Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

KREATIN KINAZA
(CK, EC 2.7.3.2)
Kreatin kinaza (ATP: kreatin N-fosfotransferaza, EC 2.7.3.2, CK) katalizuje reverzibilnu
N-fosforilaciju kreatina prema sledeoj reakciji u kojoj sudeluju Mg+2-ATP/Mg+2-ADP kompleksi:
pH 9.0

ATP + kreatin

Mg2+

ADP + fosfokreatin

pH 6.7

ATP koji nastaje u povratnoj reakciji se koristi za kontraktilne ili transportne sisteme. Ravnotea
reakcije zavisi od pH vrednosti. Pri neutralnom pH 6,8 ravnotea je pomerena ka stvaranju ATP,
dok je pri pH 9,0 reakcija usmerena ka formiranju fosfokreatina, drugog visoko-energetskog
jedinjenja. Povratna reakcija je 2 do 6 puta bra od reakcije fosforilacije kreatina. Fizioloki
znaaj kreatin kinaze ogleda se u tome to je fosforilisani kreatin osnovni rezervoar fosforilacije
u miiima (nalazi se u koliini 8 puta veoj od koliine ATP). U toku miine kontrakcije ATP
prelazi u ADP, a njegova ponovna fosforilacija deava se na raun defosforilacije kreatina pod
dejstvom CK.
Kao i kod svih drugih kinaza, Mg +2 jon je neophodan za katalitiku aktivnost. Optimalan opseg
koncentracija Mg+2 jona je vrlo uzak, tako da viak ovog jona deluje inhibitorno. Enzim inhibiraju
i mnogi drugi metalni joni (Mn2+, Ca2+, Zn2+, Cu2+), kao i reagensi koji vezuju sulfhidrilne grupe u
aktivnom centru. Urati i cistin su moni inhibitori CK u serumu. ak su i joni Cl - i SO42- u stanju
da delimino inhibiraju enzimsku aktivnost, pa stoga koncentracija ovih jona treba biti niska u
testovima za odreivanje aktivnosti CK zasnovanim na povratnoj (fosfokreatin + ADP) reakciji.
Aktivnost CK opada usled oksidacije sulfihdrilnih (SH) grupa u aktivnom centru, tako da je
enzim relativno nestabilan. Ovaj efekat se moe spreiti inkubiranjem uzorka sa odgovarajuim
tiolnim reagensima (N-acetilcistein, monotioglicerol, ditioeritrol, glutation). Efikasnost pomenutih
reagenasa zavisi od vremena koje je proteklo od uzimanja krvi do njihovog dodavanja u uzorak i
od tipa reagensa.
CK je dimer koji se sastoji od dve subjedinice: B (brain) i M (muscle). M i B subjedinice su
veoma sline, imaju relativnu molekulsku masu od oko 43 000, sadre jedno katalitiko mesto i
jednu reaktivnu SH grupu. U zavisnosti od kombinacije subjedinica, prisutna su tri izoenzima
1

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

CK: CK BB (CK-1), CK MB (CK-2) i CK MM (CK-3). Sistem obeleavanja izoenzima CK

brojevima odnosi se na elektroforetsku pokretljivost.
Kreatin kinaza je citoplazmatini i mitohondrijalni enzim i iroko je zastupljena u razliitim
tkivima. Aktivnost CK je najvea u skeletnim miiima, mozgu i miokardu. Druga tkiva kao to su
bubrezi i GIT sadre srazmerno niu aktivnost CK, dok u jetri i eritrocitima praktino da nema
aktivnosti. Pomenuta tri izoenzima CK nalaze se u citozolu. Postoji i etvrti izoenzim CK MiMi,
koji se nalazi u mitohondrijama miokarda i skeletnih miia, a smatra se da se sastoji iz treeg
tipa subjedinica. Oko 97% katalitike aktivnosti CK u miinom tkivu potie od citoplazmatinog
izoenzima CK MM, oko 3% od CK MB, dok se CK BB i CK MiMi uglavnom nalaze u minimalnim
koliinama. U miokardu 60% CK katalitike aktivnosti potie od izoenzima CK MM, 30 - 40% od
izoenzima CK MB i oko 10% od izoenzima CK MiMi. U mozgu, prostati i gastrointestinalnom
traktu preteno je zastupljen CK BB izoenzim.
CK moe biti prisutna i u makromolekularnoj formi (tzv. makro CK). Postoje 2 tipa makro CK:
makro CK-1 i makro CK-2. Tip 1 je obino kompleks CK BB sa IgG, ali opisani su i kompleksi
CK MM sa IgA. Makro CK-2 je oligomerna mitohondrijalna CK koja se predominantno nalazi kod
odraslih sa malignim bolestima i bolestima jetre, ili kod dece sa bolestima miokarda. Ovaj tip
interferira prilikom odreivanja aktivnosti CK MB jonoizmenjivakom hromatografijom i metodom
imunoinhibicije. U serumima zdravih osoba aktivnost CK preteno potie od CK MM i to 94 98%. Nivo aktivnosti CK u serumu u sluaju oteenja skeletnog ili sranog miia zavisi
delimino i od transporta CK Iimfnim putem.

Metode za odreivanje aktivnosti kreatin kinaze

U zavisnosti koji e se smer reakcije koju katalizuje CK koristiti, postoji vie naina
odreivanja katalitike aktivnosti CK. Pomou pogodnih reakcija aktivnost moe da se odreuje
preko fosfokreatina, ADP, kreatina i ATP. Katalitika aktivnost CK se meri spektrofotomerijski,
fluorimetrijski ili na principu bioluminescencije. Da bi se dobila odgovarajua aktivnost, CK mora
da se reaktivira u toku nekoliko minuta pomou nekog tiol jedinjenja, kao to je npr. N-acetil
cistein (NAC), ditiotreitol, monotioglicerol itd. Na isti nain je mogue da se odredi i aktivnost
samo CK-B subjedinice, ako se prethodno izvri potpuna imunoinhibicija aktivnosti
M-subjedinice pomou specifinog anti-M imunoinhibitora.
2

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Jedan od najspecifinijih postupaka za odreivanje aktivnosti CK sastoji se u odreivanju ATP

koji reaguje sa glukozom uz sudelovanje heksokinaze i glukozo-6-fosfat dehidrogenaze uz
redukciju NADP+ koji se meri na 340 nm.
CK
Kreatin-fosfat + ADP

kreatin + ATP
HK

ATP + D-glukoza

ADP + D-glukoza-6-fosfat
G-6-PDH

Glukoza-6-fosfat + NADP+

D-glukonat-6-fosfat + NADPH + H+

Postoji nekoliko interferencija kod opisane metode. Efekat glutation reduktaze je znaajan ako
se kao tiolni reagens koristi redukovani glutation (GSH) koji je kontaminiran sa oksidovanim
glutationom (GSSG). Pod ovim uslovima, glutation reduktaza prisutna u serumu katalizuje
reakciju:
GSSG + NADPH + H+

GSH + NADP+

Zbog utroka NADPH u ovoj reakciji meri se prividno nia aktivnost CK. Ovaj efekat se moe
izbei upotrebom drugog tiolnog reagensa (npr. N-acetilcisteina).
Vanu interferirajui faktor je adenilat kinaza, enzim koji se u relativno visokim koncentracijama
nalazi u gotovo svim tkivima, ukljuujui i eritrocite. Adenilat kinaza katalizuje reakciju:

2ADP

ATP + AMP

pri emu se formirani ATP ukljuuje u reakciju sa D-glukozom isto kao i ATP formiran u reakciji
koju katalizuje CK. Na ovaj nain dobijaju se lano poviene vrednosti za aktivnost CK u uzorku.
Ova interferencija moe se ukloniti dodatkom fluoridnog jona, AMP ili diadenozin pentafosfata
test reagensu. Druga mogunost je da se koristi slepa proba analize.
Testove za odreivanje aktivnosti CK

karakterie tzv. lag faza, tj. sporo poveanje brzine

reakcije nakon dodatka seruma test reagensima. Tipine lag faze za optimizovane testove su
110 sec na 250C, 90 sec na 300C i 60 sec na 370C. Ovaj fenomen ima vane praktine
implikacije jer neodgovarajui period merenja moe prozrokovati netane rezultate.
3

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Prisustvo endogenih inhibitora u serumu takoe utie na odreivanje aktivnosti CK. Ca 2+ je

vaan endogeni kompetitivni inhibitor Mg2+ jona koji je potreban za punu katalitiku aktivnost
CK.
Proizvodi reakcije kreatin-fosfat i ADP takoe mogu da se koriste za odreivanje aktivnosti CK.
Jedna od opisanih metoda zasniva se na sledeim reakcijama:
Kreatin +ATP

CK
pH 9,0
PK

ADP + fosfoenolpiruvat
Piruvat + NADH + H

kreatin-fosfat + ADP
piruvat + ATP

LDH

laktat + NAD+

Metode bioluminescencije imaju veu osetljivost od spektrofotometrijskih. U ovim metodama

ATP koji nastaje u reakciji CK se uvodi u reakciju luciferin/luciferaza:
ATP + luciferin + O2

luciferaza

AMP + oksiluciferin + PP1 + CO2 + svetlost

Svetlost nastala u reakciji je mera aktivnosti CK.

Princip metode za odreivanje aktivnosti CK:

CK
Kreatin-fosfat + ADP

kreatin + ATP
HK

ATP + D-glukoza

ADP + D-glukoza-6-fosfat
G-6-PDH

Glukoza-6-fosfat + NADP+

D-glukonat-6-fosfat + NADPH + H+

U tzv. reverznoj reakciji ravnotea je pomerena ka formiranju kreatina i ATP pri pH 6-7. Ova
primarna (merna) reakcija se nadovezuje na pomonu reakciju u kojoj sudeluje heksokinaza
(ATP: D-heksoza-6-fosfotransferaza, EC 2.7.1.1) u kojoj se gradi D-glukozo-6-fosfat. U
indikatorskoj reakciji koju katalizuje glukozo-6-fosfat dehidrogenaza (D-glukozo-6-fosfat: NADP+
1-oksidoreduktaza, EC 1.1.1.49) redukuje se koenzim NADP. Aktivnost CK je proporcionalna
brzini nastajanja NADPH koji se kontinuirano meri na 340 nm ili 334 nm.

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Reagensi:
Reagens A:
Imidazol acetat pufer pH 7,0

125 mmol/L

Magnezijum-acetat

12,5 mmol/L

Glukoza

25 mmol/L

EDTA

2 mmol/L

N-acetilcistein

25 mmol/L

Heksokinaza

6000 U/L

NADP

2,4 mmol/L

Kreatin fosfat

250 mmol/L

ADP

15 mmol/L

AMP

25 mmol/L

G-6-PDH

8000 IU/L

Reagens B:

P1,P5-di(adenozin-5-)pentafosfat

102 mol/L

Za analizu se mogu koristiti nehemolizovan serum ili heparinizirana plazma. CK je nestabilan

enzim tako da se u toku jednog dana na T 2-8 0C ili jednog sata na T 15-20 0C, aktivnost CK
smanji i do 10%.
Priprema radnog reagensa:
Radni reagens se priprema meanjem reagensa A i reagensa B u sledeem odnosu: 4 ml
reagensa A + 1 ml reagensa B.
Izvoenje:
Podesiti talasnu duinu na 340 nm, meriti prema destilovanoj vodi.

U epruvetu dodati:
Analiza
Serum
Radni reagens

(A)
50 L
1 mL

Promeati pripremljen rastvor i inkubirati 3 minuta na 37C. Izmeriti inicijalnu apsorbanciju (A0),
a zatim izmeriri promene apsorbancija svakog minuta u toku 3 minuta (A1, A2 i A3) na 340 nm.
5

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Izraunavanje aktivnosti enzima:

Izraunati prosenu promenu apsorbancije po minuti (A/min):

A / min

(A1 A 0 ) (A 2 A1 ) (A 3 A 2 )
3

Aktivnost kreatin kinaze se izraunava prema sledeoj formuli:

IU / L

( A / min) 10 6 UZ
ZA b

Pri emu su:

A/min prosena promena apsorbancije po minuti
106 faktor za konverziju mola u mikromole
UZ ukupna zapremina u kiveti (zapremina reagensa + zapremina analize)
ZA zapremina analize (u mL)
molarni apsorpcioni koeficijent za NADH na 340 nm (6300)
b duina optikog puta (1 cm)
Obzirom da su , UZ, ZA, 106 i b konstantne vrednosti, njihov odnos se moe zameniti faktorom
3333, tako da izraz za izraunavanje aktivnosti enzima postaje:

IU/L = A/min 3333

(na 37C)

Napomene:
1.

Krv treba sakupljati bez venske staze. Treba izbegavati hemolizu zbog oslobaanja adenilat
kinaze koja inteferira u reakciji.

2.

Serum mora da se odvoji odmah ili najkasnije u roku do 2 sata. Treba ga uvati na hladnom
u dobro zatvorenim epruvetama sa to je mogue manje praznog prostora iznad samog
seruma. Katalitika aktivnost zavisi i od pH, maksimalna je pri pH 6,5-7,0 a minimalna pri
pH 8,0-8,5.

3. Stabilnost izoenzima CK je razliita. Najmanje su stabilni makro oblici BB i MiMi, a zatim

izoenzimi MM, MB i BB. Do smanjenja aktivnosti moe doi usled toplotne inaktivacije,
oksidacije reaktivnih SH grupa, poveanja pH usled gubitka CO 2 kao i delovanjem svetlosti.

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Ova nestabilnost makro formi u prisustvu svetlosti koristi se za eliminaciju lano pozitivnih
rezultata za aktivnost CK MB, nastalih usled prisustva makro BB oblika.

Referentne vrednosti na 37C

Mukarci: 24-195 IU/L
ene: 24-170 IU/L
Kod zdravih ljudi, aktivnost CK zavisi od starosti, pola, rase, udela miinog tkiva, fizike
aktivnosti, kao i drugih genetski determinisanih faktora. Uopteno gledajui, deca imaju veu
aktivnost CK nego odrasli, mukarci nego ene, a crnci nego belci.

Interpretacija rezultata
Bolesti skeletnih miia
Aktivnost CK u serumu je jako poviena kod svih tipova miine distrofije, a posebno u
Duchenne-ovom tipu, kada aktivnost ovog enzima raste i do 50 puta iznad referentnih vrednosti.
Kod progresivne miine distrofije, CK aktivnost je najvea u detinjstvu i moe biti poviena pre
bilo koje druge klinike manifestacije bolesti. Aktivnost enzima opada kako pacijent stari i kako
se miina masa smanjuje usled napredovanja bolesti. Visoka aktivnost CK javlja se kod
virusnog miozitisa, polimiozitisa, i slinih bolesti miia, dok je u neurogenim miinim bolestima
(miastenia gravis, multipla skleroza, poliomijelitis, parkinsonizam) aktivnost enzima normalna.
Izuzetno visoke vrednosti sreu se i kod maligne hipertermije. Kod pacijenata sa distrofijama i
miopatijama obino se u serumu nalazi samo CK-3 (CK MM) izoenzim, ali kod visoke aktivnosti
ukupne CK, moe se nai i CK-2 (CK MB). Kod akutne rabdomiolize, aktivnost CK je i do 200
puta poviena. Serumska CK aktivnost moe biti poveana i usled direktne traume miia (im
injekcije, operativni zahvati, sepsa, hipo- ili hipertermija, intenzivna vebanja, dugotrajni napori,
itd). Osim navedenog, mnogi lekovi u farmakolokim dozama (klofibrat, dietilstilbestrol,
amfotericin B, lidokain, D-penicilamin), kao i kod zloupotrebe (amfetamini, barbiturati, alkohol,
heroin) poveavaju aktivnost CK. Interesantno, iako ne u potpunosti objanjeno, je poveanje
aktivnosti CK u stanju akutne psihoze. Smatra se da je ovo poveanje manifestacija
abnormalne funkcije skeletnih miia.

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Bolesti srca
CK-2 i CK-3 izoenzimi su rani markeri infarkta miokarda. CK-2 (CK MB) je prvi enzim ija se
aktivnost poveava u infarktu miokarda. Pik se obino dostie 24 asa nakon pojave prvog bola
u grudima, a zatim se, usled kratkog poluivota, vrednosti relativno brzo (48 asova) vraaju u
normalu. Poveanje CK-2 je obino 10 do 25 puta iznad referentnog opsega. Kod zdravih
osoba, udeo CK-2 u ukupnoj CK aktivnosti je od 3 do 6%, ali posle infarkta kree se u opsegu
od 10 do 30%. CK-3 se takoe poveava kod infarkta i dostie pik 18 do 30 asova nakon
pojave bola u grudima, a vraa se u normalu treeg ili etvrtog dana od napada. Iako mnogi
drugi uzroci dovode do poveanja aktivnosti CK, zajedniki porast i sledstveni pad aktivnosti i
CK-2 i CK-3 gotovo uvek govori o infarktu miokarda.
Sama poveana aktivnost CK-2 ne ukazuje uvek na infarkt miokarda. Ova aktivnost se
poveava i kod inflamatornih i degenerativnih procesa u miiima, oka, intoksikacije, akutne
psihoze, hipotiroidizma itd. Za pravilnu dijagnozu infarkta miokarda, potrebno je koristiti i druge
klinike znake, stepen poveanja CK-2, kao i vremenski zavisan obrazac tog poveanja. Druge
bolesti i zahvati na srcu (angina pektoris, kardiogeni ok, primena elektrookova, tahikardija,
kongestivna srana slabost, perkutana transluminalna koronarna angioplastika) mogu takoe
dovesti do poveanja aktivnosti ukupne CK, CK-2, ili obe. U cilju dijagnostike infarkta miokarda,
novije preporuke su da se odreuje ne aktivnost CK MB, ve masena koncentracija. U ove
svrhe koriste se imunohemijske metode, a smatra se da je ovo osetljiviji marker za infarkt
miokarda. Takoe, osim enzima, u dijagnostike svrhe se koristi i odreivanje specifinih
proteina kao to su troponin T, troponin I i mioglobin.
Bolesti centralnog nervnog sistema
Aktivnost CK moe biti poveana kod pacijenata sa cerebrovaskularnim bolestima i
cerebralnom ishemijom. U ovim sluajevima radi se u potpunosti o porastu aktivnosti CK-1 (CK
BB) izoenzima. S druge strane, povrede glave i subarahnoidalna hemoragija esto su praene
porastom CK-1 i CK-2 izoenzima (poviena aktivnost CK-2 u vezi je sa oteenjem miokarda
koje se javlja usled cerebralne povrede).
Bolesti tiroidee
Kod hipotireoidizma aktivnost CK je najee 5 puta vea u odnosu na referentni opseg, mada
vrednosti mogu biti i do 50 puta vee u odnosu na referentne. Osnovni izoenzim koji je u
porastu je CK-3, ali se belei i poveanje CK-2, to ukazuje na mogue pratee oteenje

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

miokarda. Kod hipertireoidizma, aktivnost CK u serumu uglavnom se kree oko donje granice
referentnog intervala.
Bolesti jetre
S obzirom da jetra sadri zanemarljive koliine CK, pacijenti sa primarnim bolestima jetre i
cirozom imaju normalnu aktivnost CK u serumu.
Ostala stanja
U toku normalnog poroaja, uterus i placenta su izvori i do 6 puta povienih aktivnosti CK u
serumu. Hirurke intervencije u toku poroaja uslovljavaju dalji porast aktivnosti CK. Tumori
prostate, bubrega, testisa, dojke, jajnika, materice, zatim neoplazme CNS-a, te leukemije,
limfomi i sarkomi praeni su sa razliitim stepenom poveanja aktivnosti CK-1, to sugerie
moguu primenu izoenzima CK-1 kao tumor markera.
Poveana aktivnost CK je i kod maratonaca, kao i kod davanja intramuskularnih injekcija.

METODE ZA RAZDVAJANJE I KVANTIFIKACIJU IZOENZIMA KREATIN KINAZE

Tehnike koje se najee koriste su elektroforeza, jonoizmenjivaka hromatografija i imunoeseji.

Elektroforeza na agaru, agarozi, celuloza acetatu ili poliakrilamidu omoguava zadovoljavajue
razdvajanje izoenzima CK. Tri izoenzima su oznaena brojevima prema elektroforetskoj
pokretljivosti kao: CK 1 = BB, CK 2 = MB i CK 3 = MM, pri emu je CK 1 najblii anodi.
Razdvojene trake se vizualizuju inkubacijom sa kreatin-fosfatom i ADP, uz glukozu, NADP,
heksokinazu i glukoza-6-fosfat dehidrogenazu. Nastali NADPH moe da se kvantifikuje
fluorescentnom denzitometrijom ili preko redukcije tetrazolijum soli u purpurno obojeni
formazan. Vano je napomenuti da kod pacijenata na dugotrajnoj hemodijalizi, razdvojeni
albumin takoe fluorescira, to moe izgledati kao lana CK-1 frakcija. Ova interferencija moe
se ukloniti posmatranjem razdvojenih frakcija pod fluorescirajuim svetlom pre i posle bojenja.

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Normalan uzorak seruma:

CK-2

CK-3
start

CK-1
Albumin

Abnormalne trake:

CK-3

Start Makro CK tip 2

CK-2

CK-1

Makro CK tip 1

CK MiMi
Jonoizmenjivakom hromatografijom izoenzimi CK se razdvajaju na mini kolonama koje sadre
DEAE-Sefadeks 50 ili DEAE-celulozu. Izoenzimi se adsorbuju na jonoizmenjivackoj smoli, a
zatim se selektivno eluiraju. CK-3 (CK-MM) izoenzim se prvi eluira sa TRIS-puferom (pH 8.0)
koji sadri 100 mmol/L NaCl. Zatim se eluira CK-2 (CK-MB) sa istim puferom, ali sa 200 mmol/L
NaCl. Na kraju se eluira CK-1 (CK-BB) sa TRIS-puferom (pH 7) koji sadri 500 mmol/L.
Imunoloke metode koje se koriste su imunoprecipitacija, imunoinhibicija i imunohemijska
odreivanja zasnovana na RIA (Radio Immunoassay) i EIA (Enzyme Immunoassay) tehnikama.
U postupcima zasnovanim na imunoprecipitaciji vri se precipitacija izoenzima CK sa anti M, ili
anti B antitelima. Anti CK-B antitela, precipitiraju CK-1 (CK BB) i CK-2 (CK MB), a u uzorku
ostaje samo CK-3 (CK MM) izoenzim ija se aktivnost moe odrediti. Anti CK-M antitela e
precipitirati CK-2 i CK-3 izoenzim, a eventualno prisutan CK-1 izoenzim moe da se odredi.
Aktivnost CK-2 izoenzima moe se nai iz razlike ukupne aktivnosti CK i aktivnosti CK-1+CK-3.
Tehnika imunoinhibicije je jednostavnija i bra od imunoprecipitacije, pa se i ee koristi.
Aktivnost CK B-subjedinice se odreuje nakon inhibicije CK M subjedinice sa specifinim
imunoinhibitorom, anti-M. Pri ovoj inhibiciji preostaju aktivne subjedinice CK B u izoenzimima
BB, MB i makro BB, kao i CK MiMi. Prema tome sa izuzetkom makro CK MiMi koja se retko
javlja metoda je specifina za aktivnost CK B subjedinice. Aktivnost CK-MB se izraunava
mnoenjem aktivnosti CK-B subjedinice sa dva. Na kraju se izraunava procenat od ukupne
aktivnosti CK. Od ove aktivnosti treba oduzeti aktivnost rezidualne adenilat kinaze.
10

Klinika enzimologija vebe 2014/15

Kreatin kinaza

Za odreivanje masene koncentracije pojedinanih izoenzima (pre svega CK MB) koriste se

imunohemijska odreivanja zasnovana na RIA (Radio Immunoassay) i EIA (Enzyme
Immunoassay) tehnikama.

11