B Praktikum

Биотехнолошки практикум 3
2 Рад у лабораторији
2.1. Општа упутства
Извођење лабораторијских вежби је један од најпродуктивнијих начина

учења у току ког извођење експеримената и анализа података омогућава
директан увид у зависности које студент изучаваа. За лабораторијске вежбе је
потребна припрема, и у оквиру Биотехнолошког практикума од студната се
очекује да се пре термина вежби посете неопходних теоријских знања и да
прочитају шта је циљ лабораторијске вежбе коју изводе и њено упутство.
Иако свака вежба има јасно упутство чијим праћењем је могуће извести
лабораторијску вежбу и без разумевања, савладавање предвиђеног градива је
могуће искључиво уколико студент разуме циљ сваке појединачне вежбе и
свесно и правилно изведе експериментални рад и правилно обради податке.
Предметни наставници стоје на располагању за сва објашњења.
Рад у лабораторији подразумева одређене хазарде који могу довести до

повреде онога ко изводи експеримент или колега који се налазе у истој
просторији. Зато при лабораторијским вежбама треба бити опрезан.
Предметни наставник и асистенти ће увек обавестити студенте када извођење
вежбе подразумева употребу хемикалијама које могу довести до било каквог
ризика и у том случају биће примењене одговарајуће заштитне мере. У
случају рада са испарљивим и токсичним супстанцама експерименти се
изводе уз додатни опрез у капелама. Потребно је да се студенти озбиљно
односе према упозорењима и да примењују све мере опреза у складу са
упутствима претметних наставника.
Општа правила понашања у лабораторији подразумевају.
 Обавезно ношење лабораторијских мантила

 Обавезно ношење затворене обуће
 Обавезно везивање дуга косе
 Није дозвољено коришћење мобилних телефона
 Није дозвољено уношење хране и пића
 Након завршеног експерименталног рада потребно је поспремити
радну површину
 Пажљиво и одговорно коришћење доступне опреме
На лабораторијске вежбе треба понети:
 Упутство за израду вежби (појединачно или у оквиру уџбеника

Биотехнолошки практикум)
 Лабораторијски мантил
 Свеску у коју треба бележити експерименталне податке
 Калкулатор потребан за прорачуне
 Перманентан маркер за обележавање узорака на стаклу
4 Биотехнолошки практикум
2.2. Коришћење микропипете
На лабораторијским вежбама у оквиру Биотехолошког практикума, поред

стандардне лабораторијске опреме користиће се и микропипете. У
експерименталном раду користићемо градуисане пипете два опсега "P-200"
(опсег 20 – 200μl) и "P-1000" (опсег 200 – 1000μl). Опсег запремина за које се
микропипета може користити је јасно означена на микропипети (слика 2.1)
Микропипета се користи за течне узорке чија запремена МОРА бити у оквиру
радног опсега пипете. Подешавање запремине ван радног опсега може
довести до трајног оштећења микропипете. Подешавање запремине
микропипете се врши окретанњем завртња на њеном врху. При избору
микропипете за узимање узорка одговарајуће запремине треба имати на уму
да је најмање прецизно узорковање најмање запремине у опсегу рада
микропипете. Због тога уколико је потребно извршити узорковање 200μl оно
се може прецизније урадити користећи микропипету опсега 20 – 200μl.
Слика 2.1 (а) Шематски приказ микропипете (б) Принцип коришћења микропипете
Микропипете се допуњују одговарајућим пластичним наставком. Након
постављања наставка узорак се узима притискањем завртња за подешавање
запремине до првог отопра (Слика 2.1б). Држећи микропипету вертикално
наставак треба уронити у узорак и ЛАГАНО отпустити завртањ, што ће
довести до увлачења узорка у наставак. Наглим отпуштањем завртња може

доћи до прскања узорка у саму микропипету (ван наставка) што утиче на
запремину узорка у наставку и доводи до запрљања микропипете. Испуштање
узорка врши се притиском на завртањ до другог отпора. Уколико је при
узорковању завртањ притиснут даље од првог отпора запремина узорка неће
одговарати подешеној запремини (биће већа).
За прецизно узорковање микропипетом неопходно је да наставак потпуно

налегне на врат пипете. Узорковање са неадекватно намештеним наставком
запремина узорка такође неће одговарати подешеној запремини (биће мања).
Уколико по узимању узорка приметите капање из наставка то је показатељ да
наставак није добро намештен и да узорковање није прецизно. У том случају
потребно је испустити узорак, адекватно подесити наставак и поново
узорковати. Наставак се уклања притиском на типку за уклањање наставка.
Приликом коришћења микропипете потребно ју је држати у вертикалном

положају. Окретањем микропипете, нарочито када се у наставку налази
узорак може довести до њеног прљања и последично - кварења. За успешан
рад у лабораторији, неопходно је да се студент одговорно односи и према
радним задацима и према достпуној опреми.
При коришћењу микропипете важно је запамтити следеће:
 Микропипета се користи само у дефинисаном опсегу запремина

 Наставак мора бити адекватно намештен
 Потребно је променити наставак при промени узорка
 Микропипета се може користити и за мешање наизменичним
узимањем и испуштањем узорка.
2.3 Спектрофотометријско одређивање концентрације биолошких
молекула
У практичној примени биотехнологије и научних дисциплина на којима се

биотехнологија заснива постоји потреба за доказивањем присуства и
квантификације биолошких молекула. У ову сврху могу се применити
различите аналитичке методе а већина ових метода су у својој основи
спектрофотометријске (колориметријске) методе.
Материја, било да је у облику чврстог тела, течности (раствора) или гаса
различитом ефикасношћу апсорбује зрачења различитих таласних дужина од
којих је сачињена бела светлост. Апсорпција светлости одређене таласне
дужине одговорна је за обојење, и показано је да се највише апсорбују
комплеметнарне боје. Па тако раствор црвене боје апсорбује (у највећој мери)
светолост таласне дужине која одговара зеленој боји. Посматрањем раствора
обојених супстанци лако се може уочити да са повећањем концентрације
настаје интензивније обојен раствор. Овакво запажање може се математички
описасти и искористити за одређивање непознате концентрације растворене

супстанце. По општа теорији апсорпције интензитет пропуштеног
(трансмитованог) зрачења (Io) пропорционалан интентзитету упадног зрачења
(I) и зависан од апсорпционог коефицијента, таласне дужине и дебљине слоја
кроз коју електромагнетни зрак пролази. Примењена на растворе општа
теорија апсорпције се описује математичком једначином 2.1. које је позната
као Ламбер-Беров (Lambert-Beer) закон.
А = 𝒍𝒐𝒈 𝑰𝒐 ⁄ 𝑰 = 𝜺 × 𝒄 × 𝒍 (2.1.)
Где је А апсорбаницја, безјединична величина која представља декадни

логаритам односа упадног и пропуштеног зрачења, ε моларни екстинкциони
коефицијент [M-1cm-1], с концентрација раствора [M] и l дебљина слоја
течност кроз коју пролази електромагнетно зрачење [cm].
Једначина Лабер-Беровог закона указује на то да је апсорбаницја
концентрацији супстанце и ова законитост је у основи спектрофотометријске
детекције и квантифкације (биолошких) молекула. Он је применљив уколико
се употреби светлост једне таласне дужине (монохроматска) светлост.
Моларни екстинкциони коефицијент (ε) је карактеристчан за сваку супстанцу
и зависи од таласне дужине.
Апсорпциони спектри показују да раствори бојене супстанце различитих
конценрација изложени електромагнетним зрацима различитих таласних
дужина дају различите апсорбанце. У аналитичкој пракси мерења апсорбанце
најчешће се обављају на таласној дужини која показује максималну
апсорбанцију јер се у том случају постиже највећа мерна осетљивост.
Спектрофотометријске методе су аналитичке методе базиране на Ламбер-
Берововом закону примењене у области електромагнетног зрачења које
припада видљивом и ултраљубичастом спектру. Оне су веома лаке за
извођење и не захтевају знајачајне материјалне ресурсе, па су у пракси веома
коришћене. Спектрофотометријске методе подразумевају примену
специјализованих уређаја (спектрофотометара) чија поједностављена
структура је дата на слици 2.2.
Слика 2.2 Шематски приказ спектрофотометра

Када монохроматска светлост познатог интензитета и таласне дужине прође

кроз узорак који се налази у кивети дефинисане ширине l детектор мери
интензитет пропуштене светлости. Аутоматско очитавање на оваквим
уређајима најчешће је дато као апсорбанција (А). Имајући у виду да се на
спектрофотометру мери апсорбанција монохроматске светлости при проласку
кроз растворе различитих концентрација који се налазе у киветама исте
ширине, измерена апсорбанција је директно пропорционална концентрацији
растворене обојене супстанце и може се описати једначином 2.2.
А=𝒌×𝒄 (2.2.)
Где је А апсорбанца, с концентрација растворене супстанце а k константа

зависности. На вредност константе зависности утиче хемијска природа
раствора, таласна дужина као и дужина оптичког пута, што је у пракси
најчешће ширина кивете. Зависност између апсорбанце и концентрације
растворене супстанце се у пракси најчешће утврђује експериментално
прављенењем такозване стандардне или калибрационе праве о чему ће бити
речи у наредном поглављу.
Мали број биолошких молекула даје обојене растворе па у вези са тим, што
значи да не апсорбују електромагнетно зрачење у видљивом делу спектра.
Уколико молекул даје обојене растворе, то значајно олакшава његову
детекцију и квантификацију. Пример таквог молекула је нпр. хемоглобин,
протеин који је одговоран за пренос О2 и СО2 кроз крвоток. Хемоглобин је
молекул црвене боје, али се његова нијанса се мења у зависности од тога да
ли је у питању слободан молекул (дезоксихемоглобин) или су за њега везан
О2 (оксихемоглобин) или СО2 (карбаминохемоглобин). Окси- облик је светло
црвене боје, дезокси- је тамнији док је карбаминохемоглобин бордо боје, што
утиче на боју артеријске и венске крви. Мерењем на спектрофотометру свака
од форми хемоглобина има свој специфичан апсорпциони спектар (слика
2.3). Зависност између концентрације испитиване супстанце и апсорбанце
може се извршити мерењем апсорбанце светлости одређене таласне дужине.
Таласна дужина на којој ће се извршити мерење се бира тако да обезбеди
највећу осетљивост али и да мале преомене таласне дужине не утичу на
резултат мерења. Као што је напоменуто, најчешће се на основу
апсорпционог спектра за радну таласну дужину бира она на којој је вредност
моларног екстинкционог коефицијента (а тиме и апсорбанције) највећа. У
случају супсанци попут хемоглобина где хемијска промена утиче на
апсорпциони спектар за радну таласну дужину бира се таласна дужина
изобестичке тачке, при којој не постоји разлика у екстинкционом
коефицијенту различитих хемијскх форми супстанце. У случају хемоглобина,
његова концентрација се најчешће одређује мерењем апсробанце на 540 nm,
што представља изобестичку тачку окси- и дезоксихемоглобина (слика 2.3).
Слика 2.3 Апсорпциони спектар дезоксихемоглобина (Нb) и оксихемоглобина (НbО2)

са назначеном изобестичком тачком у видљивом делу спектра на 540 nm
Неки необојени биолошки молекули апсробују електромагнетно зрачење

изван опсега видљивог дела спектра. Тако протеини и ДНК молекули
опасорбују ултраљубичасте зраке са апсорпционим максимумом на блиским
таласним дужинама. Протеини показују апсропциони максимум на 230 nm и
280 nm док је апсорпциони максимум ДНК молекула на 260 nm (слика 2.4).
Мерењем интензитета апсорбованог електромагнетног зрачења на таласним
дужинама 260 nm и 280 nm може се одредити концентрација оба ова значајна
биолошка молекула.
Слика 2.4 Апсорпциони спектар дезоксирибонуклеинске киселине (ДНК) и протеина у

ултраљубичастом делу спектра
Концентрација протеина одређује се помоћу емпиријске формуле 2.3, док се

концентрација ДНК прорачунава коришћењем формуле 2.4.
с протеина (mg/ml) = 1,55 × A280 - 0,76 × A260 (2.3)
с ДНК (µg/ml) = 50× A260 (2.4)
У случају одређивања концентрације ДНК на овај начин мерење апсорбанце
на 260 nm се користи за оцену чистоће ДНК узорка. ИМајући у виду облик
апсропционог спектра (слика 2.4) при анализи чистог ДНК узорка требало би
да однос апсорбанци A280 : A260 износи 1,8. Значајно смањење односа указује
на присуство велике количине протеина у испитиваном ДНК узорку, чија се
концентрација, с тога, не може прецизно одредити.
Коришћење оптичких својстава анализираног молекула ограничено је на
мали број једињења. Највећи број једињења се одређује коршћењем особине
да анализирана супстанца може да реагује са обојеним једињењем, или да
награди обојено једињење па се спектрофотометријски, индиректно, може
одредити њена концентрација. Овакве методе налазе веома широку примену
у анализи биолошких молекула, о чему ће бити речи у наредним поглаљима.
За праћење ензимске активности од великог значаја је и примена хромогених
супстарата. Хромогени супстрати су супстанце које након ензимске
хидролизе ослобађају обојено једињење. Постоје многобројни хромогени
супстрати развијени за праћење активности специфичних ензима и они
налазе значајну примену и у микробиолошкој идентификацији. Наиме
додатком у хромогеног супстрата који је подложан конверзији, најчешће
хидролизи, под дејством одабраног ензима могу се идентификовати
микроорганизми који поседују конкретан ензим на основу стварања обојених
колонија. Пажљивим одабиром хромогеног супстрата могу се прецизно
детектовати жељени микроорганизми и оваква врста анализе има огроман
значај нарочито за детекцију патогених микроорганизама у клиничкој
микробиологији. Уз то хромогени супстрати се могу користити за праћење
ензимске активности. У овом практикуму биће обрађен пример р-
нитрофенилпалмитата, који се користи за праћење активности ензима липазе.
Дејством липазе долази до раскидања естарске везе између палмитинске
киселине и р-нитрофенола, супстанце која је жуте боје, у складу са хемијском
једначином датом . Мерењем апсорпције светлости на таласној дужини од
410 nm прати се ослобађање обојеног производа на основу чега је могуће
утврдити активност липазе.
3. Протеини
3.1 Увод
Протеини (беланчевине) су најразноврснији макормолекули у живим
организмима који играју кључне улоге у практично свим биолошким
процесима који се у њима одигравају. Они представљају неопходне
макронутријенте у исхрани човека. Учествују у изградњи ткива и
обезбеђивању енергије (17 kЈ тј. 4 kcal на 1 g протеина). У различитим
количинама, налазе се у готово свим намирницама. Најзначајнији извори су
месо, риба, јаја, млеко и млечни производи, орашасти плодови, легуминозно
поврће и зрневље. Могу да функционишу као катализатори, учествују у
транспорту и складиштењу других молекула као што је кисеоник, пружају
механичку потпору и заштиту имунитета, генеришу покрете, преносе нервне
импулсе и контролишу раст и диференцијацију ћелија.
Протеини представљају линеарне полимере састављене из аминокиселина као
основних структурних јединица. Управо од аминокиселинског састава зависи
нутритивна вредност протеина. Секвенца аминокиселина у великој мери
одређује и начин на који ће бити формиране њихове тродимензионалне
структуре. Током синтезе протеина у ћелији реагују амино и карбоксилна
група при чему се формира амидна веза која се назива пептидна веза.
Уколико је везано 2-50 аминокиселинских остатака ради се о пептидима, при
чему се краћи пептидни ланци састављени из 2-20 аминокиселина називају
олигопептиди, док дужи пептидни ланци представљају полипептиде.
Протеини су дужи молекули, састављени из једног или више полипептидних
ланаца. Поред аминокиселина, у састав протеина могу улазити и друга, мање
или више сложена једињења која се називају простетским групама. У том
случају ради се о сложеним или конјугованим протеинима. Саме простетске
групе могу бити веома разнолике – липиди (липопротеиди), угљени хидрати
(гликопротеиди), нуклеинске киселине (нуклеопротеиди), фосфорна киселина
(фосфопротеиди), бојене материје (хромопротеиди), метали (металопротеиди)
итд.
На основу физиолошких функција које у организму обављају, протеини се
могу сврстати у градивне (структурни протеини), регулаторне (ензими и
хормони), заштитне (антитела) и складишне (нпр. протеини јаја и млека).
Протеини се могу поделити у три класе које одговарају одређеним типовима
њихове тродимензионалне структуре и то на глобуларне, фибриларне и
мембранске. За глобуларне протеине је карактеристично да су готово сви
растворни у води. Примери глобуларних протеина су хемоглобин, инслуин,
казеин, албумин итд. Већина глобуларних протеина су ензими, регулатрони
или транспортни протеини тако да се њихова функција заснива на
интеракцији са другим молекулима - лигандима. Ови молекули се
посредством специфичних интеракција реверзибилно везују за тачно
одређена места у молекулу протеина (код ензима се ради о везивању
супстрата за активни центар) која им одговарају према облику, величини,
наелектрисању, хидрофилности или хидрофобности. Један протеин може

имати више везивних места која одговарају различитим лигандима.
Интеракције између молекула лиганда и протеина индукују конформационе
промене на месту везивања у циљу повећања комплементарности.
Фибриларни протеини су издужене структуре и имају однос дужине према
ширини већи од 10. Они су обично нерастворни у води и најчешће су
структурни као колаген или кератин. Имају улогу да ћелији дају структуру и
чврстоћу и обично се не везују за лиганде. Представљају веома дугачка
влакна у чији састав улазе специјалне врсте завојница. Мембрански протеини
су најчешће рецептори или формирају протеинске канале за преношење
поларних или наелектрисаних молекула кроз ћелијске мембране. Могу бити
интегрални део ћелијских мембрана или интераговати са њима. Њихове
структуре је тешко одредити, с обзиром на комплексност експерименталних
услова које је неопходно обезбедити да би се очувала нативна конформација
коју поседују у свом природном окружењу.
У биотехнологији је од великог значаја доказивање присуства и
квантификција протеина као нутријената, супстрата у биотехнолошким
трансформацијама (попут ферементације или ензимске трансформације) али
и биоактивних молекула нпр. ензима, цитокина, хормона и сл. Специфичан
проблем у вези са одређивањем протеина представља чињеница да се ради о
изузетно разноврсној групи молекула са широким дијапазоном физичко-
хемијских особина. Додатни изазов при одређивању присуства и
концентрације неког конкретног протеина је тај што се протеини готово без
изузетка налазе у комплексним смешама (биолошким материјалима) у којима
су присутни разноврсни протеини, али и мноштво других органских
једињења. Из тог разлога је развијен велики број метода за доказивање
протеина, од којих свака има своје предности и недосттке. Са неким од
најчешће коришћених метода студенти ће се упознати током
експерименталних вежби у оквиру овог курса. Стандардна метода која се
примењује за квантитативну анализу протеина у индустријској и
лабораторијској пракси је Кјелдалова метода која се заснива на одређивању
садржаја азота као релативно константне особине различитих протеина.
Лабораторијски поступак извођења Кјелдалове методе биће детаљно описан у
оквиру овог поглавља. Уколико је неопходно утврдити присуство или
одредити концентрацију протеина у растворима, у лабораторијским условима
се могу користити различите, знатно једноставније методе засноване на
специфичној структури полипептида и протеина (опште) или појединих
аминокиселинских остатака и њихових активних група (специфичне) са
одређеним реагенсима, при чему се најчешће формирају обојени производи
реакције. Типичне лабораторијске методе за квалитативно доказивање
присуства протеина у раствору и њихово квантификовање биће такође
описане у оквиру овог поглавља.
3.2 Аминокиселине
Аминокиселине су органска једињења која садрже амино групу, карбоксилну
групу, атом водоника и специфичну бочну (R) групу које су везане за атом
угљеника (сликa 3.1.). Бочни остаци (R групе) се разликују према структури,
величини и наелектрисању и утичу на растворљивост и друге физичко-
хемијске особине аминокиселине.
Слика 3.1. Структурна формула α-аминокиселине.

У природи постоји око 200 различитих амино киселина, али много мањи број
улази у састав протеина. Протеини у људском организму су састављени од 20
аминокиселина (слика 3.2). Код свих ових аминокиселина амино група је
везана за α-угљеников атом, атом на који је везана карбоксилна група и од
ког почиње обележавање С атома у низу (α, β, γ итд.). Стога су све
аминокиселине које улазе у састав протеина α-аминокиселине.
Слика 3.2. Структурне формуле 20 α-аминокиселина које улазе у састав

протеина.
Са изузетком глицина као најједноставније аминокиселине, све остале
природне аминокиселине садрже најмање три атома угљеника који
сачињавају засићени низ. Такође, осим код глицина, други угљеников атом
свих природних аминокиселина је асиметричан. Из тог разлога су
аминокиселине оптички активне и поседују L- и D-конфигурацију (слика 3.3).
Већина аминокиселина са биолошком активношћу налази се у L-
конфигурацији.
Слика 3.3. L- и D-конфигурација α-аминокиселина.

Аминокиселине се могу класификовати на основу структуре бочног остатка,
његове поларности, нутритивне вредности и метаболичких путева разградње.
Према структури бочног остатка, аминокиселине се могу сврстати у
алифатичне (Glu, Аla, Val, Leu и Ile), аминокиселине са хидроксилном групом
(Ser, Тyр и Thr), сумпором (Cys, Met и цистин), киселе и њихове деривате
(Asp, Glu, Asn и Gln), базне и њихове деривате (Lys, Arg и Hys), ароматичне
(Phe, Tyr и Trp) и имино (Pro). На основу поларности деле се на хидрофобне у
које спадају алифатичне (Glu, Ala, Val, Leu, Ile, Met и Pro) и нешто мање
хидрофобне – ароматичне аминокиселине (Phe, Tyr и Trp) и хидрофилне у
које спадају поларне ненаелектрисане (Ser, Thr, Cys, Asn и Gln), поларне
позитивно наелектрисане (базне аминокиселине – Lys, Arg и Hys) и поларне
негативно наелектрисане (киселе аминокиселине – Asp и Glu). На основу
нутритивних потреба човека, аминокиселине се могу сврстати у есенцијалне
и неесенцијалне. Есенцијалне аминокиселине човеков организам није у стању
да синтетише и морају се уносити исхраном. У есенцијалне аминокиселине
спадају Arg, Val, Hys, Ile, Leu, Met, Thr, Trp и Phe. Аминокиселине Arg и Hys
могу бити синтетисане од стране одраслих, али не и у организму деце па се
могу сврстати у семи-есенцијалне аминокиселине. Аминокиселине које могу
да се синтетишу у организму и није их неопходно уносити исхраном да би се
задовољиле биолошке потребе се сврставају у неесенцијалне и у њих спадају:

Glu, Ala, Ser, Cys, Asp, Glu, Gln, Pro и Tyr. На крају, на основу метаболичког
пута разградње, аминокиселине се могу поделити на кетогене и гликогене. У
кетогене аминокиселине спадају Leu и Lys и оне се могу разградити до
ацетил коензима А који је прекурсор за синтезу кетонских тела и миелина.
Гликогене аминокиселине се конвертују у глукозу и међу њих се убрајају Ala,
Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, цистин, Asp, Glu, Hys и Arg. Остале
аминокиселине се могу разграђивати на оба начина.
С обзиром на то да садрже и киселу (карбоксилну) и базну (амино) групу,
аминокиселине могу и да приме и да донирају протон, па спадају у
амфотерне супстанце. У јако киселој средини оне су позитивно
наелектрисане, са нето наелектрисањем плус један, док су у изразито базној
средини негативно наелектрисане, са нето наелектрисањем минус један.
Свака аминокиселина при одређеној рН вредности која се назива
изоелектрична тачка (рI) постоји у облику цвитер јона односно диполарног
јона и носи укупно нето наелектрисање нула тј. ненаелектирасана је (слика
3.4). Одговарају им две константе дисоцијације које зависе од бочног остатка
– кисела и базна – које одговарају киселости NH3+ и базности COO- групе, а
од чијих вредности зависи вредност њихове изоелектричне тачке. Сваки
пептид и протеин такође поседује карактеристичну изоелектричну тачку при
којој је неутрално наелектрисан. С обзиром на то да су амфотерни молекули,
протеини могу да граде соли и са киселинама и са базама.
Слика 3.4. Изоелектрична тачка α-аминокиселина.

3.3 Пептидна веза
Аминокиселине су у оквиру полипептидног ланца повезане пептидним
везама (слика 3.5). У пептидом низу увек постоји крај на коме се налази
слободна амино-група и тај крај се назива се N-терминални крај, док се крај
на коме се налази слободна карбоксилна група назива C-терминални крај.
Слика 3.5. Приказ сегмента полипептидног ланца са означеном пептидном

везом и атомима који је формирају.
Пептидна веза је ковалентна амидна веза која се формира између

карбоксилне и амино групе. Пептидна веза има два резонантна облика (слика
3.6А.) због чега поседује неке карактеристике делимично двоструке везе. Из
истог разлога отежана је њена ротација око сопствене осе, тако да су α-C
атоми копланарни, док је амидна група планарна и може се наћи у виду cis
или trans изомера, при чему је у природи углавном заступљен trans изомер
(слика 3.6Б.). И поред тога што могућност слободне ротације око пептидне
везе не постоји, ротација око везe α-C и C атома првог и везе N и α-C атома
другог аминокиселинског остатка је неограничена. Из тог разлога планарни
фрагменти суседних пептидних веза које се сусрећу на једном α-C атому
међусобно могу заузимати различите просторне распореде.
(A)
(Б)
Слика 3.6. (А) Резонантни облици пептидне везе (Б) Транс-пептидна веза –
приказ амидне равни и могућности ротације везe α-C и C атома из пептидне
везе, и могућности ротације везе N атома из петидне везе и α-C атома
следећег аминокиселинског остатка.
3.4. Структура протеина
Протеини поседују четири нивоа структуре: примарну, секундарну,
терцијарну и кватернарну (слика 3.7.). Под примарном структуром протеина
подрзумева се секвенца аминокиселинских остатака у полипептидном ланцу
везаних пептидним везама. Аминокиселински остаци се посматрају и броје од
N-терминалног краја односно NH2-групе која није укључена у формирање
пептидне везе. Примарну структуру протеина одређује ген одговоран за
његову биосинтезу. Сваки протеин поседује јединствену секвенцу
аминокиселинских остатака која предодређује његову структуру и функцију.
Пост-транслационим модификацијама као што су гликозилација или
фосфорилација се у молекул протеина уводе додатне структуре (поред
аминокиселинских остатака) које се такође сматрају делом примарне
структуре.
Полипептидни ланци се у оквиру молекула протеина даље организују у
локално дефинисане уређене подструктуре тј. конформације. Два најчешћа
типа секундарне структуре протеина су α-хеликс и β-наборани лист (слика
3.7.) које се у оквиру једног молекула протеина могу на различите начине

смењивати.
Слика 3.7. Нивои структуре протеина.

Неколико узастопних сегмената секундарне структуре може формирати
такозване супер-секундарне структуре. Формирање секундарне структуре
омогућено је успостављањем водоничних веза између атома који формирају
пептидне везе тј. у оквиру главног ланца, па тако конформације α-хеликса и
β-набораног листа настају тамо где постоје најмање стерне сметње
формирању водоничних веза између -C=O и -N-H група. Неки делови
молекула протеина, иако су уређени, не формирају ни једну од доминантних
секундарних структура. Молекули протеина могу садржати и неуређене
сегменте, насумичне завојнице.
Протеини поседују и трећи ниво структуре који се назива терцијарна
структура и подразумева тродимензионални облик молекула протеина (слика
3.7.). Терцијарна структура настаје као последица интеракција бочних
остатака аминокиселина које могу бити различите природе. Тако се α-хеликс
и β-наборани лист се под дејством неспецифичних хидрофобних интеракција,
при чему се хидрофобни аминокиселински остаци оријентишу насупрот
молекула воде, могу додатно увијати фомрирајући компактне структуре.
Поред хидрофобних интеракција терцијарна структура настаје и услед
успостављања водоничних веза, електростатичких интеракција и

дисулфидних мостова (слика 3.8.). С обзиром на то да се само дисулфидни
мостови формирају успостављањем ковалентне везе између два
амиокиселинска остатка цистеина, они најзначајније доприносе
стабилизацији терцијарне структуре.
Слика 3.8. Хемијске везе и интеракције које стабилизују терцијарну

структуру протеина.
Уколико дође до агрегације два или више полипептидних ланаца
(субјединица) у мултимерни молекул који као такав врши своје функције,
ради се о протеинима који поседују кватернарну структуру (слика ..7.).
Формирана тродимензионална структура је стабилизована истим типовима
интеракција као и терцијарна структура. На основу броја мономерних
јединица из којих је протеин састављен, може се сврстати у димере, тримере,
тетрамере и пентамере. Уколико су све субјединице идентичне додаје се
префикс моно- а уколико су различите хетеро- (нпр. хемоглобин је
хетеротетрамер састављен из два α- и два β-ланца).
Многи протеини су састављени из неколико сегмената који формирају
различите структурне јединице који се називају доменима. Поред
структурних, постоје и функционални домени који се одликују својом
дефинисаном биолошком улогом. Не морају бити у потпуности структурно
дефинисани и често су састављени из неколико структурних домена. Кратке
секвенце аминокиселинских остатака у оквиру молекула протеина називају се
структурним секвенцама и углавном могу као такве бити препознате као
место везивања од стране других протеина. Веома често се место везивања
различитих молекула који се називају лигандима тј. активни центар
функционалног домена налази на граници два структурна домена. Активни
центар у случају ензима садржи аминокиселинске остатке који представљају
место везивања одређених лиганада (супстрата) и аминокиселинске остатке
који снижавањем енергије активације катализују одређену реакцију

трансформације тих супстрата (каталитичко место), а често им је за обављање
каталитичке функције неопходно и присуство одређених кофактора.
Поједностављени приказ овог процеса представљен је на слици 3.9.
Специфичност неког ензима према супстрату и реакцији коју катализује
зависи управо од распореда аминокиселина у оквиру активног центра.
Формирање ензим-супстрат комплекса и задржавање одређене оријентације
везаног супстрата омогућено је успостављањем водоничних веза, Ван дер
Валсових сила, хидрофобних и електростатичких интеракција. Сам активни
центар обично садржи већи број хидрофобних аминокиселинских остатака.
Молекули који могу нарушити интеракције између ензима и супстрата и
довести до успоравања ензимске реакције се називају инхибиторима. Неки
инхибитори се за активни центар ензима могу везати и правим ковалентним
везама и иреверзибилно нарушити његову каталитичку функцију.
Рецепторски протеини такође врше своје биолошке функције када се за место
везивања у оквиру њихових молекула посредством нековалентних
интеракција вежу одређени лиганди (агонисти). Уколико се за ова места вежу
други молекули који се називају антагонистима, биолошки одговор рецептора
је онемогућен, што се често примењује у фармакологији (нпр. α- и β-
блокатори, блокатори Ca-канала).
Слика 3.9. Шематски приказ одигравања ензимске реакције: везивање

супстрата за активни центар и ослобађање производа.
За одређивање структуре протеина углавном се примењује кристлографија
рендгренским зрачењем којом се мери густина дистрибуције електрона у
молекулу протеина. На основу тих података, добија се информација о
просторном распореду свих атома у молекулу протеина. Поред тога, може се
примењивати и нуклеарно-магнетно-резонантна спектроскопија. Секвенца
протеина може бити одређена различитим методама од којих се данас
најчешће примењује масена спектрометрија, али и директно из секвенце гена
који га кодира. Међутим, присуство фосфатних или гликозидних група не
може се детектовати директно из гена.
3.5. Биосинтеза протеина
Протеини настају из аминокиселина у рибозомима на основу информација
које се налазе у информационој рибонуклеинској киселини (иРНК), која
копира одређени ген. Ген представља део дезоксирибонуклеинске киселине

(ДНК) који носи информацију за синтезу одређеног протеина. Начин на који
се одиграва биосинтеза протеина у организму шематски је приказан на слици
3.10.
Слика 3.10. Шематски приказ биосинтезе протеина.

Информација садржана у молекулу ДНК се у структуру протеина пресликава
посредством молекула информационе рибонуклеинске киселине (иРНК) у
процесу транскрипције тј. преписивања који се одиграва у једру. У наредном
кораку одиграва се процес транслације у коме се у рибозомима синтетишу
полипептидни ланци на основу обрасца садржаног у молекулу иРНК на које
се везују молекули транспортне РНК (тРНК). Сваки молекул тРНК садржи
само три нуклеотида и једну аминокиселину. Примарна структура протеина
дефинсана је секвенцом нуклеотида у гену који кодира синтезу датог
протеина. Сет од три нуклеотида ДНК (триплет) представља генетски код
који носи информацију за синтезу једне одређене аминокиселине и исти је
код свих живих бића. Током синтезе протеина у рибозому ће се за сваки
кодон прекопиран у молекулу иРНК везати комплементарна тРНК која на
себи носи и аминокиселину коју тај кодон кодира. У рибозому се онда
успоставља пептидна веза између две суседне аминокиселине на суседним
тРНК након чега се прекида веза између аминокиселина и нуклеотида у тРНК
а пептидни ланац расте.
С обзиром на то да у састав молекула ДНК улазе четири различита
нуклеотида (аденин – А, тимин – Т, гуанин – G и цитозин - C) и да је укупан
број могућих кодона 43 = 64, а да у састав протеина улази 20 различитих
аминокиселина, једну аминокиселину може одређивати више кодона. Тако
метионин и триптофан кодира само по један кодон док леуцин кодира 6
различитих кодона. Укупно 61 кодон кодира аминокиселине, док преостала
три (UAA, UAG и UGA) представљају такозване стоп-кодоне у молекулу
иРНК који сигнализирају крај синтезе полипептидног ланца. За ове кодоне не
постоји комплементарна тРНК, већ њих детектује специфични протеин који
индукује отпуштање комплетног полипептидног ланца са рибозома. Након
процеса транслације, новонастали протеин може да подлеже различитим
посттранслационим модификацијама као што су цепање деловањем протеаза,
додавање хемијских група (метиловање, ацетиловање, фосфорилација),
додавање комплексних молекула (нпр. додавање молекула полисахарида тј.

гликозолација), формирање додатних дисулфидних мостова итд. На овај
начин настају сложени протеини.
3.6. Раствори протеина
Под одређеним условима средине протеини могу изгубити своју кватернарну,
терцијарну и секундарну структуру тј. нативну конформацију и тај процес се
назива денатурација. Денатурисани протеини могу постати нерастворни
(услед губитка наелектрисања и солватационог омотача) и/или формирати
агрегате (услед интеркција хидрофобних група). Они том приликом губе
своју тродимензионалну структуру и функционалност. Приликом
нарушавања кватернарне структуре, долази до дисоцијације субјединица
молекула протеина и промене њиховог просторног распореда. Нарушавање
терцијарне структуре протеина укључује раскидање ковалентних веза
(дисулфидних мостова) између сулфхидрилних група аминокиселинских
остатака цистеина, међусобних нековалентних дипол-дипол интеракција
између поларних аминокиселинских остатака (као и интеракција са
молекулима растварача) и Ван дер Валсових привлачних сила између
неполарних аминокиселинских остатака. Уколико дође до нарушавања
секундарне структуре, протеини губе правилне структуре α-хеликса и β-
набораног листа и заузимају конформацију насумичне завојнице. Са друге
стране, примарну структуру протеина је веома тешко нарушити и она остаје
непромењена након његове денатурације.
Као што је у претходном тексту напоменуто, нису сви протеини растворни у
води, а када јесу, они формирају лиофилне колоидне растворе. Лиофилни
колоиди представљају веома стабилне системе, јер колоидне честице
поседују солватациони омотач (сачињен од молекула растварача) који их
штити од међусобног сједињавања приликом судара услед Брауновог
кретања. Поред тога, солватисане честице могу да носе и извесно
наелектрисање, што је такође један од фактора стабилности колоида, јер се
истоимено наелектрисане честице међусобно одбијају и ређе долазе на
растојања при којима могу да агрегирају. Осим тога, присуство
наелектрисања повећава растворљивост, па и на тај начин повећава
стабилност колоида. Лиофилне честице, чак и ако изгубе наелектрисање,
могу да задрже омотач од молекула растварача и да остану у веома
стабилном раствору, па лиофилни колоиди постају нестабилни и почињу да
коагулишу једино ако изгубе и наелектрисање и лиофилни омотач.
На описаним особинама раствора протеина засноване су бројне методе и
поступци за њихову преципитацију (таложење) које се могу сврстати у
повратне (реверзибилне) и неповратне (иреверзибилне). У случају
реверзибилног таложења протеина, не долази до значајнијег нарушавања
њихове интрамолекулске и мицеларне структуре, па се исталожени протеини
могу поново превести у раствор који поседује особине почетног раствора
(пре преципитације). Протеини исталожени на овај начин задржавају своје
функционалне карактеристике, па се метода реверзибилног таложења може

примењивати у циљу њиховог концентровања или пречишћавања. У
најчешће коришћене реверзибилне методе таложења протеина убрајају се
исољавање солима лаких метала или амонијачних јона и таложење ацетоном
или етанолом на ниским температурама. Када приликом таложења дође до
потпуне промене нативне структуре протеинских честица ради се о
неповратној тј. иреверзибилној денатурацији. У том случају формирани талог
се не може поново растворити у првобитном растварачу. У иреверзибилне
методе спадају таложење солима тешких метала, алкалоидима, јаким
минералним киселинама и базама, загревањем итд. Ове методе се најчешће
примењују у аналитичке сврхе. Са применом иреверзибилне методе
таложења протеина Na-додецил сулфатом који спада у површински активне
материје, студенти ће се упознати приликом електрофоретског раздвајања
протеина на основу њихове молекулске масе на једној од наредних вежби.
Вежба 2. Квалитативна анализа протеина: бојене реакције на протеине

Циљ вежбе
Присуство протеина у растворима, биолошким течностима, ткивним
екстрактима и другим срединама може се врло успешно доказати низом
општих и специфичних реакција. Оне се заснивају на великој реактивности
појединих аминокиселинских остатака и њихових активних група, као и на
специфичној структури полипептида и протеина. Наиме, велики број
аминокиселинских остатака у молекулима протеина, као и слободних
аминокиселина даје карактеристичне бојене реакције, што се у пракси
користи за детекцију и одређивање појединих аминокиселина у протеинима
или смеши аминокиселина. Присуство карактеристичне пептидне везе у
полипептидима, пептонима и протеинима може се доказати путем биуретске
реакције. Присуство непротеинских компонената у сложеним протеинима
(протеидима) као што су глукопротеиди, хромопротеиди, нуклеопротеиди
итд. такође се може доказати специфичним и врло осетљивим бојеним
реакцијама. На тај начин се истовремено доказује и природа одговарајућег
протеина. У даљем тексту обрађене су бојене реакције које ће бити
примењене у оквиру лабораторијских вежби.
Као резултат ове вежбе студенти ће се упознати са експерименталним
поступком извођења најчешће примењиваних општих и специфичних
реакција за доказивање присуства протеина у растворима, као и са
принципом на коме су засноване и хемизмом сваке од метода.
2.1. Биуретска реакција
Биуретска реакција је општа реакција којом се може доказати присуство

протеина у раствору. Позитивна реакција указује на присуство молекула који
садрже пептидне везе (протеини, пептони и полипептиди) у анализираном
узорку. Позитивну биуретску реакцију такође дају и нека непротеинска
једињења која у свом молекулу имају пептидну везу. Такви су на пример
оксамид и биурет.
Биуретска реакција је назив добила управо по биурету који се образује из
карбамида (урее) загревањем при чему се ослобађа амонијак (слика 3.11.).
Слика 3.11. Формирање биурета из два молекула урее.

Осим тога биуретску реакцију дају аминокиселине хистидин и аспарагин, а
такође серин и треонин.
2.1.1. Хемизам реакције.

Биуретска метода заснива се на особини пептидних веза које се налазе у
молекулима протеина да у јако алкалној средини реагују са бакар-сулфатом
дајући комплексне соли бакра љубичасте боје које имају апсорпционе
максимуме на око 545 nm и 260 nm. Структура Cu-комплекса полипептида
или протеина приказана је на слици 3.12. Боја насталог комплекса зависи од
броја пептидних веза, па тако прости пептиди дају комплекс ружичасте боје.
Слика 3.12. Настајање Cu-комплекса протеина у алкалној средини.

2.1.2. Поступак
Реагенси
1. раствор протеина
2. 10 %-ни раствор NaOH
3. 2 %-ни раствор CuSO4
Ток анализе
У епрувету ставити 1-2 ml раствора протеина и додати исту запремину
раствора 10 %-ног раствора NaOH. Смешу промешати, па потом додати 1-2
капи 2%-ног раствора CuSO4. Поново промућкати, при чему настаје
љубичаста боја услед настајања Cu-протеин комплекса.
2.2. Нинхидринска реакција

У реакцији са нинхидрином (трикетохидринденхидрат), протеини,
полипептиди и већина природних аминокиселина дају комплексе интензивно
плаве или љубичасте боје. Нинхидринска реакција је карактеристична за α-
аминокиселине, док је за β-, γ- и δ- киселине ова реакција је негативна, јер не
настају обојени комплекси или настају слабо обојени комплекси.
Аминокиселине пролин и оксипролин са нинхидрином дају производе жуте
боје. Осетљивост реакције је велика, па се користи за анализу аминокиселина
и одређивање аминокиселина у протеинима.
2.2.1. Хемизам
Настајање комплекса интензивно плаве или љубичасте боје између α-
аминокиселина и воденог раствора нинхидрина одиграва се у неколико
ступњева.
Водени раствор нинхидрина оксидује α-аминокиселине при чему их преводи
у имино-облик. Сам нинхидрин се овом приликом редукује до 1,3-
дикетохидриндола (слика 3.13.).
Слика 3.13. Оксидација α-аминокиселина нинхидрином.

Настали имино-облик се у воденом раствору трансформише у одговарајућу
кетокиселину уз ослобађање амонијака (слика 3.14.).
Слика 3.14. Трансформација иминокиселине у кетокиселину.

На повишеној температури настале кетокиселине подлежу декарбоксилацији
прелазећи у одговарајуће алдехиде (слика 3.15.).
Слика 3.15. Декарбоксилација кетокиселине на повишеној температури.

Редуковани облик нинхидрина, 1,3-дикетохидриндол реагује са једним
молекулом амонијака прелазећи у 1,3-дикетохидриндамин (слика 3.16.).
Слика 3.16. Формирање 1,3-дикетохидриндамина.

Овај молекул реагује са једним молекулом нередукованог нинхидрина дајући
безбојни комплекс дикетохидринилиден-дикетохидриндамина који кето-
енолном таутомеријом прелази у кето-енол комплекс интензивно плаве или

љубичасте боје (слика 3.17.).
Слика 3.17. Формирање обојеног комплекса љубичасте или плаве боје.

Реагенси
2. 0,2 %-ни раствор нинхидрина
У епрувету са 3 ml раствора протеина додати 10 капи нинхидрина и кувати у
воденом купатилу око 1 минут. У зависности од природе протеина појавиће
се црвенкаста, црвенољубичаста, љубичаста или плава боја формираног
комплекса.
2.3. Ксантопротеинска реакција
За разлику од биуретске и нинхидринске реакције, ксантопротеинска
реакција је специфична. Помоћу ње се у протеинима могу детектовати
цикличне аминокиселине тирозин, триптофан и фенилаланин, које улазе у
састав готово свих протеина.
Деловањем азотне киселине на аминокиселине тирозин, триптофан и
фенилаланин и протеине који их садрже приликом загревања долази до
нитровања бензеновог прстена. На тај начин образује се нитро-једињење
жуте боје која под утицајем алкалија или амонијака прелази у наранџасту
боју, услед преласка нитрованог прстена у со хиноидне структуре (слика
3.18). Поред протеина, ксантопротеинску реакцију дају и многа проста
ароматична једињења, као што су нпр. феноли.
Слика 3.18. Прелазак нитротирозина у базној средини у со хиноидне

структуре.
Реагенси
2. концентрована HNO3
У епрувету сипати око 1 ml протеинског раствора који се анализира и додати
0,5 ml (5-6 капи) концентроване HNO3, под чијим утицајем долази до
згрушавања тј. денатурације протеина. Смешу загревати врло опрезно, при
чему долази до појаве жуте боје услед одигравања реакције нитровања.
Епрувету потом охладити под млазом воде и веома опрезно додати 1 ml
раствора NaOH. Овом приликом жута боја прелази у наранџасту (хиноидни
облик).
2.4. Адамкевичева реакција (доказивање триптофана)
Аминокиселински остатак триптофана, као и слободна аминокиселина,
подлеже реакцији са алдехидима у киселој средини формирајући обојене
кондензационе производе. На овој особини триптофана заснива се
Адамкевичева реакција.
Адамкевичева реакција се заснива на реакцији два молекула триптофана са
глиоксилном киселином, која је увек присутна у глацијалној сирћетној
киселини, при чему се образује једињење црвено-љубичасте боје (слика 3.19).
Слика 3.19. Реакција два молекула триптофана са глиоксилном киселином.

Реагенси
2. глацијална сирћетна киселина
3. концентрована H2SO4
У епрувету сипати око 1 ml раствора протеина, затим додати 1,5 ml
глацијалне сирћетне киселине. Након тога, врло опрезно (чувати лице!)
додати низ зид епрувете (епрувету држати косо) 1 ml концентроване H2SO4
водећи рачуна да се течности не помешају. На граници две фазе, на којој се
течности додирују, образује се прстен црвенољубичасте боје.
2.5. Сакагучијева реакција (доказивање аргинина)
Присуство аминокиселине аргинина у слободном облику, као и у везаном
облику у протеинима, може се доказати помоћу реакције која се одиграва
између његовог оксидованог облика и α-нафтола дајући једињење црвене
боје. Реакција је заснована на присуству гуанидинског остатка у молекулу
аргинина и назива се Сакагучијева реакција. Већина протеина садржи
аргинин, па се ова реакција може примењивати и у циљу доказивања
протеина. Реакција спада у врло осетљиве, с обзиром на то да се за чист
аргинин позитивна реакција добија и при разблажењу 1:2,5·106.
Аргинин у присуству α-нафтола под утицајем оксидационог средства
(натријум-хипохлоритa) у алкалној средини подлеже реакцији оксидације.
Овом приликом оксидовани аргинин са α-нафтолом формира обојено
једињење светло црвене боје (слика 3.20).
Слика 3.20. Комплекс оксидованог аргинина са α-нафтолом.

Реагенси
1. протеински раствор
3. 1 %-ни алкохолни раствор α-нафтола
4. 10 %-ни раствор NaOCl
У епрувету сипати 2-3 ml протеинског раствора, додати 1 ml раствора 5 %-
ног раствора NaOH и 5-6 капи раствора α-нафтола. У епрувету након тога
додати 0,5 ml оксидационог средства (NaOCl) и промешати. Уколико је у
раствору присутан аргинин, смеша постаје црвено обојена.
2.6. Милонова реакција (доказивање тирозина)
Уколико молекули протеина у свом саставу поседују аминокиселину тирозин,
која према својој хемијској структури представља дериват фенола, њихово
присуство у раствору се може доказати Милоновим тестом. Овај тест се
заснива на реакцији једињења која садрже фенолни остатак са Милоновим
реагенсом (раствор меркуринитрита у азотној киселини), дајући црвено
обојене производе.
Хемизам реакција које се одигравају приликом извођења Милоновог теста
приказан је на слици 3.21. Приликом загревања протеинског раствора са
Милоновим реагенсом у првом кораку долази до формирања нитротирозина.
У другом кораку, у реакцији насталог нитротирозина са живом, настаје со
црвене боје – меркуронитротирозин.
Слика 3.21. Хемизам Милоновог теста

Реагенси
2. Милонов реагенс
3. 1 %-ни раствор натријумнитрита
У епрувету сипати 2-3 ml протеинског раствора, затим додати 5-6 капи
Милоновог реагенса и благо промешати. Након тога епрувету загревати на
кључалом воденом купатилу око 10 минута, потом раствор охладити на собну
температуру и додати 5 капи раствора натријумнитрита. Црвена боја (попут
цигле) представља позитиван резултат.
2.7. Проба са оловоацетатом за цистеин и цистин
За протеине који у свом саставу имају аминокиселинске остатке са
сулфхидрилним групама, првенствено цистеин и цистин, каратеристично је
да се сумпор који садрже лако издваја помоћу база образујући Na2S.
Метионин не даје ову реакцију.
Хемизам реакција које се одигравају приликом извођења теста на присуство
цистеина и цистина приказан је на слици 3.22. Када се раствор протеина који
садржи цистеин или цистин загрева у алкалној средини (са NaOH) долази до
издвајања H2S који са NaOH формира Na2S. Издвојени Na2S у реакцији са
олово-ацетатом формира црни талог PbS, нерастворан у HCl.
Слика 3.22. Хемизам реакција које се одигравају приликом доказивања

протеина који садрже цистеин и цистин.
Реагенси
3. засићенi раствор Pb(CH3COO)2
У епрувету сипати 1 ml раствора протеина и једнаку запремину 40 %-ног
раствора NaOH, а затим загревати у воденом купатилу до кључања. Раствор
након тога охладити и додати око 2 ml раствора Pb(CH3COO)2. Уколико је
присутан сумпор, тј. S2- јон, формира се најпре жута, након тога сива и на
крају црна боја која се након краћег загревања издваја у виду црног талога
(PbS).
2.8. Резултат
Као резултат ове вежбе студенти треба да фотографишу епрувете са
протеинским растворима након изведених тестова и приликом подношења
извештаја укратко изложе своја запажања у вези са сваком од примењених
метода.
Вежба 3. Квантитативно одређивање протеина

Циљ вежбе
Садржај протеина у различитим узорцима може бити одређен на различите
начине.
У циљу одређивања концентрације протеина у растворима, примењује се
неколико колориметријских метода, од којих су најчешће коришћене методе
по Лорију, Смиту и Брадфорду. Ни једна од постојећих метода није у
потпуности специфична за протеине нити има униформну осетљивост према
узорцима различитих протеина. Да би одређена метода била успешно
примењена при одређивању садржаја протеина у неком узорку, она мора бити
компатибилна са карактеристикама самог узорка, укључујући и особине
протеина и раствора у коме се он налази. Такође, мора бити коришћен
адекватан стандард, а у сваком тренутку морају бити узета у обзир сва
ограничења.
С обзиром на то да је често неопходно одредити садржај протеина у узорцима
који не представљају растворе (нпр. храна за људе и животиње, узорци
земљишта), поред већ поменутих колориметријских метода, које у овом
случају није могуће применити, развијена је и универзална метода
одређивања садржаја протеина заснована на утврђивању садржаја укупног
азота – Кјелдалова метода, која ће такође бити описана.
Принцип и поступак извођења ових метода, као и упутство за припрему свих
неопходних реагенаса биће изложени у даљем тескту. Свака од ових метода
има своје предности и недостатке који ће, уз опис хемизма и
експерименталног поступка извођења, бити надаље описани.
Као резултат вежбе студенти ће савладати поступке припреме свих
неопходних реагенаса, различитих разблажења раствора стандардног
протеина и конструсања калибрационе криве, као и њене примене у циљу
одређивања концентрације протеина у узорку непознате концентрације. Од
студената се очекује да разумеју принцип сваке од метода, као и најзначајније
разлике међу њима, као и њихова основна ограничења.
3.1. Кјелдалова метода
Кјелдалова метода се сматра стандардом за одређивање концентрације
протеина у различитим узорцима, а базирана је на одређивању укупног азота,
с обзиром на то да је елементарни састав различитих протеина, укључујући и
садржај азота, релативно устаљен (51-55 % угљеника, 20-25 % кисеоника, 6-7
% водоника, 15-18,5 % азота и елементи у траговима). Заснива се на
дигестији узорка јаком киселином при чему долази до ослобађања органског
азота чија се количина може одредити применом одговарајуће титрационе
технике. Количина протеина у узорку израчунава се на основу концентрације
ослобођеног азота, дакле посредно. Измерена концентрација азота се преводи
у концентрацију протеина применом конверзионог фактора (F) чија вредност
зависи од аминокиселинског састава протеина, а чија је просечна и најчешће

примењивана вредност 6,25 (еквивалент од 16 % тј. 0,16 грама азота по граму
протеина). Сама метода састоји се из три фазе: 1) дигестија, 2) неутрализација
и дестилација и 3) титрација (слика 3.23.).
Слика 3.23. Шематски приказ поступка извођења Кјелдалове методе.

Предности Кјелдалове методе су универзалност, висока прецизност и добра
репродуцибилност. Међутим, пошто сав азот у различитим узорцима не
потиче нужно од протеина, не даје информацију о правом садржају протеина.
Такође, различити протеини захтевају примену различитих корекционих
фактора због разлика у аминокиселинском саставу. Поред тога, примена
концентроване сумпорне киселине на високим температурама као и
појединих катализатора, представља значајан хазард. Сама техника захтева
доста времена за извођење сваке анализе.
Анализирани узорак се одмери у суд за дигестију и загрева уз додатак
сумпроне киселине као оксидационог средства, анхидрованог Na- или K-
сулфата који убразава реакцију повећавањем тачке кључања и катализатора,
најчешће бакра, селена, титанијума или живе. Врло погодно је користити и
комерцијалне таблете које садрже дефинисан однос соли и катализатора.
Током процеса дигестије сав азот присутан у узорку (осим уколико је у
форми нитрата или нитрита) трансформише се до амонијака, при чему се
ослобађају CO2 и H2O. Амонијак се не ослобађа у виду гаса, већ је у форми
амонијачних NH4+ јона који се везују за сулфатне SO42- јоне, и остаје у
раствору (ј-на 3.1.).
катализатор
протеин − 𝑁 + 𝐻 𝑆𝑂 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ (𝑁𝐻 ) 𝑆𝑂 + 𝐶𝑂 + 𝐻 𝑂 (3.1.)
Након завршетка дигестије, приступа се неутрализацији узорка. Суд за

дигестију се посредством црева повезује за пријемни суд и у њега се, у циљу
постизања алакалне средине, додаје NaOH који конвертује амонијум-сулфат у
гасовити амонијак (ј-на 3.2.).
(𝑁𝐻 ) 𝑆𝑂 + 2𝑁𝑎𝑂𝐻 ↔ 2𝑁𝐻 ↑ +𝑁𝑎 𝑆𝑂 + 2𝐻 𝑂 (3.2.)
Амонијак који се ослободи из раствора из суда за дигестију прелaзи у
пријемни суд који садржи борну киселину у вишку. С обзиром на низак pH
раствора у пријемном суду, гасовити амонијак се конвертује у амонијачне
јоне, уз истовремено превођење борне киселине у боратне јоне на начин
приказан ј-ном 3.3.
𝐵(𝑂𝐻) + 𝑁𝐻 + 𝐻 𝑂 ↔ 𝑁𝐻 + 𝐵(𝑂𝐻) (3.3.)
или, у случају коришћења сумпорне киселине како је приказано ј-ном 3.4.
𝐻 𝑆𝑂 (укупна) + 2𝑁𝐻 → 𝑆𝑂 + 2𝑁𝐻 (3.4.)
У овој фази примењује се Таширо индикатор. У реакцији предестилисалог
амонијака и борне киселине, боја Таширо индикатора прелази из љубичасте у
зелену (pH 4,4-5,8), док у случају примене сумпорне киселине, боја Таширо
индикатора остаје непромењена - љубичаста.
Садржај азота се одређује титрацијом формираног амонијум-бората
стандардним раствором сумпорне или хлороводоничне киселине (ј-на 3.5.)
при чему се крај титрације одређује одговарајућим индикатором.
𝐵(𝑂𝐻) + 𝐻𝑋 ↔ 𝑋 + 𝐵(𝑂𝐻) + 𝐻 𝑂 (3.5.)
𝐻𝑋 − јака киселина (𝑋 = 𝐶𝑙)
У случају да је коришћена сумпорна киселина и да је неопходно титрисати
преосталу киселину, тиртација се врши стандардним раствором NaOH (ј-на
3.6.).
𝐻 𝑆𝑂 (преостала) + 𝑁𝑎𝑂𝐻 → 𝑁𝑎𝐻𝑆𝑂 + 𝐻 𝑂 (3.6.)
3.1.2. Припрема реагенаса
1. концентрована H2SO4
2. H2SO4 концентрације 0,05 М (или раствор борне киселине концентрације 2-
4 %).
3. Кјелдал таблете (K2SO4:CuSO4 = 5 g:0,1 g) или одговарајућа смеша соли и
катализатора (5,81 g K2SO4, 0,093 g CuSO4·5 H2O i 0,093 g Se)
5. NaOH (0,1 N) или H2SO4 тј. HCl (0,01–0,5 N)
6. Таширо индикатор (20 ml 0,04 %-ног раствора индикаторске боје метил-
црвено растворене у апсолутном етанолу и 20 ml 0,02 %-ног раствора
индикаторске боје метил-плаво растворене у апсолутном етанолу)
3.1.3. Одређивање концентрације протеина у узорку
За дигестију протеина припремити узорак који се анализира (0,01-5 g у

зависности од концентрације протеина у узорку), концентровану H2SO4 (15-
20 ml) и две Кјелдал таблете. Поступак дигестије траје 90-120 min, а
завршетак се уочава по обезбојавању садржаја у киветама/балону. Кивете се
остављају најмање 30 min на собној температри да се охладе, пре наредног
корака.
У кивету за дестилацију долива се прво дестилована вода (око 50 ml), затим
натријум-хидроксид у вишку (60 ml уколико је сипано 15 ml киселине за
дигестију). У прихватни суд се сипа 25-30 ml раствора сумпорне киселине
концентрације 0,05 М или раствора борне киселине концентрације 2-4 %,
дода се 7-8 капи Таширо индикатора и започиње дестилација воденом паром
(трајање око 5 минута уколико се користи дестилациона јединица). За
неутрализацију је потребна 4-5 пута већа запремина 30 %-ног раствора NaOH
у односу на запремину H2SO4 употребљену приликом дигестије. Битно је да
база буде у вишку, што се може препознати по појави плаве боје која настаје
услед формирања тетрааминског комплекса са бакром. Током дестилације
долази до разлагања комплекса до CuSO4 праћеног променом боје у
светлосмеђу и након тога у мрку при чему се CuSO4 преводи у CuO.
Ослобођени амонијак у дестилату везује се за киселину у прихватном суду.
Предестилисани амонијак се квантитативно везује са киселином формирајући
растворљиве амонијум јоне.
Поступак титрације изводи се на крају са циљем одређивања садржаја азота
на основу количине везаних амонијум јона у дестилату. Када се у току
дестилације као раствор за везивање амонијака користи борна киселина,
титрација се изводи стандардним растворим H2SO4 или HCl (0,01–0,5 N у
зависности од количине присутних амонијум јона) - директна титрација. Боја
раствора приликом титрације из зелене прелази у светло љубичасту боју.
Када се у току дестилације као раствор за везивање амонијака користи
сумпорна киселина, непрореаговала киселина титрише се раствором NaOH
(0,1 N). Ово је ретитрација тј. „back“ титрација. Узорак се титрише до
промене боје из светло љубичасте у сиво-зелену. На исти начин третирати и
контролни узорак (обично се третира у исто време када и анализирани узорак
да би евентуално заостале количине азота у реагенсима коришћеним за
анализу биле узете у обзир). Након одређивања садржаја азота, врши се
конверзија у садржај протеина множењем израчунате вредности са
одговарајућим конверзионим фактором.
3.1.4. Резултат
Као резултат ове вежбе потребно је израчунати садржај азота у анализираном
узорку коришћењем једанчине 3.7., уколико је као раствор за везивање
амонијака коришћена борна киселина, а титрација извођена стандардним
раствором H2SO4 или HCl.
[ ]( )
𝑁(%) = ( )
∙ ( )
∙ ∙ 100 % (3.7.)
У случају “back” титрације раствором NaOH, када је као раствор за везивање

амонијака коришћена H2SO4 користити једначину 3.8.
[ ]( )
𝑁(%) = ( )
∙ ( )
∙ ∙ 100 %
(3.8.)
У једначинама ..7. и ..8. је [H+]/[OH-] количина H+/OH- јона потребних да се

дође до краја титрације, Vsp је запремина титрационог средства утрошена за
титрацију слепе пробе, Vu је запремина титрационог средства утошена за
титрацију узорка, m је маса узорка, а 14 g/mol моларна маса азота.
На крају садржај протеина у анализираном узорку израчунати коришћењем
једначине 3.9.
садржај протеина (%) = 𝑁(%) ∙ 𝐹 (3.9.)
где је F конверзиони фактор који зависи од аминокиселинског састава
протеина (најчешће коришћена вредност 6,25).
3.2. Одређивање садржаја протеина методом по Лорију
Метода по Лорију је најчешће примењивана метода одређивања

концентрације протеина. Заснована је на биуретској реакцији и даљем
третирању насталог Cu+-протеин комплекса Folin-Ciocalteau реагенсом који
бива редукован, при чему се формира плаво обојени комплекс. Ова метода је
око 100 пута осетљивија од биуретске, али су за њену примену везани и неки
недостаци. Интензитет насталог обојења у великој мери зависи од
аминокиселинског састава протеина, па ће тако протеини са већим садржајем
триптофана и тирозина дати већу апсорбанцу од оних протеина који имају
мањи садржај ових аминокиселина. Због тога је веома важно примењивати
стандардни протеин који је адекватан за одређену врсту узорка. Бројне
супстанце које се често могу наћи у биолошким или лабораторијским
узорцима као што су феноли, мокраћна киселина, ксантин, Трис пуфер,
амонијум сулфат, глицин, хидразин, ЕДТА и различити редукујући агенси
интерферирају методу и доводе до грешака у добијеним резултатима. Нека
друга једињења као што су нуклеинске киселине, уреа, гуанидин
хидрохлорид, етанол или ацетон, који су такође често присутни у
анализираним узорцима, не ометају развијање боје и не доприносе стварању
додатног обојења. Приликом извођења Лоријеве методе, боја се развија
споро, а релативно брзо долази до постепеног обезбојавања, па је од великог
значаја да реакционо време и температура буду прецизно мерени, што може
представљати проблем уколико се анализира већи број узорака.
3.2.1.Хемизам
Одређивање садржаја протеина методом по Лорију започиње додавањем
алкалног раствора двовалентног бакра (Cu2+) у узорак. Бакар при овим
условима формира комплекс са атомима азота из пептидне везе и редукује се
до једновалентног - Cu+. Настали Cu+, као и бочни остаци тирозина,
триптофана и цистеина, реагује са додатим Folin-Ciocalteau реагенсом, који
садржи натријум-волфрамат, натријум-молибдат, фосфорну киселину и HCl.
Током ове реакције, Cu+ се оксидује а Фолинов реагенс се редукује у
молибден-волфрам плаво (слика 3.24). Апсорбанца се мери на 720 nm
(максимум апсорпције на 700-750 nm), или, уколико је вредност превисока
(>2), на 500 nm.
Слика 3.24. Реакција Cu-протеин комплекса са Folin-Ciocatleau реагенсом.

При оптималним условима, и у одсуству реактивних бочних остатака,
показано је да долази до прелаза два електрона по тетрапептидној јединици.
Међутим, протеини који садрже значајне количине пролина или
хидроксипролина, или бочне остатке који стварају комплексе са бакром
(попут глутамата) стварају слабије обојење. Остаци цистеина, триптофана и
тирозина доприносе са по једним, четити и четири електрона, респективно.
Управо из тог разлога, различити протеини ће (првенствено због различитог
садржаја тирозина и триптофана) стварати обојења различитог интензитета.
Поступак извођења Лоријеве методе шематски је приказан на слици 3.25.
Слика 3.25. Графичка илустрација поступка одређивања концентрације

протеина методом по Лорију.
3.2.2.1. Припрема реагенаса
• Реагенс A: 2 %-ни раствор Na2CO3 у NaOH (0,1 mol/dm3)
• Реагенс B: 1 % -ни раствор CuSO4·5H2O у дестилованој води
• Реагенс C: 2 %-ни раствор К,Na-тартарата (KNaC4H4O6) у
дестилованој води.
• Реагенс D: припрема се мешањем 1 cm3 реагенса B и 1 cm3 реагенса C,
а затим се помешани раствори допуне реагенсом А до укупне запремине од
100 cm3. Припрема се непосредно пред употребу!
• Реагенс F: Folin-Ciocalteau реагенс.
3.2.2.2. Одређивање калибрационе криве за одређивање садржаја протеина

Калибрациона крива се конструише помоћу стандардног раствора протеина
(албумин из говеђег серума – BSA (енг. bovine serum albumine)) да би се
одредио садржај укупних протеина у узорку. Калибрациона крива се одређује
пре сваке серије експерименталних мерења. Стандардни раствори у опсегу од
0,1 до 1 mg/cm3 припремају се разблаживањем основног раствора
стандардног протеина концентрације 1 mg/cm3.
У епрувете додати одређене запремине основног раствора микропипетом, а
затим дестиловану воду тако да је укупна запремина 1 cm3, на начин приказан
у табели 1.
Табела 3.1. Запремине стандардног раствора BSA и дестиловане воде
потребне за припрему 1 cm3 раствора BSA различите концентрације.
Редни Запремина Запремина Концентрација

број основног раствора дестиловане воде протеина
епрувете протеина (cm3) (mg cm-3)
0 0 1 0
1 0,1 0,9 0,1
2 0,2 0,8 0,2
3 0,3 0,7 0,3
4 0,4 0,6 0,4
5 0,5 0,5 0,5
6 1,0 0 1,0
У растворе се затим додаје 2 cm3 реагенса D и након мешања на вортексу
раствори се оставе да стоје још 10 минута на собној температури. После тога,
додаје се 0,2 cm3 реагенса F и садржај епрувете се добро промеша на
вортексу. Узорци се оставе 45 минута на собној температури да се развије
плава боја чија се апсорбанца мери спектрофотометријски на 500 nm. Из
очитаних вредности добија се калибрациона крива помоћу које се одређују
концентрације протеина у узорцима. Добијена стандардна крива се користи
за израчунавање концентрације протеина у анализираним узорцима.
3.2.2.3. Одређивање концентрације протеина у узорку непознате
концентрације
У епрувету се пренесе 1 cm3 узорка непознате концентрације и дода 2 cm3
реагенса D. Уколико је концентрација протеина у узорку превисока,
разблажити узорак дестилованом водом и даље радити са 1 cm3 разблаженог
узорка. Након 10 мин дода се 0,2 cm3 реагенса F, вортексира и након 45 мин
мери се апсорбанца спектрофотометријски на 500 nm. Из добијеног резултата
и претходно добијене стандардне криве израчунава се концентрација
протеина у узорку.
Као резултат ове вежбе неопходно је да студенти конструишу калибрациону

криву на основу апсорбанци за растворе стандардног протеина различитих
концентрација на 500 nm и да одреде њен нагиб (нпр. коришћењем Excel
програма). Затим се, множењем бројчане вередности нагиба и апсорбанце
узорка непознате концентрације протеина на 500 nm, израчунава садржај
протеина у анализираном узорку. Уколико је узорак разблаживан пре
анализе, та чињеница мора бити узета у обзир множењем добијеног резултата
фактором разблажења. Добијени резултат упоредити са резултатима
добијеним коришћењем методе по Брадфорду и Смиту.
3.3. Одређивање садржаја протеина методом по Брадфорду

Метода одређивања концентрације протеина по Брадфорду је
најједноставнија и најбржа метода и готово подједнако се често употребљава
као и метода по Лорију. Поред тога, веома је прецизна и узорци који су
приликом првог мерења били ван опсега, могу врло брзо бити поново
анализирани. Препоручљива је за општу употребу, нарочито при одређивању
концентрације протеина у растворима који садрже већину соли, растварача,
пуфера, тиола, редукционих средстава и агенаса који хелирају јоне метала.
Може се користити за одређивање концентрације различитих протеина које
детектује и при веома ниским концентрацијама. Међутим, ова метода није
погодна за анализирање раствора протеина који садрже површинкси активне
материје које чак и при ниским концентрацијама могу довести до
преципитације реагенса, а због линеарности у релативно уском опсегу
концентрација (до око 2 mg/ml) често је неопходно вишеструко
разблаживање узорака што може довести до грешке. Поред тога, непогодна је
за одређивање концентрације протеина нерастворних у киселој средини, а
варирање резултата при анализирању различитих протеина је око два пута
веће у односу на методе базиране на хелирању јона бакра (Лоријева и
Смитова метода). Овај недостатак методе илустрован је на примеру две
калибационе криве (слика 3.26.) добијене коришћењем два различита
стандардна протеина – албумина из говеђег серума (BSA) и имуноглобулина
Г (IgG).
Апсорбанца на 590 nm
Имуноглобулин Г (IgG)
Албумин из говеђег серума (BSA)
Концентрација стандарда, mg/ml
Слика 3.26. Пример калибрационих кривих добијених коришћењем

Брадфордове методе за два различита стандардна протиена.
Брадфордова метода за одређивање концентрације протеина заснива се на
нековалентном везивању протеина и анјонског облика молекула Coomassie
Blue G-250 (слика 3.27.) у киселој средини. Ове методу први пут је 1976.
године описао Др. Марион Брадфорд.
Слика 3.27. Хемизам реакције протеина са анјонским обликом боје Coomassie

Blue G-250.
Наиме, боја Coomassie Brilliant Blue G-250 може постојати у три различите
форме – анјонска (плава), неутрална (зелена) и катјонска (црвена). У киселој
средини, црвено обојени катјонски облик се конвертује у своју анјонску,
плаво обојену форму која се везује за базне и ароматичне аминокиселинске
остатке протеина чија се концентрација одређује. Овај молекул реагује
првенствено са остацима аргинина, али може да реагује у малој мери и са
другим базним аминокиселинама (лизином и хистидином), као и
ароматичним аминокиселинама (триптофаном, фенилаланином и тирозином).
Сам реагенс је црвено-браон боје, са апсорпционим максимумом на 465 nm, а
после реакције са протеинима настаје плаво обојени комплекс који има
апсорпциони максимум на 610 nm. Разлика између два облика је највећа на
590-595 nm, па је управо ово оптимална таласна дужина за мерење
интензитата насталог плавог обојења. По потреби, мерење може бити вршено
на било којој таласној дужини између 575 и 615 nm. Боја се брзо развија (већ
након 5 минута) и стабилна је око 1 h.
Поступак извођења Брадфордове методе шематски је приказан на слици 3.28.

протеина методом по Брадфорду.
3.3.2.1. Припрема реагенса
Концентровани раствор боје Coomassie Blue G-250 се припреми тако што се
100 mg прво раствори у 95%-ном етанолу, а затим се овај раствор пренесе у
нормални суд од 200 ml, дода се 100 ml фосфорне киселине и допуни до црте
дестилованом водом. Брадфордов реагенс се припрема разблаживањем
концентрованог раствора боје Coomassie Blue G-250 и филтрирањем
разблаженог раствора кроз филтер папир. Разблаживање се изводи тако што
се 200 ml концентрованог раствора боје Coomassie Blue G-250 допуни до 1 l
дестилованом водом. Првих 20-30 ml процеђеног раствора треба одбацити.
3.3.2.2. Одређивање стандардне криве за одређивање садржаја протеина
Раствори стандардног протеина у опсегу концентрација 0,1 до 1 mg/cm3
припремају се на начин описан у поглављу 3.1.2.2, као што је приказано у
одговарајућој табели. Потом се по 60 μl сваког од припремљених раствора
пренесе микропипетом у други сет епрувета.
Реакција се изводи тако што се у епрувету са 60 μl раствора протеина дода 3
ml Брадфордовог реагенса и ова смеша се промеша на вортексу. Након 5 min
мери се апсорбанца на 590 nm. Добијени резултати се користе за
конструисање калибрационе криве која описује зависност између апсорбанце
и концентрације протеина у узорку.
3.3.2.3. Одређивање концентрације протеина у узорку
У епрувету се пренесе 60 μl узорка непознате концентрације протеина и 3 ml

Брадфордовог реагенса и ова смеша се промеша на вортексу. Након 5 min
мери се апсорбанца на 590 nm. На основу претходно одређене стандардне
криве, израчунава се концентрација протеина у узорку.
концентрација на 590 nm и да одреде њен нагиб (нпр. коришћењем Excel
програма). Затим се, множењем бројчане вередности нагиба и апсорбанце
узорка непознате концентрације протеина на 590 nm, израчунава садржај
протеина у анализираном узорку. Уколико је узорак разблаживан пре
анализе, та чињеница мора бити узета у обзир множењем добијеног резултата
фактором разблажења. Добијени резултат упоредити са резултатима
добијеним коришћењем методе по Лорију и Смиту.
3.4. Одређивање садржаја протеина методом по Смиту

Метода за одређивање концентрације протеина по Смиту или BCA (енг.
bicinchoninic acid – бицинхонинска киселина) метода широко је
распрострањена, а базирана је на истом принципу као и метода по Лорију –
хелирању јона бакра. Први пут је описана од стране Пол К. Смита, 1985.
године. Међу најзначајнијим предностима ове методе су компатибилност са
најразличитијим узорцима раствора протеина, укључујући и оне у којима је
садржај сурфакатаната до 5 %. Такође, пружа значајно уједначенији одзив
када се анализирају исте концентрације различитих протеина у поређењу са
методом по Брадфорду. Метода је осетљива и може се примењивати у опсегу
од око 0,5 µg/ml до 1,5 mg/ml. Међутим, присуство супстанци које редукују и
хелирају бакар у раствору протеина онемогућавају поуздано одређивање
садржаја протеина у овим узорцима. Такође, и поједине аминокиселине као
што су цистеин, цистин, тирозин и триптофан ће такође произвести додатно
обојење о ометати методу. Метода није компатибилна ни са редукујућим
шећерима, закисељивачима, липидима и фосфолипидима који могу бити
присутни у анализираним растворима протеина. Временски је захтевнија за
извођење у поређењу са методом по Брадфорд-у, с обзиром на то да је време
инкубације узорка између 0,5 и 2 h.
Поступак одређивања садржаја протеина методом по Смиту састоји се из два
корака. Први корак идентичан је као и при одређивању садржаја протеина по
Лорију, с обзиром на то да се обе методе заснивају на особини пептидних
веза које се налазе у молекулима протеина да у јако алкалној средини реагују
са бакар-сулфатом дајући комплексне соли бакра љубичасте боје тј.
биуретској реакцији. Одређивање садржаја протеина овом методом дакле
започиње додавањем алкалног раствора двовалентног бакра (Cu2+) у узорак.
Бакар при овим условима формира комплекс са атомима азота из пептидне
везе и редукује се до (Cu+). Други корак се заснива на хелирању два молекула
BCA са једним јоном једновалентног бакра (слика 3.30. и 3.31), што
резултира стварањем интензивног љубичастог обојења. Формирани
хидросолубилни комплекс је веома стабилан и има апсорпциони максимум на
таласној дужини од 562 nm, а мерење се може вршити у опсегу од 550 до 570
nm са променом апсорбанце мањом од 10 %. Поред тога, BCA реагенс је
стабилан у базној средини, па може бити укључен у раствор бакра, тако да се
поступак може извести у једном кораку.
Слика 3.29. Формирање комплекса Cu+ јона и два молекула бицинхонинске

киселине.
Слика 3.30. Шематски приказ методе одређивања садржаја протеина методом

по Смиту.
Поступак извођења Смитове методе шематски је приказан на слици 3.31.

протеина методом по Смиту.
3.4.2.1. Припрема реагенаса
За извођење експерименталне процедуре неопходно је припремити раствор
BCA, 4 % раствор CuSO4, као и растворе стандардног протеина (BSA) у
опсегу концентрација 0,1 до 1 mg/cm3. BCA реагенс се припрема мешањем 1
ml раствора CuSO4 и 49 ml раствора BCA.
3.4.2.2. Одређивање стандардне криве за одређивање садржаја протеина
Раствори стандардног протеина у опсегу концентрација 0,1 до 1 mg/cm3
припремају се на начин описан у поглављу 3.1.2.2, као што је приказано у
одговарајућој табели. Потом се по 150 μl сваког од припремљених раствора
пренесе микропипетом у други сет епрувета у којима се налази по 3 ml BCA
реагенса. Ове смеше се промешају на вортексу и инкубирају на 37 °C током
30 min. Након тог времена епрувете се охладе на собну температуру и мери се
апсорбанца на 562 nm. Добијени резултати се користе за конструисање
калибрационе криве која описује зависност између апсорбанце и
концентрације протеина у узорку.
3.4.2.3. Одређивање концентрације протеина у узорку
У епрувету се пренесе 150 μl узорка непознате концентрације протеина и 3 ml
BCA реагенса и ова смеша се промеша на вортексу. Након 30 min
инкубирања на 37 °C и хлађења узорака на собну температуру, мери се
апсорбанца на 562 nm. На основу претходно одређене стандардне криве,
израчунава се концентрација протеина у узорку.
концентрација на 562 nm за стандардни протеин и да одреде њен нагиб (нпр.
коришћењем Excel програма). Затим се, множењем бројчане вередности
нагиба и апсорбанце узорка непознате концентрације протеина на 562 nm,
израчунава садржај протеина у анализираном узорку. Уколико је узорак
разблаживан пре анализе, та чињеница мора бити узета у обзир множењем
добијеног резултата фактором разблажења. Добијени резултат упоредити са
резултатима добијеним коришћењем методе по Лорију и Брадфорду.
4 Угљени хидрати
4.1 Увод
Угљени хидрати су по хемијској природи полихидроксилни алдехиди,
полихидроксилни кетони или молекули који до ових једињења хидролизују.
Могу се поделити на просте, који се састоје из једне мономерне јединице
(моносахариди) и сложене угљене хидрате који су састављени из више
моносахаридних јединица. Уколико садрже 2-10 моносахаридних јединица
називају се олигосахаридима, док се, уколико поседују већи број
моносахаридних јединица, називају полисахаридима. Према броју
моносахаридних остатака, олигосахариди се могу сврстати у ди-, три-,
тетрасахариде итд. Са друге стране, број мономерних јединица у појединим
полисахаридима који се срећу у природи може износити и по више хиљада и
тада се ради о макромолекулима. Сложени угљени хидрати могу бити
изграђени од једне или више различитих врста моносахаридних јединица.
Тако се полисахариди на основу врсте мономерних јединица које улазе у
њихов састав могу сврстати у хомо- (садрже истоимене моносахаридне
јединице) и хетерополисахариде (садрже различите моносахаридне јединице).
Угљени хидрати и њихови деривати имају бројне функције у живим
организмима. Полисахариди као што су скроб или гликоген служе за
складиштење енергије, док целулоза и хитин представљају структурне
макормолекуле. Моносахарид глукоза има кључну улогу у метаболизму где
кроз гликолизу и Кребсов циклус служи за обезбеђивање енергије у живим
организмима, док рибоза улази у састав рибонуклеинске киселине и неких
значајних коензима. Дезокси рибоза (дериват рибозе без једног О атома) је
саставни део молекула дезоксирибонуклеинске киселине.
Угљени хидрати, од којих су неки сварљиви а неки несварњиви, налазе се у
различитим намирницама. Сварљиви угљени хидрати се још називају и
шећерима. Најчешћи извори шећера у људској исхрани су индустријски
рафинисани или стони шећер (сахароза), млеко (лактоза), воће, мед и неке
врсте поврћа (глукоза и фруктоза). Ове намирнице су и чести састојци
процесиране хране и пића, па су саставни део свакодневне исхране. Веома
заступљен у људској исхрани је и полисахарид скроб, који је веома
распрострањен у житарицама као што су пшеница, пиринач или кукуруз,
кромпиру и процесираној храни, углавном пекарским производима.
Несварљиви угљени хидрати који се називају и дијететским влакнима не
поседују енергетску вредност, али су такође веома значајни у исхрани људи
јер олакшавају дефекацију и тиме позитивно утичу на очување здравља
дигестивног тракта. Целулоза спада у несварљиве угљене хидрате и
најраспрострањенији је биополимер на Земљи. Улази у састав ћелијског зида
биљака и представља основну компоненту дијетеских влакана. Поред
целулозе, у састав дијететских влакана улазе и резистентни скроб и инулин
који се убрајају у пребиотике тј. не варе се у танком цреву, већ у дебелом
цреву бивају метаболисани од стране „добрих“ бактерија до масних киселина

кратког ланца.
С обзиром на велики значај угљених хидрата за исхрану и здравље људи, као
и њихову распорострањеност у различитим врстама потенцијалних
материјала са којима се можемо срести у лабораторијским условима
(биолошки материјал, узорци хране за људе и животиње итд.), развијене су
бројне методе за њихову квалитативну и квантитативну анализу. У
биохемијској аналитици се у циљу карактеризације биолошких узорака или
праћења неких биохемијских процеса веома често примењују базичне
спектрофотометријске методе одређивања концентрације укупних шећера
(антрон методом) као и шећера који поседују редукујућу моћ (ДНС
(динитросалицилна киселина) методом). Ове методе су једноставне за
извођење и имају веома широку могућност примене, са чиме ће студенти
бити упознати на примерима одређивања концентрације укупних и
редукујућих шећера у узорцима непознате концентрације, као и праћења тока
ензимске хидролизе олигосахарида. Методе које омогућавају квантитативно
одређивање појединачних шећера у лабораторијским условима подразумевају
примену хроматографских техника, са чиме ће се студенти упознати у оквиру
курсева на вишим годинама студија.
4.2 Моносахариди
Моносахариди су најједноставнији угљени хидрати који представљају
основне градивне јединице сложених угљених хидрата и који се деловањем
разблажених минералних киселина не могу даље хидолизовати. Углавном су
безбојне, кристалне чврсте супстанце растворне у води, од којих неке имају
сладак укус. Сладак укус се код моносахарида и других шећера изражава као
степен сласти који је нормиран у односу сахарозу која поседује степен сласти
100. Њихова општа формула је CnH2nOn. Моносахариди садрже најмање један
асиметричан (хиралан) атом угљеника. Просторни положај супституената
вазаних за овај асимитеричан атом угљеника дефинише оптички активну
форму стереоизомера (енантипмера) који могу имати D- i L- облик (слика
4.1). У природи ови различити енантиомери поседују различите биолошке
функције. У природи су моносахариди углавном заступљени у D-форми.
Слика 4.1. Оптички изомери моносахарида глукозе (лево) и фруктозе (десно).

На основу броја угљеникових атома могу се поделити на тетрозе, пентозе и
хексозе (слика 4.2.). Уколико поседују алдехидну групу називају се алдозама,
док се моносахариди са кето групом заву кетозе.
Слика 4.2. Алдозе (црвено уоквирено) и кетозе (плаво уоквирено) D-серије.

Моносахариди из линеарне (ацилкичне) прелазе у цикличну форму у
повратној реакцији нуклеофилне адиције између карбонилне и једне од
хидроксилних група истог молекула при чему се формира прстен састављен
из атома угљеника спојених посредством једног атома кисеоника (слике 4.3. и
4.4.). У зависности од тога да ли је у својој линеарној форми почетни
моносахарид био алдоза или кетоза, новоформирани молекул поседује
хемиацеталну (слика ..3.) или хемикеталну групу (слика 4.3). Цикличне
форме моносахарида углавном поседују пет (фуранозе) или шест (пиранозе)
атома.
Већина моносахарида је у чврстом стању и раствору у највећем проценту
присутна управо у облику своје цикличне форме (нпр. мање од 0,02 %
глукозе је у раствору присутно у линеарној форми), али генерално се ради о
смешама различитих облика који се називају заједничким именом (нпр.
глукоза). Услед циклизације, формира се нови стереоцентар на карбонилном
угљениковом атому. Хидроксилна група која замењује карбонилни кисеоник
може се наћи у два различита положаја у односу на раван фуранозног или
пиранозног прстена, па самим тим сваки ациклични моносахарид може имати
два изомера у цикличној форми који се називају аномерима. Два изомера се
означавају као α- и β-аномери. Они у процесу званом мутаротација могу
прелазити један у други посредством оксо облика (слика 4.5.).
Слика 4.3. Формирање хемиацетала.
Слика 4.4. Формирање хемикетала.
Слика 4.5. Успостављање равнотеже између α- и β-изомера D-глукозе преко

оксо облика.
С обзиром на то да молекули моносахарида поседују већи број хидрофилних
хидроксилних (OH) група, они се могу растварати у води, чак и у веома
високим концентрацијама. Растворљиви су у изразито хидрофилним
органским растварачима (глицерол, формамид, гликол), знатно слабије у
алкохолима (чак и метанолу и етанолу), док се у типичним органским

растварачима, као што су етар, бензен или хексан, не растварају. Виши
угљени хидрати су мање растворни у односу на ниже, а са порастом моларне
масе угљених хидрата њихова растворљивост опада. Сви угљени хидрати,
укључујући и моносахариде, су чврсте супстанце за које је карактеристична
појава асоцијације, што за последицу има немогућност њихове дестилације.
Термички су нестабилни и приликом загревања се разграђују – постепено
мењају боју (150 ºC), карамелизују (200 ºC) и угљенишу се (изнад 200 ºC).
Услед мутаротације, алдозе су у воденом раствору увек у некој мери
присутне у облику развијене форме, тако да имају слободну карбонилну
групу која подлеже оксидацији и, самим тим, поседују редукујућа својства. С
обзиром на то да кетозе таутомеризују у алкалној средини формирајући
алдехидну групу, и оне поседују редукујућа својства па се може рећи да су
сви моносахариди редукујући шећери. Могу их оксидовати и врло блага
оксидациона средства као што су Cu2+ и Fe3+ јони. На овој чињеници
заснован је Фелингов тест који се може примењивати за детекцију
(квалитативну анализу) редукујућих шећера у раствору. На основу овог теста
развијене су и волуметријске методе за квантитативно одређивање
редукујућих шећера. Фелингов раствор се добија мешањем две компоненте
непосредно пре употребе: раствора CuSO4 и изразито алкалног раствора
К,Na-тартарата. Овом приликом плаво обојени Cu2+ јони граде са тартаратом
комплекс интензивно плаве боје. Када се у овај раствор дода једињење са
алдехидном групом и смеша загрева, плава боја раствора се губи, карбонилна
група се оксидује до карбоксилне групе, а комплекс Cu2+ јона и тартарата се
редукује и издваја као црвени талог Cu2O (слика ...). Концентрација
награђеног Cu2O се може одредити реоксидацијом помоћу I2 и титрацијпм
непрореаговалог I2 Na-тиосулфатом. Квалитатвно доказивање редукујућих
шећера засновано на истом принципу може се вршити и применом
Толенсовог реагенса (реакција сребрног огледала). У присуству амонијачног
раствора сребро хидроксида ([Ag(NH3)2]+OH-), карбонилна група бива
оксидована до карбоксилне групе, док се Ag+ јон редукује до елементарног
сребра које формира талог налик на сребрно огледало.
Слика 4.6. Хемијске реакције које се одвијају током извођења Фелинговог

теста.
Међу најзначајније моносахариде у исхрани људи спадају три хексозе -

глукоза, фруктоза и галактоза.
D-глукоза (глукоза, декстроза, грожђани шећер) је алдоза коју ћелије кроз
процес ћелијског дисања користе као примарни извор енергије и интермдијар
у метаболизму. У биљном свету и код прокариота глукоза настаје у процесу
фотосинтезе уз помоћ сунчеве светлости, воде и угљен диоксида, док у
животињском свету и код гљива глукоза настаје разградњом плимерних
форми глукозе као што је гликоген. У биљкама се делимично складишти у
виду полимера – скроба и амилопектина, а код животиња као гликоген.
Ћелије мозга и остатка нервног система зависе искључиво од глукозе као
јединог извора енергије. Улази у састав многих олиго- и полисахарида као
што су сахароза, лактоза, рафиноза, малтоза, целулоза, скроб, гликоген итд., а
индустријски поступак добијања се углавном базира на коришћењу
кукурузног скроба. Глукоза је бела прашкаста супстанца, без мириса, слатког
укуса (степен сласти 75), растворна у води (909 g/l на 25 °C) и сирћетној
киселини, а слабо растворна у метанолу и етанолу. У воденом раствору је
углавном у пиранозном облику, 64 % β-D-глукопиранозе и 36 % α-D-
глукопиранозе, и у малој количини (0,02 %) у ацикличној форми.
Фруктоза (воћни шећер) је кетоза која се налази у многим биљкама, као
слободна или у виду дисхарида сахарозе у коме је везана за моносахаридну
јединицу глукозе. Током варења хране директно се апсорбује у
гастроинтестиналном тракту и одлази у крвоток. Чиста фруктоза је бела
кристална чврста супстанца, без мириса, слатког укуса (слађа од осталих
шећера са степеном сласти 173) и растворна у води (растворљивија од
осталих шећера - ~4000 g/l на 25 °C). У највећим количинама налази се у
меду, воћу, цвећу и коренастом поврћу. Индустријски поступци добијања се
углавном базирају на коришћењу шећерне репе, шећерне трске и кукуруза. У
воденом раствору, у равнотежи се налазе различите форме фруктозе. У
смеши се налази 68,2 % β-D-фруктопиранозе, 22,4 % β-D-фруктофуранозе, 6,2
% α-D-фруктофуранозе, 2,7 % α-D-фруктопиранозе и 0,5 % ацикличне форме.
С обзиром на то да се, у поређењу са глукозом, налази у већем проценту у
виду ацикличне форме, брже подлеже Мајлардовој реакцији (реакцији између
амино-група и редукујућих шећера) због чега током стајања у већој мери
доприноси промени укуса и нутритивне вредности хране. Брже апсорбује и
спорије отпушта влагу у односу на сахарозу, глукозу и остале заслађиваче, па
у процесираној храни повољно утиче на текстуру и рок трајања.
Галактоза је алдоза која представља C-4 епимер глукозе и која се најчешће
налази везана за молекул глукозе формирајући млечни шећер - лактозу. Чиста
галактоза је бела прашкаста супстанца, без мириса, слатког укуса (степен
сласти 38), растворна у води (650 g/l на 20 °C). Налази се у млечним
производима, авокаду, шећерној репи итд. У великом проценту заступљена је
и у виду полимера галактана који улази у састав полисахарида хемицелулозе.
Такође се синтетише и у организму где у појединим ткивима улази у састав

гликолипида и гликопротеина.
4.3 Олигосхариди
Олигосахариди настају повезивањем 2-10 моносахаридних јединица
гликозидним везама. Посебну категорију олигосахарида представљају
олигосахариди састављени из две моносхаридне јединице – дисахариди. Они
су веома распрострањени у природи, а најчешћи су сахароза, лактоза и
малтоза. Неки олигосахариди могу имати веома значајне улоге у организму
као што су ћелијско препознавање, ћелијско везивање, имуни одговор итд.
Ови олигосахариди обично су присутни у виду гликана – везани N- или O-
гликозидним везама за липиде (гликолипиди) или одговарајуће бочне
аминокиселинске остатке протеина (гликопротеини). Други имају складишну
и транспортну улогу у свету биљака, као нпр. трисахарид рафиноза, док
поједини настају као производи разградње полисахарида од стране
микроорганизама (нпр. малтодекстрини и целодекстрини).
Фруктоолигосахриди (ФОС) и галактоолигосхариди (ГОС) су веома значајне
групе олигосахарида јер се сврставају у пребиотска једињења тј. несварљиве
састојке хране који позитивно утичу на домаћина стимулишући раст и
активност „добрих“ бактерија у дебелом цреву.
У зависности од положаја и конфигурације (α или β) хидроксилне групе која
улази у састав гликозидне везе која се формира између моносахардиних
јединица које улазе у састав олигосахарида, разликује се више типова веза –
α(1→4), α(1→6) β(1→4), β(1→3)... На примеру настајања дисахарида малтозе
и целобиозе, на слици 4.6. приказано је формирање α(1→4) и β(1→4)
гликозидне везе. У овом случају ради се о правој гликозидној вези и
новонастали молекули задржавају редукујућа својства јер једна хемиацетална
хидроксилна група учествује у формирању везе, док је друга хемиацетална
хидроксилна група и даље слободна. Уколико у састав гликозидне везе улазе
обе хемиацеталне хидроксилне групе настали дисахарид губи редукујућа
својства. Примери таквих дисахарида су трехалоза (α(1→1) веза) и сахароза
(α,β(1→2) веза), чије је настајање из моносахаридних јединица приказано на
слици 4.7.
Слика 4.6. Формирање α(1→4) везе између два молекула α-D-глукозе (горе) и
β(1→4), везе између два молекула β-D-глукозе (доле).
Слика 4.7. Формирање α(1→1) везе између два молекула α-D-глукозе (горе) и
α,β(1→2) везе између молекула α-D-глукозе и β-D-фруктозе (доле).
Три дисахарида од највећег значаја у исхрани људи су сахароза, лактоза и
малтоза.
Сахароза је дисахарид састављен из моносахаридих јединица α-D-глукозе и
β-D-фруктозе повезаних α,β(1→2) гликозидном везом (слика ..7.). С обзиром
на то да су обе хемиацеталне хидроксилне г рупе укључене у формирање
гликозидне безе, сахароза се убраја у нередукујуће шећере. Чиста сахароза је
бела прашкаста супстанцца без мириса, слатког укуса (степен сласти 100),
растворна у води (2000 g/l на 25 °C). На високим температурама се не топи,
већ се изнад 186 °C разграђује и карамелизује. У природи се производи у
биљкама, нарочито у плодовима воћа, нектару цвећа и корењу појединих
биљака, где служи за складиштење енергије произведене у процесу
фотосинтезе. Многи сисари, птице, инсекти и бактерије акумулирају сахарозу
или је уносе исхраном кроз конзумирање биљака богатих овим шећером. У
комерцијалне сврхе, сахароза се углавном екстрахује и рафинише из шећерне
репе и шећерне трске. Сахароза се под дејством киселина и ензима инвертазе
разграђује до моносахаридних јединица. У оквиру експерименталних вежби,

студенти ће се упознати са могућношћу праћења тока ензимске хидролизе
сахарозе ДНС методом, о чему ће бити више речи у оквиру наредних
поглавља.
Лактоза је дисахарид који се састоји из остатака молекула β-D-галактозе и
молекула β-D- глукозе повезаних β(1→4) гликозидним везама. Поседује
слободну хемиацеталну хидроксилну групу, па се убраја у редукујуће
шећере. Основни извор лактозе је млеко у коме сачињава 2-8 % укупне масе.
Чиста лактоза је бела прашкаста супстанца, без мириса, благо слатког укуса
(степен сласти око 20), растворна у води (195 g/l на 25 °C). Због свог благог
укуса и погодних технолошких својстава, често се користи као носач и
стабилизатор прехрамбених арома и фармацеутских производа. Лактоза се
под дејством ензима β-галактозидазе разграђује до моносахаридних јединица.
У оквиру експерименталних вежби, студенти ће се упознати са могућношћу
праћења тока ензимске хидролизе лактозе ДНС методом, о чему ће бити више
речи у оквиру наредних поглавља.
Малтоза је дисхарид у коме су два молекула α-D-глукозе повезана α(1→4)
гликозидном везом (слика ..6.). С обзиром на то да поседује слободну
хемиацеталну хидроксилну групу, спада у редукујуће шећере. Улази у састав
амилозе, једне од две основне структурне компоненте полисахрида скроба, па
је у различитим количинама присутан у производима добијеним делимичном
хидролизом скроба као што су малтодесктрин или кукурузни сируп. Значајна
је компонента слада – зрна жита проклијалих под контролисаним условима
чија је најчешћа примена у производњи појединих алкохолних пића (пива и
вискија). Чиста малтоза представља белу прашкасту супстанцу, без мириса,
слатког укуса (степен сласти 38), растворна у води (1080 g/l на 20 °C).
4.4 Полисахариди
Полисахариди настају повезивањем више од десет моносахаридних јединица
гликозидним везама. Може се радити о веома дугим угљено-хидратним
ланцима који заузимају различите конформације као што су линеарна,
спирална или сферна. У зависности од тога да ли су у молекулу полисахарида
моносахаридне јединице повезане посредством једног или више различитих
типова гликозидних веза, разликујемо линеарне (један тип везе) и разгранате
(више типова веза) полисахариде. Као и прости шећери, настају у процесу
фотосинтезе и у организму могу имати структурну (целулоза у биљном и
хитин у животињском свету), резервну (скроб у биљном и гликоген у
животињском свету) или заштитну (смоласте и слузасте материје у биљном и
мукополисахариди у животињском свету) улогу. За разлику од моно- и
олигосахарида, нерастворни су у води или дају колоидне растворе. Најбоље
проучени и најраспрострањенији хомополисахариди у природи су скроб и
целулоза.
Чист скроб је бела прашкаста супстанца без мириса и укуса, нерастворна у

хладној води и етанолу. На температури од око 60-70 °C при кувању у води
прелази из кристалне у аморфну форму. Већина зелених биљака га производи
у циљу складиштења енергије. Најзаступљенији је угљени хидрат у људској
исхрани и у великим количинама се налази у кромпиру, житарицама и
легуминозном поврћу. Скроб је по хемијској структури разгранати
хомополисахарид који садржи α-D-глукозу као моносахаридну јединицу и
који се састоји из две компоненте, амилозе и амилопектина, чији се удео у
скробу разликује у зависности од извора. Генерално се скроб састоји из 20-25
% амилозе и 75-80 % амилопектина. Амилоза је линеарни или хеликоидни
полисахарид код кога су моносахаридне јединице повезане α(1→4) везама,
док је амилопектин разгранат хомополисахарид са α(1→6) и α(1→4)
гликозидним везама (слика 4.8.).
Слика 4.8. Структура амилозе и амилопектина.

Присуство скроба у раствору се може доказати једноставним тестом са
Луголовим раствором који представља водени раствор калијумјодида са
елементарним јодом. Уколико је скроб присутан у раствору, након 15 минута
може се детектовати тамно плава боја раствора која потиче од формираног
комплекса у коме се I3- јони смештају унутар хеликоидних ланаца амилозе.
Разгранати сегменти амилопектина у оквиру полимерних ланаца скроба
такође поседују краће делове који формирају спирале, па се и у реакцији I3-
јона са амилопектином формира обојени комплекс, у овом случају пурпурно-
љубичасте боје.
Ензими који катализују хидролизу скроба се називају амилазама и спадају у

групу гликозид хидролаза. Ови ензими се налазе у пљувачки људи и других
сисара, где учествују у започињању процеса варења хране. Примењњују се
приликом разних ферментативних поступака, као адитиви, у молекуларној
биологији, медицини итд. Постоји неколико различитих врста амилаза, α, β и
γ, које се разликују према механизмима разградње, изворима и оптималним
условима деловања. α-амилаза је најзначајнији дигестивни ензим у
животињском свету. Овај ензим производе пљувачне жлезде и панкреас и он
катализује разградњу скроба из хране до ди- и трисахарида. Ензим α-амилаза
може деловати на било ком делу угљенохидратног ланца скроба, дајући као
крајње производе разградње амилозе малтотриозу и малтозу, док
амилопектин разграђује до малтозе, глукозе и „граничног декстрина“.
Приликом хидролизе катализоване ензимом β-амилазом, скроб се може
разградити до малтозе као главног деградацоног производа. Овај ензим
делује на ланац моносхаридних јединица глукозе на његовом нередукујућем
крају, тако да се његовим деловањем може остварити степен деградације
амилозе од готово 100 % и амилопектина од око 50 %, док неразграђени
остатак представља „гранични декстрин“. Углавном је присутан у биљном
свету и свету микроорганизама. Ензим γ-амилаза може раскидати α(1→6) и
α(1→4) гликозидне везе на нередукујућим крајевима амилозе и
амилопектина, дајући глукозу као крајњи производ свог деловања.
Инулини су група природних полисахарида које производи велики број
биљака, а који се сврставају у групу фруктана. Служе за складиштење
енергије (налик скробу), а у исхрани људи сврставају се у дијететска влакна.
Најчешће се добијају из цикорије. Представљају линеарне полимере
састављене из моносахаридних јединица β-D-глукозe повезаних β(1→2) или
β(2→6) гликозидним везама и терминалним остатком α-D-глукозе (слика 4.9).
Слика 4.9. Структура инулина.

Полисхарид који код животиња, гљива и бактерија служи за складиштење

енергије назива се гликоген. Гликоген је разгранат хомополисахарид
састављен из моносахаридних јединица α-D-глукозe (око 30000 јединица)
повезаних α(1→6) и α(1→4) гликозидним везама. Гликоген је заправо
амилопектин нешто вишег степена гранања у односу на амилопектин
присутан у скробу. Формира грануле у чијем се центру налази протеин
гликогенин.
Целулоза је најраспрострањенији органски полимер на планети Земљи. По
структури представља линеарни полисахарид састављен из моносахаридних
јединица β-D-глукозe повезаних β(1→4) гликозидним везама (слика 4.10).
Веома је значајна структурна компонента примарног ћелијског зида
дрвенастих биљака, неких агроиндустријских сировина, зелених биљака и
многих алги, док је неке бактеријске врсте излучују формирајући
биофилмове. Садржај целуозе у памучним влакнима је око 90 %, док дрво
садржи 40-50 % целулозе. Углавном се примењује у папирној индустрији, у
новије време се из појединих агроиндустријских сировина богатих целулозом
добија биоетанол, а деривати целулозе (нитрати, ацетати, метил-, етил-етри и
карбоксиметил целулоза) се користе се у текстилној, пластичној, козметичкој
и индустрији боја и лакова.
Слика 4.10. Сегмент линеарног полисахаридног ланца целулозе.

Целулоза је бела прашкаста супстанца без мириса и укуса, нерастворна у
води и већини органских растварача. У поређењу са скробом, има израженију
кристалну структуру и за прелазак из кристалног у аморфно стање у воденом
раствору неопходна је температура од 320 °C и притисак од 25 MPa.
Карактеристично је да поседује кристалне и аморфне регионе (слика 4.11)
који се оксидацијом и ензимским третманом могу раздвојити као посебне
фракције. Особине целулозе у највећој мери зависе од степена
полимеризације. Целулоза добијена из дрвене пулпе обично садржи 300-1700
моносахаридних јединица, док памучна и остала биљна влакна, као и
бактеријска целулоза могу имати између 800 и 10000 меносахаридних
јединица. Полимер целулозе има круту линеарну конформацију, док
водоничне везе између хидроксилних група глукозе из једног ланца и атома
кисеоника из истог или суседног ланца, држе групе ланаца заједно једне уз
друге при чему они формирају структуре зване микрофибриле за које је
карактеристична веома велика затезна чврстоћа. Микрофибриле целулозе су

у ћелијском зиду биљака део полисахаридног матрикса заједно са другим
полимерима. У ћелијском зиду биљака се налази заједно са
хетерополисахаридима - хемицелулозом и пектином, у различитом односу у
зависности од извора. У дрвенастим биљкама, целулоза заједно са
хемицелулозом и лигнином (полимером на бази ароматичних алкохола)
доприноси њиховој великој затезној чврстоћи.
.
Слика 4.11. Графички приказ кристалних и аморфних региона целулозе.
Ензими који катализују хидролизу целулозе до моносахарида (β-D-глукозe)
или краћих олигосхаридних ланаца називају се целулазама. На основу
реакције коју катализују, могу се поделити на пет основних типова.
Ендоцелулазе насумично раскидају везе у унутрашњости аморфних регија
целулозе формирајући нове краће полимерне ланце. Егзоцелулазе или
целобиохидролазе делују на крајевима полимерних ланаца насталих
деловањем ендоцелулаза, ослобађајући тетра- или дисахариде (целобиозу).
Разликују се два типа егзоцелулаза – тип I који делује са редукујућег и тип II
који делује са нередукујућег краја полимерног ланца целулозе. Целобиазе или
β-глукозидазе даље хидролизују продукте разградње настале деловањем
егзоцелулаза до моносахарида. Целулозне оксидазе деполимеризују целулозу
радикалским механизмом, док фосфорилазе користе фосфате уместо воде.
У животињском свету се као најзначајнији структурни полисахарид јавља
хитин који представља скелетну материју ракова и инсеката и основну
компоненту ћелијског зида гљива. Састоји се из N-ацетил-D-глукозамина као
основних јединица, које су повезане β(1→4) гликозидним везама. По
хемијским својствима и влакнастој структури, сличан је целулози.
Вежба 4. ДНС метода за одређивање концентрације редукујућих шећера

Циљ вежбе
Основна особина редукујућих шећера је првобитно била примећена у
растворима Ag+, Cu2+ i Fe3+, па је примењена у квалитативној анализи за
доказивање присуства редукујућих шећера у Фелинговом или Бернардовом
тесту. Касније су развијене и волуметријске аналитичке методе за
одређивање концентрације редукујућих шећера, попут Офнерове методе, која
је заснована на јодометријском одређивању бакра редукованог у реакцији са
редукујућим шећерима. У новије време највише се користе
спектрофотометријске методе, као што је ДНС метода која ће бити
примењена у овој вежби.
Принцип и поступак извођења ДНС методе, као и упутство за припрему свих
неопходних реагенаса биће изложени у даљем тескту. У оквиру ове вежбе,
суденти ће се први пут сусрести са ДНС методом, па ће главни циљ бити
савладавање самог поступка извођења експеримента (припреме реагенаса,
конструисања калибрационог дијаграма и његове примене у циљу
одређивања концентрације редукујућих шећера у узорку непознате
концентрације). Поред тога, од студената се очекује да разумеју принцип на
коме је заснована сама метода, као и које су могућности њене примене тј.
који шећери са којима се можемо срести у лабораторијским условима су
редукујући, а који нередукујући.
4.1.Хемизам
3,5-Динитросалицилна киселина реагује са редукујућим шећерима при чему
се нитро група на трећем C атому редукује до амино групе (слика 4.12.).
Производ ове реакције, 3-амино-5-нитросалицилна киселина, је једињење
црвене боје које има апсорбциони максимум на 540 nm, па се мерењем
апсорбанце на овој таласној дужини може одредити концентрација
редукујућих шећера.
Слика 4.12. Хемизам ДНС методе.

4.2. Поступак
У овој вежби ДНС метода биће примењена за одређивање концентрације
глукозе. У првој фази, биће припремљени раствори познатих концентрација
глукозе, према експерименталном плану приказаном у одговарајућој табели,
затим ће раствори бити подвргнути реакцији са ДНС реагенсом, апсорбанце

ће бити измерене на спектрофотометру и добијене вредности ће бити
употребљене за конструисање калибрационе криве. Затим ће бити одређена
концентрација глукозе у узорку непознате концентрације. Поступак извођења
ДНС методе приказан је на слици 4.13.
Слика 4.13. Графичка илустрација експерименталног поступка ДНС методе.

4.2.1. Припрема реагенаса
ДНС реагенс се припрема тако што се 16 g NaOH и 10 g динитросалицилне
киселине раствори у 300 ml воде, а 300 g K,Na-тартарата у 200 ml воде. После
растварања, раствори се помешају, разблаже водом до 1 l и профилтрирају.
Такође је неопходно припремити основни раствор глукозе у води,
концентрације 10 mM.
У раствору ДНС реагенса NaOH обезбеђује алкалну средину. Алкална
средина погодује изомеризацији кетоза до алдоза, те омогућава детекцију и
ове групе моносахарида ДНС методом. K,Na-тартарат служи да омогући
стабилност реагенсу.
4.2.2. Одређивање стандардне праве
За конструисање калибрационе криве неопходно је припремити по 0,5 ml
раствора глукозе концентрације 0,5-10 mM према упутству приказаном у
табели 4.1. Ово су узорци познатих концентрација глукозе. Даљи поступак
извођења експеримента је као што је приказано на слици ..13.
Табела 4.1. Запремине основног раствора глукозе, дестиловане воде и ДНС

реагенса неопходне за конструисање калибрационе криве.
Запремина
Редни Запремина Запремина
основног Концентрација
број дестиловане ДНС
раствора глукозе (mM)
епрувете воде (ml) реагенса (ml)
глукозе (ml)
0 0 0,5 0,5 0
1 0,025 0,475 0,5 0,5
2 0,05 0,45 0,5 1
3 0,1 0,4 0,5 2
4 0,2 0,3 0,5 4
5 0,3 0,2 0,5 6
6 0,4 0,1 0,5 8
7 0,5 0 0,5 10
У епрувете са 0,5 ml узорака познате концентраицје глукозе додати 0,5 ml

ДНС реагенса. Епрувете одмах након додавања ДНС реагенса оставити 5
минута у кључалом воденом купатилу, разблажити са 4 ml воде, вортексирати
и мерити апсорбанца раствора на 540 nm у односу на слепу пробу. У овом
случају слепа проба је епрувета са редним бројем 0 и представља узорак који
у себи не садржи редукујуће шећере – 0,5 ml дестиловане воде.
4.2.3. Одређивање концентрације глукозе у узорку непознате концентрације
У епрувету означену као слепа проба сипати 0,5 ml дестиловане воде и 0,5 ml
ДНС реагенса. У епрувету са 0,5 ml узорка непознате концентрације глукозе
додати 0,5 ml ДНС реагенса. Епрувете се затим оставе 5 минута у кључалом
воденом купатилу, разблаже са 4 ml воде, вортексирају се и мери се
апсорбанца раствора на 540 nm у односу на слепу пробу.
4.3. Резултат
Као резултат ове вежбе студенти треба да конструишу калибрациону криву
добијену коришћењем раствора глукозе познатих концентрација и на основу
вредности њеног нагиба (нпр. добијеног коришћењем Excel програма) одреде
концентрацију редукујућих шећера у узорку непознате концентрације. У
случају да је узорак разблаживан пре анализе, та чињеница мора бити у обзир
множењем добијеног резултата фактором разблажења.
Вежба 5. Праћење тока ензимске хидролизе олигосахарида ДНС методом

- утицај хидролизе виших шећера на редукујућу моћ
Циљ вежбе
Заједничка карактеристика реакција хидролизе различитих олигосахарида и
полисахарида је да се заснивају на раскидању гликозидних веза, па доводе до
ослобађања редукујућих група. Пошто се тиме повећава редукујућа моћ
реакционе смеше, методе које омогућавају мерење редукујуће моћи
омогућавају ефикасно праћење тока ових хидролитичких реакција. Из тог
разлога, ДНС метода за одређивање концентрације редукујућих шећера може
врло ефикасно да се користи за праћење тока ензимских реакција и
одређивање ензимске активности.
У овој вежби ДНС метода биће примењена ради праћења тока хидролизе
сахарозе, лактозе и рафинозе коришћењем три индустријски значајна ензима:
инвертазе, α-галактозидазе и β-галактозидазе, редом. Принцип и поступак
праћења тока ензимске хидролизе набројаних шећера, биће изложени у
даљем тескту. С обзиром на то да се студенти први пут срећу са ензимским
реакцијама, примарни циљ вежбе је савладавање самог поступка извођења
експеримента (припреме реагенаса, конструисања калибрационог дијаграма у
три различита случаја и његове примене у циљу одређивања концентрације
редукујућих шећера током реакције), као и разумевање хемизама
одговарајућих реакција који омогућавају примену ДНС методе у ове сврхе.
5.1. Праћење тока ензимске хидролизе сахарозе ДНС методом
Сахароза је, као што је већ речено, дисахарид који се састоји из остатака
молекула α-D-глукозе и молекула β-D-фруктозе (α-глукопиранозидо-β-
фруктофуранозид). Хидролизу сахарозе катализује ензим инвертаза (β-D-
фруктофуранозид-фруктохидролаза), који на сахарозу делује са стране
фруктозе (слика 4.14.). То је групно специфичан ензим, који осим што делује
на супстрате у којима се налази β-фруктоза у фуранозном облику, делује и на
оне који садрже и β-гликозидну везу. Назив “инверзија” је изведен због тога
што после хидролизе сахарозе долази до промене смера обртања равни
поларизоване светлости. Еквимоларна смеша глукозе и фруктозе која настаје
у овој реакцији назива се ˝инвертни шећер˝.
Слика 4.14. Хидролиза сахарозе катализована ензимом инвертазом.

Пошто је гликозидна веза настала између полуацеталних хидроксилних група
C-1 атома глукозе и C-2 атома фруктозе, сахароза није редукујући шећер.
Међутим, хидролизом се ослобађају обе редукујуће полуацеталне
хидроксилне групе, па смеша која настаје после хидролизе има редукујућа
својства. Ова карактеристика реакције хидролизе сахарозе се често користи
ради праћења тока реакције. У овој вежби ток ензимски катализоване
хидролизе сахарозе биће праћен помоћу ДНС методе за одређивање
концентрације редукујућих шећера.
5.1.1. Поступак ензимске хидролизе сахарозе
Пошто је производ реакције хидролизе сахарозе еквимоларна смеша глукозе
и фруктозе („инвертни шећер“), неопходно је пре извођења реакције
хидролизе сахарозе конструисати стандардну праву за одређивање
концентрације инвертног шећера ДНС методом. Поступак извођења овог дела
експеримента и конструисања калибрационе криве аналоган је поступку
примењеном приликом извођења вежбе 4. Након што је констрисана
калибрациона крива за инвертни шећер, приступа се хидролизи сахарозе. У
овом делу експеримента студенти треба да припреме раствор супстрата,
изведу реакцију хидролизе сахарозе катализовану ензимом инвертазом и
одреде концентрацију насталог инвертног шећера и остварени степен
хидролизе сахарозе. Поступак ензимске хидролизе сахарозе и праћења
утицаја хидролизе на редукујућу моћ реакционе смеше шематски је приказан
на слици 4.15.
Слика 4.15. Графичка илустрација експерименталног поступка хидролизе

сахарозе.
5.1.1.1. Реагенси
1. Na-ацетатни пуфер концентрације 0,1М, pH 4,5
2. 10 %-ни раствор сахарозе
3. Инвертаза (0,01 mg/ml)
4. Основни раствор инвертног шећера (5 mM глукозе + 5 mM фруктозе)
5.1.1.2. Одређивање калибрационе криве инвертног шећера
Поступак извођења ДНС методе је идентичан поступку примењеном у вежби
4. (слика ..13.). За конструисање калибрационе криве неопходно је
припремити по 0,5 ml различитих раствора инвертног шећера (концентрације
0,025-5 mM), а затим, непосредно пре убацивања епрувета у кључало водено
купатило, додати 0,5 ml ДНС реагенса. У епрувете обележене редним
бројевима треба додати запремине супстанци приказане у табели 4.2.
Табела 4.2. Запремине основног раствора инвертног шећера, пуфера и ДНС

реагенса неопходне за конструисање калибрационе криве.
Запремина
Редни основног Запремина Концентрација
Запремина
број раствора ДНС инвертог
пуфера (ml)
епрувете инвертног реагенса (ml) шећера (mM)
шећера (ml)
0 0 0,5 0,5 0
1 0,025 0,475 0,5 0,25
2 0,05 0,45 0,5 0,5
3 0,1 0,4 0,5 1
4 0,2 0,3 0,5 2
5 0,3 0,2 0,5 3
6 0,4 0,1 0,5 4
7 0,5 0 0,5 5
Након додавања одговарајућих запремина свих супстанци, епрувете се оставе

5 минута у кључалом воденом купатилу, разблаже са 4 ml воде, вортексирају
се и мери се апсорбанца раствора на 540 нм у односу на слепу пробу. Нацрта
се калибрациона крива зависности апсорбанце од концентрације инвертног
шећера (mmol/dm3).
5.1.1.3. Хидролиза сахарозе
Поступак хидролизе сахарозе (слика 4.15.) се састоји из три фазе:
припремања супстрата, извођења реакције хидролизе сахарозе и одређивања
концентрације редукујућих шећера ДНС методом.
Припремање супстрата
Раствор супстрата припрема се тако што се у епрувету пренесе 3 ml ацетатног
пуфера и 1 ml 10 %-ног раствора сахарозе. Затим се епрувета са супстратом и
ензимски препарат (инвертаза) инкубирају на температури реакције (45 °C) у
току 15 минута. Сврха овог корака је да обе компоненте реакционе смеше
достигну температуру реакције пре мешања у следећем кораку, чиме се
обезбеђује да од почетка експеримента реакциона смеша буде на жељеној
температури.
Реакција
Затим се у епрувету са 4 ml раствора супстрата дода 1 ml раствора инвертазе,
смеша се промеша на вортексу и инкубира на 45 °C да би се одиграла
реакција хидролизе сахарозе. Из ове епрувете се сваких 5 мин узимају узорци
запремине 0,5 ml који се убацују директно у епрувету са приперемљених 0,5
ml ДНС реагенса ради одређивања концентрације редукујућих шећера и
праћења тока хидролизе сахарозе. (Треба обратити пажњу да се током

узорковања реакциона смеша минимално задржава ван термостата!)
Одређивање концентрације инвертног шећера
Ови узорци у даљем току пролазе кроз једнак третман као раствори
инвертног шећера при одређивању стандардне криве. Дакле, епрувете са 0,5
ml узорка и 0,5 ml ДНС реагенса се оставе 5 минута у кључалом воденом
купатилу, разблаже са 4 ml воде, вортексирају се и мери се апсорбанца
раствора на 540 nm у односу на слепу пробу. Слепа проба у овом случају
треба да предстваља почетну реакциону смешу (не само пуфер!) јер ензимски
препарат може у себи садржати компоненте које поседују редукујућу моћ. С
обзиром на то да је реакциона смеша добијена мешањем 1 ml раствора
сахарозе, 3 ml пуфера и 1 ml раствора ензима, 0,5 ml смеше који се мешају са
0,5 ml ДНС реагенса садрже 10 пута мање запремине ових компоненти. Слепа
проба може представљати „нулту тачку“ тј. може се у тренутку додавања
ензима узорковати из реакционе смеше или је студенти могу припремити
посебно, директно мешајући одговрајуће запремине компонената реакционе
смеше и ДНС реагенса следећим редоследом: 0,1 ml раствора сахарозе, 0,3 ml
пуфера, 0,5 ml ДНС реагенса и, непосредно пре урањања епрувете у кључало
водено купатило, 0,1 ml раствора ензима. Важно је ензим додати на самом
крају, да не би отпочела ензимска реакција. Након мерења апсорбанце сваког
узорка, израчунати концентрацију инвертног шећера у раствору на основу
стандардне криве одређене са инвертним шећером.
добијену коришћењем раствора инвертног шећера познатих концентрација и
на основу вредности њеног нагиба (нпр. добијеног коришћењем Excel
програма) одреде концентрацију инвертног шећера у узорцима добијеним
након 5, 10 и 15 минута реакције хидролизе сахарозе катализоване
инвертазом. На основу одређених вредности, треба израчунати степен
хидролизе сахарозе, као однос концентрације насталог инвертног шећера и
почетне концентрације сахарозе у реакционој смеши. Приметити да се у 5 ml
реакционе смеше налази 1 ml припремљеног раствора сахарозе. Након тога,
студенти треба да конструишу график зависности степена хидролизе од
времена реакције.
5.2. Праћење тока ензимске хидролизе лактозе ДНС методом
Лактоза је дисахарид који се састоји из остатака молекула β-D-галактозе и
молекула β-D- глукозе повезаних β(1→4) гликозидним везама па има
системско име β-галактопиранозидо-(1→4)-глукопираноза. Хидролизу
лактозе катализује ензим β-галактозидаза, чије је системско име β-D-
галактозид-галактохидролаза (слика ..16.). Овај ензим је групно специфичан
јер катализује хидролизу β-гликозидних веза између галактозе и других
органских лиганада, а примећена је активност и у хидролизи арабинозида и
фукозида. Ипак, примарна улога овог ензима у природи је хидролиза лактозе

па се често у литератури може наћи и тривијални назив лактаза. Реакција
хидролизе лактозе веома је значајна због примене у добијању млечних
производа без лактозе које могу конзумирати и људи са интолеранцијом на
овај шећер.
Лактоза је редукујући шећер, пошто поседује слободну полуацеталну
хидроксилну групу на остатку глукозе. Ипак, хидролизом лактозе се повећава
редукујућа моћ јер се ослобађа и полуацетална група на галактозном остатку
па се ток ове реакције може пратити методама за одређивање редукујућих
шећера. У овој вежби ток реакције пратићемо помоћу ДНС методе.
Слика 4.16. Хидролиза лактозе катализована ензимом β-галактозидазом.

Пошто је у овој реакцији супстрат (лактоза) редукујући шећер, праћење
реакције хидролизе ДНС методом нешто је сложеније него у случају
хидролизе сахарозе (5.1.1.) или хидролизе рафинозе (5.3.1.). Нарочито се то
односи на одређивање стандардне праве јер се не може конструисати
користећи само производ реакције (еквимоларну смешу глукозе и галактозе),
него се мора додати и непрореаговали супстрат (лактоза) јер утиче на
редукујућу моћ раствора. Из тог разлога, састав смеше која се користи за
одређивање стандардне праве зависи од почетне концентрације супстрата и
иста стандардна права не сме да се користи при другачијим почетним
концентрацијама лактозе!
5.2.1. Поступак ензимске хидролизе лактозе
Производ реакције хидролизе лактозе је еквимоларна смеша глукозе и
галактозе, али пошто и непрореаговала лактоза даје одређену редукујућу моћ
шећеру, при конструисању стандардне праве користе се смеше ова три
шећера, које се у даљем тексту називају „хидролизати лактозе“. Састав
„хидролизата лактозе“ зависи од почетне концентрације лактозе у реакционој
смеши. Пошто ће хидролиза лактозе у овом експерименту бити изведена у
раствору који садржи 4 mM лактозе сви хидролизати се припремају
мешањем, у различитим односима, 4 mM раствора лактозе и раствора који се
добија потпуном хидролизом лактозе (4 mM глукозе и 4 mM галактозе).
Након што је констрисана калибрациона крива за различите „хидролизате

лактозе“, приступа се хидролизи лактозе. У овом делу експеримента студенти
треба да припреме раствор супстрата, изведу реакцију хидролизе лактозе
катализовану ензимом β-галактозидазом и одреде остварени степен
хидролизе лактозе. Хидролиза лактозе изводи се према поступку чија је
графичка илустрација приказана на слици 4.15.
2. Раствор лактозе (20 mM)
3. Раствор β-галактозидазе (0,5 mg/ml)
4. Основни раствор лактозе (4 mM)
5. Основни раствор „потпуног хидролизата лактозе“ (4 mM глукозе + 4
mM галактозе)
5.2.1.2. Одређивање стандардне праве хидролизоване лактозе
За конструисање стандардне праве неопходно је припремити по 0,5 ml
различитих „хидролизата лактозе“ (табела 4.3.) и, пре урањања епрувета у
кључало водено купатило, додати 0,5 ml ДНС реагенса, у складу са
поступком извођења ДНС методе (слика 4.13). „Хидролизати лактозе“ су
дефинисани и домашајем реакције, односно степеном хидролизе лактозе који
одговара таквом садржају смеше, што је такође приказано у табели 4.3.
Табела 4.3. Запремине основног раствора „потпуног хидролизата лактозе“,
основног раствора лактозе и ДНС реагенса неопходне за конструисање
калибрационе криве.
Запремин Карактеристике смеше
а Запреми
основног на
Запреми
раствова основно Конц. Конц. Конц.
Редн на ДНС Степен
„потпуног г глуко галакто лакто
и бр. реагенса хидроли
хидролиза раствора зе зе зе
(ml) зе (%)
та лактозе (mM) (mM) (mM)
лактозе“ (ml)
(ml)
0 0 0,5 0,5 0 0 4 0
1 0,025 0,475 0,5 0,2 0,2 3,8 5
2 0,05 0,45 0,5 0,4 0,4 3,6 10
3 0,1 0,4 0,5 0,8 0,8 3,2 20
4 0,15 0,35 0,5 1,2 1,2 2,8 30
5 0,25 0,25 0,5 2 2 2 50
6 0,375 0,125 0,5 3 3 1 75
7 0,5 0 0,5 4 4 0 100
Епрувете се након 5 минута у кључалом воденом купатилу разблаже са 4 ml

воде, вортексирају се и мери се апсорбанца раствора на 540 nm, у односу на
слепу пробу (епрувета са редним бројем нула). Може се приметити да у овом
случају и слепа проба, која одговара почетној реакционој смеши, поседује
одређену редукциону моћ јер је сама лактоза редукујући шећер. Нацрта се
стандардна крива зависности апсорбанце од степена хидролизе лактозе (%).
5.2.1.3. Хидролиза лактозе
Поступак хидролизе лактозе се састоји из три фазе: припремања супстрата,
извођења реакције хидролизе лактозе и одређивања концентрације
редукујућих шећера ДНС методом. Поступак је идентичан поступку
приказаном на слици 4.15.
пуфера и 1 ml раствора лактозе (20 mM). Затим се епрувета са супстратом и
ензимски препарат (β-галактозидаза) инкубирају на температури реакције (45
°C) у току 15 минута. Сврха овог корака је да обе компоненте реакционе
смеше достигну температуру реакције пре мешања у следећем кораку, чиме
се обезбеђује да од почетка експеримента реакциона смеша буде на жељеној
Реакција
Затим се у епрувету са раствором супстрата дода 1 ml раствора β-
галактозидазе, смеша се промеша на вортексу и инкубира на 45 °C да би се
одиграла реакција хидролизе лактозе. Из ове епрувете се сваких 5 мин
директно у епрувету а припремљених 0,5 ml ДНС реагенса узимају узорци
запремине 0,5 ml ради одређивања концентрације редукујућих шећера и
праћења тока хидролизе лактозе. (Треба обратити пажњу да се током
узорковања реакциона смеша минимално задржава ван термостата!)
Одређивање концентрације редукујућих шећера и степена хидролизе лактозе
различитог степена хидролизе лактозе при одређивању стандардне криве.
Дакле, епрувете са 0,5 ml узорка и 0,5 ml ДНС реагенса се оставе 5 минута у
кључалом воденом купатилу, разблаже са 4 ml воде, вортексирају се и мери
се апсорбанца раствора на 540 nm у односу на слепу пробу. Слепу пробу
припремити у складу са упутством датом у поглављу 5.1.1.3.
добијену коришћењем раствора „хидролизата лактозе“ познатих
концентрација и на основу вредности њеног нагиба (нпр. добијеног
коришћењем Excel програма) одреде концентрацију различитих шећера
(лактозе, глукозе и галактозе) и степен хидролизе у узорцима добијеним
након 5, 10 и 15 минута реакције хидролизе лактозе катализоване β-

галактозидазом на основу измерених апсорбанци. Након тога, студенти треба
да конструишу график зависности степена хидролиза лактозе (%) од времена
реакције.
5.3. Праћење тока ензимске хидролизе рафинозе ДНС методом
Ензим α-галактозидаза катализује хидролизу α(1→6)-гликозидних веза које
су формиране између полуацеталних хидроксилних група галактозе и
хидроксилних група на C-6 атому другог моносахарида, обично глукозе или
манозе. Овај ензим није строго специфичан, па катализује хидролизу
различитих олигосахарида (рафиноза, мелибиоза, стахиоза и вербаскоза) и
полисахарида (галактоманани и галактоглукоманани). Каталитичка активност
α-галактозидазе у овој вежби биће примењена у хидролизи рафинозе.
Рафиноза је трисахарид чије су монасахаридне јединице галактоза, глукоза и
фруктоза (слика ..17.). Глукоза и фруктоза су повезане као у молекулу
сахарозе, гликозидном везом између полуацеталних група, а хидроксилна
група на C-6 атому глукозе повезана је гликозидном везом са α-галактозом.
Пошто су полуацеталне хидроксилне групе моносахаридних јединица
„блокиране“ у овом трисахариду, рафиноза је нередукујући шећер. Из овог
разлога се хидролиза рафинозе помоћу α -галактозидазе може лако пратити
помоћу ДНС методе јер се хидролизом, поред нередукујуће сахарозе,
ослобађа редукујући шећер галактоза. Стога, стандардна права се конструише
помоћу раствора који садрже различите концентрације галактозе, пошто
други производ реакције, сахароза, не утиче на редукујућу моћ раствора.
Слика 4.17. Хидролиза рафинозе катализована ензимом α-галактозидазом.

5.3.1. Поступак ензимске хидролизе рафинозе
Производ реакције хидролизе рафинозе је еквимоларна смеша сахарозе и
галактозе, али пошто сахароза није редукујући шећер праћењем садржаја
редукујућих шећера се уствари прати само настала галактоза. Зато ће у овој
вежби стандардна права бити одређена помоћу раствора галактозе
различитих концентрација. Након што је констрисана калибрациона крива за
различите концентрације галактозе, приступа се хидролизи рсфинозе. У овом
делу експеримента студенти треба да припреме раствор супстрата, изведу

реакцију хидролизе рафинозе катализовану ензимом α-галактозидазе и одреде
остваерени степен хидролизе рафинозе. Хидролиза рафинозе изводи се према
поступку чија је графичка илустрација приказана на слици 4.15.
2. Раствор рафинозе (50 mM)
3. Раствор α-галактозидазе (0,5 mg/ml)
4. Основни раствор галактозе (10 mM)
5.3.1.2. Одређивање стандардне праве галактозе
За конструисање стандардне праве неопходно је припремити по 0,5 ml
различитих раствора галактозе (концентрација 0,5-10 mM), а затим,
непосредно пре убацивања епрувета у кључало водено купатило, додати 0,5
ml ДНС реагенса. У епрувете обележене редним бројевима треба додати
запремине супстанци приказане у табели 4.4. Поступак извођења ДНС методе
је идентичан поступку примењеном у вежби 4. (слика 4.13.).
Табела 4.4. Запремине основног раствора галактозе, пуфера и ДНС реагенса
неопходне за конструисање калибрационе криве.
Запремина
основног Запремина Концентрација
Редни број Запремина
раствора ДНС галактозе
епрувете пуфера (ml)
галактозе реагенса (ml) (mM)
(ml)
0 0 0,5 0,5 0
1 0,025 0,475 0,5 0,5
2 0,05 0,45 0,5 1
3 0,1 0,4 0,5 2
4 0,2 0,3 0,5 4
5 0,3 0,2 0,5 6
6 0,4 0,1 0,5 8
7 0,5 0 0,5 10
Епрувете са свим компонентама се оставе 5 минута у кључалом воденом

купатилу, разблаже са 4 ml воде, вортексирају се и мери се апсорбанца
раствора на 540 нм у односу на слепу пробу. Нацрта сe стандардна крива
зависности апсорбанце од концентрације галактозе (mmol/dm3).
5.3.1.3. Хидролиза рафинозе
Поступак хидролизе рафинозе се састоји из три фазе: припремања супстрата,
извођења реакције хидролизе рафинозе и одређивања концентрације
редукујућих шећера ДНС методом. Поступак је идентичан поступку

приказаном на слици 4.15.
пуфера и 1 ml раствора рафинозе. Затим се епрувета са супстратом и
ензимски препарат (α-галактозидаза) инкубирају на температури реакције (45
°C) у току 15 минута. Сврха овог корака је да обе компоненте реакционе
смеше достигну температуру реакције пре мешања у следећем кораку, чиме
се обезбеђује да од почетка експеримента реакциона смеша буде на жељеној
Реакција
Затим се у епрувету са раствором супстрата дода 1 ml раствора α-
галактозидазе, смеша се промеша на вортексу и инкубира на 45 °C да би се
одиграла реакција хидролизе рафинозе. Из ове епрувете се сваких 5 мин
директно у епрувету са 0,5 ml ДНС реагенса узимају узорци запремине 0,5 ml
ради одређивања концентрације редукујућих шећера и праћења тока
хидролизе рафинозе. (Треба обратити пажњу да се током узорковања
реакциона смеша минимално задржава ван термостата!)
Одређивање концентрације редукујућих шећера и степена хидролизе
рафинозе
различитог степена хидролизе лактозе при одређивању стандардне криве.
Дакле, епрувете са 0,5 ml узорка и 0,5 ml ДНС реагенса се оставе 5 минута у
кључалом воденом купатилу, разблаже са 4 ml воде, вортексирају се и мери
се апсорбанца раствора на 540 nm у односу на слепу пробу.
добијену коришћењем раствора галактозе познатих концентрација и на
основу вредности њеног нагиба (нпр. добијеног коришћењем Excel програма)
одреде концентрацију галактозе и степен хидролизе у узорцима добијеним
након 5, 10 и 15 минута реакције хидролизе рафинозе катализоване α-
галактозидазом на основу измерених апсорбанци. Степен хидролизе
рафинозе израчунати као однос концентрације настале галактозе и почетне
концентрације рафинозе у реакционој смеши (приметити да се на почетку
реакције у 5 ml рекционе смеше налази 1 ml припремљеног раствора
рафинозе). Након тога, студенти треба да конструишу график зависности
степена хидролизе рафинозе (%) од времена реакције.

B Praktikum

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

B Praktikum

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Биотехнолошки практикум 3

2.1. Општа упутства

Извођење лабораторијских вежби је један од најпродуктивнијих начина

Рад у лабораторији подразумева одређене хазарде који могу довести до

Општа правила понашања у лабораторији подразумевају.

 Обавезно ношење лабораторијских мантила

 Упутство за израду вежби (појединачно или у оквиру уџбеника

2.2. Коришћење микропипете

На лабораторијским вежбама у оквиру Биотехолошког практикума, поред

довести до увлачења узорка у наставак. Наглим отпуштањем завртња може

За прецизно узорковање микропипетом неопходно је да наставак потпуно

Приликом коришћења микропипете потребно ју је држати у вертикалном

При коришћењу микропипете важно је запамтити следеће:

 Микропипета се користи само у дефинисаном опсегу запремина

У практичној примени биотехнологије и научних дисциплина на којима се

описасти и искористити за одређивање непознате концентрације растворене

Где је А апсорбаницја, безјединична величина која представља декадни

Слика 2.2 Шематски приказ спектрофотометра

Када монохроматска светлост познатог интензитета и таласне дужине прође

Где је А апсорбанца, с концентрација растворене супстанце а k константа

Слика 2.3 Апсорпциони спектар дезоксихемоглобина (Нb) и оксихемоглобина (НbО2)

Неки необојени биолошки молекули апсробују електромагнетно зрачење

Слика 2.4 Апсорпциони спектар дезоксирибонуклеинске киселине (ДНК) и протеина у

Концентрација протеина одређује се помоћу емпиријске формуле 2.3, док се

наелектрисању, хидрофилности или хидрофобности. Један протеин може

Слика 3.1. Структурна формула α-аминокиселине.

Слика 3.2. Структурне формуле 20 α-аминокиселина које улазе у састав

Слика 3.3. L- и D-конфигурација α-аминокиселина.

задовољиле биолошке потребе се сврставају у неесенцијалне и у њих спадају:

Слика 3.4. Изоелектрична тачка α-аминокиселина.

Слика 3.5. Приказ сегмента полипептидног ланца са означеном пептидном

Пептидна веза је ковалентна амидна веза која се формира између

3.7.) које се у оквиру једног молекула протеина могу на различите начине

Слика 3.7. Нивои структуре протеина.

успостављања водоничних веза, електростатичких интеракција и

Слика 3.8. Хемијске везе и интеракције које стабилизују терцијарну

који снижавањем енергије активације катализују одређену реакцију

Слика 3.9. Шематски приказ одигравања ензимске реакције: везивање

копира одређени ген. Ген представља део дезоксирибонуклеинске киселине

Слика 3.10. Шематски приказ биосинтезе протеина.

додавање комплексних молекула (нпр. додавање молекула полисахарида тј.

функционалне карактеристике, па се метода реверзибилног таложења може

Вежба 2. Квалитативна анализа протеина: бојене реакције на протеине

Биуретска реакција је општа реакција којом се може доказати присуство

Слика 3.11. Формирање биурета из два молекула урее.

2.1.1. Хемизам реакције.

Слика 3.12. Настајање Cu-комплекса протеина у алкалној средини.

2.2. Нинхидринска реакција

Слика 3.13. Оксидација α-аминокиселина нинхидрином.

Слика 3.14. Трансформација иминокиселине у кетокиселину.

Слика 3.15. Декарбоксилација кетокиселине на повишеној температури.

Слика 3.16. Формирање 1,3-дикетохидриндамина.

енолном таутомеријом прелази у кето-енол комплекс интензивно плаве или

Слика 3.17. Формирање обојеног комплекса љубичасте или плаве боје.

Слика 3.18. Прелазак нитротирозина у базној средини у со хиноидне

Слика 3.19. Реакција два молекула триптофана са глиоксилном киселином.

Слика 3.20. Комплекс оксидованог аргинина са α-нафтолом.

Слика 3.21. Хемизам Милоновог теста

Слика 3.22. Хемизам реакција које се одигравају приликом доказивања

Вежба 3. Квантитативно одређивање протеина

зависи од аминокиселинског састава протеина, а чија је просечна и најчешће

Слика 3.23. Шематски приказ поступка извођења Кјелдалове методе.

Након завршетка дигестије, приступа се неутрализацији узорка. Суд за