IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

IV GRUPA OTROVA – BILJNI I SINTETSKI

OTROVI

- OTROVI KOJI SE EKSTRAHUJU ORGANSKIM

RASTVARAČIMA -

67
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Dokazivanje biljnih i sintetskih otrova

Materijal za analizu: urin, želudačni sadržaj

Princip metode

Za sistematsko istraživanje otrova ove grupe primenjuje se Stas-ova metoda sa

izmenama i dopunama, na čijim principima se zasnivaju i metode za izolovanje ove grupe
otrova iz biološkog materijala u sudskoj i kliničkoj toksikologiji. Otrovi IV grupe, u
zavisnosti od svojih fizičko-hemijskih osobina dokazuju se u kiselom ili baznom ekstraktu
primenom bojenih reakcija i tehnikom tankoslojne hromatografije.

Postupak ekstrakcije

UZORAK (urin, želudačni sadržaj) preneti u levak za odvajanje

Zakiseliti uzorak 20% vinskom kiselinom
Ekstrahovati hloroformom

Vodena faza Kiseli hloroformski ekstrakt

 Zaalkalisati sa 10% NH4OH
 Ekstrahovati hloroformom
 Filtrirati preko anhidrovanog Na2SO4
 Identifikovati grupu jedinjenja
 Upariti do suva
 Ostatak rastvoriti u malo hloroforma i
kapilarom nanositi na TLC ploču

Vodena faza
odbaciti

Alkalni hloroformski ekstrakt

 Filtrirati preko anhidrovanog Na2SO4

 Identifikovati grupu jedinjenja
 Upariti do suva
68  Ostatak rastvoriti u malo hloroforma i kapilarom nanositi na TLC ploču
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Deo alkalnog i kiselog hlorofomskog ekstrakta upariti do suva i na sahatnim staklima,

karakterističnim bojenim i taložnim reakcijama, identifikovati grupu jedinjenja.

Iz baznog ekstrakta dokazuju se:

Benzodiazepini:
a) reakcijom diazotacije sa N--naftil-N,N–dietilpropilen diaminom dobija se
jedinjenje ružičaste do ljubičaste boje, nakon kisele hidrolize
b) sa Dragendorff-ovim reagensom dobija se narandžast talog, koji grade i alkaloidi
Alkaloidi:
sa opštim reagenasima za dokazivanje alkaloida (Dragendorff-ov, Mayer-ov, Bouchardat-
ov, Bertrand-ov, pikrinska kiselina i dr.) daju taložne reakcije
Fenotiazini:
sa FPN reagensom daju bojene reakcije. Ovom reakcijom se fenotiazini mogu dokazati
direktno u urinu.

Napomena: Taložne reakcije se izvode u rastvoru soli (rastvoriti suvi ostatak u

2 – 3 kapi 1:20 HCl).

Iz kiselog ekstrakta dokazuju se:

Barbiturati:
Parri-Griffon-Fabre reakcijom nastaje ljubičasta boja.
Organofosfati:
ako se u uzorku ne dokaže prisustvo drugih jedinjenja četvrte grupe, može se posumnjati
na prisustvo organofosfata.

69
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

TLC tehnikom, na osnovu Rf vrednosti standarda i analize, dokazati prisustvo određenih

jedinjenja.
Kiseli hloroformski ekstrakt

Barbiturati Organofosfati
1. barbiton (veronal) 1. forat
2. fenobarbiton (luminal) 2. malation
3. dimetoat

Mobilna faza Mobilna faza

hloroform : aceton (9 : 1) n-heksan : aceton (8 : 2)
Detekcija Detekcija
1% Hg2(NO3)2 1% PdCl2 ili dest. H2O

Alkalni hloroformski ekstrakt

Benzodiazepini Fenotiazini Alkaloidi

1. diazepam 1. hlorpromazin 1. atropin
(apaurin, bensedin) (largaktil) 1. strihnin
2. hlordiazepoksid 2. tioridazin 2. brucin
(librium) (meleril) 3. morfin
3. medazepam 3. levomepromazin
(nobrium) (nozinan)

Mobilna faza Mobilna faza Mobilna faza

Hloroform : aceton Hloroform : aceton Metanol : amonijak
(9:1) (9:1) (10 : 0,15)

Detekcija Detekcija Detekcija

Dragendorff-ov reagens H2SO4:H2O:C2H5OH Dragendorff-ov reagens
(2:2:1)

70
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Toksikološki izveštaj

U uzorku urina dokazano je prisustvo__________________.

71
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

BENZODIAZEPINI

Prema podacima centara za kontrolu trovanja, akutna trovanja su uz maligne

i kardiovaskularne bolesti najčešći uzročnici smrtnog ishoda. Od svih trovanja
lekovima najzastupljenija su benzodiazepinima, često i u kombinaciji sa drugim
lekovima i alkoholom.

Materijal za analizu: plazma, urin

HPLC analiza benzodiazepina u biološkom materijalu

Metoda HPLC uspešno se primenjuje za dokazivanje i određivanje

benzodiazepina i smatra se metodom izbora u dijagnostici trovanja
benzodiazepinima. Potvrda rezultata dobijenih HPLC metodom može se izvršiti
metodom GC/MS.

Napomena: Metoda je osetljiva i precizna, bez interferentnih pikova sa endogenim

jedinjenjima.

Uslovi hromatografiranja

Aparatura za tečnohromatografsku analizu HPLC LKB BROMMA

 pumpa 2150 HPLC LKB
 Diode array detektor, LKB
 injektor RHEODYNE 7161, petlja 20 L
 pisač CANON PJ-1080A
 pretkolona C18 GUARD-PAK
 kolona Bondapak C18,10/m, 3,9 mmx300 mm

Radni uslovi hromatografiranja

 protok 1,5 mL/min
 izokratski rad
 sobna temperatura

Mobilna faza
Metanol:voda:sirćetna kiselina (55:44:1), degazirana pre upotrebe.

72
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Priprema uzorka za hromatografsku analizu

U epruvetu sa šlifom od 10 mL odmerti 1 mL plazme (urina), dodati 1 mL boratnog

pufera pH 9 i 5 mL dietil-etra. Nakon mućkanja na mešalici (20 minuta) i centrifugiranja
na 3000 obrt/min (10 minuta), bistar supernatant (etarski ekstrakt) prebaciti u suvu
staklenu epruvetu i upariti do suva na temperaturi do 40 ºC. Suvi ostatak rekonstituisati u
100 L metanola. Po potrebi ovaj rastvor (ako nije bistar) se filtirira kroz mernbranski
filter i 20 L se injektuje u hromatograf.

Dokazivanje benzodiazepina

U hromatograf se inicira 20 L standardne smeše benzodiazepina (1mg/mL). Po

završenom hromatografiranju, inicira se 20 L pripremljenog uzorka. Poređenjem pikova
(retenciono vreme i UV spektar) hromatografa dokazuje se prisustvo benzdiazepina u
uzorku (slike 1 i 2).

Slika 1. HPLC hromatogtami smeše standarda: nitrazepama (Rt = 5,91), oksazepama (Rt = 7,68), N-
dezmetildiazepama (Rt = 10,02), diazepama (Rt = 12,79) i prazepama (Rt = 25,97). Mobilna faza:
metanol:voda:sirćetna kiselina (55:44:1). Protok 1mL/min.

73
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Slika 2. UV spektar diazepama

Toksikološki izveštaj

U uzorku plazme/urina dokazano je prisustvo__________________________________.

Određivanje diazepama

Izrada kalibracione krive i izračunavanje regresione jednačine

Priprema rastvora za izradu kalibracione krive

I– Osnovni (Stock) metanolni rastvor diazepama (1mg/mL)

II - Radni standardni rastvor (50 g/mL) – 50 L rastvora I i 950 L mobilne faze

III – Merni standardni rastvori:

0 mg/L 1 mL mobilne faze

2 mg/L 40 L rastvora II i 960 L mobilne faze
5 mg/L 100 L rastvora II i 900 L mobilne faze
10 mg/L 200 L rastvora II i 800 L mobilne faze
20 mg/L 400 L rastvora II i 600 L mobilne faze

74
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Inicirati po 20 L radnih mernih standardnih rastvora diazepama i izračunati regresionu

jednačinu.

X – osa (mg/L) Y – osa (apsorbancija na 230 nm)

Priprema uzorka za hromatografsku analizu

Priprema uzorka za određivanje diazepama je ista kao i za dokazivanje benzodiazepina.

Izračunavanje koncentracije diazepama u uzorku:

Nakon hromatografske analize 20 L pripremljenog uzorka, sadržaj diazepama izračunati

iz regresione jednačine i preračunati na litar uzorka.

Napomena: prinos date metode je 80-95%.

75
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Klinička interpretacija laboratorijskih rezultata

Tabela. Terarijske, toksične i letalne koncentracije benzodiazepina u krvi prema podacima iz literature
(Clark, 2008 )
Diazepini sa dugotrajnim delovanjem (t1/2 > 24h)
Koncentracije u plazmi [mg/L]
terapijske toksične letalne
Diazepam 2,5 5 5-19
Flurazepam 0,02 1 1-17
Hlorazepat 2 5
Hlordiaizepoksid 2 5 6,9
Klonazepam 0,05 1
Medazepam 2 10
N-dezmetildiazepam 2 5 13,4
Prazepam 2 5
Diazepini čije je t1/2 izmedju 5-25h
Alprazolam 0,02
Bromazepam 0,15
Lorazepam 0,2 2
Nirazepam 0,2 2 5-9
Oksazepam 1 5
Diazepini sa kratkim delovanjem (t1/2 manje od 5h)
Midazolam 0,4

Toksikološki izveštaj

Određena koncentracija diazepama u uzorku je _____________ mg/L.

Određena doza diazepama u uzorku je:
terapijska / toksična / letalna.
(zaokružiti tačan odgovor)

76
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Salicilati

Toksikološki značajni salicilati: salicilna kiselina, Na-salicilat, acetilsalicilna

kiselina. Uzročnici su akutnih trovanja (medicinska, samoubilačka, slučajna) i
izazivaju poremećaj acido-bazne ravnoteže (respiratorna alkaloza, metabolička
acidoza).

Materijal: urin

Određivanje salicilata u urinu

Princip metode

Fenolska grupa salicilata sa feri jonom daje jedinjenje ljubičaste boje. Ova reakcija
se može izvoditi direktno iz urina, bez prethodne ekstrakcije, te je svrstana u prethodne
probe.

Analiza uzorka

U epruvetu sipati 1 mL urina i dodati 5 mL reagensa za slicilate (rastvor

ferinitrata), pri čemu se razvija ljubičasta boja ferisalicilata. Intenzitet boje se meri na
kolorimetru uz zeleni filter.
Paralelno sa analizom se radi slepa proba sa 1 mL destilovane vode. Iz razlike apsorbancija
određuje se sadržaj salicilata u urinu.
Ovom metodom moguće je odrediti do 2,90 mmol/L salicilata. Ukoliko je sadržaj salicilata
u uzorku veći od ove vrednosti, neophodno je ponoviti postupak sa 1 mL razblaženog
uzorka (razblaženje uzeti u obzir pri izračunavanju). U analizu i slepu probu dodati po 0,1
mL sirupaste fosforne kiseline, kako bi se izbegla interferencija drugih supstancija koje
reaguju sa feri jonom i izmeriti apsorbancija ovih rastvora.
Koncentracija salicilata u urinu se izračunava iz jednačine prave iz razlike apsorbancija bez
i sa sirupastom fosfornom kiselinom.

77
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Izračunavanje sadržaja salicilata u urinu

Koristeći kalibracionu krivu preračunati sadržaj salicilata na litar uzorka.

Toksikološki izveštaj

Urin – salicilati, koncentracija materije_________mmol/L.

78
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Bojni otrovi

Bojni otrovi su sve hemijske supstance koje se na osnovu fizičko-hemijskih i

toksikoloških osobina mogu koristiti direktno ili indirektno za masovno
onesposobljavanje ili uništenje žive sile neprijatelja.
Ženevskim Protokolom iz 1925. godine zabranjena je primena bojnih otrova.
Najnovija Konvencija o hemijskom oružju doneta je 1994. godine, kojoj je SR
Jugoslavija pristupila 2000. godine.

Dokazivanje bojnih otrova u vodi

Analiza uzorka

1. Prethodne probe

a) Određivanje pH vode

Indikator papirom odrediti pH ispitivanog uzorka vode.

Ukoliko je pH < 6 ili pH > 8,5 voda se ne sme upotrebljavati.
b) Orijentaciono određivanje utroška oksidacionog sredstva

Postupak sa KMnO4: U 100 mL ispitivane vode dodati nekoliko kapi HCl do kisele
sredine i 1 mL KMnO4 i promešati. Gubitak ljubičaste boje ukazuje na prisustvo organskih
materija i/ili drugih redukujućih jedinjenja.

2. Dokazivanje cijanovodonične kiseline, cijanida, halogen-cijanida, tabuna

U epruvetu sipati 2 – 3 mL ispitivane vode, dodati na vrh kašičice reagensa CN-1

(hloramin-T), dobro promućkati i posle jednog minuta dodati na vrh kašičice reagensa CN-2
(nikotin-amid: Na2CO3; 1:9).
Pojava žute boje označava pozitivnu reakciju.

3. Dokazivanje alkaloida

U dve epruvete sipati po 2 – 3 mL ispitivane vode. U svaku epruvetu dodati po

jednu kašičicu kiselog praška (KHSO4) i promućkati. Zatim u jednu epruvetu dodati 5 kapi
Bouchardat-ovog reagensa, a u drugu Bertrand-ovog reagensa.

79
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Pojava zamućenja ili taloga u jednoj od epruveta označava pozitivnu reakciju.

Napomena: Pozitivne reakcije daje i iperit.

4. Dokazivanje soli teških metala

U epruvetu sipati 2 – 3 mL ispitivane vode, dodati na vrh kašičice kiselog praška

(KHSO4) i dobro promućkati. Zatim dodati na vrh kašičice reagens za TM (Na 2S) i
promućkati. Uporedo uraditi i slepu probu sa česmenskom vodom.
Pojava mrkog, crnog ili žutog taloga označava pozitivnu reakciju.

5. Dokazivanje arsenovih jedinjenja

Vrši se pomoću pribora za dokazivanje arsena (bočica i cev). U donji suženi deo
cevi pribora, pomoću pincete staviti komadić vate natopljen Pb(CH3COO)2, a u gornji deo
na unutrašnju užu cev staviti kružić reagens hartije natopljen sublimatom (HgCl 2). Reagens
hartiju pričvrstiti probušenim čepom od plute.
U bočicu sipati oko 10 mL ispitivane vode, dodati nekoliko mg KHSO 4 (ili H2SO4 –
1:5) i promućkati dok se kiseli prašak ne rastvori. Zatim u bočicu dodati granulu Zn i
odmah je zatvoriti prethodno pripremljenom cevi. Ostaviti da stoji na tamnom mestu oko
20 min. Pojava bledo žute do tamno-mrke boje na reagens hartiji označava pozitivnu
reakciju.

AsH3 + HgCl2 AsH2(HgCl) + HCl

AsH2(HgCl) + HgCl2 AsH(HgCl)2 + HCl
AsH(HgCl)2 + HgCl2 As(HgCl)3 + HCl
As(HgCl)3 + AsH3 As2Hg3 + 3HCl

Toksikološki izveštaj

U ispitivanom uzorku vode dokazano je prisustvo ____________________________.

Voda se MOŽE / NE MOŽE koristiti za piće.
(zaokružiti tačan odgovor)

80
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Osnovni principi procene rizika po zdravlje ljudi

Procena rizika po zdravlje ljudi (Human Health Risk Assessment) izloženih

štetnim agensima predstavlja složen višefazni proces predviđanja stepena opasnosti
putem modelovanja. Procena rizika je naučno zasnovana, kvantitativna procena
potencijalnih efekata pri datom nivou ekspozicije (SZO 1999, EHC 210). Proces
procene rizika se sastoji od četiri faze: 1) identifikacija hazarda, 2) procena odnosa
doza-odgovor, 3) procena ekspozicije i 4) karakterizacija rizika. Hazard je sposobnost
supstance da prouzrokuje štetni efekat pod određenim uslovima ekspozicije. Rizik je
verovatnoća pojave štetnog efekta pod određenim uslovima ekspozicije.

Procena rizika fenola u vodi za piće

Formulisanje problema prisustva fenola u vodi za piće:

Zvanični podaci Ministarstva zaštite životne sredine za:

Prisustvo fenola u rečnoj vodi Ibra i pijaćoj vodi Kraljeva
Istorijat problema:
Novembar 1983. godine – veliko zagađenje vodovoda Kruševac i Kraljevo; enormno
zagađenje reke Sitnice, Ibra i Zapadne Morave 3000 - 5000 µg/L.
Talasi zagađenja su ponavljani tokom cele zime i proleća 1983 – 1984. godine.
Ustanovljeno je stalno povećanje fenola u Sitnici kod Nedakovca i Ibru kod Leposavića,
Raške i Kraljeva. U međuvremenu su pogoni gasifikacije uglja i pogoni proizvodnje fenola
pri termoelektrani »Obilić« prestali sa radom, ali opasnost zagađenja fenolima nije
otklonjena. 30000 m3 zagađenih voda su trajno smeštene u neodgovarajućе rezervoare.
14.1.2003. - povećane su koncentracije fenola na profilima Kraljevo i Raška – 7,0 µg/L i
7, 2 µg/L
14.1.2003. - vanredna ispitivanja pojave fenolnih zagađenja: Raška 2,2 – 14 µg/L , a kod
Kraljeva manje, ali još uvek iznad MDK za vode II klase
14-17.1.2003. - vanredni monitoring: tendencija opadanja sadržaja fenola
18.1.2003. - Raška: 12h – 60 µg/L; 17h – 54,8 µg/L; 20h – 18,7 µg/L; 22h – 5,9 µg/L
19.1.2003. - Raška: 5,9 µg/L

81
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

do 20.2. 2003. - nastavljen vanredni monitoring i u vodi za piće sadržaj ukupnih fenola se
kretao od 1 – 10 μg/L.

Šema procene rizika

1. Formulacija problema

2. Analiza

3. Karakterizacija rizika

1. FORMULACIJA PROBLEMA

Skrining toksičnih
supstanci Skrining receptora Skrining ekspozicije

Konceptualni model

Analiza

82
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

2. ANALIZA

Formulacija problema

Karakterizacija Karakterizacija Klasifikacija Baza podataka

toksičnih receptora toksičnog o toksičnosti
supstanci agensa

Analiza Doza-odgovor
izloženosti analiza

Karakterizacija rizika

3. KARAKTERIZACIJA RIZIKA

Analiza

Procena rizika
· Integracija procene
toksičnosti i ekspozicije
· Analiza nesigurnosti

Opis rizika
· Sumiranje rizika
· Interpretacija značaja

83
IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Unos
HQ (Količnik hazarda) =
Referentna vrednost

Napomena: Ako je vrednost količnika hazarda ≤ 1 rizik se smatra prihvatljivim.

Unos predstavlja ukupnu količinu supstance unete u organizam.
Referentna vrednost (RfD, ADI, TDI) podrazumeva dozu pri kojoj se ne ostvaruje štetni
efekat.

CC x CR x EFD
Unos =
BW x AT

CC sadržaj supstance u sredini (medijumu) (mg/L, mg/kg)

CR dnevni unos medijuma (L/dan, kg/dan)
EFD učestalost/dužina ekspozicije medijumom (dani/godina)
BW telesna masa čoveka
AT vremenski period u toku koga je praćena ekspozicija (dana, godina)

Primer za izračunavanje doze i količnika hazarda:

CC 10 μg/L fenola u pijaćoj vodi

CR 2 L/danu
EF 15 – 365 dana (subhroničan efekat)
BW 70 kg
AT 15 – 365 dana
ADI* 4 μg fenola/kg/danu (15 – 365 dana)

*ADI (prihvatljiv dnevni unos): 3-4 μg fenola/kg/danu je doza koja oralnim putem, pri
subhroničnoj ekspoziciji (od 15 – 365 dana) ne daje štetne efekte kod ljudi.

20 μg fenola/danu
Doza = = 0,286 μg fenola/kg/danu
70 kg

0,286 μg fenola/kg/danu
Količnik hazarda = = 0,0714
4 μg fenola/kg/danu

84
 IV Grupa otrova – Biljni i sintetski otrovi

Tumačenje dobijenog rezultata

Količnik hazarda je 0,0714; značajno manji od 1; rizik je prihvatljiv.

85