1

Jonska hromatografija se zasniva na reakciji

jonske izmene tj. zamene jona komponente sa
jonom iz jonoizmenjivake kolone.
U zavisnosti od svog afiniteta prema izmeni
sa jonom iz kolone, razliiti joni iz smee koju
analiziramo putuju razliitim brzinama.
DAlelio 1942

- za razliku od veine ostalih hromatografskih

metoda (gasna hromatografija se moe
primenjivati i za analizu plemenitih gasova i
neorganskih gasova),
jonska hromatografija ima veliku
primenu u analizi neorganskih jona, ali i u
biohemiji, za razdvajanje aminokiselina
- jonska hromatografija razdvaja komponente
koje su u jonizovanom obliku
3

- stacionarna faza je jonoizmenjivaka smola:

sastoji se od inertne matrice na kojoj su
vezane funkcionalne grupe sposobne da otpuste
jedne i veu druge jone
- katjonski izmenjivai sadre kisele funkcionalne
grupe, izmenjuju katjone,
- anjonski izmenjivai sadre bazne funkcionalne
grupe i izmenjuju anjone,
- amfoterni izmenjivai sadre obe vrste
funkcionalnih grupa i mogu da izmenjuju
istovremeno i anjone i katjone ili anjone u
jednom, a katjone u drugom opsegu pH
vrednosti
5

na umreenu polistirensku matricu se

hemijskom sintezom ugrauju funkcionalne
grupe.
6

Funkcionalna grupa sadri:

- fiksirani jon koji je za matricu vezan
kovalentnom vezom i
- kontra jon koji je za fiksirani jon vezan
elektrostatikom silom (jonskom vezom).
Kontra jon uestvuje u jonskoj izmeni.
Vrednost konstante disocijacije funkcionalnih
grupa, koje sadri, je veliina koja
karakterie odreeni jonski izmenjiva.
8

Mobilna faza

Bira se na osnovu vrste stacionarne faze i

fiziko-hemijskih osobina supstanci koje se
razdvajaju.
ini je jedan rastvara ili smea dva ili vie
rastvaraa, koji na sobnoj temperaturi dobro
isparavaju i imaju malu toksinost.
U odnosu na supstancu koja se razdvaja mora
biti iste polarnosti ili polarnija.
Za razdvajanje nepolarnih aktivnih supstanci
primenjuje se hromatografija reversnih faza
(mobilna faza polarnija od adsorbensa), a za
polarne aktivne supstance, hromatografija
normalnih faza.
9

- Minimum adsorpcije protein pokazuje ukoliko je

pH veoma bliska ili jednaka njegovoj pI
- Vrednost pI definie i vrednost pH mobilne
faze u zavisnosti od primenjene stacionarne faze
(anjonit ili katjonit)

- kompeticija komponenti pufera se spreava

primenom pufera jako niske koncentracije
10-20 mmol/L
- najee se koriste fosfatni ili acetatni
10

gel, agarozna ili celulozna zrna na koja se veu naelektrisane grupe

obe faze se uspeno

primenjuju na pH 4-8
to je od velikog znaaja za
primenu na biomolekule

11

 nekada se moe, pored izokratskog eluiranja,

primeniti i gradijentna desorpcija vezanih
analita

to se najee postie kontinualnim

poveanjem jonske sile (npr.porast
koncentracije NaCl od 0-1 mol/L) ili laganom
promenom pH vrednosti mobilne faze

12

13

14

- kod katjonske izmene eluiranje se vri pomou

rastvora HCl
- eluiranje rastvorima razliite koncentracije HCl
(razliiti pH), efekat slian zagrevanju kod gasne ili
promeni sastava smee za eluiranje u podeonoj i
adsorpcionoj tenoj hromatografiji
- pri nioj pH eluirae se katjoni nieg afiniteta
(Li+, Na+), a pri veoj pH katjoni veeg afiniteta
(npr. Mg2+ i Ca2+)
15

- kod anjonske izmene eluiranje se vri

rastvorom KOH razliite koncentracije
(moe i rastvor Na2CO3)
- za jonsku hromatografiju najee se koristi
konduktometrijski detektor;
za naelektrisane organske molekule se moe
koristiti i UV detektor
- zato je konduktometrijski detektor pogodan?
16

 Jedna od najveih prednosti jonoizmenjivake

hromatografije
je
mogunost
merenja
provodljivosti,

to

je

pogodna

metoda

za

detekciju i odreivanje koncentracije eluiranih

sastojaka.

17

18

19

UV detektor sa fiksnom talasnom duinom

20

21

Ravnotea jonske izmene

Objanjava se zakonom o dejstvu mase.
npr. pri dodiru razblaenog rastvora Ca2+ jona
sa katjonitom uspostavlja se ravnotea:

Ca 2 (aq ) 2H (smola ) Ca 2 (smola ) 2H (aq )

Primenom zakona o dejstvu masa dobija se:

Ca
K
Ca

(aq ) H (smola )

(smola ) H (aq )

2
2

22

)
H (smola) i
Ca 2 (<<aq) H (aq,)
Uz uslov da je Ca 2 (smola<<
izraz za konstantu ravnotee se moe napisati nakon sreivanja:

Ca (smola)
Ca (aq)
2

H (smola)
H (aq)
odnos raspodele

i predstavlja afinitet
U ovoj jednaini K je
izmenjivaa za Ca2+ jon u odnosu na drugi jon (H+).
Koeficijenti raspodele izraavaju afinitet smole prema
pojedinim jonima i zahvaljujui razlikama u njihovoj veliini
mogue je razdvajanje.
Kada K za neki jon ima veliku vrednost, tada stacionarna faza
snano zadrava taj jon.
Izbor zajednikog referentnog jona, npr. H +, omoguava
upotrebu odnosa raspodele za razliite jone na odreenoj vrsti
izmenjivaa.
23

 Polivalentni joni se snanije veu za jonski izmenjiva

u poreenju sa jednovalentnim jonima.
Joni istog naelektrisanja mogu da imaju razliite
vrednosti K, to se povezuje sa veliinom hidratisanog
jona, kao i sa nekim drugim osobinama.
Uz katjonski izmenjiva sa sulfonskom kiselinom
vrednost K za jednovalentne jone se smanjuje
sledeim redosledom: Ag + > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ >
Na+ > H+ > Li+.
Za dvovalentne katjone niz je sledei: Ba 2+ > Pb2+ >
Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ >
UO22+.
24

25

26

 Pri jonoizmenjivakoj hromatografiji analit se

nanosi na poetak kolone koja je napunjena
pogodnim jonskim izmenjivaem.
Joni uzorka istiskuju jone eluenta sa mesta gde
se nalaze naelektrisani joni na adsorbensu.
npr. anjoni kao to su Cl-, CN-, SO42- i PO43- se
mogu odvojiti na anjonskom izmenjivau

xRN (CH 3 ) 3 OH A x RN (CH 3 ) 3 x A x xOH

Eluiranje se zatim nastavlja razblaenim
rastvorom baze, pri emu se otputaju anjoni.
Poto se odnosi raspodele razliitih anjona
meusobno razlikuju, tokom eluiranja e doi do
frakcionisanja.
27

Jonoizmenjivaka tankoslojna
hromatografija
Stacionarnu fazu ine katjonske ili anjonske
izmenjivake smole (stiren-divinilbenzen
kopolimeri), koje na svojoj povrini imaju
kvaternerne amonijum grupe ili sulfonil grupe,
sposobne za jonsku izmenu.
Kao mobilna faza koriste se jake baze ili jake
kiseline.
Koristi se retko, za razdvajanje supstanci
amfoternog karaktera velikih molekulskih masa.
28

Razdvajanje slabih kiselina i slabih baza

Za njihovo razdvajanje se koriste rastvarai sa

protogenim i protofilnim osobinama.
Prilikom hromatografskog razdvajanja dolazi do
stvaranja konjugovanih kiselina ili konjugovanih
baza.
Nagraene konjugovane baze i konjugovane
kiseline su pokretljivije na adsorbensu.

29

Jonoizmenjivaka hromatografija sa
priguenjem eluenta* (sa supresorom)
U toku odreivanja moe da se javi problem usled
vika jona eluenta:
prekrivaju jone koje odreujemo!
U tom sluaju se supresor postavlja izmeu
detektora i kolone - odvaja jone eluenta.

* Detekcija se vri na osnovu provodljivosti

30

31

Kolona za priguenje eluenta napunjena je jonskim

izmenjivaem koji se razlikuje od izmenjivaa
koji se koristi u analitikoj koloni.
Taj izmenjiva prevodi jone prisutne u eluentu,
koji izlaze iz kolone, u molekule sa ogranienom
jonizacijom koji ne utiu na pokretljivost jona
iz analiziranog uzorka.

32

 npr, pri odvajanju i odreivanju katjona gde je

HCl izabrani eluent, a u koloni za priguenje se
nalazi anjonski izmenjiva u hidroksidnom obliku
proizvod reakcije izmeu eluenta i priguivaa
je voda:

H (aq ) Cl (aq ) smola OH (s ) smola Cl (s ) H 2O

33

 Za anjonska odreivanja kolona se puni priguivaem

(supresorom) koji je kiseli oblik katjonskog izmenjivaa
uz natrijum-hidrogenkarbonat ili karbonat kao eluent.
Reakcija na priguivau je tada:

Na (Najveim
aq ) HCOdelom
(
aq
)

smola
H
(
s
)

smola
Na
(s ) ne
H 2utie
CO 3 (aq )
3
nedisosovana ugljena kiselina
na promenu pokretljivosti.
Ove kolone su nepogodne, jer je neophodna
regeneracija (svakih 8-10 sati) kako bi se vratile na
poetni kiseli ili bazni oblik.

34

 Pri odstranjivanju, npr., Na2CO3 ili NaHCO3,

eluent prelazi preko vrlo retkih membranskih
katjonskih izmenjivaa koji ih odvaja iz kiselog
rastvora za regeneraciju, koji neprekidno tee
u suprotnom smeru.
Natrijumovi joni iz eluenta zamenjuju se sa
vodonikovim
jonima
iz
reagensa
za
regeneraciju.
Vodonikovi joni iz rastvora za regeneraciju
kreu se u suprotnom smeru i time odravaju
elektrinu neutralnost.
35

36

- HP LC jonska hromatografija, jonoizmenjivaka

kolona i supresor (ostalo analogo obinoj HPLC)

37

- jonska hromatografija se pored HPLC

konfiguracije koristi i sa otvorenom kolonom
gde se mobilna faza za eluiranje kree pod
uticajem gravitacije
- jonska izmena se koristi za preiavanje
odvajanjem jona (npr. dejonizacija vode) ili
za razdvajanje i koncentrovanje analita
- u biohemiji, za razdvajanje aminokiselina
38

vano

Klasian model uspeno objanjava

interakcije kada su u pitanju mali,
neorganski joni, ali interakcije
biomakromolekula, kao to su proteini i
nukleinske kiseline, sa jonoizmenjivakom
kolonom, ne opisuju na adekvatan nain.
Kada su u pitanju polielektroliti
elektrostatike interakcije ne dozvoljavaju
primenu jednostavnih stehiometrijskih
zakonitosti.
Viestruke are nisu simultano dostupne tj
pristupane u reakciji jonske izmene.
39
Razvijen je model koji definie jonsku izmenu

Mehanizam jonsko izmenjivake

hromatografije aminokiselina

40

41

 Promena kiselosti vina

Uklanjanje zamuenja
Preiavanje vina pri odreivanju arsenika
Izdvajanje antibiotika (streptomicin,
vitamina B12 iz fermentacione tenosti

neomicin)

Odreivanje organskih kiselina u urinu

Odreivanje antibiotika u hrani
42

43