Primena HPLC na biolokim

materijalima
Student: Gordana Petrovi BH 31/2011
Prof: Dr.Rada Baoi
Dr.Sneana Mandi
HPLC analiza i fluorescentna
detekcija 3-D-hidroksibuterne
kiseline, deravitizacija sa
benzofurazanom; Primena u analizi
humane plazme

UVOD


Koncentracija D-3-HBA u serumu je indikator za oksidaciju
masnih kiselina u jetri, D-3-hidroksibuterna kiselina
predstavlja glavni oblik ketonskih tela posebno kod stanja kao
to je metabolika glad, dijabetes melitus, gde je oksidacija
masnih kiselina u jetri poboljana.
UVOD
Brojne metode raene su u ovu svrhu:
Enzimski testovi koji se zasnivaju na reakciji reverzibilnog
pretvaranja 3-D-HBA do acetoacetata, uz pomod enzima D-3-
hidrokisbuterne dehidrogenaze(absorbanca na 340 nm). Ova
enzimska-spekrofotometrijska metoda je jednostavna i tana,
ali nije dovoljno osetljiva i precizna.

GC-MS-primenjuje se kod uzoraka krvi i urina, koji sadre ovo
jedinjenje , pri koncentraciji vedoj od 20 mol/L. Medjutim
ova metoda zahteva specifinu i skupu aparaturu.

UVOD
Koristedi drugaiji pristup, naunici su razvili metodu
fluorescentne derivatizacije za enantioselektivno odreivanje
oba enantiomera 3-hidroksibutarata u normalnim tkivima
pacova i tkivima pacova obolelim od dijabetesa, koridenjem
HPLC sistema.

Imajudi u vidu prethodna ogranienja razvili su osetljiv i
pogodan HPLC sistem za kvantitativno odreivanje D
enantiomera 3-hidroksibuterne kiseline, iako L-3-
hidroskibuterna kiselina nema bioloki znaaj, potrebno je
odvojiti oba enantiomera.

UVOD
Potreban je selektivni i osetljiv sistem za detekciju malih koliina hiralnih
jedinjenja kod biolokih uzoraka. Fluorescentno obeleivanje je jedna od
najefikasnijih naina za kvantitativno odredjivanje biolokih uzoraka u
smislu osetljivosti i/ili selektivnosti.
U ovu svrhu sintetisan je hiralni fluoroescentni derivatizacioni reagens, koji
ima benzofuranoznu strukruru, (2S)-2-amino-3-metil-1-[4-(7-nitro-benzo-
2,1,3-oksadiazol-4-il)-piperazin-1-il]-butan-1(NBD-PZ-Val), koji lako i
kvantitativno reaguje sa D i L mlenom kiselinom i formira visoko stabilno i
fluorescentno jedinjenje, distereomerni amid.

Eksperimentalni deo
Hemikalije:

NBD-PZ
DIEA
O-(7-azobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronium
heksafluorofosfat (HATU)
D,L-3-hydroxybutyric and D-3-Hidroksibuterna kiselina, (S)-2-(Boc-
amino)-metilbuterna kiselina
(Boc-L-valin; enantiomerna distoda 99.0%), O-(benzotriazol-1-il)-
N,N,N,N-tetrametil-uronium heksafluorofosfat (HBTU),
trifluorsirdetna kiselina(TFA) , N ,N-dimetilformamid (DMF) i HCl
NBD-PZ-Val

Eksperimentalni deo
Uzorci plazme:
Dobijeni su standardnom procedurom. Humana krv je uvana u
epruvetama koje sadre EDTA kao antikoagulans. Plazma je dobijena
centrifugiranjem 2000 obrtaja/15 min, a uzorci su uvani na 80C do
analize.

Priprema uzoraka:
40 l uzorka(bilo humane plazme ili 20500 mol/L rastvora natrijum D-3-
hidroksibutarata ili D, L-3-hidroksibutarat u vodi) je pomeano sa 40 L
vode, i sa 120 L rastvora CH3CN, i dobijeni rastvor se centrifugira 4,500
obrtaja/6 min. Nakon toga 40 L dobijenog rastvora, dodat je u 40 L 6
mmol/L NBD-PZ-Val u CH3CN, u prisustvu 40 L HATU i DIEA (oba su 8
mmol/L u rastvoru CH3CN), i dobijeni rastvor inkubiran je na 30 C u toku 5
min a zatim zakieljen sa 80 L 1 mol/L HCl.


Aparatura i hromatografski uslovi

HPLC analize vrene su na Agilent
1100 sistemu sa degaserom,
gradijentnom kvaternarnom
pumpom sa visokim pritiskom,
runim injektorom za uzorke sa
petljom od 5 mikroL, grejaem
kolone i fluorescentnim
detektorom. Analiza podataka
raena je na Agilent ChemStation
softveru.
Mobilne faze su 0.1% vodeni
rastvor trifluorosirdetne kiseline i
MeOH(A i B). Odvajanje je
izvreno pri brzini protoka od 600
L/min.
Kolona je ekvilibrisana 30%
rastvorom B, koji je linearno
rastao tokom 20 minuta do 50%, i
tokom narednih 5 minuta do
100%, nakon ega je jos 2 minuta
proputan 100% B.
Eksperimentalni deo
Kalibracija i linearnost:
5 standarnih rastvora D-3-HBA u opsegu kocentracije 20500 mol/L, su
kalibrisani. Oni su bili analizirani 3x dnevno tokom 4 dana. Rezultati
linearne regresivne analize D-3-HBA, koji predstavljaju povrine pikova, su
kombinovani sa koncentracijama D-3-HBA ime su dobijeni kalibracioni
parametri za D-3-HBA.
Recovery i preciznost:
Recovery je odredjen analizom humane plazme uzete od zdravih ljudi
nakon dodatka D-3-HBA u raznim koncentracijama. Koncentracije
spajkovanih uzoraka su odredjivane po 3 puta. Reproduktivnost metode
potvrdjena je ponavljanjem analize 3 puta u toku jednog dana, i
ponavljanjem analize istog uzorka tokom 4 dana.



Rezultati
Fluorescentna svojstva
Spekti eksitacije i emisije hiralnog reagensa i derivati D-3-HBA u acetonitrilu.



Rezultati
Hromatografsko razdvajanje :
Hromatogram standardih rastvora derivatizovanog racemskog D-3-HBA u
vodi pokazuje odlino razdvajanje.

Rezultati
Hromatografsko razdvajanje:

Derivatizovani enantiomeri D-3-HBA u vodi, humanoj plazmi, i
standardni rastvori D-3-HBA u humanoj plazmi.

Pik se odnosi na D-3-HBA pokazuje da je dobro razdvojen, sa
vremenom zadravanja 15,3 minuta.

Rezultati
Rezultati
Linearnost , limit kvantifikacije(LOQ) i limit detekcije (LOD):
Kalibraciona kriva dobijena za D-3-HBA u je opsegu
koncentracije 20500 mol/L.
Jednaina regresije :
y = 2.16x + 6.70 (r
2
= 0.9997).
Limit kvantifikacije(LOQ) i limit detekcije(LOD) dobijaju se
matematiikim odreivanjem, deljenjem standardnog
odstupanja tri puta(za LOQ) i deset puta(za LOD).
LOD i LOQ vrednosti su 7,7 mol/L i 25,8 mol/L.

Rezultati
Recovery i preciznost
Recovery je procenjen merenjem koncentracije analita u humanoj plazmi
splajkovanjem 4 razliite koncentracije standardnih rastvora D-3-HBA u
opsegu 83,390,9%.




Rezultati
Reproduktivnost metode analizira se pomodu standardnih rastvora
derivatizovanih enantiomera D-3-HBA u humanoj plazmi. Vrednosti Intra-
testa su ispod 1% i vrednosti inter-testa iznad 2.13%.


Rezultati
Analiza derivata D-3-HBA u humanoj plazmi:
Koncentracije D-3-HBA u plazmi od 5 zdravih osoba bile su pogodne za
procenu primene metode kod biolokih uzoraka.


Diskusije
Ova tema opisuje korisnu indirektnu RP-HPLC metodu, sa
fluorescentnom detekcijom za kvantitativno odredjivanje D-3-
HBA u humanoj plazmi, upotrebom hiralnih derivatizacionih
reagenasa.

Sinteza reagenasa je jednostavna, zahvaljujudi blagim
reakcionim uslovima, ne javlja se racemizacija. Kao dokaz
dobijanja enantiomerno istog D-3-HBA , sa hiralnim
reagensom proizvela je pik, ime se ukazuje da je hiralni
deravitizacioni reagens optiki ist, i da se ne javlja
racemizacija u toku sinteze ovog reagensa ili tokom reakcije
deravitizacije.
Diskusije
HPLC metoda pokazuje sasvim zadovoljavajudu preciznost i
linearnost , i uspeno je primenjena za odredjivanje D-3-HBA
u malim koliinama (40 L) u uzorcima humane plazme.

Diastereomer L-3-HBA je dobro odvojen od D diastereomera u
puferu, skriven je u plazmi, zbog velikog pika, koji potie
najverovatnije od mlene kiseline.

Vano je napomenuti da je ova metoda osetljivija od bilo koje
druge metode.

Literatura
1. HPLC determination of D-3-hydroxybutyric acid by
derivatization with a benzofurazan reagent and fluorescent
detection: Application in the analysis of human plasma;
Clinica Chimica Acta; Giorgio Cevasco ,Anna Maria
Pitek,Sergio Theaa; vol. 429,90-95, 2014
HPLC metoda za odreivanje
piridoksal-5-fosfata i 4-piridoksalne
kiseline u humanoj plazmi
Uvod
4% intracelularne enzmske aktivnosti zavisi od PLP koji je
kofaktor vitamina B
6 .
4-PA je degradacioni produkat PLP-a, i
moe se meriti u krvnoj plazmi. Nedostatak PLP-a, povezuje
se sa kardiovaskularnim bolestima(CDV). Vedina studija
pokazala je da nedostatak vitamina B

povezan sa
inflamacijom. Ovaj vitamin je takoe i antioksidans, i moe
igrati ulogu u onkogenezi.
Uvod
Nekoliko metoda se koristi za ispitivanje PLP-a u plazmi, ali u
svim metodama se koriste toksini reagensi, i potrebna je
velika koliina uzoraka za analizu. Takoe u nekim analizama,
koeficijent varijacije u toku jednog dana je veoma visok, i do
37%, a tokom nekoliko dana varira od 2 do 26%. Srednja
vrednost recovery-a dodatog PLP-a u uzorcima plazme ide od
53 do 144 %.

Opisana HPLC metoda, je veoma jednostavna i precizna, ne
zahteva upotrebu toksinih reagenasa, i zahteva malu koliinu
uzoraka. U okviru metode ide i korak taloenja proteina.


Materijali i metode
Reagensi i standardni rastvori:
PLP, 4-PA, trihlorsirdetna kiselina(TCA), kalijum fosfat, natrijum
perhlorat.
Pripremljeni PLP standardi u duplo destilovanoj vodi.
Rastvorljivost 4-PA u vodi je mala; Stoga je 4-PA prvo rastvoren
u 1% rastvoru NaOH, a potom u duplo destilovanoj vodi.

Uzorci krvi sakupljani su u heparin boicama,i u boicama bez
antikoagulanta, za odreivanje seruma,i to od 168 ispitanika.

Materijali i metode
Uzorci krvi za analizu koeficijenta varijacije(CV):
Uzorci krvi sakupljani su od 10 zdravih osoba u heparin boicama, EDTA
boicama, i boicama bez antikoagulanta za odreivanje seruma za analizu
CV. Svi uzorci krvi uvani su na ledu, u mraku, i centifugirani 30 minuta na
4C. Boice za serum inkubirane su na 4C u toku 45 min, pre
centrifugiranja. Plazma sa dodatim heparinom, plazma sa dodatim EDTA
reagensom i serum su izolovani i korideni za ispitivanje preciznosti
analize.

Uzorci krvi za odreivanje recovery testa:
Sakupljeni su uzorci krvi od 6 osoba u heparin boicama. Za recovery test
uzeta je plazma sa dodatim heparinom.

Materijali i metode
Priprema plazme i seruma za HPLC analizu:
U 50 L uzorka plazme ili 50 L seruma, proteini su istaloeni
dodatkom 50 L 16% TCA; finalna koncentracija TCA bila je
8% u uzorku. Uzorci su stavljeni na vorteks (1 min) a potom
centifugirani 13,000 rpm/10 min na 4C. Proteini u plazmi su
odekantovani, i 25 L istog supernatanta je injektovano u
auto-sampler za odreivanje PLP-a i 4-PA.

HPLC sistem:
Sastoji se od 3000-Dionex Sistema, fluorescentnog detektora
(ex = 300 nm i em = 400 nm) i kolone grejaa.

Materijali i metode
Mobilna faza
Mobilna faza sadri pufer A koji sadri 0,1 M kalijum fosfat; 0,1 M natrijum
perhlorat i 0,5 g/L natrijum bisulfata.
Pufer B sadri 0,1 M kalijum fosfata, 0,1 M natrijum perhlorata, 0,5 g/L
natrijum bisulfate i 20%-tni rastvor acetonitrila.
pH vrednost pufera A i B je 3, dodatkom fosforne kiseline.
Kolona je ekvilibrisana 100% rastvorom A, od 0 do 4 minuta, i 27%
rastvorom B od 4,1 do 13 minuta. Kolona je isprana sa 50%tnim rastvorom
acetonitrila,a zatim eluirana rastvorom A pre nanoenja slededeg uzorka.

Merenje PLP-a i 4-PA u plazmi:
Na grafiku se na x osi nalaze PLP i 4-PA, a povrina pika nalazi se na y osi.
Koridenjem linearno regresivne analize povuena je prava, i na osnovu
jednaine prave, dobijene su koncentracije PLP i 4-PA u plazmi. Da bi se
merili PLP i 4-PA u uzorcima plazme, pripremani su svei PLP i 4PA
standardi.

Rezultati
Standardne krive:
Na slici 2 se vide standardne krive, rezultati linearne regresivne analize
PLP-a i 4PA. Nanoene su koncentracije standarda od 0-100 nmol/L PLP-a i
4-PA na x osu i njihove odgovarajuce povrine pikova na y osu,na dva
odvojena grafika.
Slika pokazuje standardne krive, linearne regresije PLP i 4-PA standarda.
Korelacioni koeficijenat (R):
Za PLP je 0,999 (p< 0,0001), Y = 0,002 + 0,15 X,
Za 4-PA, R je 0,999 (p< 0,0001) ), Y =0.04 + 0.045 X
4-PA u standardu i u uzorcima plazme pokazuje vii pik od PLP.

Slika 1 pokazuje prazan hromatogram, PLP standard, 4-PA standard i
spajkovane plazma uzorke.
Rezultati
Rezultati
Koeficijent varijacije:

Koeficijent varijacije za PLP i 4-PA (n= 10) tokom 3 dana odreen je za tri vrste
biolokih uzoraka(plazma sa dodatim heparinom, plazma sa EDTA reagensom i
serum),i varira od 2 do 26%, dok ukupni CV za sve dane varira od 5,5% do 6,0 %.
Koncentracija PLP u ovim uzorcima je znaajno razliita
(p <0.0001).
Koeficijent validacije za 4-PA u istim uzorcima je u opsegu od 1,8 % do 7,2 %, dok
ukupni CV za sve dane varira od 4,4% do 6,0%.
Koncentracija 4-PA u uzorcima je znaajno razliita
(p <0.0001).

Recovery:
Za ovu analizu dve razliite koncentracije PLP-a i 4-PA dodate su u uzorak plazme sa
heparinom.
Recovery PLP je od 100% do 107%, i recovery 4-PA u plasma je od 99% do 104%.
(Tabele 2B and 2C).

Rezultati
Rezultati


Literatura


1. A simple high-performance liquid chromatography (HPLC)
method for the measurement of pyridoxal-5-phosphate and
4-pyridoxic acid in human plasma; Rona Cabo, Karolina Kozik
Maciej Milanowski, Sigrunn Hernes, Audun Slettan,
Margaretha Haugen, Shu Ye, Rune Blomhoff, M.
AzamMansoor; Clinica Chimica Acta; vol.433, 150156, 2014.