ANALITIKA ENZIMA

 JETRENI ENZIMI
1) AMINOTRANSFERAZE
 Kolorimetrijske metode
- Diskontinuirane metode
- Kuplovanje sa hromogenom reakcijom
- 2,4 dinitrofenilhidrazin reaguje sa okso kiselinama
 Spektrofotometrijske metode
- Kontinuirane metode
- Kuplovanje sa specificnim dehidrogenazama

 Odredjivanje aktivnosti AST

L- aspartat + 2-oksoglutarat --- AST, P-5“-P  oksaloacetat + L – glutamat

- Sistem sadrzi 2AK i 2 oksokiseline

- Supstrati : L -aspartat i 2- oksoglutarat
- Indikatorska reakcija, indikatorski enzim malatdehidrogenaza
- Oksaloacetat sa NADH, ox koenzima NAD+, pad A

 Odredjivanje aktivnosti ALT

L – alanin + 2- oksoglutarat ---ALP, P- 5“ –P  piruvat + L- glutamat

- Sistem sadrzi 2AK i 2 oksokiseline

- Supstrati : L -alanin i 2- oksoglutarat
- Indikatorska reakcija, indikatorski enzim laktatdehidrogenaza
- Piruvat sa NADH, ox koenzima NAD+, pad A

 Metode separacije i kvantifikacije izoenzima AST

 Elektroforetsko razdvajanje
- Anjonski izoenzim citoplazmatski AST (c-AST)
- Katjonski izoenzim mitohondrijalni AST (m-AST)
- Niske vr m-AST u normalnom serumu su granica detekcije ove metode
 Imunoprecipitacione metode
 Homogena inhibicija
- Selektivna proteoliza sa proteinazom K citosolnog AST omogucava
automatizaciju mjerenja m-AST jer se onda mjeri samo ovaj izoenzim pri
merenju aktivnosti AST
2) GAMA GLUTAMIL TRANSFERAZA

o Nehemoliziran serum, EDTA plazma

 Ranije metode su koristile L- gama – glutamil-p-nitroainlid (GGPNA) kao supstrat

i sa glicilglicinom kao akceptorom gama-glutamil ostatka.
- GGPNA ima ogranicenu rastvorljivost u reakcionoj smesi i tesko je postici
konc.supstrata kojima se enzim zasiti.
- Stvoreni p-nitroanilin u ovoj reakciji je zuto obojen i prati se na 405 nm.
- Koriste se i derivati GGPNA sa bocnim grupama na benzenskom prstenu:
 Povecana rastvorljivost u vodi
 Primer: L-gama-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid

o Gama- glutamil- p- nitroanilid + Glicilglicin ---GGT, pH=8,2 

p- nitroanilin + gama- glutamilglicilglicin

 IFCC referentna metoda

- Supstrat : L-gama-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid
- Akceptor : Glicilglicin
- Pufer: Glicilglicin
- Temperatura: 37C
- Meri se : 5-amino-2- nitrobenzoat na 410nm
 3) 5“ NUKLEOTIDAZA – NTP

- Supstrati: adenozin-5“-monofosfat (AMP) i inozin- 5“monofosfat (IMP)

- Supstati su organski fosfatni estri i oni mohu biti hidrolizovani i drugim enzimima,
prevashodno nespecificnom alkalnom fosfatazom, cak i pri pH nizem od 7,5 koji je
inace optimalan za NTP.
- Metode odredjivanja NTP moraju da koriguju hidrolizu nespecificnim fosfatazama.

Inozin – 5“-monofosfat --- NTP  inozin ---purin nukleozid fosfohidrolaza 

hipoksantin---ksantin oksidaza  mokracna kiselina + H2O2

H2O2 + hromogen  H2O + obojeni kompleks 510 nm

- Uklanjanje interferenci drugih fosfataza:

Efekat ALP na IMP je inhibiran sa beta- glicerofosfatom. Ova supstanca je supstrat za

ALP ali ne i za NTP. Time se smanjuje ALP koja bi hidrolizovala supstrat za NTP, inozin
monofosfat.

4) GKUTAMAT DEHIDROGENAZA – GLD

L – glutamat ---GLD (NAD  NADH )  Ketoimino kiselina

Ketoimino kiselina ---spontano (H2O  NH3)  2- oksoglutarat

o Kontinuirana metoda
- Reakcija GLD moze se odvijati u oba smera
- Ravnoteza forsira stvaranje glutamata, veca brzina je dobijena kada je
2- oksoglutarat koristen kao supstrat
- Reakciona smesa : NADH, amonijumova so i ADP u puferu pH 7,5
- Reak zapocinje dodatkom 2- oksoglutarata
- Meri se pad A na 339 nm.
 U reakcionu smesu se dodaje oksamat jer ova kiselina inhibira aktivnost LD,
i na taj nacin izbegava koristenje NADH od strane ovog enzima.
5) LAKTAT DEHIDROGENAZA – LDH ILI LD

1) Laktat + NAD+ ---LDH  piruvat - metoda krajnje tacne

pH = 8,8 – 9,8
2) Piruvat + NADH --- LDH  laktat
pH = 7,4 – 7,8
3) Kompleksiranje sa DNPH (dinitofenilhidrazin)
Stvaranje obojenog produkta sa piruvatom
4) Odredjivanje fluorescirajuceg NADH – metoda krajnje tacne
Laktat  piruvat + NADH fluorescirajuci
5) Metoda sa tetrazolijem
Oslobodjeni NADH + tetrazolijum ---- gradjenje obojenog kompleksa

METODE SEPARACIJE I KVANTIFIKACIJE IZOENZIMA LD

1) Elektroforeza na agaroznom gelu i celuloza acetatu

- Metoda koja se najcesce koristi za razdvajanje izoenzima LD
- Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom reakciona smesa se preliva
preko potpornog medijuma. Reakciona smesa obicno sadrzi L-laktat
500mmol/L, NAD+ 13mmol/L, obicno rast.u puferu pH 8,0
- Oslobodjeni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje : fluorescencijom
detektuje se UV 365 nmili redukcijom tetrazolijum soli u obojeni
formazan (plavi).

2) Selektivna inhibicija i to LD-2 do LD-5 i omogucavaju odredjivanje samo LD-1

Inhibitori su : 1,6- heksandiol, natrijumperhlorat, gvanidintiocijanat

3) Imunoprecipitacija
- Antiserum (kozji) na LD-5 se koristi za merenje LD-1
- -Antiserum precipitira LD -2 do LD-5
- U supernatantu ostaj LD-1
 6) HOLINESTERAZA

Metode određivanja aktivnosti serumske holinesteraze

Suprtrati: soli joda acetilholina, butiltioholina, benzotioholina, sukciniltioholina

Indikatorska reakc:
- oslobođeni tioholin reaguje sa Elmansoviim reagensom (DNTB) i 2- nitrobenzoatom

Proizvod reakcije :
- 5- merkapto-2- nitro benzoik, A= 410 nm

Butiltioholin-- (serum holinesteraza) --> butarat + tioholin

tioholin + DTNB  5-MNBA

Određivanje inhibivcije dibukainom

Prema osjetljivosti na inhibiciju lokalnim anestetikom postavljena je metoda za ident
osoba tj. tipova holinesteraze uoicajni, intermedijarni i atipicni

DIBUKAINSKI BROJ

- konc dibukainaoda je 10- mol /l

- uobicajna CHE je inhibirana 80%
- atipicna 20%
- za identifikaciju ostalih fenotipova koristi se natrijum fluorid

serum je uzorak izbora

 ENZIMI PANKREASA

ODREDJIVANJE AKTIVNOSTI ALFA AMILAZE

Metode:

-Saharogene

-Amilklasticne

-Wolgemounth

-Hromoliticke

1.Saharogena metoda

Skrob--------> glukoza + maltoza-------> reducirani supstrat

amiaza

Glukoza i maltoza se mogu odrediti enzimatskim reakcijama

2.Amiloklasticna metoda

Skrob + I2--------> Plavii komplex---------> Crveni komplex

amilaza

Brzina nastanka plavog komplexa= aktivnost amilaze

Skrob se moze mjeriti i turbidimetrijski

  Nove metode sa dobro definisanim supstratima

Supstrati: Maltopentoza i maltotetroza(dobra stabilnost)

1.Kaufman Tietzova metoda

Skrob-------------> maltotrioza+maltoza+dekstrini

amilaza

Maltoza +maltotrioza----------> glukoza

alfa glukozox

Glukoza +1/2O2-------->H2O2 + delta glukonolakton

GOD

Dodavanje peroksidaze H202+abts------>H20 +abts(obojeni hromogen)

2.Du Pont Aca

Maltopentoza------ maltotrioza+maltoza

amilaza

maltoza+maltotrioza----- glukoza

alfaglukozidaza

Glukoza + ATP------ G6P+AdP

heksoiknaza

G6P+NAD----------- 6 fosfoglukono lakton+NADPH

G6PDH
3.Odredjivanje amilaze sa heksokinazom

Maltotetraza-------2 maltoza

alfa amilaza

Maltoza+Pi------------ glukoza+glukoza1fosfat

maltozofosforilaza

Glukoza1fosfat------------ glukoza6fosfat

fosfoglukomutaza

gukoza6fosfat+NAD-------6fosfoglukonolakton+NADPH

G6PDH

Mjeri se nadph na 340nm

Nema glukoze i maltotrioze

Nize vrijednosti alfa amilaze

4.Odredjivanje amilaze sa 4 nitrofenil glikozidnim supstratom

4NP(glukoza)7------ 4NP(glukoza)4,3,2 + (glukoza)5,4,3

amilaza

4NP(glukoua)4,3,2 -----------4NP(glukoza)4 +xglukoza +NP 405nm

U originalnoj metodi rezultat kombinovane hidrolize AMY iz uzorka i sa reagensom alfa

glukozidazom, nastaje vise od 30% slobodnog NP.
  Metode separacije i odredjivanja alfa amilaze:
- Elektroforeza
- Izolelektricno fokusiranje
- Jonoizmjenjivacka hromatografija
- Selektivna inhibicija S AMY pomocu inhibitora iz klice zitarica
- Imunoprecipitacija sa monoklonalnim antitijelima
- Imunoinhibicija

ODREDJIVANJE AKTIVNOSTI LIPAZE

-Postoji veci broj metoda koje kao supstrat koriste trigliceride i netrigliceride.

-Metode koje koriste trigliceride pokazuju bolju korelaciju sa klinickim stanjima u odnosu
na druge metode.

Principi:

Titrimetrijske, turbidimetrijske, spektrofotometrijske, fluorimetrijske, imunoloske tehnike

1.Titrimetrijske metode

Cherry Crandallova metoda

LPS katalizira hidrolizu masnih kiselina iz emulzije masinovog ulja ili oleinske kis.

Titracija masnih kiselina sa razblazenim alkalijama

Kineticke verzije koriste automatski potenciometrijski titrator

Kolicina upotrijebljene baze se mjeri u jedinici vremena i sluzi za mjerenje stvorene

kolicine masnih kis u toku reakcije.

Apsorbanca se mjeri na 340nm

deltaA/min je mjera enzimske aktivnosti LPS, nekad apsorbanca umjesto da opada raste
uslijed rasta turbiditeta(reumatoidni faktor)
Linearnost ogranicena

2.Spektrofotometrijske metode

Koristi se veiki broj supstrata i kompleksa, pomocnih i indikatorskih enzima

•Sintetički supstrat 1-oleoil-2,3-diacetilgliceroli emulgator je dodecilbenzensulfonat.

•LPS aktivnost se mjeri sa kompleksom pomoćnih i indikatorskih enzima i produkuje

obojeni proizvod kojise mjeri na 550nm.

•Substrat je više specifičan za intestinalnu nego pankreasnu lipazu

3.Imunohemijske metode

4.Elisa test
 ENZIMSKA DIJAGNOSTIKA OBOLJENJA MISICA

ANALITIKA KREATIN KINAZE

-Odredjivanje ukupne CK

- Separacija izoenzima CK:

hromatografija

elektroforeza

imunohemija

- Odredjivanje izoencima CK-MB

imunoinhibicija-> odr aktivnosti CK-MB

imunoesej-> odr masene koncentracije CK-MB

- Seperacija izoformi CK
 1) Odredjvanje aktivnosti ukupne CK

Metode: fotometrijske, fluorometrijske,kuplovane

Komercijalni testovi koji koriste kreatin fosfat kao supstrat

Kreatin fosfat + ADP--CK---- kreeatin + ATP

ATP+glukoza-----HEKSOKINAZA--------G6P + adp

G6P+NADPH-----G6PDH-----6fosfogukonat +NAD

To je Szsasova metoda, referntna

Uloga MG jona, zastita SH grupa

Dodatak NAC

2) Bioluminiscentne metode

Osjetljivije od spektrofotometrijskih

KP+ADP------- K + AtP

CK

ATP+luciferin------AMP +oksiluciferin

luciferaza

 Metode separacije i kvantifikacije izoenzima CK

- Hromatografija,
- elektroforeza,
- imunohemija
  Elektroforeza:

-potporni medijum: agar, celuloza acetat, agaroza

Detekcija izoenzima:

-NADPH fluorescentna metoda 360nm

-NadPH bojena reakcija sa tetrazolijum soli—obojeni formazan

Denzitometrija fluorimetrije traka izoenzima na elfelogramu

3) Odredjivanje CK-MB imunoinfibicijom

2 fazze:

I faza : imunoinhibicija sa antitijelom na M subjedinicu

II faza: Odr aktivnosti B subjedinice, referentnom metodom

4) Odredjivanje masene koncentracije CK MB

Metoda je osjetljivija jer mjeri masenu koncentraciju

Metoda koristi sendvic tehniku: 2 antitijela( 1 za M, 1 za B subjedinicu)

Prvo At je imobilizirano na matrix, a drugo konjugovano sa enzimom kao markerom, mjeri

se samo CK MB a ne ostale 2 izoforme.
 ENZIMATSKA DIJAGNOSTIKA OBOLJENJA KOSTIJU

ALKALNA FOSFATAZA
ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE SA 4- NITROFENILFOSFATOM

4- nitrofenilfosfat --(ALP,Mg 2+, pH= 10,3)- 4- nitrofenol (bezbojan) + PO4- 4-

nitrofenoxid
(zut)

ALP katalizuje hidrolizu 4- NPP, stvarajuci fosfat i slobodni 4-nitrofenol koji je u kiseloj
sredini bezbojan. Pod alkalnim uslovima, 4-NP prelazi u 4- nitrofenoxid koji ima
intenzivnu zutu boju.

Uzorak: serum ili haparizirana plazma

Kompleksirajuci antikoagulansi: citrat oksalat, EDTA se ne koriste jer se vezju za katione
koji se koriste kao kofaktori (Mg, Zn)

ELEKTROFOREZA IZOENZIMA ALP

Nakon elektroforeze, ALP zone se boje tako sto se gel inkubira a 1- naftilfosfatom kome se
dodaje hromogen – diazonijum so.

Ako se koristi celulozo acetat, boja se nanosi pomocu agar gela.

Tumacenje elfelograma
- jetrena ALP krece se brze prema anodi
- kostana ALP daje vise difuznu zonu i ima redukovanu anodnu pokretljivost
- intenstinalna ALP migrira dosta sporije nego kostana
-placentarna ALP daje usku traku obicno preko kostane

--Kao alternative elektroforetskom razdvajanju kostane od jetrene ALP koristi se

odredivanje enzima gama- GT koja je povecana samo u bolestima jetre

--Inkubacija seruma sa neuromidazom preko noci se koristi kao dokaz prisustva

intenstinalne ALP.
IMUNOHEMIJSKE METODE:

- najbolja separacija za intenstinalnu i placentarnu ALP

- IRMA- određuje se masa kostane ALP sa monok At
-ELISA
- Automatizovana metoda sa hemiluminccentnom detekcojom
- Imunoapsorpcija s 1 At i p- nitrofenilfosfatom
KISELA FOSFATAZA

- Određivanje aktinosti ukupne kisele fosfateze u serumu

- Određivanje prostaticne kisele fosfataze
- Određicanje neprostaticne kisele fosfataze

ODREĐIVANJE PROSTATICNE ACP

Tararat inhibira osjetljivu prostaticnu ACP a ostala aktivnost se mjeri i oznacava kao
neproostaticna ACP. Iz razlike ukupne i neprostaticne ACP dobija se prostaticna ACP.

SUPSTRATI:4- nitrofenilfosfat, 1-naftil-fosfat, timolftalein-fosfat

DISKONTINUIRANA METODA:

4- nitrofenilfosfat + H2O <- fosfat + 4- nitrofenol

- Kisela sredina, prekida se dodatkom alkalije

- A= 405 nm

KONTINUIRANA METODA :

1- Naftil fosfat
- 1- naftol oslobođen od svog fosfatnog estra gradi obojeni produkt koji je stabiliziran
diazonijum solima.
- Alkoholi povecavaju senzitivnost jer djeluju kao akceptori fosfata, ubrzavaju rakc
- Dodatak natrijum tattarata inhibira osjetljive izoenzime (prostaticnu i lizomalnu
ACP)