PROTEINSKA ELEKTROFOREZA AK proteina poseduju odreene elektro-karakteristike, to je ovisno od njihovih bonih grupa i posttranslacijskih modifikacija, kao to je fosforilacija.

Od ovih ostataka zavisi njihova pH vrijednost i izoelektrina taka proteina. Naboj proteina je odgovoran za njegovu topivost.Zahvaljujui naboju proteini se u elektrinom polju kreu prema suprotno naelektrisanoj elektrodi. Njihovo putovanje je razliito i zavisi od fizikih osobina proteina te od elektroforetskog sistema kojeg koristimo. Pri tom kretanju vaan je i otpor kojeg prua matrix kroz koji se protein kree i taj otpor je proporcionalan masi proteina. Ukupan naboj proteina je zbir pozitivnog i negativnog naboja bonih lanaca AK. Ako je protein nabijeniji elektricitetom putuje bre i obrnuto.Putovanje zavisi od: Jaine elektrinog polja pH vrijednosti pufera viskoznosti pufera.

Fig. 23.1. Physical basis of electrophoresis Molekule se kreu u elektrinom polju na osnovu ukupnog eletrinog naboja i oblika. Manje I nabijenije estice se kreu veom brzinom. Proteini sa identinim nabojem su odvojeni zbog njihovog razliitog oblika. Kao puffer za PE se najee koristi Tris-Cl i Tris-glicin.Pufer ispunjava prostor izmeu suprotno naelektrisanih elektroda elektroforetskog sistema. Visok napon moe da dovede do zagrijavanja gela ili polimera koji se koristi za elektroforezu te do poveanja viskoznosti pufera a to skupa doprinosi loijoj razdvojivosti i rezoluciji analiziranih proteina. Tokom elektroforeze napon struje treba biti konstantan kao i pH vrijednost pufera. Za EP koristimo gelove koji poseduju mreastu strukturu i razliite mehanike karakteristike.Za analizu proteina uglavnom se koristi: vertikalna elektroforeza sa ploastim gelom elektroforeza u tubama mikrokapilarna elektroforeza.

Gel mora posedovati odreenu stabilnost zbog postelektroforetske manipulacije. Gel mora biti hemijski nereaktivan ili sa minimalnom reaktivnou sa analiziranim proteinima. Gelove najee pravimo od akrilamidnog polimera uz pomo male koliine bisakrilamida(N,N metilenbisakrilamid) uz pomou kojeg pravimo metilenske mostove izmeu dugih susednih lanaca 1

akrilamida. Na taj nain se dobija gelsa odreenom veliinom pora. Za separaciju proteina odnos akrilamida i bisakrilamida je obino 40:1. Takva solucija predstavlja osnovni razlog za pravljenje gelova od 5.20% akrilamida u finalnom volumenu. Debljina ovakih gelova je razliita a obino se kree oko 1 mm. Njihova pH vrijednost mora biti stalna.

Fig. 23.2. Acryalide polymerises in the presence of persulphate radicals to form polyacrylamide. N,N -methylene bisacrylamide introduces crosslinks between the polyacrylamide strands

Table 23.1.Raspon razdvajanja proteina na poliakriamidnim gelovima zavisno od conc.poliakrilamida.

Zbog upotrebe poliakriamidnog gela ovu elektroforezu nazivamo PAGE. pHvrijednost ovakvih gelova moze biti od 6,9-9 pH, zavisno od vrste proteina koje elimo da dobijemo.Gelovi manje koncentracije imaju neutralniji pH a gelovi vee koncentracije su uglavnom baznog karaktera.Od koncentracije gela zavisi I njegova jonska snaga odnosno elektrohemijska inerntnost. Da bismo napravili gradijentni pH gel koristimo amfolite tj.molekule koje imaju grupe sa pozitivnim i negativnim polom. Odnosno molecule koje su polimeri razliitih duina dobijene polimerizacijom amino ili karboksilnih skupina. SDS -poliakriamidna gel elektroforeza.Proteini se meusobno dre slabim elektrostati kim vezama i mostovima formiranim uz pomo odreene soli. Tokom elektroforeze moe doi do hidrolize slabih elektrostatikih veza izmeu peptide proteina koji imaju tercijalnu strukuru. Elektroforetska mobilnost se zbog toga razlikuje u denaturirajuim i nedenaturirajuim uslovima elektroforeze. To moramo imati na umu kada elimo da zadrimo bioloku aktivnost ili kvarternu strukturu ciljnog proteina. Denaturirajue uslove postiemo dodavanjem npr.uree(najee). Visoka koncentracija uree razgrauje hidrogenske veze to dovodi do destrukcije sekundarne,tercijalne i kvarterne structure. Urea jeste vrlo hidrosolubilna ali nije polarna i ne kree se u elektrinom polju. Drugi denaturant koji se koristi u vertikalnoj EP je sodijum didecil sulfat (SDS).Sadri 12-karbonskih hidrofobni lanac i polarnu sulfatnu glavu.I on je jak denaturant proteinske structure.Zbog svoje bipolarnosti on se vezuje za protein stvarajuci jedan sloj koji im daje negativan naboj i takvi proteini uvek putuju prema anodi zbog ega se SDS i najvie koristi.

IZOELEKTRINO FOKUSIRANJE Ukupni naboj proteina varira zaisno od pH vrijednosti to je povazeno sa bonim AK-skim lancima ili posttranslacijskom modifikacijom. U standardnim elektroforetskim uslovima i odsustvu hemijske modifikacije izoelektrina taka je konstantna osobina proteina. Uz pomo pufera ne moemo napraviti gel sa gradijentnom pH vrijednou. Zato koristimo amfolite koji su heteropolimeri (polimeri razliitih duina)oligoamino i oligokarboksilne kiseline.Razliitom kombinacijom amino i karboksilnih grupa moemo sintetizirati veliki broj razliitih amfolita koji imaju razliitu izoelektrinu taku (pI). Kada uspostavimo elektrino polje amfoliti se u gelu rasporeuju (migriraju) do svoje individualne izoeletrine take. Dalje se ne kreu jer su u svojoj izoelektrinoj taci elektroneutralni. Oni na svojoj lokalnoj poziciji deluju kao pufer i na taj nain je napravljen gel sa razliitim pH gradijentom. Kada protein doe u odgovarajue pH polje u kome odputa I prima isti broj elektrona postie svoju elektroneutralnost i prestaje da se kree.Tada kaemo da je protein dostigao svoju izoelektrinu taku. Ova karakteristika nam pomae za bolju separaciju ili ekstrakciju proteina.

KAPILARNA ELEKTROFOREZA Kod proteinske kapilarne elektroforeze koristimo tanke kapilare malog unutranjeg volumena ali relativno velike unutranje povrine sa kojom protein mogu doi u kontakt. Kapilare od stakla imaju unutranji dijametar od 10-100 mikrona a spoljanji prenik do 300 mikrona. Duine su od 10-100cm- veoma su korisne zato to zahtevaju malu koliinu uzorka. Mogu se puniti samo poliakriamidom koji nije unakrsno povezan bisakrilamidom.Moemo formirati i denaturirajue uslove ako je potrebno. Unutranji zidovi staklenih ili siliko-kapilara imaju negativan naboj pa se prije upoterbe moraju tretirati jonima Na+ ili H+ jonima kako bi spreili interakciju zidova kapilare sa analiziranim proteinima. Napon pri kapilarnim elektroforezama je mnogo vei i kree se od 5-50 KV, dok kod obine elektroforeze se kree od 300-500 V.

Fig. 25.1. Schematic of a capillary electrophoresis system EP koristimo za: 1. odreivanje molekularne mase 2. odreivanje bioloske aktivnosti kao u sluaju katalitikih enzima gde upotrebljavamo spec.bojenje ili umetne supstrate kako bi uz pomo inteziteta bojenja gela determinisali katalitiku aktivnost. 3. SDS EP koristimo za determinaciju disulfidnih mostova. 4. Radi bolje razdvojivosti proteina koristi se dvodimenzionalna SDS PAGE ELEKTROFOREZA(2D SDS POSTTRANSLACIJSKE MODIFIKACIJE PROTEINA(PTM) Je hemijska modifikacija ili isjecanje dijela proteina nakon translacije. Protein se moe modificirati djelovanjem proteolitikih enzima, formiranjem disulfidnih uslova, kovalentnim djelovanjem fosfora, sulfata, alkalne grupe, lipida, karbohidrata, polipetdida i na druge naine. PTM kao npr. M-glikolizacija se moze dogaati tokom translacije ili nakon translacije proteina, dakle imamo ko- i postranslacijsku modifikaciju. Veina proteina prolazi kroz postranslacijsku modifikaciju. 30% proteina sisara u eliji je u fosfoniliranoj fazi. Skoro svi cirkulirajui protein plazme su glikolizirani. PTM utie na naboj, hidrofobnost, konformaciju, imunoloke karakteristike, stabilnost, lokalizaciju te aktivnost proteina. Bioloke funkcije mnogih proteina zavise od njihove posttranslacijske modifikacije, kao npr.specifini oligosaharidi na receptorima limfocita igraju vrlo vanu ulogu u njihovoj aktivnosti i sazrevanju, signalna kaskada se iskljuuje i ukljuuje reverznim dodavanjem ili oduzimanjem fosfata. Ubikvitacija igra vanu ulogu u degradaciji intracelularnih proteina. Naravno svaka posttranslacijska modifikacija nuno ne menja aktivnost ili druge karakteristike proteina. Zbog svega navedenog vrlo je vano prouavati odnos proteinske strukture i njihove funkcije. Tu nam pomae sekvenciranje AK-skog sastava proteina i uporeivanjem te sekvence sa odgovarajuim DNA/mRNA sekvencama. Meutim na osnovu ove komparacije ne moemo da odredimo vrstu posttranslacijske modifikacije. Ova prouavanja su vrlo vana za kreiranje proteinskih terapeutika. Sastavni su dio funkcionalne genomike i proteomike. Humani genom sadri do 25000 gena(sadasnja predpostavka) koji kodiraju do 1 milion razliitih proteina koji su nastali zahvaljujui alternativnom splasingu(srastanje) i posttranslacijskim modifikacijama. Zadatak proteomike je da izvri inventuru svih proteina prije svega kod ovjeka, da odredi njihovu strukturu i funkciju. Misli se da se to ne moe ostvariti manje od 3 naredna vijeka imajui u vidu predpostavljeni napredak tehnologije. Ako se tome doda i odreivanje (definisanje) protein, protein interakcije onda ova predpostavka ima smisla. Zadatak funkcionalne genomike je da izvri inventuru gena, njihovu strukturu, funkciju i intergenske odnose. U ovom pogledu prouavanje transkriptoma (mRNA) predstavlja vaan zadatak. Preko 4

trnskriptoma dolazimo do informacija o ekspresiji gena (proteina u odreenom tkivu) ali ne i do informacija o posttranslacijskim modifikacijama. PTM dovode i do promjene mase proteina to najbolje moemo odrediti masenom spektrometrijom. Neke modifikacije menjaju i naboj proteina usled acetilacije, alkilacije, karboksimetilacije,fosforilacije, sulfatacije . Promene u naboju moemo odrediti primjenom izoelektrinog fokusiranja, putem afmolitne dvodimenzionalne gel elektroforeze. Ova elektroforeza slui jo i kao sredstvo za izdvajanje proteina iz proteinskog mixa i njegovih izoformi. Osim navedene elektroforeze za purifikaciju proteina za ove svrhe moe nam koristiti 2D HROMATOGRAFIJA, masena spektrometrija i proteolitika restrikcija enzima. Pri ovim prouavanjima nezaobilazne su baze podataka i specifini softveri za analizu predpostavljenih posttranslacijskih modifikacija jo ne okarakteriziranih proteina. Ipak se PTM specifino dogaa na odreenim AK sekvencama to moemo programski simulirati putem izrde njihovih predpostavljene 3D struktura koje moemo praviti kod nepoznatih proteina na osnovu DNA/mRNK sekvence. PTM moemo podeliti na: Ireverzibilne i reverzibilne Enzimatske i neenzimatske, to zavisi od bioloke funkcije i lokalizacije odreenog proteina.

Metode Proteolitikom restrikcijom-hidrolizom moemo proavati razliite PTM kao npr. N-terminalnog signala kraja peptide i 2D gel elektroforezom i masenom spektrometrijom analizom dobijenih peptidnih fragmenata. Peptidne fragmente moemo podvrgnuti analizi aminokiselinske sekvence putem N ili Cterminalnim sekvenciranjem (Edmanovom reakcijom) ili masenom spektrometrijom. Odreivanje disulfidnih veza proteinu koje nastaju oksidacijom sulfhidrilne grupe (-SH) koja se nalazi na AK Cistein. Ove veze znaajno doprinose stabilizaciji trodimenzionalne structure kao i biolokoj aktivnosti ovakvih proteina.Odreivanje ovih mostova predstavlja obaveznu karakterizaciju proteina. Postoje razliiti protokoli za odreivanje slobodnih cisteinskih ostataka (SH grupa) , najee se radi hidroliza proteina a kasnije odreivanje AK sastava peptide. Mapiranje prisustva cisteina u peptide moe se odrediti hemijski hidrolizom proteina uz pomo amonijum hodroksida NH4OH na mjestima prisustva SH grupa cisteina. Kasnije se to potvruje masenom spektrometrijom. Fosforilacija proteina je reverzibilna. Vri se dodavanjem fosfatne grupe na AK ostatke serina, treonina,tirozina putem enzima kinaza. Ovom analizom odreujemo i funkciju proteina koji igraju vrlo vanu bioloku ulogu u mnogim elijskim procesima ukljuujui signalnu transdukciju, regulaciju elijskog ciklusa, stepena enzimtske aktivnosti. Zato je determinacija fosforilacije vrlo vana za dublje 5

poznavanje regulatornih mehanizama elije. Aberantna fosforilacija je prisutna kod mnogih bolesti i zato predstavlja jedno od ciljnih mjesta za djelovanje terapeutika. Masena spektrometrija predstavlja jako dobru metodu za odreiivanje fosforilacije kao i automatsko hemijsko odreivanje AK sekvence peptide (Edmanovom degradacijom). Naravno prije toga moramo izdvojiti (purificirati) fosfoproteine. U tome nam moe pomoi 2D gel elektroforeza. Sulfatacija proteina se odvija uz pomo enzimske aktvinosti sulfotransferaze. Ova modifikacija se veinom dogaa na ostacima tirozina pa je zato nazivamo tirozin O-sulfacija. Javlja se kod sekretornih i transmembranskih proteina za koje se misli da su kljuni modulatori u interakcijama proteina te razliitim biolokim procesima ukljuujui homeostazu,meusobnu komunikaciju limfocita, proces proteolize proteina i proces sekrecije proteina. Za detreminaciju ove modifikacije koristi se: radioaktivno obeleavanje proteina sa 35s izotopom edmanova analiza sa 3 fluor acetnom kiselinom (TFA) radioaktivno obeleavanje sa 3 H izotopom na mjestu tirozina.

Za mapiranje peptida koristi se HPLC metoda i MALDI MS za analizu odvojenih peptida ili separacione metode kao sto su HPLC,SDS PAGE ili TLC-hromatografija pod alkalnim uvjetima. Glikolizacija je kovalentno vezanje saharida na protein tokom kao i posttranslacijski. To se dogaa na: karboksi amino nitrogenu ostatku asparagina-N vezana glikolizacija ili na hidroksilnom ostatku serina i treonina- O vezana glikolizacija

Oligosaharidi menjaju fizike karakteristike proteina kao to su sterike i visoko hidrofilne karakteristike. Glikoproteini mogu postojati u razliitim izomernim i razgranatim formama, to im daje kompleksnu trodimenzionalnu strukturu od ega i zavisi njihova bioloka funkcija.Glikolozacija utie na: savijanje proteina njihovu stabilnost meusobno povezivanje unutar elijsku komunikaciju imuni odgovor maskiranje elija raka zarastanje povreda regulacija upalnih procesa kao selektivni ligandi.

Ne moe se ba tvrditi da se na osnovu vrste glikolizacije moe precizno definisati bioloka funkcija proteina. Analiza ove modifikacije zahteva razliite protokole za odreivanje N ili O-glikolizacije.To se moe raditi direktno pomou fluorescentnog bojenja ili specifinog vezivanja lecitina ili odreivanja masenog spectra nakon peptidne fragmentacije. U tome nam pomau 2D gel elektroforeza i selektivno fluorescentno bojenje. Ovu modifikaciju mozemo detektirati i pomou analize karboksilnih dodataka tj.karakterizacijom njihovih monosaharida koju ine karbohidrati Naravno da moramo izolirati protein, izvriti odvajanje oligosaharidne komponente kako bi analizirali njegov sastav. Pri tome nam pomae hromatografska separacija, detekcija i kvantifikacija. Acidnu analizu karbohidrata moemo vriti tri fluor siretnom kiselinom (TFA) ili hlorovodoninom kiselinom (HCl). Nakon toga analizu monosaharida moemo vriti jono izmenjivakom hromatografijom. N-vezanu glikolizaciju proteina moemo istraivati uz pomo enzima . Zavisno od tipa ove modifikacije koja moe biti manozni oligosaharid ili complex oligosaharid. Oligosaharidi se vezuju za aspartan uz pomo oligosaharid tranferaze koja prepoznaje sekvencu asparaginska kiselina-x, - serin/treonin. Enzimskom hidrolizom na navedenoj sekvenci moemo dobiti fragmente koje moemo fl uorescentno oznaiti a razdvojiti sa hromatografijom I okarakterisati direktno masenom spektrometrijom. O-vezanu glikolizaciju moemo determinisati eliminacijom saharida putem beta hidrolize uz pomo Nahidroksida i Na-hlor hidrata budui da znamo da se saharidne komponente i oblika di i tri saharida dodaju na hidroksilnim ostacima treonina i serina. O-glicin N-acetilglukozamin proteinska modifikacija (O-GlcNAc) je modifikacija ukljuena kod proteina transkripcije, translacije, nuklearnog transporta i elijske signalizacije. Mnogi protein nukleusa citoskeleta, citoplazme kao i membranski proteini tj.njihovi citoplazmatski ostaci se modificiraju na hidroksilnim grupama serina I treonina kovalentinim vezanjem -N acetil proteinskih glukozaminskih monosaharida. Najpogodnija metoda za detekciju ove PTM je MS,KE I HPLC. Modifikacija Glikozilfosfatidilinozitolom (GPI) je esta za protein elijskih membrane i to spoljanjeg sloja, kod epitelnih elija, elija imunog odgovora. Ove modifikacije imaju i patoloki znaaj u sluaju infektivnih bolesti. Modifikacije masnim kiselinama, brojni eukarioti kao i proteini virusa prolaze kroz kovalentnu modifikaciju tj.dodavanje masnih kiselina uglavnom enzimatskim putem kako na N tako na C-terminusu (kraju).

Acetilacija i metilacija su posttranslacijske promene koje se esto dogaaju na proteinima. Metil grupa se ukljuuje na atomoma Nitrogena ili Oksigena nukleofilnog dijela lanca mijenjajui hidrofobnost i naboj proteina. Moe se dodavati vie metil grupa. N-metilacija se odvija na ostacima lizina,histidina, arginina, glutamine i asparagine. O-metilacija se odvija : glutamin i asparagine. Postoji tzv.S-metilacija koja se dogaa na cisteinu. Metode za detekciju metiliranih proteina je MS. Ubikvitacija je kovalentno dodavanje ubikvitin peptide od 76-AK mase 8 kDa na amino grupu lizina,celularnih proteina. esta modifikacija koja pomae prailnu degradaciju putem ubikvitinproteozom sistema. Pomae u regulaciji mnogih elijskih procesa kao to je dioba, signalna transdukcija, diferencijacija (specijalizacija elija) i mnogi kontrolni elijski mehanizmi. Abekvantna ubikvitacija je udruena sa mnogim bolestima kao to su neurodegenerativne bolesti, inflamatorne bolesti i maligniteti. Dobra metoda za detekciju je MS. Histidin ubikvitacija se moe detektovati Nikl-afinitetnom hromatografijom. Pored ubikvitina postoji jos 10 slinih njemu homologa kojima se vri PTM. Aminacija i deaminacija nekih eukariotskih proteina, neurotransmitera i faktora rasta se dogaa na Ckraju proteina glicina sto utie na aktivnost ovih proteina a time i na signalnu transdukciju i vezujue receptore proteina signalne transdukcije. Za predikciju tercijalne i kvarterne structure kao i PTM neophodno je koristiti podatke iz adekvatnih baza, zatim softvere za modifikaciju 3D i 4D proteinske structure uz pomo odgovarajuih nukleotidnih i mRNK sekenci. Ovi alati nam pomau da preciznije okarakterisemo sve nivoe structure proteina i modifikacija kako bi bolje definisali aktivna mesta proteina I sve njegove dr.karakteristike. Ova prouavanja su neizostavna u procesu kreiranja proteina za razliite terapeutike, dijagnostiku i dr.upotrebne svrhe.

MONOKLONALNA ANTITIJELA Su monospecifina, producirana od strane jedne elije (klona), za razliku od poliklonalnih antitijela koja su nastala od nekoliko klonova elija. Monoklonalna At su monovalentna, vezuju se samo za isti epitop (peptid ne vise od 20 AK). Kao takva mogu nam posluiti za: Vizuelizaciju Detekciju Smanjenje aktivnosti,za izdvajanje specifinog supstrata iz odreenog mixa. Vrlo su vana za istraivanje za th. i dg. 8

Razvoj produkcije Mat naglo je poeo od 70-ih. Danas je vrlo rairena metoda. Najrairenija metoda proizvodnje Mat je HIBRIDOMA TEHNOLOGIJA-koja se zasniva na fuziji mijeloma elija sa odreenom klasom B-elije koju izdvajamo iz slezene predhodno imunizirane ivotinje,obino mia ili kunia koristei polietilenglikol za uspenu fuziju membrane elija u meavini. Da bi izvrili selekciju fuzirane elije moramo koristiti selektivni medij (podlogu) za uzgoj hibridnih elija. elije mijeloma su izgubile sposobnost produkcije At tokom neoplastine transformacije, a mutirane su za sintezu guanine zbog mutacija na genu hipoksantin-guanin-fosforibozin transferaze(HG PRT). Meutim, elije imaju alternativni put sinteze purina kojeg blokiramo dodavanjem aminopterina-analoga folne kiseline koji inhibira dihidrofolat reduktazu (DHFR). Na ovaj nain smo mijeloma elije blokirali u njihovom rastu jer ne mogu izvriti replikaciju DNK molecule hromosoma. Selektivni medij se naziva HAT medij zato sto sadri hipoksantin,aminopterin i timidin. Na njemu mogu rasti fuzirane hibridoma elije.Izolirane zdrave elije iz slezene domaina mogu rasti samo ogranieno do 45 dioba pa ugibaju. Mijeloidne elije su potrebne da fuziranoj eliji daju besmrtnost, a hibridna elija od zdrave elije je nasledila mogunost za produkciju monoklonalnog At. Hibridoma elije su sposobne da na ovakom mediju rastu neogranieno i postanu besmrtne. Nakon ovoga sledi jo jedna selekcija, jer smo iz slezene verovatno pored target elije zahvatili i elije drugoga klona pa iz te eventualne meavine hibridoma elija moramo ispitati koja producira eljeno Mat. Za tu svrhu koristimo ELISA ili Ag-mikroset ili imuno-dot-blot. Imunizacija odabrane ivotinje domaina se vri u toku 2-3 sedmice i u slezeni takve ivotinje uglavnom dominira eljeni klon B-elije. Nakon toga vrimo skrining prisustva At u serumu ivotinje i odreujemo titar At ELISA tehnikom i nakon toga pristupamo izdvajanju eljenih B-elija. Monoklonalna antitijela se koriste: Istraivake, th. i dg. svrhe, Imunofruoroscencija je neizostavna u dg.razliitih oboljena Fluocitometrija za izdvajanje subpopulacija limfocita, CD3, CD4 (Helpert-T limfociti), CD8 (citotoksicni T limfociti) Kod izdvajanja At komplementarnih bilo kojih elija iz kosane sri ili periferne krvi. T-elije iz uzorka kotane sri davaoca da bi minimizirali reakciju grafta na organizam domaina. Moemo kod davaoca izdvojiti CD3 i CD4 elije da bi smo pospjeili imunotoleranciju na transplatirani organ. Koriste za odreivanje krvnih grupa U dg. CA u sluaju monoklonalne T akutne limfaticne leukemije (ALL) i time je diferencirati od B-ALL. 9

Mat nam pomazu u preciznom dostavljanju radioaktivne antiCA-Th. Za izdvajanje nekog specificnog proteina iz seruma ili dr.bioloskog uzorka npr.afinitetnom hromatografijom.

MASENA SPEKTROMETRIJA PROTEINA I PEPTIDA

Masena spektrometrija predstavlja jedan od osnovnih alata za identifikaciji i karakterizaciju proteina i peptida. Mogue je izmeriti protein mase od>100kDa sa tanou od nekoliko Da i masu peptida od nekoliko MDa. MS je vrlo specifina, ima visoku osetljivost u rasponu femtomola (10-15mola), pa je pogodna za analizu tragova iz uzorka. MS se temelji na osobinama nabijenih estica koje se kreu pod uticajem elektri nog i magnetnog polja, pa su vrste prouavanja joni a ree molekule. Veina MS eksperimenata se izvodi na pozitivnim jonima, koji se mogu stvoriti uklanjanjem jednog ili vie elektrona iz svake molekule ili dodavanjem jednog ili vie katjona, obino protona. Prema tome prvi korak u svakom mjerenju MS je transfer molekule u plinsku fazu i jonizirati je, ime smo izmjerili omjer mase i naboja molecule(m/z). Veina biolokih uzoraka je smjesa brojnih spojeva, pa njihovi m/z spectri mogu biti vrlo sloeni. Veina peptida i proteina su polarne, involatilne i termiki nestabilne, tako da klasine metode proizvodnje jona osiguravaju malo informacija o molekulskoj strukturi, one najee razbijaju molekulu na male komadie. Ova situacija se dramatino promenila prije 20 godina razvojem novih jonizacionih tehnika kao sto su matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI), i electrospray ionization (ESI)-tehnike koje su dobro prilagoene za analizu velikih biomolekula. MALDI (jonizacija potpomognutu matriksom uz desorpciju laserskim zraenjem )-analit je pohranjen na vrstu podlogu, obino u vakumu zajedno sa znatnim viskom matrice i izloeni su djelovanjem lasera. Kao matrica se koriste otopine odreenih tvari u smjesi vode i organskog otapala. Analit je otopljen u matrici.Na matricu se djeluje laserom, najee duikovim laserom. Matrica ti ti analit od lasera, slui da apsorbuje energiju od lasera a njezinim isparavanjem i ionizacijom, ona prenosi dio naboja na analit, ionizirajui ga. MALDI tehnika je pogodna za ionizaciju biomolekula i velikih organskih molekula. ESI (jonizaciju elektro rasprenjem )-jonizacija jonizira analit u obliku otopine. Kao otapalo, obino se koristi nekakva tvar koja je hlapljivija od analita. Otopljeni analit, stvara ione u otopini. Otopina se proputa kroz kapilaru u prostor pod vakuumom. Kada otopina ue u evakuiranu komoru, ona se raspruje u aerosol, zbog odbijanja iona u otopini. Otapalo isparava s kapljicama, ostavljajui

10

ione analita. Ova tehnika se koristi za ionizaciju makromolekula, jer se one vrlo lako fragmentiraju.Za ovu tehniku, dodjeljena je Nobelova nagrada za kemiju za 2002.godinu. Figure 27.2 Figure 27.3

MASENI SPEKTROMETRI Su ureaji koji razdvaju jone, nastale u jonizatoru po njihovoj masi i/ili naboju. Slue za mjerenje m/z ili samo mase molecule ako je naboj stanice poznat. Klasine metode koriste magnetski sector masenog spektrometra, koji daje visoku preciznost ali slabu senzitivnost. Ovi instrumenti su gotovo u potpunosti zamenjeni novim instrumentima poput time-of-flight (TOF), kvadrupolni, i jonrezonancija masenim spektrometrima. Time-of-Flight Mass Spectrometer(TOF) je metoda koja je dobro prilagoena MALDI mjerenju. Analiza MALDI-TOF metoda je identifikacije proteina dobivenih iz gela koja se temelji na razgradnji svakog proteina uz pomo tripsina te njihovoj ionizaciji, nakon ega se dobiveni spektri masa fragmenata usporeuju sa spektrima pohranjenim u bazama podataka, te se na taj nain ustanovljava o kojem je proteinu rije. Kod analize MALDI dobiveni se fragmenti razdvajaju na temelju omjera mase i naboja (engl. mass-to-charge, m/z). Quadrupole Mass Spectrometers Linear Quadrupole Mass Filter-je prilagodjen tehnikama elektrosprej jonizacije. Sastoji seod etiri valjkste paralelne elektrode. Ioni se proputaju izmeu etiri elektrode.Na elektrode je prikljuen izvor izmjenine struje. Kroz analizator mogu proi samo odreeni ioni, a pretraivanje se provodi mjenjanjem frekvencije napona.. Quadrupole Ion Traps-drugi instrument u mjerenju kvadrupolne masene spektrometrije je 3D quadrupole ion traps, koji se sastoji od 3 hiperbolicke elektrode, prstena i 2 kapice koje su simetricne sa Z osom

. Figure XX.Kvadrupolni spektrometar Resonance Instruments 11

Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR) predstavlja tehniku analize iona po masama. Ureaj se sastoji od velikog magneta koji proizvodi homogeno magnetsko polje. Unutar magnetskog polja se nalazi niz elektroda. Ioni koji uu u komoru spektrometra, gibaju se u krunim putanjama unutar komore zbog magnetskog polja. Pomou dvije elekrode, koje su postavljene okomito na smjer magnetskog polja, mogue je kontrolirati poloaj iona unutar komore. Na druge dvije elektrode, smjetene paralelno magnetskom polju narine se izmjenina struja odreene frekvencije. To izmjenino elektrino polje djeluje na sve ione u komori, ureujui njihove putanje. Nakon zavretka djelovanja izmjeninim elektrinim poljem, promatra se prolazak iona pored detektorskih elektroda, koje su takoer smetene paralelno smjeru magnetskog polja. Signal koji se dobiva sa detektorskih elektroda, sadri informaciju o svim ionima, bez obzira na njihovu masu. Na taj signal, potrebno je primjeniti matematiku operaciju - fourierovu transformaciju. Tom operacijom se dobiva se maseni spektar. Ova metoda je brza i ima veliko razluivanje, ali je i jako skupa. S obzirom da je u ovakvom instrumentu mogue manipulirati ionima, mogue je provoditi razliita istraivanja na njima . The Orbitrap-Ionska zamka je mala kutijica s nekoliko elektroda na koje je doveden izmjenini napon i istosmjerni napon. Ion, koji ue uzamku oscilira u zamci kompleksnim putanjama, koje se kontroliraju elektrodama s istosmjernim naponom.Ova metoda je brza i ima nisko razluivanje. Masena spektrometrija se najee koristi za analizu primarne structure proteina, odnosno odreivanje AK sekvence. Ako odgovorajua nukleotidna sekvenca postoji u jednoj od baza podataka, osnovni problem je identifikacija ispitivanog proteina. To mogu biti promjene koje nisu definirane bazom podataka kao npr.mutacije u drugom uzorku, posttranslacijske modifikacije, ali barem je osnovna struktura proteina definisana. Meutim, ako nukleotidna sekvenca nije pohranjena u bazi podataka, potrebno jede novo sekvenciranje, koje je puno tee.Standardna metoda analize proteina (sekvenciranje bottom-up), prvo razbija molekule djelovanjem enzima, obino tripsina, koji cijepaaminokiselinski lanac na Cterminalnom kraju arginina ili lizina. Fragmenti dobiveni ovim digestijom tada se ispituju u masenom spektrometru. Ako se ne uspije idendificirati protein onda je neophodno razbiti enzimatski fragment obino sa molekulama plina pa se mjere mase proizvedenih jona pomou MS/MS mjerenja. Ovaj proces se vri TANDEM masenim spektrometrom. Ovi spektrometri su evoluirali kako bi se dobilo vie informacija od ukupne vrednosti mase koje pruaju obini spektrometri. Mjerenja se obino provode u 2 analizatora u nizu, prvi analizator odabire precursor jon ,dok ce proizvod jon mjere u drugom analizatoru. Neki instrumenti omogucuju mjerenje u jednom instrument kao npr 3D ion trap.Tandem spektrometri su trostruki kvadropolni maseni spektrometri, The Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer i drugi. 12

Masena spektrometrija se koristi za: odreivanje sastava nepoznatog uzorka (kvalitativna analiza) odreivanje izotopskog sastava uzorka odreivanje strukture molekula na bazi njihove fragmentacije odreivanje molarne mase molekule odreivanje koliine odreene materije u uzorku (kvantitativna analiza) odreivanje fizikih i hemijskih svojstava materije prouavanje ponaanja jona u vakuumu

MS se upotrebljava u proteomici, prehrambenoj industriji, farmaceutskoj industriji, u th.praenju koncentracije lijeka (TDM), istraivakim ustanovama, u klinikim laboratorijima itd. PROTOCNA CITOMETRIJA Jedan od temelja protone citometrije je sposobnost za mjerenje svojstava pojedinih estica. Protoni citometar se sastoji od 3 meusobno povezana sustava: protonog,optikog i elektronskog. Protoni sustav ine pokretaka tekuina, koja je nosa stanine suspenzije, stanina suspenzija i zrani potisak. Protoni sustav omoguuje da stanice iz stanine suspenzije pojedinano laminarnom protokom kroz sustav uske kapilare dolaze do snopa laserskog svjetla koje s leama, filtrima i osjetnicima ine optiki sustav. Stanice se obasjavaju laserskim svjetlom, a stupanj rasprenja svjetlosti iste valne duljine pokazatelj je fizikih osobina stanica veliine (svjetlost koja se rasprila pod malim kutom od 0,5-10,FSC - prema engl.forward scatter) i zrnatosti;granuliranosti(svjetlost rasprena pod pravim kutom - SSC, prema engl. side scatter).

Oba FSC i SSC su jedinstveni za svaku esticu, te kombinacijom se mogu upotrijebiti za razlikovanje razliitih tipova stanica u heterogenom uzorku. Dodatno obiljeavanje stanica slobodnim ili (ponajee) za monoklonska protutijela vezanim fluorescentnim bojama(fluorokromima) rabi se za dodatno obiljeavanje specifinih staninih struktura .Fluorokromi obasjani laserskom svjetlou emitiraju svjetlost vee valne duljine od ulazne svjetlosti, a hvataju je specifini osjetnici (detektori) protonog citometra. Detektori su ili silikonske fotodiode ili fotomultiplikacijske cijevi (PMTs). Silikonske fotodiode se obino koristi za mjerenje FSC kada je signal jak. Specifinost detekcije je kontrola optikim filterima koji blokiraju odreene valne duljine a proputaju druge. Postoje tri vrste filtera: long pass, short pass i band pass:

13

Fugure 2: Razliite vrste optikih filtera

Svi filteri blokiraju svetlo absorbcijom.. Sve svjetlosne signale elektronski sustav pretvara u digitalne signale koji se prenose u elektroniko raunalo i slue za analizu. Brzina protoka sortiranja ovisi o nekoliko faktora, ukljuujui veliinu estica i brzine stvaranja kapljica.Tipina mlaznica je izmeu 50-70 JM u promjeru i moe proizvesti 30,000-100,000 kapljica u sekundi, to je idealno za precizno sortiranje. Za definiciju staninih populacija najee se koristi citogram veliine i zrnatosti stanica (FSCSSC)na kojem se postavlja regija(R) analize oko ciljnih stanica iz kojihe se analizirati specifini fluorescentnisignali. Upravo je to jedna od najveih prednosti moderne protone citometrije, budui da stanice prije analize nije potrebno prethodno fiziki razdvojiti. Od ostalih prednosti valja izdvojiti veliku brzinu mjerenja signala (>103 stanica u sekundi) te istodobno mjerenje vie parametara (fizikih parametara i fluorescentnih signala),pa se na modernim citometrima istodobno moe analizirati i do desetak parametara .

Figure3. Shematski prikaz tipinog protonog citometra 14

Premda je do danas razvijen velik broj protono citometrijskih testova za analizu razliitih staninih obiljeja i/ili funkcija, ona se jo uvijek ponajvie rabi u cilju imunofenotipizacije, tj.obiljeavanjes pecifinih staninih biljega.Od imunofenotipskih analiza posebnose izdvaja analiza limfocita periferne krvi u cilju ocjene imunolokog statusa, imunofenotipizacija leukemija i limfomai praenje ostatnih malignih stanica(minimalne rezidualne bolesti), mjerenje broja CD34+ krvotvornih matinih stanica u perifernoj krvi i leukocitno koncentrat za potrebe transplantacije krvotvornih matinih stanica, dijagnostika paroksizmalne none hemoglobinurije(PNH) i mjerenje sadraja stanine DNA u cilju otkrivanja aneuploidija (najeeu leukemijama) i proliferacijske aktivnosti stanica (za funkcijske testove limfocitaili procjenu proliferacije tumorskih stanica). Funkcijski testovi leukocita najee se rabe za mjerenje aktivacije i proliferacije limfocita, kao i za analizu funkcije granulocita (fagocitoze i respiracijskog praska). Protona citometrija se koristi za brojanje stanica, sortiranje stanica, detekciju biomarkera. Korsti se u detekciji razliitih bolesti naroito leukemija, ali ima brojne druge primjene u temeljnim istraivanjima, klinikoj praksi i klinikim ispitivanjima.

15