Kofaktori

•Nekim enzimima su, da bi bili aktivni, potrebni kofaktori

(1) Esencijalni joni (najčešće joni metala)
(2) Koenzimi (organska jedinjenja)

Apoenzim + kofaktor Holoenzim

(samo protein) (aktivan)
(inaktivan)

Zimogeni oblik enzima≠apoenzim

Kofaktori su neproteinske komponente enzima

1. 2.

1. Metalom-aktivirani enzimi – zahtevaju metalne jone ili ih metalni joni

stimulišu (npr. joni K+ , Ca2+ , Mg2+ ). Češće kod strukturnih nego kod
katalitičkih proteina
2. Metaloenzimi sadrže vezane metalne jone u aktivnim centrima. Metalni joni
učestvuju u katalizi (Fe3+, Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co2+ )

1
 Primer metaloenzima: Anhidraza ugljene kiseline
(karboanhidraza...)
Anhidraza ugljene kiseline katalizuje reakciju (u plućima i nefronima
bubrega): CO2 + H2O ⇔ HCO3- + H+
Ubrzava reakciju 107 puta. U aktivnom centru enzima vezan je Zn2+, koji
učestvuje u reakciji i formiranju prelaznih stanja.

https://www.youtube.com/watch?v=0eQZgjCrjRE

Jon gvožđa u metaloenzimima

• Jon gvožđa u metaloenzimima podleže reverzibilnoj oksidaciji i redukciji:

Fe3+ + e- (redukovani supstrat) Fe2+ + (oksidovani supstrat)

• Hem grupe enzima i citohromi sadrže jone gvožđa

• U hemoproteinima (hemoglobin) jon gvožđa ne podleže oks/red, ovi proteini

imaju transportu ulogu.

• U citohromima učestvije u oks/red.

• Nehemsko gvožđe postoji u gvožđe-sumpor klasterima (gvožđe je vezano

za sulfidne jone i -S- grupe cisteina)

2
 (II)

• Hem (a,b,c, itd) je prostetična grupa hemoglobina, mioglobina,

citohroma i brojnih redoks enzima (katalaza, peroksidaza itd).
• Hemoproteini imaju karakteristične apsorpcione spektre, koji su
posledica prisustva protoporfirina IX u njihovoj strukturi. Njihovi spektri se
razlikuju zbog: različitih liganada hema, različitog načina vezivanja hema
za proteine, različitog oksidacionog stanja jona gvožđa.

Katalaza
2H2O2 2H2O + O2
Peroksidaza
R-O-O-H + AH2 A + R-O-H + H2O
• U hemoenzimima (katalaza, peroksidaza) jon gvožđa u hem grupi
učestvuje u oks/red.

• Ovi enzimi su deo antioksidantnog (zaštitnog) sistema organizma.

R-O-O-H - alkil hidroperoksidi

AH2 – redukujući agensi: fenoli, hidrohinoni, dihidroaskorbat itd

3
 CYP7A1 ili Holesterol - 7alfa-hidroksilaza ima hem grupu u aktivnom centru, i
katalizuje hidroksilovanje holesterola u položaj 7, što je prva faza u konverziji
holesterola u žučne kiseline

Gvožđe-sumpor klasteri
• Joni gvožđa su kompleksirani sa sulfidnim (S2- ) ili tiolatnim jonima bočnih
ostataka Cys.
• Gvožđe-sumpor klasteri prenose po jedan elektron,
na primer u ETS

4
 Koenzimi
• Koenzimi su mali organski molekuli, obično derivati vitamina.
• Deluju kao reagensi za prenos grupa; prenose: vodonikove atome, elektrone
ili neke grupe (alkil...)
• Grupe koje se prenose vezuju se za koenzim u reaktivnom centru enzima
• Reakcije koenzima mogu da se klasifikuju prema njihovim tipovima
supstrata i mehanizmima

1. 2.

1. Kosupstrati se menjaju za vreme reakcije i regenerišu se drugim enzimom

2. Prostetične grupe ostaju vezane za enzim tokom reakcije, regenerišu se u
drugoj fazi katalize

Klasifikacija koenzima kod sisara

1. Metabolički koenzimi – sintetišu se iz metabolita: ATP,

SAM, UDP-glukoza
2. Koenzimi- derivati vitamina (sisari ne mogu da sintetišu
vitamine; unose ih hranom, jer su neophodni za
funkcionisanje organizma)

10

5
 Metabolički koenzimi
ATP

11

Phosphoryl /
γ phosphate

Pirofosforil grupa adenilil

(γ+ß fosfati)
adenozil
ATP može da prenosi različite grupe :
Fosfatne grupe (γ-fosfat); Pirofosfatne grupe
(γ,β fosfati); Adenilil grupe (AMP); Adenozil grupe...po
12
potrebi

6
 Sinteza SAM

ATP je izvor za sintezu drugih metaboličkih koenzima, kao što je npr.

S-adenozilmetionin (SAM). SAM je donor metil grupe u mnogim
biosintetskim reakcijama.

Aktivirana metil grupa

Metionin + ATP S-Adenosilmetionin + Pi + Ppi

UDP-Glukoza

• UDP-glukoza je
ugljenohidratni
koenzim. Nastaje iz
UTP i glukoza-1-
fosfata.
• Aktivirana glukoza se
može upotrebiti za
glikozilaciju proteina, za
produženje rastućeg
polimera glikogena, itd.

14

7
 Koenzimi –derivati vitamina
• Vitamini su potrebni za sintezu koenzima; moraju se unositi hranom jer
ih ljudski organizam ne sintetiše, a neophodni su (esencijalni)
• Izvor vitamina za životinje su najčešće biljke i mikroorganizmi, mada i
meso može biti takođe izvor nekih vitamina
• Većina vitamina se enzimski transformiše u koenzime

15

16

8
 Vitamin C je vitamin ali ne i koenzim
• Deficijencija dovodi do bolesti – skorbut, koja je posledica čitavog
niza metaboličkih problema
• Većina životinja (osim primata) može da sintetiše Vit C
• δ-lakton L- gulonske kiseline

Simtomi deficijencije:
Problemi sa desnima, mikrokrvarenja, psihički poremećaji, smanjenje imunog
odbranbenog sistema. Skorbut
Dnevne potrebe: 45-100 mg
17

Biohemijske funkcije vitamina C

-zasnovane na sposobnosti da oksiduje supstrate
–Stvaranje i održavanje kolagena
Prolin → hidroksiprolin
Lizin → hidroksilizin
–Redoks procesi povezani sa mitohondrijalnim
elektron-transportnim lancem (ETS) (citohrom c)

–Važan je za redoks homeostazu nekih organela

(ER)

–Metabolizam tirozina
Tirozin → p-hidroksifenilpiruvat → 2,5-dihidroksifenilacetat

18

9
 Antioksidantne osobine vitamina C

pomažu u sprečavanju oštećenja celularnih proteina i DNK

O O
HO OH
O

HO O
HO O O
O
OH
OH

Normalnim metaboličkim procesima u ćeliji stvaraju se reaktivni

oksidujući agensi, kao što je npr. superoksid O2-.
Superoksid može da reaguje sa proteinima i DNK, ošteti ih i
dovede do celularnih promena koje vode preranom starenju ili
kanceru.
Vitamin C reaguje sa superoksidom, neutrališe ga i tako
sprečava ova oštećenja.
19

NAD+ i NADP+
Nikotinska kiselina (niacin) je
prekursor NAD+ i NADP+.
Nedostatak niacina dovodi do
bolesti koja je poznata pod
imenom pelagra (‘hrapava
koža’)
Izvor niacina: žitarice, meso,
mahunarke
Simptomi deficijencije: Psihički
poremećaji, muka, gubitak
težine i jačine, osećaj
pregrevanja, Pellagra
Dnevne potrebe: 13-17 mg

10
Dehidrogenaze prenose 2 elektrona (kao hidridni jon, H-) sa supstrata na
piridinski prsten C-4 NAD+ ili NADP+

nicotinamide

NAD+ i NADP+ su kosupstrati dehidrogenaza

21

• Primer: reakcija laktat dehidrogenaze

• NAD+ se veže prvi a NADH oslobađa poslednji

• Reakcija može da se prati na osnovu

promene aps. max NAD+ tj. NADH

22

11
 Mehanizam laktat dehidrogenaze
• Hidridni jon (H:-) se prenosi
sa C-2 L-laktata na C-4 Histidin učestvuje u
baznoj katalizi
NAD+

Arginin učestvuje u
vezivanju supstrata

23

NADH učestvuje u reakcijama katabolizma

NADPH učestvuje u reakcijama anabolizma

24

12
Enzim razlikuje dva atoma vodonika na C-4 nikotinamidnog prstena, pa
postoje A-, odnosno B-zavisne dehidrogenaze

25

A-zavisne dehidrogenaze B-zavisne dehidrogenaze

Alkohol dehidrogenaza (NAD+) Glicerol-3-fosfat dehidrogenaza

ADH (NAD+)
Laktat dehidrogenaza (NAD+) 3-Hidroksibutirat dehidrogenaza
LDH (NAD+)
Malat dehidrogenaza (NAD+) Glukoza dehidrogenza (NAD+)
MDH
Citohrom b5 reduktaza (NAD+) Gliceraldehid-3-fosfatdehidrogenaza
(NAD+) GAPDH
Šikimat dehidrogenaza Homoserin dehidrogenaza (NADP+)
(NADP+)
Gotovo sve dehidrogenaze deluju ili na NAD+ ili na NADP+. Osnova ovih
specifičnosti je jasna u slučaju onih dehidrogenaza čije su trodimenzionalne
strukture poznate, kao sto su: ADH, LDH, GAPDH.

26

13
 Riboflavin i njegovi koenzimi
•Flavin adenin dinukleotid (FAD) i Flavin mono-nukleotid (FMN) su derivati riboflavina
(Vit B2 )
•Flavinski koenzimi učestvuju u reakcijama oksidacije-redukcije mnogih enzima
(flavoenzima ili flavoproteina)
•FAD i FMN flavoenzima katalizuju transfer jednog ili dva elektrona

Simptomi deficijencije: Oštećenja usta i jezika,

slaba koncentracija, problemi sa očima 27
Dnevne potrebe: 1.1-1.5 mg

28

14
Redukcija i reoksidacija FMN ili FAD

29

30

15
 31

Koenzim A (CoA ili HS-CoA)

β - Alanin

2,4-Dihidroksi-3,3-
dimetilbutanska kiselina

∆Go’ za hidrolizu acetil CoA je -29.6 kJ/mol

1945.god. Lippman je pronašao kofaktor

koji učestvuje u transferu
acetil ili acil grupa u mnogim
enzimskim reakcijama i nazvao ga CoA
jer je kofaktor enzima koji katalizuju
acetilovanje. 32

16
 Koenzim A (CoA ili HS-CoA)
•Derivat je vitamina pantotenata (Vit B3 )

• Učestvuje u reakcijama transfera acil-grupa karboksilnih i masnih

kiselina
• CoA-zavisne reakcije uključene su u oksidaciju molekula goriva, biosintezu
karboksilnih i masnih kiselina (citratsintaza, ketotiolaza).
• Acil grupe se kovalentno vežu na -SH grupu CoA tioestarskom vezom
• Osnova delovanja ovog koenzima je reaktivna tioestarska veza u acil-CoA.
• Tioestarska veza CoA je dovoljno stabilna da ovakav molekul može nastati
u ćeliji, ali nakon toga lako prenosi acil-grupu sa acil-CoA na drugi molekul.
• Simptomi deficijencije: zamor, muka, parestezija (nadražena koža-peckanje,
svrab...), "burning feet syndrome”
• Dnevne potrebe: 5-6 mg

33

Pantotenska kiselina
U aktiviranom obliku ona je deo
• koenzima A (CoA, metabolizam (β oksidacija) masnih kis) i
• proteina koji prenosi acil-grupu (acyl-carier protein, ACP, u biosintezi masnih kiselina)
• Prvo se fosforiluje sa ATP u 4’-fosfopantotenat
• 4’-fosfopantetein nastaje daljim dodatkom cisteina i dekarboksilacijom
• Adenilacijom sa ATP nastaje defosfo-CoA
• Fosforlilacijom 3’-OH riboze nastaje CoA (koenzim A)

34

17
 Fosfopantetein

Fosfopantetein se sastoji od
ugljovodoničnog niza koji je 2.0
nm dug i ima mogućnost rotacije
oko jednostrukih veza. Ovo mu
omogućuje kretanje, domet u
prostoru velike zapremine i
obuhvatanje aktivnih centara svih
6 enzima u multienzimskom
kompleksu sintaze masnih
kiselina.

Kompleks sintaza masnih kiselina

36

18
Tiamin pirofosfat (TPP)

Vitamin B1; antiberi-beri vitamin; antineuritični faktor, prvi

otkriveni vodorastvorni vitamin (Eijkman, Nobelova nagrada za
otkriće uloge vitamina)
•TPP je derivat tiamina (Vit B1 )
•Reaktivni centar je tiazolijumski prsten (kiseli atom vodonika
na C-2)
• TPP učestvuje u reakcijama:
(1) Dekarboksilacije
(2) Oksidativne dekarboksilacije
(3) Kao koenzim transketolaza
• Simptomi deficijencije: Gubitak
apetita, zamor, nerovoza, muka,
bolest Beriberi
Tiazolijumov prsten je
aktivno mesto
• Dnevne potrebe: 1.0-1.3 mg 37

TPP-zavisne reakcije: 1. piruvat dekarboksilaza; 2. piruvat

dehidrogenaza; 3. transketolaze; 4. acetoacetatsintetaza

19
 39

Piridoksal fosfat (PLP)

•PLP je derivat grupe vitamina B6

• Deficijencija dovodi do dermatitisa i poremećaja metabolizma
proteina
• Vitamin B6 se fosforiluje, pri čemu nastaje PLP
• Simptomi deficijencije: nervne smetnje
• Dnevne potrebe: 1.2-1.5 mg

40

20
 B6 Vitamini su prekursori piridoksal fosfata (PLP)

Phosphorylation

41

O
- H2O +
R C H + NH2 R2 R C N R2 (PLP)R C N R(lysine---
+ H2O H
ALDEHYDE AMINE SCHIFF BASE H H

Schiff Base

42

21
- PLP je prostetska grupa enzima koji katalizuju reakcije
metabolizma aminokiselina (transaminacija, izomerizacije,
dekarboksilacije, eliminacije ili zamene bočnih ostataka)
- U svakoj od ovih transformacija jedna od veza α-ugljenika
aminokiseline se raskida u prvom stepenu reakcije

Veza se raskida pri

dekarboksilaciji

Raskidanje veze izmedju

Cα −Cβ Veza se raskida u transaminaciji,
racemizaciji i α,β -eliminaciji

43

Mehanizam transaminacije

22
45

46

23
 Mehanizam dekarboksilacije aminokiselina
katalizovane PLP-om

47

U PLP-zavisnim reakcijama, veza koja se raskida u prvoj fazi

reakcije, zavisi od konformacije aminokiseline koja se vezuje na enzim.

48

24
• Piridoksal-5-fosfat može u odsustvu enzima da katalizuje sam reakciju.
Reakcija je, međutim, spora, dešava se na visokim temperaturama i u prisustvu
metalnih jona.

• U prisustvu enzima reakcija postaje specifična i mnogo brža.

• Osnovna biohemijska funkcija PLP je stvaranje aldimina sa aminokiselinama i

rezonanciona stabilizacija intermedijera (negativnog naelektrisanja karbanjona
na α ili β C atomu, delokalizacijom elektrona u piridinijumski prsten
koenzima).

49

50

25
 51

Biotin

• Biotin je potrebno unositi u malim količinama

zato što ga u malim količinama stvaraju crevne
bakterije

• Avidin (protein svežeg belanceta) veoma čvrsto

vezuje biotin i može izazvati deficijenciju ovog
koenzima (kuvanjem jajeta se avidin denaturiše i
ne može više vezati biotin)

• Biotin je prostetična grupa enzima koji katalizuju:

1. Reakcije transfera karboksilne grupe

2. ATP-zavisne reakcije karboksilacije

• Simptomi deficijencije: retki
52
• Dnevne potrebe: 30-60 µg

26
 Biotin se veže kovalentno na enzim

•Biotin se veže amidnom vezom na ε-amino grupu lizinskog ostatka enzima

•Reaktivni centar biotina je N-1

53

• Koenzimska funkcija biotina je posredovanje u reakcijama karboksilacije;

koenzim preuzima ATP-om aktiviranu karboksilnu grupu i prenosi je na
odgovarajući supstrat - akceptor.
Dvostepen proces:
1. Vezivanje CO2 na biotin: N1-karboksibiotin

O ATP O O Biotinil-E
- - -
HO C O O P O C O N 1 -karboksibiotinil-E
ADP OH Pi

2. Transfer CO2 na supstrat

N1-Karboksibiotinil-E + CH3COSCoA Biotinil-E + -OOCCH2COSCoA
– Za aktivaciju biotin-enzima potrebni su CO2, ATP i Mg++

54

27
 Biotin ima hemijske i strukturne osobine
koje mu omogućuju da posreduje u
reakcijama karboksilacije; lako vezuje
aktiviranu karboksilnu grupu na N1 i
prenosi je na supstrate-akceptore.

- Biotin vezan za ε-amino grupu

Lys ostatka enzima,

-ima karboksilnu grupu na N1 na

jednom kraju ugljovodoničnog
niza koji je 1.6 nm dug i koji ima
rotacionu slobodu oko
jednostrukih veza,

....... što mu omogućava transfer

aktivirane karboksilne grupe kroz
prostor iz AC za aktivaciju
karboksilne grupe u AC za
karboksilaciju supstrata.
56
AC-aktivni centar

28
 Tetrahidrofolat (THF)

Vitamin B9 tj. Folat (folna kiselina)

nalazi se u zelenim biljkama, svežem
voću, jetri i kvascu. Folna kiselina je
dobila ime od latinske reči folium,
“list.”
Simptomi deficijencije: oštećenje
vezano za broj i razvoj krvnih ćelija,
zapaljenja sluznice, muka, defekt
neuralne tube (prekursor CNS) kod
novorođenčadi
Dnevne potrebe: 400 µg DFE1
57

Pyrimidine Pyrazine
-
COO
8
1
H2N N N CH2
7
2
6
O CH2
N 9 10
3 4 N CH2 NH C N CH
5
OH H COO
-

6-Methylpterin p-Aminobenzoic acid Glutamate

Pteroic acid
Pteroylglutamic acid - (folic acid)

Folat sadrži ostatke glutamata koji olakšavaju vezivanje

koenzima na enzim.

58

29
• Pterini su dobili ime od grčke reči za krila, zato što su prvobitno nađeni u krilima
insekata: dva pterina, Xanthopterin i leucopterin, nađena su u krilima leptira.
Organizmi sisara ne mogu sintetisati pterine; oni dobijaju folate iz hrane ili
mikroorganizama koji su aktivni u crevima

59

Koenzim THF (tatrahidrofolat) je

derivat folata koji je redukovan u
položajima 5,6,7,8 pterinskog
prstena
8
1
H2N N N
7
2
6 10
N 9
3 4 N CH2 NH
5
OH

Uloga THF je da učestvuje u

prenosu jednougljeničnih grupa
(1C) fragmenata

60

30
 Oksidaciona stanja ugljenika u jednougljeničnim
fragmentima koje prenosi tetrahidrofolat (THF)

Oksidacioni Nivo oksidacije Jedno- Oblik

broj ugljenični tetrahidrofolata
fragment

-2 Metanol (najviše -CH3 N5-Metil-THF

redukovan
0 Formaldehid -CH2O N5,N10-Metilen-THF

2 Format (najviše -CH=O N5-Formil-THF

oksidovan) -CH=O N10-Formil-THF
-CH=NH N5-Formimino-THF
-CH= N5,N10-Metenil-THF

61

Jednougljenični fragment se veže/oslobađa na N5 ili N10

62

31
 63

10-FormilTHF 5,10-metilenTHF 5-metilTHF

O O O
CH3
N N HN
HN HN
+
NH3
N N N N N -
CH3 O
PO O PO O O S
PO
O

OH OH OH OH OH OH

• 10-formilTHF i 5,10-metenilTHF – donori formil grupe supstratima

transformilaza
• 5,10-metilen THF – donor hidroksimetil grupe (nekim enzimima) i
metil grupe supstratu timidilat sintetaze
• 5-metilTHF – donor metil grupe supstratu metionin sintaze koja
katalizuje stvaranje metionina iz homocisteina. 64

32
• Formaldehid je toksična supstanca. Reaguje spontano sa
amino grupama proteina i DNK, hidroksimetiluje ih i
umrežava preko metilenskih grupa (mostova). Slobodan
formaldehid otuda pustoši žive ćelije i ne može biti
upotrebljiv hidroksimetilirajući agens. U obliku 5,10-
metilenTHF njegova hemijska reaktivnost je umanjena ali
je zadržana u potencijalno korisnom obliku neophodnom
za specifično enzimsko delovanje.

• Format je dosta nereaktivan u fiziološkim uslovima i mora

da se aktivira da bi bio efikasan formilirajući agens. Kao 10-
formilTHF i 5,10-metenilTHF on je dovoljno reaktivan da
se može preneti na odgovarajuće supstrate.

• Jedna od osnovnih biohemijskih uloga THF je održavanje

formaldehida i formata u hemijskim oblicima u kojima nisu
toksični za ćeliju ali su na raspolaganju za esencijalne
procese katalizovane odgovarajućim enzimima.

65

5,6,7,8, Tetrahidrobiopterin, pterinski koenzim

• Sadrži na C-6 trougljenični fragment
• Učestvuje u metabolizmu aromatičnih AK
• Ne nastaje iz vitamina, neki organizmi ga sintetišu

O
H H H
N
HN 5 6 C C CH3
8 7 OH OH
H2N N N
H
5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin

66

33
 Kobalamin (Vitamin B12 )

• Sintetišu ga samo neki mikroorganizmi

• Ljudi se snabdevaju kobalaminom iz
hrane animalnog porekla

Simptomi deficijencije:
Perniciozna anemija,
krvarenje, psihički
poremećaji
Dnevne potrebe: 2.4-3 βg

67

Kobalamin (Vit B 12 ) i njegovi koenzimi

Grupa koju
prenosi u 6.
koord. položaju

Kobalamin sadrži
korinski prsten i jone
kobalta.

Korinski prsten je
sličan porfirinskom
prstenu hema.

68

34
 Koenzimi:

metil-

cijan-

hidroksikobalamin,

adenozilkobalamin

69

koenzim: adenozilkobalamin

Intramolekulski rearanžman kataliziran adenozilkobalaminskim

enzimima - Promena mesta H i supstituenta X na susednom C
atomu.

70

35
Koenzimi kobalamina učestvuju u enzim-katalizovanom molekulskom
rearanžmanu u kome atom H na jednom i grupa na susednom C atomu
supstrata zamenjuju mesta.

71

Metilkobalamin učestvuje i u transferu metil-grupa

72

36
 Lipoamid

Životinje mogu da sintetišu liponsku kiselinu i zato ona nije vitamin.

Liponska kiselina je karboksilna kiselina koja sadrži 8-C atoma i

sulfhidrilne grupe na C-6 i C-8
Liponska kiselina je vezana amidnom vezom na ε-amino grupu Lys-
ostatka enzima

73

Lipoamid

S CH2
CH2
NH
S CH lipoic acid O lysine
CH2 CH2 CH2 CH2 C NH (CH2)4 CH
Reaktivni centar koenzima
lipoamide C O
pokazan je crvenom bojom

2e− + 2H+
HS CH2
CH2
NH
HS CH O
CH2 CH2 CH2 CH2 C NH (CH2)4 CH
dihydrolipoamide C O

74

37
Transfer acil grupe između aktivnih centara

Lipoamid funkcioniše kao pokretna ruka

“swinging arm” koja prenosi acil grupe
između aktivnih centara multienzimskog
kompleksa. On takođe prenosi i elektrone,
dakle ima dvostruku funkciju, prenosa acil
grupe i elektrona u procesu dekarboksilacije
i oksidacije α-keto kiselina.

•Acetil grupe vezane na C-8 lipoamida se

mogu preneti na molekule akceptore

•U reakciji koju katalizuje piruvat

dehidrogenaza acetil grupa se prenosi na
koenzim A pri čemu nastaje acetil-SCoA

75

38