Proteini/tehnike I dio

Prof.dr Adlija Čaušević

Farmaceutski fakultet Sarajevo

Kolegij: Klinička biohemija I

Metode određivanja koncentracije
proteina u biološkim uzorcima,
frakcioniranje serumskih proteina,
elektroforeza serumskih proteina,
potporni mediji
Proteini se od peptida razlikuju po kompleksnosti i veličini molekula (peptidi>50 AK).
Jednostavni proteini su izgrađeni samo od aminokiselina, a složeni (proteidi) imaju i
druge gradivne sastavnice (prostetičnu skupinu):
 Prostetična skupina
 Metali (Metaloproteini)
 Lipidi (Lipoproteini)
 Ugljikohidrati
 Glikoproteini (5-15%): <15%UH;<4% heksozamina (Tf, Cp)
 Mukoproteini (75%):15-75%UH;>4% heksozamina (Hpt,Hpx)
α1-kiseli glikoprotein i C-reaktivni protein u akutnoj fazi upale
 Fosfor (Fosfoproteini)
 Frakcija Rel. c (g/l)
količina (%)
Albumini: albumin 52 – 58 34 –
pre-albumin (transtiretin) 50

1-globulini: tiroksin vezujući globulin, transkortin, 2,4 – 4,4 2-4

1-kiseli glikoprotein, 1-antitripsin, 1-lipoprotein
(HDL), 1-fetoprotein

2-globulini: haptoglobin, makroglobulin, 6,1 – 10,1 5–9

ceruloplazmin
-globulini: transferin, hemopeksin, lipoprotein 8,5 – 14,5 6 – 11
(LDL), fibrinogen, C-reaktivni protein, C3 i C4
komponente komplementa

-globulini: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 10 – 21 8 – 15

Ispitivanje poremećaja vezanih za proteine

1- Serum ukupni proteini

2- Serum albumin.
3- Serum albumin: globulin odnos,
globulin = ukupni proteini – albumin i
normalan opseg za A:G omjer je 1.3-1.8

4- Elektroforeza proteina sa sepracijom različitih frakcija

5- Određivanje koncentracije specifičnih proteina.
 Putem reaktivnosti
• Biuret reakcija, Lowry metoda
 Putem hemijskih osobina
• Absorpcija na =260 nm (Phe) ili 280 nm
(Tyr, Trp)
 Putem određivanja aktivnsoti
 Enzimi, imunoglobulini,
 Putem imunogeničnosti
• Kjeldahl metod (reference)
• Direktna fotometrija
• Folin-Ciocalteu (Lowry) metod
• Metode vezivanja boja (Amido crno; Coomassie
Brilliant plavo; Srebro)
• Precipitacija sa sulfosalicilnom kiselinom ili
trihloroctenom kiselinom (TCA)
• Biuret metod
 Uzorak
Topla H2SO4 digestija
Korekcija za NPN

NH4+
Titracija sa Nesslerovim
reagensom (KI/HgCl2/KOH)

Protein nitrogen
Pomnožiti sa 6.25 (100%/16%)

Ukupni protein
 H2 H
C COOH H2 H
C C COOH
C
NH2
OH CH NH2
HN

Tyrosine Tryptophan

max= 280 nm
 Absorpcija na, može se koristiti za pepidne
veze 200–225 nm (max za peptidne veze)
 Slobodni Tyr i Trp, mokračna kisleina, i
bilirubin interferenca na 280 nm
 Protein
fosfotungstat/fosfomolibdat Redukovani oblik(plav)
(Tyr, Trp)

Nekad se koristi u kombinaciji sa biuret

100 puta osjetljivija od biureta
Traži purifikaciju zbog interferenci
 H
H2N N NH2

Cu++
O O
or . . . O Blue adduct ( = 540 nm)
-
OH
H H
N C C
C N
H

 Kalij natrij tartarat se doda na kompleks i

stabilizira Cu++ (kupri) jone
 Jodid se dodaje kao antioksidans.
 Albumin je najzastupljeniji protein u serumu (40-
60% ukupnih proteina)
 Albumin je protein anion (pI=4.0-5.8)
• Bogat sa Asp, Glu
  Albumin reagira sa anionskim bojama
• BCG (max= 628 nm), BCP (max= 603 nm)
 Vezivanje BCG i BCP nije specifično,pošto drugi
proteini također sadrže Asp i Glu ostatke
• Čitanje absorbance u roku 30 s povećava specifičnost
 BCG (pH 4.2)
Albumin Zeleni ili ljubičasti adakt
BCP (pH 5.2)

Aaaaabsorbanca 

30 s
Vrijeme 
1. Precipitacija solima.
2. Cohn’s metod frakcione precipitacije.
3. Separacija ultracentrifugiranjem.
4. Papirna hromatografija.
5. Elektroforeza
 Hromatografija
• Gel , HPLC, jonska razmjena, imunoafinitet
 Elektroforeza
• Škrobni gel, agarozo gel, celulozo acetat, PAGE
2. Podjela vezana za tip elektroforeze
a. Gel eelktroforeza na slidovima.
b. Elektroforeza u eprivetama.
c. Disk elektroforeza.
d. Elektroforeza pri niskim i visokim naponom.
e. Dvodimenzionalna elektroforeza

Aplikacije elektroforeze:
1. Separacija serum proteina za dijagnostičke svrhe.
2. Separacija hemoglobin.
3. Separacija i identifikacija lipoproteina.
4. Separacija i analiza izoenzima.
5. Izučavanja na nukleinskim kisleinama.
6. Određivanje moleklulske mase proteina.
 Teorija elektroforeze

Kretanje nabijenih molekula u električnom polju

V=Eq/f
V=brzina kretanja molekula
E=električno polje u voltima/cm
Q=net naboj
F=frikcioni koeficijent(ovisi od mase i oblika molekula)

Načini separacije: papir

celuloza
škrob
agar,
agaroza, poliakrilamid
 Cover
– +
Power
supply

Anode Cathode
Insulating plate Buffer
Electrophoresis support medium

Nabijene molekule se kreću kroz medij zbog snage koju ispoljava električno polje.
 Veća viskoznost
Elektromotorna snaga (emf) Sporije kretanje
Kroz rastvarač

+
Vuče

+ V Q –
Femf  EQ 
d
Fdrag  6r
when Femf  Fdrag , velocity is constant
I. Električno polje:
a. Voltaža - V∞M
b. Struja - C∞M
c. Rezistencija- R 1/∞ M

II. Uzorak:
a. Naboj - C∞M
b. Veličina - S 1/∞ M
c. Oblik molekula -
Faktori koji djeluju na mobilnost makromolekula

1.Naboj i konformacija

2.Jonska atmosfera i potencijal zeta

joni suprotnog naboja koji se koncentrišu oko makromolekula, stvaju dvostruki sloj
naboja=jonska atmosfera
3. Efekat relaksacije -iregularno kretanje u skokovima, smanjena mobilnost

4. Elektroforetski efekat-joni u vodi hidrirani, elektrolit koji se kreću u suprotnom smjeru

Nose rastvarač sa sobom

NOSAČI

Mogu biti rastvori kao gradient saharoze

Ali češće se koriste nerastvorljivi materijali- sa česticama ili kontinuirani

Sa česticama: Sefadeks, vlakna celuloze

Kontinuirani: poliakrilamod, škrob, agaroza
Efekat pH na mobilnost

Naboj i mobilnost karakteristika svakog jona

Ako solucija sadrži substancu čiji pK je blizu pH otopine,
substanca postoji u nabijenom i stanju bez naboja
Kada je pH=pKa slabe kiseline samo 50% čestica će imati
naboj

Na pH za jedinicu ispod-----90% čestica će biti bez naboja

Na pH jedinicu iznad--------90 % čestica će biti sa
nabojem

Efektivni naboj substance varira sa pH te i mobilnost

substance mora varirati sa pH.
Proteini
Nizak pH-----------visoko pozitivni
Nula na specifičnoj višoj pH
Negativan--------na alkalnijoj pH
Posljedica----rastvori moraju biti puferovani da se održi
Konstantnost pH
pH pufera se odabire za postizanje optimalnog net naboja
prilikom separacije
Za proteine raspon pH 7do9,serumski proteini 8,6

Puferi-jonske substance, aktivne u procesu elektroforeze

Kretanje jona i provodljivost

V=otpor X struja V=Struja/Provodljivost

Elektroforeza, struja je protok jona u oba smjera

Provodljivost predstavlja sumu koncentracijaXefektivne

mobilnosti svih prisutnih jona
Jon sa većom mobilnošću nosi veći dio struje
 Optimalne elektroforetske separacije moraju izbalansirati
između brzine i rezolucije
• Visoki napon povećava brzinu, a toplota izaziva evaporaciju pufera i može
denaturirati proteine
• Pufer visoke jonske jačine povećava provodljivost, ali stimulira efekte
endoosmoze
Zašto!

Ako se poveća koncentarcija soli-raste provodljovost,

Intenzitet struje konstantan, podesiti napon-umanjiti ga

Pad napona------redukcija
napona- F elec nabijenih čestica.,
Usporeno kretanje
Dulje treba za separaciju,
Posljedica: pad rezolucije zbog povećane difuzije

Povećanje provodljivosti na fiksiranom naponu, raste

jačina struje, raste električna toplota, konvektivne
disturbanse u rastvoru

Posljedica denaturacija
 - -
- -
-
-
- + -
-
- -
-

+ –
 Velike, visoko nabijeni proteini
migriraju prema elektrodi sa sličnim
nabojem.
 Teorija

•Kretanje nabijenih čestica u električnom polju

•V=Eq/f
V=brzina molekule
E=električno polje u voltima/cm
Acrobat Document
Q=naboj molekula
F=frikcioni koeficijent (ovisi od mase i oblika molekule)

Načini separacije: Papir

Celuloza,
Škrob,
Agar,
Agaroza,
poliakrilamid gel
Lokalizacija analita

1.Mjerenje absorbcije svjetlosti

2.Refraktivni indeks
3.Bojenje

Denaturacija proteinskog gela—potapanje gela u diluiranu

acetatnu kiselinu ili TCA
Bojenje svih proteina: Stains All ili srebro boja, bromfenol plavo
Amido crno
Lipoproteini:Sudan Black, oil red, Coomasie briliant plavo
Celulozo acetat_Ponceau S., Coomasie plavo- poliakrilamid
Hemoglobin-----orto dianisidin
Ninhidrin-amino grupe
Enzimi: nitroblue tetrazolium klorid, NADH-dehidrogenaze
Fosfataze----1 naftil fosfat i fast blue
Korištenje tagova
 Elektroforeza serumskih proteina
Ukupni (g/dL)
serum
proteini
Albumin: 58%–74% 3.5–5.5
Alfa1 2.0%–3.5% 0.2–0.4
globulin:
Alfa-2 5.4%–10.6% 0.5–0.9
globulin:
Beta 7%–14% 0.6–1.1
globulin:
Gama 8%–18% 0.7–1.7
globulin:
Kliničke aplikacije

1.Gama globulini i albumini

Hemoglobin i podklase
Monoklonalni proteini
Lipoproteini

2. Analiza izoenzima

3.Imunoelektroforeza

4.Western blot----identifikacija specifičnog proteina

Prisustvo At na HIV

5. Southern blot-identifikacija DNK i RNK

 A lb u m in

a1 a2 b g

M ig ra tio n d is ta n c e

Elektroforeza proteina
Albumin 1 2  

+ -
KAPILARNA ELEKTROFOREZA
 Rast koncentracije albumina-posljedica dehidracije.
 Rast koncentracije alfa-1 globulina javlja se kod
sistemskog lupusa,reumatoidnog artritisa,u trudnoći, kod
infekcija ili kod kancera.
 Rast koncentracije alfa-2 globulina izazvan sistemskim
lupus eritematozusom, reumatoidnim artritisom,
kancerom, obolenjem bubrega, srčanim infarktom,
hroničnim infekcijama(tuberkuloza).
 Rast u procentu beta globulina izazvan bolestima jetre
(ciroza), anemia, ili rastu koncentracije lipida.
 Rast koncentracije gama globulina-hronične
infekcije,autoimune bolesti, neki tipovi leukemije,
multipli mijelom, Waldenstrom's makroglobulinemia,
bolesti jetre, Hodgkin. Dop rasta može doći i u
starosti(monoklonalna gamopatija nepoznatog značaja).
•Padalbumina vezan za malnutriciju, opekotine,bolesti jetre ili pak
bubrega, sistemski lupus, reumatoidni artritis, Hodgkinova
bolest,kancer ji se proširio u organizmu, Crohnova bolest.
•
•PADalFA-1 globulina IZAZVAN BOLEŠČU JETRE ILI PAK
BUBREGA ILI NASLJEDNIM OBOLENJEM KOJE MOŽE
IZAZVATI EMFIZEM.
•PADalFA-2 globulina-oštećenje jetre, leukemija, hemolitička
anemija, hipotiroidizam, Wilsonova bolest.
•Pad beta globulina-bolesti bubrega ili problemi sa koagulacijom .
•Pad gama globulina-bolesti bubrega ili problemi sa imunim
sistemom.(niske količine antitijela)
Albumin 1 2  
 Pad albumina
Rast APR haptoglobina

Albumin 1 2  
 Albumin opada
Haptoglobin raste
Gama globulini rastu

Albumin 1 2  
 Opadaju gama globulini

Albumin 1 2  
 Opada albumin
Raste 2-makroglobulin
Opadaju gama globulini

Albumin 1 2  
Opada sinteza albumina
Rast gama globulini (poliklonalna gamopatija)
“- most”

Albumin 1 2  
 Albumin opada
Oštar pik u zoni gama

Albumin 1 2  
Opada albumin
Opadaju gama globulini
Raste alfa2-makroglobulin

Albumin 1 2  
 Antigen je substanca koja ima sposobnost indukcije imunološkog
odgovora. Ulaze u organizam preko infekcije. Bivaju prepoznati u
formi epitopa putem B ćelija ili Receptora na T ćelijama.

Proteini i glikoproteini predstavljaju najbolje antigene jer najbolje

stimuliraju prepoznavanje antigena. Neki imunoeseji tetsiraju
antigene, a neki antitijela.
• Antitijela se produkuju od strane B
limfocita. Oni predstavljjau glikoproteine
koji pripadaju supergenskoj familiji
imunoglobulina i produciraju se kao
odgovor na prisustvo strane substance u
organizmu.

Antitijela imaju relativno poznatu

strukturu, ali u sklopu iste imaju regije po
kojima se međusobno razlikuju koje
akomodiraju specifične antigene (Abbott
Diag.).
 Imunoeseji predstavljaju grupu osjetljivih analitičkih testova koji
koriste vrlo specifične komplekse Ag vs At za nastanak signala koji
se mogu izmjeriti i dovesti u vezu sa koncentracijom substance u
rastvoru.(wild).Imunoeseji produciraju i kvalitativne podatke u
smislu prisustva ili odsustva substance u organizmu.
 Paul Ehrlich (1854-1915)
predložio da se antigen
kombinuje sa
preegzistirajućim bočnim
lancima na površini ćelije.
 Ehrlich’s teorija je baza
genetske teorije specifičnosti
antitijela
 Karl Landsteiner (1868-1943) je
postao slavan po otkriću A/B/O
krvnih grupa i Rh faktoru.
 Utvrdio je da specifičnost antigena
je zasnovana na prepoznavanju
specifičnih molekularnih
struktura., nazvao ih je hapteni.
• 1959, Dri. Rosalyn Yalow &
Soloman Berson su izumili RIA, koji
podrazumijeva korištenje izotopa
kod određivanja insulina.

• RIA je prethodnik modernih eseja

Dr. Rosalyn Yalow je prva žena koja

Je dobila Nobelovu nagradu za svoj rad
Na RIA.
 -
O
CH2-CH2-CH2-CH3

O
NH 2

OH
Cl
3 + N
NH

O
O-
 Ne kovalentna
 Reversibilna
 Intermolekularne snage
• Vodikove veze
• Hidrofobne veze
• van der Waals (London) veze
 Klonalne varijacije
 Višak At Višak antigena
Precipitat

etc.

Zona ekvivalencije

Antitijelo/Antigen