VISOKOEFIKASNA TEČNA HROMATOGRAFIJA

High Performance Liquid Chromatography - HPLC

PRINCIP

Tečna hromatografija pod visokim pritiskom je vrsta tečne hromatografije na koloni pri
posebnim uslovima, kao što su visok pritisak, velika brzina protoka eluenta i specijalno
punjenje kolone. Pomoću ove tehnike moguće je ispitivanje manje količine uzorka većom
brzinom i efikasnošću nego običnom hromatografijom u koloni.

Ključna karakteristika visokoefikasne tečne hromatografije, koja određuje efikasnost, brzinu

protoka, a samim tim i dužinu trajanja hromatografskog procesa, je veličina čestica (zrna)
stacionarne faze. Tek 60-ih godina prošlog veka razvijena je tehnologija proizvodnje zrna
veličine 10 μm i manjih (do data su se koristila zrna veličine 150-200 μm). Za primenu te
tehnologije bili su neophodni mnogo složeniji uređaji od jednostavnih staklenih kolona, pa se
kod HPLC tehnike koriste čelične kolone punjene stacionarnom fazom.

Što je veličina zrna stacionarne faze manja i sto su čestice ujednačenije (veličina i oblik) to je
efikasnost kolone veća. Za postizanje dovoljno velikih brzina protoka u kolonama sa
savremenim puniocoma, neophodno je primeniti pritisak od nekoliko miliona Paskala (koji bi
omogućio protok mobilne faze kroz gusto punjenje čestica stacionarne faze). Tako visoki
pritisci zahtevaju mnogo složeniju opremu od one koja se sreće kod do sada objašnjenuh
tehnika hromatografije.

PRIMENA

HPLC se koristi u raznim oblastima, a nezamenjiva je tehnika kod kontrole kvaliteta

proizvoda, ispitivanja životne sredine, hemijske i farmaceutske industrije, fundamentalnih
istraživanja itd. Ono što je čini nezamenjivom u odnosu na ostale metode analize je
mogućnost ispitivanja:
 malih količina supstanci,
 neisparljivih i termolabilnih uzoraka (koji ne mogu da se ispitaju pomoću gasne
hromatografije),
 preparativna prečišćavanja i do nekoliko grama,
 direktna analiza bioloških tečnosti.

Od približno milion organskih jedinjenja, samo oko 15 % mogu se prevesti u gasovito stanje
bez razlaganja. To su uglavnom jedinjenja sa nižim relativnim molekulskim masama čije
razdvajanje se vrši najčešće gasnom hromatografijom. Razdvajanja ostalih jedinjenja ulaze u
domen tečne hromatografije.

17
PODELA

U zavisnosti od punjenja kolone, razlikuju se četiri vrste tečne hromatografije na koloni:

1. Podeona hromatografija (tečno-tečna hromatografija)

2. Adsorpciona hromatografija (tečno-čvrsta hromatografija)
3. Jono-izmenjivačka hromatografija
4. Gel hromatografija

Visokoefikasna podeona hromatografija

Podeona hromatografija je vrsta tečne hromatografije koja se najčešće primenjuje i obično se

deli na hromatografiju u sastavu tečnost-tečnost i na hromatografiju u sastavu vezane faze. Te
dve vrste tečne hromatografije razlikuju se po načinu na koji je stacionarna faza vezana za
zrna nosača. Kod sastava tečnost-tečnost tečna stacionarna faza se vezuje za nosač na temelju
fizičke adsorpcije, dok kod sastava vezane faze nastaju kovalentne veze između tečne
stacionarne faze i nosača. Kad se počela primenjivati, podeona hromatografija se temeljila
isključivo na sastavu tečnost-tečnost. Danas preovladavaju metode vezane faze, a
hromatografija u sastavu tečnost-tečnost se veoma retko primenjuje.

Vezano fazna pakovanja se većinom dobijaju reakcijom organohlorsilana sa –OH grupama

formiranim na površini silikagela hidrolizom u toploj, razblaženoj hlorovodoničnoj kiselini.
Tom reakcijom nastaje organosiloksan.

CH3
CH3
R
R Si
Si OH + Si
CH3
O
Cl CH3 Si

Shema. Nastajanje organosiloksana

Na slici R predstavlja ravan lanac oktil ili oktildecil grupe (C8H17- ili C18H37). Na površini
sorbensa mogu se vezati i druge organske funkcionalne grupe kao što su alifatični amini, etri i
aromatični ugljuvodonici.

Visokoefikasna adsorpciona hromatografija

Adsorpcina hromatografija se primenjivala u razdvajanju supstanci pre svih ostalih vrsta

hromatografije. To je tečno-čvrsta hromatografija, gde stacionarnu fazu predstavlja fino
usitnjena čvrsta materija, najčešće silikagel. Mehanizam razdvajanja se zasniva na ulasku
analita u pore na površini stacionarne faze, kao rezultat adsorpcionih sila.

18
Visokoefikasna hromatografija jonske izmene

Polimeri velikih molekulskih masa, koji sadrže brojne funkcionalne grupe na svojoj površini
(slika), predstavljaju stacionarnu fazu u jono-izmenjivačkoj hromatografiji. Joni sličnog
naboja se razdvajaju elucijom iz kolone punjene fino usitnjenim zrncima jonskih izmenjivača.
Katjonski izmenjivači mogu biti ili jake kiseline sa sulfonskim kiselim grupama (RSO3-H+) ili
slabe kiseline sa karboksilnim kiselim grupama (RCOOH). Anjonski izmenjivači sadrže
bazne amino funkcionalne grupe vezane za polimer. Izmenjivači sa jakim bazama su
kvaternerni amini [RN(CH3)3OH-]. Jonski izmenjivači sa slabim bazama sadrže sekundarne ili
tercijarne amine.

Gel hromatografija

Hromatografija na gelu, il ekskluziona hromatografija je vrsta hromatografije kod koje proces

razdvajanja supstanci zavisi od veličine molekula analiziranih sastojaka i naročito je povoljna
za analizu jedinjenja velikih molekulskih masa. Stacionarna faza se sastoji od zrnaca
silikagela ili polimera (~10 µm) koji line mrežu pora jednake veličine. Molekuli manje mase
mogu da uđu u pore stacionarne faze. Dok se nalaze u porama, molekuli nisu prisutni u toku
mobilne faze, pa se samim tim i sporije kreću u odnosu na veće molekule koji se manje
zadržavaju u porama stacionarne faze ili se ne zadržavaju uopšte. Dakle, najveći molekuli se
kreću najbrže i prvi izlaze iz kolone.

STACIONARNE FAZE

Većina separacija se bazira na mehanizmima particije, koristeći hemijski modifikovan

silicijum kao stacionarnu fazu i polarne rastvarače kao mobilnu fazu. Površina podloge, tj.
silanolske grupe silicijuma, se podvrgava reakciji sa raznim silanskim reagensima da bi
proizvela kovalentno vezane derivative silila, pokrivajući promenljivi broj aktivnih mesta na
površini podloge. Priroda vezane faze je važan parametar za odredjivanje separacionih
svojstava hromatografskog sistema.

Uobičajene vezane faze koje se koriste su :

Oktil Si-(CH2)7-CH3 C8
Oktadecil Si-(CH2)17-CH3 C18
Fenil Si-(CH2)n-(C6H5) C6H5
Cijanopropil Si-(CH2)3-CN CN
Aminopropil Si-(CH2)3-NH2 NH2
Diol Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH

U zavisnosti od polarnosti mobilne i stacionarne faze razlikuju se dve vrste podeone

hromatografije: normalno fazna i reverzno fazna hromatografija. U normalno faznoj

19
hromatografiji stacionarna faza je polarna, a mobilna faza je nepolarna dok je u reverzno
faznoj hromatografiji stacionarna faza nepolarna, a mobilna faza je polarna. U normalno
faznoj hromatografiji najmanje polaran sastojak eluira prvi, a povećanjem polarnosti mobilne
faze smanjuje se vreme eluiranja. Suprotno tome, u reverzno faznoj hromatografiji
najpolarniji sastojak eluira prvi, a povećanjem polarnosti mobilne faze produžuje se vreme
elucije.

MOBILNE FAZE

Sastav mobilne faze u tečnoj hromatografiji je jedan od važnih činilaca od kojih zavisi
hromatografsko razdvajanje. Za mobilnu fazu je osnovno da:
 ne menja karakteristike kolone,
 bude kompatibilna sa detektorom,
 rastvara uzorak,
 ima malu viskoznost,
 omogućuje ponovnu regeneraciju uzorka, ukoliko je potrebno,
 bude bez stranih primesa i
 bude komercijalno dostupna.

Za normalno faznu hromatografiju se primenjuju manje polarni rastvarači. U reverzno-faznoj

LC primenjuju se vodene mobilne faze, sa ili bez organskih modifikatora.

Komponente mobilne faze se obično filtriraju da bi se odstranile čestice veće od 0,45 m. Za
sve tečnosti koje se koriste kao mobilna faza bitno je da budu degasirane. Vazduh koji se
nalazi rastvoren u rastvarčima stvara mehuriće u detektoru izazivajući visok šum. Degasiranje
se vrši u vakumu, u ultrazvučnoj kadi ili zagrevanjem. U savremenijim uređajima degaser je
ugrađen u sistem pumpe.

Podešavanje pH, ako je potrebno, vrši se pomoću samo vodene komponente mobilne faze, a
ne pomoću mešavine. Ako se koriste puferski rastvori, adekvatno ispiranje HPLC sistema,
nakon završetka analiza, se vrši mešavinom vode i organskog modifikatora mobilne faze (5%
v/v) da bi se sprečila klistalizacija soli posle završetka hromatografije.

APARATURA

Apartura se sastoji od sistema za pumpanje, injektora, hromatografske kolone, detektora i

sistema obrade podataka (ili integratora ili rekordera za grafikone). Mobilna faza se dovodi iz
jednog ili više rezervoara i teče kroz kolonu, a zatim kroz detektor. Na slici je prikazan HPLC
instrument sa svojim elementima.

20
 2
3
5

Sema: HPLC
1-rezervoar sa mobilnom fazom,
2-sistem za pumpanje,
3-injektor,
4-hromatografska kolona,
5-detektor,
6-sistem za obradu podataka

Sistem za pumpanje

Sistemi za pumpanje su neophodni za dovod mobilne faze sa konstantnim stepenom protoka.

Fluktuacija pritiska treba da bude minimalna.

Mikroprocesorski kontrolni sistemi mogu precizno da isporučuju mobilnu fazu konstantnog

sastava - izokratska elucija ili promenljivog sastava - gradijentna elucija, u skladu sa
definisanim programom. U slučaju gradijentne elucije, postoje sistemi pumpi koji isporučuju
rastvarač(e) iz nekoliko rezervoara, a mešanje rastvarača se postiže na odgovarajućoj strani
pumpe, sa niskim odnosno visokim pritiskom.

Injektor

Uzorak rastvora se uvodi u tekuću mobilnu fazu na ili u blizini vrha kolone pomoću
injekcionog sistema koji može da radi pod visokim pritiskom. Koriste se raznovrsni uredjaji

21
različite zapremine. Injektovanje može biti automatsko ili ručno. Ručno punjenje može
dovesti do lošije preciznosti zapremine pri injektiranju.

Kolona

Kolone za HPLC su obično izrađene od nerđajućeg čelika. Dužine za većinu kolona kreću se
od 10-30 cm, a unutrašnji prečnik 4-10 mm. Pakovanja kolona se obično sastoje iz čestica
prečnika 5-10 μm. U skorije vreme su dostupne i visokoefikasne mikrokolone unutrašnjeg
prečnika 1-4,6 mm i dužina od 3 do 7,5 cm. Ovakve kolone su pakovane česticama veličine 3-
5 μm i imaju dodatnu prednost u brzini i minimalnoj potrošnji rastvarača.

Detektor

Među detektorima koji se koriste u tečnoj hromatografiji spadaju UV detektori, fluorescentni,

elektrohemijski, detektori na bazi indeksa refrakcije, maseno spektroskopski, detektori na bazi
rasejavanja svetlosti i detektori radioaktivnosti. Najčešće se primenjuju UV detektori, čiju
posebnu vrstu čine tzv. diode array detektori (DAD).

Primena UV detektora je ograničena na jedinjenja koja apsorbuju u UV-oblasti i na mobilne

faze koje ne apsorbuju u istoj. Široko se upotrebljava zbog jednostavne primene. UV detektori
mogu raditi na jednoj, na više ili na određenom rasponu talasnih duzina.

Polihromatski DAD detektori imaju mogućnost analize uzoraka u UV/VIS spektralnoj oblasti.
Dobija se potpuni spektar eluirajuće supstance i obezbeđuje dobra identifikacija analita.

KVALITATIVNA I KVANTITATIVNA ANALIZA

Kod podeone hromatografije ravnoteža analita između tečne stacionarne i tečne mobilne faze
može se prikazati koeficijentom raspodele, tipičnim za dve tečnosti koje se međusobno ne
mešaju:

K = Cs /Cm

Cs i Cm - koncentracije supstance u stacionarnoj, odnosno mobilnoj fazi.

22
Prosečna brzina kojom se supstanca kreće kroz kolonu zavisi od vremena koje provede u
mobilnoj fazi. Retenciono vreme, tR je vreme potrebno analitu da nakon unošenja uzorka
stigne u detektor, dok je mrtvo vreme, tM vreme potrebno da supstanca koja se ne zadržava na
koloni stigne u detektor (slika). Brzina kretanja molekula koji kolona ne zadržava jednak je
prosečnoj brzini kretanja molekula mobilne faze.

Identifikacija analita može se izvršiti pomoću retencionog vremena, ukoliko se retenciono

vreme analita poklapa sa retencionim vremenom standardne supstance, injektovane pod istim
hromatografskim uslovima. Za pouzdaniju informaciju porede se i UV spektri standarda i
uzorka (moguće samo kod DAD detektora).

Određivanje sadržaja vrši se preko površine ispod pika. Površinu ispod pika analita potrebno
je uporediti sa površinom ispod pika standardne supstance injektovane pod istim
hromatografskim uslovima, pri čemu važi proporcija:

Panalita:canalita=Pstandarda:cstandarda

Gore pomenuta proporcija odnosi se na metod određivanja nepoznate koncentracije pomoću

jedne tačke. Međutim, najčešće se za određivanje sadržaja koristi metoda kalibracije pomoću
eksternog ili internog standarda.

23
 EKSTRAKCIJA NA ČVRSTOJ FAZI (Solid phase extraction – SPE)

Kod svih hemijskih analiza, analit – supstanca koju želimo da odredimo, mora biti prisutan u
dovoljnoj koncentraciji i u odgovarajućoj formi u uzorku kako bi bio kvantifikovan
određenim instrumentom. Zbog toga priprema uzorka predstavlja kritični korak u analizi, i
ima veliki uticaj na samo merenje, kao i na njegovu pouzdanost i tačnost.

Ekstrakcija na čvrstoj fazi (SPE) se najčešće koristi za prečišćavanje (uklanjanje

interferirajućih supstanci) ili koncentrovanje analita u uzorku. To je jednostavna metoda koja
ima brojne prednosti u odnosu na stariju tehniku - tečno/tečno ekstrakciju.
SPE se izvodi na plastičnim kertridžima, sličnim špricu, u kojima se nalazi odgovarajuća
čvrsta faza (adsorbens).

Osnovni koraci pri izvođenju SPE:

- Kondicioniranje čvrste faze
- Uzorak se nanosi na SPE medijum u rastvaraču slabe elucione moći, pri čemu se analit
vezuje za čvrstu fazu
- Ispiranje rastvaračima slabe elucione moći (koji neće eluirati analit sa čvrste faze) koji
će ukloniti onečišćenja
- Analit se eluira rastvaračem jake elucione moći

Kertridži su najčešće povezani sa određenim sistemom koji putem vakuuma omogućava

proticanje rastvarača željenom brzinom.

24
Tipovi adsorbenasa (čvrstih faza) koji se koriste kod SPE:
- Reverzna faza - lipofilni silika gel (oktil, oktadecil, fenil)
- Normalna faza - polarni modifikovani silika gel (aminopropil, diol, cijano)
- Polimeri (stiren-divinilbenzen, poliamidi)
- Anjonski i katjonski izmenjivači

25