OPŠTI ASPEKTI

ENZIMSKE KATALIZE

Prof. dr Marija Matić

 ENZIMI SU KATALIZATORI HEMIJSKIH REAKCIJA U ĆELIJI

 Osnovna karakteristika žive ćelije je

neprekidna razmena materije i energije sa
okolinom.

 Unutar ćelije molekuli podležu

hemijskim promenama:
 razgradnja na gradivne molekule
 gradivni elementi za složenije molekule.

 Da bi ćelija funkcionisala kao

organizovan sistem neophodna je kontrola
brzine i obima hemijskih reakcija, kako u
vremenu tako i u prostoru - moguće jer se
reakcije u ćeliji odvijaju uz učešće
bioloških katalizatora - enzima.

 Oko 4000 reakcija u ćelijama koje

katališu enzimi, gotovo svaka je
omogućena postojanjem enzima
specifičnog za tu reakciju.
 ISTORIJAT ENZIMA

 1700ih - otkrivena biološka kataliza na primeru varenja mesa želudačnim sokom

 1833. – Payen i Persoz sprovode ispitivanje prevođenja skroba u šećer u

prisustvu pljuvačke i ekstrakta biljaka - diastaza

 1850ih - Louis Pasteur je zaključio da je fermentacija šećera u alkohol pomoću

kvasca katalizovana tzv. fermentima koji su sastavni deo ćelija kvasca,
fermentacija moguća samo u živom organizmu

 1876. -Frederick W. Kühne uvodi pojam ENZIMA (grčki en-u i zyme-kvasac)

za fermente koji su izolovani iz živog organizma u kom su i nastali

 1897. – braća Buchner su pokazala da ekstrakti kvasca vrše fermentaciju

šećera u alkohol i kada se odvoje od matične ćelije

 1915. – Richard Willstatter : “enzimi su posebna vrsta još uvek

neidentifikovanih jedinjenja”
 ISTORIJAT ENZIMA

 1926. – James Sumner je izolovao ureazu i pokazao da se kristali ureaze

najvećim delom sastoje od proteina - postulirao da su svi enzimi proteini

 1929. - John Northrop je izvršio kristalizaciju pepsina, veliki broj dokaza o

proteinskoj strukturi

 1930. – JBS Haldane napisao članak ENZIMI u kome je izneo svoju

pretpostavku da se između Enzima i Supstrata uspostavljaju slabe veze
koje su odgovorne za katalizu - osnova razumevanja enzimske katalize

1931-33. – Moses Kunitz izoluje i vrši kristalizaciju tripsina, himotripsina,

karboksipeptidaze, heksokinaze, za sve pokazano da su proteini

 1965. – DC Phillips izvršio kristalizaciju lizozima, enzima prisutnog u suzama,

pljuvačci i belancetu, koji ima sposobnost razgradnje omotača nekih
bakterija; time je otvoreno novo polje istraživanja tzv. strukturna
biologija (kako enzimi rade na molekularnom nivou ?)
 KATALIZATORI HEMIJSKIH REAKCIJA

 Katalizatori utiču na brzinu odvijanja reakcije tako što snižavaju

potrebnu energiju aktivacije (Ea)
 Katalizatori se ne troše, niti stvaraju za vreme odvijanja katalisane
reakcije
 Katalizatori samo menjaju brzinu postizanja ravnotežnog stanja, ali ne
menjaju smer reakcije
 KATALIZATORI HEMIJSKIH REAKCIJA
 Enzimi, kao biološki katalizatori, poseduju sve navedene osobine
katalizatora
 Enzimi ubrzavaju hemijske reakcije tako što samnjuju Ea, ali ne utiču na
promenu slobodne energije katalisane reakcije, niti menjaju konstantu
ravnoteže date reakcije
 Najčešće su proteini, a mogu biti i katalitičke RNK tj. RNK enzimi ili
ribozimi (1980. TR Cech otkrio katalitičku ulogu, 1982. K.Kruger uveo
pojam ribozima)

Nekatalisana reakcija Katalisana reakcija

 ENZIMI SNIŽAVAJU ENERGIJU AKTIVACIJE

Slobodna energija (G) – razlika

Prelazno stanje ES između entalpije i proizvoda
temperature i entropije
G=H-TS
ΔG (nekatalisano) Entalpija (H) – sadržaj toplote
sistema, zbir unutrašnje energije
ΔG (katalisano)
i proizvoda pritiska i zapremine
Slobodna energija

Entropija (S) – mera

Supstrat
neuređenosti sistema
ΔG
reakcije

Proizvod Δ G<0 – egzergona reakcija,

odvija se spontano
Δ G=0 - sistem je u ravnoteži
Tok hemijske reakcije Δ G>0 – endergona reakcija,
moguća ako se sistemu dovede
energija
 DIJAGRAM PROMENE SLOBODNE ENERGIJE
U REAKCIJI KATALISANOJ HIMOTRIPSINOM
 enzim varenja
 u digestivnom traktu katališe
hidrolizu određenih peptidnih
veza (fenilalanin, tirozin ili
triptofan) u denaturisanom
proteinu
 serin proteaza – koristi serin
u aktivnom mestu u cilju
formiranja kovalentnog
intermedijera u toku proteolize
 KLASIFIKACIJA ENZIMA

Nazivi enzima mogu biti:

 Trivijalni (ureaza)
 Nazivi na osnovu sistematizacije Internacionalne unije za biohemiju i
molekularnu biologiju (IUBMB) – supstrat i tip reakcije-aza
 Nazivi na osnovu klasifikacije Enzimske komisije (EC broj ili Enzyme
Commission number) - šest klasa

EC broj enzima opisuje:

Laktat dehidrogenaza
1.1.1.27 Serijski broj enzima
Klasa, vrsta
reakcije
(oksidoreduktaza) Odgovara
Podlasa, najčešće akceptorskoj grupi
odgovara vrsti grupe (NAD+ ili NADP)
na koju enzim deluje
(CH grupa)
Klasa Tip reakcije Glavne podgrupe
1. Oksidoreduktaze Oksido-redukcije Dehidrogenaze, oksidaze,
oksigenaze, reduktaze,
peroksidaze, hidroksilaze,
katalaze
2. Transferaze Prenos grupa sa donora na Transketolaze i
akceptor transaldolaze, acil-, metil-,
glukozil- i fosforil-
transferaze, kinaze,
fosfomutaze
3. Hidrolaze Prenos grupa sa donora na Esteraze, glukozidaze,
molekul vode tj. hidrolitičko peptidaze, fosfataze,
razlaganje C-O, C-N, O-P i C-S fosfolipaze, amidaze, tiolaze,
veza deaminaze, ribonukleaze
4. Liaze Reakcija uvođenja ili uklanjanja Dekarboksilaze, aldolaze,
elemenata vode, amonijaka ili hidrataze, dehidrataze,
ugljen-dioksida sintaze

5. Izomeraze Reakcije premeštanja unutar Racemaze, epimeraze,

molekula (inverzija na izomeraze, mutaze
asimetričnom C atomu,
premeštanje grupa u molekulu)
6. Ligaze Spajanje dva molekula uz Sintetaze, karboksilaze
cepanje fosfatne veze ATP-a
 FAMILIJE ENZIMA

 Enzimi koji pripadaju istoj familiji imaju u aktivnom mestu istu

katalitičku aktivnu grupu i katališu isti tip reakcije, imaju različite
supstrate i razlikuju se po fiziko-hemijskim i kinetskim osobinama.

 serin proteaze (kao katalitičku grupu koriste –OH grupu serina,

npr. tripsin, himotripsin, elastaze, enteropeptidaze, trombin)
 NIVOI STRUKTURE PROTEINA

Primarna Sekundarna Tercijerna Kvaternerna

struktura struktura struktura struktura
Redosled, vrsta -heliks i β-nabrana Uvijanje jednog Udruživanje
i broj ploča, nastaje polipeptidnog lanca u subjedinica ne
AK koje su povezivanjem AK fibrilarnu ili globularnu kovalentnim vezama
međusobno (1-4) vodoničnim strukturu nastalo
povezane vezama povezivanjem
peptidnim pojedinačnih udaljenih
vezama AK kovalentnim ili ne
kovalentnim vezama
 STRUKTURA ENZIMA

 prosti
 složeni
 multienzimski kompleksi

 Holoenzim je katalitički potpuno aktivan enzim, sa vezanim

koenzimom ili jonom metala za proteinski deo enzima ili apoenzim.

 Prostetske grupe, kofaktori i koenzimi su mali neproteinski molekuli

i metalni joni koji učestvuju direktno u vezivanju supstrata ili katalizi
I Prostetske grupe
 čvrsto, stabilno integrisane u strukturu proteina kovalentnim ili nekovalentnim
vezama
 najčešće su metalni joni prostetske grupe (metaloenzimi) ili organski molekuli
poreklom iz vitamina
 piridoksal-fosfat, FMN, FAD, tiamin-pirofosfat, biotin i metalni joni (Co, Cu,
Mg, Mn, Se i Zn)

II Kofaktori
 Vezuju se reverzibilno za enzim ili supstrat (npr. ATP) u toku reakcije
 Moraju biti prisutni u okruženju enzima da bi se reakcija odigrala
 Najčešće su kofaktori metalni joni (enzimi koji se aktiviraju metalnim jonima)

III Koenzimi
 Funkcionišu kao prenisioci atoma ili grupa sa mesta stvaranja do mesta
korišćenja (eng. Shuttle Transpoters)
 Najčešći supstrati koji se prenose putem koenzima: H+ atom, H-jon (NAD(P)+),
metil-grupe (folat), acil-grupe (koenzim A)

 Kosupstrati imaju afinitet prema enzimu sličan kao kod supstrata (drugi
supstrat)
 MULTIENZIMSKI SISTEMI

 Veći broj enzima i koenzima, katališe reakcije u nizu (piruvat

dehidrogenazni komples,  - ketoglutarat dehidrogenazni kompleks,
sintaza masnih kiselina)
 Fizički blisko orijentisani

Piruvat dehidrogenazni kompleks Sintaza masnih kiselina

 NEORGANSKI KOFAKTORI ENZIMA

Cu2+ Citohrom oksidaza

Fe2+/Fe3+ Citohrom oksidaza, katalaza, peroksidaza

K+ Piruvat kinaza

Mg2+ Heksokinaza, glukozo 6-fosfataza, piruvat kinaza

Mn2+ Arginaza, ribonukleotid reduktaza, SOD

Mo Nitrat reduktaza

Ni2+ Ureaza

Se Glutation peroksidaza

Karbon anhidraza, alkohol dehidrogenaza,

Zn2+
karboksipeptidaza A i B
 ULOGA KOENZIMA U ENZIMSKOJ KATALIZI

Oboljenje vezano za
Prostetična grupa Prenosi Unos u organizam
nedostatak

Aktivirane
Tiamin pirofosfat Tiamin, vitamin B1 Beri-beri
oksi-grupe

Redukcione
FAD/FMN Riboflavin, vitamin B2 Arabino-flavinoza
ekvivalente

Piridoksal fosfat Amino kiseline Piridoksin, vitamin B6

Različite
Kobalamin ugljenične Vitamin B12 Perniciozna anemija
grupe

Lipoamid Acil grupe Lipoična kiselina

Biotin CO2 Biotin

 ULOGA KOENZIMA U ENZIMSKOJ KATALIZI

Oboljenje vezano za
Kosupstrat Prenosi Unos u organizam
nedostatak
Fosfatnu
ATP /
grupu
Redukujuće
NAD/NADP Niacin Pelagra
ekvivalente

CoA Acil grupu Pantotenat

Tetrahidrofolat 1-ugljeničnu Poremećaji uočljivi na

Folna kiselina
FH4 komponentu rođenju

S-adenozil metionin Metil grupu Metionin

Polisaharidne
UDP- glukoza /
monomere
 TIAMIN PIROFOSFAT (TPP)

 Prekursor TPP je vitamin B1 - tiamin (uz utrošak ATP-a)

 Izvor: meso

 TPP ulazi u sastav enzimskih kompleksa za dekarboksilaciju a-keto kiselina

(piruvat dehidrogenaze i a-ketoglutarat dehidrogenaze), kao i transketolaze u
putu pentozo-fosfata (prenosi aktiviranu aldehidnu jedinicu) - ugroženo
stvaranje energije u ćeliji pri nedostatku tiamina
 Poremećaji: beri-beri (nakupljanje tečnosti, bolovi, paraliza), neuropatije
(lokalizovan u membrani perifernog nerva, značajan u sintezi acetil-holina)
 FLAVIN KOENZIMI (FMN i FAD)

 Prekursor flavin koenzima je riboflavin (B2)

 Životinje ga ne sintetišu
 Tokom resorpcije u GIT-u se fosforiliše u
riboflavin fosfat ili riboflavin mononukleotid

Esterifikovana
 Flavin mononukleotid (FMN) i flavin adenin
5-OH ribitola dinukleotid (FAD), kao tipične prostetske
grupe enzima učestvuju u reakcijama
oksido-redukcije, u prenosu pojedinačnih
elektrona i protona
Adenin
 FAD je strukturni analog NAD, po tome
što ima adenozin vezan pirofosfatnom vezom
za heterociklični prsten, u ovom slučaju
riboflavin
Fosfat

Riboza  Vezani su kovalentno/nekovalentno za

proteinski deo odgovarajuće dehidrogenaze,
čvršće od niacinskih koenzima
NIKOTINAMID-ADENIN DINUKLEOTID (NAD+)

 Prekursori za NAD+ i NADP+ mogu biti

nikotinska kiselina i nikotinamid (niacin –
piridin 3 karboksilna kiselina ili B3)
 Većina životinja ga sintetiše iz triptofana
 Koenzimi brojnih dehidrogenaza u citosolu
i mitohondrijama
 Učestvuju u reakcijama oksido-
redukcije kao pokretni prenosioci elektrona,
odnosno kao drugi supstrati (kosupstrati)
 NAD+ kao koenzim uglavnom učestvuje u
kataboličkim, dok NADP+ kao koenzim
učestvuje u anaboličkim reakcijama
 Redukcioni ekvivalenti se primaju na
piridinski prsten i to UVEK u paru
 Nedostatak: pelagra (3D- dermatitis,
diarea, demencija)
 Primeri: laktat dehidrogenaza, alkohol
dehidrogenaza
 KOENZIM A (CoA)

Acetil grupa
 Prekursor CoA je pantotenska kiselina
β-merkaptoetilamin (vitamin B5)
 Učestvuje u brojnim reakcijama
Adenin prenosa acil-grupa (reakcijama oksidacije
i sinteze MK, reakcija acetilacije i
Pantotenska
oksidativne dekarboksilacije)
kiselina
 Zajednički proizvod katabolizma lipida,
ugljenih hidrata i proteina, a i polazni
materijal u procesima sinteze (masne
kiseline i holesterol)
D-riboza
 Reaktivna
grupa
PIRIDOKSAL FOSFAT (B6)

 Prekursori mogu biti piridoksin,

Piridoksal fosfat (PLP) piridoksamin ili piridoksal – isti značaj i
mogu da se interkonvertuju
 Piridoksal fosfat (PLP) ima ključnu
ulogu u reakcijama sinteze, razgradnje i
interkonverzije amino kiselina
 Prostetska grupa svih
aminotranseferaza/transaminaza, nekih
dekarboksilaza i dehidrataza
 kofaktor fosforilaze (glikogenoliza) i
pri kondenzaciji glicina i sukcinil-CoA
(sinteza hema)
 deficit je veoma redak
 TETRAHIDROFOLAT (THF)
Folna
kiselina
 Folna kiselina (B9) je prekursor
tetrahidrofolata (THF)
 THF i različiti derivati (metenil
N5-Metil
tetrahidrofolat
THF, metilen THF i formil THF)
čine pul THF
 Uloga u prenosu i
interkonverziji grupa sa jednim
ugljenikovim atomom
 Reakcije u putu sinteze purina i
rekacije prevođenja deoksiuridilata
(dUMP) u deoksitimidilat (dTMP)
 Nedovoljan unos folata u
organizam dovodi do smanjenja
sinteze DNK i zaustavljanja deoba
ćelija, sa “megaloblastnim“
promenama u veličini i izgledu
jedra (megaloblastna anemija)
 KOBALAMIN (CoB12)

 Samo dva enzimska sistema zahtevaju

prisustvo kofaktora koji potiču od
kobalamina (vitamina B12):
 Homocistein:tetrahiodrofolat
metil transefaraza- kofaktor je
metil-kobalamin
 Metilmalonil koenzim A mutaza-
kofaktor je 5-deoksiadenozil-
kobalamin
 Nedostatak vitamina B12 dovodi do
pojave megaloblastne anemije
(poremećaj u regenerisanju
metil kobalamin
Homocistein Metionin tetrahidrofolne kiseline) i perifernih
u citoplazmi neuropatija (poremećaj u metabolizmu
lipida zbog nedostatka 5-deoksi
adenozil-kobalamina)
5 adenozil Sukcinil
Metilmalonil CoA
kobalamin CoA
u mitohondrijama
ADENOZIN TRIFOSFAT (ATP)

 Sintetiše se de novo u svim

ćelijama sisara

 Kao kosupstrat ga koriste

KINAZE (npr. glukokinaza)

 Modulator enzimske aktivnosti -

alosterni efektor
 AKTIVNO MESTO ENZIMA

Mesta za vezivanje na molekulu enzima:

 Aktivno mesto
 Alosterno mesto

Specifičnost enzima: aktivno mesto

Aktivno mesto enzima se formira u tercijernoj strukturi enzima, prostornim
približavanjem aminokiselina (AK) koje u primarnoj strukturi mogu biti veoma
udaljene jedna od druge. Funkcionalne grupe AK koje ulaze u sastav aktivnog
mesta omogućavaju prepoznavanje odgovarajućeg supstrata, a time i
specifičnost delovanja enzima.
 AKTIVNO MESTO ENZIMA

Funkcije aktivnog mesta :

 Vezivanje supstrata
 Kataliza

Mesto za vezivanje i katalitički centar se mogu preklapati, mada je najčešće

mesto za vezivanje veće od katalitičkog centra.
 SPECIFIČNOST ENZIMA

 APSOLUTNA- ureaza, piruvat

kinaza

 ISTA REAKCIJA, SRODAN

SUPSTRAT- heksokinaze

 GRUPNA- fosfataze

 STEREOSPECIFIČNOST
 AKTIVNO MESTO ENZIMA

 1880. Charles-Adolphe Wurtz pokazao da je stvaranje ES kompleksa centralni

događaj u enzimskoj katalizi
 polazna tačka u matematičkoj analizi enzimske kinetike
 REAKCIJA U AKTIVNOM MESTU ENZIMA

 U aktivnom mestu enzima se nalaze katalitički centar i mesto za vezivanje

supstrata, a mogu biti prisutni i kofaktori
 Supstrat formira veze sa AK u veznom mestu, što indukuje konformacionu
promenu aktivnog mesta enzima
 Funkcionalne grupe AK i kofaktori učestvuju u formiranju kompleksa prelaznog
stanja, koji je stabilizovan dodatnim nekovalentnim vezama sa enzimom
 Nakon oslobađanja proizvoda, enzim se vraća u prvobitno stanje
 NEKE FUNKCIONALNE GRUPE
KOJE ULAZE U SASTAV AKTIVNOG MESTA ENZIMA
 INTERAKCIJA ENZIM - SUPSTRAT

Aktivno
mesto

Model ključ-brava
(1894, Fischer)

MODEL KLJUČ BRAVA

Aktivno Slabe
mesto sile

Model indukovanog
prilagođavanja
(1958, Koshland)
MODEL INDUKOVANOG
PRILAGOĐAVANJA
KOŠLANDOVA TEORIJA INDUKOVANOG PRILAGOĐAVANJA
 na početku reakcije enzim i supstrat su samo
delimično komplementarni
 u toku stvaranja ES kompleksa enzim indukuje
konformacionu promenu supstrata tako da se
konformacija supstrata približava konformaciji
prelaznog stanja
 vezivanje supstrata indukuje uspostavljanje
termodinamski povoljnih nekovalentnih veza
(vodonične, hidrofobne, Van der Walsove i
elektrostatske), čijim stvaranjem se oslobađa
energija vezivanja, na čiji račun se smanjuje Ea
 inicijalno vezivanje supstrata za enzim dovodi do
konformacione promene molekula enzima, što
omogućava postavljanje funkcionalnih grupa AK u
aktivnom mestu u odgovarajući položaj, od značaja za
proces katalize
 u konformaciji prelaznog stanja su molekuli
optimalno komplementarni
 Interakcija između enzima i supstrata dovodi do
konformacionih promena i u molekulu enzima i u
molekulu supstrata, čime molekuli postaju
optimalno komplementarni
 MEHANIZMI ENZIMSKE KATALIZE
 Naprezanje supstrata – vezivanje supstrata za enzim dovodi do
konformacionih promena na molekulu supstrata, a nastalo “naprezanje”
supstrata slabi veze što dovodi do njegove destabilizacije i doprinosi
postizanju konformacije prelaznog stanja

 Kiselinsko-bazna kataliza (kiselo-bazna) – stabilizacija nestabilnih

naelektrisanih intermedijera koji imaju tendenciju da se brzo razlože na
svoje sastavne reaktante se postiže dodavanjem ili oduzimanjem
protona, čime se stvaraju jedinjenja koja se mnogo brže prevode u
proizvod nego u reaktante
 Specifična – donori ili akceptori protona koriste H+ ili OH- jone iz
vode
 Opšta – ulogu donora ili akceptora protona mogu imati lanci različitih
aminokiselina

 Kovalentna kataliza – između supstrata i enzima dolazi do stvaranja

prolaznih kovalentnih veza, a ovakvi kovalentni kompleksi uvek podležu
daljim reakcijama u kojima se oslobađa enzim

 Kataliza metalnim jonima – učestvuju u katalizi na više načina:

održavaju odgovarajuću konformaciju enzima neophodnu za katalizu ili
direktno kao katalizatori, učestvuju u vezivanju supstrata za aktivno
mesto i učestvuju u reakcijama oksido-redukcije
 MEHANIZAM KISELINSKO-
Bez katalize, nestabilni
(naelektrisani)
BAZNE KATALIZE
intermedijeri se brzo
razlažu na reaktante

Donor ili akceptor Donor ili akceptor

protona je molekul protona mogu biti
vode različite AK
Vezivanje heksasaharida za aktivno mesto lizozima

Heksasaharid-supstrat

•Lizozim- hidroliza 1-4 glukozidne veze

oligosaharida u molekulu proteoglikana.

•Vezivanje heksasaharida (N-

acetilmuraminska kiselina i N-
acetilglukozamin) za lizozim se odvija preko
6 mesta na molekulu enzima

•Katalitička grupa je COOH grupa koja je na

pH 5 nejonizovana glutaminske kiseline (35)-
nepolarno okruženje; donor H+ koji direktno
učestvuju u cepanju glukozidnih veza
Mesto
hidrolize •Asparaginska kiselina (52)-polarno
okruženje COOH grupa na pH 5 je
jonizovana; akceptor H+. Ima ulogu u
stabilizaciji intermedijernog kompleksa koji
nastaje tokom reakcije
 Vezivanje heksasaharida za aktivno mesto lizozima-
konformacija polustolice

vezivanje supstrata za enzim dovodi do

konformacionih promena u molekulu
supstrata (prsten D je napregnut od
strane enzima u konformaciju polustolice
– konformacija prelaznog stanja, a
hidroliza se odvija između prstenova D i
E)
Konformacija
polustolice
Molekul glukoze iz tetraedarskog
oblika (stolice) prelazi konformaciju sa
planarnom geometrijom (polustolica).
Mehanizmom naprezanja supstrata
dolazi do destabilizacije i slabljenja veza
unutar molekula. Konformacija
stolice
 za enzim je mnogo povoljnije da deluje
na supstrat u konformaciji prelaznog
stanja, nego na supstrat u nativnoj
konformaciji
 Mehanizam katalize lizozima- naprezanje supstrata i kiselinsko-bazna
kataliza
 Glutaminska kiselina na položaju 35 se ponaša kao donor protona koji
direktno učestvuju u cepanju glukozidnih veza
 Glukozidna veza se cepa i stvara se karbkatjon (pozitivno naelektrisan
atom ugljenika C1)
 E-NAG (E prsten glukoze, Proizvod 1) difuzijom napušta enzim

proizvod
P1
NAG
Karboksilna grupa NAG
glutaminske kiseline daje H+ O
jon vezi između C1 atoma D
E
prsetna i atoma kiseonika O
glukozidne veze E H C4
C4 O O
H O Glu H
O C
35
Glu +
C C1 O O- C1
35 O
O O
O- C Asp Asp
D D C
52 52
-O -O
COO- ostatak
asparaginske kiseline
NAG 3 NAG 3 ne učestvuje u
katalizi, ali doprinosi
stabilizaciji
intermedijernog
karbkatjona
Mehanizam katalize lizozima- naprezanje supstrata i kiselinsko-bazna
kataliza

• intermedijerni karbkatjon reaguje sa OH-grupom iz vode

• tetra-NAG (proizvod 2) difuzijom odlazi sa enzima
• glutamat 35 ponovo vezuje H+ iz vode i enzim je spreman novi
katalitički ciklus

O
H
H proizvod
P2
O- O H
Glu Glu
C H C
35 35 HO H
O + O
C1 C1
O O
O O
C Asp C Asp
D D
52 52
-O -O

NAG 3 NAG 3
Mehanizam katalize himotripsinom
•Pripada familiji serin proteaza koje
koriste serin u aktivnom mestu za
obrazovanje kovalentnog intermedijera
u toku proteolize.
•Himotripsin hidrolizuje peptidnu vezu
na karboksi-terminalnom kraju
aromatičnih a.k. fenilalanina, triptofana
i tirozina u denaturisanim proteinima
•Uopšteno OH- iz vode napada
ugljenikov atom iz karboksilne grupe
(parcijalno pozitivno naelektrisan) koja
formira peptidnu vezu, a jon H+ se
dodaje azotu iz peptidne veze, i tako se
ona raskida.
•U reakciji katalizovanoj himotripsinom,
funkcionalne grupe u aktivnom mestu
aktiviraju hidroksilnu grupu, formiraju
kovalentne intermedijere i stabilizuju
tetraedarske komplekse u prelaznom
stanju
•Katalitička trijada (aspartat-histidin-serin) predstavlja primer kooperativne
interakcije amino kiselina u aktivnom mestu
MEHANIZAM KATALIZE HIMOTRIPSINA

Nakon što se supstrat veže u

aktivnom mestu, Serin-195 i Histidin
se približavaju i orijentišu tako da
elektroni sa azota histidina mogu da
privuku vodonik serina

Histidin se ponaša kao akceptor (opšti

bazni katalizator) i preuzima proton
od serina, čime se povećava
nukleofilnost kiseonika serina koji
sada napada karbonilni ugljenik
 Četiri atoma koji su vezani za
karbonilni ugljenik su raspoređeni
tetraedarski i formiraju tzv.
oksianjonski tetraedarski
intermedijer (tetraedarsko prelazno
stanje), stabilizovan N-H grupama
serina i glicina himotripsina

Azot iz peptidne veze je

stabilizovan interakcijom sa
protonom histidina, pa se histidin se
ovde ponaša kao opšti kiselinski
katalizator. Nakon što se elektroni
C-N peptidne veze vrate na azot,
A elektroni oksianjona se vraćaju
karbonilnom ugljeniku supstrata i
dolazi do raskidanja peptidne veze.
Raskidanje peptidne veze dovodi d
formiranja kovalentnog acil-enzim
intermedijera, a amidni de
razgrađenog proteina disosuje.

Nukleofilni napad molekula vode na

karbonilni ugljenik je potpomognut
histidinom, čiji elektroni azota
odvlače proton iz molekula vode.
 Formira se drugi tetraedarski oksianjonski
intermedijer, koji je ponovo je stabilizovan
vodoničnim vezama sa glicinom i serinom.

Nakon što je proton histidina pridružen

elektronima iz veze između kiseonika
serina i karbonilne grupe supstrata,
elektroni oksianjona se vraćaju ugljeniku
supstrata i acil-enzim kovalentna veza se
ADFGHJJ raskida.

Nakon oslobađanja proizvoda, enzim se

vraća u prvobitno stanje.
 DIJAGRAM PROMENE SLOBODNE ENERGIJE
U REAKCIJI KATALISANOJ HIMOTRIPSINOM
 ULOGA METALNIH JONA U KATALIZI

 Metaloenzimi su enzimi koji sadrže metalne jone. Joni metala se za

enzim najčešće vezuju koordinativnim vezama za bočne grupe amino
kiselina.
 Nekad su metali deo prostetske neproteinske grupe (npr. hem)
 Metalima aktivirani enzimi su enzimi koji se aktiviraju metalima, njima
su metali neophodni za katalitičku funkciju, ali nisu strukturni deo
enzima.

 Uloge metala:
 Održavaju odgovarajuću konformaciju enzima neophodnu za katalizu
 Učestvuju u vezivanju supstrata za aktivno mesto
 Učestvuju u reakcijama direktno kao katalizatori
 Učestvuju u reakcijama oksido-redukcije pri čemu dolazi do njihove
ciklične oksido-redukcije
Ternerni kompleksi metala, enzima i supstrata I

Enz-S-M: “Substrate-bridged”
kompleks
 Pravi supstrat za kreatin kinazu
(prevodi kreatin u kreatin-fosfat) nije
ATP, već Mg2+-ATP. Mg2+ ne reaguje
direktno sa enzimom, već služi da
neutralizuje negativno naelektrisanje
na molekulu ATP i ubrza vezivanje za
enzim.
 Vezivanje Mg2+-ATP i glukoze u
aktivnom mestu heksokinaze
 Sve kinaze, osim mišićne piruvat
kinaze (fosfoenol-piruvat u piruvat u
glikolizi) i fosfoenolpiruvat kinaze
(piruvat u fosfoenolpiruvat u
glukoneogenezi), imaju “Substrate-
bridged” kompleks
Ternerni kompleksi metala, enzima i supstrata II

Enz-M-S: “Metal-bridged”
kompleks

Piruvat kinaza:

 inicijalno vezivanje K+ indukuje

konformacione promene u enzimu,
što rezultira povećanjem
afiniteta za supstrat
fosfoenolpiruvat
 K+ doprinosi odgovarajućoj
orjentaciji fosfoenolpiruvata za
prenos fosfatne grupe na ADP
(drugi supstrat)
 Mg2+ olakšava vezivanje
supstrata u aktivnom mestu

 Metali, kao što su K+ i Na+,

stabilizuju aktivnu konformaciju
enzima, ali su pasivni u katalizi
KARBOANHIDRAZA
 Prvi korak je generisanje H+ i OH- iz vode vezivanjem za Zn2+
 Tek posle se H+ i OH- prenose na CO2 i dolazi do stvaranja ugljene kiseline
 RIBOZIMI

 Jedini molekuli u živim sistemima koji istovremeno poseduju i katalitičke i

replikativne sposobnosti
 Za razliku od enzima proteinske prirode, ribozimi se u toku autokatalitičkih
reakcija i sami modifikuju, pa zbog toga ne mogu da katališu veći broj reakcija
(kao enzimi)
 Postoje i ribozimi koji deluju kao pravi katalizatori (ne autokatalitički) i
ponašaju se po zakonima kinetike Michaelis-a i Menten-ove
Zbog toga se svi ribozimi mogu podeliti na:
 AUTOKATALITIČKE
 KATALITIČKE
 SLIČNOST RIBOZIMA SA ENZIMIMA

Specifično vezivanje supstrata

Stvaranje kovalentnih intermedijera u toku obrade
 Mogu da pokazuju saturacionu kinetiku
Trodimenzionalna struktura je značajna za funkciju
 Prisustvo kompetitivnog inhibitora smanjuje katalitičku aktivnost
(neki ribozimi)
 Mogu se inaktivirati dejstvom temperature (neki ribozimi)
 ULOGA RIBOZIMA

 Osnovna uloga ribozima je da katališu reakcije uključene u

postranskripcionu obradu molekula RNK tj. reakcije transesterifikacije i
reakcije hidrolitičkog cepanja fosfodiestarske veze

 Supstrat im je RNK

 Postoje 5 vrste katalitičkih RNK: 3 su autokatalitičke, a četvrta i peta

su katalitičke (ribonukleaza (Rnaze P) koja sa katalitičkom aktivnošću
svoje RNK komponente učestvuje u obradi tRNK, i i rRNK, Koja učestvuje
u stvaranju peptidne veze u ribozomima)
 Grupe
Klase ribozima Reakcija koju
ribozima
katališu
Reakcije
transesterifikacije u
Introni prve grupe obradi rRNK
jednoćelijskih
Autokatalitički

eukariota
Autokatalitička
Introni druge grupe obrada tRNK

Nukleolitički ribozimi (ribozimi Isecanje delova

u obliku glave čekića; ribozimi u
obliku ukosnice; Varkud satelit
ribozim; ribozimi hepatitis
delta virusa)
Katalitički
molekula čime se iz
velikih oligomernih
prekursora generiše
RNK
Obrada prekursora

Ribonukleaza P tRNK

Stvaranje peptidne
rRNK veze u ribozomima
MEHANIZAM KATALIZE INTRONA PRVE GRUPE

 Kod protozoa, gljiva i u

bakteriofagu T4
 Aktivnost joj je dokazana in vitro.
 Učestvuje u odvajanju egzona od
introna na nivou prepoznatog
guanozin nukleotida
 Ovaj nukleotid reaguje sa intron-
egzon fosfodiestarskom vezom i
razdvaja ih
 Slobodan egzon tada napada
intron-egzon fosfodiestarsku vezu
na drugom kraju introna
 Egzoni se povezuju
MEHANIZAM KATALIZE INTRONA DRUGE GRUPE

 U prekursorima mitohondrijalne
RNK, kvasca i gljiva
 Pripada tipu “self splicing”
introna
RIBOZIM U OBLIKU GLAVE ČEKIĆA

 Uokvireni nukleotidi su
visoko konzervisani i neophodni
su za katalitičku aktivnost

 Strelica pokazuje mesto

samoisecanja tj. ona se u toku
generisanja RNK molekula iz
velikih multimernih prekursora
sama “cepa”

 Prisutna u virusima biljaka

 MEHANIZAM KATALIZE RNaze P

 sadrži i protein i RNK

 deluje na prekursore tRNK kako bi nastao zreo 5' kraj tRNK; prepoznaje
konstantnu strukturu vezanu za prekursor tRNK, a proizvod koji nastaje po njenom
dejstvu sadrži 5' fosfat
 Obradi prvo podležu krajevi: 5`na kom deluje endonukleaza - RNaza P, a zatim 3`
kraj na kom deluje egzonukleaza - RNaza D
U toku dodavanja CCA sekvence na 3`kraju, dolazi do modifikacije baza u
preostalom delu transkripta
Konačna obrada podrazumeva isecanje introna u centralnom delu transkripta
HVALA NA PAŽNJI