Regulacija ekspresije gena na nivou obrade primarnih transkripata

Kao i kod prokariota, i kod eukariota se regulacija ekspresije gena najčešće obavlja na
nivou inicijacije transkripcije. Inicijacija transkripcije je tipično regulisana proteinima koji se
vezuju za specifične sekvence na DNK i aktiviraju njegovu ekspresiju (aktivatori) ili je inhibiraju
(represori). Međutim, ekspresija eukariotskih gena često je regulisana i nakon sinteze RNK.
Nakon transkripcije, pre-iRNK se obrađuje kako bi se dobila funkcionalna iRNK. Ovi rocesi
obuhvataju splajsovanje, dodavanje 5’ kape, dodavanje poli A repa kao i editovanje. Zrela iRNK
se potom transportuje u citplazmu gde podleže procesu translacije.
Kada govorimo o regulaciji na nivou obrade primarnih transkripata, govorimo pre svega
o mehanizmima kojima se određuje način na koji će se obraditi primarni transkript, a najčešće
se ostvaruje regulacijom alternativnog splajsovanja. Regulatorni mehanizmi koji deluju na nivou
obrade pre-iRNK su tkivno specifični, čime nastaju tkivno specifične izoforme proteina.
Kada je prvi put opisan, fenomen splajsovanja je delovao kao čist energetski gubitak, s
obzirom da ćelija troši energiju za sintezu introna a potom i za njihovo uklanjanje iz pre-iRNK.
Ovo je dugo bunilo istraživače s obzirom da prirodna selekcija eliminiše suvišne procese. Tako,
umesto pojednostavljenog shvatanja da je splajsovanje čist energetski gubitak, mnogi istraživači
su ipak očekivali da splajsovanje ima neki biološki značaj. Vrlo brzo, značajna biološka prednost
koju sa sobom nosi i alternativno splajsovanje, postala je jasna, jer omogućava da se jedna pre-
iRNK obradi na više različitih načina. Kao rezultat alternativnog splajsovanja, dobija se više
različitih polipeptida koji praktično potiču od jednog gena.
Stepen splajsovanja i alternativnog splajsovanja varira u velikoj meri između različitih
vrsta. Kvasac, npr. ima oko 6000 gena u svom genomu i oko 5% kodira pre-iRNK koje se
splajsuju, a od njih samo nekoliko podleže alternativnom splajsovanju. Dakle, kod jednoćelijskih
eukariota alternativno splajsovanje nije glavni mehanizam za dobijanje različitih proteina. S
druge strane, složeni višećelijski organizmi se mnogo više oslanjaju na alternativno splajsovanje
kao mehanizam za dobijanje raznovrsnih proteina. Humani genom sadrži oko 20000 gena, i
pretpostavlja se da oko 70% njih podleže alternativnom splajsovanju. Neke pre-iRNK ljudi se
alternativno splajsuju dajući desetine različitih polipeptida čime se u značajnoj meri poveća
potencijal produkcije različitih proteina.
Alternativno splajsovanje nije nasumičan, već strogo regulisan događaj. Tačnije,
specifičan obrazac splajsovanja regulisan je na poseban način u svakom tipu ćelija. Možemo da
pogledamo kao primer α tropomiozin, protein koji reguliše kontrakciju ćelija. Osim u mišićnim,
ovaj protein se sinteiše i u drugim tipovima ćelija, ali u manjoj količini. Pre-iRNK sadži 14
egzona, od kojih je 6 konstitutivno eksprimiranih (prikazani crvenom bojom), što znači da su
prisutni u zreloj iRNK u svim tipovima ćelija. Konstitutivni egzoni kodiraju segmente proteina α
tropomiozina koji su neophodni za njegovu opštu strukturu i funkciju. Nasuprot tome, alternativni
egzoni (prikazani zelenom bojom) nisu prisutni u svim zrelim iRNK. Ovi egzoni tako kodiraju
verovatno delove α tropomiozina koji ispunjavaju tkivno specifične potrebe.

1
M. Kecmanović
 Slika . Alernativni načini splajsovanja pre-iRNK za α -tropomiozin pacova.

U procesu splajsovanja, splajsozom prepoznaje mesta splajsovanja i katalizuje reakcije

transesterifikacije čime se uklanjaju introni i spajaju egzoni. Neka mesta splajsovanja su “jaka” i
mogu da obezbede konstitutivno splajovanje. Međutim, za alternativno splajsovnje potrebo je
učešće proteina koji su označeni kao regulatori splajsovanja. Ključna uloga regulotora
splajsovnja jeste da promene afinitet spajsozoma ka 5’ ili 3’ mestu splajsovanja. To može da se
postigne na dva načina. Neki regulatori splajsovanja funkcionišu kao represori i inhibiraju
splajsozom da se veže za određeno mesto splajsovanja. Na slici, represor je vezan za 3’ mesto
splajsovanja i sprečava splajsozom da prepozna to mesto. Usled toga, splajsozom se vezuje za
sledeće dostupno 3’ mesto splajsovanja čime se egzon 2 uklanja iz zrele iRNK. Nasuprot tome,
pojačivači splajsovanja pojačavaju sposobnost splajsozoma da prepozna i veže se za određeno
mesto splajsovanja. Na primer, pojačivač splajsovanja se vezuje za 5’ i 3’ mesto splajsovanja
koja okružuju egzon 3, što rezultuje inkluzijom egzona 3 u zrelu iRNK.

Slika . Uloge faktora spajanja tokom alternativnog spajanja (a) Represori splajsovanja - faktori
splajsovanja mogu delovati kao represori kako bi sprečili prepoznavanje mesta splajsovanja. U ovom
primeru, prisustvo represora dovodi do preskakanja egzona 2 koji zbog toga ne ulazi u sastav zrele iRNK.

b) Pojačivači splajsovanja U ovom primeru, pojačivači splajsovanja promovišu prepoznavanje mesta

splajsovanja koja se nalaze na krajevima egzona 3, dovodeći tako do njegovog uključivanje u iRNK

2
M. Kecmanović
Regulacija ekspresije gena na nivou translacije

U uslovima smanjene dostupnosti nutrijenata, virusne infekcije, povišene temperature ili

drugih stresnih uslova za ćeliju, eukariotska ćelija generalno smanji brzinu translacije. U ovom
slučaju, dva početna koraka u inicijaciji translacije su target za inhibiciju: prepoznavanje iRNK i
vezivanje inicijatorske tRNK za 40S subjedinicu. Ovo su kod eukariota odvojeni procesi.
Uobičajeni mehanizam inhibicije translacije ostvaruje se fosforilacijom inicijacionog
faktora translacije eIF2. Ovaj faktor translacije vezuje GTP i inicijatorsku tNRKmet koju dovodi u
P mesto 40S subjedinice. Nakon što isporuči inicijatorsku tRNK u P mesto ribozoma, dolazi do
hidrolize GTP-a. Da bi eIF2 mogao da uđe u sledeći ciklus, neophodno je da se GDP zameni
GTP-om. Faktor koji vrši ovu zamenu je eIF2B. Fosforilacija α subjedinice eIF2 inhibira eIF2B,
čime se smanjuje nivo eIF2-GTP. Kako je eIF2 – GTP neophodan za isporuku inicijatorske
tRNK za 40S subjedinicu, njegov smanjen nivo ograničava inicijaciju translacije.

Slika . Put koji vodi do fosforilacija eIF2a i inhibicije translacije

Drugi mehanizam kojim se ostvaruje globalna inhibicija inicijacije translacije usmeren je

na protein koji se vezuje za 5’ kapu: eIF4E. Nakon vezanja za 5’ kapu, eIF4E se veže za eIF4G.
Za isti region za eIF4E za koji se vezuje eIF4G, vezuju se i drugi proteini (4E-BP). Ovi proteini
kompetiraju sa eIF4G za vezivanje za eIF4E i, prema tome deluju kao generalni inhibitori

3
M. Kecmanović
inicijacije translacije. Kao i eIF2, 4E-BP su takođe regulisani fosforilacijom. U svom
nefosforiliranom stanju, 4E-BP čvrsto se vežu za eIF4E i inhibiraju translaciju. U suprotnosti,
fosforilacija 4E-BP inhibira njihovo vezivanje za eIF4E. Fosforilaciju 4E-BP vrši ključna ćelijska
protein kinaza zvana mTor. Faktori rasta, hormoni i drugi faktori koji stimulišu ćelijsku deobu
aktiviraju ovu kinazu i na taj način povećavaju ukupni translacioni kapacitet ćelije.

Slika . Inicijacija translacija kod eukariota je globalno regulisana eIF4E vezujućim proteinima (4E-BP).

Regulatorni molekuli RNK kod eukariota

Projekat Genom čoveka imao je za cilj da se očita kompletna sekvenca genoma čovaka
kako bi se objasnila biološka složenost čoveka. Kao rezultat tog projekta, ustanovljeno je da u
genomu čoveka postoji oko 20.000 protein kodirajućih gena. Kao funkcionalni elementi
definisani su egzoni, ali je ustanovljeno da ovi protein-kodirajući regioni čine svega 1-2%
humanog genoma. Distribucija i zastupljenost regulatornih elementa ostala je nepoznata za koje
se i dalje smatralo da mapiraju u pustinjama između gena. Kako je postalo jasno, da složenost
biologije čoveka ne zavisi samo od gena za proteine (sekvence koje su se malo menjale tokom
evolucije), započet je nov projekat pod nazivom Enciklopedija elemenata DNK (eng.
Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE). Cilj ovog projekta bio je da se sistematski mapiraju

4
M. Kecmanović
funkcionalni elementi genoma čoveka. Ustanovlejno je da se preko 93% genoma čoveka
transkribuje i to preko > 70% sa oba lanca, odnosno da funkcionalni elementi nisu samo
protein-kodirajući regioni. Glavni rezultat ovog projekta bilo je, dakle, saznanje da se genom
pervazivno transribuje, što znači da veliki procenat genoma ima određenu, ne samo protein-
kodirajuću ulogu. Ukoliko se uporedi odnos nekodirajućih i protein-kodirajućih regiona genoma,
može se uočiti da taj odnos raste u zavisnosti od biološke složenosti organizama. Genomi
prokariota sadrže manje od 25% nekodirajuće DNK, genomi jednostavnih eukarioti sadrže
između 25 i 50% nekodirajuće DNK, a složeniji eukarioti, gljive, biljke i životinje imaju više od
50%, a dostižu približno 98,5% nekodirajuće DNK kod ljudi, čija je veličina genoma za tri reda
veličine veća od prokariota. Zapravo, pretpostavlja se da se povećanje složenosti biologije
eukariota može objasniti usložnjavanjem regulatornih mreža, koje osim proteinskih, uključuju i
regulatorne mreže koje čine nekodirajući molekuli RNK.
nekodirajuća DNK

Slika . Odnos nekodirajuće i protein-kodirajuće DNK kod vrsta različite biološke složenosti (Mattick, J.
2004, Nat Rev Genet)

Prema hipotezi RNK sveta, prvi život na Zemlji bio je zasnovan na molekulima RNK koji
su potom čuvanje genetičke informacije prepustili stablnijim molekulima DNK a katalitičke
funkcije raznovrsnijim proteinima. Tako, i centralna dogma molekularne biologije, koja se odnosi
na usmeren protok genetičke informacije u ćeliji, od DNK preko RNK do proteina, praktično
podrazumeva da su geni sinonim za protein-kodirajuće regione. Ovakvo shvatanje moralo je da
dobije svoje novo tumačenje sa otkrićem da su RNK molekuli paralelno evoluirali i da pored
ključne uloge u procesima translacije i splajsovanja koja je poznata od ranije, imaju i regulatornu
ulogu. Genomi eukariota eksprimiraju, dakle, dva nivoa informacija: iRNK koja nosi informaciju
za sintezu proteina i nekodirajuće RNK koje imaju uglavnom regulatornu funkciju.
Sve regulatorne molekule RNK možemo podeliti u dve grupe: na male nekodirajuće
RNK (<200bp) i duge nekodirajuće RNK (>200bp).

5
M. Kecmanović
Male nekodirajuće RNK

Male nekodirajuće RNK se prema biogenezi, proteinima familije argonaut sa kojima

stupaju u kontakt ali i mehanizmima kojima ostvaruju RNK interferenciju (RNKi) dele na: mikro
RNK (eng. micro RNA, miRNK), male interferirajuće RNK (eng. small interfering, siRNK) i
RNK koje interaguju sa proteinima PIWI, (eng. piwi-interacting RNA, piRNK). siRNK i miRNK,
koje su dugačke od 21-31 nukleotid, nastaju obradom dugačkih prekursora RNK enzimom
Dicer. Dicer je RNaza koja prepoznaje i digestira dugačke dvolančane RNK ili petlje kakve
formiraju prekursori miRNK. piRNK ne nastaju obradom dvolančanih prekursora, već obradom
dugačkog primarnog transkripta koja ne podrazumeva učešće enzima Dicer. Male nekodirajuće
RNK u procesu RNK interferencije usmeravaju mašineriju za utišavanje gena (eng. RNA
induced silencing complex, RISC) ka ciljnoj RNK kroz komplementarno bazno sparivnaje.

Mikro RNK (miRNK)

Mikro RNK su male nekodirajuće RNK dužine 21 do 23 nukleotida. Predstavljaju

posttranskripcione regulatore ekspresije gena. Polovina gena za proteine regulisana je miRNK,
pri čemu jedna iRNK može da bude regulisana sa više miRNK, a takođe, jedna miRNK može da
učestvuju u regulaciji više ciljnih iRNK.
Geni za miRNK mapiraju u različitim delovima genoma. Mogu biti 1) samostalno
raspoređeni u genomu, 2) mogu biti delovi gena za proteine (introni, netranslatirajući regioni,
kodirajući regioni), 3) delovi gena za duge nekodirajuće RNK ili 4) obrađeni pseudogeni.

Slika .Različiti regioni genoma kodiraju miRNK.

6
M. Kecmanović
 Zrele miRNK nastaju u kanonskom i nekanonskom putu. Kanonski put podrazumeva
da prepisivanjem gena za miRNK nastaju dugački jednolančani transkripti koji su označeni kao
primarne miRNK. Ovi transkripti veoma brzo zauzimaju sekundarnu strukturu u obliku ukosnice
unutarmolekulskim spajanjem komplementarnih regiona vodoničnim vezama. Sekundarna
struktura ukosnice obezbeđuje dvolančanost primarne miRNK (pri-miRNK), a u ručicama
ukosnice nalazi se miRNK. U početku se mislilo da se u jednoj ručici ukosnice pre-miRNK nalazi
regulatorna miRNK. Međutim, identifikovani su brojni primeri u kojima oba kraka ukosnice daju
funkcionalne miRNK (dve miRNK oznečene crvenom i plavom bojom na slici).

Slika . Struktira nekih pre-miRNK pre obrade. Crvenom i plavom bojom su obeležene sekvence miRNK
lin-4 i let-7 su identifikoane genetički, dok su miRNK sa oznakom miR identifikovane bioinformatičkim
analizama

Pri-miRNK se još u nukleusu obrađuje endonukleazom Drosha. Ovaj enzim pripada klasi
RNazaIII enzima. Enzimi RNase III su specifični za dvolančane RNK i seku ih na način koji
ostavljaju 2-nukleotida viška na 3’ kraju dvolančane RNK. Ovi nukleotidi viška su važni za
prepoznavanje tako obrađenog RNK molekula od strane sledećeg enzima u putu, Dicer.
Delovanjem enzima Drosha oslobađa se ukosnica i nastaje pre-miRNK, koja uz pomoć proteina
“izvoznika” napušta jedro i odlazi u citoplazmu. U citoplazmi, pre-miRNK seče endonukleaza
Dicer pri čemu nastaje zrela dvolančana miRNK: Oba enzima koja vrše sečenje, i Drosha i
Dicer, svoj supstrat prepoznaju na osnovu strukture, ne na osnovu sekvence.

7
M. Kecmanović
Slika . Struktura pri-miRNK sa pregledom mesta sečenja enzimima Drosha i Dicer

U citoplazmi se obrađena dvolančana miRNK udružuje sa jednim od proteina AGO i

dodatnim proteinima, formirajući kompleks miRISC. Kratka dvolančana RNK nastala aktivnošću
enzima Dicer se inkorporira u miRISC, potom se denaturiše pri čemu lanac "vodič“ predstavlja
funkcionalnu miRNK koja određuje identitet kompleksa. Drugi lanac, označen kao lanac "putnik"
se degraduje proteinom AGO ili se otklanja iz kompleksa RISC pa zatim degraduje.
Alternativan put sinteze miRNK odvija se preko mirtrona. Mirtroni su zapravo kompletni
introni protein-kodirajućih gena koji predstavljaju primarnu miRNK. Splajsovanjem mirtrona, ne
delovanjem enzima Drosha nastaje pre-miRNK. Dalje se ovaj put uliva u kanonski put, odnosno
pre-miRNK napušta nukleus i u citoplazmi biva supstrat za Dicer.

Slika . Kanonski i nekanonski put sinteze miRNK

8
M. Kecmanović
 Interakcija miRNK i ciljne iRNK ostvaruje se komplementarnim baznim sparivanjem
Vezivna mesta u iRNK za miRNK (eng. microRNA response elements, MRE) uglavnom se
nalaze u 3'-UTR, ređe u 5'-UTR ili kodirajućem region. Efekat miRNK na utišavanje gena zavisi
od stepena komplementarnosti miRNK i iRNK, te su moguća tri ishoda: a) inhibicija translacije
ciljne iRNK, b) endonukleolitička degradacija ciljne iRNK, kao i c) epigenetičko utišavanje
komplementarnih sekvenci u genomu.
Dodatni nivo regulacije ekspresije genoma posredovan je molekulima miRNK. Ove male
nekodirajuće RNK učestvuju u formiranju složenih regulatornih mreža koje se ostvaruju
međusobnom “komunikacijom” transkripata. Naime, različite endogene RNK kompetiraju za
vezivanje iste miRNK (transkripti koji sadrže iste MRE) i na taj način titriraju nivo miRNK u
citoplazmi i međusobno “komuniciraju”. Vezivanjem istih regulatornih miRNK veliki deo
transkriptoma je u datom trenutku u međusobnoj interakciji. Što je broj zajedničkih MRE veći,
veći je i nivo njihove međusobne "komunikacije", a time i koregulacija takvih RNK. Kroz
vezivanje istih miRNK, veći broj različitih iRNK je u međusobnoj komunikaciji, te na taj način
ostvaruju i međusobnu kontrolu ekspresije. Tako se molekulima iRNK pored protein-kodirajuće
može pripisati i regulatorna uloga.

Male interferirajuće RNK (siRNK)

Male interferirajuće RNK su dugačke 21-25 nukleotida i nastaju obradom endogeno

sintetisanog ili egzogenog dvolančanog RNK prekursora, obradom enzimom Dicer u citoplazmi.
siRNK stupaju u interakciju sa proteinima AGO formirajući siRISC kompleks koji učestvuje u
odbrani od virusa, kontroli transpozona i regulaciji ekspresije gena. Svoj efekat u regulaciji
ekspresije gena siRNK ostvaruju degradacijom ciljnog transkripta ili usmeravanjem
epigenetičkog utišavanja.

RNK koje interaguju sa proteinima PIWI (piRNK)

piRNK su najbrojnija klasa malih nekodirajućih RNK i evolutivno su najmanje očuvane.

Karakteristične su samo za životinje. Za razliku od miRNK i siRNK, ova klasa malih
nekodirajućih RNK nastaje obradom veoma dugačkih jednolančanih transkripata prepisanih sa
piRNK klastera u genomu, čija obrada ne uključuje enzim Dicer. Takođe, za razliku od miRNK i
siRNK stupaju u interakciju sa proteinima PIWI familije Argonaut.
Poput CRISPR sistema, piRNK učestvuju u odbrani od parazitskih nukleinskih kiselina.
Međutim, dok je glavna uloga CRISPR-a zaštita od bakteriofaga, za životinjski genom, glavna
pretnja su transpozoni. Transpozoni su prisutni u genomima svih eukariota i to u značajnom
procentu. Uloga piRNK je zaštita ćelija od aktivnih transpozona i predominantno su prisutne u
germinativnim ćelijama (ćelije čija je zaštita najvažnija). Klasteri piRNK u okviru kojih se nalazi
informacija za različite piRNK sadrže delove sekvenci transpozona, odnosno predstavljaju
zapravo „groblje transpozona “. Samim tim, piRNK generisane iz ovakvih transkripata targetiraju
transkripte koji su prepisani sa aktivnih transpozona, inhibirajući ih na taj način. DNK sekvence

9
M. Kecmanović
koje završavaju u piRNK klasterima verovatno tamo dospevaju premeštanjem u taj region, pa
se na taj način i klasteri obogate za sekvencu transpozona.
Pored endonukleolitičke degradacije transkripata prepisanih sa transpozona, piRNK
usmeravaju i epigenetičko utišavanje genomskih kopija transpozona.

Slika . Poređenje bakterijskog CRISPR (a) i životinjskog piRNK (b) odbrambenog sistema od invazivnih
nukleinskih kiselina. Iako dele mnoge osobine, molekularne komponente nisu zajedničke. Dok CRISPR
aktivno stiče nove spacer sekvence od inficirajućih faga, sekvence transpozona od kojih nastaje sistem
piRNK, pasivno stižu unutar klastera piRNK

RNK interferencija

Mehanizam koji omogućava da mali nekodirajući molekuli RNK blokiraju ekspresiju

ciljnih gena sa kojima imaju homolognu sekvencu naziva se RNK interferencija (RNKi). RNKi je
prisutna kod mnogih vrsta eukariota.
Ovaj fenomen otkriven je 1998. godine u studijama koje su se bavile izučavanjem
ekspresije gena. Tačnije, otkriveno je da dvolančane RNK mogu da inhibiraju ekspresiju iRNK
sa kojima imaju komplementarnu sekvencu. U studiji Fajera (Fire) i Meloa (Mello), za ispitivanje
ekspresije određenih gena korišćene su antisens RNK (RNK komplementarne iRNK) kako bi se
inhibirala translacija cilljnih iRNK. Međutim, ono što je bilo neobično, jeste da kada se u ćeliju

10
M. Kecmanović
pored antisense uvede i sens RNK (RNK koja ima sekvencu istu kao i ciljna iRNK), takođe
dolazi do inhibicije translacije ciljne iRNK. Još jedan kuriozitet bilo je zapažanje da su efekti
antisens RNK dugo bili prisutni u ćeliji, mnogo duže nego što se pretpostavljalo uzimajući u
obzir kratak poluživot većine RNK. Ova dva zapažanja navela su Fajera i Meloa da istraže na
koji način RNK inhibiraju iRNK kada se injeciraju u ćeliju.
U ekspreimentu je korišćen C.elegans kao model sistem jer je relativno lako injecirati
RNK u njihove ćelije, a ekspresija mnogih gena je kod njih već bila poznata. Ispitivali su ulogu
RNK u regulaciji ekspresije gena mex3 za koji je bilo poznato da se eksprimira u ranim
embrionima. Svoj eksperiment su počeli tako što su klonirali mex3 gen i njegovom ekspresijom
dobili sens RNK. Takođe su napravili i drugu verziju gena mex3 kod koje je promotor tako
postavljen da je omogućena sinteza antisens RNK.
U sledećem koraku, dobijene RNK su injecirane u jaja C. elegans i praćen je efekat kod
embriona u razvoju. U jednom slučaju injekcirana je samo antisens RNK, a u drugom sens i
antisens RNK koje zbog komplementarnosti formiraju dvolančanu RNK. Takođe su koristili jaja
u koja ništa nije injekcirano, kao kontrole. Da bi odredili ekspresiju gena mex3, inkubirali su
embrione (i one u koje je injekcirana RNK i kontrole) sa obeleženom probom koja je
komplementarna iRNK mex-3. Ukoliko ćelije eksprimiraju gen mex-3, iRNK u ćelijama će se
vezati za obeleženu probu.

Slika . Uvođenje antisense i dvolančane (sense + antisense) RNK u C. elegans i njihov efekat na
utišavanje iRNK

11
M. Kecmanović
 Kontrolni embrioni su pod mikroskopom bili tamni (proba je hibridizovala sa mex3 iRNK),
što znači da je mex3 gen eksprimiran. U embrionima u koje je injekcirana samo antisens RNK,
nivo mex3 iRNK je bio nešto niži (ekspresija je smanjena). Međutim, ono što je bilo
iznenađujuće, jeste da u ćelijama u koje je injekcirana dvolančana RNK (sense+antisense), nije
bilo ekspresije mex-3 iRNK (ekspresija je inhibirana). Ovi rezultati su ukazali da dvalančana
RNK ima mnogo veći potencijal da blokira ekspresiju gena u poređenju sa jednolančanom
antisens RNK. U ovom konkretnom slučaju, dvolančana RNK dovela je do degradacije mex3
iRNK.

Slika . Rezultati eksperimenta – dvolančana RNK dovodi do potpunog utišavanja ekspresije gena - RNK
interferencija

Iako otrkrivena kao rezulat eksperimenta, RNKi je danas prilagođena eksperimentalna

procedura za utišavanje gena. Sličan mehanizam otkriven je kod prokariota 2013. godine –
CRISPR. Slično CRISPR sistemu i RNKi predstavlja urođen imunski sistem za odbranu od
invazivnih nukleinskih kiselina, međutim osim od spoljašnjih neprijatelja (virusa), RNKi je
mehanizam odbrane i od unutrašnjih neprijatelja (transpozona). Posredstvom ovog mehanizma
vrši se i epigenetička regulacija i kontrola transkripcije.
Tokom RNK interferencije formira se utišavajući kompleks RISC (eng. RNA induced
silencing complex) čije su osnovne komponente 1) mala nekodirajuća RNK i 2) proteini familije
Argonaut (AGO i PIWI). U pitanju je modularni mehanizam s obzirom da male nekodirajuće
RNK i proteini familije Argonaut mogu da se kombinuju na najrazličitije načine dajući izuzetnu
plastičnost ovom sistemu. Identitet kompleksu daje mala nekodirajuća RNK koja ga usmerava
ka ciljnim, komplementarnim, sekvencama. Ishod RNK interferencije zavisi od stepena
komplementarnosti male nekodirajuće RNK i ciljne iRNK i može da bude a) degradacija ciljne
iRNK, b) utišavanje translacije i c) epigenetička regulacija (RISC kompleks se vraća u nukleus
gde vrši regrutovanje kompleksa za remodelovanje hromatina i na taj način inhibira ekspresiju
sa okolnih promotora).

12
M. Kecmanović
Slika . Nastanak miRNK i siRNK i mehanizam njihovog delovanja. Obrada dvolančaog RNK prekursora
kako bi nastala siRNA i obrada pre-miRNK kako bi nastala miRNK, delovanjem enzima Dicer u
citoplazmi. SiRNK i miRNK usmeravaju kompleks za utišavanje gena ka komplementarnim sekvencama
iRNK. Ukoliko je kompletno komplementarno sparivanje, dolazi do degradacije ciljne iRNK, a ako je
komplementarnost delimična, dolazi do inhibicije translacije ciljne iRNK. RISC kompleks može da se vrati
u nukleus gde regrutuje komplekse za remodelovanje hromatina i na taj način inhibira ekspresiju gena.

13
M. Kecmanović
 RNK interferencija je veoma efikasan mehanizam s obzirom da su vrlo niske
koncentracije dvolančane RNK dovoljne da dovedu do potpune inhibicije ekspresije ciljnog
gena. Amplifikaciju inhibitornog signala vrši RNK zavisna RNK polimeraza (eng. RNA-
dependent RNA polymerase, RdRP) i deo je RISC kompleksa.

Slika . Amplifikacija interferirajućeg signala od strane RNK zavisne RNK polimeraza (RdRP).

14
M. Kecmanović