5.

veba: Praenje toka enzimske hidrolize oligosaharida DNS metodom i

odreivanje enzimske aktivnosti
5.1. Uticaj hidrolize viih eera na redukujuu mo
Zajednika karakteristika reakcija hidrolize razliitih oligosaharida i polisaharida je da se
zasnivaju na raskidanju glikozidnih veza, pa dovode do oslobaanja redukujuih grupa. Poto se
time poveava redukujua mo reakcione smee, metode koje omoguavaju merenje redukujue
moi omoguavaju efikasno praenje toka ovih hidrolitikih reakcija. Iz tog razloga, DNS
metoda za odreivanje koncentracije redukujuih eera moe vrlo efikasno da se koristi za
praenje toka enzimskih reakcija i odreivanje enzimske aktivnosti.
U ovoj vebi DNS metoda bie primenjena radi odreivanja aktivnosti tri industrijski
znaajna enzima: invertaze, -galaktozidaze i -galaktozidaze.

5.2. Odreivanje aktivnosti invertaze
Saharoza je disaharid koji se sastoji iz ostataka molekula -D-glukoze i molekula -D-
fruktoze (-glukopiranozido--fruktofuranozid). Hidrolizu saharoze katalizuje enzim invertaza
(-D-fruktofuranozid-fruktohidrolaza), koji na saharozu deluje sa strane fruktoze (slika). To je
grupno specifian enzim, koji osim to deluje na supstrate u kojima se nalazi -fruktoza u
furanoznom obliku, deluje i na one koji sadre i -glikozidnu vezu. Naziv inverzija je izveden
zbog toga to posle hidrolize saharoze dolazi do promene smera obrtanja ravni polarizovane
svetlosti. Ekvimolarna smea glukoze i fruktoze koja nastaje u ovoj reakciji naziva se invertni
eer.


Poto je glikozidna veza nastala izmeu poluacetalnih hidroksilnih grupa C-1 atoma
glukoze i C-2 atoma fruktoze, saharoza nije redukujui eer. Meutim, hidrolizom se
oslobaaju obe redukujue poluacetalne hidroksilne grupe, pa smea koja nastaje posle hidrolize
ima redukujua svojstva. Ova karakteristika reakcije hidrolize saharoze se esto koristi radi
praenja toka reakcije. U ovoj vebi tok enzimski katalizovane hidrolize saharoze bie praen
pomou DNS metode za odreivanje koncentracije redukujuih eera.

5.2.1. Enzimska hidroliza saharoze

5.2.1.1. Hemikalije
Na-acetatni pufer (0,1M; pH 4,5)
10%-ni rastvor saharoze
Invertaza (0,01 mg/ml)
Osnovni rastvor invertnog eera (5 mM glukoze + 5 mM fruktoze)

5.2.2. Postupak

5.2.2.1. Odreivanje standardne prave invertnog eera
Poto je proizvod reakcije hidrolize saharoze ekvimolarna smea glukoze i fruktoze
(invertni eer), neophodno je pre izvoenja reakcije hidrolize saharoze konstruisati
standardnu pravu za odreivanje koncentracije invertnog eera DNS metodom. Za konstruisanje
standardne prave neophodno je pripremiti po 0,5 ml razliitih rastvora invertnog eera
(koncentracije 0,025-5 mM) i dodati 0,5 ml DNS reagensa. U epruvete obeleene rednim
brojevima treba dodati sledee zapremine supstanci:
Redni
broj
epruvete
Zapremina osnovnog
rastvora invertnog
eera (ml)
Zapremina
pufera (ml)
Zapremina
DNS reagensa
(ml)
Koncentracija
invertnog eera
(mM)
0 0 0,5 0,5 0
1 0,025 0,475 0,5 0,25
2 0,05 0,45 0,5 0,5
3 0,1 0,4 0,5 1
4 0,2 0,3 0,5 2
5 0,3 0,2 0,5 3
6 0,4 0,1 0,5 4
7 0,5 0 0,5 5
Epruvete se zatim ostave 5 minuta u kljualom vodenom kupatilu, razblae sa 4 ml vode,
vorteksiraju se i meri se apsorbanca rastvora na 540 nm u odnosu na slepu probu. Nacrta se
standardna kriva zavisnosti apsorbance od koncentracije invertnog eera (mmol dm
-3
).



5.2.2.2. Hidroliza saharoze
Pripremanje supstrata:
Rastvor supstrata priprema se tako to se u epruvetu prenese 3 ml acetatnog pufera i 1 ml 10 %-
nog rastvora saharoze. Zatim se epruveta sa supstratom i enzimski preparat (invertaza) inkubiraju
na temperaturi reakcije (45
o
C) u toku 15 minuta. Svrha ovog koraka je da obe komponente
reakcione smee dostignu temperaturu reakcije pre meanja u sledeem koraku, ime se
obezbeuje da od poetka eksperimenta reakciona smea bude na eljenoj temperaturi.


Reakcija:
Zatim se u epruvetu doda 1 ml rastvora invertaze, smea se promea na vorteksu i inkubira na
45
o
C da bi se odigrala reakcija hidrolize saharoze. Iz ove epruvete se svakih 5 min uzimaju
uzorci zapremine 0,5 ml radi odreivanja koncentracije redukujuih eera i praenja toka
hidrolize saharoze. (Treba obratiti panju da se tokom uzorkovanja reakciona smea minimalno
zadrava van termostata!)

Odreivanje koncentracije invertnog eera:
Ovi uzorci u daljem toku prolaze kroz jednak tretman kao rastvori invertnog eera pri
odreivanju standardne krive. Dakle, u 0,5 ml uzorka doda se 0,5 ml DNS reagensa Epruvete se
zatim ostave 5 minuta u kljualom vodenom kupatilu, razblae sa 4 ml vode, vorteksiraju se i
meri se apsorbanca rastvora na 540 nm u odnosu na slepu probu.
Nakon merenja apsorbance uzorka, izraunati koncentraciju invertnog eera u rastvoru
na osnovu standardne krive odreene sa invertnim eerom.

5.3. Odreivanje aktivnosti -galaktozidaze
Laktoza je disaharid koji se sastoji iz ostataka molekula -D-galaktoze i molekula -D-
glukoze povezanih -(14)-glikozidnim vezama pa ima sistemsko ime -galaktopiranozido-
(14)-glukopiranoza.
Hidrolizu laktoze katalizuje enzim -galaktozidaza, ije je sistemsko ime -D-galaktozid-
galaktohidrolaza. Ovaj enzim je grupno specifian jer katalizuje hidrolizu -glikozidnih veza
izmeu galaktoze i drugih organskih liganda, a primeena je aktivnost i u hidrolizi arabinozida i
fukozida. Ipak, primarna uloga ovog enzima u prirodi je hidroliza laktoze pa se esto u literaturi
moe nai i trivijalni naziv laktaza.
Laktoza je redukujui eer, poto poseduje slobodnu poluacetalnu hidroksilnu grupu na
ostatku glukoze. Ipak, hidrolizom laktoze (slika) se poveava redukujua mo jer se oslobaa i
poluacetalna grupa na galaktoznom ostatku pa se tok ove reakcije moe pratiti metodama za
odreivanje redukujuih eera. U ovoj vebi tok reakcije pratiemo pomou DNS metode.



Poto je u ovoj reakciji supstrat (laktoza) redukujui eer, praenje reakcije hidrolize
DNS metodom neto je sloenije nego u sluaju hidrolize saharoze (5.2.2.) ili hidrolize rafinoze
(5.4.2.). Naroito se to odnosi na odreivanje standardne prave jer se ne moe konstruisati
koristei samo proizvod reakcije (ekvimolarnu smeu glukoze i galaktoze), nego se mora dodati i
neproreagovali supstrat (laktoza) jer utie na redukujuu mo rastvora. Iz tog razloga, sastav
smee koja se koristi za odreivanje standardne prave zavisi od poetne koncentracije supstrata i
ista standardna prava ne sme da se koristi pri drugaijim poetnim koncentracijama laktoze!

5.3.1. Enzimska hidroliza laktoze

5.3.1.1. Hemikalije
Na-acetatni pufer (0,1M; pH 4,5)
Rastvor laktoze (20 mM)
Rastvor -galaktozidaze (0,5 mg/ml)
Osnovni rastvor laktoze (4 mM)
Osnovni rastvor potpunog hidrolizata laktoze (4 mM glukoze + 4 mM galaktoze)

5.3.2. Postupak

5.3.2.1. Odreivanje standardne prave hidrolizovane laktoze
Proizvod reakcije hidrolize laktoze je ekvimolarna smea glukoze i galaktoze, ali poto i
neproreagovala laktoza daje odreenu redukujuu mo eeru, pri konstruisanju standardne
prave koriste se smee ova tri eera, koje se u daljem tekstu nazivaju hidrolizati laktoze.
Sastav hidrolizata laktoze zavisi od poetne koncentracije laktoze u reakcionoj smei. Poto e
hidroliza laktoze u ovom eksperimentu biti izvedena u rastvoru koji sadri 4 mM laktoze svi
hidrolizati se pripremaju meanjem, u razliitim odnosima, 4 mM rastvora laktoze i rastvora koji
se dobija potpunom hidrolizom laktoze (4 mM glukoze i 4 mM galaktoze).
Za konstruisanje standardne prave neophodno je pripremiti po 0,5 ml razliitih
hidrolizata laktoze i dodati 0,5 ml DNS reagensa. Hidrolizati laktoze su definisani i
domaajem reakcije, odnosno stepenom hidrolize laktoze koji odgovara takvom sadraju smee.

Epr. Zapremina
osnovnog
rastvora
potpunog
hidrolizata
laktoze (ml)
Zapremina
osnovnog
rastvora
laktoze (ml)
Zapremina
DNS
reagensa
(ml)

Karakteristike smee
Konc.
glukoze
(mM)
Konc.
galaktoze
(mM)
Konc.
laktoze
(mM)
Stepen
hidrolize
(%)
0 0 0,5 0,5 0 0 4 0
1 0,025 0,475 0,5 0,2 0,2 3,8 5
2 0,05 0,45 0,5 0,4 0,4 3,6 10
3 0,1 0,4 0,5 0,8 0,8 3,2 20
4 0,15 0,35 0,5 1,2 1,2 2,8 30
5 0,25 0,25 0,5 2 2 2 50
6 0,375 0,125 0,5 3 3 1 75
7 0,5 0 0,5 4 4 0 100

Epruvete se zatim ostave 5 minuta u kljualom vodenom kupatilu, razblae sa 4 ml vode,
vorteksiraju se i meri se apsorbanca rastvora na 540 nm u odnosu na slepu probu. Nacrta se
standardna kriva zavisnosti apsorbance od stepena hidrolize laktoze (mmol dm
-3
).

5.3.2.2. Hidroliza laktoze
Pripremanje supstrata:
Rastvor supstrata priprema se tako to se u epruvetu prenese 3 ml acetatnog pufera i 1 ml
rastvora laktoze (20 mM). Zatim se epruveta sa supstratom i enzimski preparat (-galaktozidaza)
inkubiraju na temperaturi reakcije (45
o
C) u toku 15 minuta. Svrha ovog koraka je da obe
komponente reakcione smee dostignu temperaturu reakcije pre meanja u sledeem koraku,
ime se obezbeuje da od poetka eksperimenta reakciona smea bude na eljenoj temperaturi.

Reakcija:
Zatim se u epruvetu doda 1 ml rastvora -galaktozidaze, smea se promea na vorteksu i inkubira
na 45
o
C da bi se odigrala reakcija hidrolize laktoze. Iz ove epruvete se svakih 5 min uzimaju
uzorci zapremine 0,5 ml radi odreivanja koncentracije redukujuih eera i praenja toka
hidrolize laktoze. (Treba obratiti panju da se tokom uzorkovanja reakciona smea minimalno
zadrava van termostata!)

Odreivanje koncentracije redukujuih eera i stepena hidrolize laktoze:
Ovi uzorci u daljem toku prolaze kroz jednak tretman kao rastvori razliitog stepena
hidrolize laktoze pri odreivanju standardne krive. Dakle, u 0,5 ml uzorka doda se 0,5 ml DNS
reagensa Epruvete se zatim ostave 5 minuta u kljualom vodenom kupatilu, razblae sa 4 ml
vode, vorteksiraju se i meri se apsorbanca rastvora na 540 nm u odnosu na slepu probu.
Nakon merenja apsorbance uzorka, izraunati koncentraciju razliitih eera (laktoze,
glukoze i galaktoze) u uzorku i stepen hidrolize laktoze na osnovu standardne krive odreene u
5.3.2.1.
5.4. Odreivanje aktivnosti a-galaktozidaze
Enzim a-galaktozidaza katalizuje hidrolizu -(16)-glikozidnih veza koje su formirane
izmeu poluacetalnih hidroksilnih grupa galaktoze i hidroksilnih grupa na C-6 atomu drugog
monosaharida, obino glukoze ili manoze. Ovaj enzim nije strogo specifian, pa katalizuje
hidrolizu razliitih oligosaharida (rafinoza, melibioza, stahioza i verbaskoza) i polisaharida
(galaktomanani i galaktoglukomanani).
Katalitika aktivnost a-galaktozidaze u ovoj vebi bie primenjena u hidrolizi rafinoze.
Rafinoza je trisaharid ije su monasaharidne jedinice galaktoza, glukoza i fruktoza (slika ).
Glukoza i fruktoza su povezane kao u molekulu saharoze, glikozidnom vezom izmeu
poluacetalnih grupa, a hidroksilna grupa na C-6 atomu glukoze povezana je glikozidnom vezom
sa -galaktozom. Poto su poluacetalne hidroksilne grupe monosaharidnih jedinica blokirane u
ovom trisaharidu, rafinoza je neredukujui eer. Iz ovog razloga se hidroliza rafinoze pomou
a-galaktozidaze moe lako pratiti pomou DNS metode jer se hidrolizom, pored neredukujue
saharoze, oslobaa redukujui eer galaktoza. Stoga, standardna prava se konstruie pomou
rastvora koji sadre razliite koncentracije galaktoze, poto drugi proizvod reakcije, saharoza, ne
utie na redukujuu mo rastvora.

5.4.1. Enzimska hidroliza rafinoze

5.4.1.1. Hemikalije
Na-acetatni pufer (0,1M; pH 4,5)
Rastvor rafinoze (50 mM)
Rastvor -galaktozidaze (0,5 mg/ml)
Osnovni rastvor galaktoze (10 mM)

5.4.2. Postupak

5.4.2.1. Odreivanje standardne prave galaktoze
Proizvod reakcije hidrolize rafinoze je ekvimolarna smea saharoze i galaktoze, ali poto
saharoza nije redukujui eer praenjem sadraja redukujuih eera se ustvari prati samo
nastala galaktoza. Zato e u ovoj vebi standardna prava biti odreena pomou rastvora
galaktoze razliitih koncentracija.
Za konstruisanje standardne prave neophodno je pripremiti po 0,5 ml razliitih rastvora
galaktoze i dodati 0,5 ml DNS reagensa, prema uputstvu iz tabele.
Redni
broj
epruvete
Zapremina osnovnog
rastvora galaktoze
(ml)
Zapremina
pufera (ml)
Zapremina
DNS reagensa
(ml)
Koncentracija
galaktoze
(mM)
0 0 0,5 0,5 0
1 0,025 0,475 0,5 0,5
2 0,05 0,45 0,5 1
3 0,1 0,4 0,5 2
4 0,2 0,3 0,5 4
5 0,3 0,2 0,5 6
6 0,4 0,1 0,5 8
7 0,5 0 0,5 10

Epruvete se zatim ostave 5 minuta u kljualom vodenom kupatilu, razblae sa 4 ml vode,
vorteksiraju se i meri se apsorbanca rastvora na 540 nm u odnosu na slepu probu. Nacrta se
standardna kriva zavisnosti apsorbance od koncentracije galaktoze (mmol dm
-3
).

5.4.2.2. Hidroliza rafinoze
Pripremanje supstrata:
Rastvor supstrata priprema se tako to se u epruvetu prenese 3 ml acetatnog pufera i 1 ml
rastvora rafinoze. Zatim se epruveta sa supstratom i enzimski preparat (-galaktozidaza)
inkubiraju na temperaturi reakcije (45
o
C) u toku 15 minuta. Svrha ovog koraka je da obe
komponente reakcione smee dostignu temperaturu reakcije pre meanja u sledeem koraku,
ime se obezbeuje da od poetka eksperimenta reakciona smea bude na eljenoj temperaturi.

Reakcija:
Zatim se u epruvetu doda 1 ml rastvora -galaktozidaze, smea se promea na vorteksu i inkubira
na 45
o
C da bi se odigrala reakcija hidrolize rafinoze. Iz ove epruvete se svakih 5 min uzimaju
uzorci zapremine 0,5 ml radi odreivanja koncentracije redukujuih eera i praenja toka
hidrolize rafinoze. (Treba obratiti panju da se tokom uzorkovanja reakciona smea minimalno
zadrava van termostata!)

Odreivanje koncentracije redukujuih eera i stepena hidrolize rafinoze:
Ovi uzorci u daljem toku prolaze kroz jednak tretman kao rastvori razliitog stepena
hidrolize laktoze pri odreivanju standardne krive. Dakle, u 0,5 ml uzorka doda se 0,5 ml DNS
reagensa Epruvete se zatim ostave 5 minuta u kljualom vodenom kupatilu, razblae sa 4 ml
vode, vorteksiraju se i meri se apsorbanca rastvora na 540 nm u odnosu na slepu probu.
Nakon merenja apsorbance uzorka, izraunati koncentraciju galaktoze u uzorku i stepen
hidrolize rafinoze na osnovu standardne krive odreene u 5.4.2.1.