MOLEKULARNO

BIOLOKE METODE ZA
ANALIZU RNK
 Kvantifikacija
RNK
Odreivanje veliine i mapiranje 5 i 3
krajeva RNK
Mapiranje ekson-intron granica u genu
Prouavanje diferencijalne ekspresije
gena preko analize iRNK molekula
 Northern blot hibridizacija
Nuclease protection assays
RT-PCR
Array analize
ZAJEDNIKI START METODA
Liza elija
Disrupcija membrana
Inhibicija aktivnosti
ribonukleaza
Deproteinizacija
Ekstrakcija intaktne
RNK
 NORTHERN BLOT HIBRIDIZACIJA

Razdvajanje na osnovu veliine

elektroforezom u agaroznom gelu
Prenos na membranu
Hibridizacija sa specifinom DNK
ili RNK probom
Detekcija
 NORTHERN BLOT HIBRIDIZACIJA

RNK izolacija (totalna ili poliA frakcija RNK)

Sinteza probe
Elektroforeza u denaturiuem agaroznom gelu
Transfer razdvojenih RNK na membranu i
imobilizacija
Prehibridizacija i hibridizacija sa probom
Ispiranja
Detekcija
Stripovanje i ponovna hibridizacija - mogua
 TRANSFER
1) Kapilarni transfer
(u neutralnom ili alkalnom puferu)
2) Vakum transfer
3) Elektrotransfer

Nakon transfera, RNK molekuli koji su

preli na membranu fiksiraju se za nju
primenom visoke temperature ili
ultravioletnim zracima na =254 nm.
 Nitrocelulozne membrane

Denaturisana RNK se vrsto vezuje za nitrocelulozu i veoma efikasno

hibridizuje sa obeleenom probom.

Senzitivnost sa kojom RNK vezana za nitrocelulozu moe biti

detektovana hibridizacijom je takva da dozvoljava da se one RNK koje
su zastupljene sa manje od 0,001% u smei iRNK mogu identifikovati i
lako kvanitifikovati.

Iako se oekuje da je vezivanje RNK za nitrocelulozu nekovalentno,

ono je u sutini iriverzibilno

Ovo omoguava stripovanje (skidanje vezane probe sa membrane) i

ponovnu hibridizaciju RNK imobilisane na nitrocelulozi bez njenog
znaajnog gubitka, pa time i slabljenja hibridizacionog signala.

Nitrocelulozna membrana nije dovoljno postojana da bi izdrala vie

od 2 do 3 runde stripovanja, hibridizacija i pranja.
 NAJLONSKE MEMBRANE
Prednost najlonskih, a posebno pozitivno
naelektrisanih najlonskih membrana je to dobro
podnose veliki broj stripovanja, hibridizacija i
pranja pri emu ne dolazi do promene
intenziteta hibridizacionog signala, s obzirom da
se nukleinske kiseline kovalentno vezuju za njih

Mana ovog tipa membrana je to daju vei

background.
 Hibridizacija specifine probe i
RNK imobilisane na membrani
selektivna i senzitivna

Selektivnost i senzitivnost hibridizacije se

postiu izlaganjem membrane za koju je vezana
RNK odgovarajuoj probi dui vremenski period
u uslovima koji favorizuju hibridizaciju probe sa
komplementarnim RNK sekvencama

Pranjima, nakon hibridizacije, sa membrane se

skida viak nevezane probe i razbijaju
nekompletni hibridi
 DETEKCIJA

Direktna i indirektna

Uslovljena vrstom obeleavanja proba

Radiaktivno i neradiaktivno obeleavanje

PRIMENA NORTHERN BLOT HIBRIDIZACIJE

1) Detekcija i relativna kvantifikacija specifine

iRNK

2) Relativna kvantifikacija ekspresije ispitivane

iRNK izmeu razliitih uzoraka na istoj
membrani

3) Odreivanje veliine transkripta

4) Detekcija alternativno splajsovnih transkripata

Detekcija i relativna kvantifikacija specifine iRNK

Detekcija aktin gena u totalnoj

elijskoj RNK izolovanoj iz timusa
mia

Northern analizom

Identini Northern blotovi sa

oznaenim koliinama totalne RNK
su hibridizovani sa radioaktivno
obeleenim DNK i RNK probama

Vea senzitivnost dobijena je

korienjem RNK probe
Relativna kvantifikacija ekspresije ispitivane iRNK
izmeu razliitih uzoraka na istoj membrani
 Detekcija alternativno splajsovnih transkripata

Primena Northern analize u detekciji iRNK

ije se 2 splajsovne forme eksprimiraju
razliito u razliitim tkivima
skel.
mii
srce mozak slezina plua jetra bubreg testis

Alternativni transkript 1
Alternativni transkript 2
OBRADA REZULTATA
 OGRANIENJA NORTHERN BLOT HIBRIDIZACIJE

Tekoe sa korienjem veeg broja proba u analizi.

Da bi se detektovao vei broj iRNK obino je neophodno stripovati

prethodno korienu probu i ponoviti hibridizaciju sa drugom probom.

Ovaj proces je vremenski zahtevan, moe smanjiti senzitivnost metode jer se

u procesu stripovanja skida i deo vezane RNK sa membrane, a dolazi i do
oteenja nitrocelulozne membrane.