Tema:

 Priprema i prečišćavanje uzoraka salive

primenom čvrsto-tečne ekstrakcije za ispitivanje
lekova i njihovih metabolita.

 Uradili:Mia Dragoje i Nikola Aleksić

 Asistent:Brankica Milovanovic
 Datum:20.12.2018.
Saliva predstavlja lako dostupnu i veoma korisnu telesnu tečnost za
terapijsko praćenje lekova kao i za farmakokinetičke i
farmakodinamske studije.

Korisnost salive u monitoringu lekova ograničena je na niz lekova

zbog inter- i intra-individualnih razlika u S/P odnosu (odnos
koncentracija leka u salivi i u plazmi).
Postoji 3 para salivarnih žlezda:

• 2 najveće su parotidne žlezde (po 1 sa obe strane obraza)

• 2 submandibularne žlezde u pozadini usta, na obe strane vilice
• 2 sublingvalne žlezde na dnu usta

Sve žlezde prazne salivu u usta preko kanala koji se otvaraju na različitim
mestima u ustima.

Razlikuju se dva tipa salive koja se može sakupljati:

1. glandularna saliva
2. saliva mešovitog sastava
Najčešće se sakuplja saliva mešanog sastava, nastala sekrecijom:

• podviličnih žlezda (glandulae submandibularis) - 65%

• zaušnih žlezda (glandulae parotis) - 23%
• podjezičnih žlezda (glandulae sublingualis) - 4%
• mnogobrojnih malih žlezda -8%

Stimulacija lučenja se najčešće vrši uz parafinski vosak, žvakaću gumu ili

kristale limunske kiseline.

Pre samog uzorkovanja ispitanici treba da isperu usta dejonizovanom vodom.

Ispitanik treba da se smesti udobno, otvorenih očiju, i glave nagnute napred.
Zatim sledi period mirovanja od 5 minuta u toku kojeg se preporučuju
minimalni pokreti lica i usta.
1.Metod dreniranja: Salivi je omogućeno da se sliva niz donju usnu preko
levka u epruvetu koja je prethodno izmerena i graduisana. Na kraju perioda
sakupljanja ispitanik treba da ispljune zaostalu pljuvačku u test epruvetu.
Postoje komercijalno dostupne epruvete povezane sa levkom.

2. Metod pljuvanja: Saliva se skuplja u ustima

i izbacuje napolje svakih 60 sekundi u prethodno izmerenu
i graduisanu epruvetu.

3. Metod sukcije: Saliva se kontinuirano usisava iz usne

duplje pomoću ejektora ili aspiratora.

4. Bris metod: Saliva se sakuplja pomoću prethodno izmerene pamučne vate

ili gaze koje se postavljaju na izlivne kanala glavnih žlezdi i nakon perioda
sakupljanja se ponovo mere i preračunava se količina i sastav prikupljene
salive.
Čvrsto-tečna ekstrakcija (SPE) je tehnika zasnovana na selektivnoj raspodeli
jedne ili više komponenti između dve faze, od kojih je jedna čvrsti
sorbens,druga faza je najčešće tečnost.

Dva opšta principa izolovanja i prečišdavanja uzorka su:

I. adsorbovanje komponenti matriksa dok željene komponente prolaze kroz

kertridž.

II. adsorbovanje željenih komponenti dok komponente matriksa prolaze kroz

kertridž.
Biološki uzorak za čvrsto-tečnu ekstrakciju sastoji se iz:
1. matriksa – medijum iz koga se vrši ekstrakcija
2. ciljanog analita – supstance koju je potrebno izdvojiti
3. interferencija – supstanci koje ometaju selektivno izdvajanje ciljanog
analita

Osnovni ciljevi SPE su:

1. koncentrovanje uzorka
2. odstranjivanje neželjenih komponenti matriksa
3. izmena rastvarača u matriksu rastvaračem koji je kompatibilan sa
analitičkom metodom
4. derivatizacija
5. desoljavanje
 Izbor SPE sistema zasniva se pre svega na interakcijama između analita i
sorbensa .Najvažniji tipovi interakcija koje se ovde sreću su nepolarne
interakcije, vodonične veze, dipol-dipol interakcije i jonske interakcije.
Normalno-fazna SPE (NP-SPE) podrazumeva polarni analit, nepolarni do
srednje polarni matriks (aceton, hlorovani rastvarači i heksan) i polarnu
stacionarnu fazu. Osnovni mehanizam zadržavanja analita predstavlja
elektrostatičko privlačenje između naelektrisanih funkcionalnih grupa
analita i naektrisanih grupa na površini silike.
 Šema odabira SPE prema tipu ciljanog analita. SAX-snažan
anjonski jonoizmenjivač; SCX-snažan katjonski jonoizmenjivač;
WAX- slab anjonski jonoizmenjivač; WCX-slab katjonski
jonoizmenjivač
 neinvazivna metoda uzorkovanja
 saliva je praktično deproteinizirana tečnost, odnosno koncentracija
proteina u salivi manja je od 1% koncentarcije proteina u plazmi.
Upravo zato se smatra da je koncantracija slobodnog (nevezanog) leka
u plazmi jednaka koncentraciji leka u salivi.
 Upotreba salive je od najvećeg značaja u farmakokinetičkim
ispitivanjima kod:
 dece
 odraslih sa slabo dostupnim venama
 bolesnika sa poremećajem u vezivanju leka za proteine plazme

 Upotrebi salive ide u prilog to što je neinvazivna metoda sakupljanja,

lako dostupna, korelacija sa koncentracijom leka u plazmi je dobra
 Osnovni zahtev pri izboru sorbensa za SPE predstavlja visoka Recovery
vrednost, tj. visok procenat analita zadržan na sorbensu, koji se potom brzo
i kompletno eluira. Sorbens mora biti stabilan u prisustvu rastvarača i
matriksa i imati veliku kontaktnu površinu sa uzorkom

 Za uspešnu SPE ključna su dva zahteva:

 1. Analit se mora u visokom procentu vezivati za sorbent
 2. Analit se mora lako i potpuno eluirati sa sorbenta pogodnim rastvaračem
 Iz ovoga sledi da proces vezivanja mora da bude selektivan i reverzibilan.
 Saliva predstavlja biološki material kompleksne strukture, a ispitivane
supstance se nalaze u veoma niskim koncentracijama pa je zbog toga
neophodno pripremiti uzorak SPE metodom kako bi se ispitivana supstanca
ukoncentrisala, i kako bi se uklonile potencijalne interferencije koje bi
poticale iz samog matriksa. Interferencije prisutne u matriksu
podrzumevaju imunoglobuline, proteine, enzime, mucin, kao i ureu i
amonijak.
 Interferencije iz matriksa moraju se ukloniti kako ne bi došlo do
začepljenja aparata za detekciju uzoarka
 Metoda za pripremu uzorka bira se imajući u vidu:

◦ Opseg koji ima metoda koja će se primenjivati za

kvantitativnu analizu
◦ Selektivnost
◦ Zahtevanu Recovery vrednost
◦ Stabilnost pripremljenog uzorka
◦ Da pripremljeni uzorak mora biti kompatibilan sa
metodom koja se primenjuje za analizu

 Pripremom uzorka mora se dobiti:

 Koncentracija analita u opsegu metode (merljiva

postavljenom metodom)
 Čistoća uzorka postavljena za odgovarajuću metodu
 Uzorak kompatibilan sa postavljnom metodom
 Recovery vrednost reproduktivan od uzorka do uzorka
 Analit stabilan do kraja cele analize
 1. Kondicioniranje kolone
 Izvodi se propuštanjem rastvarača ili smeše rastvarača kroz kolonu
napunjenu sorbensom (kertridž ili disk) čime je omogućeno aktiviranje
kolone. Kondicioniranje se vrši nepolarnim rastvaračem, najčešće
rastvaračem u kome je pripremljen uzorak
 2. Adsorpcija-perkolacija (nanošenje)
 Propuštanje uzorka (rastvora analita, biološkog materijala itd.) kroz
kertridž. U ovoj fazi dolazi do adsorpcije komponenti iz matriksa na čvrstu
fazu. Veze koje se ostvaruju između kertidža i matriksa su većinom Van der
Waals-ove sile.
 3. Ispiranje
 Vrši se pogodnim rastvaračem kako bi se odstranile komponente matriksa
dok analit ostaje vezan za čvrstu fazu. Kako je matriks polaran, ispiranje
će se vršiti sa rastvaračima koji su polarniji od samog matriksa kako bi sa
sobom povukle sve supstance koje nam nisu od interesa.
 4. Eluiranje
 Eluiranje ciljanog analita vrši se rastvaračem koji sa sobom povlači ciljani
analit ali ne i interferirajuće supstance. Rastvarač mora biti selektivan i
njegova interakcija sa analitom mora biti jača od interakcije sorbensa i
analita. Za efikasno eluiranje treba podesiti brzinu protoka rastvarača za
eluiranje.
 Primenom čvrsto-tečne ekstrakcije vrši se zadovoljavajuća priprema uzorka
salive za dalju analizu.

 Saliva je biološki materijal koji pruža visok nivo informacija koji za neke
lekove odgovara informacijama dobijenim iz plazme.

 U zavisnosti od prirode lekova i metabolita koji se određuju iz salive zavisi
izbor sorbenta koji će se koristiti.

 Salivi se poklanja sve više pažnje u rutinskim određivanjima mnogih

supstanci.