Razlaganje saharoze enzimom

Student: Jovana Stanic

Broj indeksa: 2012/0018

Teorijski deo:
Veliki broj enzimski katalizovanih reakcija se moe predstaviti mehanizmom
koji je poznat kao Mihaelis-Mentenov mehanizam:
k1

E S ES
k 1

ES P E
k2

Po ovom mehanizmu enzim E reaguje sa supstratom S, gradei kompleks ES.

Ravnotea izmeu E, S i ES se uspostavlja vrlo brzo (k1>k-1), ali se zbog slabe
rastvorljivosti enzima u vodi (E)0<<(S), (ES)<<(S) i (P) moe primeniti uslov
stacionarnosti u odnosu na intermedijernu vrstu ES. Koncentracija (ES) je tada
data jednainom:

(ES)

k 1 (E )(S)
k 1 k 2

(1)

Koncentracija enzima u trenutku t je jedanaka:

(E) + (ES) = (E)0

(2)

Iz jednaina (1) i (2) sledi da se koncentracija (ES) moe izraziti kao:

( ES)

k 1 (E) 0 (ES) (S)

k 1 k 2

( ES)

k 1 (E ) 0 (S)
k 1 k 2 k 1 (S)

(3)

Sledi da je brzina reakcije (brzina nastajanja produkta):

v (S)
d (P)
max
dt
K M (S)

(4)

gde je KM Mihaelisova konstanta, jednaina (5) i vmax maksimalna brzina

reakcije jednaina (6).

KM

k 1 k 2
k1

(5)
(6)

vmax = k2(E)0
Jednaina (4) se moe napisati u sledeem obliku:
KM
1
1

v v max v max (S)

(7)

Iz jednaine (7) se vidi da, ako se 1/v prikae u zavisnosti 1/(S), dobija se prava
sa nagibom KM/vmax i odsekom 1/vmax. U ovoj vebi ispitivana je reakcija
enzimskog razlaganja saharoze koja se moe predstaviti opisanim
mehanizmom. Promena koncentracije saharoze sa vremenom moe se pratiti na
osnovu rotacije ose polarizacije svetlosti, jer su produkti reakcije optiki aktivne
supstancije. Optika aktivnost je povezana sa postojanjem asimetrinog
ugljenikovog atoma u molekulu. Ugao obrtanja ravni oscilovanja polarizovane
svetlosti naziva se ugao rotacije, , i proporcionalan je koncentraciji aktivne
komponente, c, i debljini sloja (l) kroz koju prolazi polarizovana svetlost:
lc
t

(8)

Koeficijent proporcionalnosti,
, se naziva ugao specifine rotacije i za datu
temperaturu i talasnu duinu upotrebljene svetlosti, karakteristika je optiki
aktivne supstance. Najee se koristi svetlost talasne duine 589.6 nm
(karakteristina uta linija u spektru pare natrijuma). Ugao specifine rotacije
saharoze je +66.550, glukoze 52.560 i fruktoze 91.900. Kako je ugao obrtanja
ravni polarizovane svetlosti jednak algebarskom zbiru uglova obrtanja pojedinih
komponenata, tokom procesa razlaganja saharoze ugao rotacije e se smanjivati
od poetne vrednosti 0, do granine negativne vrednosti , na kraju reakcije.
Razlika 0 proporcionalna je ukupnoj koliini saharoze, tj. poetnoj

koncentraciji, (S)0, dok je razlika -, gde je ugao rotacije u trenutku t,

proporcionalna trenutnoj koncentraciji saharoze, (S), tako da vai jednaina:

(S)

(S) 0 0

(9)

Ugao rotacije se meri na polarimetru.

Eksperimentalni deo:

Napravljeno je 100ml rastvora saharoze u vodi sledeih koncentracija: 0.510-2,

0.810-2, 2.010-2 i 3.010-2 M. Takoe je pripremljeno 10ml rastvora enzima
koncentracije 1mg/ml (3.710-6 M, Menzima = 270000 g/mol).
Odreeni su poetni uglovi rotacije za sve rastvore. Rastvor za merenje
poetnog ugla rotacije je pripremljen tako to je u 40ml rastvora dodat 1ml
destilovane vode. Reakciona smea je dobijena meanjem 40ml rastvora
saharoze sa 1ml rastvora enzima. U trenutku dodatka enzima ukljuen je
hronometar i u redovnim vremenskim intervalima je praen ugao rotacije. Posle
praenja reakcije rastvor je zagrevan na reou (vodei rauna da ne dode do
kljuanja) kako bi se zavrila reakcija. Izmeren je ugao rotacije i ovog rastvora.
Postupak je ponovljen za sve pripremljene rastvore razliitih koncentracija.
Rezultati merenja:
Tabela 1 Rezultati merenja za rastvor 1.

01
[o]

01
[o]

besk
[o]

besk
o

[o]

t [s]

t
[s]

20,25

0,05

0,45

0,05

20,80

0,05

90

20,25

0,05

0,45

0,05

20,40

0,05

120

20,25

0,05

0,45

0,05

20,30

0,05

150

20,25

0,05

0,45

0,05

20,00

0,05

180

20,25

0,05

0,45

0,05

19,75

0,05

210

[]

[S]
[M]

[S]
[M]

0,030
8
0,030
2
0,030
1
0,029
6
0,029

0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000

20,25

0,05

0,45

0,05

19,60

0,05

240

20,25

0,05

0,45

0,05

19,30

0,05

270

20,25

0,05

0,45

0,05

18,50

0,05

300

20,25

0,05

0,45

0,05

18,15

0,05

360

20,25

0,05

0,45

0,05

18,50

0,05

420

20,25

0,05

0,45

0,05

18,90

0,05

480

20,25

0,05

0,45

0,05

18,45

0,05

540

20,25

0,05

0,45

0,05

17,90

0,05

600

20,25

0,05

0,45

0,05

17,55

0,05

660

20,25

0,05

0,45

0,05

17,30

0,05

720

20,25

0,05

0,45

0,05

16,90

0,05

780

20,25

0,05

0,45

0,05

17,00

0,05

840

20,25

0,05

0,45

0,05

16,55

0,05

900

2
0,029
0
0,028
6
0,027
3
0,026
8
0,027
3
0,028
0
0,027
3
0,026
4
0,025
9
0,025
5
0,024
9
0,025
1
0,024
4

3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
2
0,000
3
0,000
2

0,032
0,031
0,030

[S] [M]

0,029
0,028
0,027
0,026
0,025
0,024
0

200

400

600

800

1000

t [s]

Slika 1 Grafik zavisnosti koncentracije saharoze od vremena za rastvor 1.

0,000014
-5

V01=1,3287 10 M/s
0,000012

V1 [m/s]

0,000010

0,000008

0,000006

0,000004
0

200

400

600

t [s]

800

1000

Slika 2 Zavisnost brzine reakcije 1 od vremena

Tabela 2 Rezultati merenja za rastvor 2.

02
[o]

02
[o]

besk
[o]

besk
[o]

[o]

t [s]

t
[s]

10,75

0,05

0,4

0,05

11,40

0,05

60

10,75

0,05

0,4

0,05

11,20

0,05

90

10,75

0,05

0,4

0,05

11,30

0,05

120

10,75

0,05

0,4

0,05

11,25

0,05

150

10,75

0,05

0,4

0,05

11,00

0,05

180

10,75

0,05

0,4

0,05

10,65

0,05

210

10,75

0,05

0,4

0,05

10,60

0,05

240

10,75

0,05

0,4

0,05

10,55

0,05

270

10,75

0,05

0,4

0,05

10,45

0,05

300

10,75

0,05

0,4

0,05

10,35

0,05

360

10,75

0,05

0,4

0,05

10,10

0,05

420

10,75

0,05

0,4

0,05

9,50

0,05

480

10,75

0,05

0,4

0,05

9,55

0,05

540

10,75

0,05

0,4

0,05

8,90

0,05

600

10,75

0,05

0,4

0,05

8,80

0,05

660

10,75

0,05

0,4

0,05

8,70

0,05

720

10,75

0,05

0,4

0,05

8,40

0,05

780

10,75

0,05

0,4

0,05

8,15

0,05

840

10,75

0,05

0,4

0,05

7,70

0,05

900

[S]
[M]
0,021
3
0,020
9
0,021
1
0,021
0
0,020
5
0,019
8
0,019
7
0,019
6
0,019
4
0,019
2
0,018
7
0,017
6
0,017
7
0,016
4
0,016
2
0,016
0
0,015
5
0,015
0
0,014
1

[S]
[M]
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
4
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3
0,000
3

0,022
0,021
0,020

[S] [M]

0,019
0,018
0,017
0,016
0,015
0,014
0,013
0

200

400

600

800

1000

t [s]

Slika 3 Grafik zavisnosti koncentracije saharoze od vremena za rastvor 2.

0,000014
-5

V02=1,3313 10 M/s
0,000012

v02 [m/s]

0,000010

0,000008

0,000006

0,000004
0

200

400

600

800

1000

Slika 4 Zavisnost brzine reakcije 2 od vremena

Tabela 3 Rezultati merenja za rastvor 3.

03
[o]

03
[o]

besk
[o]

besk
o

[o]

t [s]

t
[s]

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,90

0,05

60

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,56

0,05

90

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,60

0,05

120

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,35

0,05

150

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,30

0,05

180

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,20

0,05

210

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,15

0,05

240

5,20

0,05

-1,4

0,05

4,10

0,05

270

5,20

0,05

-1,4

0,05

3,90

0,05

300

5,20

0,05

-1,4

0,05

3,55

0,05

360

5,20

0,05

-1,4

0,05

3,50

0,05

420

5,20

0,05

-1,4

0,05

3,35

0,05

480

5,20

0,05

-1,4

0,05

3,20

0,05

540

5,20

0,05

-1,4

0,05

2,85

0,05

600

5,20

0,05

-1,4

0,05

2,60

0,05

660

5,20

0,05

-1,4

0,05

2,40

0,05

720

5,20

0,05

-1,4

0,05

2,10

0,05

780

5,20

0,05

-1,4

0,05

2,10

0,05

840

5,20

0,05

-1,4

0,05

1,75

0,05

900

[]

[S]
[M]

[S]
[M]

0,007
6
0,007
2
0,007
3
0,007
0
0,006
9
0,006
8
0,006
7
0,006
7
0,006
4
0,006
0
0,005
9
0,005
8
0,005
6
0,005
2
0,004
8
0,004
6
0,004
2
0,004
2
0,003
8

0,000
3
0,000
2
0,000
3
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
1
0,000
1
0,000
1

0,0080
0,0075
0,0070
0,0065

[S]

0,0060
0,0055
0,0050
0,0045
0,0040
0,0035
0

200

400

600

800

1000

t [s]

5 Grafik zavisnosti koncentracije saharoze od vremena za rastvor 3.

-5

V03=0,4958 10 M/s

0,0000050

0,0000048

V03 [m/s]

0,0000046

0,0000044

0,0000042

0,0000040

200

400

600

800

1000

t [s]

Slika 6 Zavisnost brzine reakcije 3 od vremena

Tabela 4 Rezultati merenja za rastvor 4.

04
[o]
1,10
1,10

04
[o]
0,05
0,05

besk
[o]
-0,4
-0,4

besk
[o]
0,05
0,05

[o]

t [s]

1,10
0,95

0,05
0,05

60
90

t
[s]
1
1

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,90

0,05

120

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,40

0,05

150

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,70

0,05

180

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,50

0,05

210

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,45

0,05

240

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,55

0,05

270

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,60

0,05

300

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,35

0,05

360

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,35

0,05

420

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,20

0,05

480

1,10

0,05

-0,4

0,05

0,00

0,05

540

1,10

0,05

-0,4

0,05

-0,10

0,05

600

1,10

0,05

-0,4

0,05

-0,10

0,05

660

1,10

0,05

-0,4

0,05

-0,15

0,05

720

1,10

0,05

-0,4

0,05

-0,20

0,05

780

1,10

0,05

-0,4

0,05

-0,45

0,05

840

1,10

0,05

-0,4

0,05

-0,30

0,05

900

[S]
[M]
0,005
0,005
0,004
3
0,002
7
0,003
7
0,003
0
0,002
8
0,003
2
0,003
3
0,002
5
0,002
5
0,002
0
0,001
3
0,001
0
0,001
0
0,000
8
0,000
7
0,000
2
0,000
3

[S]
[M]
0,001
0,001
0,000
7
0,000
4
0,000
6
0,000
5
0,000
5
0,000
5
0,000
5
0,000
4
0,000
4
0,000
3
0,000
2
0,000
2
0,000
2
0,000
1
0,000
1
0,000
0
0,000
1

0,006

0,005

0,004

[S]

0,003

0,002

0,001

0,000

-0,001
0

200

400

600

800

1000

t [s]

Slika 7 Grafik zavisnosti koncentracije saharoze od vremena za rastvor 4.

0,000012
-5

V04=1,1459 10 M/s
0,000010

V04 [M/s]

0,000008

0,000006

0,000004

200

400

600

800

1000

t [s]

Slika 8 Zavisnost brzine reakcije 4 od vremena

Tabela 5 Rezultati prorauna

Rastv
or

[S]
[mM]

V
[M/s]10
-6

V
[M/s]10-6

1/V
[s/M]105

1/V
[s/M]105

1/[S]
[1/M]

30,0

13

0,8

0,1

33

20,0

1,3

0,9

50

8,0

5,0

0,8

2,0

0,4

125

5,0

11

0,87

0,08

200

300000

250000

150000

-1

V0 [s/M]

200000

100000

50000

0
20

40

60

80

100

120

140

160

180

t [s]

Slika 9 Grafik zavisnosti 1/V0=f(1/[S0])

Na osnovu nagiba i odseka krive odreene su vrednosti:

nagib=Km/Vmax
odseak=1/Vmax
Vmax=(1,30,8)10-5 M/s

200

220

KM=(76)10-4M
Zakljuak:
Krive zavisnosti koncentracije od vremena pokazuju generalno loe poklapanje
sa teorijski pretpostavljenom eksponencijalnom zavisnou. Razlog za ovo
neslaganje moe biti neka sistemska greka kao i greka eksperimentatora.
Druga je znatno verovatnija i svakako vie doprinosi nepreciznosti merenja kao
i tanosti. Uprkos loe izmerenim vrednostima mogue je primeniti
formalizama M. M. mehanizma enzimske katalize. Dobijene vrednosti
odreivanih konstanti su oekivanog reda veliine.