SEPARACIONE

HROMATOGRAFSKE
METODE

HROMATOGRAFIJA
Hromatografija (od gr. :chroma - boja i
:grafein - pisati) je zajedniki naziv za
grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje
smea

Ona ukljuuje kretanje ispitivane supstance,

rastvorene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu
fazu", ime se DELOVI SMEE RAZDVAJAJU
I IZOLUJU, te ih je mogue analizirati i
kvantitativno odrediti
Hromatografija moe biti analitika i
preparativna

HROMATOGRAFIJA
PREPARATIVNA HROMATOGRAFIJA se bavi
razdvajanjem komponenti iz smee radi dalje obrade, pa
se moe smatrati metodom preiavanja
U ANALITIKOJ HROMATOGRAFIJI se obino radi sa
malim uzorcima gde se pokuava izmeriti relativni odnos
komponenti u smei

Hromatografija je jedna od vodeih analitikih metoda i

omoguava RAZDVAJANJE I KVANTITATIVNO
ODREIVANJE supstanci veoma sline strukture i
hemijskih osobina
Pod hromatografijom se podrazumevaju metode
razdvajanja koje se zasnivaju na razliitoj raspodeli
komponenata uzorka izmeu dve faze, od kojih je jedna
nepokretna (STACIONARNA), a druga pokretna
(MOBILNA) u odnosu na prvu

HROMATOGRAFIJA - Istorija
Prvu hromatografsku tehniku je pronaao ruski botaniar Mihail
Cvet 1900. godine tokom svog istraivanja hlorofila. Koristio je
staklenu kolonu koja je sadravala CaCO3 da bi razdvojio biljne
pigmente
Zanimljivo je da Mikhailovo prezime "Tsvet" na ruskom jeziku
znai boja, tako da je mogue da je hromatografiju nazvao po
svom prezimenu
Godine 1952. britanski naunici Archer John Porter Martin i
Richard Laurence Millington Synge su dobili Nobelovu nagradu za
hemiju za svoje otkrie PARTICIONE HROMATOGRAFIJE
Od tada, hromatografija se brzo razvija. Naunici su ubrzo otkrili
da se principi Tsvetove hromatografije mogu primeniti na
razliite naine i varijante. U isto vreme, poboljane su i
unapreene tehnike performanse hromatografije, omoguavajui
razdvajanje veoma slinih molekula

Pojmovi u hromatografiji
Analit je supstanca koja se razdvaja u hromatografiji
Analitika hromatografija se koristi za odreivanje prisustva i
koncentracije analita u uzorku
Hromatogram je vizuelni prikaz rezultata hromatografskog postupka.
Svakoj supstanci odgovara odreeni pik na hromatogramu
Hromatograf je instrument za hromatografiju
Eluent je komponenta separacijskog sistema koja pokree uzorak kroz
kolonu
Efluent je kompletna mobilna faza koja izlazi iz kolone
Mobilna faza je faza koja se kree u odreenom pravcu. Moe biti tena
(LC) ili gasovita (GC). Mobilna faza se kree kroz kolonu nosei uzorak
koji se razdvaja
Preparativna hromatografija slui za preiavanje supstanci za
odreene svrhe (ne za analizu)
Retenciono vreme je vreme za koje analit proe kroz hromatografski
sistem u odreenim uslovima
Stacionarna faza je supstanca koja je fiksirana u koloni (GC i LC) ili
ploi (npr. silikagel u TLC), na ijoj se povrini odreeno vreme
zadravaju supstance koje se razdvajaju

Hromatogram

Hromatogram

Hromatografsko
razdvajanje crnog
mastila

Klasifikacija hromatografskih
metoda
Hromatografske metode je mogue podeliti prema
razliitim kriterijumima:
prema FIZIKOM STANJU FAZA
prema fiziko-hemijskim fenomenima koji se deavaju prilikom
razdvajanja (MEHANIZMU RAZDVAJANJA)

Podela prema fizikom stanju faza

Tena hromatografija:

Adsorpciona (teno/vrsto), npr. TLC, HPLC

Jonska
Ekskluziona
Particiona (teno/teno)

Gasna hromatografija:
Gas/teno
Gas/vrsto

Superkritina fluidna hromatografija

Klasifikacija hromatografskih
metoda
Podela prema obliku sistema

Kolonska hromatografija hromatografija na

koloni
Planarna hromatografija, npr. TLC

Podela prema mehanizmu razdvajanja

Jonoizmenjivaka (jonska) hromatografija

Ekskluziona hromatografija

Hromatografija na koloni

Hromatografsko razdvajanje hlorofila

GASNA HROMATOGRAFIJA

Gasna hromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije volatilnih ISPARLJIVIH organskih jedinjenja i nekih neorganskih gasova iz smee

GC je nastala 1950. godine i danas se razvila u jednu od primarnih tehnika u

hemijskoj analizi

U GC dolazi do particionisanja - RASPODELE GASOVITOG UZORKA izmeu

inertnog gasa kao mobilne faze i tene ili vrste stacionarne faze

Ureaj za GC se naziva GASNI HROMATOGRAF

Kao mobilna faza (GAS NOSA) najee se upotrebljavaju helijum, azot,

vodonik ili smea argona i metana

Izbor gasa zavisi od uzorka i detektora, a najvie se koristi HELIJUM

Uzorak se unosi pomou injektora (manuelni ili automatski) i noen gasom prelazi
u kolonu

Kolone za GC koje su se u poetku koristile su tzv. pakovane kolone.

Danas su u upotrebi KAPILARNE KOLONE, zbog bolje efikasnosti razdvajanja.
Unutranji zidovi kapilarne kolone su prevueni vrstim poroznim materijalom ili
viskoznom tenou

U GC se koristi vie tipova detektora, iji se izbor vri na osnovu komponente

koja se analizira

GASNA HROMATOGRAFIJA

TENA HROMATOGRAFIJA
Tena hromatografija (LC) je razdvajanje supstanci na osnovu
distribucije izmeu vrste stacionarne faze i TENE MOBILNE FAZE
Postoje dva tipa LC: klasina i LC visokih performansi (HPLC)
Klasina LC koristi velike kolone, duine i do 50 cm, pakovane poroznim
materijalom, a mobilna faza prolazi gravitaciono, pa je zbog toga mali
protok i metoda nije efikasna
HPLC je moderna analitika tehnika kod koje se mobilna faza dovodi
pomou pumpe. Uzorak se ubacuje pomou manuelnog ili automatskog
injektora. Kolone za HPLC su punjene silikatnim ili polimernim
materijalom
Postoji vie tipova DETEKTORA za HPLC. Najee se koristi UV-VIS
detektor, a osim njega i fotodiodni, fluorescentni, elekrohemijski i dr.
Na osnovu polarnosti razlikuje se LC na normalnim i obrnutim - reverznim
fazama
Razdvajanje na NORMALNIM FAZAMA podrazumeva da je stacionarna
faza polarna (npr. silikatna), a mobilna faza nepolarna (npr.heksan)
Kod razdvajanja na OBRNUTIM - REVERZNIM FAZAMA stacionarna
faza je nepolarna (npr. C-18 ugljovodonik), a MOBILNA FAZA
POLARNA (npr. voda i metanol)

TENA HROMATOGRAFIJA
Izgled hromatograma

ema tenog ili gasnog hromatografa

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

boca sa gasom/tenosti
regulator pritiska
uzorak
injektor
kolona
termostat
detektor
PC
tampa
hromatogram

TANKOSLOJNA
HROMATOGRAFIJA
Tankoslojna hromatografija (TLC) koristi tanak sloj (0.10
0.25 mm) adsorbujueg materijala (SILIKAGEL, aluminijum
oksid, celuloza) nanesen na vrsti nosa od stakla,
aluminijuma ili plastike
Uzorak rastvoren u odgovarajuem rastvarau se nanosi u
vidu mrlje na jednu stranu ploe, na udaljenosti 1 cm od
ivice
Ploa se unosi u komoru na ijem dnu se nalazi rastvara koji
kapilarnim silama prolazi kroz adsorbens nosei sa sobom
komponente uzorka, koje se kreu do odreene udaljenosti
na ploi i na taj nain ih razdvaja
Zbog razliitog afiniteta prema adsorbujuem materijalu
komponente se zaustavljaju na razliitim mestima na
ploi, to omoguava njihovu identifikaciju (razvijanjem
boje ili posmatranjem pod UV lampom)

TANKOSLOJNA
HROMATOGRAFIJA

JONOIZMENJIVAKA
HROMATOGRAFIJA
Jonoizmenjivaka hromatografija (IEC) ili jonska
hromatografija je tehnika koja ima dosta slinosti sa HPLC
tehnikom
Kao stacionarna faza koriste se umreene polimerne smole
(najee polistirenske smole umreene pomou divinilbenzena), na koje su kovalentno vezane jonske funkcionalne
grupe
Te grupe su neutralisane jonima suprotnog naelektrisanja i
oni mogu biti zamenjeni jonima koji su prisutni u ispitivanom
uzorku
U zavisnosti od afiniteta, joni e se razliito vreme
zadravati na stacionarnoj fazi, to omoguava njihovo
razdvajanje
Generalno, jonoizmenjiva favorizuje vezivanje jona veeg
naelektrisanja i manjeg radijusa
Kao mobilna faza najee se upotrebljavaju puferi

Jonoizmenjivaka hromatografija
Ureaj za jonoizmeljivaku hromatografiju

Combining IEC DEAE-825 (a column for weak

anion exchange chromatography) with an
electrochemical detector (ECD) has permitted
sensitive detection of cyanide.
With this method, the detection limit of cyanide
is 0.2 micro-g/L.
Column: Shodex IEC DEAE-825 (8.0mmID*75mm
Eluent: (10mM Sodium carbonate + 1mM
Ethylenediamine) aq./CH3OH=90/10
Flow rate: 1.0mL/min
Detector: ECD(Electrode; Ag 0mV SCE)
Column temp. : 40deg-C
Sample: 1g/L, 100L

EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA
Ekskluziona hromatografija je metoda kod koje se
separacija komponenata vri na osnovu veliine estica

Kao stacionarna faza koriste se porozni materijali (silikagel

ili polimerne smole)
Manje estice mogu ui u pore stacionarne faze i
zadravaju se due vremena
Vee estice koje su prisutne u uzorku ne mogu ui u pore i
eliuraju se pre
Ovaj tip hromatografije se naziva jo i gel-filtracija ili
hromatografija na molekularnim sitima
Engleski naziv je size exclusion chromatography, pa se
koristi akronim SEC. Ova metoda je pogodna za razdvajanje
proteina

EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA

Size Exclusion Chromatography

SUPERKRITINA FLUIDNA
HROMATOGRAFIJA
Superkritina fluidna hromatografija
(SFC) je metoda kod koje je
MOBILNA FAZA gas na temperaturi i
pritisku iznad kritinih vrednosti
(pod ovim uslovima mobilna faza je
superkritini fluid niti je gas niti
tenost)
Superkritini fluidi imaju viskoznost
slinu gasovima, pa lako prolaze kroz
kapilarne i pakovane kolone bez
potrebe za visokim pritiskom kao kod
HPLC metode

Gustina superkritinih fluida je slina

tenostima, pa se ponaaju kao rastvara

Najee se koristi CO2

Njegova kritina temperatura je 31C i

kritini pritisak 72.9 bar-a (atm) to se
relativno lako postie

Aparat za SFC

SUPERKRITINA FLUIDNA
HROMATOGRAFIJA

Fazni dijagram za superkritini fluid

Dijagram i ema SFC

SUPERKRITINA FLUIDNA
HROMATOGRAFIJA

REFERENCE

Savi,J., Savi, M.: Osnovi analitike hemije, Svjetlost Sarajevo, 1987

Sadek, P.C.:Illustrated pocket dictionary of chromatography, John Wiley & Sons,
2004 ISBN 0471200212
Rouessac, F., Rouessac, A.: Chemical Analysis: Modern Instrumentation methods
And Technques, John Wiley & Sons, 2007 ISBN 9780470859025
Settle, F.A.: Handbook of instrumental techniques for analytical chemistry,
Prentice Hall, 1997 ISBN 0131773380
Robert Meyers (Editor): Encyclopedia of physical science and technology, Third
edition, Ramtech Limited, Kalifornija, 2001 ISBN 0122274105
Harvey, D.: Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill, 2000 ISBN 0072375477
http://ull.chemisty.uakron.edu/chemsep/super/
Smith R. M.; Nomenclature for supercritical chromatography and extraction,
IUPAC Recommendations, Pure Appl. Chem. 1993, 65(11), 2397-2403.
Christie W. W.; Supercritical Fluid Chromatography and Lipids, Lipid Technology
, 1990, 2, 107-109.
Dixon D. J. and Jhonston K. P.; Encyclopedia of Separation Technology, Ruthven
D. M.Ed., John Wiley, 1997, 1544-1569.
http://www.j-chrom-sci.com/jan-apr95.htm
Rozzi N.L. and Singh R.K.; Supercritical fluids and the food industry,
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety , 2002, 1, 33-40.
Supercritical Fluids-Fundamentals and Applications,
http://chemeng.iisc.ernet.in./giridhar/rect.html