ZNAČAJ GENETSKIH ANALIZA U

SAVREMENOJ
LABORATORIJSKOJ PRAKSI
mr.sci.ph Drina Topalov
Specijalista medicinske biohemije
Zavod za laboratorijsku dijagnostiku Konzilijum

28. STRUČNI SASTANAK

SPAS-Udruženje privatnih apotekara Srbije
26.. April 2013..
Hotel METROPOL-
METROPOL-Palace,
Palace, Beograd
 Struktura DNK i RNK
DNK
RNK

pentoza - H3PO4
5’ NUKLEOTID 1 pentoza - H3PO4 NUKLEOTID 2 NUKLEOTID N 3’

Fosforna
Nukleozid
kiselina
Purinske
Baze (adenin,
Guanin)

Šećer
Glikozidna veza Azotna baza
Pentoza
Pirimidinske
baze (Citozin,
Timin)
Šta je genetika? genesis – poreklo
Nauka koja se bavi proučavanjem procesa
nasleđivanja i variranja osobina iz generacije u
generaciju
Razvoj genetike počinje sa HH vekom, ekspanziju
doživljava u poslednjim decenijama HH veka.
Tvorcem genetike smatra se Gregor Mendel
(1822–1884), ali njegovi radovi nisu bili priznati.
Pre Mendela postojala je „teorija mešanja“, koja
kazuje da se telesne tečnosti roditelja mešaju
prilikom razmnožavanja i da se osobine potomaka
ne mogu predvideti.
Mendel uvodi partikularnu teoriju, po kojoj osobine
nisu bilo gde već na posebnim česticama
(partikulama) – genima.
 Šta su geni?
– To su prenosioci naslednih osobina koji
određuju karakteristike jedinke
– To su segmenti DNK
(odnosno hromozoma)
– To je niz nukleotida (u proseku od 600
do 1800) koji nosi šifru za sintezu
jednog funkcionalnog produkta,
polipeptida ili RNK.
 Šta su hromozomi ?

Hromatinski materijal jedra koji se u

toku ćelijske deobe organizuje u
štapićaste strukture.
Čine ih DNK i pridruženi proteini
(histoni)
Vrsta su specifični u smislu broja i
oblika.
 Šta je humani genom?

GENOM je skup gena на haploidnom

setu hromozoma
(23 hromozoma-germinativne ćelije)
 Šta je genotip?

Skup gena u somatskim ćelijama,

odnosno u čitavom organizmu
 Šta je homozigotnost i
heterozigotnost?

Aleli su različite forme istog gena.

Homozigotnost je prisutnost istih

alela na hromozomskom paru.

Heterozigotnost je prisutnost
različitih alela na hromozomskom
paru.
 Šta je fenotip?

Fenotip je rezultat uzajamnog

dejstva genotipa i spoljašnje sredine
Označava sve unutrašnje i spoljašnje
karakteristike organizma.
 Koji su tipovi nasleđivanja?
Osobina je posledica interakcije genskih
alela.
U vezi sa tim razlikujemo nekoliko
tipova nasleđivanja.

2 osnovna tipa nasleđivanja su:

dominantno nasleđivanje (u tim slučajevima
potrebna je samo jedna mutacija da bi se osobina
ispoljila u 50% potomaka-Apertov sindrom).
recesivno nasleđivanje (u ovom slučaju da bi se
ispoljila osobina potrebno je da se od oba
roditelja naslede mutacije).
 Tipovi nasleđivanja
Dominantno Recesivno
Nasleđivanje krvnih grupa
 GENETSKE ANALIZE
Omogućavaju “čitanje” GENA- delova DNK u kojima su
zapisane informacije o celokupnom organizmu, pa i o
sklonostima ka određenim bolestima.

Uglavnom se rade SAMO jednom u životu.

Mogu se raditi na bilo kom biološkom materijalu:
krv
bris bukalne sluzokože
cervikalni bris, uretralni bris
urin, feces
plodova voda, CVS (horionske čupice), abortni materijal,
fetalna krv
tkivo iz parafinskih kalupa
koren dlake, opušak cigare...
 PCR metoda

Predstavlja umnožavanje željenog

dela DNK lanca
Prajmerima se ograničava deo DNK
lanca od interesa
Umnožena DNK se dalje analizira
jednom od tehnika
Šematski prikaz PCRa (Lančane Reakcije Polimeraze)

Denatiuracija DNK na 92ºC

Vezivanje prajmera na 50-60ºC
Sinteza (elongacija) DNK 72º C
Broj ciklusa i temperaturne uslove diktira
specifičnost gena od interesa.
 Shema PCR-a
(eng. Polymerase Chain Reaction)
 Tehnike za detekciju DNK

FRAGMENTNA ANALIZA
SEKVENCIRANJE GENA
ELEKTROFOREZA NA AGAROZNOM
GELU
REAL-TIME PCR
 FRAGMENTNA ANALIZA

Prenatalna dijagnostika
Utvrđivanje očinstva
Genetski profil
Mikrodelecijski sindromi
Bilijarna atrezija
 Prenatalna dijagnostika
PCR metoda u PRENATALNOJ DIJAGNOSTICI
se koristi za detekciju najčešćih
hromozomskih abnormalnosti:
• DOWN sy. -TRIZOMIJA 21. HROMOZOMA
• EDWARDSOV sy. -TRIZOMIJA 18. HROMOZOMA
• PATAU sy. -TRIZOMIJA 13. HROMOZOMA
• TARNEROV sy.,
• KLINEFELTEROV sy.
• ANALIZA POLNIH HROMOZOMA X I Y.

ANALIZA FETALANOG TKIVA PORED 13., 18., 21.

i POLNIH HROMOZOMA UKLJUČIJE
i 15., 16. i 22. HROMOZOM.
 FRAGMENTNA ANALIZA:

Posmatra hromozome ili velike delove DNK.

Fragmenti hromozoma su predstavljeni pikovima
Analizom dobijenih pikova dolazi se do informacije da li postoji
poremećaj ili ne.
 Downov Syndrom
“Spectral caryotyping” GTG band
 Downov sindrom
učestalost u ljudskoj populaciji je 1:700 živorođenih
umna zaostalost; IQ = 40-50,
mada ima podataka da IQ
može biti i od 25 do 75;
anomalije srca praćene
u različitom stepenu
anomalijama (nenormalnostima)
drugih organa,
smanjena otpornost
prema infekcijama,
povećan rizik za
pojavu leukemije,
prevremeno starenje
Trizomija 13 (Patau) i 18 (Edwards)
Klinefelter i Tarnerov sindrom
PREDNOSTI PCR METODE:
• kratko vreme za dobijanje rezultata (24h)

• analiza se može uraditi i u kasnoj trudnoći

(i do 28. nedelje)

• detektovanje kontaminacije majčinim ćelijama

• moguće je uraditi neograničen broj analiza

• Dovoljna je mala količina uzorka (2-5ml

amniona, 1-2 horinske čupice)

• pouzdanost 97%
 UZORCI
za prenatalnu dijagnostiku su:

•AMNIONSKA TEČNOST - 2ml do 20ml

•CVS-HORIONSKE ČUPICE – 2 do 10 horionskih čupica
•ABORTNI MATERIJAL uz uzorak majke radi
poređenja genetskih profila
•Fetalna krv

Analizu možemo raditi i kod već rođene dece i

odraslih iz krvi ili brisa bukalne sluzokože
 UTRVĐIVANJE OČINSTVA :

•Radi se iz brisa bukalne sluzokože, krvi, korena dlake,

amnionske tečnosti, CVS, abortnog materijala, fetalne krvi,
opuška cigare, korišćene čaše, ili bilo kog drugog biološkog
materijala
•Analiza se radi poređenjem dva genetska profila
•Analiza traje dva do tri dana
 MIKRODELECIJSKI SINDROMI
PCR metodom mogu se detektovati sledeći sindromi:
•Prader-Willi sy.
•Smith-Magenis sy.
•Miller-Dieker sy.
•Allagil sy.
•Williams sy.
•Delecija 1p36
•DiGeorge sy.
•Sotos sy.
•Saether-Chotzen sy.

Analiza se radi iz citratne krvi, uzoraka za prenatalnu dijagnostiku ili

brisa bukalne sluzokože.
 SEKVENCIRANJE GENA

BRCA1 i BRCA2 GEN

Hemohromatoza
Cistična fibroza
Wilsonova bolest
Intolerancija na laktozu
Trombofilije
EFGR gen
Analiza fecesa za kancer debelog creva
 SEKVENCIRANJE DNK LANCA
•Analiza GENA - ne posmatraju se hromozomi već GENI

•U svakoj ćeliji imamo DNK jednu nasleđenu od oca jednu od majke

•Mutacije koje smo nasledili od oca ili majke se nazivaju

•GERMINATIVNE MUTACIJE i postoje u svakoj našoj ćeliji

•Mutacije koje smo stekli u toku života se nazivaju SOMATSKE

•MUTACIJE i prisutne su samo u pojedinim ćelijama organizma

•Zato analizu germinativnih mutacija možemo raditi iz bilo kog

•biološkog uzorka a somatske mutacije ciljano iz odgovarjućih
•organa
 SEKVENCA PRIKAZUJE PIKOVE KOJI
ODGOVARAJU REDOSLEDU NUKLEOTIDA
OD KOJIH JE SASTAVLJEN DNK LANAC
GERMINATIVNE MUTACIJE koje se rade iz bilo kog biloškog
uzorka su:
•HEMOHROMATOZA-HFE gen
•WILSONOVA BOLEST-ATP7B gen
•CISTIČNA FIBROZA-CFTR gen
•GENI ZA TROMBOFILIJE-Leiden V, PII, MTHFR i PAI gen
•MC4R
•MIKRODELECIJE Y HROMOZOMA
•Intolerancija na laktozu-LCT gen
•Gaucheova bolest
•Apert-ov sindrom
•Huntingtonova bolest
•Friedreichova ataxia
•Spinocerebralna ataxia tip 1
•BTNL2 gen

GERMINATIVNE MUTACIJE koje moraju da se rade iz krvi su:

•BRCA 1 I 2 gen
 Apertov sindrom

Uzrok: U 2/3 slučajeva uzrok je mutacija na genu

za FGFR
SOMATSKE MUTACIJE se rade iz:

•Parafinskog kalupa kod

analize EGFR gena – PLUĆA

•Parafinskog kalupa kod

analize KRAS - DEBELO CREVO

•FECES- analiza:
APC gena,
KRAS gena,
LONG DNA,
MSI,
p53 gen
 ANALIZA BRCA 1 i BRCA 2 GENA
KARCINOM DOJKE I JAJNIKA

Mutacija u BRCA1 i BRCA 2 genima dovodi do

povećanog rizika za razvoj karcinoma dojke i
jajnika

Žene sa ovakim mutacijama su u riziku da se

tumor razvije na obe dojke

Mutacije u BRCA genu se prenose na muške

potomke - to ne znači da će oni razviti tumor
ali mogu da budu tihi prenosioci mutacije na
njihova ženska potomstva
 FAKTORI RIZIKA ZA RAZVOJ
TUMORA DOJKE I JAJNIKA

Tumor dojke kod jednog ili više bliskih rođaka

Rana pojava tumora dojke ili jajnika kod članova
porodice ( pre 50-te godine života)
Tumor dojke ili jajnika u više od jedne generacije
Tumor u obe dojke kod jednog ili više članova porodice
Tumor pankreasa u porodici
 ŠTA SE DEŠAVA KADA
POSTOJI MUTACIJA U BRCA GENU?
Svaka osoba ima dve kopije svakog gena
Mutacija u jednoj kopiji BRCA gena kod ćelija dojke i jajnika NE DOVODI do
problema (druga zdrava kopija može i dalje da produkuje protein koji kontroliše
ćelijski rast)
Mutacija mora da se desi u obe kopije BRCA gena u istoj ćeliji da bi se izgubila
kontrola rasta i razvio tumor

ŠTA SE DEŠAVA KAD OSOBA NASLEDI MUTACIJU U BRCA GENU?

NORMALNA KOPIJA Osoba se rađa sa jednom kopijom

BRCA gena koja nosi mutaciju u
MUTACIJA svakoj ćeliji.
PROTEIN SE NORMALNO
Druga kopija gena je zdrava i normalno
PRODUKUJE obavlja svoj posao
Takva osoba se naziva
‚‚BRCA GENE CARRIER‚‚
BRCA gene
 MUTACIJA MUTACIJA
MUTACIJA

PROTEIN NIJE
FUNKCIONALAN
ILI SE NE
PROIZVODI

nosioc BRCA mutacije ćeliju pogađa druga mutacija

• sa godinama mutacije nastaju u u različitim genima, u različitim ćelijama

• Ukoliko se u ćeliji koje već nosi BRCA mutaciju dogodi druga mutacija,
takva ćelija više nema normalnu kopiju gena i BRCA protein se neće
produkovati i ćelija postaje besmrtna-TUMOR
 DUBOKE VENSKE TROMBOZE
• Prema dosadašnjim naučnim dokazima, promene na četiri gena
uzrokuju naslednu trombofiliju - sklonosti ka stvaranja
tromboza.
U pitanju su:
• faktor 5 Lieden (R506Q),
• faktor 2 (Prothrombin G20210A)
• MTHFR-metilentetrahidrofolat reduktazu (677C>T)
• PAI-1 gen (4G/4G,4G/5G,5G/5G genotip)
 ELEKTROFOREZA
NA AGAROZNOM GELU

Mikrodelecije Y Hromozoma
Polno prenosive bolesti
Virusi influnece A/B
 MUŠKI STERILITET
PROVERA Y HROMOZOMA
• Mikrodelecije Y hromozoma, odnosno nedostaci ili gubici gena koji utiču
na formiranje muških polnih ćelija tokom embrionalnog razvoja, mogu
dovesti do smanjenja ili potpunog nedostatka spermatozoida kod muških
potomaka.

• Ovakve promene nisu vidljive standardnim mikroskopskim procedurama

i jedini način da se proveri nasledni faktor jeste PCR metoda.

• PCR metodom se analiziraju svi geni u okviru AZFa, AZFb i

AZFc regiona.
 REAL-TIME PCR

HPV genotipizacija “high risk genotipova”

RH faktor ploda iz krvi RH negativne
majke
Pol ploda iz krvi majke
Kvantifikacija virusa (HIV, HCV, HBV)
 na REAL-TIME PCR metodi zasniva se:
• HPV genotipizacija
• RhD faktor ploda iz krvi trudnice
• Pol ploda iz krvi trudnice
• Kvantifikacija HBV, HCV i HIV virusa
Uzorci za analizu su:

HPV-genotipizacija : cerviklani bris kod žena, uretralni bris ili

prvi jutrnji urin kod muškaraca

RHD faktor ploda : 15ml venske krvi sa EDTA

Pol ploda : 15ml venske krvi sa EDTA

Kvantifikacija virusa : 5ml venske krvi sa EDTA

NAJNOVIJA TEHNOLOGIJA U DETEKCIJI
HUMANOG PAPILOMA VIRUSA - HPV
i DRUGIH PATOGENA
CT/NG TEST
Prikaz nalaza sa Cobas 4800
• postoji preko 100 genotipova HPV-a
od kojih su oko 40 seksualno prenosivi

•HPV infekcija može prouzrokovati:

1. Ne-maligne lezije (low-risk tipovi)
2. Invazivne kancere (high risk tipovi)

•HPV je odgovoran za preko 99% cervikalnog kancera

•HPV je najčešće sekusalno prenosiva bolest

•Preko 75% žena biva izložena HPV infekciji u toku života

•Stalne infekcije sa jednim ili više od 14 high

 Cobas 4800 HPV test
tri rezultata iz jednog testa

Detektuje 14 high-risk
genotipova i daje tri rezultata:
•Individualni rezultat za
31, 33, 35, genotip 16
39, 45, 51,
52, 56, 58, •Individualni rezultat za
59, 66, 68 genotip 18
•Grupni rezultat za ostalih
12 high-risk genotipova

Beta-globin se koristi kao

interna kontrola,
radi provere adekvatnosti uzorka
 FETALNE ĆELIJE U MAJČINOJ PLAZMI

• 90-tih godina pronađene slobodno-cirkulišuće fetalne ćelije

u majčinoj plazmi

• nastaju nakon apoptoze trofoblasta embriona

• sastoje se od kratkih fragmenata DNK

• prisutne su u majčinoj cirkulaciji već od 5. nedelje trudnoće

• poluživot 16 sati

• nestaju dva sata posle porođaja

DETEKCIJA RhD FETUSA IZ KRVI MAJKE
• Detekcija 7. i 10. exona RHD gena real-time PCR-om (RT-PCR)
• detekcija pola fetusa iz krvi majke:
- upotreba SRY gena (pol determinišućeg gena)
• korišćenje interne kontrole - gen za β globin
 10.nedelja
trudnoće

REZULTAT ANALIZE:
•RHD NEGATIVNI ŽENSKI POL
REZULTAT ANALIZE:
•RhD POZITIVNI ženski pol
•RhD NEGATIVNI muški pol
•RhD POZITIVNI muški pol

OBAVEZNO KONAČAN
PONAVLJANJE REZULTAT
 ANALIZU RhD FENOTIPA FETUSA
bi trebalo raditi
SVIM RhD NEGATIVNIM TRUDNICAMA

METODA JE NEINVAZIVNA MOŽE SE RADITI U PRVOM

TRIMESTRU TRUDNOĆE
Analize koje se rade u KONZILIJUMU
• Brza prenatalna dijagnostika
• Detekcija Gaucher-ove bolesti - GBA gen
• Detekcija Willsonove bolesti - ATP7B gen
• Analiza BRCA1 i BRCA2 gena - karcinom dojke i jajnika
• Analiza gena za duboku vensku trombozu
(Leiden V, MTHFR i protrombin II)
• Analiza HFE gena-hemohromatoza (poremećaj u metabolizmu Fe)
• Nasledni oblici gojaznosti - analiza gena za MC4 receptor
• Analiza mikrodelecija Y hromozoma (muški sterilitet)
• Utvrđivanje očinstva
• Cistična fibroza -CFTR gen
• Kolorektalni kancer iz fecesa - APC, p53, K-ras, MSI, long DNA
• Mikrodelecijski sindromi - Prader-Willi sy., DiGeorge sy., Sotos sy.,
Williams sy., Smith-Magenis sy., Miller-Dieker sy., Alagille sy.,
Saethre-Chozen sy., 1p36 delecija
• Analiza EGFR gena-personalizacija terapije karcinoma pluća
• Analiza K-ras gena - personalizacija terapije karcinoma
debelog creva
• Genetska analiza LCT gena - intoleracija na laktozu
• Intolerancija na gluten - HLA tipizacija
• PCR na polno prenosive bolesti
• Real-time analiza HPV genotipizacije
Analize koje se rade u KONZILIJUMU

•Određivanje RhD faktora fetusa iz krvi majke

•Određivanje pola ploda iz krvi majke
•Detekcija Apertovog sindroma
•Detekcija Huntingtonove bolesti
•Detekcija Spinocerebralne ataxie tip 1
•Detekcija Friedreichove ataxie
•Analiza BTNL2 gena - rizik za razvoj sarkoidoze
•Real-time kvantitativna detekcija HCV virusa
•Real-time kvantitativna detekcija HBV virusa
• Real-time kvantitativna detekcija HIV-a
Chromosomally Normal Egg Chromosomally Abnormal Egg

Egg from a woman in her 20's Egg from a woman in her early 40's
Chromosomes line up straight on spindle Chromosomes line up erratically –
a mishap during chromosome
separation is much more likely
 Prikaz slučaja Ca-125
kao odgovor na prošlogodišnje pitanje
Hvala na pažnji

28. STRUČNI SASTANAK

SPAS-Udruženje privatnih apotekara Srbije
26.. April 2013..
Hotel METROPOL-
METROPOL-Palace,
Palace, Beograd