Univerzitet u Beogradu – Medicinski fakultet

DAS – Molekularna genetika čoveka

CRISPR/Cas
Nebojša Brezić
Savremeni sistemi za editovanje genoma
• Unošenje visokospecifičnih promena u
sekvencu DNK živog organizma,
pritom menjajući njegovu genetičku
strukturu
• Oblik genetičkog inženjeringa
• Postojeća sekvenca DNK se izbacuje,
menja ili se nova ubacuje u genom
• Sistem čine domen za vezivanje
DNK i endonukleazni domen
• Meganukleaze (12-45 bp)
• DSB se popravljaju putem homologne
rekombinacije i NHEJ
Definicija CRISPR

Clustered
Regularly
Interspaced
Short
Palindromic
Repeats
Istorijski osvrt

Yoshizumi Ishino

Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase
isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol 169:5429–5433
CRISPR/Cas sistem
• Porodica DNK sekvenci u genomu prokariota
• 50% bakterijskih i 90% genoma arheja
• Fragmenti DNK bakteriofaga, plazmida ili
transpozona – spacer sekvence
• Stečeni imunski sistem prokariota
• Stiče se horizontalnim transferom
• Cas – CRISPR-associated genes/proteins
• crRNK + tracrRNK = gRNK
• Male nekodirajuće RNK
CRISPR lokus i array
• Leader sekvenca (100-350 bp)
• Bogata AT parovima, promotor za
transkripciju pre-crRNK
• Direct repeats (DR) (28-37 bp)
• Nisu u potpunosti palindromske
sekvence, ali formiraju sekundarne
strukture (ukosnice)
• (proto)spacers (32-38 bp)
• Sekvenca bakteriofaga, plazmida ili
transpozona
Klase CRISPR/Cas sistema

• Multi-unit vs. single efektorski molekuli

• Klasa 1 čini 90% svih CRISPR/Cas sistema
Struktura Cas9
• REC I – vezuje gRNK
• REC II
• Bridge helix – vezivanje i inicijalno
sečenje target DNK
• PAM interacting – inicijacija vezivanja
DNK prepoznavanjem PAM sekvence
• HNH i RuvC – nukleaze (ssDNK)

Recognition (REC) lobus = REC I + REC II

Nuclease (NUC) lobus = HNH + RuvC
pozitivno naelektrisani džep u koji se smešta negativno
naelektrisani heterodupleks gRNK-target DNK
 Struktura gRNK

5'
DNK sekvenca virusa se uvek integriše u
5' kraj CRISP lokusa – prvo se prepisuje
Konformaciona promena
1. Cas traži PAM (protospacer
adjacent motif) sekvencu
(2-3 nukleotida), porekla
virusne DNK, koja se nalazi
1 nukleotid nizvodno od
sekvence kojoj je
komplementarna gRNK

2. Kada se veže, Cas raskida

vodonične veze uzvodno
od PAM i gRNK se vezuje
za target sekvencu

3. Nukleaze prave DSB posle

trećeg nukleotida uzvodno
od PAM
Memorija za buduće infekcije
1. Dizajniranje i sinteza gRNK
• Identifikacija target sekvence DNK (20 bp) koja će se editovati
(treba da sadrži PAM nizvodno)
• Dizajniranje gRNK koja je komplementarna target sekvenci
• Optimizacija dizajna gRNK – efikasnost i specifičnost
2. Generisanje CRISPR/Cas9 sistema
• Kloniranje Cas9 gena ili sinteza proteina tehnologijom
rekombinantne DNK
• Unošenje Cas9 gena i gRNK sekvence u plazmid/vektor
3. Transfekcija/transformacija ćelije/organizma
• Elektroporacija, lipofekcija
4. Selekcija i izolacija ćelija
• Identifikacija ćelija koje su preuzele CRISPR/Cas9 i njihova izolacija
• Selektivni pritisak
5. Analiza ishoda editovanja
• Izolacija DNK → PCR → analiza PCR produkata (sekvenciranje, *Off-target analiza
RFLP, HRM, gel-elektroforeza) • Bioinformatičkim alatkama predvideti
potencijalna off-target mesta na kojima bi
6. Ispitivanje efekata editovanja na krupnom planu sistem mogao da deluje
• Funkcionalni eseji, analize • Analizirati za mesta na potencijalne
genske ekspresije, fenotipske studije, Western blot, imunoeseji... mutacije (sekvenciranje)
Primena CRISPR/Cas9 u regulaciji genske
ekspresije i editovanju baza
Katalitički nekativan mutant Cas9 proteina se fuzioniše sa
aktivatorima ili represorima transkripcionih faktora
• dCas9 – ''dead Cas9''
• Aktivatori: VP64, p65, Rta (''VPR'')
• Represori: KRAB
Editovanje baza – ABE i CBE
• dCas9 + adenozin ili citidin deaminaza = point mutacije (editovanje baza)
Prime editing
• Cas9 – SSB umesto DSB
• Reverzna transkriptaza
• pegRNK sa editom
Dilataciona kardiomiopatija
Knockout onkogena i knock-in tumor-supresorskih gena
Knockout Knock-in
• CD113: smanjena ekspresija vimentina
u ćelijama CRC – smanjena proliferacija, • PTEN: inhibicija nishodnih onkogenih
formacija kolonija, migracija i invazija puteva u ćelijama melanoma i TNBC
malignih ćelija
• BAP1: smanjena metastatska invazija
• miR3064: smanjena proliferacija i holangiokarcinoma
invazija malignih ćelija karcinoma
pankreasa • Knockout tumor-supresorkih gena se
• EGFR: smanjen rast, proliferacija i koristi eksperimentalno na ćelijskim
veličina karcinoma pluća linijama radi ispitivanja njihove uloge
• FAK: oštećenje DNK i povećana u karcinogenezi
osetljivost na radioterapiju u ćelijama
NSCLC sa KRAS mutacijom
• UBR5: smanjen rast tumora i metastaze
u TNBC
Zhang, H., Qin, C., An, C. et al. Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing
technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Mol Cancer 20, 126 (2021)
Knockout gena za rezistenciju na hemioterapeutike
• NRF2: povećana senzitivnost malignih ćelija
karcinoma pluća na karboplatin i cisplatin
• SKA3: povećana osetljivost malignih ćelija
karcinoma grkljana na cisplatin
• RSF1: povećana osetljivost NSCLC na paklitaksel
• AURKB: povraćena ekspresija p53 i povećana
osetljivost NSCLC na cisplatin i paklitaksel
Knockout metaboličkih gena
• HIF-1α i GLUT1: smanjena proliferacija,
migracija i invazija, smanjeno preuzimanje
glukoze i stvaranje laktata u malignim
ćelijama karcinoma cerviksa
Knockout gena stem ćelija raka
CRISPR/Cas9 i HIV-1
• Isecanje genoma DNK HIV-1 iz genomske DNK
• Isecanje ili bazno editovanje gena za CCR5
CRISPR/Cas9 i CAR-T
ćelijska terapija
• Knockout endogenih TCR gena ili PD-1
• Ekspresija samo CAR - veća specifičnost i manje
komplikacija
• Ubacivanje CAR gena
• Umesto virusnih vektora
• Optimizacija CAR
• Modifikacija antigen-binding domena - povećan afinitet i
specifičnost
• Inkorporacija kostimulatornih signalnih domena u CAR -
veća funkcionalnost i perzistencija

!
CRISPR/Cas9, anemija srpastih ćelija
i beta-talasemija
CRISPR/Cas9 i cistična fibroza

Okt4, Klf4,
Sox2, c-Myc
CRISPR/Cas9 i Dišenova
mišićna distrofija

Dišen → Beker
 CRISPR/Cas i Leberova
kongenitalna amauroza

EDIT-101: Brilliance Clinical Trial

Editovanje genoma humanih embriona?
Prednosti CRISPR/Cas9 tehnologije
• Mogućnost targetovanja bilo kog regiona u genomu
• Mogućnost targetovanja većeg broja regiona u genomu
• Multifunkcionalnost programiranja (insercije, delecije, reparacija gena)
• Visoka efikasnot i specifičnost
• Široka primena in vivo i ex vivo
• Jednostavan mehanizam
• Jednokratna primena?