Klinika enzimologija vebe 2014/2015

Kisela fosfataza

KISELA FOSFATAZA
(KF, EC 3.1.3.2)
Kisela fosfataza (ortofosfat-monoestar fosfohidrolaza) pripada grupi enzima koji u kiseloj sredini
hidrolizuju monoestre fosfatne kiseline, pri emu se oslobaaju razliiti alkoholi ili derivati fenola.
Maksimum aktivnosti ovog enzima je u kiseloj sredini izmeu pH 4 i pH 6.
KF
ortofosfat monoestar + H2O

alkohol + ortofosfat

Kisela fosfataza se nalazi u skoro svim organima i telesnim tenostima, kao i u eritrocitima,
leukocitima i trombocitima, a najvia aktivnost je prisutna u prostati. Ima vie izoenzima, koji se
razdvajaju elektroforetski, a poreklom su iz prostate, trombocita, eritrocita, kostiju (osteoklasti) i
dr. Intracelularni izoenzimi se nalaze u lizozomima ili su vezani za membranu.
Kisela fosfataza je nestabilna u alkalnoj sredini, a na aktivnost ne utiu joni Mg 2+ i Zn2+.
Aktivnost KF stimuliu hidroksilna jedinjenja, koji deluju kao akceptori fosfata. Izoenzimi KF se
meusobno razlikuju i po osetljivosti prema inhibitorima kao to su etanol, formaldehid,
L-(+)-tartarat, gvoe, bakar i fluorid. Efekat pojedinih inhibitora se koristi za odredjivanje
aktivnosti izoenzima KF. Dijagnostiki je najznaajnija inhibicija sa L-(+)-tartaratom na koji je
osetljiv prostatini izoenzim. Formaldehid i Cu2+ joni vie inhibiraju eritrocitnu KF nego
prostatini izoenzim. L-(+)-tartarat ne inhibira eritrocitni ili kotani izoenzim (tartarat-rezistentna
KF). Osim toga, izoenzimi se razlikuju i prema pH optimumu.

Metode za odreivanje aktivnosti kisele fosfataze

Kisela fosfataza ne pokazuje veliku supstratnu specifinost i moe da deluje na brojne
alifatine i fenolne estre fosfatne kiseline. Danas se kao supstrati za odreivanje aktivnosti KF
najee koriste 4-nitrofenil-fosfat, 1-naftil-fosfat i timolftalein-fosfat. Pojedini izoenzimi KF
pokazuju razliitu specifinost prema supstratima (1-naftil-fosfat i timolftalein-fosfat bre
hidrolizuju sa prostatinim izoenzimom nago sa ostalim ne-prostatinim KF).
Prvi supstrat koji je korien za odreivanje aktivnosti KF je bio -glicero-fosfat, a posle
inkubacije u kiseloj sredini odreivao se osloboeni fosfat. U metodama u kojima se kao
supstrat koristi fenil-fosfat odreuje se osloboeni fenol bojenom reakcijom, najee sa 4aminoantipirinom. Kao supstrat moe da se koristi i 1-naftil-fosfat, a osloboeni 1-naftol moe
1

Klinika enzimologija vebe 2014/2015

Kisela fosfataza

da se prati kontinuirano ili da se meri posle bojene reakcije sa o-dianizidinom ili 5-nitrozo-oanizidinom.
Statika metoda za merenje aktivnosti KF kao supstrat koristi 4-nitofenilfosfat, koji u reakciji
hidrolizuje do 4-nitrofenola pri pH 4.9. Reakcija se zaustavlja dodatkom NaOH, to poveava pH
na 11 i inaktivira enzim. Pri ovom pH 4-nitrofenol prelazi u 4-nitrofenoksidni jon, ija se
apsorbancija se meri na 405 nm.
Kinetika metoda kao supstrat koristi 1-naftil-fosfat. Hidrolizom 1-naftil-fosfata pri pH 5.2
oslobaa se 1-naftol, koji zatim reaguje sa Fast Red TR (diazonijum so) i stvara obojeno
jedinjenje ija se apsorbancija meri na 405 nm. Ova metoda je mnogo specifinija nego metoda
sa 4-nitofenilfosfatom prilikom odreivanja prostatinog izoenzima. Ne-prostatina KF ne deluje
na supstrat istom brzinom kao prostatini izoenzim, a dodatkom L-(+)-tartarata inhibira se 95%
prostatine KF.

Princip metode za odreivanje aktivnosti ukupne kisele fosfataze:

Kisela fosfataza hidrolizuje 1-naftil-fosfat u kiseloj sredini na 370C do 1-naftola i fosfata.
U sledeoj reakciji dolazi do kuplovanja 1-naftola sa Fast Red TR i stvara se diazo boja.
Poveanje apsorbancije na 405 nm je proporcionalno aktivnosti enzima.
KF
1-naftil-fosfat + H2O 1-naftol + fosfat
1-naftol + Fast Red TR diazo boja
Reagensi:
Reagens AT: Na-citrat 110 mmol/L, 1,5-pentandiol 220 mmol/L, pH 5.2
Reagens AI: Na-citrat 110 mmol/L, Na-tartarat 110mmol/L 1,5-pentandiol 220 mmol/L, pH 5.2
Reagens B1: 1-naftil-fosfat 12.5 mmol/L supstrat
Reagens B2: Fast Red TR 1.25 mmol/L
Reagens C: Siretna kiselina 0,6 mmol/L
Radni reagens se priprema dodatkom 10 ml reagensa AT (za odreivanje ukupne ACP) ili 10 ml
AI (za odreivnje porostatine ACP) u reagens B1. Supstrat se rastvara krunim meanjem
sadraja boice do potpunog rastvaranja. Rastvoreni sadraj dodati u boicu reagensa B2,
zapuiti i meati do potpunog rastvaranja.

Klinika enzimologija vebe 2014/2015

Kisela fosfataza

Za analizu se koriste uzorci seruma ili EDTA plazme. Stabilnost KF u serumu se poveava
zakieljavanje sa acetatnim puferom pH 5.0. Uzorci plazme dobijene sa oksalatom ili fluoridom
se ne mogu koristiti.

Izvoenje:
Podesiti talasnu duinu na 405 nm.
U epruvetu dodati:
Analiza
Serum
Radni reagens za odreivanje ukupne KF

(A)
100 L
1 mL

Promeati, sipati u termostatiranu kivetu na 37C i inkubirati 5 minuta, a zatim proitati inicijalnu
apsorbanciju (A0) i ukljuiti topericu. Nakon 1 minuta oitati apsorbanciju (A 1), a zatim itati
apsorbancije nakon 2 minuta (A2) i nakon 3 minuta (A3) na 405 nm.
Izraunavanje aktivnosti enzima:
Izraunati prosenu promenu apsorbancije po minuti (A/min):

A / min

(A1 A 0 ) (A 2 A1 ) (A 3 A 2 )
3

Aktivnost ukupne kisele fosfataze se izraunava prema sledeoj formuli:

IU / L

( A / min) 10 6 UZ
ZA b

Pri emu su:

A/min prosena promena apsorbancije po minuti
106 faktor za konverziju mola u mikromole
UZ ukupna zapremina u kiveti (zapremina reagensa + zapremina analize)
ZA zapremina analize (u mL)
molarni apsorpcioni koeficijent za 4-nitrofenol na 405 nm (13033 L/mol cm)
b duina optikog puta (1 cm)
3

Klinika enzimologija vebe 2014/2015

Kisela fosfataza

Obzirom da su , UZ, ZA, 106 i b konstantne vrednosti, njihov odnos se moe zameniti faktorom
844, tako da izraz za izraunavanje aktivnosti enzima postaje:

Ukupna KF (IU/L) = A/min 844 (na 37C)

Napomene:
1. Vensku krv treba uzimati pri uslovima minimalne staze.
2. Nakon odvajanja serum treba odmah zakiseliti acetatnim puferom pH 5.0 (20 L pufera na 1
mL seruma) jer je KF nestabilna pri alkalnom pH, koji nastaje usled gubitka CO2 iz seruma.
3. Aktivnost enzima je stabilna 3 dana na +4C. Ako se uzorci ne analiziraju odmah treba ih
uvati zamrznute na -20C.
4. Hemolizovane uzorke ne treba koristiti.

Referentne vrednosti na 37C

Ukupna kisela fosfataza: mukarci do 10 IU/L
ene do 3.7 IU/L
Prostatina kisela fosfataza: do 3.5 IU/L
Odreivanje aktivnosti prostatinog izoenzima
U epruvetu dodati:
Analiza
Serum
Radni reagens za odreivanje tartarat-rezistentne KF

(A)
100 L
1 mL

Promeati, sipati u termostatiranu kivetu na 37C i inkubirati 5 minuta, a zatim proitati inicijalnu
apsorbanciju (A0) i ukljuiti topericu. Nakon 1 minuta oitati apsorbanciju (A 1), a zatim itati
apsorbancije nakon 2 minuta (A2) i nakon 3 minuta (A3) na 405 nm.

Aktivnost tartarat-rezistentne KF se rauna prema formuli:

Tartarat-rezistentna (U/L) = A/min 844 (na 37C)

4

Klinika enzimologija vebe 2014/2015

Kisela fosfataza

Aktivnost prostatine kisele fosfataze se rauna prema formuli:

Prostatina KF (IU/L) = ukupna KF (IU/L) tartarat-rezistentna KF (IU/L)

( na 37C)

Interpretacija rezultata
Odreivanje aktivnosti kisele fosfataze u prvom redu se koristi za dijagnozu i terapijsku
kontrolu karcinoma prostate. Ako je aktivnost prostatinog izoenzima poviena, sa sigurnou
se moe tvrditi da se radi o karcinomu prostate, moda i sa metastazama, ak i u sluajevima
kada se palpacijom ne pipa tumor. Aktivnost KF je poviena i kod nekih kotanih bolesti i to
istovremeno sa alkalnom fosfatazom.
Bolesti prostate, kao to su benigna hipertrofija prostate, prostatitis, infarkt prostate i
malignitet dovode do poveanja aktivnosti KF. Kod veine pacijenata postoji korelacija izmeu
stadijuma bolesti i poveanja aktivnosti enzima: u stadijum A aktivnost KF je poveana kod oko
15% pacijenata, a u stadijumu D bolesti aktivnost enzima je poveana kod oko 80% pacijenata.
U ovim sluajevima je od dijagnostikog znaaja aktivnost prostatinog izoenzima.
Bolesti kostiju dovode do poveanja aktivnosti ukupne KF, ali nema promene u
aktivnosti prostatinog izoenzima. Ove promene se uoavaju kod dece i mladih koji rastu, ali i
kod hiperparatiroidizma, Paget-ove bolesti i osteogenese, kao i kod mijeloma. Kod nekih
malignih procesa na kostima zajedno sa kiselom fosfatazom poveava se i aktivnost alkalne
fosfataze.
Aktivnost KP raste u i u lizozomalnim bolestima (lipidoza, Gaucher-ovo oboljenje).
Tromboembolijske bolesti (tromboza, arterijska embolija, tromboflebit) su praene
poveenjem aktivnosti KF, jer se enzim nalazi u trombocitima. Posle infarkta miokarda takoe
dolazi do poveanja aktivnosti KF.

Prostata specifini antigen (PSA)

PSA je protein (serin proteaza) koji se sintetie u epitelnim elijama prostate i izluuje
samo u semenu tenost. Kako se normalno ne nalazi u serumu, zbog svoje tkivne specifinosti
koristi se kao tumorski marker u dijagnostici karcinoma prostate.
5

Klinika enzimologija vebe 2014/2015

Kisela fosfataza

Poviene vrednosti PSA u serumu mogu se javiti i kod benignih tumora prostate i
prostatitisa. Takoe, uroloke dijagnostike procedure mogu da dovedu do poveanja
koncentracije PSA. Utvreno je da svako stanje koja naruava normalnu grau prostate moe
da dovede do prelaska izvesne koliina PSA u krv. Koncentracija PSA se odreuje
imunohemijsko metodom.
Normalnim rezultatom se smatra koncentracija u serumu koja je manja od 4 ng/mL.
Ukoliko je koncentracija PSA 10 ng/mL i vie, potrebno je uraditi biopsiju prostate jer je rizik za
postojanje karcinoma i do 80%. Kod pacijenata ija je serumska koncentracija PSA izmeu 4 i
10 ng/mL potrebno je odrediti odnos slobodnog PSA (free PSA) i ukupnog PSA (total PSA),
poto se najvei procenat serumske PSA nalazi u kompleksu sa inhibitorima proteaza (najee
sa 1-antihimotripsinom, PSA-ACT). Ukoliko je ukupni PSA izmeu 4 i 10 ng/mL i odnos free
PSA / total PSA vei od 20% verovatnoa za razvoj karcinoma je mala, a ako je odnos free PSA
/ total PSA manji od 10% potrebno je izvriti biopsiju jer verovatnoa za razvoj karcinoma raste.
PSA ima najveu primenu u praenju pacijenata nakon operativnog uklanjanja prostate.
Ukoliko je zahvat bio uspean, oekuje se pad koncentracije PSA u serumu. Poviena vrednost
PSA nakon hirurke intervencije znak je pojave recidiva ili metastaza.