Dijagnostički značaj

ispitivanja amnionske tečnosti

Ivana Stojanović
Katedra za biohemiju
Medicinski fakultet
 Amnionska tečnost
Amnionska tečnost okružuje fetus u razvoju.

Fizičke karakteristike – bistra, svetlo žuta

tečnost
- pH oko 7.2
- specifična težina - 1.006 – 1.008

Zapremina zavisi od dužine gestacije (400

ml u sredini trudnoće do oko 1000 ml od
36-38. nedelje
 Amnionska tečnost

obezbeđuje prostor za rast, pokrete i

razvoj fetusa
ingestija u GIT→ rast i razvoj
razvoj pluća fetusa (20-ta nedelja)
štiti fetus od povreda
održava temeperaturu fetusa
ima antibakterijsku aktivnost
pomaže dilataciju cerviksa tokom porođaja
 Sastav plodove vode
 98-99 % vode
 spec. težina 1,005-1,008

 sastav organskih i neorganskih materija sličan ECT

 urea, mokraćna kis. i kreatinin rastu naročito pri

kraju trudnoće (urin fetusa)

 sadrži i bilirubin, fosfolipide (iz pluća fetusa),

proteine (albumine i globuline), masti, mucine,
glukozu, enzime, hormone, lanugo dlačice, epitelne
ćelije
Varijacije supstanci u
amnionskoj tečnosti
1200

Hemoglobin
1000
Amount of substance (% or (%)
Iron (mg/100ml)
800

Cholesterol
mg/100ml)

(mg/100ml)
600
Lipids
(mg/100ml)

400

200

0
2 3 4 5 6 7 8 9
Months of Pregnancy
 Stvaranje amnionske
tečnosti

U ranom periodu - amnionske ćelije

Kasnije – difuzija iz majčinih tkiva preko

amniohorionske membrane i iz placente, malo fetus

Od 4-og meseca, fetus utiče na sastav AT:

• urinom
• gutanjem
• ulaskom i izlaskom tečnosti iz respiratornog
trakta
 Volumen amnionske tečnosti
u odnosu na gestaciju

Amnionska tečnost
brzo  od oko 50 ml
u 12-oj nedelji do
400 ml sredinom
trudnoće.
24-te nedelje volumen
amnionske tečnosti
nastavlja da 
Maksimum - 1 litar
od 36-te do 38-te
nedelje.
Normalni protok između fetusa i
amnionske tečnosti
• kontinuirana razmena
tečnosti
• sekrecija bubrega, pluća
i glave fetusa

• promene protoka dovode

do promena u amnionskoj
tečnosti

A= transplacentalno
B= intramembranski
C= transmembranski
 Cirkulacija amnionske
tečnosti

Oko 500 ml uđe i napusti amnionsku kesu

svakog sata.
Postepeno ↑ do 36 nedelje do oko 600 -
1000 ml onda ↓.

Normalni raspon prosečnih vrednosti:

- 500 ml u 18. nedelji
- 800 ml u 34. nedelji
- 600 ml u terminu porođaja
 Cirkulacija amnionske
tečnosti
Sadržaj AT se menja svaka 3 sata.

Velike količine se kreću u oba pravca između

cirkulacije majke i fetusa, uglavnom preko
placentalne membrane.

Fetus je guta ili apsorbuje preko GIT i

respiratornog trakta.

U poslednjem stadijumu trudnoće fetus guta

oko 400 ml dnevno.

Višak vode u krvi fetusa se ekskretuje preko

bubrega i vraća u AT preko urinarnog trakta.
 Abnormalnosti
amnionske tečnosti
Oligohidramnioni:
Redukovana amnionska tečnost -
indeks amnionske tečnosti (amniotic
fluid index - AFI) 5 cm ili manje ili
najveća vertikalna dubina < 2 cm.

Polihidramnioni:
Ekscesivna kolčina amnionske tečnosti
- 2000 ml ili više (AFI > 25 cm ili
najveća vertikalna dubina > 8 cm) .
 Oligohidroamnioni i
polihidroamnioni
Oligohidramnioni:
 najčešće u poslednjem trimestru
 agenezija bubrega fetusa
 diabetes mellitus ili hipertenzija majke

Polihidramnioni:
 atrezija ezofagusa
(fetus ne guta dovoljno amnionske
tečnosti)
 Klinički značaj
amnionske tečnosti
Screening za malformacije fetusa
(serumski α-fetoprotein)
Ispitivanje stanja fetusa (indeks
amnionske tečnosti)
Procena zrelosti pluća fetusa (L/S
odnos)
Diagnoza i praćenje porođaja
Diagnoza PROM (premature rupture of
membranes)
 Amniocenteza

• između 15 i 20-te
nedelje

• početak II trimestra –
RANA AMNIOCENTEZA

• amnionska tečnost sadrži

ćelije fetusa iz
digestivnog trakta i
pluća
 Rizici
amniocenteze
Koji su rizici ?
- abortus: 1 na 200 do 400 žena (viši rizik kod
rane amniocenteze)
- infekcije uterusa: 1 od 1000

Kada se dobijaju rezultati ?

- 2 nedelje ili kraće (zavisno od testa)

Imperativ: minimalno vreme dobijanja rezultata !

1. Ispitivanja zrelosti pluća (lecitin/sfingomijelin
odnos ili prisustvo fosfatidil glicerola)

2. Citološke analize

3. Određivanje kreatinina

4. Određivanje glukoze

5. Određivanje bilirubina

6. Enzimske analize
Hromozomske analize: testiranje na
Down-ov sindrom kod starijih trudnica i dr.

DNK analize – za genetske bolesti

 Ispitivanja zrelosti pluća
• visoka stopa perinatalnog mortaliteta zbog
“nezrelosti” pluća fetusa

• surfaktant faktor
• sastoji se od lipida (80-90%), proteina (10-20%)
i ugljenih hidrata (1-2%)

• 80 -90% ukupnih lipida – fosfolipidi

• od toga – 70 -80% lecitina

• fosfatidil-inozitol, fosfatidil-serin, lizolecitin,

sfingomijelin i dr.
 Lecitin
 21% ukupnih lipida u 20. nedelji

 sfingomijelin 51%

 odnos se menja tokom gestacije

U poslednjem mesecu:

lecitin / sfingomijelin = 2 :1
 Metode za procenu
zrelosti pluća
1. FIZIČKE
 Test pene (Clements-ov test)

 Merenje optičke gustine plodove

vode

 Merenje površinskog napona

(Wilhelmy-eva vaga)

 Metode za procenu
zrelosti pluća
2. BIOHEMIJSKE
 Određivanje L/S odnosa (odnos lecitin /
sfingomijelin)

 Određivanje lecitinskog fosfora:

 Određivanje koncentracije lecitina
 TPP (totalni fosfor lipida)

 Određivanje fosfatidil glicerola

 Enzimske metode
 Određivanje L/S odnosa

 26. nedelja – lecitin se javlja u plodovoj

vodi (raste do 35. nedelje)

 32. nedelja – izjednačenje koncentracija

lecitina i sfingomijelina

 u 20. nedelji – L/S = 0,5

 u 31. nedelji – L/S = 1

 u 36. nedelji – L/S = 2

Određivanje L/S odnosa
po Gluck-u
lipidna ekstrakcija

precipitiranje fosfolipida hladnim

acetonom

izdvajanje fosfolipida trankoslojnom

hromatografijom

bojenje fosfolipida

denzitometriranje
 Određivanje L/S odnosa
po Gluck-u
 potrebno 3 ml amnionske tečnosti

 referentne vrednosti 1,8 – 3,5

 može jako varirati – 2 – 9 posle 37.

nedelje

 ekstrermno niske, ali i ekstremno visoke

vrednosti - odsustvo adekvatne zrelosti
pluća
Kritični u proceni !
 Određivanje koncentracije
lecitina
 bez hladne precipitacije

 metoda je pouzdanija, ali komplikovanija

 slična metodi određivanja L/S odnosa

 određuje se konc. fosfora u mrlji lecitina

 fosfolipidi se na tankoslojnoj ploči boje

kristalima joda
 Određivanje totalnog
fosfora fosfolipida (TPP)

 hladna precipitacija acetonom

 kritična vrednost 0,14%

 prediktivni faktor RDS kod

prevremenih porođaja
 Određivanje fosfatidil
glicerola
 bolji pokazatelj opasnosti od RDS

 skoro da ga nema pre 35. nedelje

 granična vrednost 2%

Metode:
 jednodimenzionalna tankoslojna hrom.

 dvodimenzionalna tankoslojna hrom.

 test brze aglutinacije (Amniost-FLM)

 Plućni profil

 L/S odnos

 procenat dipalmitoil-lecitina

 količina fosfatidil inozitola (PI)

 količina fosfatidil-glicerola (PG)

Stepen sazrevanja pluća

1. Nezrela pluća

2. Intermedijarno zrela pluća

3. Nepotpuno zrela pluća

4. Potpuno zrela pluća

 Stepen sazrevanja pluća

1. Nezrela pluća
 L/S odnos < 2:1 (najčešće manji od 1:1)

 lecitin < 45%

 nema fosfatidil inozitola

 nema fosfatidil glicerola

 Stepen sazrevanja pluća

2. Intermedijarno zrela pluća

 L/S odnos 1,5 – 2,0

 lecitin oko 45%

 malo fosfatidil inozitola

 nema fosfatidil glicerola

 Stepen sazrevanja pluća

3. Nepotpuno zrela pluća

• L/S odnos > 2,0

• lecitin > 45%

• malo fosfatidil inozitola

• nema fosfatidil glicerola

 Stepen sazrevanja pluća

4. Potpuno zrela pluća

 L/S odnos > 2,0

 lecitin > 45%

 malo fosfatidil inozitola

 veoma mnogo fosfatidil glicerola

Stepen sazrevanja pluća
 Citološka ispitivanja

 Kariotip fetusa

 Velike ćelije nepravilnih ivica i renalne

ćelije ( II polovina trudnoće)

 Lipidne ćelije (od 36. nedelje; >10% - zrelost)

 Kulture ćelija amnionske tečnosti –

mogućnost determinisanja metaboličkih i enzimskih
defekata
Amniocenteza i kariotipizacija

1955
 nakon amniocenteze pravi se kultura
fetalnih ćelija

 određuje se ukupan broj hromozoma,

uključujući i polne hromozome

 prva kariotipizacija je indentifikovala

fetus, nosioc ozbiljnog poremećaja na
polnom hromozomu
 Prenatalna dijagnostika

 plodova voda (amnionska tečnost)

 uzorak horionskih resica
 uzorci uzeti aspiracijom iz
fetalnih organa i šupljina
 fetalna krv (uzeta kordocentezom)
 uzorak fetalne krvi ili organa
 fetalne ćelije izolovane iz majčine
cirkulacije
 Priprema kariotipa

metafaza

• sakupljene ćelije
• kultura ćelija – 1-2 dana
• ćelije se zaustavljaju u
metafazi, ubijaju i fiksiraju
 Down-ov sindrom
Prenatalna dijagnoza

• dva tipa procedura:

• Screening testovi procenjuju rizik da

beba ima Down sindrom
• Dijagnostički testovi - siguran dokaz
 Biohemijski screening za
Down-ov sindrom
određuju se hCG, AFP i uE3 (unconjugated
estriol – nekonjugovani estriol)

“Double test” – dva analita ( hCG↑i PAPP-A

↓ ili hCG ↑ i AFP↓)
PAPP-A – pregnancy associated protein A; sintetiše
se u trofoblastu; marker aneuploidije fetusa)

“Triple test”- visok hCG, nizak AFP, i nizak

uE3
Kariotip trizomije 21
Trizomija 21
FISH: Fluorescentna
IN SITU hibridizacija
Prikazuje fluorescentno
obojene hromozome u
metafazi

zeleno = test za kraj 4-og

hromozoma

crveno = kontrolna proba

centromere X hromozoma i
druga proba za kraj
hromozoma X
FISH test: Bojenje
hromozoma
 FISH test: Bojenje
hromozoma
hromozomi 13, 18, 21, X, i Y obojeni
fluorescentnim probama

zeleno = hromozom 13 plavo = hromozom 18

crveno = hromozom 21 zeleno = X hromozom
red = Y hromozom
 Genetska testiranja
obuhvataju:
 Uzorci
Amniocenteza
CVS (uzorci horionskih čupica)
Fetalne ćelije u serumu majke
 Vrste testova
Kariotip
PCR
Dijagnoza specifičnih bolesti
Down-ov sindrom i cistična fibroza se mogu
dijagnostifikovati pomoću ovih testova
Chorion villi sampling (CVS)
• ispitivanje horionskih čupica (CVS) u I trimestru
• rana dijagnoza
• bezbedniji prekid trudnoće
• obično 9 – 11 nedelja gestacije
Fetalne ćelije iz krvi majke
• u poslednjih nekoliko godina, neinvazivna procedura

• prednosti – selekcija odgovarajućih ćelija (limfociti

fetusa, fetalni trofoblast, eritrociti fetusa sa jedrom)
• izolacija ćelija antitelima - markerima za CD71, CD36,
transferinske receptore i glikoforin A, korišćenjem
separacionih metoda sa fluorescentno ili magnetski
aktivisanim ćelijama.
• PCR ili FISH

• problem – ćelije ploda iz prethodne trudnoće ostaju u

krvi majke nekoliko godina
Screeining seruma majke
 Prenatalni screening

 Screening identifikuje visoki rizik

 AFP screening u serumu majke: 15-22 ned.

 AFP viši od 2.0 - 2.5 ukazuje na visok rizik

fetalne smrti ili drugih strukturnih anomalija

 zahteva dalja ispitivanja

 Alfa-fetoprotein
(AFP)
 u serumu i urinu fetusa, AT i serumu majke

 sinteza u fetalnoj jetri najviša od 12-14. nedelje

 povišene vrednosti u AT

 spina bifida i
 aneuploidija
Alfafetalni protein (AFP)
 Povišen nivo AFP
 Defekt neuralne tube  Niska porođajna težina
 Esofagealna ili  Oligohidramnioni
intestinalna opstrukcija
 Multifetalna gestacija
 Cistični higrom
 Smanjena težina majke
 Defekti abdominalnog
zida
 Urinarna opstrukcija
 Renalne anomalije -
policistični bubrezi ili
nedostatak bubrega
 Alfa-fetalni protein
(AFP)

• visoka koncentracija AFP u 80-90% slučajeva

defekta neuralne tube

• povišen nivo AFP u amnionskoj tečnosti

• za potvrdu Dg određuje se aktivnost acetilholin

esteraze – enzima specifičnog za nervno tkivo
 Određivanje kreatinina

 procena zrelosti bubrega

 u II polovini trudnoće

 2 mg% - kritična vrednost za dokaz

zrelosti fetalnog ekskretornog aparata

 od 37. nedelje
 Određivanje glukoze

 u krvi fetusa u slobodnom obliku

 u plodovu vodu dospeva bubrežnom ekskrecijom i
transudacijom iz epitela horiona

 65 mg% - 12. - 14. nedelja

28 mg% - 17. - 20. nedelja
18 mg% - 38. nedelja

Posle termina porođaja nestaje iz

plodove vode.
 Određivanje glukoze

 konc. glukoze opada tokom gestacije

 indikator zrelosti ploda

 screening na dijabet – 24-28. nedelja

 praćenje i kontrola trudnica sa dijabetom

Visoka glukoza majke i fetusa i insulin fetusa usporavaju

biohemijske i morfološki razvoj pluća ploda !
 Određivanje glukoze
 Pregestacijski dijabet – povišene vrednosti
glukoze u plodovoj vodi

 EPH gestoze – izrazito smanjenje od 38. nedelje

 Insuficijencija placente – smanjenje od 32. –

34. nedelje

Hipotrofični plodovi – hipoglikemija, smanjenje

rezervi glikogena i pad glukoze u plodovoj vodi !
 Određivanje bilirubina

 produkt razgradnje fetalnih Er

 raste do 18. n., a posle opada (znak zrelosti
jetre – konjugacija bilirubina i dalje metabolisanje)

Bilirubin je indikator pojačane hemolize, urođenih

grešaka metabolizma !

(glukuronil transferaza, GPDH i piruvat kinaza)

 Određivanje bilirubina

Značaj:
 Rh-izoimunizacija
 fetalna zrelost jetre

Granična vrednost – 0,13 mg%

 Određivanje bilirubina

 Porast bilirubina korelira sa težinom

hemolitičke bolesti

 Pad bilirubina je prognostički znak da će

fetus preživeti

 Skok bilirubina ukazuje na erithroblastosis

fetalis
Određivanje bilirubina

 Srpasta anemija i
hiperbilirubinemija majke
Daju povišene vrednosti
bilirubina u amnionskoj tečnosti.
 Enzimska ispitivanja

 alkalna fosfataza
 termostabilna alkalna fosfataza (TSAF)

 oksitocinaza (cistin-aminopeptidaza)

 diamino oksidaza
 Alkalna fosfataza

 rano određivanje – 14-22. nedelja

 kasno određivanje – 25-44. nedelja

Porast TSAF - rani znak ozbiljnog

fetalnog poremećaja - EPH gestoze
 Oksitocinaza

 aktivnost u plodovoj vodi – 12. nedelja

 maksimum aktivnosti – 24-32. nedelja

 fetalnog porekla

Hipertenzija, EPH gestoze, hipotrofija

fetusa - korelacija vrednosti u
plodovoj vodi i serumu majke
 Diamino oksidaza

 niska aktivnost u plodovoj vodi

 nije fetalnog porekla

 pad aktivnosti u serumu majke

prethodi spontanom pobačaju

 u plodovoj vodi određivanje nema

veći značaj
 Prevremeni porođaj

Savremeni multimarkeri u amnionskoj

tečnosti:
 interleukin-6 (IL-6),

 alkalna fosfataza
 urea
Savremeni dijagnostički
markeri u AT
protein S100B
sVEGFR (soluble VEGF receptor)
eritropoetin
sEndoglin
endotelin 1
interleukin-6 (IL-6),
adiponektin
urea
 Protein S100B

Ca-vezujući protein male molekulske mase

multifunkcionalni (regulacija energetskog
metabolizma, stimulacija sekrecije IL-6 i NO,
modulacija učenja u memorije i razvojna plastičnost)

ekstracelularni i intracelularni protein

u krvi novorođenčadi viši nego kod odraslih
u likvoru i/ili serumu povišen kod Daunovog
sindroma, intrauterine smrti ploda, preranog
porođaja, hipertenzivnih stanja u trudnoći, spine
bifide, anencefalije.
 Protein S100B

U preeklampsiji – povišen u AT

Amnion – izvor S100B u AT

U preeklampsiji – oksidativni stres

Patološki faktori koji dovode do

hipoksičnog stresa su verovatno uzrok
povećanja proteina S100B u
amnionskoj tečnosti.
 Porast proteina S100B

Anencefalija
Defekt neuralne tube
Oštećenja CNS-a
Monoamnionske blizanačke trudnoće
Trizomija 21.hromozoma

Porast proteina S100B u srednjem trimestru trudnoće ukazuje da

je on obećavajuće dijagnostičko sredstvo u predviđanju
neobjašnjive intrauterine smrti ploda sa specifičnošću,
senzitivnošću, pozitivnom i negativnom prediktivnom vrednošću -
100%.
Florio et al. Pediatrics 2006; 118(3): e747-54.
 Atrezija ezofagusa

Biohemijski pristup poboljšanju

dijagnostičke efikasnosti:
Biohemijski markeri u amnionskoj tečnosti:
 proteini

 alfa-fetoprotein (AFP)

 digestivni enzimi (gama-glutamil transpeptidaza)

 EA indeks (AFP pomnožen sa gGT)

 PROM (premature
rupture of membranes)
Potentni markeri PROM u AT:
 prolaktin
 alfa-fetoprotein (AFP)
 b-humani horionski gonadotropin (bHCG)

Elektrohemoluminescencija (ECLIA) -
metoda izbora za merenje sva 3 proteina (trajanje analize
18 min).

Analiza ROC kriva:

AFP ima 94% specifičnosti, senzitivnosti, pozitivnu i
negativnu prediktivnu vrednost i efikasnost.
Prolaktin i bHCG mnogo manje – 70-80%.
 Preeklampsija

Neadekvatni rast placente

Usporeni rast vaskulature
Endotelna disfunkcija
Hipoksija fetusa
Oštećenje CNS-a fetusa
Intrauterina smrt ploda
VEGFR-1 i eritropoetin
u preeklampsiji
VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase)
receptor za VEGF
mitogen i regulator vaskularne
permeabilnosti
prisutan u amnionskoj tečnosti

U preeklampsiji slični mehanizmi, osetljivi

na hipoksiju, indukuju porast VEGFR-1 i
eritropoetina.
 Preeklampsija

Vuorela et al. Obstetrics & Gynecology 2000; 95(3): 353-7.

 Preeklampsija
Promene nivoa anti-angiogenih proteina u AT se
javljaju pre razvoja preeklampsije i zastoja u intrauterinom
(IU) rastu ploda.

Endotelin-1, sFLT1 (fms-like tyrosine kinase receptor),

sEndoglin i leptin rastu u AT pre razvoja preklampsije.

sFLT1, sEndoglin, adiponektin i leptin su značajno

viši kod preeklampsije sa zastojem u IU rastu ploda u
odnosu na preklampsiju bez zastoja u rastu.

Leptin se može smatrati prediktivnim markerom za

eklampsiju, jer raste 2 meseca pre pojave simptoma.
 Preeklampsija

Wang et al. J Clin Endocrinol Metab 2010; 95(3):1431–41.

 Preeklampsija

Wang et al. J Clin Endocrinol Metab 2010; 95(3):1431–41.

 Proteomika
Uspešna istraživanja amnionske tečnosti u cilju
razvoja proteinskih markera za brojnu patologiju
vezanu za trudnoću.

Fokus – postavljanje proteomike kao

glavne tehnologije u proučavanju različitih
stanja ploda: fetalna aneuploidija, prevremeni
porođaj, preeklampsija, intra-amnionska infekcija
i stres fetusa.

Proteomika će postati standardni pristup u

zbrinjavanju brojnih bolesti i stanja udruženih sa
zdravljem fetusa i majke.
Zahvaljujem se na pažnji !