Univerzitet u Beogradu

Hemijski fakultet

HROMATOGRAFSKO PREČIŠĆAVANJE REKOMBINANTNIH

NETAGOVANIH PROTEINA NA VELIKOJ SKALI

Damjan Ružić

Đorđe Popović
 U svetu postoji sve veća potreba za proizvodnjom proteina u industriji za različite
namene. One uključuju pronalaženje lekova, proizvodnju biofarmaceutika i sl. Oko 200
biofarmaceutika zasnovanih na rekombinantnim proteinima su dobili dozvole za terapiju i
dijagnostiku ljudskih bolesti, a preko 350 je u poslednjoj fazi kliničkih ispitivanja. Takođe,
različita strukturna proučavanja genoma zahtevaju miligramske količine proteina za 3D
prezentovanje. Dok trenutno korišćene strategije za preparativno dobijanje proteina daju i
koncentracije do nekoliko desetina grama po litru, postoji posledično i potreba da se dobiju
visoko prečišćeni proteini. Tako je prečišćavanje proteina na velikoj skali postao ključni izazov i
zadatak koji predstavlja uglavnom od 45 do 92% ukupne cene pravljenja rekombinantnog
proteina.

Afinitetna hromatografija

Afinitetna hromatografija je često metoda izbora u prečišćavanju proteina jer je

jednostavna, brza i dovoljno selektivna. Zbog svoje selektivnosti, prečišćavanje afinitetnom
hromatografijom je uveliko uvedeno kao rani korak u prečišćavanju. Time se ukupan broj
postupaka može smanjiti.

Sistem koji se najviše primenjuje za prečišćavanje antitela (posebno IgG) je afinitetna

hromatografija sa proteinom A. Afinitet proteina A ka imunoglobulinu G je jedna od prvih
izučavanih nativnih interakcija u cilju prečišćavanja proteina. Još jedan afinitetni ligand koji se
takođe koristi za prečišćavanje IgG a poreklom je iz bakterije je SPG (Staphylococcal Protein A).
Uprkos velikoj primeni proteina A i G u prečišćavanju antitela, stabilnost liganda je faktor koji
ograničava njihovu upotrebljivost. Zbog veće stabilnosti proteina A, primena proteina G u
industrijskim prečišćavanjima je vrlo ograničena. Ipak, prečišćavanje pomoću proteina G je
metoda izbora u radu sa humanim IgG potklase III.

Takođe se razvijaju i alternative proteinskim ligandima, pre svih ligandi na bazi triazina
za prečišćavanje antitela.

Protein A (eng. Streptococcal Protein A, SPA) je protein asosovan sa ćelijskim zidom i

pronađen je kod bakterije Staphylococcus aureus. SPA ima visok afinitet za IgG čoveka i zeca, a
nešto manji za IgG govečeta i miša. Sastoji se iz tri regiona: S – signalne sekvence koja se
obrađuje tokom sekrecije; pet homologih IgG vezujućih domena (E, D, A, B i C); i regiona koji se
usidrava u ćelijski zid – XM region (slika 1).
Slika 1 – Protein A iz Streptoccus aureus

Svaki od pet vezujućih domena je sposoban da se nezavisno vezuje za Fc deo IgG1, IgG2 i
IgG4 sa procenjenom konstantom afiniteta od 108 M-1. Takođe svaki domen poseduje visok
afinitet za vezivanje Fab delova nekih antitela.

Kako je ranije navedeno, proteinski ligandi koji postoje u prirodi uglavnom pokazuju
visoku specifičnost, ali stabilnost na visokim pH je manje od željene u radu na velikoj skali.
Procedura za CIP se mora postaviti pojedinačno za svaki postupak, a protokol treba da bude
dizajniran s obzirom na kontaminante prisutne u smeši koja se prečišćava. Natrijum-hidroksid u
koncentracijama od 0,1 do 1 M se najčešće koristi kao agens za čišćenje opreme i matriksa. Zato
je važno imati sistem koji je otporan na visoko pH. Različite strategije se koriste za stabilizovanje
i optimizovanje IgG vezujućih domena proteina A i G, a često uključuju modifikovanje
aminokiselinske sekvence (npr. zamena asparagina treoninom).

Prečišćavanje proteina je uglavnom najskuplji deo pri dobijanju proteina pa je izolovanje

u jednom koraku pomoću liganda sa visokom selektivnošću i stabilnošću idealna strategija.
Afinitetna hromatografija se koristi za prečišćavanje proteina godinama a najnoviji rezultati u
kombinovanom i de novo dizajniranju liganda deluju obećavajuće. Sam dizajn liganda koji se
koristi za prečišćavanje ciljnog proteina može se izvoditi na različite načine od kojih su
dominantni dizajn na osnovu strukture ili funkcije ciljanog proteina. Dizajn liganda na osnovu
strukture ciljanog proteina koristi poznatu 3D strukturu proteina od interesa i omogućuje
ligandu da se usidri u protein. Uslovi vezivanja, afinitet i molekulski parametri se mogu odrediti
softverski. Postoje radovi gde se dobijaju ligandi za prečišćavanje proteina, a primer je dizajn
boje biomimetika kao liganda za laktat dehidrogenazu i njeno prečišćavanje iz srca govečeta ili
jetre kokošaka. Dizajn na osnovu funkcije se primenjuje kad nam je struktura ciljanog proteina
nepoznata. Primer je boja Cibracon blue 3GA, koja se vezuje za strukture slične nukleotidima i
može da se iskoristi za izolovanje nukleotid-vezujućih proteina [1].

IMAC (eng. Immobilized metal ion affinity chromatography) se može koristiti i za

prečišćavanje netagovanih proteina. Primer je rekombinantna karboanhidraza II iz govečeta (r-
BCA; Mr 30 000), protein koji prirodno sadrži izložene histidinske ostatke. Rađeno je na HiTrap
IMAC HP koloni (IMAC Sepharose High Performance). Najbolje rezultate je dao jon Zn2+ zbog
visokog prinosa i male toksičnosti [2].

Mešovita hromatografija

Mešovita hromatografija (zhao) (eng. Mixed-Mode Chromatography, MMC) se naglo

razvija u širokom opsegu procesa prečišćavanja. Predstavlja hromatografsku metodu koja
primenjuje više od jednog tipa interakcija između stacionarne i mobilne faze. U poređenju sa
drugim tipovima hromatografija, mešovita hromatografija ima prednosti u adsorpciji nezavisnoj
od koncentracije soli, lakoj eluciji koja se zasniva na odbijanju istoimenih naelektrisanja i
jedinstvenoj selektivnosti. Tako je već postala korisna za razdvajanje proteina, ali i u drugim
oblastima.

Primer ovakve hromatografije je hromatografija na MEP HyperCel smoli, koja je

napravljena kao mimetik proteina A. Ova smola vezuje proteine na neutralnom pH vodoničnim i
hidrofobnim interakcijama. Ima nulto neto naelektrisanje na neutralnom pH, ali zakišeljavanjem
postaje pozitivno naelektrisana zbog titracije piridina (pKa oko 4,8), što rezultuje odbijanjem
pozitivnog naelektrisanja histidina na Fc delu antitela. Ova kolona je time omogućila eluiranje
antitela na višoj pH vrednosti nego što je potrebna za protein A kolone. Dodatak arginina
poboljšava performanse kolonskih hromatografija smanjivanjem nespecifične adsorpcije
proteina i protein-protein interakcija. Dodatak vodenog rastvora arginina omogućio je eluiranje
vezanih antitela čak na pH 7,0 [3].

Hromatografija na hidroksiapatitu (Ca5(PO4)3OH)2, HA) je tradicionalan primer mešovite

hromatografije. Sintetički hidroksiapatit kao medijum za hromatografiju je predstavio Tiselius
1956. i otad se primenjuje za prečišćavanje IgG. Adsorptivna površinska jedinica HA ispoljava
dve primarne osobine koje su distribuirane u ponavljajućim heksagonalnim šablonima: C- i P-
mesta. Svako C- mesto sastoji se od dva pozitivno naelektrisana ostatka kalcijuma. Dominantne
interakcije su heliranje kalcijuma proteinskim karboksilnim klasterima kao i koordinativno
kovalentne interakcije kalcijuma i fosfatnih grupa na DNA ili drugim fosforilovanim vrstama. C-
mesta takođe se mogu ponašati kao anjonski jonoizmenjivači prema negativno naelektrisanim
ostacima u rastvoru. Helirajuće i koordinativno kovalentne veze se mogu eluirati fosfatima, koji
imaju visok afinitet ka kalcijumu iz HA, ali su ove veze jače od elektrostatičkih i uglavnom
preživljavaju izlaganje 4M NaCl u odsustvu fosfata.

Većina IgG monoklonskih antitela ispoljavaju relativno slabe interakcije sa kalcijumom iz

HA. Slika 2 ilustruje dinamički kapacitet za mišje monoklonsko antitelo IgG u opsegu od 0-16
mM Na3PO4. Kapacitet opada za oko 75% od 0 do 8 mM fosfata, a dalje se vrlo malo menja. Ovo
ukazuje na to da je vezivanje kalcijuma za antitelo uveliko eliminisano, a da su koncentracije do
16 mM nedovoljne da značajnije umanje jonsku izmenu. Kiseli proteini, kao što je BSA,
zahtevaju do 60 mM fosfate za eluiranje, čak i u prisustvu NaCl. Činjenica da na zadržavanje BSA
vrlo malo utiče prisustvo ili odsustvo 1 M NaCl ukazuje na to da jonska izmena ima vrlo malu
ulogu u vezivanju. Svako P- mesto sastoji se iz tri fosfatne grupe. Fosfati se ponašaju kao
katjonski jonoizmenjivači i vezuju se za proteinske amino grupe pod određenim uslovima. Mali,
vrlo bazni proteini kao što je lizozim se vezuju gotovo isključivo kao izmenjen katjon. Mogu se
eluirati bilo kojom solju, čak i u odsustvu fosfata. Slika 3 prikazuje krivu dinamičkog kapaciteta
antitela sa slike 2, ali kao funkciju koncentracije NaCl. Svojstvo natrijum-hlorida da smanji
kapacitet za oko 90% od 0 do 500 mM ukazuje na to da je katjonska izmena primarni
mehanizam zadržavanja antitela, ali činjenica da HA ipak vezuje antitelo pri 500 mM soli (pH
6,5) govori da postoji i mehanizam nezavisan od koncentracije NaCl – heliranje kalcijuma.
 Hromatografija na HA je takođe vrlo korisna i kod uklanjanja proteinskih agregata koji
mogu biti prisutni zajedno sa ciljnim proteinom u smeši. Prisustvo polietilenglikola u puferu
pospešuje zadržavanje proteina na koloni.

Osim pomenutih matriksa koriste se i drugi, a najvažniji su navedeni u tabeli 1 [4].

Tabela 1 – Medijumi u MMC

Medijum Proizvođač Tip Ligand pH stabilnost

CHT keramički Bio-Rad Jonska izmena, Ca5[PO4]3OH]2 Radno pH 5,5-14
hidroksiapatit laboratories heliranje metala Može se čistiti 1-2M
NaOH
CHT Fluorapatit Bio-Rad Jonska izmena, [Ca10[PO4]6F]2 Radno pH 5-14
laboratories heliranje metala Čišćenje 1-2 M NaOH
MEP Pall Life Hidrofobne interakcije 4-merkaptoetilpiridin Radno pH 2-12
Sciences na neutralnom pH pri čišćenju 2-14
pH;eluiranje
snižavanjem pH
HEA Pall Life Hidrofobne interakcije Heksilamin Radno pH 2-12
Sciences na neutralnom pH pri čišćenju 2-14
pH;eluiranje
snižavanjem pH
PPA Pall Life Hidrofobne interakcije Fenilpropilamin Radno pH 2-12
Sciences na neutralnom pH pri čišćenju 2-14
pH;eluiranje
snižavanjem pH
MBI Pall Life Hidrofobne interakcije 2-merkapto-5- -
Sciences na neutralnom benzimidazolsulfonska
pH;eluiranje kiselina
snižavanjem pH
Capto MMC GE Healthcare Katjonska izmena 2-benzamido-4- Radno pH 2-12
merkaptobutanska
kiselina
Capto adhere GE Healthcare Jaka anjonska izmena N-benzil-N- Radno pH 2-12
metiletanolamin

Kontinualna hromatografija

U klasičnoj kolonskoj hromatografiji, npr. protein A hromatografiji, na kolonu se nanosi

90% od 1% proboja kolone što dovodi do nedovoljnog iskorišćenja kapaciteta kolone. Takođe,
dok dno kolone ostaje nezasićeno, ulaz u kolonu se zasićuje, a to uslovljava upotrebu više
pufera za ispiranje i eluiranje. Ovi faktori mogu biti problem u radu na preparativnoj skali. Neki
od ovih problema se mogu prevazići tako što se uzorak kontinualno uvodi i izvodi iz sistema.
Postoji mnogo tipova kontinualne hromatografije. Na primer, višekolonsko protivstrujno
prečišćavanje (eng. multicolumn countercurrent solvent gradient purification, MCSGP). Ovaj
sistem se sastoji iz nekoliko (najmanje dve a najviše šest) hromatografskih kolona. Većina
kolona je opremljena gradijentnom pumpom kako bi se regulisao dotok uzorka. Kod bač
hromatografije, frakcije nečistoća (R1 i R2 sa slike), moraju se udaljiti kako bi se postigao
određen stepen čistoće proteina od interesa. Sa MCSGP, frakcije koje sadrže nečistoće se
automatski recikliraju, čime se prinos povećava. Ovo umnogome doprinosi većoj ekonomičnosti
procesa [5]. (chomachron.ch)

Slika 2 – Prednost MCSGP u odnosu na bač hromatografiju

Gel filtracija

Gel filtracija razdvaja molekule na osnovu njihove hidrodinamičke zapremine.

Retenciono vreme je za veće molekule manje nego za manje molekule i tako se omogućuje
efikasno razdvajanje. Isti princip može se iskoristiti i pri rasoljavanju ili izmeni pufera u kom je
protein. Rezolucija među molekulima različite veličine je u funkciji veličine pora matriksa, visine
kolone, protoka, sastava mobilne faze i veličine uzorka. Proteini mogu interagovati sa
matriksom elektrostatičkim ili hidrofobnim interakcijama što produžava njihova retenciona
vremena, smanjuje rezoluciju ili povećava veličinu pika što može biti nepoželjno. Pad pH
mobilne faze smanjuje jonizaciju kiselih proteina. Dalje, jonizacija smanjuje interakcije protein-
stacionarna faza kod kiselih proteina. pH mobilne faze se može odabrati uzimajući u obzir
prirodu ciljnog proteina i kontaminanata, tako da se poveća retenciono vreme kontaminanata,
a smanji za ciljni protein ili obratno. Još jedan faktor koji određuje retenciono vreme je jonska
sila. Visoka koncentracija fosfata i umerena koncentracija NaCl sprečava interakcije proteina sa
stacionarnom fazom. Međutim, visoke koncentracije npr. amonijum-sulfata mogu stimulisati
adsorpciju proteina za matriks hidrofobnim interakcijama. Upotreba organskog rastvarača (npr.
acetonitrila) može sprečiti ove interakcije ali i denaturisati protein od interesa. Upotreba 0,2 M
arginina pokazala je da sprečava interakcije protein-stacionarna faza [6].

Hidrofobna hromatografija

Hidrofobne interakcije su važne sa aspekta preparativnog prečišćavanja proteina. Ova

metoda koristi hidrofobnu prirodu rastvorka. U HH slab hidrofobni ligand kao što su alkil- ili aril-
funkcionalne grupe se zakače na relativno hidrofilnu stacionarnu fazu. Tesna veza je primećena
između Hofmajsterove serije i sposobnosti pojedinih jona da produže ili skrate zadržavanje u
HH. Kosmotropi (liotropne soli) produžavaju retenciono vreme, a haotropi (MgCl2, NaSCN, KI) ga
skraćuju. Neki organskih rastvarača (metanol, etanol, 2-propanol) se koriste u manjim
koncentracijama za smanjivanje afiniteta proteina ka stacionarnoj fazi. Detergenti se takođe
koriste kao hidrofobni kompetitori na HH matriksima. U radu sa rekombinantnim proteinima na
velikoj skali, postoje podaci gde je kombinovanje različitih aditiva omogućilo selektivnost pri
ispiranju sa kolone [7].

Preparativna HIC može se koristiti za prečišćavanje rekombinantnog proteina

nukleokapsida Nipah virusa (iz roda Henipavirus) iz homogenata bistrog homogenata E. coli.
Proveravane su osobine različitih matriksa za rad sa ovim proteinom: SepharoseTM 6 FF low sub,
high sub, butyl i octyl. Korišten je soj E. coli BL21 za ekspresiju proteina nukleokapsida (N
protein). Bakterijske ćelije su gajene na LB podlozi sa ampicilinom u mućkalici. Ekspresija ciljnog
proteina je indukovana kad je kultura dostigla OD600 oko 0,6, dodatkom IPTG. Ćelije su potom
centrifugirane, a talog je resuspendovan u 5 tipova pufera, koji su pripremani dodatkom AS do
zasićenja od 5%, 10%, 15%, 20% i 30% u Na-fosfatni pufer pH 7,5. Nakon toga je suspenzija
promešana sa lizozimom i 4 mM MgCl2∙6H2O. Onda je sledio tretman ultrazvukom,
centrifugiranje i prikupljanje bistrog homogenata. Amonijum-sulfat je dodavan u homogenat do
10% zasićenja, pa je centrifugirano, pa do 20% i 30% uz centrifugiranje. Tri taloga su
resuspendovana i dijalizovana prema Tris-NaCl puferu, nakon čega je kvantifikovan N protein.
Dalje se pristupilo traženju liganda sa najboljim performansama: kolone (po 1 mL) su
ekvilibrisane 20 mM Na-fosfatnim puferom pH 7,5 sa AS 15% zasićenja (pufer A). Kolone je
isprana istim puferom, a proteini su eluirani linearnim opadajućim gradijentom soli (mešanjem
pufera A i pufera B). Utvrđeno je da je SepharoseTM 6 FF low sub najbolji matriks i sa njim se
radilo na većoj skali, tj. na koloni prečnika 0,77 cm i 10 cm dužine. Kolona je instalirana na Äkta
FPLC. Uzorak je nanesen na kolonu koja je ekvilibrisana puferom A, uz protok od 300 cm/h.
Kolona je potom isprana puferom A, adsorbovani proteini su eluirani linearnim gradijentom
pufera A od 15% do 0% zasićenja. Potom je kolona regenerisana, a proteini u eluatu su
analizirani i kvantifikovani. N protein je uspešno prečišćen, uz prinos od 81% i stepen
prečišćenja 9,3. Rezultati su ilustrovani na elektroforegramu na slici.
 Slika 4 – SDS PAGE frakcija prikupljenih nakon eluiranja. bunar MM – markeri; bunar 1 –
uzorak nanošen na kolonu; bunar 2 – flowthrough; bunar 3 – frakcija nakon ispiranja; bunar 4 –
eluat.

Rezultati dobijeni ELISA testom dokazali su da prisustvo soli nije uticalo na nativnu
konformaciju i biološku aktivnost proteina[8].