ODREIVANJE -AMILAZE U SERUMU

-AMILAZA (1,4--D-glukan glikanohidrolaza, EC 3.2.1.1) katalizuje hidrolizu -1,4-glukan veze pri emu
nastaju maltoza, i vei oligosaharidi. Amilazama pripadaju enzimi koji razlau sloene ugljene hidrate, kao to
su, amiloza, glikagon, i amilopektin do manjih molekula dekstrina, maltoze i neto glukoze.
Kod oveka se ovaj enzim nalazi u pljuvanim lezdama i pankreasu. Kod zdravih ljudi nivo amilaze u
serumu je relativno nizak i konstantan. Aktivnost amilaze se poveava kod nekoh oboljenja, kao to su akutni
pankreatitis i lezije na pljuvanim lezdama.
Odreivanje aktivnosti amilaze najvei znaaj ima kod dijagnoze akutnog pankreatitisa.

Odreivanje -amilaze (kolorimetrijska metoda)

Princip:

-amilaza katalizuje hidrolizu 2-hloro-4-nitrofenilmaltotriozu (GNP-G3) do 2-hloro-4-nitrofenol (CNP),

aktivnost amilaze je proporcionalna apsorbciji 2-hloro-4-nitrofenola merene na 405nm.
-amilaza
2-hloro-4-nitofenolmaltotrioza-----------------> 2-hloro-4-nitrofenol + maltotrioza

Reagens A :

kalcijum-hlorid 5mmol/L, natrijum-hlorid 300 mmol/L, natrijum-tiocijanat 450 mmol/L,

2-hloro-4-notrofenilmaltotrioza (CNP-G3), pH 6,1.
Reagens treba uvati na temperaturi od 2-8C.

Aparatura:
Spektrofotometar ili fotometar sa termostabilnim draem kiveta nas 25, 30 ili 37C.

Materijal za analizu: Serum plazma ili urun sakupljeni uobiajenim postupkom.

Procedura:
1. Dovesti reagense i instrumente na reakcionu temperaturu.
2. Pipetirati u kivetu

37C 25, 30C

Reagens(A) 1,0ml 1,0ml

Uzorak seruma 20l 50

3. Promeati i postaviti kivete u nosa na fotometru.
4. Proitati inicijalnu spsorbciju a zatim jo tri puta uzastopno sa intervalom od po 1 minut.
5. Izraunati razliku izmeu uzastopnih apsorbcija i najveu apsorbcionu razliku u minuti.

Izraunavanje:
Koncentraciju katalitike aktivnosti -amilaze izraunavamo prema formuli:

Vt x 10 000 000
A/min x ----------------------- = U/L () molarna apsorbanca CNP na 405 nm, iznosi 15490
x I x Vs (I) duina svetlosnog puta, 1 cm kiveta
(Vt) ukupna reakciona smea iznosi 1,05ml na 25 i 30C
( Vs) zapremina uzorka iznosi 0,05 ml na 25 i 30 C
Na osnovu ovoga su izraunati koeficijenti za brzo izraunavanje i ini za serum i plazmu raenu na 25 ili
30C iznose: x 1355 = U/L; ili x 22,6 = kat/L .