Hromatografske

metode
Visokoefikasna tečna
hromatografija na koloni
HPLC
 HPLC
► Velikiznačaj u analiziranju aktivnih supstanci iz
doziranih oblika
► Spada u SEPARACIONE METODE i
primenjuje se za razdvajanje, kvalitativnu i
kvantitativnu analizu smeše aktivnih i
neaktivnih supstanci koje ulaze u sastav
farmaceutskih doziranih oblika
► Razdvajanje supstanci se vrši na dodirnoj
površini mobilna/stacionarna faza
 HPLC faze
► STACIONARNA FAZA je u obliku KOLONE i
može biti čvrsta ili tečna
► MOBILNA FAZA se pod PRITISKOM
ubrizgava u HPLC aparaturu i u neprekidnom
toku prelazi preko stacionarne faze
► Uglavnom se koristi tečno/tečna HPLC gde se
razdvajanje pojedinih supstanci odvija po
pravilu tečno/tečne ekstrakcije na osnovu
razlike u podeonim koeficijentima (Kp)
 Eluacione zone
► Eluacione zone se formiraju praktično na koloni
i pod pritiskom ulaze u detektor
► Krajnjirezultat HPLC hromatografije su
eluacioni hromatogram i retencioni
parametri pomoću kojih vršimo kvalitativnu i
kvantitativnu analizu supstanci
Pojmovi važni za HPLC
 Optimalni uslovi u HPLC
hromatografskom sistemu
Pre nego što se uspostavi jedan hromatografski
sistem ispituju se neke osnovne vrednosti:

► Eluaciona ili retenciona zapremina za svaku

supstancu iz smeše
► Prazna (mrtva) zapremina kolone
► Efikasnost kolone
► Separacioni faktor
► Rezolucija (dve ili više supstanci)
 Eluaciona ili retenciona
zapremina

► Eluaciona ili retenciona zapremina VR je

ZAPREMINA MOBILNE FAZE POTREBNA
ZA ELUIRANJE NEKE SUPSTANCE SA
KOLONE u periodu od vremena iniciranja do
vremena kada je maksimalna koncentracija
uzorka eluirana – kada se postigne maksimalni
pik
 Retenciono vreme
► Retenciono vreme tR je vreme koje protekne
između iniciranja i maksimalne eluacije uzorka
► Ukoliko je proticanje mobilne faze
konstantno (mL/min) onda se retenciona
zapremina i retenciono vreme ne menjaju
i njihov odnos se može predstaviti na sledeći
način:
VR = FxtR
F – protočna brzina mobilne faze (mL/min)
 Konstantni hromatografski uslovi
podrazumevaju istu:
► Kolonu
► Stacionarnu fazu
► Mobilnu fazu
► Temperaturu
► Pritisak i protočnu brzinu mobilne faze

Ako su zadovoljeni prethodni uslovi onda su

retenciono vreme i retenciona zapremina konstantne
vrednosti za neku supstancu i koriste se za njenu
identifikaciju
 Prazna (mrtva) zapremina kolone i
efikasnost kolone
► Zapremina kolone V0 je zapremina mobilne faze koja
se stalno nalazi na koloni u bilo kom vremenu
(neretenciona zapremina)
► Efikasnost kolone je bitan faktor za dobro
razdvajanje supstanci iz smeše i izražava se preko
faktora kapaciteta (k') ili preko broja teoretskih platoa
k' = (V2-V0) / V0
ili

N =16 (tR/w)2
w – širina osnove pika izražena u jedinicama vremena
 Separacioni faktor α
► Stepen razdvajanja dve supstance iz smeše
izražava se preko separacionog faktora α
koji se izračunava prema jednačini:
 Rezolucija supstanci
► Zapostavljanje HPLC uslova za razdvajanje
supstanci neke smeše treba da se izračuna
rezolucija supstanci:
 Efikasnost u razdvajanju
► Efikasno razdvajanje supstanci iz smeše se
postiže kada se ustanovi:

1. Optimalan protok mobilne faze

2. Optimalan pritisak
3. Optimalna temperatura
 HPLC sistem
► HPLC hromatograf predstavlja integrisani sistem
od više osnovnih delova, koji mogu da budu
odvojeni ili ukomponovani u jednu celinu u
zavisnosti od modela
HPLC sistem
 HPLC sistem sadrži:
► Rezervoar mobilne faze (jedan ili više)
► Pumpu koja ubacuje mobilnu fazu pod
pritiskom od 500 – 7000 psi (1000psi = 70 bara)
 Može se u zavisnosti od toga šta razdvajamo koristiti
kao izokratna pumpa ili kao gradijent pumpa
 Pumpa je jedan od najvažnijih uslova za održavanje
konstantnog protoka mobilne faze koji se kreće
u rasponu od 1 mL/min do 10 mL/min
 HPLC sistem sadrži:
► Injektor je sastavni deo HPLC sistema gde se
uz pomoć mikrošpriceva ubacuje uzorak koji
predstavlja ispitivanu smešu supstanci koja je
rastvorena u stacionarnoj fazi ili nekom drugom
pogodnom rastvaraču

► KOLONA je najvažniji deo HPLC sistema, na

njoj DOLAZI DO RAZDVAJANJA
SUPSTANCI tako što se postepeno eluiraju
mobilnom fazom koja se kreće preko
stacionarne faze u neprekidnom protoku
 HPLC sistem sadrži:
► Detektor je mesto u koje ispitivana supstanca nakon
razdvajanja na koloni dolazi zajedno sa mobilnom
fazom i gde se vrši detekcija eluacionih zona

 Eluacione zone dolaze u detektor prema redosledu

njihovog eluiranja (redosled zavisi od Kp)

 Odabir detektora vrši se na osnovu fizičko – hemijskih

osobina eluiranih supstanci iz analizirane smeše
 HPLC sistem sadrži:
► Pumpe koje se dele u dve vrste:
1. Pumpe koje održavaju konstantan pritisak
2. Pumpe koje održavaju konstantan protok

Pumpe koje održavaju konstantan pritisak mogu biti:

a) Ubrizgavajuće pumpe (direktno ubrizgavaju mobilnu fazu u
kolonu)
b) Recipročne (povratne) pumpe, su klipne pumpe koje su
preciznije i mogu ubacivati svega nekoliko mikrolitara
mobilne faze
 HPLC sistem sadrži:

► Injektor koji može biti:

1. Špric injektor – direktno povezan sa početkom
kolone. Kod ove vrste injektora kolona je u prednjem
delu ispunjena staklenim kuglicama. Protok mobilne
faze se može prekinuti prilikom ubrizgavanja uzorka
ali se može injektovati i pri protoku mobilne faze

2. Injektor sa petljom kroz koju se preusmeri

mobilna faza nakon ubacivanja uzorka, a ona je
povezana sa vrhom kolone
 HPLC sistem sadrži:
► Kolonu, koja je uglavnom napravljena od nerđajućeg
čelika ili od debljeg stakla. Staklene kolone su
uglavnom smeštene u čeličnim cevima zbog visokog
pritiska u HPLC sistemu
 Dužina kolone iznosi 10-30cm sa unutrašnjim prečnikom Φ
od 1-5 mm najčešće Φ 4.5-5 mm

 Danas se koriste komercijalne kolone ali se mogu pakovati i

ručno
 Materijali za pakovanje
kolona
► Površinski porozni materijal – to mogu biti
porozne staklene kuglice ili staklene kuglice
obložene nekim poroznim adsorbensom
 Φ staklenih kuglica od 5 – 50μm, najčešće 35-45
μm
 Efikasnost ovih kolona nije velika na šta nam
ukazuju HETP vrednosti, imaju mali broj teoretskih
platoa
 Materijali za pakovanje
kolona
► Male porozne čestice - 3, 5, 10 μm, ako je Φ
kolona 4.5 – 5 mm broj teoretskih platoa iznosi
30.000
 Ako se koriste čestice veličine 5 μm onda broj teoretskih
platoa iznosi 60.000 a ako se koriste čestice veličine 3
μm onda broj teoretskih platoa iznosi 100.000 !!!
► Najčešćese koristi silicijum oksid i
aluminijum oksid
 Materijali za pakovanje
kolona
Pakovanje vezanih faza (Bonded Phase
Paking)

► Ova vrsta pakovanja se uglavnom koristi u analitici lekova

► Karakteristično je za ovu vrstu pakovanja da se sastoji od
silikonskih nizova za koji su hemijski vezani lanci
(nizovi) organskih jedinjenja
 Ovako dobijeni nosač se nanosi na male staklene kuglice porozne
površine za koje se vezuje preko slobodnih hidroksilnih grupa na
staklenoj površini
 Ovim postupkom se dobijaju sferične čestice približnih veličina što ima
veliki značaj za HPLC analizu
Materijali za pakovanje kolona:
Silanol grupe
► Silanolgrupe na površini daju izrazito polarni
karakter i slabu kiselost silika gelu
► Vezivanjem ugljovodoničnih lanaca za
silikonski niz (R) dobijaju se NEPOLARNI
nosači, a ako se vežu organska jedinjenja
sa ciano, amino, nitro ili hidroksilnom
grupom dobijaju se POLARNI nosači
 Radikali (R)
► Radikali(R) koji mogu biti vezani za
silikonski nosač:
 Radikali (R)
►Uzavisnosti koji je radikal vezan kolona može biti
POLARNA i da se koristi kao kolona
NORMALNIH faza
► NEPOLARNI radikal će dati kolonu za
hromatografiju REVERSNIH faza
► Kolonasa oktadecilsulfatom (ODS) C18 je
najčešće upotrebljavana kolona u hromatografiji
reversnih faza (pored nje se koriste C8 i C6 )
 REVERSNO – FAZNE KOLONE
(nepolarne kolone)

► Najbitnija razlika je U VELIČINI PORA koja

bitno utiče na razdvajanje supstanci iz smeše

► Za supstancu sa većom molekulskom masom

potrebni su silikonski nosači sa većim porama

► Koriste se za razdvajanje nepolarnih supstanci

 POLARNE KOLONE
► Zasilikonski nosač mogu biti vezane različite grupe
koje utiču na polarnost kolone:
 -CH2-CH2-CH2-CN cijanopropil
 -O-CH2-CH2-ON oksinitril
 -CH2-CH2-CH2-NH2 aminopropil

Njihova grupa je ograničena jer amino-, ciano-, ili

alkoholne- grupe mogu hemijski da reaguju sa
supstancama koje se razdvajaju ili sa rastvaračima iz
mobilne faze
Stabilnost kolona sa silikonskim
nosačima

►U kolonama koje su punjenjne silikonskim nosačima

mora se strogo voditi računa o pH vrednosti u
ovim kolonama
► pH treba da se održava u rasponu od 2-8 pH jedinica
► Ako je pH manje od 2 dolazi do slepljivanja čestica
nosača
► Ako je pH veće od 8 dolazi do rastvaranja čestica
nosača
 Jono-izmenjivačke kolone
► Kao nosači se koriste organski polimeri a najčešće
stiren-divinil-benzen ko-polimeri
►U mrežastu strukturu stiren-divinil-benzena se mogu
inkorporisati kvaternerna amonijum jedinjenja,
sulfonske ili karbonske kiseline i na taj način dobijamo
jono-izmenjivačke kolone
 Ove kolone imaju malu primenu u rutinskoj analizi lekova ali
se često koriste u:
 biohemijskim laboratorijama (npr. za određivanje HbA 1c –
glikozilirani Hb) i
 laboratorijama sanitarne hemije
 Rastvarači
► Izbor rastvarača se vrši na osnovu:
 polarnosti rastvarača
 polarnosti kolone
 vrsti detektora i
 polarnosti i rastvorljivosti supstanci koje se razdvajaju iz smeše
► Za HPLC se koriste samo ULTRAČISTE hemikalije
► Polarnostse može odrediti merenjem adsorpcione
energije u odnosu na neki adsorbens
► Snyder-ova klasifikacija se zasniva na merenju
adsorpcione energije rastvarača u odnosu na
aluminijum-oksid
 Polarnost rastvarača
► Osim merenja adsorpcione energije da bi se ispitala
polarnost rastvarača potrebno je odrediti:
 dipol moment
 proton akceptorske/donorske osobine
 jačinu disperzionih sila u rastvaraču

► Naosnovu ovih parametara Snyder je uveo pojam

indeks polarnosti za rangiranje rastvarača
► Pored
gore navedenih parametara potrebno je znati
indeks refrakcije, apsorpciju u UV spektralnoj
oblasti i viskozitet
 Indeks polarnosti
► Indeks polarnosti koji treba da bude u smeši
rastvarača izračunava se i potrebno je da se
izborom rastvarača u binarnom sistemu
postigne podeoni koeficijent 2-5 za supstance iz
smeše

IZRAČUNAVANJE INDEKSA POLARNOSTI (PI)

Za smešu rastvarača A i B izračunava se polarnost na
osnovu jednačine:
PI (AB) = % rastvarača AxPI (A) + % rastvarača BxPI (B)
 Puferi
► Za održavanje pH vrednosti u sastav mobilne ili
stacionarne faze ulaze i PUFERI
► Oni imaju ulogu da modifikuju hromatografsko
razdvajanje gde će krajni ishod biti brzo i efikasno
razdvajanje analiziranih supstanci iz smeše (Kp,
VR, tR)
► Najčešće se koriste: acetatni, boratni, karbonatni,
trietanolaminski, dietanolaminski, perhloratni i
nitratni
 DETEKTORI
► Detektor je integralni deo HPLC sistema i
nastavlja se na kolonu
► Eluiranesupstance zajedno sa mobilnom fazom
ulaze u u detektor a vizuelna slika se dobija
preko integratorskog i računarskog sistema koji
su vezani za detektor
► Izbor
detektora se vrši na osnovu fizičko-
hemijskih osobina supstanci koje dospevaju u
detektor
 Opšti uslovi koje treba da ispune
detektori:

• Da daju odgovor za svaku supstancu iz smeše

• Da ne daju odgovor protoku mobilne faze (bazna linija)
• Da se dobija linearan odgovor za svaku supstancu u odnosu
na njenu koncentraciju
• Da odgovori na detektoru ne zavise od temperature detektora
niti od brzine proticanja mobilne faze
• Da odgovor na detektoru ne zavisi od veličine eluacione zone
već samo od koncentracije supstance u mobilnoj fazi
 Podela detektora
Detektori se dele u dve osnovne grupe:

• Fotometrijski (UV, fluorescentni i IR detektori)

• Razni detektori (radioaktivni, elektrohemijski, refrakcioni –

indeks detektori, i NMR detektori)
► Postoje i drugi detektori ali oni nisu značajni za
određivanje supstanci iz doziranih oblika
► Detektori se mogu kombinovati ako se jednim detektorom ne
može dobiti odgovor za svaku aktivnu supstancu:
 UV/Refrakcioni indeks detektor ili
 UV/elektrohemijski detektor
 UV apsorpcioni detektori
► Najčešće se koriste u HPLC analizi doziranih oblika
► Veliki broj aktivnih supstanci poseduje u svojim
molekulima UV HROMOFORNE grupe koje apsorbuju u
UV spektralnoj oblasti
• Osetljivost ovih detektora je 10-6mg/mL
► Zapremina ćelija iznosi 5-10μL a dužina protoka kroz
ćeliju 5-10mm
► Mogu biti:
 UV fiksni 254nm
 UV promenljivi 280-380nm i 180-450nm kao i
 UV/VIS promenljivi 200-900nm i 180-700nm
 Fluorescentni detektori
► Malo se koriste u analitici lekova
► Detekcija prirodno fluorescirajućih (ergot alkaloidi)
supstanci dok supstance koje nemaju ove osobine
mogu se derivatizacijom prevesti u fluorescirajuće
► Koriste se za ananlizu supstanci koje imaju slične
fizičko-hemijske i kada se nalaze u veoma malim
koncentracijama
► Osetljivost ovih detektora je 10-8mg/mL
 IR detektori
► Spadaju u apsorpcione spektroskopske
detektore
► Mana im je da se mogu koristiti za mali broj
rastvarača
► Osetljivost im je veoma mala
► Uglavnom se koriste za identifikaciju polimernih
jedinjenja
 Refrakcioni indeks detektori
► Ova vrsta detektora se koristi u ispitivanju doziranih
oblika kada supstance koje ih čine ne apsorbuju u UV
spektralnoj oblasti i kada je koncentracija eluirane
supstance u mobilnoj fazi veklika
► Osetljivost refrakcionog indeks detektora iznosi 10-3mg/mL
► Uslov za njihovo korišćenje je konstantna t°, pritisak,
protok mobilne faze i sastav mobilne faze
► Koristi se za određivanje šećera
 Elektrohemijski detektori
► Koriste se kao detektor u HPLC sistemima reversnih faza
(jedan od rastvarača u mobilnoj fazi je voda)
► Eluat koji dolazi do detektora je vodeni rastvor
ispitivane supstance
► Princip određivanja je oksidacija ili redukcija supstanci na
površini elektroda (živina, platinska, stakleno-grafitna ili
grafitna elektroda)
► Osetljivost im je jako velika 10-12mg/mL ,
moguće je odrediti PIKOMOLSKE koncentracije
► Uglavnom se koriste u oksidacionoj varijanti jer se u
redukcionoj mora uklanjati kiseonik iz mobilne faze i iz
rastvora uzorka