KVALITATIVNA ANALIZA

ENZIMA Vežba 6
 Enzimi = biokatalizatori
 Sve biološke promene i fiziološke funkcije – pod

katalitičkim dejstvom enzima

 Sumner (1926.) izolovao enzim ureazu

 Po hemijskoj prirodi enzimi su proteini

Holoenzim = apoenzim + koenzim

 Proenzimi – enzimi u inaktivnom stanju

 Inhibicija aktivnosti enzima može biti rezultat

delovanja fizičkih ili hemijskih faktora
 Enzimska inhibicija može biti nekompetitivna i

kompetitivna
 Nekompetitivna inhibicija – denaturacija proteinskog
dela enzima.
 Kompetitivna inhibicija – inhibitor se takmiči sa

supstratom za enzim.
 Kombinovani tip inhibicije enzimske aktivnosti

 Grupe enzima – oksidoreduktaze, transferaze,

hidrolaze, liaze, izomeraze, ligaze
 Enzime karakteriše visok stepen specifičnosti njihove

katalitičke aktivnosti.
 KVALITATIVNA ANALIZA AKTIVNOSTI ENZIMA

 Koncentracija enzima.
 Koncentracija supstrata.

 Promena pH vrednosti.

 Temperatura.

 Amilaze – enzim iz grupe poliaza.

 Razlikuju se α – amilaza i β – amilaza.
 α-Amilaza
 Alfa-amilaza je enzim koji u organizmu ima ulogu u
varenju složenih ugljenih hidrata – hidrolizuje skrob
(amilozu i amilopektin, koji su sačinjavaju skrob),
cepajući α (1 4) glikozidne veze.
 Razlikujemo 2 tipa (izoenzima) α-amilaze:
 pljuvačnu (salivarnu) α-amilazu, označavamo je kao S-
tip, koju luče pljuvačne žlezde i koja razgrađuje skrob u
ustima,  i
 pankreasnu α-amilazu, označavamo je kao P-tip koju
luči pankreas, a koja se izlučuje u tanko crevo gde
razgrađuje ugljene hidrate.
Dejstvo amilaze na skrob
U 3 epruvete sipati po 5 ml 1% rastvora skroba.

 U jednu epruvetu dodati 1 ml prethodno

pripremljenog rastvora amilaze (2 ml salive razblaziti
destilovanom vodom u odnosu 1:5).
 U dve epruvete dodati po 1 ml amilaze.

 Sve 3 epruvete inkubirati 15 min./55° C.

 U sve 3 epruvete dodati po 5 kapi radnog rastvora

joda.
 Pratiti promenu boje u sve tri epruvete.
 Sa epruvetom gde je amilaza razložila skrob do maltoze
(odsustvo bojene reakcije) uraditi Felingovu probu.
 Pozitivan test sa Felingovim reagensom znači da je došlo

do potpunog razlaganja skroba.

 Dinamika razlaganja skroba amilazom (uticaj duzine
inkubiranja na aktivnost amilaze)
Pripremiti 5 epruveta sa radnim rastvorom joda.

 Jednu epruvetu sa 10 ml 1% rastvora skroba i 1 ml

amilaze inkubirati na 55° C i na svakih 5 min. vaditi po

jednu kap i dodavati radnom rastvorom joda.
 U prvu epruvetu se doda kap mešavine skroba i amilaze

pre inkubiranja u vodenom kupatilu (nulto vreme)!

 Pratiti promenu boje u epruvetama sa rastvorom joda

od tamno plave (prva epruveta) preko ljubičaste do

bezbojnog rastvora.
Uticaj količine enzima na aktivnost amilaze
U 4 epruvete sipati 10 ml 1% rastvora skroba.

 U prvu epruvetu otpipetirati 0.5 ml, u drugu 1 ml, u

treću 1,5 ml i u četvrtu 2 ml amilaze.

 Epruvete inkubirati 15 min./55° C.

 Zatim epruvete ohladiti i u svaku dodati 10 kapi radnog

rastvora joda.
 Na osnovu boje rastvora zaključiti kako utiče količina

enzima na brzinu hidrolize skroba.

 Uticaj ph vrednosti na aktivnost amilaze
 U 8 epruveta sipati po 1 ml destilovane vode.
 U prvu epruvetu dodati 1 ml 0.2% rastvora HCl.

 Promućkati sadržaj epruvete i iz nje 1 ml rastvora

preneti u drugu epruvetu, iz druge 1 ml rastvora prebaciti

u treću i tako redom do osme epruvete.
 U sve epruvete dodati po 2 ml 1% rastvora skroba i po 1

ml ekstrakta amilaze.
 Epruvete inkubirati 15 min./55° C.

 Rastvore ohladiti pa dodati po 3 kapi radnog rasvora

joda.
 U epruveti gde je rastvor bezbojan enzim je najaktivniji.
Uticaj temperature na aktivnost amilaze
Pripremiti 4 epruvete sa radnim rastvorom joda.

 U druge 4 epruvete dodati po 10 ml 1% skroba i 1 ml

ekstrakta amilaze i inkubirati ih po 10 min. na razičitoj

temperaturi (0°C, 37°C, 100°C).
 Iz ovih epruveta dodati po 2 kapi rastvora u

pripremljene epruvete sa radnim rastvorom joda.

 Plava boja – enzim potpuno inaktivisan, bezbojan

rastvor – skrob potpuno razgrađen pod dejstvom

amilaze, nijanse ljubičaste – nedovršena hidroliza
skroba.
Specifičnost aktivnosti amilaze
U jednu epruvetu sipati 5 ml 1% rastvora skroba a u

drugu 5 ml 10% rastvora saharoze.

 U obe epruvete dodati po 1 ml amilaze.

 Epruvete promućkati i inkubirati 15 min./55° C.

 Obe epruvete ispitati na prisustvo redukujućih šećera

pomoću Felingove probe.

Epruveta sa skrobom će dati pozitivnu reakciju, a

epruveta sa saharozom negativnu reakciju.