Klinička enzimologija – vežbe 2015/2016 Alkalna fosfataza

ALKALNA FOSFATAZA
(ALP, EC 3.1.3.1)

Alkalna fosfataza (ortofosfat-monoestar fosfohidrolaza) pripada grupi enzima koji u

alkalnoj sredini hidrolizuju monoestre fosfatne kiseline, pri čemu se oslobađaju različiti alkoholi
ili derivati fenola, zavisno od supstrata koji učestvuje u reakciji.
ALP
ortofosfat monoestar + H2O alkohol + ortofosfat

Alkalna fosfataza ima malu supstratnu specifičnost i deluje na veliki broj različitih
prirodnih i sintetskih estara fosfatne kiseline, mada nisu poznati prirodni supstrati na koje enzim
deluje u humanom organizmu. Činjenica da osobe sa urođenim nedostatkom ovog enzima
izlučuju velike količine etanolamin-fosfata ukazuje na to da je ovaj estar (ili možda
fosfatidiletanolamin) jedan od fizioloških supstrata.
Optimalni pH za alkalnu fosfatazu je oko 10, zavisno od izoenzimskog sastava i reakcione
sredine. Enzim je metalo protein jer u svom sastavu ima cink, a u aktivnom centru ostatak
serina. Cink je funkcionalno nerazdvojiv od enzima, ali je za punu enzimsku aktivnost potreban i
jon magnezijuma. Odgovarajući odnos Mg2+/Zn2+ je neophodan da bi se postigla optimalna
aktivnost. Pored toga, promene u koncentraciji jona Mg2+ i supstrata izazivaju promene u pH
optimumu. Alkalnu fosfatazu inhibiraju Ca+2 i neorganski fosfat. Molekul enzima sadrži velike
količine glikoproteina.
Alkalna fosfataza se nalazi u gotovo svim organima, a naročito visoka aktivnost je prisutna u
ćelijskim membranama organa koji imaju apsorptivnu ili ekskretornu funkciju. Najzastupljenija je
u intestinalnoj mukozi i placenti, zatim u bubrezim, kostima (osteoblasti), jetri, plućima i slezini.
Postoje četiri različita genska lokusa za alkalnu fosfatazu koji su raspoređeni na prvom i drugom
hromozomu. Genski lokus na hromozomu jedan kodira tkz. tkivno nespecifičnu alkalnu
fosfatazu (jetreno-koštano-bubrežne izoforme). Proteini sintetisani na ribozomima podležu post-
translacionim modifikacijama u okviru kojih dolazi do vezivanja različitih količina sijalnske
kiseline za molekul enzima zbog čega se ove izoforme razlikuju po elektroforetskoj
pokretljivosti i termostabilnosti. Koštani enzim je termolabilan, za razliku od jetrenog i bubrežnog
enzima koji su termostabilni. Na drugom hromozomu se nalaze genski lokusi za intestinalnu,
placentarnu i alkalnu fosfatazu zametka.
Jetreno-koštano-bubrežne varijante ALP nalaze se u endotelu, četkastoj prevlaci tankog
creva i bubrežnih tubula, u mikrovilima, u žučnim kanalićima i u osteoblastima. Koštana ALP

1
Klinička enzimologija – vežbe 2015/2016 Alkalna fosfataza

ima ulogu u sintezi i kalcifikaciji kostiju, dok je fiziološka uloga jetrene i bubrežne ALP prilično
nejasna. Intestinalna ALP učestvuje u transportu masnih kiselina, kalcijuma i fosfata kroz
ćelijsku membranu enterocita i potom putem limfe dospeva u krv, gde se vezuje za membranu
eritrocita. Vezivanje za membranu eritrocita je intenzivno kod krvnih grupa A i AB, a neznatno
kod krvnih grupa B i O. Placentarna ALP (Reganov izoenzim) se razlikuje od drugih oblika ALP
po tome što pokazuje izuzetnu stabilnost prema visokim temperaturama. Posle zagrevanja na
650C u toku 30 min placentarna ALP ostaje i dalje aktivna, za razliku od ostalih oblika enzima
koji se inaktiviraju. Aktivnost placentarne ALP se povećava kod trudnica između 16-te i 20-te
nedelje trudnoće i ostaje povišena sve do porođaja. Na normalu se vraća 4-7 dana posle
porođaja.
Serumska ALP zdravih osoba je smeša enzima koji potiču najvećim delom iz jetre i
kostiju. Kod mladih osoba većina aktivnosti potiče od koštane ALP, a kod trudnica aktivnost
uglavnom potiče iz placente.
Razdvajanje izoenzima ALP vrši se na osnovu razlika u:
 elektroforetskoj pokretljivosti
 otpornosti prema hemijskoj (urea) ili temeperaturnoj denaturaciji
 odgovoru na prisustvo selektivnih inhibitora (L-fenilalanin)
 afinitetu prema lektinu
 imunohemijskim karakteristikama
Kako su razlike između izoenzima ponekada male (posebno kod koštanog i jetrenog
izoenzima), moraju se kombinovati različite tehnike da bi se izoenzimi dobro razdvojili.
Elektroforetsko razdvajanju izoenzima ALP se vrši pri alkalnom pH i mogu se koristiti različiti
potporni medijumi (skrob, agar ili poliakrilamid). Jetrena ALP najbrže putuje prema anodi. Iako
koštana ALP, koja daje nešto razvučenije zone, ima manju anodnu mobilnost od jetrene, dolazi
do delimičnog preklapanja ove dve frakcije. Intestinalni izoenzim putuje sporije od koštane
izoforme, a placentarna ALP se uočava kao traka koja se preklapa sa frakcijom koštane
izoforme.
U cilju boljeg razdvajanja koštanog i jetrenog izoenzima predložene su dve modifkacije
elektroforetske metode. Jedna od modifikacija se izvodi u prisustvu lektina (izolovanog iz klice
pšenice), koji vezuje N-acetilglukozamiske ostatke na enzimu što više usporava kretanje
koštanog nego jetrenog izoenzima. Druga metoda zasniva se na kratkotrajnoj inkubaciji uzorka
sa neuraminidazom koja uklanja ostatke sijalinske kiseline sa enzima. S obzirom da su ostaci
sijalinske kiseline koštane ALP dostupniji neuraminidazi, nakon inkubacije elektroforetska
pokretljivost koštane izoforme je više smanjena nego pokretljivost jetrene izoforme. Umesto

2
Klinička enzimologija – vežbe 2015/2016 Alkalna fosfataza

elektorforetskog razdvajanja u rutinskoj praksi često se određuje aktivnost enzima γ-GT čija
aktivnost raste u bolestima jetre, ali ne i u bolestima kostiju. Ukoliko se inkubacija sa
neuraminidazom produži (preko noći), doći će značajnog smanjenja u elektroforetskoj
pokretljivosti svih izoenzima osim intestinalnog. Ovaj izoenzim nema sijalinsku kiselinu pa je
rezistentan na delovanje neuraminidaze.
Razlika u temperaturnoj stabilnosti se koristi za određivanje placentarne ALP, jer je
samo aktivnost ovog izoenzima očuvana nakon inkubacije na 65°C u toku 30 minuta. Na
denaturaciju u prisustvu visoke koncentracije ureje najosetljiviji je koštani izoenzim, dok su
jetreni, intestinalni i placentarni izoenzimi rezistentniji. U prisustvu L-fenilalanina inhibirana je
aktivnost intestinalnog i placentarnog izoenzima. Ovaj inhibitor ima slabiji efekat na koštanu i
jetrenu ALP. Imunohemijske metode se koriste u komercijalnim testovima za određivanje
aktivnosti placentarnog i intestinalnog izoenzima.

Metode za određivanje aktivnosti alkalne fosfataze

Prva metoda za određivanje aktivnosti ALP zasnivala se na određivanju neorganskog

fosfata oslobođenog iz -glicerofosfata pod delovanjem enzima. Drugi supstrat koji je korišćen
je fenil-fosfat čijim se razlaganjem oslobađa fenol, a on se određuje različitim osetljivim
fotometrijskim metodama, od kojih su neke i danas adaptirane za primenu na automatima.
Najviše primenjivan supstrat za određivanje aktivnosti ALP je 4-nitrofenil-fosfat (stari naziv je
p-nitrofenil-fosfat) čijim se razlaganjem dobija 4-nitrofenol. Ovo jedinjenje u uslovima reakcije
(pH 9,2) prelazi u 4-nitrofenoksidni jon koji je u hinoidnom obliku intenzivno žuto obojen sa
maksimumom apsorbancije na 405 nm. Zbog toga brzina enzimske reakcije može da se prati
direktno fotometrijskim merenjem, a metode koje se zasnivaju na ovom principu su brojne i
razlikuju se po temperaturi na kojoj se reakcija odvija, vrsti i koncentraciji pufera, pH vrednosti,
koncentraciji dodatog Mg2+ i zapremini uzorka. Ova metoda je optimizovana na nivou IFCC-a.

Brzina enzimske reakcije se povećava ako se kao pufer koristi neki aminoalkohol (2-amino-
2-metil-1-propanol (AMP), dietanolamin (DEA), tris-(hidroksimetil)-aminometan (TRIS), etil-
aminoetanol (EAE) i u poslednje vreme N-metil-D-glukamin). Ova jedinjenja deluju kao puferi,
jer vezuju vodonikov jon za azot, ali i kao fosfatni akceptori, pa stoga imaju i ulogu aktivatora.
Najveći stepen fosforilacije se postiže sa jedinjenjima kod kojih je OH grupa razdvojena od
atoma azota sa dva C atoma, a za drugu vezu na azotu je vezan alkil ostatak sa jednim ili dva C
atoma (-(C)-C-NH-C-C-OH). Enzimska aktivnost u prisustvu optimalnih koncentracija ovih
pufera može da bude 2 - 6 puta veća nego u prisustvu neaktivirajućih pufera kakav je karbonat.

3
Klinička enzimologija – vežbe 2015/2016 Alkalna fosfataza

Statička metoda za merenje aktivnosti ALP sa 4-nitofenilfosfatom se i dalje koristi. Uzorak se

inkubira sa supstrat-pufernim rastvorom pH 10.3 u toku 30 minuta na 37°C. Reakcija se
zaustavlja dodatkom 10 mL NaOH, što povećava pH na 11.5-12, inaktivira enzim i konvertuje
proizvod reakcije 4-nitrofenol u 4-nitrofenoksidni jon. Hinoidni oblik ovog jedinjenja je intenzivno
žuto obojen i njegova apsorbancija se meri na 405 nm.
Kinetička metoda takođe koristi kao supstrat 4-nitofenilfosfat i pufer AMP. Sve uzorke i
reagense treba preinkubirati na 37°C. Nakon dodavanja supstrata meri se promena
apsorbancije svakog minuta u toku 3 minuta. Modifikacija ove metode, koja je preporučena od
strane IFCC-a, podrazumeva primenu helatnog agensa N-hidroksietil-etilendiamino-
tetrasirćetne kiseline (HEDTA), koja održava optimalnu koncentraciju jona Mg2+ i Zn2+.

Princip metode:
Alkalna fosfataza hidrolizuje 4-nitrofenil-fosfat u alkalnoj sredini na 370C do 4-nitrofenola,
koji u alkalnoj sredini prelazi u 4-nitrofenoksidni jon. Hinoidni oblik ovog jedinjenja je intenzivno
žuto obojen, a promena apsorbancije se meri na 405 nm.

4
Klinička enzimologija – vežbe 2015/2016 Alkalna fosfataza

Reagensi:
Reagens A: AMP pufer 0.4 mol/L, pH 10.4
Mg2+ 2,5 mmol/L
Zn2+ 1,2 mmol/L
HEDTA 2,5 mmol/L
Reagens B: 4-nitrofenilfosfat 60 mmol/L - supstrat
Priprema radnog reagensa:
Radni reagens se priprema mešanjem reagensa A i reagensa B u sledećem odnosu: 4 ml
reagensa A + 1 ml reagensa B.
Za analizu se koriste uzorci seruma, heparinizirane plazme. Uzorci plazme dobijene sa EDTA,
oksalatom ili citratom se ne mogu koristiti, pošto ovi antikoagulansi vezuju dvovalentne katjone.

Izvođenje:
Podesiti talasnu dužinu na 405 nm, meriti prema vazduhu.

U epruvetu dodati:
Analiza
(A)
Serum 20 μL
Radni reagens 1 mL

Promešati, sipati u termostatiranu kivetu na 37°C i inkubirati 1 minut, a zatim pročitati inicijalnu
apsorbanciju (A0) i uključiti štopericu. Nakon 1 minuta očitati apsorbanciju (A1), a zatim čitati
apsorbancije nakon 2 minuta (A2) i nakon 3 minuta (A3) na 405 nm.

Izračunavanje aktivnosti enzima:

Izračunati prosečnu promenu apsorbancije po minuti (ΔA/min):

( A1  A 0 )  ( A 2  A1 )  ( A 3  A 2 )
A / min 
3

5
Klinička enzimologija – vežbe 2015/2016 Alkalna fosfataza

Aktivnost enzima se izračunava prema sledećoj formuli:

( A / min)  10 6  UZ
IU / L 
  ZA  b

Pri čemu su:

ΔA/min – prosečna promena apsorbancije po minuti
106 – faktor za konverziju mola u mikromole
UZ – ukupna zapremina u kiveti (zapremina reagensa + zapremina analize)
ZA – zapremina analize (u mL)
ε – molarni apsorpcioni koeficijent za 4-nitrofenol na 405 nm (18450 L/mol · cm)
b – dužina optičkog puta (1 cm)

Obzirom da su ε, UZ, ZA, 106 i b konstantne vrednosti, njihov odnos se može zameniti faktorom
2764, tako da izraz za izračunavanje aktivnosti enzima postaje:

IU/L = ΔA/min · 2764 (na 37°C)

Napomene:
1. Vensku krv treba uzimati pri uslovima minimalne staze. Za analiziranje je najbolje da se
koristi sveže dobijen serum.
2. Hemoliza i lipemija ne utiču značajno na određivanje aktivnosti ALP.
3. Aktivnost ALP u uzorku je stabilna 6 sati na sobnoj temperaturi. Stabilnost aktivnosti ALP
zavisi i od izvora enzima (placentalna alkalna fosfataza je stabilna nekoliko dana, dok je
koštani enzim veoma labilan). Kod seruma čuvanih u frižideru dolazi do povećanja
aktivnosti za 2% na dan. Smrzavanje seruma dovodi do gubitka aktivnosti, koja se sporo
vraća odmrzavanjem, tako da uzorak treba da stoji na sobnoj temperaturi 18-24h pre
analiziranja da bi se postigla puna aktivnost enzima.

Referentne vrednosti na 37°C

Muškarci: 58 - 128 IU/L
Žene: 44 - 128 IU/

6
Klinička enzimologija – vežbe 2015/2016 Alkalna fosfataza

Interpretacija rezultata

Aktivnost alkalne fosfataze u plazmi i serumu se određuje vrlo često, ali značaj rezultata za
dijagnozu i prognozu bolesti nije naročito veliki. Kada se dobije povišena aktivnost ALP u
serumu nije moguće odgovoriti na pitanje da li je ona koštanog ili jetrenog porekla dok se ne
uradi elektroforetsko razdvajanje, a isto tako samo na osnovu povišene vrednosti ALP ne može
da se ustanovi da li se radi o intra- ili posthepatičnom poremećaju. Takođe nema kvantitativne
zavisnosti između aktivnosti ALP i veličine koštanog tkiva koje je zahvaćeno malignim
procesom.
Bolesti kostiju, odnosno svi procesi razgradnje i obnavljanja kostiju, dovode do povećanja
aktivnosti ALP, a to se dokazuje elektroforetskim razdvajanjem, pri čemu se dobija povećan
koštani izoenzim. Kod metastaza na kostima, kao i kod osteogenog sarkoma aktivnosti ALP su
veće 5 do 30 puta u odnosu na gornju granicu referentnih vrednosti. Povećana aktivnost se
javlja i kod rahitisa usled nedostatka vitamina D, primarnog i sekundarnog hiperparatiroidizma.
Frakture i osteomalacija su praćene neznatnim povećanjem aktivnosti ALP, dok osteoporoza,
osteomijelit i mijelom dovode retko do povećanja ALP.

Hepatobilijarni procesi (intra- i ekstrahepatična holestaza) uvek dovode do povećanja

aktivnosti ALP u serumu, često i pre nego što su povećane vrednosti transaminaza.
Elektroforetskim razdvajanjem se dobija povećan jetreni izoenzim, a često se pojavljuje i nova
frakcija koja se kreće brzo ka anodi i označava se kao "brzi jetreni" izoenzim. Razlozi za pojavu
ove frakcije nisu sasvim jasni i verovatno je da se ne radi o novom izoenzimu, nego o asocijaciji
membranskog enzima sa lipidnim materijalom, kao i fragmentima membrane ćelija žučnih
puteva i hepatocita. Prisustvo "brze jetrene" ALP uvek je dokaz postojanja opstruktivne bolesti
jetre.

Snižene aktivnosti ALP u serumu se javljaju usled naslednog poremećaja (autosomalno

recesivno nasleđivanje) koje je praćeno je izuzetno niskim vrednostima ALP i promenama na
kostima koje se dokazuju radiološki i histološki. Pored toga, kod ovih osoba su česte spontane
frakture, hiperkalcemija i nefrokalcinoza, kao i visoke koncentracije pirofosfata i
fosforiletanolamina u plazmi i urinu.
Placentarna alkalna fosfataza (Reganov enzim) može da se koristi kao tumorski marker
kod seminoma i kancera ovariuma. Tokom razvoja ovih kancera smanjuje se supresija gena za
PALP što se manifestuje rastom aktivnosti placentarne ALP.