ANALITIKA HIRALNIH

JEDINJENJA

Doc. dr Biljana Stojanovi

1

Homohiralnost prirode
odgovarajue grupe jedinjenja
u ivom organizmu su u obliku
samo jednog enantiomera
ugljeni hidrati (D),
aminokiseline (L), proteini,
hormoni, enzimi, alkaloidi...

Bioloki organizam
(hiralna sredina)

Hiralni selektor

Lekovi na tritu 50 % racemati

Lekovi sa 50 % neistoa ???
2

Hiralne molekule

Podsetimo
se...

Hiralnost molekule se odnose kao predmet i lik u ogledalu.

Par hiralnih
molekula u
rukama

par enantiomera

Hiralne i nehiralne molekule

Hiralne molekule:

Nehiralne molekule:

Imaju jedan asimetrini centar

Nemaju asimetrini centar

atom povezan sa 4 razliita

Imaju ravan simetrije

supstituenta

Nisu optiki aktivni

Optiki aktivni

Osobine enantiomera

Iste fiziko-hemijske osobine

(MS spektar, NMR spektar,
IR spektar, hemijske
reakcije...)

Razlikuju se po ravni skretanja

polarizovane svetlosti:
-jedan skree u smeru kazaljke
na satu (+) - dekstrogiri
- jedan skree u smeru
suprotnom kazaljke na satu (-) levogiri,
-smea (+) i (-) oblika u odnosu
50:50 je racemat
-racemat ne obre ravan
polarizovane svetlosti

Bitne osobine hiralnih lekova

Farmakoloki aspekt
Toksikoloki aspekt
Farmakokinetiki aspekt
Aspekt analitike hiralnih
lekova
Komercijalni aspekt

Farmakoloki aspekt

Upotreba lekova racemata u klinikoj praksi:

1. jedan enantiomer aktivan (eutomer), a drugi inaktivan ili je
aktivnost smanjena (distomer) ili prouzrokuje toksinost ili
neki drugi eljeni ili neeljeni efekat
2. oba enantiomera imaju istu aktivnost
3. jedan ili oba enantiomera podleu hiralnoj inverziji

1. Enantiomeri sa razliitom aktivnou

O

N
H
H

N
H

O
H

OH

OH

S(-) - propranolol

R(+) - propranolol

100 x aktivniji kao -blokator

Terapija hipertireoidizma

HO

HO

H
N
HO

H
N
HO

HO

HO

R(-) - albuterol

S(+) - albuterol

aktivan, 5 x skuplji od racemata

inaktivan i neeljeni efekti

8

2. Oba enantiomera sa istom aktivnou

O

H
N

CH3

F3C

O
N
H

F3C

HN

CF3

R,S flekainid
(antiaritimik)

R,S fluoksetin
(antidepresiv)

3. Enantiomer(i) podleu hiralnoj inverziji

CH3

H
COOH

CH3

H3C

COOH

CH3

in vivo

CH3

H3C

R(-) - ibuprofen

S(+) - ibuprofen
100 x aktivniji

H
N

H
N

OH

OH

H
Cl

R(-) - oksazepam

in vitro

H
Cl

S(+) - oksazepam
100 x aktivniji

10

Toksikoloki aspekt
COOH

COOH

NH2

HO

NH2

HO
OH

OH

D - dopa

L - dopa
(antiparkinsonik)

(agranulocitoza)

H
CH3
O

HN

CH3
O

HN

OH

OH

R(+) - sekobarbital
(antikonvulziv)

S(-) - sekobarbital
(antikonvulziv)
potentniji i toksiniji anestetik
11

in vivo
N

NH
O

R(+) - talidomid

NH
O

S(-) - talidomid
sedativ, imunomodulator, teratogen??

12

Farmakokinetiki aspekt
1. Transformacija prohiralne supstance u hiralni metabolit
ketoni

redukcija

2 alkoholi

HN

HN

NH

NH
O

oksidacija

fenitoin

OH

(R,S)-4-hidroksifenitoin

2. Transformacija hiralne supstance u hiralni metabolit

OH

oksidacija

H
OH

OH

(S)-varfarin

(S)-7-hidroksivarfarin

13

3. Transformacija hiralne supstance u dijastereoizomerni metabolit

2 met.
OH

OGlu

(-)-mentol

(-)-mentol glukuronid

T1/2 = 2,4h

2 met.

OH

(+)-mentol

OGlu

(+)-mentol glukuronid

T1/2 = 4,0h

14

Da li je lako dobiti ist aktivan enantiomer?

Razvoj postupka za dobijanje iste hiralne aktivne farmaceutske supstance

zahteva:
Odreenu kontrolu procesa sinteze
Farmakoloku i toksikoloku procenu oba enantiomera
Odgovarajuu procenu metabolizma i distribucije
Odgovarajuu kliniku procenu lekova

Odgovor: Dobijanje istih enantiomera je sloen i

skup postupak!

15

Analitika enantiomera
Odreivanje enantiomerne istoe:
1. Polarimetrija
2. Gasna hromatografija
3. Tena hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC)
Veliki znaaj u:
1. Farmaceutskoj industriji
2. Analizi iz biolokog materijala

16

1. Polarimetrija

= dobijeni ugao rotacije

l = duina elije u dm
c = koncentracija u g/mL

Prednosti
Brza, jednostavna i jeftina metoda
Najee se upotrebljava za odreivanje optike aktivnosti
Nedostaci
Zahteva da uzorci budu homogeni
Ne sme doi do kristalizacije
Ugao rotacije istog enantiomera mora biti poznat
Ugao rotacije osetljiv na promene temperature i koncentracije rastvora
Kod koncentrovanih rastvora specifina optika rotacija i koncentracija
nisu u linearnoj zavisnosti

17

2. Gasna hromatografija
Hiralna stacionarna faza koja sadri hiralni agens visoke enantiomerne
istoe, adsorbovan na povrinu silike
Reverzibilne dijastereoizomerne interakcije razdvajanje enantiomera
Prednosti
Brza i jednostavna metoda
Neistoe u tragovima ne utiu na rezultate
Veoma osetljiva metoda
Na osnovu faktora selektivnosti, mogue je odrediti jainu interakcije izmeu
pojedinanih enantiomera i hiralne stacionarne faze
Mogue odreivanje apsolutne konfiguracije (uz standard)
Nedostaci
Skupa metoda
Analizirane supstance moraju biti isparljive i termostabilne
U Ph. Eur. za odreivanje hiralne istoe.

18

3. Tena hromatografija pod visokim pritiskom

Hiralno razdvajanje:
graenje dijastereoizomernih soli
enzimsko razlaganje enantiomera (mikroorganizmi)
klasina HPLC
hiralna HPLC
najkorisnija u analizi hiralnih lekova

19

Hiralna HPLC

Direktna

hiralna mobilna faza

hiralna stacionarna faza

Indirektna

Hiralni derivatizacioni agens

Mehanizam razdvajanja
Formiranje kompleksa izmeu enantiomera i stacionarne faze
razliite energije vezivanja razdvajanje

20

10

Za razdvajanje enantiomera HPLC metodom potrebno je

obezbediti hiralnu sredinu!
Naini postizanja hiralne sredine su:
Primenom hiralne mobilne faze i nehiralne
stacionarne faze
Primenom hiralne tene stacionarne faze i nehiralne
mobilne faze
Primenom hiralne vrste stacionarne faze i nehiralne
mobilne faze
21

Najznaajniji hromatografski parametar za razdvajanje

enanatiomera je faktor selektivnosti:

Pri emu je k2 > k1

Cilj: razdvajanje na baznoj liniji uz <3

22

11

Hiralne mobilne faze

Hiralni agens

+ enantiomeri

dijastereoizomeri

Razliita raspodela
izmeu stacionarne i
mobine faze
23

Princip: u mobilnu fazu doda hiralni agens koji gradi kompleks sa

parom enantiomera, nagrauju se dijastereoizomeri koji imaju
razliite distribucione koeficijente izmeu mobilne i stacionarne
faze.

PrImer hiralnog selektora:

hinin

24

12

Primer: razdvajanja enantiomera N-(1-feniletil)ftalamske kiseline uz

upotrebu hinina kao hiralnog agensa

Hromatografski uslovi: stacionarna faza, LiChrosorb SI 100, 5 m;

mobilna faza, dihlormetanbutan-1,2-diol (99:1 V/V) koja sadri 0,35 mM
hinina i siretne kiseline; UV detektor.

25

Prednosti primene hiralnog agensa:

postojanje velikog broja hiralnih agenasa
ekonomina (hiralni agensi se dodaju u malim koliinama)
nema ogranienja pri izboru mobilne faze
ne mora imati visok stepen optike istoe

Ogranienja primene hiralnog agensa:

nakon razdvajanja enantiomeri nalaze u obliku dijastereoizomernih
kompleksa, ija je disocijacija u nekim sluajevima onemoguena
26

13

Hiralne tene stacionarne faze

Ako se hiralnom tenom fazom obloi povrina stacionarne faze, pri emu
je mobilna faza zasiena stacionarnom fazom, dobija se teno teni
hromatografski sistem raspodele.

Primer: razdvajanja aminoalkohola norefedrina na (+)-dibutil tartarat

stacionarnoj fazi
Hromatografski uslovi: kolona, (+)dibutil tartarat Phenyl Hypersil 150 mm
4,6 mm, 5 m veliina estica; mobilna
faza, fosfatni pufer (pH 6,0) koji sadri
heksafluorofosfat, zasiena dibutil
tartaratom; UV detektor, 254 nm.

27

Hiralne vrste stacionarne faze

Da bi hiralna stacionarna faza mogla da interaguje sa svakim enantiomerom i
prevede ga u odgovarajui dijastereoizomerni kompleks potrebno je da se ostvare
najmanje 3 od sledeih interakcija:

1. vodonine veze

2. - interakcije

3. dipol interakcije

4. stvaranje inkluzionih kompleksa

5. sterno uslovljene interakcije

28

14

CSP

Biphenyl derivative

29

30

15

Na osnovu mehanizma razdvajanja hiralne stacionarne faze

dele se na:
1) Brush-type hiralne stacionarne faze - mali molekuli,
najee sa grupama koje sadre elektrone vezane za
povrinu silike
2) spiralni polimeri - uglavnom celuloza i njeni derivati
3) uplje faze - tipa ciklodekstrina, policiklinih etara i
makrociklinih glikopeptidnih antibiotika
4) proteinske faze
31

5) ligand izmenjivake faze

1. Brush-type hiralne stacionarne faze

Primer: prva sintetisana i najvie koriena je sa dinitrobenzoilfenilglicinom
Pirkle faza
Osnovne karakteristike:
dinitrobenzoil
grupa

Ima dve amidne grupe

Mogu da ostvare dipol-dipol

interakcije, vodonine veze

akceptor elektrona
Jedinjenje mora imati u
strukturi aromatian
prsten!!!

Stupa u interakciju sa donorima

32

elektrona

16

Primer: Primena DNBPG silike za razdvajanje (D, L)-propranolola

(u obliku oksazolidonskog derivata) iz krvi.

Hromatografski uslovi: uzorak, puna krv, 2,5 h nakon primenjene doze od 80 mg racemske smee
propranolola, koji je derivatizovan fozgenom do oksazolidonske strukture; kolona, 3,5-DNBfenilglicin silika, 25 cm 4,6 mm, 5 m veliina estica; mobilna faza, heksan izopropanol
acetonitril (97:2:1 V/V/V), protok, 2 ml min-1; fluorescentni detektor, 290 335 nm; IS, interni 33
standard (oksazolidonski derivat pronetalola).

Primeri brush type hiralnih stacionarnih faza

34

17

2. Spiralni polimeri
Vrste:
a) nederivatizovana mikrokristalna celuloza
b) derivatizovana mikrokristalna celuloza triacetil, tribenzoat,
trifenilkarbamat...
Nederivatizovana mikrokristalna celuloza

35

Derivatizovana mikrokristalna celuloza

(a) celuloza tris(3,5-dimetillfenilkarbamat) ; (b) amiloze tris(3,5-dimetilfenilkarbamat) i

(b)

celuloza tris(4-metilbenzoat)

36

18

Primeri spiralnih hiralnih stacionarnih faza

37

3. uplje faze
a) Ciklodekstrinske
Koriste se u :
- cikodekstrin sadri 6 jedinica glukoze

-hromatografiji reverznih faza

- cikodekstrin sadri 7 jedinica glukoze

-hromatografiji normalnih faza

- cikodekstrin sadri 8 jedinica glukoze

-hromatografiji sa veoma
polarnim mobilnim fazama

struktura zarubljene kupe

38

19

b) policiklini etri
-selektivno interaguju sa aminokiselinama i primarnim aminima

39

c) makrociklini antibiotici

aglikon

vankomicin

glikon

-voluminozni molekuli koji pored nekoliko benzenovih prstenova sadre i

nekoliko prstenova peptidnog tipa
40

20

Neke osobine stacionarnih faza sa makrolidnim antibioticima:

1. stabilne u veini rastvaraa

2. bilo koja promena u stacionarnoj fazi je reverzibilna
3. visoka selektivnost u svim tipovima hromatografije (moe se
koristiti i u hromatografiji normalnih i u hromatografiji reverznih
faza)
4. pogodne je za optimizaciju i razvoj metode

41

4. Proteinske faze
Princip: mnogi proteini, pogotovo enzimi, ali transportni proteini, poput
albumina, pokazuju visok stepen enantioselektivnosti u interakciji sa malim
hiralnim molekulima. Ovo je iskorieno u enantioseparaciji tako to je
vezivanjem proteina za povrinu silike dobijena nova klasa stacionarnih faza
namenjena za razdvajanje hiralnih lekova

42

21

Komercijalno dostupne proteinske stacionarne faze su: albumini, -kiseli

glikoprotein, ovomukoid, avidin, celobiohidrolaza I i pepsin.
Proteini se nalazi vezan za sferne estice veliine 5 m. Enantiomeri
preteno kiselih jedinjenja mogu se razvojiti direktno bez prethodne
derivatizacije.

Prednosti i ogranienja:
Proteinske faze su skupe, teke za rukovanje, a zapremine uzorka koje se
mogu analizirati na njima su male. Meutim u mnogim sluajevima njihova
izvanredna enantioselektivnost nadomeuje ove nedostatke.
43

5. Ligand izmenjivake faze

Princip: aminokiseline vezane za povrinu stacionarne faze u prisustvu
Cu2+ jona mogu stereoselektivno da interaguju sa aminokiselinama iz
vodenih rastvora.

Grafiki prikaz dijastereoizomernog kompleksa D- i L-fenilalanina na L44

prolin silika stacionarnim fazama u prisustvu jona bakra

22

Upotreba ligand izmenjivakih stacionarnih faza je odgovarajua za

razdvajanje aminokiselina, -aminoalkohola i slinih struktura jer sadre
dve polarne funkcionalne grupe na odgovarajuem rastojanju.
Interesovanje za ovakav pristup je ogranieno zbog niske efikasnosti
ovih kolona, problema prilikom detekcije nederivatizovanih uzoraka i
prisustva jona bakra u mobilnim fazama.

45

Primeri ligand-izmenjivakih hiralnih stacionarnih faza

Prolin-bakar kompleks

46

23

Indirektno razdvajanje enantiomera

Princip: ako se enantiomeri derivatizuju sa hiralnim, optiki istim reagensom,

dobija se par dijastereoizomera. Dijastereoizomeri su molekuli sa dva ili vie
hiralnih centara, koji imaju razliite fizike osobine.
Dijastereoizomeri mogu biti razdvojeni u nehiralnom hromatografskom sistemu,
ali derivatizacioni agens mora biti paljivo odabran.
Dervatizacioni agens mora biti visokog stepena istoe da ne bi dolo do
nastajanja dva para enantiomera
Pri procesu derivatzacije voditi rauna da ne doe do racemizacije
Derivatizacioni agens mora biti u viku
47
Funkcionalna grupa koja se derivatizuje treba da bude blizu hiralnog centra

Primer
Reakcija (R,S)-metoprolola sa (S)-tercbutil-3-(hloroformoksi)-butirat i
odreivanje odnosa enantiomera u
humanoj plazmi.
Hromatografski uslovi: stacionarna
faza, oktadecil silika; mobilna faza,
fosfatni pufer acetonitril (50:50 V/V);
fluorescentni detektor, 272/312 nm.

Pogodno za
analizu biolokih
uzoraka
48

24

Primeri ispitivanja enatiomerne istoe

1.

Levodopa

Ph. Eur za odreivanje enantiomerne istoe propisuje metodu tene

hromatografije.
Odreuje se D-dopa (neistoa D).
Hromatografski uslovi:
Kolona: C18 150 mm 4,6 mm, 10 nm veliina estica
Mobilna faza: rastvor bakar(II)-acetata i N, N-dimetil-L-fenilalanina u vodi sa
pH podeenim glacijalnom siretnom kiselinom na 4,0 i metanol.
Talasna duina: 280 nm.
Protok: 1 mL min-1
49

Limit za neistou D je 0,5 %.

2.
Metotreksat

Ph. Eur za odreivanje enantiomerne istoe propisuje metodu tene

hromatografije.
Odreuje se (R)-metotreksat (neistoa F).
Hromatografski uslovi:
Kolona: 150 mm 4,6 mm pakovana sa goveim albuminom vezanim za
silika gel za hromatografiju veliine estica 7 m sa porama veliine 30 nm
Mobilna faza: rastvor anhidrovanog dinatrijum-hidrogenfosfata i natrijumdihidrogenfosfata, pH podeen na 6,9 pomean sa propanolom.
Talasna duina: 302 nm.
Protok: 1,5 mL min-1

50

Limit za neistou F je 3,0 %.

25

3.
Naproksen

Ph. Eur za odreivanje enantiomerne istoe propisuje metodu tene

hromatografije.
Odreuje se (R)-naproksen (neistoa G).
Hromatografski uslovi:
Kolona: 250 mm 4,6 mm pakovana sa stacionarnom fazom tipa akceptor/-donor za hiralno razdvajanje, 5 m veliine estica
Mobilna faza: glacijalna siretna kiselina, acetonitril, 2-propanol i heksan.
Talasna duina: 263 nm.
Protok: 2,0 mL min-1
51

Limit za neistou G je 2,5 %.

Zakljuak
1. Razdvajanje enantiomera je od velikog znaaja u farmaceutskoj inustriji
2. Zbog malih razlika u osobinama izmeu enantiomera (samo u smeru
okretanja ravni linearno polarizovane svetlosti) mora se posvetiti posebna
panja razvoju metode
3. Najvei znaaj u analitici enantiomera ima hiralna hromatografija
4. Hiralna hromatografija je sloena i zahteva veliko iskustvo
ekpserimentatora

52

26