Vežbe iz medicinske biohemije

Holesterol
Holesterol (holest-5-en-3β-ol) je steroid u čijoj strukturi se nalaze prstenovi B/C i C/D u trans
položaju, a zbog dvostruke veze u položaju C-5 između A i B prstena nema izomerije. Hidroksilna
grupa na C-3 položaju je u β konformaciji, pa holesterol ima hemijske osobine sekundarnog alkohola.

Holesterol je neophodan je za normalno funkcionisanje organizma jer učestvuje u izgradnji

membrana svih životinjskih ćelija, prekursor je žučnih kiselina i svih steroidnih hormona. Sa
organskim i neorganskim kiselinama gradi estre, a u humanom organizmu ta reakcija se odigrava sa
masnim kiselinama. Holesterol i njegovi estri sa masnim kiselinama su skoro potpuno nerastvorljivi u
vodi, pa se u cirkulaciji prenose lipoproteinima.
Holesterol je prisutan u svim lipoproteinima, ali se oko 60% ukupnog holesterola transportuje
putem LDL čestica. Oko 2/3 holesterola je esterifikovano masnim kiselinama dugih lanaca, najviše sa
linolenskom kiselinom, jer je najzastupljenija. Esterifikaciju holesterola u plazmi katalizuje enzim
lecitin-holesterol-acil-transferaza (LCAT), a intracelularno enzim acil-koenzim A: holesterol-
aciltransferaza (ACAT). Hidroliza estara holesterola se odvija u jetri.
Koncentracija ukupnog holesterola određuje se u okviru ispitivanja lipidnog statusa pacijenta.
Parametari lipidnog statusa se određuju u cilju postavljanja dijagnoze dislipidemije, praćenja terapije
dislipidemije i utvrđivanja rizika za nastanak kardiovaskularnih oboljenja. Pokazano je da postoji
pozitivna veza između koncentracije holesterola i razvoja kardiovaskularnih bolesti; zato se
koncentracija ukupnog holesterola koristi kao jedan od parametara za praćenje i tretman
kardiovaskularnih bolesti. Za razliku od drugih parametara koji se određuju u laboratorijama, za
koncentracije lipida u serumu ne koriste se referentne vrednosti, već preporučene vrednosti, koje su
zapravo granične vrednosti za definisanje najmanjeg rizika za razvoj kardiovaskularnih bolesti. Ove
preporuke su date od strane asocijacija za prevenciju i tretman kardiovaskularnih bolesti. Primenom
preporučenih vrednosti moguće je razdvojiti osobe sa različitim stepenom rizika za pojave bolesti, tj.
svrstati ih u visoko rizičnu, umereno rizičnu ili grupu bez rizika. Preporučene koncentracije ukupnog
holesterola su od 4,68 - 5,2 mmol/L, umereno rizične koncentracije od 5,2 - 6,2 mmol/L, a vrednosti
veće od 6,2 mmol/L su visoko-rizične.
Ukoliko se pacijentu određuje samo koncentracija holesterola, nije neophodno uzimati uzorak
natašte. Međutim, ukoliko se određuju i ostali parametri lipidnog statusa (trigliceridi, HDL-holesterol i
LDL-holesterol, što je najčešći slučaj), uzorak se mora uzeti posle 12-časovnog gladovanja.
Koncentracija holesterola se može određivati u punoj krvi (ređe), serumu ili plazmi. Preporuka je ipak
da se koristi serum, s obzirom da su preporučene koncentracije holesterola utvrđene određivanjem
ovog parametra u serumu. Najbolje je analizirati uzorak istog dana, mada je koncentracija holesterola
u uzorku stabilna do 4 dana ukoliko se čuva na 4˚C. Ukoliko se uzorak zamrzne (-20˚C) koncentracija
holesterola je stabilna nekoliko meseci, a na -80 ˚C je stabilna nekoliko godina.

1
 Vežbe iz medicinske biohemije

Metode za određivanje koncentracije holesterola

Holesterol se određuje pomoću hemijskih i enzimskih metoda. Određivanje koncentracije ukupnog
holesterola podrazumeva određivanje i esterifikovanog i slobodnog holesterola. To ima određen
analitički značaj, jer u nekim reakcijama boja koju daju estri holesterola ima veći intenzitet, što može
da prouzrokuje grešku.

Hemijske metode
Od hemijskih metoda ranije je korišćena Liebermann-Burchard-ova metoda. Princip reakcije je
oksidacija holesterola u jako kiseloj sredini (smeša sumporne kiseline, sirćetne kiseline i anhidrida
sirćetne kiseline). U toku reakcije holesterol se postupno oksiduje, tako da se u svakom stepenu
oksidacije dobija holestapolien molekul koji ima jednu dvostruku vezu više nego jedinjenje iz koga je
dobijen. Sirćetna kiselina i anhidrid sirćetne kiseline služe kao rastvarači i dehidratacioni agensi, a
sumporna kiselina ima ulogu u dehidrataciji i oksidaciji. Intenzitet nastale boje je veći za estre
holesterola, a u reakciji interferiraju bilirubin (u prisustvu reagensa se oksiduje u biliverdin, koji
apsorbije u istoj oblasti kao i obojeni proizvod), vitamini A, C i D, steroidni hormoni, mokraćna
kiselina itd.
Zbog navedenih interferencija ova metoda je modifikovana, pa se izvodila kao jednostepena ili čak
kao četvorostepena metoda. Jednostepene metode su direktni postupci u kojima nema pripreme
uzorka, niti ekstrakcije steroida. Samim tim postoji verovatnoća pojave greške usled interferencija,
kao i zbog razlika u intenzitetu boje između slobodnog i esterifikovanog holesterola. Dvostepene
metode uključuju fazu ekstrakcije pre određivanja samog holesterola, čime se otklanjaju nespecifični
hromogeni koji mogu da interferiraju. Pošto nema faze saponifikacije, još uvek postoji razlika između
intenziteta boje koju daju slobodan i esterifikovan holesterol. Trostepene metode imaju pored stepena
ekstrakcije i stepen saponifikacije, kojim se hidrolizuju estri holesterola. U ovu grupu spada Abell-ova
metoda koja je referentna. U ovoj metodi serum se tretira rastvorom KOH da bi se izvršila
saponifikacija estara holesterola. Zatim se holesterol ekstrahuje iz smeše pomoću heksana, a potom se
ekstrahovani rastvor suši u vakuumu. Na kraju se osušeni ostatak rastvara u Liebermann-Burchard-
ovom reagensu, a intenzitet nastale boje se meri na 620 nm. Kao standard se koristi čist holesterol.
Iako je ova metoda jako zametna još uvek se smatra referentnom metodom. Postoje i četvorostepene
metode, koje posle faze ekstrakcije i saponifikacije imaju i fazu taloženja holesterola digitoninom.
Digitonin reaguje sa hidroksilnom grupom u položaju C-3 i taloži holesterol, pa se na taj način
eliminiše interferirajući uticaj nespecifičnih hromogena. Generalno, metode koje imaju više faza su
specifičnije, ali mogu da budu izvor mnogih grešaka.
Metode sa feri-jonom u kiseloj sredini se izvode sa sirćetnom i sumpornom kiselinom, ali bez
anhidrida sirćetne kiseline, čime se vrši dehidratacija, a zatim sledi oksidacija sa feri-jonom i nastaje
tetraenilni katjon čiji se intenzitet boje meri na 563 nm. Ove metode su oko sedam puta osetljivije od
Liebermann-Burchard-ove metode, a slobodan i esterifikovan holesterol daju istu boju, tako da nema
potrebe da se hidrolizuju estri.
Metode sa p-toluensulfonskom kiselinom su slične prethodnim metodama, izvode se u prisustvu
sirćetne kiseline, anhidrida sircetne kiseline i sumporne kiseline. Esterifikovani i slobodni holesterol
daju istu boju čiji se intenzitet meri na 550 nm.

2
 Vežbe iz medicinske biohemije

Enzimske metode
Prve metode za enzimsko određivanje holesterola imale su stepen hemijske saponifikacije estara, a
savremene metode su potpuno enzimske.
Prvi stepen u ovim metodama uključuje saponifikaciju estara holesterola sa holesterol-esterazom:

holesterol - estar + H 2 O     
→ holesterol + masna kiselina
holesterol- esteraza

U sledećoj fazi se holesterol oksiduje u prisustvu holesterol-oksidaze pri čemu se dobija Δ4-holestenon
(holest-4-en-3-on) i vodonik-peroksid:

holesterol + O 2     → Δ 4 − holestenon + H 2 O 2

holesterol- oksidaza

Posle ove reakcije holesterol može da se odredi polarografski (direktna metoda) merenjem brzine
utroška kiseonika, čime se izbegava interferencija bilirubina. U direktnoj metodi interferiraju:
turbiditet, lipemija, ikteričnost i hemoliza.
Pored toga, vodonik-peroksid je moguće odrediti reakcijama u kojima se dobijaju obojeni
proizvodi čija se apsorbancija meri spektrofotometrijski (indirektne metode).

2H 2 O 2 + fenol + 4 − aminofenazon   → hinonimin + 4H 2 O

peroksidaza

ili
H 2 O 2 + metanol  → formaldehid + H 2 O
katalaza

formaldehid + acetilaceton 
→ 3,5 − diacetil − 1,4 − dihidrolutidin

Vodonik-peroksid može da se odredi i metodom u kojoj se u indikatorskoj reakciji meri apsorbancija

redukovanog piridin-nukleotida (Warburg-ov optički test):

H 2 O 2 + etanol  
→ acetaldehid + 2 H 2 O
katalaza

acetaldehid + NADP +      → acetat + H + + NADP

aldehid- dehidrogenaza

Interferencije se javljaju u prisustvu povišene koncentracije bilirubina, askorbinske kiseline i drugih

supstanci koje troše vodonik-peroksid (negativna interferencija), dok hemoliza i mokraćna kiselina ne
ometaju njegovo određivanje.
Enzimske metode za određivanje koncentracije holesterola se izvode kao metode završne tačke
(„end-point” reakcije), moguće ih je automatizovati (nema potrebe da se vrši ekstrakcija), a za analizu
je potrebna mala zapremina uzorka.
U ovim metodama kao standard se može koristiti primarni standardni rastvor holesterola
(stabilizovani slobodan holesterol) ili kalibratorski serumi. Kako se u primarnom standardu nalazi
samo slobodan holesterol, a u uzorku pacijenta se inače nalaze i slobodan i esterifikovani holesterol,
postoji mogućnost da se dobiju niži rezultati. Osim toga, u standardu se koriste različiti deterdženti
koji služe za solubilizaciju holesterola, a oni mogu da inhibiraju aktivnost holesterol-oksidaze i tako
dovedu do nižih rezultata.

3
 Vežbe iz medicinske biohemije

Trigliceridi
Trigliceridi su estri glicerola i masnih kiselina. Trigliceridi biljnog porekla sadrže polinezasićene
masne kiseline C18:2 i u tečnom su obliku, dok oni životinjskog porekla sadrže zasićene masne
kiseline C12:0 i C18:0 i na sobnoj temperaturi su u čvrstom obliku.

Poreklo triglicerida u organizmu može biti egzogeno (unose se hranom) ili endogeno (sintetišu se
u jetri). Egzogeni trigliceridi se varenjem razgrađuju do glicerola, monoglicerida i neesterifikovanih
masnih kiselina, a zatim apsorbuju u intestinumu. U enterocitima se trigliceridi ponovo sintetišu, pa se
u cirkulaciji prenose putem hilomikrona. Endogeni trigliceridi se u cirkulaciji transportuju putem
VLDL čestica.
Trigliceridi se nalaze u svim lipoproteinima, ali je njihov sadržaj najveći u lipoproteinima čija je
gustina manja od 1,019 kg/L (hilomikroni, hilomikronski ostaci, VLDL i IDL čestice). U stanju
gladovanja hilomikroni nisu prisutni u cirkulaciji, pa trigliceridi u plazmi većinom potiču od VLDL-a.
Koncentracija triglicerida je najviša 4 sata nakon obroka, a vrednosti ostaju povišene više od 8 sati,
sve dok se ne uklone svi hilomikroni. Zbog toga je neophono da se uzorak krvi za određivanje
koncentracije triglicerida uzima 12h nakon poslednjeg obroka.
Ako su u serumu prisutne visoke koncentracije lipoproteina u čijem sastavu se nalazi najveći
procenat triglicerida (hilomikroni i VLDL čestice), stvara se zamućenje ili opalescenciija, jer su ovi
lipoproteini većih dimenzija. Zamućenje je vidljivo kada je koncentracija triglicerida veća od 4,52
mmol/L.
Koncentracija triglicerida se određuje u cilju postavljanja dijagnoze i praćenja terapije familijarne
hipertrigliceridemije, utvrđivanja rizika za nastanak kardiovaskularnih oboljenja, ali i za izračunavanje
koncentracije LDL-holesterola.
Uzorke seruma ili plazme treba što pre ohladiti, zbog aktivnosti endogenih lipaza. Ako se uzorak
čuva na 4oC stabilan je nedelju dana, na -20oC tri meseca, a na -80oC godinama. Nakon odmrzavanja,
lipemične serume treba pre analiziranja zagrejati na 37oC i dobro promešati.

Metode za određivanje koncentracije triglicerida

Hemijske metode
Trigliceridi se ekstrahuju organskim rastvaračem ili prečiste adsorbensom, čime se uklanjaju
fosfolipidi i slobodan glicerol. Ekstrakt se saponifikuje kako bi se oslobodio glicerol, a zatim se vrši
oksidacija glicerola sa perjodatom do formaldehida. Dalje određivanje formaldehida može se vršiti na
različite načine, uglavnom u reakciji sa hromoforama, pri čemu nastaje hromogen čija se
apsorbanacija meri na kraju.

4
 Vežbe iz medicinske biohemije

U hemijske metode spada i referentna metoda. U ovoj metodi ekstrakcija triglicericerida se vrši
smešom silicijumske kiseline (H4SiO4) i hloroforma, zatim se vrši alkalna saponifikacija, oksidacija
glicerola i određivanje formaldehida meta-perjodat-arsenit-hromotropnom kiselinom.

Enzimske metode
Ove metode se koriste za rutinsko određivanje koncentracije triglicerida. U prvom stupnju reakcije
lipaza hidrolizuje trigliceride do glicerola i slobodnih masnih kiselina:

→
lipaza
trigliceridi + 3 H2O glicerol + 3 masne kiseline

U sledećem koraku određuje se koncentracija glicerola preko niza uzastopnih enzimskih reakcija.
U zavisnosti od izbora enzimskih reakcija, određivanje se može vršiti preko Warburg-ovog optičkog
testa, preko formazana ili preko vodonik-peroksida.

Određivanje glicerola preko Warburg-ovog optičkog testa:

glicerol−kinaza
glicerol + ATP    → glicerol -3-fosfat + ADP

piruvat −kinaza
ADP + fosfoenol-piruvat    → piruvat + ATP

laktat −dehidrogenaza
piruvat + NADH +H      
→ laktat + NAD+

U poslednjoj, indikatorskoj reakciji, nastaje NAD+, pa se prati smanjenje apsorbancije na 340 nm,
koje je proporcionalno koncentraciji glicerola

Određivanje glicerola preko formazana:

glicerol−kinaza
glicerol + ATP    → glicerol -3-fosfat + ADP

glicerol−3−fosfat −dehidrogenaza
glicerol-3-fosfat + NAD+         
→ dihidroksiaceton-fosfat + NADH + H+

 →
diaforaza
tetrazolijum so + NADH + H+ formazan + NAD+

U poslednjoj, indikatorskoj reakciji, nastaje formazan, koji je crveno obojen i čija se apsorbancija
meri na 500-590 nm.

5
 Vežbe iz medicinske biohemije

Određivanje glicerola preko vodonik-peroksida:

glicerol−kinaza
glicerol + ATP    → glicerol -3-fosfat + ADP

glicerol −3− fosfat − oksidaza

glicerol-3-fosfat + O2       → dihidroksiaceton-fosfat + H2O2

  →
peroksidaza
2 H2O2 + fenol + 4-aminofenazon hinonimin + 4H2O

U poslednjoj, indikatorskoj reakciji, nastaje hinonimin, koji je crveno obojen i čija se apsorbancija
meri na 500-550 nm.

Kako se u serumu nalazi i izvesna količina slobodnog glicerola, to može da bude razlog lažno
povišenih rezultata, pa se u nekim enzimskim metodama koristi slepa proba uzorka. U hemijskim
metodama ta interferencija je izbegnuta prethodnom ekstrakcijom triglicerida.
Potencijalna greška kod enzimskih metoda usled prisustva slobodnog glicerola može da se
kompenzuje tako što se prvo odredi koncentracija triglicerida standardnim postupkom, gde se
istovremeno određuju i slobodan i glicerol nastao hidrolizom triglicerida, a zatim se u istom uzorku
određuje samo slobodni glicerol (na isti način kao u standardnom postupku, ali bez lipaze). Iz razlike
ukupnog i slobodnog glicerola dobija se glicerol nastao hidrolizom triglicerida.

glicerol iz TG = ukupan glicerol - slobodan glicerol

(sa lipazom) (bez lipaze)

Nedostatak ove modifikacije je to sto se istovremeno rade dve analize iz istog uzorka. Ovaj način
eliminacije interferencije slobodnog glicerola se još naziva metoda spoljne slepe probe.
Još jedna od modifikacija enzimskih metoda podrazumeva preinkubaciju sa glicerol-kinazom,
glicerol-oksidazom i peroksidazom. Ovim reakcijama se vrši razgradnja slobodnog glicerola, a potom
uzorak tretira lipazom, tj. počinje standardni enzimski postupak. U samom reagensu postoji sve što
treba da se eliminiše endogeni glicerol, ali da se ne oslobodi jedinjenje koje se može meriti. Ovaj
način eliminacije interferencije slobodnog glicerola se još naziva metoda unutrašnje slepe probe.
Osim glicerola, izvori endogene interferencije su i hemoliza, bilirubin i jaka lipemija. Glicerol
može biti i egzogenog porekla, u slučaju primene epruveta presvučenih glicerolom (za kapilarnu krv),
krema za ruke ili laboratorijskih deterdženata.
Slepa proba uzorka se obavezno postavlja ukoliko je koncentracija triglicerida veća od 2,83
mmol/L, a rezultat se izdaje sa naznakom da je urađena slepa proba uzorka.

U metodama se kao standard može koristiti primarni standard glicerola (vodeni rastvor). U tom
slučaju ne radi se prva reakcija hidrolize pod dejstvom lipaze. Alternativno, može se koristiti
tripalmitin ili triolein, koji su nerastvorni u vodi, te zahtevaju organske rastvarače, a to može da
interferira pri enzimskom određivanju. Kao sekundarni standard može se koristiti serumski pool
(mešavina seruma više osoba). Za pripremanje pool-a koriste se uzorci u kojima je koncentracija
triglicerida manja od 2,25 mmol/L. U serumskom pool-u koncentracija triglicerida mora biti određena
referentnom metodom, a uz svaku seriju se obavezno postavlja primarni standard glicerola u cilju
provere linearnosti metode.

6
 Vežbe iz medicinske biohemije

Eksperimentalni rad:

1. Određivanje koncentracije holesterola (CHOD-PAP metoda)

Ova metoda je zasnovana na hidrolizi holesterol estara (na položaju C-3) do holesterola i masnih
kiselina, pod dejstvom holesterol-esteraze (CHE). Slobodan holesterol i holesterol oslobođen iz estara
se oksiduju kiseonikom, pod uticajem holesterol-oksidaze (CHOD) do holestenona, uz izdvajanje
vodonik-peroksida. U drugoj reakciji dolazi do kondenzacije fenola sa reagensom za kuplovanje 4-
aminofenazonom (PAP) i vodonik-peroksidom, u prisustvu peroksidaze (POD). Nastaje hromogen
hinonimin sa maksimumom apsorbancije na 500 nm.

holesterol - estar + H 2 O     
→ holesterol + masna kiselina
holesterol- esteraza

holesterol + O 2     → Δ 4 − holestenon + H 2 O 2

holesterol- oksidaza

2H 2 O 2 + fenol + 4 − aminofenazon  
→ hinonimin + 4H 2 O
peroksidaza

Radni reagens (enzimski reagens)

Pipes pufer pH 7 35 mmol/L
Fenol 28 mmol/L
POD > 1 kU/L
4-aminofenazon 0,5 mmol/L
CHE > 400 U/L
CHOD > 400 U/L

Standard holesterola 5,18 mmol/L

Reagensi su spremni za upotrebu.

Kao uzorak koristiti serum ili EDTA ili heparizovanu plazmu.

Talasna dužina 500 nm

Kiveta 1 cm
Temperatura 30 ili 37ºC

Pipetirati u epruvete Auz Ast Asp

Radni reagens 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Uzorak 10 μL - -
Standard - 10 μL
Destilovana voda - - 10 μL
Promešati reakcionu smešu i inkubirati 5 minuta na 37 ºC ili 10 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim
izmeriti apsorbancije uzorka i standarda prema slepoj probi reagensa na 500 nm. Boja je stabilna dva
sata.

7
 Vežbe iz medicinske biohemije

Izračunavanje
AA
ukupan holesterol, mmol/L = ⋅ 5,18
A St

Preporučene koncentracije:
- preporučeno: < 5,2 mmol/L
- umeren rizik: 5,2 – 6,19 mmol/L
- visok rizik: > 6,2 mmol/L

Koncentracija holesterola zavisi od mnogih faktora, a najvažniji među njima su starost i pol. Sem
toga, postoji i dnevna varijacija u koncentraciji od 6 - 8%. Holesterol kod muškaraca je uvek viši nego
kod žena pre menopauze, a posle menopauze je odnos obrnut: žene imaju više vrednosti holesterola
nego muškarci. Pored pola i starosti na vrednosti holesterola značajan uticaj imaju i sledeći faktori:
nasleđe, način ishrane (zasićene masti u hrani povećavaju koncentraciju holesterola, a polinezasićene
je smanjuju), fizička aktivnost (efekat zavisi od tipa, intenziteta, trajanja vežbanja), hormoni (hormon
rasta, glukagon i tiroksin smanjuju koncentraciju holesterola u plazmi).
Hiperholesterolemija se javlja usled primarnih hiperlipoproteinemija, ali i kao posledica drugih
bolesti (dijabetes melitus, disfunkcija tiroideje, nefrotski sindrom). Hipoholesterolemija se javlja kod
primarnih hipolipoproteinemija, a sekundarno se može javiti kod nekih malignih i endokrinih bolesti.

2. Određivanje koncentracije triglicerida (GPO-PAP metoda)

Metoda je zasnovana na hidrolizi triglicerida do glicerola i masnih kiselina pod dejstvom

lipoproteinske lipaze (LPL). Fosforilacijom glicerola pod dejstvom glicerol-kinaze (GK), a zatim
oksidacijom glicerol-3-fosfata, pod dejstvom glicerol-3-fosfat-oksidaze (GPO) nastaje vodonik-
peroksid. Količina nastalog vodonik-peroksida se određuje u prisustvu 4-aminoantipirina i fenola pod
dejstvom peroksidaze (POD), pri čemu nastaje obojeni hinonimin, sa maksimumom apsorbancije na
500 nm. Intenzitet boje hinonimina je direktno proporcionalan koncentraciji triglicerida.

→
lipaza
trigliceridi + 3 H2O glicerol + 3 masne kiseline

glicerol −kinaza
glicerol + ATP    → glicerol -3-fosfat + ADP

glicerol −3− fosfat − oksidaza

glicerol-3-fosfat + O2       → dihidroksiaceton-fosfat + H2O2

  →
peroksidaza
2 H2O2 + fenol + 4-aminofenazon hinonimin + 4H2O

8
 Vežbe iz medicinske biohemije

Reagensi

Radni reagens (enzimski reagnes)

Pipes pufer pH 7,0 45 mmol/L
4-hlorfenol 6 mmol/L
2+
Mg 5 mmol/L
Peroksidaza 0,8 U/mL
4-aminofenazon 0,75 mmol/L
Glicerol-kinaza > 1,5 U/mL
Glic-3-fosfat oksidaza > 4 U/mL
ATP 0,9 mmol/L
Lipaza >100 U/L

Standard triglicerida 2,26 mmol/L

Kao uzorak koristiti serum ili EDTA ili heparizovanu plazmu.

Talasna dužina 500 nm

Kiveta 1 cm
Temperatura 25, 30 ili 37ºC

Pipetirati u epruvete Auz Ast Asp

Radni reagens 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Uzorak 10 μL - -
Standard - 10 μL
Destilovana voda - - 10 μL
Promešati reakcionu smešu i inkubirati 5 minuta na temperaturi od 37˚C ili 10 minuta na temperaturi
20-25˚C, a zatim izmeriti apsorbancije uzorka (Auz) i standarda (Ast) prema slepoj probi reagensa
(Asp). Merenje izvršiti u roku od dva sata na 500 nm.

Izračunavanje
AA
trigliceridi, mmol/L = ⋅ 2,26
A St
Preporučene koncentracije:
– optimalna: < 1,7 mmol/L
– granična: 1,70 – 2,25 mmol/L
– visoka: 2,26 – 5,64 mmol/L
– vrlo visoka: > 5,65 mmol/L