Vebe iz medicinske biohemije

Neorganski fosfat
U organizmu se nalazi oko 20 mol (620 g) fosfora, najveim delom u obliku fosfata, koji je
rasporeen ravnomerno izmeu ekstra- i intraelularnog prostora! U elijama se fosfor nalazi najvi"e
kao organski ili estarski vezan u obliku fosfolipida, fosfoproteina, glierofosfata, #eksoza fosfata,
nukleotid fosfata! $onentraija fosfora u eliji je vrlo niska, ali i pored toga ima zna%ajnu ulogu - u
obliku fosfolipida predstavlja strukturnu komponentu elijske membrane, a u obliku nulkleotid fosfata
u%estvuje u energetskom metabolizmu, predstavlja supstrat za oksidativnu fosforilaiju i u%estvuje u
proesima u kojima se stvara &'(! )ajvei deo ekstraelularnog fosfata (oko *+,) prisutan je u
kostima u obliku soli #idroksiapatita, a u plazmi ga ima najvi"e neorganski vezanog (--,) u obliku
jona .
2
(/
0
-
i .(/
0
2-
! /ko 10, fosfata u plazmi je vezano za proteine, a 2-, je kompleksno vezano
sa magnezijumom, kalijumom i natrijumom! /dnos neorganskog monovalentnog i dvovalentnog jona
u plazmi zavisi od p.3 pri p. +,0 iznosi 130, u aidozi su konentraije jednake, a u alkalozi idu do
134!
$onentraija fosfata u plazmi rezultat je ravnote5e izmeu apsorpije u intestinumu, ekskreije
putem urina i feesa i preraspodele izmeu ekstraelularne te%nosti, elija i %vrsti# tkiva! $ao i kod
kalijuma, nivo fosfata reguli"u parat#ormon (sni5ava konentraiju fosfata u plazmi), kalitonin
(sni5ava konentraiju fosfata u plazmi) i vitamin 6
2
(poveava konentraiju fosfata u plazmi)!
7etabolizmi kalijuma i neorganskog fosfata su povezani, pa poremeaji u regulaiji jednog od ova
dva jona izazivaju poremeaje u regulaiji drugog! 8toga je uputno da se u istom uzorku sa
neorganskim fosfatom odreuje i kalijum! $onentraija fosfata u plazmi koja se rutinski odreuje u
laboratorijama je neorganska frakija, koju %ine slobodni fosfati i frakija koja je vezana za proteine!
(ovi"ene vrednosti neorganskog fosfata u serumu ozna%avaju se kao #iperfosfatemija, a to su
stanja u kojima je konentraija neorganskog fosfata vea od 1,0- mmol9:! .iperfosfatemija nastaje
zbog prekomernog unosa fosfata (mle%no-alkalni sindrom koji se odlikuje i #iperkalemijom,
alkalozom i azotemijom), prekomerne mobilizaije fosfata iz kostiju, poremeaja u endokrinoj
regulaiji (#ipoparatiroidizam i pseudo#ipoparatiroidizam, prekomerno uno"enje vitamina 6,
akromegalija, &disonova bolest), smanjenog renalnog izlu%ivanja (bubre5na insufiijenija) i kao
posledia dejstva neki# lekova!
8ni5ene vrednosti fosfata u plazmi ozna%avaju se kao #ipofosfatemija, a to su stanja u kojima je
konentraija neorganskog fosfata manja od 0,*+ mmol9:! .ipofosfatemija nastaje zbog smanjenog
unosa ili poremeene apsorpije fosfata (malapsorpija, malnutriija, defiit vitamina 6, alko#olizam),
poremeene endokrine regulaije (#iperparatiroidizam), renalne disfunkije (nefrolitijaza, renalna
tubularna aidoza, osmotska diureza), prelaska fosfata iz ekstraelularne u intraelularnu te%nost
(dijabeti%na ketoaidoza, opekotine, sepsa) i kao posledia dejstva neki# lekova!
.ipofosfatemija ne mora da dovede do smanjenja intraelularne konentraije fosfata! )a primer,
ukoliko je #ipofosfatemija posledia smanjene apsorpije u digestivnom traktu ili primarnog
#iperparatiroidizma, dolazi do smanjenja ukupne (intraelularne i plazmatske) koli%ine fosfata u
organizmu! 7eutim, kod #ipofosfatemije mogu da budu prisutne i normalne ili %ak povi"ene rezerve
fosfata (intraelularno), "to je posledia prelaska fosfata iz ekstraelularne u intraelularnu te%nost,
posebno u mi"iima, masnom tkivu i jetri! Uzroi za ovakvu preraspodelu fosfata su alkaloza ili
promena u metabolizmu ugljeni# #idrata (kod davanja infuzionog rastvora sa glukozom ili kod
#iperalimentaije)!
1
Vebe iz medicinske biohemije
;a odreivanje konentraije fosfata krv se uzima od paijenata posle nonog gladovanja!
)aime, posle obroka ekstraelularna konentraija fosfata se smanjuje jer fosfat ulazi u elije
(deponovanje glikogena u jetri i mi"iima)! 'akoe, posle obroka se poveava p. plazme "to
pogoduje obrazovanju kompleksa izmeu kalijuma i fosfata i njegovo deponovanje u kostima!
(o5eljno je da se krv uzima bez podveske, jer venska staza izaziva #emokonentraiju (zbog izlaska
vode iz krvni# sudova) i #ipoksiju, "to poveava razlaganje fosfatni# estara pa se dobijaju vi"e
vrednosti! ;a dobijanje plazme ne bi trebalo da se koriste uobi%ajeni antikoagulansi kao sto su oksalat,
itrat ili <6'&, jer mogu da interferiraju u formiranju fosfomolibdata! 8erum i plazma treba da se
odvoje od eritroita najkasnije jedan sat po uzimanju krvi, a mogu da se %uvaju nekoliko dana na 0
o
=,
ili nekoliko mesei na -2-
o
=! )e treba koristiti #emolizovane uzorke zbog oslobaanja fosfata iz
eritoita!
Urin u kome se odreuje fosfat sakuplja se u sudu koji je bez tragova deterd5enata i opran
kiselinom! &ko je urin alkalan mo5e da doe do talo5enja fosfata i treba mu pre rada dodati .=l
konentraije 6 mol9:!
'reba izbegavati pranje staklenog pribora deterd5entima, jer svi sadr5e fosfate! (reporu%uje se
kori"enje plasti%ni# epruveta za jednokratnu upotrebu, ili pranje pribora razbla5enom azotnom
kiselinom (l mol9:) i potom ispiranje obi%nom i demineralizovanom vodom!
Metode za odreivanje neorganskog fosfata
)ajvei broj metoda za odreivanje konentraije fosfata zasnovan je na reakiji fosfatnog jona sa
amonijum molibdatom, pri %emu nastaje amonijum fosfomolibdat, ().
0
)
2
(/
0
(7o/
2
)
12
, kompleksno
jedinjenje 5ute boje! )astali amonijum fosfomolibdat se mo5e meriti direktno, nakon redukije do
molibdenskog plavog ili nakon reakije sa bojama!
U direktim metodama, neredukovani amonijum fosfomolibdat mo5e da se meri
spektrofotometrijski na 200 nm, a metoda ima dobru ta%nost, preiznost i osetljivost, mada na rezultate
mogu da uti%u #emoliza i lipemija! 6ruga modifikaija je stvaranje kompleksa sa vanadatom, %ija se
5uto-narand5asta boja meri spektrofotometrijski! )edostatak ove metode je "to u slabo kiseloj sredini
slepa proba ima visoku apsorbaniju, a u jako kiseloj sredini dolazi do #idrolize labilni# fosfatni#
estara, pa se dobijaju vi"e vrednosti za fosfat!
Redukcijom amonijum fosfomolibdata nastaje molibdensko plavo, kompleksni #eteropolimer
nepoznate i #eterogene strukture, %ija se apsorbanija meri na 660 nm! $ao redukiona sredstva u
ovim metodama mogu da se koriste3 #idro#inon, 1-amino-2-naftol-0-sulfonska kiselina (&)8), stano-
#lorid, askorbinska kiselina, fero amonijum sulfat, p-metil-aminofenolsulfat i )-fenil-p-fenilendiamin!
)edostatak #idro#inona kao redukionog sredstva je u tome "to sporo deluje, boja nije naro%ito
intenzivna, a sam intenzitet reakije zavisi od temperature i kiselosti sredine! (ri kori"enju &)8-a
kao redukionog sredstva, reakija se mo5e izvoditi na sobnoj temperaturi, ali je nedostatak to "to je
boja nastalog kompleksa nestabilna! 7nogo intenzivniju boju od one koja se dobija sa &)8 daje
stano-#lorid, ali je boja nestabilna i osetljiva na male promene u konentraiji kiseline!
)astali amonijum fosfomolibdat se mo5e odrediti i u reakijama sa baznim bojama! U jednoj od
metoda koristi se trifenil-metanska boja mala#it-zeleno, a reakija je 20 puta osetljivija od redukioni#
postupaka! (rinip metode se zasniva na promeni maksimuma apsorbanije nastalog kompleksa u
odnosu na maksimum apsorbanije same boje! (ored boje mala#it zelenog mogu da se koriste i
brilijant zeleno ili rodamin >!
Enzimske metode su speifi%ne i osetljive, ali zbog te"koa u pripremanju reagensa
(kontaminaija fosforom) jo" uvek nisu na"le "iroku primenu! (rva od takvi# metoda zasnivala sa na
2
Vebe iz medicinske biohemije
sistemu reakija koje su katalizovali enzimi glikogen-fosforilaza (?@), fosfoglukomutaza (@?7) i
glukozo-6-fosfat-de#idrogenaza (?-6-(6.), a koli%ina fosfata je bila proporionalna stvorenom
)&6(., koji se meri na 200 nm3
+ +



H + NADPH + nat fosfogluko - 6
NADP
+ P - 6 - glukoza
P - 6 - glukoza P - 1 - glukoza
P - 1 - glukoza glikogen + HPO
PDH - 6 - G
FGM
GF - 2
4
6rugi sistem enzimski# reakija za odreivanje fosfata zasniva se na %etiri enzimske reakije, koje
katalizuju glieralde#id-fosfat-de#idrogenaza (?&(6.), fosfoglierat-kinaza (@?$), #eksokinaza
(.$) i na kraju glukozo-6-fosfat-de#idrogenaza (?-6-(6.), a stvorena koli%ina )&6(. u poslednjoj
reakiji proporionalna je koli%ini fosfata3
+ +
+
+
+ + +
+ +
+ +
+ +
+ +
H NADPH nat fosfogluko 6 NADP fosfat 6 glukoza
ADP fosfat 6 glukozo glukoza ATP
ATP rat fosfoglie ! ADP erat "ifosfogli ! # 1
H NADH erat "ifosfogli ! # 1
NAD P ! $i" glieral"e HPO
PDH 6 G
H%
FG%
GAPDH 2
4
U novije vreme predlo5ena je enzimska metoda za odreivanje fosfata u kojoj se koriste enzimi
purin nukleozid fosforilaza (()@), ksantin oksidaza ($s/6) i peroksidaza ((/6), koja katalizuje
reakiju izmeu nastalog peroksida i #romogena )-etil-)-(2-metilfenil)-)-aetiletilendiamina! $ao
krajnji proizvod nastaje rveno-ljubi%asti kompleks, %ija se apsorbanija meri na --- nm3
ko&'leks o(o)eni + O H $ro&ogen + O H
O H + kiselina &okra*na O 2 + O H 2 + n $i'oksanti
P - 1 - ri(ozo + n $i'oksanti inozin +
HPO
2
POD
2 2
2 2
%sOD
2 2
PNF - 2
4



Eksperimentalni rad:
2
Vebe iz medicinske biohemije
Odredjivanje neorganskog fosfata metodom sa amonijum-molibdatom (direktna metoda)
Princip metode
)eorganski fosfat iz seruma (u obliku mono- i di#idrogen-natrijum-fosfata) reaguje sa amonijum-
molibdatom u kiseloj sredini, pri %emu nastaje kompleksno jedinjenje 5ute boje amonijum-fosfo-
molibdat, %ija se apsorbanija meri na 200 nm!
eagensi
!" Molibdatni reagens
&monijum molibdat 0,40 mmol9:
8umporna kiselina 2*0 mmol9:
6eterd5enti
8tabilizatori
#" $tandard fosfata 1 mmol9:
%zvoenje
U epruvete odmeriti (m:)3
& 8t 8(
serum 0,02 - -
reagens 2 - 0,02 -
demineralizovana voda - - 0!02
reagens 1 1,0 1,0 1,0
Azme"ati, ostaviti da stoji 2 min i zatim izmeriti apsorbaniju anlize (&
&
) i
standarda (&
8t
) prema slepoj probi na 200 nm! >oja je postojana trideset minuta!
%zra&unavanje
1
A
A
+ , &&ol # fosfat neorganski
-t
A
=
eferentne vrednosti
8erum3 0,*+ - 1,0- mmol9:

Urin3 12,0 - 02,0 mmol9dan
0