Professional Documents
Culture Documents
Holesterol
Holesterol (holest-5-en-3-ol) je steroid u ijoj strukturi se nalaze prstenovi B/C i C/D u trans
poloaju, a zbog dvostruke veze u poloaju C-5 izmeu A i B prstena nema izomerije. Hidroksilna
grupa na C-3 poloaju je u konformaciji, pa holesterol ima hemijske osobine sekundarnog alkohola.
Hemijske metode
Od hemijskih metoda ranije je koriena Liebermann-Burchard-ova metoda. Princip
reakcije je oksidacija holesterola u jako kiseloj sredini (smea sumporne kiseline, siretne kiseline ili
anhidrida siretne kiseline). U toku reakcije holesterol se postupno oksidie, tako da se u svakom
stepenu oksidacije dobija holestapolien molekul koji ima jednu dvostruku vezu vie nego jedinjenje iz
koga je dobijen. Siretna kiselina i anhidrid siretne kiseline slue kao rastvarai i dehidratacioni
agensi, a sumporna kiselina ima ulogu u dehidrataciji i oksidaciji. Intenzitet nastale boje je vei za
estre holesterola, a u reakciji interferiraju bilirubin (u prisustvu reagensa se oksiduje u biliverdin, koji
apsorbije u istoj oblasti kao i obojeni proizvod), vitamini A, C i D, steroidni hormoni, mokrana
kiselina itd.
Zbog navedenih interferencija ova metoda je modifikovana, pa se izvodila kao jednostepena
ili ak kao etvorostepena metoda. Jednostepene metode su direktni postupci u kojima nema pripreme
uzorka, niti ekstrakcije steroida. Samim tim postoji verovatnoa pojave greke usled interferencija,
kao i zbog razlika u intenzitetu boje izmeu slobodnog i esterifikovanog holesterola. Dvostepene
metode ukljuuju fazu ekstrakcije pre odreivanja samog holesterola, ime se otklanjaju nespecifini
hromogeni koji mogu da interferiraju. Poto nema faze saponifikacije, jo uvek postoji razlika izmeu
intenziteta boje koju daju slobodan i esterifikovan holesterol. Trostepene metode imaju pored stepena
ekstrakcije i stepen saponifikacije, kojim se hidrolizuju estri holesterola. U ovu grupu spada Abell-ova
metoda koja je referentna. U ovoj metodi serum se tretira rastvorom KOH da bi se izvrila
saponifikacija estara holesterola. Zatim se holesterol ekstrahuje iz smee pomou heksana, a potom se
ekstrahovani rastvor sui u vakuumu. Na kraju se osueni ostatak rastvara u Liebermann-Burchardovom reagensu, a intenzitet nastale boje se meri na 620 nm. Kao standard se koristi ist holesterol.
Iako je ova metoda jako zametna jo uvek se smatra referentnom metodom. Postoje i etvorostepene
metode, koje posle faze ekstrakcije i saponifikacije imaju i fazu taloenja holesterola digitoninom.
Digitonin reaguje sa hidroksilnom grupom u poloaju C-3 i taloi holesterol, pa se na taj nain
eliminie interferirajui uticaj nespecifinih hromogena. Generalno, metode koje imaju vie faza su
specifinije, ali mogu da budu izvor mnogih greaka.
Metode sa feri-jonom u kiseloj sredini se izvode sa siretnom i sumpornom kiselinom, (bez
anhidrida siretne kiseline), ime se vri dehidratacija, a zatim sledi oksidacija sa feri-jonom i nastaje
tetraenilni katjon iji se intenzitet boje meri na 563 nm. Ove metode su oko sedam puta osetljivije od
Liebermann-Burchard metoda, a slobodan i esterifikovan holesterol daju istu boju, tako da nema
potrebe da se hidrolizuju estri.
Metode sa p-toluensulfonskom kiselinom su sline prethodnim metodama, izvode se u
prisustvu siretne kiseline, anhidrida sircetne kiseline i sumporne kiseline. Esterifikovani i slobodni
holesterol daju istu boju iji se intenzitet meri na 550 nm.
Enzimske metode
Prve metode za enzimsko odreivanje holesterola imale su stepen hemijske saponifikacije
estara, a savremene metode su potpuno enzimske.
Prvi stepen u ovim metodama ukljuuje saponifikaciju estara holesterola sa holesterolesterazom:
holesterol- esteraza
holesterol - estar H 2 O
U sledeoj fazi se holesterol oksiduje u prisustvu holesterol-oksidaze pri emu se dobija 4-holestenon
(holest-4-en-3-on) i vodonik-peroksid:
holesterol O 2
holesterol- oksidaza
4 holestenon H 2 O 2
Posle ove reakcije holesterol moe da se odredi polarografski (direktna metoda) merenjem brzine
utroka kiseonika, ime se izbegava interferencija bilirubina. U direktnoj metodi interferiraju:
turbiditet, lipemija, ikterinost i hemoliza.
Pored toga, vodonik-peroksid je mogue odrediti reakcijama u kojima se dobijaju obojeni
proizvodi ija se apsorbancija meri spektrofotometrijski (indirektne metode).
peroksidaz
a hinonimin 4H 2 O
2H 2 O 2 fenol 4 aminofenazon
ili
katalaza
formaldehid H 2 O
H 2 O 2 metanol
formaldehid acetilaceton
katalaza
acetaldehid + NADP
acetaldehid + 2 H 2 O
aldehid - dehidrogenaza
acetat + H + NADP
Trigliceridi
Trigliceridi su estri glicerola i masnih kiselina. Trigliceridi biljnog porekla sadre polinezasiene
masne kiseline C18:2 i u tenom su obliku, dok oni ivotinjskog porekla sadre zasiene masne
kiseline C12:0 i C18:0 i na sobnoj temperaturi su u vrstom obliku.
Poreklo triglicerida u organizmu moe biti egzogeno (unose se hranom) ili endogeno (sintetiu se
u jetri). Egzogeni trigliceridi se varenjem razgrauju do glicerola, monoglicerida i neesterifikovanih
masnih kiselina, a zatim apsorbuju u intestinumu. U enterocitima se trigliceridi ponovo sintetiu, pa se
u cirkulaciji prenose putem hilomikrona. Endogeni trigliceridi se u cirkulaciji transportuju putem
VLDL estica.
Trigliceridi se nalaze u svim lipoproteinima, ali je njihov sadraj najvei u lipoproteinima ija je
gustina manja od 1,019 kg/L (hilomikroni, hilomikronski ostaci, VLDL i IDL estice). U stanju
gladovanja hilomikroni nisu prisutni u cirkulaciji, pa trigliceridi u plazmi veinom potiu od VLDL-a.
Koncentracija triglicerida je najvia 4 sata nakon obroka, a vrednosti ostaju poviene vie od 8 sati,
sve dok se ne uklone svi hilomikroni. Zbog toga je neophono da se uzorak krvi za odreivanje
koncentracije triglicerida uzima 12h nakon poslednjeg obroka.
Ako su u serumu prisutne visoke koncentracije lipoproteina u ijem sastavu se nalazi najvei
procenat triglicerida (hilomikroni i VLDL estice), stvara se zamuenje ili opalescenciija, jer su ovi
lipoproteini veih dimenzija. Zamuenje je vidljivo kada je koncentracija triglicerida vea od 4,52
mmol/L.
Koncentracija triglicerida se odreuje u cilju postavljanja dijagnoze i praenja terapije familijarne
hipertrigliceridemije, utvrivanja rizika za nastanak kardiovaskularnih oboljenja, ali i za izraunavanje
koncentracije LDL-holesterola.
Uzorke seruma ili plazme treba to pre ohladiti, zbog aktivnosti endogenih lipaza. Ako se uzorak
uva na 4oC stabilan je nedelju dana, na -20 oC tri meseca, a na -80oC godinama. Nakon odmrzavanja,
lipemine serume treba pre analiziranja zagrejati na 37 oC i dobro promeati.
U hemijske metode spada i referentna metoda. U ovoj metodi ekstrakcija triglicericerida se vri
smeom silicijumske kiseline (H4SiO4) i hloroforma, zatim se vri alkalna saponifikacija, oksidacija
glicerola i odreivanje formaldehida meta-perjodat-arsenit-hromotropnom kiselinom.
Enzimske metode
Ove metode se koriste za rutinsko odreivanje koncentracije triglicerida. U prvom stupnju reakcije
lipaza hidrolizuje trigliceride do glicerola i slobodnih masnih kiselina:
trigliceridi + 3 H2O
lipaza
U sledeem koraku odreuje se koncentracija glicerola preko niza uzastopnih enzimskih reakcija.
U zavisnosti od izbora enzimskih reakcija, odreivanje se moe vriti preko Warburg-ovog optikog
testa, preko formazana ili preko vodonik-peroksida.
Odreivanje glicerola preko Warburg-ovog optikog testa:
glicerol + ATP
glicerolkinaza
ADP + fosfoenol-piruvat
piruvat + NADH +H
piruvat kinaza
laktat dehidrogenaza
piruvat + ATP
laktat + NAD+
U poslednjoj, indikatorskoj reakciji, nastaje NAD +, pa se prati smanjenje apsorbancije na 340 nm,
koje je proporcionalno koncentraciji glicerola
Odreivanje glicerola preko formazana:
glicerol + ATP
glicerolkinaza
glicerol-3-fosfat + NAD+
glicerol3fosfat dehidrogenaza
dihidroksiaceton-fosfat + NADH + H+
formazan + NAD+
diaforaza
tetrazolijum so + NADH + H+
U poslednjoj, indikatorskoj reakciji, nastaje formazan, koji je crveno obojen i ija se apsorbancija
meri na 500-590 nm.
Odreivanje glicerola preko vodonik-peroksida:
glicerol-3-fosfat + O2
peroksidaza
dihidroksiaceton-fosfat + H2O2
hinonimin + 4H2O
U poslednjoj, indikatorskoj reakciji, nastaje hinonimin, koji je crveno obojen i ija se apsorbancija
meri na 500-550 nm.
Kako se u serumu nalazi i izvesna koliina slobodnog glicerola, to moe da bude razlog lano
povienih rezultata, pa se u nekim enzimskim metodama koristi slepa proba uzorka. U hemijskim
metodama ta interferencija je izbegnuta prethodnom ekstrakcijom triglicerida.
Potencijalna greka kod enzimskih metoda usled prisustva slobodnog glicerola moe da se
kompenzuje tako to se prvo odredi koncentracija triglicerida standardnim postupkom, gde se
istovremeno odreuju i slobodan i glicerol nastao hidrolizom triglicerida, a zatim se u istom uzorku
odreuje samo slobodni glicerol (na isti nain kao u standardnom postupku, ali bez lipaze). Iz razlike
ukupnog i slobodnog glicerola dobija se glicerol nastao hidrolizom triglierida.
Eksperimentalni rad:
1. Odreivanje koncentracije holesterola (CHOD-PAP metoda)
Ova metoda je zasnovana na hidrolizi holesterol estara (na C-3) do holesterola i masnih
kiselina, pod dejstvom holesterol-esteraze (CHE). Slobodan holesterol i holesterol osloboen iz estara
se oksiduju kiseonikom, pod uticajem holesterol-oksidaze (CHOD) do holestenona, uz izdvajanje
vodonik-peroksida. U drugoj reakciji dolazi do kondenzacije fenola sa reagensom za kuplovanje 4aminofenazonom (PAP) i vodonik-peroksidom, u prisustvu peroksidaze (POD). Nnastaje hromogen
hinonimin sa maksimumom apsorbancije na 500 nm.
holesterol- esteraza
holesterol - estar H 2 O
holesterol O 2
holesterol- oksidaza
4 holestenon H 2 O 2
2H 2 O 2 fenol 4 aminofenazon
Reagens 1
Enzimski reagens
Pipes pufer pH 6,8
Fenol
POD
4-AA
CHE
CHOD
peroksidaza
hinonimin 4H 2 O
50 mmol/L
10 mmol/L
> 1 kU/L
0,75 mmol/L
> 400 U/L
> 400 U/L
Reagens 2
Standard holesterola 5,17 mmol/L
Reagensi su spremni za upotrebu.
Kao uzorak koristiti serum ili EDTA ili heparizovanu plazmu.
Talasna duina 500nm
Kiveta 1 cm
Temperatura 30,37C
Pipetirati u epruvete
Auz
Ast
Asp
10 L
10 L
Standard
Destilovana voda
10 L
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Uzorak
Radni reagens
Promeati reakcionu smeu i inkubirati 5 minuta na 37 C ili 10 minuta na sobnoj temperaturi a zatim
izmeriti apsorbancije uzorka i standarda prema slepoj probi reagensa na 500 nm. Boja je stabilna 30
minuta.
Izraunavanje
A
ukupan holesterol, mmol/L = A x 5,17
A St
Preporuene koncentracije:
- preporueno: < 5,2 mmol/L
- umeren rizik: 5,2 6,19 mmol/L
- visok rizik: > 6,2 mmol/L
Koncentracija holesterola zavisi od mnogih faktora, a najvaniji meu njima su starost i pol, a
postoji i dnevna varijacija od 6 - 8%. Holesterol kod mukaraca je uvek vii nego kod ena pre
menopauze, a posle menopauze je odnos obrnut: ene imaju vie vrednosti holesterola nego mukarci.
Pored pola i starosti na vrednosti holesterola znaajan uticaj imaju i sledei faktori: naslee, nain
ishrane (zasiene masti u hrani poveavaju koncentraciju holesterola, a polinezasiene je smanjuju),
fizika aktivnost (efekat zavisi od tipa, intenziteta, trajanja vebanja), hormoni (hormon rasta,
glukagon i tiroksin smanjuju koncentraciju holesterola u plazmi).
Hiperholesterolemija se javlja usled primarnih hiperlipoproteinemija, ali i kao posledica drugih
bolesti (dijabetes melitus, disfunkcija tiroideje, nefrotski sindrom). Hipoholesterolemija se javlja kod
primarnih hipolipoproteinemija, a sekundarno se moe javiti kod nekih malignih i endokrinih bolesti.
lipaza
glicerol
kinaza
glicerol-3-fosfat + O2
glicerol
3 fosfat
oksidaza
peroksidaz
a
dihidroksiaceton-fosfat + H2O2
hinonimin + 4H2O
Reagensi
Reagens 1 Pufer reagnes
Pipes pufer pH 7,4
40 mmol/L
4-hlorfenol
5,4 mmol/L
Reagens 2 Enzimski reagens
Mg2+
5 mmol/L
POD
0,8 U/mL
4-AA
0,4 mmol/L
GK
> 0,4 U/mL
GPO
> 1,5 U/mL
ATP
1,0 mmol/L
Lipaza
> 150 U/L
Reagens 3
Standard triglicerida
2,29 mmol/L
Radni reagens: Sadraj enzimskog reagensa rastvoriti u pufer reagensu, kvantitativno preneti u
boicu sa pufer reagensom i promeati.
Kao uzorak koristiti serum ili EDTA ili heparizovanu plazmu.
Talasna duina 500nm
Kiveta 1 cm
Temperatura 25,30, 37C
Pipetirati u epruvete
Auz
Ast
Asp
10 L
10 L
Standard
Destilovana voda
Uzorak
10 L
Radni reagens
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Promeati reakcionu smeu i inkubirati 5 minuta na temperaturi od 37C ili 10 minuta na temperaturi
20-25C, a zatim izmeriti apsorbancije uzorka (Auz) i standarda (Ast) prema slepoj probi reagensa
(Asp). Merenje izvriti u roku od 30 minuta na 500 nm.
Izraunavanje
trigliceridi, mmol/L = Auz/Ast x 2,29
Preporuene koncentracije:
10