PCR

LANANA REAKCIJA
POLIMERIZACIJE

PCR
Lanana reakcija polimerizacije
Kary Mullis je osmislio PCR 1983
1993 Nobelova nagrada za hemiju
In vitro amplifikacija definisane DNK sekvence koja
predstavlja imitaciju procesa DNK replikacije
Ciklus:
a. Denaturacija DNK
b. Hibridizacija dva oligonukleotida prajmera koji su komplementarni
krajevima sekvenci koja se umnoava
c. Ekstenzija hibridizovanih prajmera od strane termostabilne DNK polimeraze
Uspenost PCR amplifikacije proverava se elektroforezom na agaroznom gelu

KOMPONENTE PCR SMEE

DNK uzorak, matrica koja se kopira

Prajmeri oligonukleotidi komplementarni krajevima
sekvenci koja se kopira
Nukleotidi gradivni elementi DNK
Taq polimeraza termostabilna DNK polimeraza koja
katalizuje ugradnju nukleotida po principu
komplementarnosti sa DNK matricom
Joni Mg 2+
Pufer

Shema PCR-a

PCR ciklus se sastoji iz tri koraka:

denaturacija DNK, raskidanje vodoninih veza izmedju

komplementarnih DNK lanaca, izvodi se inkubacijom
PCR reakcione smee na 95 C
hibribridizacija prajmera sa matricom, izvodi se na
temperaturi 42 C do 65C
elongacija prajmera, ugradnja nukleotida ma 3 krajevima
prajemera katalizovana termostabilnom Taq
polimerazom, 72 C

za 2 sata dobija se 10 6-10 9 kopija odreenog DNK

fragmenta

Prednosti PCR metode

Visoka senzitivnost minimalna koliina materijala DNK iz samo

jedne elije
Visoka specifinost odreena selektivnom hibridizacijom prajmera
Jednostavnost, brzina, niska cena

Fragmenti do 1kb, 5 kb pa do 40 kb pa i vie

Uzorak DNK
IZ HUMANOG BIOLOKOG MATERIJALA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

Leukociti periferne krvi

Epitela bukalne sluznice
Amnionske tenosti
Horionskih upica
Bioptikog tkiva
Autopsijskog tkiva
Urin
Semena tenost
Cerebrospinalna tenost
Korena kose
Krvne mrlje
Pljuvaka

istoa DNK uzorka

Fenol hromoformska ekstrakcija

Prajmeri

Sintetski jednolanani oligonukleotid

Duina od 14 do 40 nukleotida
G/C sadraj od 40 do 75%
Balansirana distribucija G/C i A/T bogatih regiona
Taka topljenja od 42 do 65 C
Optimalna koncentracija od 0.1 do 0.6M

5'

Prajmer
1

3'

Prajmeri

Sparivanje 3'
komplementarnih
5' krajeva prajmera

3'
Prajmer
2

5'

5'

5'

5'

Elongacija

Ne sadre 3 kraj
komplementaran 3
kraju drugog prajmera
u PCR jer mogu
meusobno
hibridizovati i posluiti
kao matrica to za
rezultat ima prajmer
drajmer artefakt

Ne sadri palidromske
sekvence koje na niim
temperaturama
stvaraju strukture
ukosnice stabilizovane
intralananim
vodoninim vezama

Prajmer-dajmer
artefakt

Palindromska sekvenca

5' Prajmer

3'
Struktura
ukosnice

5'

3'

Smanjena
efikasnost ili
inhibicijaPCR

KOMPONENTE PCR SMEE

Taq polimeraza
Izolovana iz bakterije Thermus aquaticus
DNK polimeraza termostabilna na 72 75 C, sposobna je da zadri
aktivnost i nakon inkubacije na 95 C
DNK zavisna polimeraza, koristi DNK ko matricu za sintezu
komlementarnog DNK lanca bez 3-5 egzonukleazne aktivnosti

RT-PCR
PCR kome prethodi
reverzna transkripcija

RT - PCR
Kvalitativno i kvantitativno izuavanje RNK
RT-PCR
Primena:
-analiza ekspresije gena, molekularna dijagnostika detekciji HIV-a

Prvi korak RT - konvertuje RNK molekul u komplementarnu cDNK

Drugi korak cDNK kao matrica slui za PCR

RT - PCR
-

Minimalna koliina RNK

Enzim reverzna transkriptaza
Reakcioni pufer
dNTP-ovi
Inhibitori enzima RNKaza
prajmer za poetak sinteze cDNK

RT-PCR
RT na 42 C u trajanju od 15 min. do 1 sata
Nakon sinteze prvog cDNK lanca,
RT se inhibira kuvanjem RT smee na 99 C
5 minuta i dranjem na ledu jo 5 minuta
Za PCR
specifini prajmeri ako su se koristili nasumini heksameri ili
oligo dT prajmeri
ili samo uzvodno specifini prajmeri ako su se za RT koristili
nizvodno specifini prajmeri

RT - PCR

RT-PCR

OTKRIE
TERMOSTABILNIH POLIMERAZA KOJE ZA SINTEZU DNK
KORISTE KAKO DNK TAKO I RNK MATRICU Tth polimeraza
OMOGUILO JE IZVOENJE RT-PCR-a u JEDNOM KORAKU

 http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_

KsDI&feature=related
http://www.youtube.com/watch?
v=o_0dFor_syw