Vežba br.

7 – Određivanje belančevina 1

ODREĐIVANJE UKUPNIH I RASTVORLJIVIH BELANČEVINA

MLEKA PO KJELDAHLU

Princip

Metoda se zasniva na razaranju organske materije sumpornom kiselinom, pri čemu azotna
jedinjenja prelaze u amonijak koji s kiselinom obrazuje amonijum-sulfat. Iz takvog rastvora se
amonijak istiskuje pomoću NaOH i njegova količina se posle destilacije određuje titracijom pomoću
standardne kiseline. Na osnovu količine utrošene kiseline se izračunava sadržaj azota u uzorku i
preračunava na belančevine množenjem odgovarajućim faktorom. Taj faktor za ukupne belančevine
mleka iznosi 6,37, za kazein 6,45, a za albumine i globuline mleka 6,34. On je za meso i jaja 6,25, a
za vezivno tkivo - 5,55.

Instrumenti, pribor i hemikalije

- Aparatura za razaranje uzoraka po Kjeldahlu (čita se: kjeldal)

- Aparatura za destilaciju amonijaka po Kjeldahlu
- Vodeno kupatilo
- Normalni sud od 100 ml
- Pipeta od 20 ml
- Menzura
- Erlenmajer od 250 ml
- Laboratorijska čaša, 250 ml
- Filtar-papir (garantovano bez azota)
- Koncentrovana sumporna kiselina
- Katalizator (u tabletama ili u prahu)
- Rastvor borne kiseline (2%) sa smešom indikatora (bromkrezolzeleno + metilcrveno)
- Standardni 0,02N rastvor H2SO4 (alternativno, standardni 0,1N rastvor HCl)
- Rastvor sirćetne kiseline, 10%
- Almenov rastvor (taninske kiseline)

Postupak za ukupne belančevine mleka

U balonu za razaranje se s tačnošću 0,0001 g izmeri oko 1,5 g (1,5 ml) mleka i doda 20 ml
koncentrovane H2SO4. Kada se reakcija smiri, doda se katalizator i počne sa zagrevanjem na
aparaturi za razaranje uzorka po Kjeldahlu, pri temperaturi koju preporučuje proizvođač. Razaranje je
završeno kada se rastvor izbistri. Pošto se rastvor ohladi, celokupni razoreni uzorak u kiveti se može
postaviti u aparat za destilaciju ili se dalje može raditi s njegovim alikvotnim delom X. U ovom drugom
slučaju se u ohlađeni rastvor doda malo vode, ceo sadržaj kvantitativno prebaci u normalni sud od
100 ml i dopuni destilovanom vodom do crte. Od tako dobijenog rastvora se odmeri alikvotni deo
(npr. peti deo, 100/X = 20 ml) i stavi u čistu kivetu Kjeldalove aparature. Ta kiveta se postavi u aparat
za destilaciju, kao i erlenmajer u kome se nalazi 20 ml 2% H3BO3 za hvatanje amonijaka. U aparatu se
u uzorak uvodi rastvor 20%-og NaOH, a zatim vodena para koja odnosi oslobođeni amonijak i s njim
kondenzuje u erlenmajeru s bornom kiselinom, zbog čega prvobitno zelenkasti rastvor poplavi.

Po završenoj destilaciji se erlenmajer s bornom kiselinom titruje pomoću standardnog rastvora

0,02N H2SO4 do prve promene boje.

Izračunavanje

ml(0,02N H2SO 4 ) ⋅ F(H2SO 4 ) ⋅ 0,00028 ⋅ 100 ⋅ 6,37 ⋅ X

%proteina =
odvaga

1 ml 0,02 N H2SO4 odgovara 0,28 mg N2. X predstavlja alikvotni deo (npr. peti deo, X=5)

Na slici 1 je prikazana aparatura za istovremeno razaranje do 8 uzoraka, a na slici 2 –

odgovarajuća aparatura za destilaciju amonijaka (firma Gerhardt). Obe se mogu programirati za
automatski rad.
 Vežba br. 7 – Određivanje belančevina 2

Postupak za rastvorljive belančevine mleka

Od ukupnih belančevina mleka se staloži i odvoji kazein, a zatim se ono što ostane u
razređenom rastvoru (albumini i globulini) određuje na već opisan način.

10 ml mleka se razredi u čaši sa oko 90 ml vode i zagreva do 420 C u vodenom kupatilu.

Onda se doda 1,5 ml 10% CH3COOH i ostavi da stoji na istoj temperaturi 3-5 min, dok se slegne
pahuljičasti talog kazeina. Pošto se rastvor izbistri, dekantuje se kroz filtar-papir koji ne sadrži azot,
zaostali talog ispere hladnom vodom i sav talog pomoću nje prenese na filtar-papir.

Iz filtrata se talože albumini i globulini pomoću Almenovog rastvora taninske kiseline (4 g

taninske kiseline rastvori se u 8 ml 25% sirćetne kiseline i 190 ml 50% etanola). Dodaje se 6-10 ml
Almenovog rastvora. Rastvor se filtruje i talog dalje mineralizuje po Kjeldalu.

Slika 1. Aparatura za istovremeno, programirano spaljivanje osam uzoraka po Kjeldahlu sa

automatskim odvođenjem para – ovde prikazana sa samo 2 kivete
(Gerhardt)

Slika 2. Aparatura za automatsku, programiranu destilaciju amonijaka po Kjeldahlu

(Gerhardt)