
upotrebu. Ne sme se ispirati bilo kakvim rastvorom. Povratni pritisak nove kolone pri brzini
protoka od 1.0 ml/min je oko 55 bara (800 psi) i moe da poraste usled korienja i/ili starosti. Sve
dok su separacije zadovoljavajue, eventualni povieni povratni pritisak ne stvara nikakve posledice,
ali ipak ne bi trebalo da pree 200 bara (3000 psi).

4.4 uvanje i odravanje HPLC sistema

4.4.1 Pumpa i cevovod
Analitiki rad u rasponu osetljivosti koji zahtevaju ove analize zahteva izuzetnu istou svih
komponenti. Zbog toga je potrebno da koristite iskljuivo reagense i rastvarae odgovarajueg stepena
istoe. Posebno kod elektrohemijske detekcije, ak i najmanji tragovi elektrohemijski aktivnih
supstanci mogu dovesti do znaajnog poveanja prateih ili dodatnih pikova.
U veini sluajeva, problemi elektrohemijske detekcije nastaju kao rezultat kontaminacije
HPLC sistema. Po pravilu, preporuuje se pre-oksidaciona pasivizacija HPLC sistema
azotnom kiselinom jednom u 3-4 meseca (zavisno od proputene koliine uzorka).
Postupak pasivizacije:
Pre same pasivizacije potrebno je odvojiti HPLC kolona od elektrohemijskog detektora.Takoe je
potrebno izvriti pasivizaciju kapilarne cevi koja vodi od analitike kolone do elije detektora;
jednostavno je integriite u kapilarni sistem putem spajanja. Pre ispiranja azotnom kiselinom, pufer za
uravnoteenje se mora isprati vodom (priblino 20ml). Zatim se 15 - 20 % azotna kiselina upumpava
kroz kapilarnu cev i sistem za ubrizgavanje po brzini protoka od 1 -2 ml/min., tokom 20 minuta.
Jedinica za ubrizgavanje bi trebalo da izvri postupak ubrizgavanja nekoliko puta: Kod korienja
runih sistema za ubrizgavanje prebacite sa LOAD (puni) na INJECT (ubrizgavaj) najmanje 10 puta.
Kada koristite automatski sempler napunite boice za uzorak 15-20% azotnom kiselinom i ubrizgajte
to veu koliinu.
Po izvrenoj pasivizaciji, isperite azotnu kiselinu iz sistema ultraistom vodom, tako to ete ponovo
aktivirati, i to nekoliko puta, postupak ubrizgavanja. pH vrednost izlazne vode za ispiranje mora da
dostigne pH vrednost ulazne vode pre nego to se sistem ponovo ne uravnotei sa mobilnom fazom.

4.4.2 Radna elektroda {"Aktivacija"}

Previe duga upotreba ovog elektrohemijskog detektora moe dovesti do kontaminacije aktivne
povrine radne elektrode, to e smanjiti njenu osetljivost. Za ponovno uspostavljanje osetljivosti
radne elektrode od staklastog ugljenika preporuuje se tretman hrom -sumpornom kiselinom.

Panja!
Nosite sigurnosne naoare i budite izuzetno paljivi u radu sa koncentrovanim kiselinama. Proverite
da elektroda bude sasvim suva pre nego to zaponete postupak ienja.

Postupak:
(Samo za elektrohemijske detektore Chromsystems, Pharmacia ili Waters)
1. Izvadite radnu elektrodu iz elije za analizu. Budite paljivi sa elektrodom, dodirujte je samo
po ivicama.
2. Stavite elektrodu na ravnu povrinu.
3. Koristei pipetu, kapnite jednu kap hrom-sumporne kiseline na povrinu elektrode. Na ovaj
nain nakvasite samo povrinu elektrode od staklastog ugljenika (crni sredinji deo elektrode).
Saekajte 5 minuta.
Dobro isperite elektrodu ultraistom vodom.
Vratite elektrodu u eliju za analizu, ponovo uravnotete sistem.

4.4.3 Referentna elektroda

(Samo za elektrohemijske detektore Chromsystems, Pharmacia ili Waters)
Tokom vremena, joni iz rastvora elektrolita (3 mol/I KCl) difuzuju se kroz dijafragmu u mobilnu fazu,
pomerajui pri tom vrednost potencijala referentne elektrode navie. Kako bi se zadrao potencijal
koji je definisan za odreeni referentni sistem, neophodno je dopunjavati referentnu elektrodu
najmanje jednom nedeljno 3 M KCl rastvorom. Pazite da u referentnoj elektrodi ne ostanu nikakvi
vazduni mehurii. Beli Teflon adapter fiksira referentnu elektrodu u eliji za analizu. Porozna
staklena dijafragma na dnu adaptera kontrolie difuziju jonova izmeu mobilne faze i referentne
elektrode. Soli koje se kristaliu unutar elije mogu da prouzrokuju naprsline na dijafragmi, to e
dovesti do curenja izmeu eluenta i unutranje strane referentne elektrode.
Ukoliko se Ag/AgCl-elektroda koristi due vremena, kristali AgCl se mogu nataloiti stvarajui tamni
sloj na dijafragmi. Ovakav AgCl talog na dijafragmi dovodi do poremeaja izbalansiranosti
referentnog sistema. Podeeni radni potencijal nee moi da se odrava na konstantnom nivou. Da bi
ste ovo spreili, zamenitie adapter elektrode ili pokuajte da oistite dijafragmu 25% amonijakom
(ostavite Teflonski adapter u 25% amonijaku preko noi a zatim dobro isperite vodom).

4.4.4 Izbei pulsiranje pumpe

Elektrohemijska detekcija se zasniva na elektrohemijskoj reakciji analita na povrini radne elektrode.
Brzina reakcije u mnogome zavisi od brzine kojom se analiti transportuju do elektrode. Pulsiranja
pumpe izazivaju neravnomernost protoka eluenta kroz protonu eliju, to dovodi do nepravilne
brzine reakcije analita na povrini elektrode i time do veoma nestabilnog osnovnog oitavanja. Za
merenja visoke osteljivosti preporuuje se korienje priguivaa pulsiranja.

4.4.5 Prekid rada

Ukoliko se analize nee vriti u periodu kraem od nedelju dana, preprouuje se da instalisan i
uravnoteen HPLC sistem ostane da radi. Brzina unutranje cirkulacije mobilne faze se moe smanjiti
(0,2 ml/min.).
Za due periode van upotrebe, preporuuje se sledei postupak prekida rada:
Paljivo iskljuite i zapeatite HPLC kolona. Nije potrebno ispirati kolona niti mu dodavati bilo
kakvu vrstu konzervansa. Kolona ostavite u mobilnoj fazi..
2. Prebacite prekida elektrohemijskog detektora na stand-by.
3. Isperite HPLC sistem sa priblino 50ml meavine vode i metanola (1: 1)
4. Izvadite i radnu i referentnu elektrodu iz detektora, isperite ih vodom i uvajte ih na suvom
mestu do sledee upotrebe. Oznaite aktivnu stranu radne elektrode.

5 Priprema uzorka
Panja: Pri korienju reagensa, molimo vas da uzmete u obzir informacije o opasnim supstancama
u poglavlju 10.

5. 1 Prikupljanje i uvanje uzoraka plazme

Za analizu se normalno se koriste urini od 24 h. Ukoliko je to teko izvesti ili uopte nije mogue,
mogu se analizirati i spontani uzorci. U tom sluaju podaci bi trebalo da se odnose na kreatinin iz
urina. Urin od 24h se prikupljaju odgovarajuim posudama kontejnerima koji sadre 10 ml 25%
HCL. Tretiran na ovaj nain, urin ostaje stabilan najmanje 5 dana na temperaturi od +2 to +8 "C. Za
due dranje, alikvote 24h urina treba zamrznuti na -20 0C.

5.2 Rekonstituisanje kalibracionog standarda za urin

Kalibracioni standard (porudbina-nalog Br.. 6009) se vezuje za referentne supstance koje su kupljene
od ovlaenih dobavljaa. Po izvrenoj rekonstituciji, kalibracioni standard se podvrgava celokupnom
postupku pripreme uzorka, analogno uzorcima pacijenata. Tako pripremljen standard se koristi za
kalibraciju HPLC sistema.
Da biste ponovo uspostavili kalibracioni standard liofilizovanog urina, pipetom dodajte tano 10,0 ml
destilisane vode u boicu. Ostavite boicu da stoji na sobnoj temperaturi oko 10 - 15 min, povremeno
lagano protresite dok se sastav boice potpuno ne rastvori. Izbegavajte direktno izlaganje sunevoj
svetlosti! Stvarne koncentracije zavise od sastava same isporuke i mogu se nai u uputstvu koje se
isporuuje uz standard.

Oprez:
Svi davaoci krvi koji su dali krv za plazmu za izradu kalibracionog standarda plazme su testirani i
potvreno ne-reaktivni na povrinske antigene Hepatitisa B , antigene Hepatitisa C i antitela HIV
1+2. Poto ne postoji test kojim se moe dati apsolutna garancija da proizvod koji sadri materijale
ljudskog porekla ne sadri nikakve infektivne agense, trebalo bi uvek uzeti u obzir rizik od mogue
kontaminacije. Ovaj proizvod takoe moe sadrati i druge materijale ljudskog porekla za koje ne
postoje potvreni testovi. Proizvode koji sadre materijale ljudskog porekla treba smatrati
potencijalno zaraznim. Zbog toga u radu sa ovim materijalom treba primeniti mere opreza kao i u
radu sa potencijalno zaraznim uzorcima uzetim od pacijenata).
Rok trajanja rekonstituisanog kalibracionog standarda:
Rekonstituisani kalibracioni standard moe se uvati do 2 dana ukoliko se dri vrsto zapeaen, na
tamnom i hladnom mestu (+2 do +8 0C). Za due periode uvanja (do 2 meseca), alikvotujte i
zamrznite (- 20 C).

5.3 Rekonstitucija kontrola

Kontrolni uzorci urina za normalni raspon (nalog br. 0040) i patoloki raspon (nalog br. 0050) podleu
celokupnoj pripremi uzorka, analogno uzorcima pacijenata. Pripremljene kontrole su ukljuene u
svaku seriju analiza kako bi se pratila tanost i preciznost unutar sistema. Da biste rekonstituisali
liofilizovane kontrole urina, pipetom dodajte tano 8,0 ml destilisane vode u boicu. Ostavite boicu
da stoji na sobnoj temperaturi oko 10 - 15 min, povremeno lagano protresite dok se sastav boice
potpuno ne rastvori. Izbegavajte direktno izlaganje sunevoj svetlosti! Stvarne koncentracije zavise od
sastava same isporuke i mogu se nai u uputstvu koje se isporuuje uz kontrole.

Oprez:
Svi davaoci krvi koji su dali krv za plazmu za izradu kalibracionog standarda plazme su testirani i
potvreno ne-reaktivni na povrinske antigene Hepatitisa B , antigene Hepatitisa C i antitela HIV
1+2. Poto ne postoji test kojim se moe dati apsolutna garancija da proizvod koji sadri materijale
ljudskog porekla ne sadri nikakve infektivne agense, trebalo bi uvek uzeti u obzir rizik od mogue
kontaminacije. Ovaj proizvod takoe moe sadrati i druge materijale ljudskog porekla za koje ne
postoje potvreni testovi. Proizvode koji sadre materijale ljudskog porekla treba smatrati
potencijalno zaraznim. Zbog toga u radu sa ovim materijalom treba primeniti mere opreza kao i u
radu sa potencijalno zaraznim uzorcima uzetim od pacijenata).
Rok trajanja rekonstituisanih kontrola urina:
Rekonstituisane kontrole urina mogu se uvati do 5 dana ukoliko se dre vrsto zapeaene, na
tamnom i hladnom mestu(+2 do +8 "C). Za due periode uvanja, (do 3 meseca) alikvotujte i
zamrznite (- 20 C).

5.4 Postupak pripreme uzorka

Stabilizacija i prethodno razblaivanje uzoraka urina:
Prebacite 3 ml urina u odgovarajuu boicu i dodajte 100 l rastvora internog standarda. Zatim
razblaite sa 6 ml pufera za neutralizaciju i dodajte 2 N NaOH dok uta boja ne pree u zelenu ili
sivkasto zelenu (slika 4); kod veoma kiselih urina moe se upotrebiti koncentrovaniji NaOH. Zelena
boja je indikacija da je pH vrednost pravilno podeena za potrebe ekstrakcije koja sledi. Ukoliko ova
meavina poprimi purpurnu boju, pH vrednost je previe bazna i treba je umanjiti paljivim
dodavanjem 2 N HCL dok se ne dobije zelena boja.

Po dodavanju pufera za
neutralizaciju jako kiselo

pH korektan

pH previe bazna

Slika 4: Podeavanje pH razblaenog uzorka

Trebalo bi izbei viestruko menjanje pH vrednosti (kiselo- bazno i obrnuto), jer to moe dovesti
do gubitka u povraanju usled poveanog nagomilavanja soli.
Ekstrakcija uzorka sa kolonama za ienje uzoraka:
Kratko protresite (promrdajte) i obeleite kolonu za pripremu uzorka za svaki uzorak. Uklonite
poklopac kolone i odsecite zaptivku. Dozvolite da pufer za uravnoteavanje sasvim istekne. Nanesite
ceo razblaeni uzorak urina u pripremljenu kolonu za ienje uzorka.
Uklonite efluent (ostatak). Isperite kolonu za pripremu uzorka sa destilovanom vodom u koliini koja
odgovara zapremini dve kolone (Napunite kolonu za pripremu uzorka destilovanom vodom do gornje
ivice levka i dozvolite da voda potpuno proe; ponovite ovaj postupak jo jednom). Uklonite efluent.

Eluacija :
Stavite kolonu za pripremu uzorka u odgovarajue obeleenu test epruvetu, dodajte 6 ml pufera za
eluaciju i prikupite eluat.
Zakiselite eluat sa 180 l 5 M HCL (30 I 5 M HCL po mililitru eluata).
Ubrizgajte 20 l eluata u HPLC sistem.

5.5 Postupak pripreme uzorka - kratak pregled

Stabilizacija i prethodno razblaivanje uzoraka urina:
3 ml urina (uzorak pacijenta, kontrola, kalibrator urina)
+ 100 l rastvora internog standarda
+ 6 ml pufera za neutralizaciju
Dodajte 2 N NaOH dok uta boja ne pree u zelenu ili sivo-zelenu
Ukoliko ova meavina poprimi purpurnu boju, pH vrednost je previe bazna i treba je umanjiti
paljivim dodavanjem 2 N HCl dok se ne dobije zelena boja.
Ekstrakcija:
Nanesite ceo razblaeni uzorak urina u pripremljenu kolonu za ienje uzorka.
Uklonite efluent (ostatak). Napunite kolonu za pripremu uzorka destilovanom vodom do gornje ivice
levka i dozvolite da voda potpuno proe; ponovite ovaj postupak jo jednom. Uklonite efluent.
Eluacija:
Dodajte 6 ml pufera za eluaciju i prikupite eluat.
HPLC analiza:
Proverite stopu protoka, integracioni metod i osnovnu liniju. Zakiselite eluat sa 180 l 5 M HCl (30 I
5 M HCl po mililitru eluata).
Ubrizgajte 20 l eluata
Molimo Vas da imate na umu:
Kalibracioni standard porudbeni nalog Br. 6003 se ubrizgava direktno u HPLC sistem, bez prethodne
pripreme uzorka!

5.6 Rok upotrebe pripremljenih uzoraka

Kateholamini (u puferu za eluaciju) su stabilni do 48h na temperaturi +2 do +8 0C. Za due dranje,
uzorke treba zamrznuti na -20C.

6 Dobijanje i evaluacija podataka

6.1 Kalibracija sistema za analizu podataka
Pre zapoinjanja kvantitativne analize uzoraka pacijenata, preporuuje se kalibracija hromatograma sa
svim supstancama od interesa. Da biste ovo uinili, ponavljajte ubrizgavanje vodenog standarda za
kalibraciju, dok dva sukcesivna hromatograma ne pokau praktino identina vremena zadravanja,
pik rezolucije i najvie take. Ovi hromatogrami se mogu upotrebiti za pravilno podeavanje
integracionih parametara. Hromatogram poslednjeg test ubrizgavanja se koristi za badarenje sistema
za analizu podataka (PC softver, integrator). Unesite vremena retencije koja ste dobili kao i
koncentracije kalibracionog standarda u tabelu za analizu:
a) Korienje standarda vodene kalibracije (porudbenica nalog br. 5003):
Ova meavina za kalibraciju se direktno (bez pripreme uzorka) ubrizgava u HPLC sistem.
Analit
Noradrenalin
Adrenalin
Interni standard (DHBA)
Dopamin

Vreme retencije
(priblino min.)
4,5
5,5
8,3
13,5

Koncentracija*
(g/l)
25
5
1
100

Ova meavina za kalibraciju se direktno (bez pripreme uzorka) ubrizgava u HPLC sistem.
b)Korienje kalibracionog standarda urina (porudbina br. 6009):
Analit
Noradrenalin
Adrenalin
Interni standard (DHBA)
Dopamin

Vreme retencije (priblino

min.)
4,5
5,5
8,3
13,5

Koncentracija*
(ng/l ili pmol/l)
Videti list sa informacijama
-"1
Videti list sa informacijama

Standard kalibracije urina se podvrgava celokupnoj pripremi uzorka, analogno uzorcima pacijenata.
Koncentracije pojedinih analita zavise od isporuke i mogu se nai u informacionom listu koji se
isporuuje uz standard.
Da biste obezbedili da ne doe do izmena bilo u kalibracionim ili HPLC uslovima (vremena retencije,
itd.), trebalo bi da ubrizgavate alikvot kalibracionog standarda tokom i na kraju serije analiza.

6.2 Kvantitativna evaluacija sa internim standardom

Upotreba internog standarda omoguava kompenzaciju eventualnih gubitaka tokom pripreme
uzorka. Svakoj vrsti uzorka se dodaje poznata koliina internog standarda (kalibracioni
standard, kontrole, uzorci pacijenata). PC ili integrator dobija odgovarajui pik (za analizu
kateholamina pik Br. 3 sa hromatograma kalibracionog standarda) iz procesa kalibracije kao
interni standard.
Sastav vodenog kalibracionog standarda (porudbina nalog br. 6003):
Noradrenalin:
Adrenalin:
Dopamin:
Interni standard (DHBA):

25 ng/ml
5 ng/ml
100 n/ml
50 ng/ml

(25 g/l)
( 5 g/l)
(100 g/l)
(50 g/l)

Koncentracija internog standarda:

Dihidroksi-benzilamin (DHBA)
1,5 ng/l
100 l rastvora internog standarda (1,5 ng/l) dodati na 3 ml urina. Konana koncentracija
internog standarda u uzorku je onda 50 ng/ml (50l). Poto je to identino sa kalibracionim
standardom, koncentracija internog standarda u svim uzorcima se moe uneti kao "1".
Kada koristite kalibracioni standard za urin (porudbina br. 6009), dodaje se ista
koliina internog standarda kalibracionom standardu kao i uzorcima pacijenata. Zato se
koncentracija internog standarda moe uneti kao "1" u svim uzorcima. I kalibracioni i
interni standard se mogu pronai prema referentnim supstancama kupljenim od
ovlaenog dobavljaa.
Izraunavanje kreatinin-referentnih vrednosti (u g/g kreatinina):
Podelite vrednost koncentracije (u g /l) sa koncentracijom kreatinina u urinu (u g/l).
Izraunavanje 24h uzorka (u g):
Pomnoite utvrenu koncentraciju (u g/l) sa zapreminom urina (u l).

6.3 Runa kalkulacija

Za rune proraune su potrebni sledei pikovi ili maksimumi:

Pik ili maksimum supstance A u hromatogramu uzorka. = AUzorak

Pik ili maksimum supstance A u hromatogramu kalibracionog standarda = AStandard
Pik ili maksimum internog standarda u hromatogramu uzorka = ISUzorak
Pik ili maksimum internog standarda u hromatogramu kalibracionog standarda = ISStandard

Koncentracija CAnalita, uzorak u uzorku se zatim izraunava na sledei nain:

CAnalit, Uzorak (ng/l) =

AUzorak x ISStandard
------------------------------------------------ x Faktor
AStandard x ISUzorak

7 Kontrola kvaliteta

Preciznost i tanost analiza se moe pratiti ukljuivanjem dodatnih kontrola pri svakoj analizi.
(Kontrole Chromsystems, porudbina nalog br. 0040, 0050). Ukoliko analiza ovih kontrola da
vrednosti koje su van raspona datog na prateem informacionom listu, sistem se mora proveriti, i
ukoliko je to neophodno, re-kalibrisati.

8 Referentni rasponi
Noradrenalin:
Adrenalin:
Dopamin:

do 570 nmol/24 h
do 150 nmol/24h
do 3240 nmol/24 h

(do 97 g/24 h)
(do 27 g/24 h)
(do 500 g/24 h)

Uzeto iz: l. Thomas, labor und Diagnose, 5. Edition, TH-Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main
(2000)

9 Faktori konverzije

g/l nmol/l Noradrenalin:

Adrenalin:
Dopamin:

x 5.9102
x 5.4585
x 6.5274

Nmol/l g/l Noradrenalin: x 0.1692

Adrenalin:
x 0.1832
Dopamin:
x 0.1532

10 Informacije o opasnim supstancama

Sledee informacije se moraju uzeti u obzir i moraju se preduzeti odgovarajue sigurnosne mere.
Propisi u pogledu bezbednosti se mogu nai u odnosnim dokumentima o bezbednosti dati h materijala.
Ovi dokumenti se mogu dobiti na zahtev.
Proizvod
Mobilna faza

ifra
Xn (tetan)

11 Skladitenje i rok trajanja reagenasa

Neotvarani reagensi mogu da traju do datuma navedenog na etiketi, pod uslovom da se pridravate
uslova dranja koji su takoe naznaeni na etiketi.
Uslovi skladitenja reagenasa:
Proizvod

Mobilna faza
Kalibracioni standard
Kalibracioni standard urina
Interni standard
Pufer za neutralizaciju
Pufer za eluaciju
Kolone za ienje uzorka
Kontrole urina, nivo I i nivo II
Mobilna faza

Skladitenje

Ambijentalna temperatura
+2 do +8C
<- 18 C
+2 do +8C
Ambijentalna temperatura
Ambijentalna temperatura
Ambijentalna temperatura
+2 do +8 C
Ambijentalna temperatura

Reagensi moraju biti pravilno zatvoreni i stavljeni u skladini prostor odmah posle upotrebe. Ukoliko
nita drugo nije posebno navedeno, rok trajanja reagenasa iznosi do godinu dana po otvaranju, ali ne
ukoliko bi to znailo prekoraenje datuma navedenog na etiketi kao rok trajanja. Za kalibracioni
standard plazme i kontrole pogedati poglavlja 5.2 i 5.3.

12 Uklanjanje otpadnih materijala

Mobilna faza sadri organske rastvarae i mora se uklanjati kao otpadni materijal bez halogenih
materija u skladu sa lokalnim propisima.

13 Primeri hromatograma

13.1 Hromatogram kalibracionog standarda (porudbina nalog br 5003)

13.2 Hromatogram QC (kontrole kvaliteta) plazme (normalni raspon)

14 Validacija
Linearnost i limit kvantifikacije
Ovaj metod omoguava odreivanje noradre nalina, adrenalina i dopamina u rasponu koncentracije
od 3 do 1.000 g/l
Limit kvantifikacije 3 g/l
Rikaveri:
Analitika regeneracija je odreena na osnovu pada kalibracionih krivih spajkovanihuzoraka
urina i razblaenih rastvora standarda
Noradrenalin:
Adrenalin:
Dopamin:
Interni standard (DHBA):

81%
69%
73%
79%

Analitika regeneracija korigovana za regeneraciju internog standarda je bila (3 odreivanja):

Noradrenalin:
Adrenalin:
Dopamin:

103 %
87 %
92 %

Preciznost testiranja unutar uzorka:

Utvrivanje unutranje preciznosti testova je izvreno viestrukim ienjem i utvrivanjem
koncentracija noradrenalina, adrenalina i dopamina u prikupljenom urinu.
Prikupljeni urin: normalni raspon

Noradrenalin
Adrenalin
Dopamin

Koeficijent varijacije / %
(koncentracija g/l)
N=10
1,5 (70,1)
1,5 (15,2)
4,9 (219,1)

Preciznost testiranja razliitih uzoraka :

Utvrivanje unutranje preciznosti testova je izvreno viestrukim ienjem i utvrivanjem
koncentracija kateholamina u prikupljenom urinu u 10 razliitih serija testova.
Prikupljeni urin: normalni raspon

Noradrenalin
Adrenalin
Dopamin

Koeficijent varijacije / %
(koncentracija g/l)
N=10
1,6 (68,4)
4,9 (16,3)
6,0 (222,1)

15 REAVANJE PROBLEMA
Problem
Nestabilna osnovna
linija

Osnovna linija
fluktuira ritmiki

Mogui uzroci
HPLC sistem je kontaminiran
elektrohemijski aktivnim
supstancama

Predloeno reenje
Pasivizirajte pumpu,
kapilarne cevi i sistem za
ubrizgavanje azotnom
kiselinom

Naprsline na dijafragmi

Zamenite teflonski adapter

Naslage na dijafragmi referentnog

sistema
Oteen zaptiva na pumpi HPLC
sistema

Oistite dijafragmu 25%

amonijakom ili je zamenite
Proverite da li pumpa curi, i
popravite ako je potrebno

Povrina radne elektrode je

kontaminirana

Oistite (aktivirajte) radnu

elektrodu

Oteenje unutranjeg zida elije

detektora

Zamenite eliju ili je

servisirajte

elija detektora curi

Proverite da li elija curi,

paljivo zategnite vijak ili
zamenite zaptivnu masku

Vazduni mehurii u pumpi

Osnovna linija
odstupa

Sistem jo nije uravnoteen

Ambijentalna temperatura se menja

Jaka pozadinska struja

Sistem je kontaminiran
elektrohemijski aktivnim
supstancama

Proverite pumpu, uklonite

vazdune mehurie iz sistema
Recirkuliite mobilnu fazu
dui period vremena
Obezbedite konstantnu
ambijentalnu temperaturu,
termostatirajte kolonu,
ukoliko se esto pojavljuju
velike temperaturne
varijacije.
Pasivizirajte pumpu,
kapilarne cevi i sistem za
ubrizgavanje azotnom
kiselinom

Mobilna faza je kontaminirana

Zamenite sveom mobilnom

fazom

HPLC kolona kontaminiran

Zamenite kolona

Povrina radne elektrode je

kontaminirana

Oistite (aktivirajte) radnu

elektrodu

Problem
Gubitak osetljivosti
detektora, signal gubitka

Artefakt dostie pik u

hromatogramu

Mogui uzroci
Povrina radne elektrode je
kontaminirana

Predloeno reenje
Oistite (aktivirajte) radnu
elektrodu

Radni potencijal je pao

Proverite potencijal izmeu

radne i referentne elektrode; ako
je previe nizak servisirajte
referentnu elektrodu
Isperite sistem za ubrizgavanje
vodom, a zatim izopropanolom;
da biste oistili rune
ubrizgivae, esto prebacujte
ventile tokom faze ispiranja. Za
ispiranje autosamplera
aktivirajte nekoliko puta proces
ubrizgavanja, sledite detaljna
uputstva za ienje iz uputstva
za rukovanje autosamplerom

Sistem za ubrizgavanje je kontaminiran

pric za ubrizgavanje kontaminiran

Sistem je kontaminiran elektrohemijski

aktivnim supstancama

Dobro isperite pric

izopropanolom i vodom; ako je
potrebno isperite 15-20%
isperite, kratko, azotnom
kiselinom
Pasivizirajte pumpu, kapilarne
cevi i sistem za ubrizgavanje
azotnom kiselinom

Kolona je kontaminirana
Neodgovarajui zaptivni materijal
sistema za ubrizgavanje

Promena retencionog
vremena

Promene sobne temperature

Nepravilna brzina protoka

Dupli pikovi

mrtva zapremina (naslaga) u ulazu

kolone

Zameniti kolonu
Zaptivke rotora u ventilima za
ubrizgavanje su obino
nainjene od Vespel-a i mogu
da se natope tokom vremena, te
da prouzrokuju pikove
artefakta. U principu treba
koristiti zaptivke rotora od
Tefzel-a.
Obezbedite konstantnu
ambijentalnu temperaturu za
kolonu; termostatirajte kolona.
Izmerite brzinu protoka.
Ukoliko je protok neregularan,
proverite da u sistemu nema
vazdunih mehuria; ako je
potrebno,zovite strunu pomo
servisa
Napunite pakovanje kolonaa na
ulazu stacionarnom fazom;
ukoliko je neophodno, zamenite
kolona

Naprsline u leitu kolone

Zamenite kolona

mrtva zapremina u sistemu za

ubrizgavanje

Proverite leite prstena sistema

za ubrizgavanje; proverite
rupice u zaptivci rotora

Problem
Stvaraju se pikovi koji
prethode ili dolaze
posle regularnih
pikova
iroki pikovi, sa
repovima
Visok povratni
pritisak

Mogui uzroci
Mrtva zapremina u koloni

Kapacitet kolona je istroen

Predloeno reenje
Proverite punjenje kolone na
ulazu; proverite da li
kapilarne spojnice ispravno
naleu.
Zamenite kolonu

Nagomilavanje estica u analitikoj

koloni ili pred-koloni

Zamenite kolonu ili predkolonu

Opstrukcija sistema za ubrizgavanje

Isperite sistem za
ubrizgavanje vodom, zatim
izopropanolom a zatim
ponovo vodom

16 Literature
1. Cooper JR., Bloom RH., The Biochemical Basis of Neuropharmacology, 5th Edition New
York, Oxford University Press (1986).
2. Wisser H., Knoll E., Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie, Schattauer
Verlag Stuttgart (Hsrg. H. Greiling und AM Gressner) (1987).
3. Bravo EL., Gifford RW., Pheochromocytoma: Diagnosis, Localization and
Management; N. Engl. J. Med. 311:1298-1303 (1984).
4. Bravo EL., The Clinical Value of Catecholamine Measurement, Laboratory
Management (June 1982).
5. Proye., C., Fossati, P., Fontaine, P., Lefebvre, J., Decoulx, M., Wemeau, J. L., Dewailly, D.,
Rwamasirabo, E., Cecat, P.; Dopamine-secreting pheochromocytoma: an unrecognized
entity? Classification of pheochromocytomas according to their type of secretion, Surgery
6, 1154-1162 (1986).
6. Thomas L., Labor und Diagnose. 5.th edition, TH-Books Verlagsgesellschaft,
Frankfurt/Main (2000).
7. Ratge D., Baumgardt G., Knoll E., Wisser H., Plasma free and conjugated catecholamines
in diagnosis and localisation of pheochromocytoma, Clin. Chem. Acta 132:229-243
(1983).
8. Grobecker, H., Saavedra, J.M. Dominiak, P.; Catecholamines in experimental and essential
hypertension. In: The Heart in Hypertension, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New
York, 109-121 (1981).
9. P. Hjemdahl, Plasma catecholamines as markers for sympathoadrenal activity in man, Acta
Physiol Scand. 1984, Suppl. 527:7-9.
10. Christensen NJ., Catecholamines and Diabetes Mellitus, Diabetologia 16:211 (1979).
11. Lake CR., Sternberg DE., Van Kammen DP., Ballenger JC., Ziegler MG., Post RM.,
Kopin IJ., Bunney WE., Schizophrenia: Elevated Cerebrospinal Fluid Norepinephrine,
Science 207:311 (1980).
12. Borg S., Kvande H., Sedvall G., Central Norepinephrine Metabolism During Alcohol
Intoxication in Addicts and Healthy Volunteers, Science 213:1135 (1981).
13. Kauert G., Schoppek B., Clarmann v. M., Hibler A., PlasmaKatecholamin-Verlauf bei
Alkylphosphat-Intoxikationen und deren Therapie, Klin. Wochenschr. 67:456-462 (1989).
14. Darwish R., Elias A.N., Plasma and Urinary catecholamines and their metabolites in
chronic renal failure, Arch Intern Med. Vol. 114, Jan. 1984.
15. Cohn J.N., Levine T.B., Olivari M.T., Garberg V., Lura D., Plasma norepinephrine as a
guide to prognosis in patients with chronic congestive heart failure, N. Engl. J. Med.
311:819-823 (1984).
16. Goldstein D.S., Plasma catecholamines in clinical studies of cardiovascular diseases, Acta
Physiol Scand, Suppl. 527:39-41 (1984).
17. Elworthy P.M., Hitchcock E.R., Estimation of plasma catecholamines by HPLC with ECD
in patients with subarachnoid haemorrhage.
18. Wind P., Causon R.C., Brown M.J., Barnes P.J., Circulating catecholamines in acute
asthma, British Medical Journal, Volume 20 (1985).
19. Halter J.B., Stratton J.R., Pfeifer M.A.,Plasma catecholamines in hemodynamic
respones to stress states in man, Acta Physiol Scand, Suppl. 527:31-38 (1984).
20. Hjemdahl P., Freyschuss U., Juhlin-Dahnfeld A., Linde B., Differentiated sympathetic
activation during mental stress evoked by the stroop test, Acta Physiol Scand, Suppl. 52725-29 (1984).

21. Weicker H., Determination of free and sulfoconjugated catecholamines in plasma and
urine by HPLC, Int. J. Sports Med. 9:68-74 Supplement (1988).
22. Pluto R., Brger P., Normal Values of catecholamines in blood plasma determined by
HPLC with Amperometric Detection, Int. J. Sports Med. 9:75-78 Supplement (1988).