Mehanizmi toksinosti

Prof. dr Biljana Antonijevi

Toksikologija, 2011/12.
 Ciljna mesta toksinosti
Organizam, organi, tkiva, elije, molekuli...
Otrovi se vezuju za konstituente elija
strukturni i funkcionalni poremeaji
Biomolekuli: proteini, nukleinske kiseline, lipidi
Dejstvo otrova na biomolekule
Neselektivno (dvoguba veza, tiolne grupe)
Selektivno (specifini receptori)
Toksikokinetika
Mehaniki, prisustvo ksenobiotika
 Mehanizmi toksinosti
Vezivanje za enzime i druge proteine (nespecifino i
specifino)
Oksidativni stres, lipidna peroksidacija
Oteenje DNK
Bioaktivacija otrova (nastanak reaktivnih metabolita)
Kovalentno vezivanje reaktivnih metabolita za elijske
makromolekule
Interakcije sa bioelementima
Interakcije sa jonskim transportom
Poremeaj elijske homeostaze kalcijuma
Poremeaj mitohondrijalnih funkcija (smanjenje sinteze
ATP ili energetsko iscrpljivanje elije)
Imuno mehanizmi
Apoptoza, nekroza
Proteini
 Transportni, depo proteini I
hemoglobin
smeten u eritrocitima, ima funkciju prenosa
O2 ,
sadri 4 subjedinice (proteinska struktura sa
hem grupom koja sadri Fe 2+) koje mogu
vezati 4 atoma kiseonika.
CO karboksihemoglobin
nitriti, nitrati methemoglobin (Fe 3+)
onemoguena distribucija O2 ANOKSIJA
Transportni, depo proteini II
feritin (Fe)
ceruloplazmin, kuprein (Cu)
metalotioneini (Zn, Cu)

strukturni i transmembranski proteini

(primer Hg)
vezivanje za funkcionalne grupe,
istiskivanje esencijalnih katjona
 Enzimi - meta otrova
enzimi katalizuju reakcije
supstrat + enzim (aktivno mesto) = produkt + enzim (hemijski neizmenjen)

Vmax

Vmax/2

Km Koncentracija supstrata

ksenobiotik + enzim (alosterno mesto) smanjena aktivnost enzima

 Inhibicija enzima dejstvom otrova
Reverzibilna (nekovalentna Ireverzibilna (kovalentna
veza) veza)
kompetitivna inhibicija: inhibicija
poveana je Km acetilholineseraze
(smanjen afinitet), a
Vmax (kapacitet) je organofosfatima (OF)
nepromenjena ako ima vezivanjem za aktivno
dosta supstrata mesto enzima
nekompetitivna inhibicija: vezivanjem organofosfata
(vezivanje otrova za enzim se fosforilie
alosterno mesto) Km je
ista ali je smanjena Vmax
Dejstvo otrova na enzime
-primeri-
 Inhibicija acetilholinesteraze
AChE AChE

SER SER

O O
S
H P R
O H X
O R O
O R O
X P
R
S (O)
Fosforilacija
AChE
X = naputajua grupa O
O
O
P

O S
N+

Paration O-
 P450
citohrom P450-zavisne monooksigenaze
velika grupa metabolikih enzima jetre
vana grupa enzima u toksikologiji
indukcija ili inhibicija
pojaan metabolizam stvaranje
toksinijih ili manje toksinih jedinjenja
usporen metabolizam pozitivno ili
negativno?
 Indukcija citohrom P450
Fenobarbiton + kokain

Fenobarbiton indukcija CYP

Indukcija CYP metabolizam kokaina
(N-oksidativna bioaktivacija, N-demetilacija)

Metaboliti kokaina
hepatotoksinost
 Indukcija citohrom P450

Cl O Cl
Aril-hidrokarbon
receptor (AhR) Dioksin-Ah receptor
(transkripcioni
Cl O Cl faktor u citoplazmi i
kompleks
jedru-ksenosenzor)
TCDD
(2,3,7,8-tetrahlorodibenzo-p-dioksin)
Sporedni proizvod pri proizvodnji ili DNK
unitavanju nekih hlorovanih
organskih jedinjenja - toksikant

poveana transkripcija gena za

sintezu CYP1A (koja ga metabolie)
 Inhibicija citohrom P450
Glavni uzrok interakcija meu lekovima (akutna
polimedikmentozna trovanja!)
Direktna inhibicija
1. Kompeticija izmeu dva ksenobiotika koji se metaboliu sa
istim enzimom (npr. omeprazol i diazepam)
2. Inhibitor nije supstrat za dati enzim, ali se vezuje za njega i
ometa metabolizam drugog ksenobiotika
Indirektna inhibicija
Metabolizam zavisna inhibicija (P450 prevodi ksenobiotik u
metabolit koji inhibira enzim)

sastojci grejpfruta - nifedipin

 glukoza etanol
NAD
masti NADH2
glikogen glukoza-6-fosfat
acetaldehid
NAD NADH2 NAD
NADH2
glicerol dihidroksi gliceraldehid-3-fosfat acetat
aceton
fosfat

NAD NADH2
piruvat AcCoA acetoacetil
laktat
CoA

NAD acetoacetat
aminokiseline NADH2
oksalacetat NADH2
Troenje NAD NAD
NADH2
kofaktora tokom Krebsov citrat
metabolizma ciklus NAD -hidroksibutirat
etanola NAD NADH2
aminokiseline
Dejstvo otrova na receptore
-primeri-
 Acetilholinski receptori
Stimulacija muskarinskih holinergikih receptora
muskarin

Kompetitivna blokada
tubokurarin (miini relaksant) - antagonist
acetiholinskog receptora na postsinaptikoj
membrani
 GABA receptor - aktivacija
barbiturati,
benzodiazepini, etanol
vezuju se za specifina
mesta na jonskim
kanalima GABA A
receptor, dre ih
otvorenim, ime
omoguavaju ulazak Cl- i
posledinu
hiperpolarizaciju
membrane
postsinaptikih neurona
 Antagonisti GABA receptora
Cl- blokiraju ulazak Cl- izazivaju konvulzije

Organohlorni insekticidi:
ciklodieni
GABA A receptor g-heksahlorcikloheksan (lindan)
alfa-endosulfan
dieldrin
aldrin

Koriste receptorsko mesto za pikrotoksin (alkaloid) - nekompetitivni

antagonist GABA A receptora (pokuaji terapije trovanja barbituratima)
 Kovalentno vezivanje

Nekovalentno, reverzibilno vezivanje za konstituente

elije (vodonine veze, jonske veze...) - aktiviraju ili
inaktiviraju enzime, membranske receptore, intraelijske
receptore, jonske kanale...
Kovalentno, ireverzibilno vezivanje za konstituente elije
(esto prethodi konverzija do reaktivnog intermedijera
putem bioaktivacije)
vezivanje za DNK, proteine, jedinjenja male molekulske mase

Inkorporiranje u endogena jedinjenja

 Primer kovalentnog vezivanja za
proteine
Metil izocijanat intermedijer pri proizvodnji pesticida
(akcidentalno trovanje, Bopal, Indija, 1984)
Oteenja disajnih puteva i edem plua

..
 Primer kovalentnog vezivanja za
DNK
Mesta kovalentnog vezivanja elektrofilnih metabolita
razliitih otrova za guanin spreeno stvaranje
vodoninih veza sa odgovarajuom bazom.

aflatoksin

policiklini
ugljovodonici
aromatini amini
PAH
tamoksifen

guanin
 Bioaktivacija otrova
Nastanak reaktivnih metabolita
Primer: 2-naftilamin (pri dobijanju anilina, industrija boja); karcinom
mokrane beike (visoko reaktivni, elektrofilni nitrenijum jon)

CYP UGT

2 - naftilamin
hidroliza
urin pH

UGT uridin-difosfat
glukuronozil transferaza
kovalentno nitrenijum jon
(N-hidroksil do N-glukuronida) vezivanje za DNK
 Primer - reaktivni intermedijer
aflatoksina
O O O O
CYP1A2
O CYP3A4 O

O
O O OCH3 OCH3
O O

aflatoksin B1 aflatoksin B1 epoksid

GSH
H2O
Inaktivacija - konjugacija
sa glutationom
Otvaranje epoksidnog
Kovalentno vezivanje za DNK prstena (OH grupe)
Interakcije sa bioelementima
Koji ksenobiotici (otrovi) e interreagovati?
metali, helatni agensi, ugljen disulfid,
disulfiram
Kompeticija za ista mesta vezivanja
Transportni sistemi
Faktori koji utiu na interakcije
 Inhibicija mitohondrijalnih enzima
Cijanidi: primer energetskog iscrpljivanja elije (nedovoljna
produkcija ATP)
Hem a3 (deo kompleksa IV) sadri Fe 3+ mesto vezivanja
CN-
Interakcije sa jonskim transportom

Mesto delovanja otrova: jonski nosai i jonski

kanali (reguliu prolaz jona kroz membrane)

Kompeticija za prolaz - inhibicija jonskog

fiziolokog transporta

Menjanje konformacije kanalskih peptida

 Primer digitoksin
Poremeaj K/Na pumpe remeti Na/Ca transport
Ca u eliji prekomerna stimulacija elije
 Poremeaj elijske homeostaze
kalcijuma
Nivo slobodnog Ca u eliji je strogo kontrolisan (odrava se
na vrlo niskom nivou).
Veliki broj elijskih sistema odrava razliku intra i
ekstracelularnog kalcijuma
Ksenobiotici:
povean ulaz Ca (npr. nespecifino - permeabilnosti plazma
membrane)
smanjen izlazak Ca (poremeaj funkcije kalcijumove pumpe u
membrani elije)
porast slobodnog Ca u citoplazmi usled naruavanja
membrane endoplazmatinog retikuluma (npr. dejstvom
slobodnih radikala ili kovalentnim vezivanjem otrova)
 Primer - tributiltin (TBT)
Organsko jedinjenje kalaja, biocid, iroko rasprostranjen u
ivotnoj sredini, nekontrolisana upotreba

TBT reaguje sa
tiolnim grupama
iz Ca pumpe na
membrani ER i
inaktivira je
Ca iz ER prelazi
u citoplazmu
Nekroza ili
apoptoza
 Ireverzibilno oteenje elije ulaskom Ca2+
Povean
ulaz Ca 2+ ksenobiotici
Acidoza -

Naruavanje [Ca2+] u Ca2+ - ulaz

citoskeleta citosolu u mitohondrije
Naruavanje
Aktivacija
elijske
arhitetkture fosfolipaza

Poveana membranska permeabilnost

Bubrenje
elije Bubrenje endoplazmatinog
Bubrenje mitohondrija retikuluma

Oksidativna Point of no return

fosforilacija Taka bez povratka

zgrunjavanje
i mitohondrijalna
kalcifikacija
 Oksidativni stres
Fizioloki proces
Otrovi:
Direktno dejstvo
Nastanak slobodnih radikala
Indirektno dejstvo
Antioksidativni sistem zatite (primarni i
sekundarni)
 Radikali
O2- superoksid
HO hidroksil
RO2 peroksil
ROS
RO alkoksil
HO2 hidroperoksil
NO azot oksid (azot monoksid)
RNS NO2 azot dioksid
ONOO peroksinitrit
R alkil radikali
(CCl3 trihlormetil radikal)
RCS RO alkoksil radikal
ROO peroksil radikal
RS tiil radikali
RSS GS glutatiil radikal
GSSG- diglutation anjon radikal
 Otrov oksidativni stres

nastanak slobodnih radikala

Fentonova reakcija
lipidna peroksidacija
inhibicija/aktivacija antioksidativnih enzima
pojaani utroak glutationa i drugih
antioksidanasa (vitamini E, C)
metalotioneini
 oksidovani
Parakvat parakvat NADPH

Nastajanje redukovani
parakvat
NADP

katalaza
slobodnih O2

radikala oksidovani
parakvat
superoksid
dizmutaza + O2

selen polinezasieni lipidi

lipidna peroksidacija

GSH
peroksidaza lipidni slobodni radikali
lipidni alkoholi lipidni peroksidi vitamin E

GSSG GSH

oteenja membrane
GSH izazvana slobodnim radikalima
Reduktaza

NADPH malondialdehid
NADP MDA

glukoza-6-fosfat
dehidrogenaza
 Doksorubicin

DR hinon Nastajanje
O slobodnih radikala

NADPH R R' O2

O
mikrozomi
DR semi hinon
OH

NADP R R' O2

O
 Fentonova reakcija
Men+ + H2O2 Me(n+1)+ HO+ OH-

Gvoe, bakar, mangan

Otrovi koji deluju na kretanje ovih metala
indirektni uesnici u oksidativnom stresu
Primer: toksini metali
 Lipidna peroksidacija
Najbolje proueno oksidativno oteenje
Zahvata elijske membrane, lipoproteine i druge molekule
koji sadre lipide fragmentacija lanaca masnih kiselina
Nastaju primarni visokoreaktivni intermedijeri: alkil, peroksi i
alkoksi radikali, lipidni hidroperoksidi daljom razgradnjom
sekundarni produkti npr. malondialdehid (MDA)
Posledice:
fluidnost biolokih membrana pojaana
propustljivost jona i inaktivacija membranskih enzima
ruptura lizozomskih membrana oslobaanje
hidrolitikih enzima dalja oteenja elije
 Lipidna peroksidacija
+ OH + H2O
X Y X Y
H

Nastali lipidni radikal je stabilan, jer je slobodni elektron

delokalizovan svojom rezonantnom strukturom

X Y X Y X Y


O
Lipidni radikal reaguje brzo sa kiseonikom O

+ O2
X Y X Y
Stvoren lipidni peroksil radikal prima vodonik od sledee polinezasiene
masne kiseline i stvara se lipidni hidroperoksid i novi lipidni radikal
O H
O
O O

+ + X' Y'
X Y X' Y' X Y
H
 Oksidativne promene na
proteinima
Dejstvo reaktivnih vrsta kiseonika na proteine
Promene na bonim lancima aminokiselina; manji
proteini proteini vee molekulske mase (unakrsno
protein-protein vezivanje); fragmentacija polipeptidnih
lanaca
Primer: hidroksilni radikal reaguje sa alfa-ugljenikovim
atomom (u prisustvu kiseonika) peroksi radikal
dalja destrukcija peptidne veze
Indirektno: interakcija proteina sa produktima lipidne
peroksidacije. MDA reaguje sa sulfhidrilnim i amino
grupama proteina strukturne i funkcionalne promene
Oksidativne promene na DNK
Oteenja DNK: prekidi jednog ili oba lanca, razmene izmeu
sestrinskih hromatida, DNK-DNK ili DNK-protein unakrsno povezivanje,
modifikacija baza, oteenja na eernom ili fosfatnom delu
polinukleotidnog lanca...
Naruava se replikacija, transkripcija i translacija i prouzrokuju mutacije,
apoptozu i razvoj tumora
Hidroksilni radikal najodogovorniji za efekte na DNK eerna
komponenta gubi OH, DNK baza dobija OH glavni produkt oksidacije
8-OHdG (8-hidroksideoksiguanozin) (uzronik takastih mutacija)
Indirektno: preko lipidne peroksidacije, pretpostavlja se da se
malondialdehid kovalentno vezuje za lanac DNK prekid strukture
DNK lanca
 Inhibicija antioksidativnih enzima
kadmijumom
Antioksidativni enzimi su metal-zavisni (sadre
jone metala u aktivnom centu):
Superoksid dismutaza (SOD): Cu/Zn-SOD (citosol) ili
Mn-SOD (mitohondrije),
Katalaza (CAT) i glutation reduktaza (GR): Fe
Glutation peroksidaza (GSH-Px): kofaktor je Se.
Primer - Cd
takmienje sa bioelementima za iste poloaje
vezivanja na enzimima i vezivanje za enzimske
kofaktore
promene u regulaciji transkripcije i translacije ovih
enzima
 Metalotioneini
Proteini male molekulske mase, bogati tiolnim grupama koje
vezuju jone metala (fizioloka uloga u odravanju homeostaze
Zn i Cu; pri trovanju vezuju Cd i Hg)
Ovi metali i indikuju njihovu sintezu

Pojaano se sintetiu tokom oksidativnog stresa i imaju

antioksidativnu ulogu
MT grade metal-tiolatne grupe koje reaguju sa slobodnim
radikalima O2- i HO

povean sadraj MT u jetri po akutnom trovanju:

Parakvat tokom redoks metabolizma stvara O2-
Kadmijum indirektno stvara HO kroz poveanje sadraja Fe ili Cu
(istiskivanjem iz proteinskih struktura)
Najznaajnije neenzimske komponente
antioksidativne zatite

Vit. E
CoQH
Vit. C
LOO
GSH

Glutation redoks LOOH

ciklus

GSSG Vit. C CoQH2

Vit. E
Kadmijum: putevi nastanka
oksidativnog stresa

H2O
NO
OONO- O2
Konjugovani
Cd2+ Cd2+ produkti
H2O
CAT
+e- Cd2+
GSH-Px GST
O2 O2 -
SOD
H2O2
GSSG GSH Cd2+

GR Cd2+
Fe3+ Cu2+

Cd2+

OH

Oksidativno oteenje Lipidna

proteina peroksidacija
Oksidativno
oteenje DNK
 Promene u elijskoj homeostazi

homeostaza
Izmenjena
reverziblno

homeostaze

Normalna
nivoi

homeostaza
degradacija
ireverzibilno

Taka bez povratka nekroza

vreme

oteenje
 Faze u homeostatskim promenama
1 Inicijalna faza: Promene u elijskom okruenju
koje posledino determiniu elijski odgovor na
oteenje.
2 Reverzibilna faza: elijske promene koje su
reverzibilne po uklanjanju uzronika oteenja ili
reparaciji oteenog.
3 Ireverzibilna faza: Promene u eliji koje se
deavaju na kritinom nivou take bez povratka
4 Nekrotina/apoptotina faza: Karakteristine
degenerativne promene koje vode elijskoj smrti
 elijska smrt
NEKROZA
-patoloki dogaaj-
biohemijski uzronici nekroze:
inhibicija sinteze proteina,
vezivanje reaktivnih metabolita
za proteine, lipidna
peroksidacija, poremeaj nivoa
Ca2+, naruena ravnotea
izmene Na+ i K +...
aktivira se kao brz odgovor u
sluaju izrazitih promena, teih
trovanja
APOPTOZA
-fizioloki dogaaj-
odrava homeostazu, deluje
suprotno elijama u deobi
aktivira se u patolokim
dogaajima ili dejstvom otrova
udruena je sa aktiviranjem
genetskog programa,
programirane elijske smrti
odloena forma elijske smrti
(insulti manje jaine)
Apoptoza

Nekroza
 Najznaajniji morfoloki kriterijumi
NEKROZA
Bubrenje elije i organela
Dezintegracija organela, ruptura
plazme membrane
Izlazak elijskog sadraja u
ekstraelijski prostor
Degradacija DNK praena
proteolizom histona
Uglavnom pogaa velike grupe
elija
Praena je inflamatornom
reakcijom
APOPTOZA
Zgunjavanje citoplazme i
kondenzacija jedra
Fragmentacija jedra
Fuzija ER sa plazma
membranom
elijska fragmentacija
(apoptotina telaca) intaktne
citoplazmatske organele i
fragmenti jedra
 Inhibicija apoptoze

Poremeaj u balansu izmeu elijske proliferacije i

smrti elije (apoptoze)
Porast tkivne mase i hiperplazija organa (primer
fenobarbiton) - reverzibilan proces, nakon prestanka
izloenosti ksenobiotiku
Tumor promoteri otrovi koji inhibiraju apoptozu i
omoguavaju preivljavanje elija sa oteenom
DNK, mutaciju i nastanak preneoplastinih elija
 Mehanizmi toksinosti kadmijuma
Interakcije sa bioelementima

Promene na proteinima Promene u funkciji enzima

bogatim sulfhidrilnim grupama

Promene u strukturi DNK Indukcija oksidativnog stresa

Cd
Promene u genskoj ekspresiji
Promene na elijskoj membrani

Karcinogeneza Indukcija i inhibicija apoptoze