1.

Uvod Tanini predstavljaju raznoliku grupu polifenola koji se u biljkama formiraju kao sekundarni metaboliti, i ukljuuju veliki broj oligomernih i polimernih polifenola. Kondenzovani tanini (ili proanticijanidini), galotanini i elagitanini su najei tanini. U ovom radu su opisana ispitivanja interakcija flavanol galata i kondenzovanih tanina sa proteinima. Kondenzovani tanini su oligomeri ili polimeri flavonoidnih jedinica. Njih ima u mnogim vrstama voa i pia, kao to su ajevi, pivo, vino i sokovi. Oni ove namirnice koje ljudi koriste za ishranu nutritivno obogauju, a ima ih i u mnogim biljkama koje se koriste u stonoj ishrani, znatno doprinosei zdravlju i ishrani ivotinja. Smatra se da kondenzovani tanini ometaju varenje proteina i vlakana kod ljudi i nepreivara, delujui tako to se u probavnom sistemu vezuju za proteine iz hrane i za enzime koji omoguavaju varenje. Nasuprot ovom antinutritivnom efektu, kondenzovani tanini su pokazali brojne bioloke i farmakoloke aktivnosti koji su od interesa u humanoj i veterinarskoj medicini, kao to je inhibicija okisidacije lipida, mutagenosti karcinogenih i elija tumora. Uoena blagotvorna dejstva konzumiranja aja na zdravlje i objanjenje francuskog paradoksa (tvrdnja dr. Sera Renoa da Francuzi ree boluju od sranih bolesti zbog redovnog konzumiranja crvenog vina, prim. aut.) se povezuju sa povoljnim bioaktivnostima tanina. Verovatno je da je osim ve dobro poznatih svojstava antioksidacije, interakcija tanina sa proteinima predstavlja osnovu uoenih biolokih aktivnosti. Dakle, bolje razumevanje ove interakcije omoguava jasnije objanjenje biolokih i farmakolokih aktivnosti tanina. U ovom radu je opisana metoda kojom je izvrena karakterizacija vezivanja izabranih kondenzovanih tanina sa elatinom i goveim albuminom iz seruma. elatin je bogat prolinom, ima sposobnost otvorene nasumine formacije lanaca i predstavlja model za prolamine u semenu i proteine iz pljuvake bogate prolinom, dok je govei

albumin iz seruma dobro okarakterisan pokazni globularni protein. I elatin i govei albumin se u literaturi esto pominju u istraivanjima relativnih veznih sklonosti tanina. Ispitani su tanini iz etiri izvora: na slici koja sledi prikazane su odreene strukture. Katekini zelenog aja su prvenstveno sainjeni od epigalokatekina-3-galata, kao i od epikatekina-3galata, epigalokatekina, epikatekina i katekina, i postoje brojni izvetaji o njihovom blagotvornom uticaju na zdravlje ljudi. Tanini iz kopica groa se sastoje od oligomernih i polimernih procijanidina, i oni se mogu izloiti galnoj kiselini do raznih nivoa. Slino ajnim katekinima, i kod njih je uoen povoljan uticaj na zdravlje. Tanini iz mimoze su prvenstveno oligomeri ili polimeri fisetinodolnih i robinetinedolnih jedinica. Ove jedinice se razlikuju od jedinica iz kopica groa i siraka po tome to nemaju fenolsku grupu na poziciji C-5 u A prstenu. Nema dostupnih poadataka o nutritivnoj vrednosti tanina iz mimoze. Meutim, uoeno je da tanini iz siraka umanjuju sposobnost varenja proteina.

Priprema materijala i izolovanje tanina Svi rastvori za analizu su pripremljeni u citrat buferu od 50mM pri pH 6, zatim je pre upotrebe izvrena degazacija u vakuumu. Tanini su izolovani iz komercijalno dostupnih proizvoda koji sadre tanin metodom hromatografije u Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences, Chalfont St. Giles, Buckinghamshire, UK). 2 g komercijalnih proizvoda koji sadre tanin su rastvoreni u metanolu i vodi (1:1 v/v, 10 cm3), uz ubrizgavanje mlaza azota u trajanju od 10 minuta. Rastvor je zatim centrifugiran (1400 x g), filtriran kroz staklenu vunu, nakon ega je ubaen u kolonu Sephadex LH-20 (10 g pre nego to nabubri u 10 cm 3 metanola i

vode, 1:1 v/v; dimenzije kolone 10 cm duine x 1,5 cm prenika). Netaninska jedinjenja su izolovana sa 300 cm3 metanola i vode (1:1 v/v), a frakcije tanina su izolovane sa rastvorom acetanona i vode (7:3 v/v, 150 cm3). Aceton je ostavljen in vacuo da ispari na 35C, a zatim je vodena faza zamrzavana i liofilizovana u periodu od priblino 24 h. Izolovani tanini se uvaju na -20C. MALDI-TOF MS analiza tanina iz kopica groa MALDI-TOF masena spektrometrija je izvrena na Bruker Daltonics Reflex III-TOF masenom spektrometru (Bruker Daltonics, Coventry, UK) koji moe vriti odloenu ekstraciju i koji ima N2 laser podeen na 33nm. U pozitivnom modelu refleksije korien je napon od 25kV i reflekcioni napon od 26,3 kV. Svi spektri predstavljaju sumiranje 200 doza. Spektri su kalibrisani standardima ClinProt, u koje su ukljueni standardi kalibracije proteina i peptida (Bruker). Matrica poznata kao super-DHB je pripremljena meanjem 2,5dihidroksibenzoidne kiselina (9:1 w/w) u acetontrilu: 0,1% TFA u vodi (7:3, v/v) (20mg cm3). Osueni uzorak tanina je povraen u acetontrilu (4mg cm3) i matrici pomeanoj sa 0,2M NaCl (1:1, v/v). Rastvor uzorka je zatim pomean sa matricom rastvora (1:1, v/v), a 0,8l dobijene smee je stavljeno na ciljni uzorak i ostavljena je da se osui (metoda suenja kapi).

MALDI-TOF MS za tanine iz mimoze Tanini (18mg cm3) su prvo rastvoreni u acetonu i vodi (4:1; v/v); rastvor je sadrao NaCl (18mg cm3). Zatim su pet delova trans-3-idola rastvora akrilne kiseline (75mg u 1 cm3 tetrahidrofurana) pomeano sa 1 delom rastvora tanina. Na ploicu sa uzorkom je stavljeno 0.4l zavrne smee uzorka i uzorak tanina je analiziran korienjem SAI LT3 LaserTOF masenog spektrometra (Scientific Analysis Instruments Ltd, Manchester, U.K.) koji ima azotni laser koji radi na 337 nm.

Zabeleeni su spektri ulinearnom modulu koji omoguavaju odloenu ekstraciju od 75 ns, koji rezultiraju masom usmerenom na 1000 amu. Svaki spektar je dobijen omoguavanjem laserskih pulseva za skeniranje celokupnog uzorka u pravoj liniji, koji se kreu kroz 60 odreenih pozicija i izbacuju po 8 doza na svaku poziciju Kalorimetrijska izotermalna titracija Zamerenje pentalpijskih promena koje su u vezi sa interakcijama tanina i proteina na 298K korien je instrument TA Instruments Nano ITC (TA Instruments Ltd., Crawley,West Sussex, UK). U jednom uobiajenom eksperimentu je elatin ili rastvor BSA stavljen u eliju za uzorkovanje od 1,001 cm3 u kalorimetru, nakon ega je u pric napunjen rastvor tanina iz pufera (5 g dm3). Tanini su zatim titrovani u eliji za uzorkovanje u sekvenci od 24 injekcije od 10 l alikvota. Interval izmeu injektiranja je bio 3 minuta. Sadraj elije za uzorkovanje je mean tokom celog eksperimenta brzinom od 200 rpm kako bi se zagarantovalo detaljno meanje. Neobraeni podaci su dobijeni odnosom toplotne take (J) i broja injektiranja, to je predstavljeno krivom za svako injektiranje. Ovi neobraeni pikovi su transformisani primenom softvera kako bi se dobio niz uoenih entalpija po molu ubrizganog materijala (Hobs, kJ mol1) prema molekularnom odnosu. Kontrolni eksperimenti su ukljuili titraciju puferovanih taninskih rastvora u puferu, pufera u proteinu i pufera u puferu; kontrole su ponavljane za svaki upotrebljeni sistem pufera i za svaku koncentraciju proteina. Poslednje dve kontrole su za rezultat imale male i jednake entalpijske promene za svako naredno injektiranje pufera, pa se iz tog razloga nisu dalje razmatrale u analizi podataka. Korigovani podaci su se odnosili na eksperimentalne podatke nakon oduzimanja tanina u kontrolnim podacima za pufer. Molekuli tanina su zbog svoje hidroforbnosti skloni samosjedinjavanju u grupe; stoga, kada se ubrizgaju pricem u pufer, molekuli tanina prolaze kroz

endotermni proces razbijanja grupe, analogno demicelizaciji surfaktanta. Obim razjedinjavanja obrnuto zavisi od koncentracije ve prisutnog tanina u uzorku elije; dakle, uzastopno injektiranje tanina u pufer rezultira uoavanjem progresivno manjih endotermnih entalpijskih promena. Podaci se daju nakon oduzimanja efekata razbijanja grupe tanina, to navodi na pretpostavku da se tanini pre vezivanja razjedine. Analiza podataka Procena parametara vezivanja je dobijena iz podataka uz pomo analitikog programa Bindworks TM ITC (Verzija 3.1.3, Applied Thermodynamics, Hunt Valley, MD, USA). Varijacije u podacima su dobijena primenom nezavisnih setova viestrukih modela vezivanja, za koji se analitiko reenje za ukupnu izmerenu toplotu (Q) dobija sledeom formulom:

gde je V zapremina elije kalorimetra, H predstavlja entalpiju, [L] predstavlja koncentraciju modela, [M] je koncentracija makromolekula, n predstavlja molekularni odnos vrsta u interakciji, a K predstavlja konstantu ravnotee vezivanja. Tanost varijacija je utvrena izraunavanjem 2 pomou sledee formule:

gde je N broj podataka po takama, yi predstavlja realnu vrednost, f(xi) predstavlja teoretsku vrednost, a i predstavlja greku u merenju. Varijacije podataka koje su prihvatljive u svakom sluaju jer su vrednosti _2 manje od vrednosti za

odgovarajui stepen slobode (p < 0,05). Slobodna energija, G, je utvrena iz konstante vezivanja ( G=RT u K, gde je R gasna konstanta, a T predstavlja apsolutnu temperaturu u Kelvinima) a entropija, S, iz drugog zakona termodinamike ( G= HT S).