MMUNOLOJK

TANI YNTEMLER

Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK
I- GENEL BAKI;
KLNK MMUNOLOJDE
HASTALIIN TANISI N
a) ok iyi bir YK alnmas
b) FZK NCELEME yaplmas
c) Uygun TANI TESTNN yaplmas
ZORUNLUDUR
a)YK:
KLNK MMUNOLOJ UZMANINA BAVURU
NEDENLER(sklk srasyla);
ENFEKSYONLAR (en sk)
4 Yineleyen enfeksiyon
ocuklarda bulac SYE ok sktr
Bu ocuklarda sekonder olarak
Otit, sinzit, bronit geliebilir
Bu hastalklar dier ocuklara grlmesine gre daha sksa
Antibiyotik almay gerektiriyorsa
+ Ig G alt snf yetersizlii vardr
Deri ve SYEnin;
6-12 aydan sonra balamas
Sk ve birincil olmas
+ Ig yetersizliini gsterir

4 ok ar enfeksiyonlar
Ar viral enfeksiyonlar
T hcre yetersizlii
Ar bakteri enfeksiyonlar
B hcre yetersizliini gsterir
4 Frsat mikroorganizmalarla enfeksiyon
Hastane enfeksiyon etkenleri
KT de CMV enfeksiyonu
Doal ve zgl immunitede
zellikle T hcre bozukluu

4 Kendine zg mikroorganizmlarla enfeksiyon
Aspleniklerde
Pnmokok enfeksiyonu
4 Enflamasyonsuz enfeksiyon
Aplastik anemi, ntropenik ve disfonksiyonel
ntrofiliklerde
Pyojenik bakterilere dirensizlik
4 Kronik enfeksiyon
Kronik ishal yada byme bozukluu olanlarda
sIgA yada T hcre yetersizlii
Rotavirus, G. lamblia enfeksiyonu


MMUN YETERSZLE BALI;
4 HASTALIK BELRTLER
Allerjik
Artrit
Deri deiiklikleri
4 Malign hastalklarla ilgili belirtiler



b)FZK NCELEME:
Hastada enfeksiyon bulunup bulunmad;
4 VARSA;
Hastann genel yant, salk durumunun gzlenmesi
Hastalarda;
4 Solgunluk
4 Kanama odaklar
4 Deride kolay morarma
4 Dknt
Hastann;
4 Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmad
4 Bykl saptanmaldr
Ar T hcre yetmezliinde lenf bezi ele gelmez
Bademcikler grnmez

Normal bebeklerde dalan alt ucu ele gelir
4 Ancak dalak yokluu (aspleni ile)
Bakteriyel (kapsll) enfeksiyonlar sktr
Azda pamukuklarn olmas
4 T hcre yetersizlii
Candida sp
Baz zel sendromlara spesifik;
4 Hastalk ve/veya bulgularn olmas
Di George sendromunda
Neonatal tetanoz ve KKH
Wiskott-Aldrich sendromu
Egzama
Kolay kanama eilimi
Petei
c)TANI TESTLER:
UYGUN TANI TEST NE DEMEK?
4 Hastann kliniine paralel doru
seilmi
4 Laboratuvar da zenle yaplm
4 Sonucu titizlikle aklanm testtir
UYGUN TANI TEST STEMENN NEDENLER
4 mmun sistem evre ile dinamik bir dengede olduu
iin;
ou testin spektrumu genitir
4 mmunolojik testlerin BAZILARI;
BOASSAY (yaam srecinde inceleme)
olduundan
Test srasnda kontrol edilemeyen deiken
faktrlerden etkilenirler
Bundan dolay testler
Ayn ya ve zamanda
+ Hasta ve kontrol gruplarnda yaplmaldr

4 Baz testler ilgili laboratuvarda az yaplr
Bundan dolay
Bu birim srekli nitelik kontrol yapmas gerekir
4 Test sonular
Klinik durumla paralel aklanmas gerekir
NK;
Baka ikincil hastalklar
Veya metabolik bozukluklar sonular etkiler
4 mmunolojik testler
zel ara- gere ve uzman ekipmanl laboratuvarlar
gerektirdiinden pahaldr


MMN SSTEM NCELEME ALGORTMASI


YK


FZK NCELEME


RUTN NCELEME TESTLER


MMUNOLOJK GZDEN GERME TESTLER



Total Kompleman Dzeyi Tam Kan Saym Gecikmi Tip Ar T, B ve dier Lenfosit mmunglobulin
Duyarllk Deri Testi alt grup Saymlar Dzeyleri





Dk Normal Lkositoz Lkopeni Pozitif Negatif Dk Normal Yksek Normal Dk


Trombositopeni T Hcre Yetersizlii







T Hcre Fonksiyon B Hcre Fonksiyon
Testleri Testleri
B Hcre
Yetersizlii
MMUNOLOJK ZEL TANI VE ARATIRMA TESTLER
I
O
IMMUNOLOJK TESTLERDE KLNK
RNEKLER
Venz damardan kan alnabilir
Mikrobiyal antijen tayini ile ilgili
4 Serum, dk, balgam, idrar,
4 Boaz salgs, BOS, PMNL
4 Dier enfekte doku, salg ve sekresyonlar
Humoral immuniteyle (antikor tayini) ilgili
4 Serum (antikoagulansz kan)
Hcresel immuniteyle ilgili
4 Heparinlenmi taze kan ve eriyik maddeler
4 nvivo uygulamalar (cilt testleri)
mmuno genetik almalarla ilgili
4 Kan rnekleri
4 Taze veya fikse edilmi dokular

ENFEKSYON HASTALIKLARIN TANISINDA
MMUNOLOJK NCELEMELER;
mmunolojik (Serolojik) Testler
Enfeksiyon hastalnn tansna sklkla indirekt,
(bazende direkt) yardmc olurlar
eitli klinik rneklerde mikroorganizmalara zgl
antijen (Ag) veya antikorlar (Ab) arama testleridir
Ag aratran testlerde duyarllk erken ve tedavi
edilmeyen durumlarda yksektir
Ab aratran testlerde primer immun yant 7-21 gn
iinde gelitiinden ok erken evrede yalanc negatif
olabilir
Erken tedavi edilen ve baklk yetmezlii olan
olgularda antikor yant gelimemektedir


Bu testler Ag-Ab birleme temelli testlerdir
Bu testler duyarll ve zgll farkl
YNTEMLERLE invitro olarak
yaplmaktadr
Bu yntemlerin ANALTK duyarll
farkldr
Hcresel mmun Yant (Fakltatif yada
zorunlu H..B) geliir
nvivo deri testleri
nvitro sentezlenen Quanteferon miktar ya
da Quanteferon sentezleyen hcre miktar
llr.

mmunolojik yntemlerin analitik duyarllklar (g/ml- ng/ml)
Test Yntemleri Antikor Antijen
Presipitasyon
20 g/ml 1 g/ml
mmunelektroforez
20 g/ml -
Agarda ift ynl diffzyon
(Queterlonoyplak)
1 g/ml -
Agarda tek ynl immundifzyon
(Radyal/ Mencini)
0.05 g/ml 0.05 g/ml
Kompleman birlemesi
0.5 g/ml -
Direk aglutinasyon
0.01 g/ml -
Pasif hemaglutinasyon
0.01 g/ml 15-30 g/ml
Hemaglutinasyon- inhibisyon
- 0.001 g/ml
Anti-toksin ntralizasyon
0.01 g/ml -
Virus ntralizasyonu
0.00005 g/ml -
RIA
<1 ng/ml <1 ng/ml
EIA
<1 ng/ml <1 ng/ml
Presipitasyon
MKROBYAL ENFEKSYONLARDA
SEROLOJK(MMUNOLOJK) YNTEMLERN
AMACI(I)
1- RNEN;
VRUSLARIN TANIMLANMASINDA;
Kltrle izolasyonu;
Olanaksz, g veya uzun zaman aldndan
rnein HIV enf uygun hayvan yok
Tam donanml laboratuvarlar ve deneyimli elemanlar
gerektirdiinden
Virus izolasyonu iin uygun rnek almak, transport etmek,
saklamak hususlarndaki sorunlardan dolay
RUTN TANIDA PRATK DELDR

VRUS ENFEKSYONLARINDA
SEROLOJK(MMUNOLOJK) YNTEMLERN
AMACI(I)

*Viruslerin mikroskobisinde;
-EM ve inklzyon cisimcii aranmasnn
pratikte kullanm snrl, zahmetli ve pahal
olmas
- Subjektif deerlendirmelere (deneyimli
eleman) ak olmas, yalanc pozitiflik
ve negatiflikler olabilir

VRUS ENFEKSYONLARINDA
SEROLOJK(MMUNOLOJK) YNTEMLERN
AMACI(I)

Viral nkleik asidin saptanmasnda;
-Molekler Yntemlerin
*Her salk merkezinde uygulanamamas
* Uyguland laboratuvarlara teknik donanm
yetersizlii ve deneyimli ekipman azl
* Her virus iin deneysel olarak optimize
edilememesi
-Yalanc pozitif ve negatiflik sorunu
* Her virus iin uygulamasnn olmamas
- zgl primer sorunu


Mikrobiyal Enfeksiyonlarda mmunolojik
(serolojik) Test Yntemlerinin amac;
+RNEN;
+ BAKTERYAL ETKENN TANIMLANMASINDA
zolasyonun olanaksz, g veya zaman gerektirdii durumlar;
Lepra, Sifiliz, Brucelloz, Tularemi
Derin yerleimli bir enfeksiyonda rnei elde etmek veya retmede zorluk;
Coxiella endokarditinde endokard rnei almak veya kanda
retme zorluu
Legionella, Chlamydophila, atipik pnmosinde BAL yada NFS
almak veya retme zorluu
Geirilmi bir enfeksiyon veya tayclk durum belirlemede:
ARA veya AGN de ASO dzeyi
Tifoda Anti-Vi varl
MKROBYAL ENFEKSYONLARDA ETKEN
TANIMLAMADA SEROLOJK (MMUNOLOJK)
DEERLENDRME KRTERLER (I)
Antikor tayin temelli drt kriter vardr
a) Tek bir serum rneinde;
4 Yksek titrede spesifik IgM yant
-Rubella IgM, M.pneumoniae IgM
4 Veya IgM negatif IgG pozitif ise;
Akut-konvelasan dnem (2-3 hafta sonra) serumda
4 kat titre art
-EBV IgG, C. pneumophila IgG 512
b) Akut ve konvelasan dnem (2-3 hafta) serumda
4 4 kat titre art
Total antikor yantnda
Paul Bunnel testi (EBV)
Bruselloz tansnda Wright Testi
1/20den > 1/160

c) Nadir grlen enfeksiyonlarda;
4 Tek serum rneinde
zgl IgM antikor yant
Kuduz, Botulismus


d) IgG AVDTE TESTLER
AFNTE: Multivalan bir antikorun monovalan bir
antijenle balanma kuvveti
AVDTE: Multivalan bir antikorun multivalan
bir antijenle balanma kuvveti


Olas Serolojik Profiller
IgG (-) IgG (+) IgG (+)
IgM (+) IgM (-) IgM (+)

Yeni nceden
Kazanlm Geirilmi ve
enfeksiyon Kazanlm
Baklk





Primer ve sekonder enfeksiyon
ayrmnda kullanlr


BU DURUM;
Re-enfeksiyonlarda
Toplumda yaygn dolaan viruslar;
- CMV, HSV gibi
Re-aktivasyonlarda
CMV, HSV, EBV, VZV gibi latent viruslar
Akut ve Subklinik Enfeksiyon Sonras Uzam
Serokonversiyonda GRLEBLR
Toksoplazmoz

IgG AVDTE TESTLERNDE PRENSP (I)
Primer enfeksiyonlarda viruse zgl IgG aviditesi dk;
Sekonder enfeksiyonlarda Yksek
+Re-enfeksiyon/aktivasyon
Primer enfeksiyonlarda oluan antikorlar zaman ilerledike(>4
ay), olgunlar ve antijenlere balanma gc artar
Bunun nedeni;
+ Yksek aviditeli B lenfositlerin seilmesindendir

MMUNOKOMPETAN KLERDE AVDTE
OLGUNLAMA SRELER
+ CMV 4 ay
+ RUBELLA 2 ay
+ TOXOPLASMA 6 ay
+ EBV 2.5 ay
+ HIV 6 12 ay

IgG AVDTE TESTLERNDE PRENSP (II)
Hamile kadnlarn;
CMV, Rubella konjenital enfeksiyonlarnda;
Primer ve sekonder enfeksiyon ayrmnda nemlidir
+Enfeksiyon primerse konjenital gei yksektir
+Sekonder ise virusun geii dktr
Immunsuprese Olgularda
CMV, EBV ve HHV-6 enfeksiyonlarn primer yada
sekonder ayrmnda kullanlr
Etkeni tanmlamada antijen tayini:
=Duyarll ve zgll yksek tan yntemleriyle
Doru yerden ve uygun ekilde alnan rneklerde Ag tayini
+ PMNH / pp65in IF ile CMV tans
+ Serum rneklerinde HBsAgnin EIA ile tans
+ C.trachomatis Ag tayini ancak epitel hcre ieren retral yada
endoservikal srnt yada aknt
+ H.pylori HpsA tayininde fazla sulu yada kat olmayan dk



= Ag Tayininin Yapld Durumlar;

zolasyonda(Kltr) sorunlar

Kltrde zor reyen bakterilerin tansnda;
rn: - C. trachomatis
- L. pneumophila

Kltr geciken yada uzun sren mikroorganizmalarn tansnda;
Bakteriler
- H.pylori
Viruslar
- CMV/pp65
Parazitler
- E. granulosus
Mantarlar
-C. neoformans




Ksa srede, hzl tan konulmas gereken ACL-CDD
durumlarda;
zellikle mikrobiyal menenjit tablosunda
rn: S.agalactia yenidoan menenjiti
Tonsillofarenjit
S.pyogenes

Toksijenik Aglerin tayini ile Bakteriyolojik Tansnda
C. difficile
Kark ortamlardaki bakterilerin hzl tansnda
Campylobacter
ndirekt bakteriyal tr tansnda
Shigella spp

Serolojik tan neleri amalar?(II)
2. Enfeksiyon hastaln dorulama
4 Direkt Aglutinasyon Testi
-Kltrde reyen bakterinin antijenine kar hasta serumundaki
antikor yantnn saptanmas
4 M.tuberculosis enfeksiyonunda Quanteferon testi
4 HIV de EIA ile Anti- HIV in WB ile dorulanmas
3. Bir kiinin ya da toplumun bakln saptama
4 Anti-HAV IgG,
4 Anti-HBs
4. Etkenlerin serogrup, serotip veya immuno tiplendirilmesi
4 E. colide ETEC, EPEC gibi
5. Hastaln prognozu
4 HAV IgM yant,
4 HBVde hepatit belirteleri

Serolojik(mmunolojik) Tanda Klinik
rnek Uygunluu
Serum, plazma, plevra-periton-eklem svs, BOS ve doku kesitleri
Ab Arama amal serumun eldesi aseptik koullarda olmal ve
4 Hemolizli, lipemik, fibrinli olmamal
Ag Arama temelli klinik rnekler;
4 CMV/ pp 65 PMNH baklabilir
4 RSV/Ag Nazofarengiyal ykama suyu veya aspirat
Serolojik testler test kuralna gre allmal
rnein: Souk agltinasyon
Taze serumla allmal,
4 allamyorsa;
Testlerin zelliine gre 4
0
C, -22, -40, -70
0
C
de saklanmal
Serumlarda dondurma ve zme ilemi bir kez yaplmal
Baz hastalklarda kan alm aral nemli
rnein: HIVde ortalama 1.5 ay sonra

Serolojik Tanda nvitro Test Prensipleri
IgGnin molekler yaps
Antijen (Ag)- Antikor (Ab) birlemesinin
zellikleri
Antijen-antikor birlemesi kimyasal bir reaksiyondur
nk s aa kar
zgl bir reaksiyondur
S. flexneriye kar hazrlanan Ab
S. dysenteria ile birlemez
Geriye dnr bir reaksiyondur
Ag+AbAgAb
Ag ile Ab arasnda meydana gelen denge K ile gsterilen denge
sabiti ile aklanr
K=(AgAb) / (Ag) (Ab)
K ne kadar yksek olursa birleme o kadar zgldr.

Antijen ve antikor uygun oranlarda bir araya
getirildiinde maksimum reaksiyon oluur

ki safhal reaksiyondur:
1. safha;
-ok ksadr, Gzle grlmez
-Elektrolitlere gereksinim yoktur
2. safha;
- Uzundur, gzle grlr.
- Elektrolitlere gereksinim vardr.
- Is ve ntral pH reaksiyonu hzlandrr


Antijen-antikor birlemesinde rol
oynayan kuvvetler
1- Elektrostatik kuvvetler
- Ag ve Ab molekllerinin yzeyinde birbirine zt ykl
yaplarn birbirini ekmesidir
- Bu hcrelerdeki ekme gc 2 molekl arasndaki uzakln
karesi ile ters orantldr.
F=(1/d
2
)
-Bu kuvvetler Ag ve Ab birbirine yaklatka artar
- rnein NH
+
grubu ise iyonize COO
-
gruplar birbirine eker.
2- Hidrojen balar
-Hidrofilik gruplar arasnda meydana gelen balardr
-Zayf ve geriye dnml balardr
-Bu balarn olumasnda iki molekln birbirine yaklamas
gerekmektedir.



3- Hidrofobik balar
- Bu balar 2 molekln birbirine yaklamas srasnda
su molekllerini iterek birlemesinde etkendir
4- Van der Walls kuvvetleri
- Bu kuvvetler Ag ve Ab molekln saran elektron
bulutlar ile ilgili kuvvetlerdir.
- Bu kuvvetlerin etkinlii iin Ag ve Ab molekllerinin
birbirine ok yaklamalar gerekir.
- Bu kuvvetlerin etkinlii Ag ve Ab arasndaki uzakl 7
ile ters orantldr
F=1/d
7


SEROLOJK TEST YNTEMLER
1)PRESPTASYON;


znr haldeki antijen ve zgl antikorlarn
4 Optimum konsantrasyonda kartrlmas ve
4 Birlemesine bal gelien reaksiyona denir
4 Reaksiyon sonucu
Kompleks (presipitat)gzle grlr
Birka dakikadan,1-2 gne kadar
uzayabilir
Reaksiyonda
4 Optimum Ag ve Ab miktar nemlidir
4 AYRICA;
PH, elektrolit ve s da nemlidir
Presipitasyon reaksiyonlar;
Pasif difzyon eklinde
4 Sv ortamda difzyon
Halka ve kapiller tp
N. menengitidis, S. pneumoniae, H.influenzae
Ag
4 Jel (agar)ortamda difzyon
Tek ynl difzyon
Quidin tp dif.
eitli virus ve bakteri Ag
belirlenmesinde kullanlr
Radyal, Mancini plak dif.
CRP, serum Ig ve kompleman dzeyleri
Trbidimetrik ve nefolometrik
cihazlar gelitirilmitir
ok sayda kan
deerlendirilmesi iin
ift ynl (quchterlonoy plak) difzyon
Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz
Aglerin belirlenmesinde


Immuno-double diffusion
ELEKTRO- MMUN DFZYON
Elektrikli ortamda;
4 Antijenler elektriksel alanda ayrlrlar (elektroforez)
4 Elektroforez iin deiik matriksler;
Kat
Sellloz asetat
Agar
Poliakrilamid kullanlr
4 mmun difzyon ve elektroforezin birletirilmi tekniine
MMUNELEKTROFOREZ denir
Serum proteinlerinin tanmlanmasnda
Ig snflar ve ar, hafif zincirlerdeki anormalliklerin saptanmasnda
Basit, tek ynl (laurell)(roket elektroforezi)
Titresi bilinmeyen bir antijenin titresini belirler
Kart( zt ynl) IEF
HBV Ag ve Ab saptanmasnda
Septik menenjit, pnmoni, septik artrit vb etken Antijen
saptanmasnda
2) AGLUTNASYON:
Doal olarak antijen tayan
4 Bakteriler, Eritrositler, Lkositler
Yzeylerinde yapay olarak antijen bulunan
4 Eritrosit, Latex, Bentonit
4 Polistren gibi sentetik paracklarn
Elektrolitli bir ortamda
Tadklar antijenlerle,
Spesifik antikorlarn
Kmeleme yaparak kmesine denir
Lamda, tpte mikroplaklarda yaplrlar
kiye ayrlr
4 Aktif aglutinasyon
4 Pasif aglutinasyon

AKTF AGLUTNASYON;
DREKT
4 Aglutinasyonda rol alan antijen partikln kendisidir
Bakterilerin antijenleri
Gruber- Widal, Wright, WF
Kan grubu antijenleri
Aktif hemaglutinasyon
ABO, Rh, Vd
+ Forward
+ Reverse
Cross-Matching
+ Major
+ Minor
Souk aglutinasyon
+ M.pneumoniae
Paul- Bunnel
+ EBV
AKTF AGLUTNASYON;
NDREKT
4 Antijen ve antikorun balanmasnda
ikincil bir antikorun kullanlmas

Antiglobulin Ab (tavan
kaynakl - ticari)
Direk Coombs
Eritroblostasis fetalisli
ocuklarn eritrosit yzeyindeki
Ab saptanr
ndirekt Coombs
Rh (-) annenin serumdaki Anti-
Rh Abler saptanr


PASF AGLUTNASYON
ANTKOR (Ab) ARANIYORSA
4 Aglutinasyonda rol alan antijenler
Polisakkarit veya
Proteinler (tannik asitle)
Eritrosite balanrsa
HEMAGLUTNASYON
+ VZV, Rubella, CMV, T.gondii
Latex partiklleri, bentonit, kmr vb

PASF AGLUTNASYON
ANTJEN (Ag) (TERS PASF) ARANIYORSA;
4 Eritrosit, latex, bentonit, kmr
4 S.aureus covan 1
Antikorun Fcsine balanr
Latex Agg (LA)
Ko Agg (CoA)
Serum, BOS, idrarda
+ Bakteriyal polisakkarit Agleri
+ N.menengitidis
+ Hib
+ S.pneumoniae
+ C.neoformans
+ Streptokok gruplandrlmas,
+ S.aureus koagulaz deneyi
+ eitli bakteri ve virusta ag tayinleri


Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) testi
4 Hemaglutinasyonu engelleyici antikorlarn
saptand testtir
4 Hastann serumu seri dilusyon edilir
4 zerine standardize sabit virus antijeni konulur
4 Eritrositler eklenir
Serumda Abler varsa
Hemaglutinasyonun grlmedii son titre
pozitif sonutur
nfluenzae, Kabakulak, Rubella
enfeksiyonlarnda
3)KOMPLEMAN BALAMA TEST
Antijen ve antikor birlemesinin kompleman
uyarmasna dayanarak gelitirilen iki basamakl testtir
Antikor (sklkla) ve antijen saptayabilen yar kantitatif
bir yntemdir
Test birbirinden farkl komponent ierir
4 Test sistemi
Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)
Antijen (bilinen)
KOMPLEMAN(kobay veya tavan serum)
4 ndikatr sistemi (hemolitik sistem)
Koyun eritrositleri
Koyun eritrositlerine kar Ab
DEERLENDRME;
Hasta serumunda Ab varsa
4 Ag ve Ab birleecek (klasik yol)
4 C, Ag ve Abye balanacak
4 Ortamda C kalmayaca iin
Hemolitik sisteme balanamayacak
Hemoliz olmayacak
Baz viral, riketsiyal ve fungal hastalklarn
tansnda
1990l yllarda Sifiliz iin KOLMER

4)FLOKLASYON
Kardiolipin antijenin sifilitik hasta serumlarndaki reaginlerle
birleerek oluturduklar,
VE; Toksin ile anti toksinin uygun miktarda karlatklarnda
meydana getirdikleri
4 KMECKLERE denir
Bu kmecikler gzle yada kk bytmelerle grlebilir.
4 Toksoid alarn miktar tayininde kullanlr
4 AYRICA;
Sifilizin tarama testlerinde;
Rapid plazma reagin (RPR) direkt, VDRL kadar ise serum
inaktif edilerek allr.
Bunlar tplerde veya zel lambalarla kalitatif (RPR) ve kantitatif
(VDRL) olarak yaplabilirler.
RPR, 4+dan (-) kadar, VDRL de ise den balayan ve yukar
titrelere kadar varan titrede sonu verilir.

5)NTRALZASYON

Bir virusun enfektivitesini
4 zgl antikoru ile etkiletikten sonra
Kaybetmesine denir.
4Enfektiviteyi ntrleyen antikorlarn ortaya karlmas testidir.
4 BROK VRAL ENFEKSYON TANISI
Ntrolizan Ablerin saptanmas
ift serumda Ab titresinin artyla salanr
Poliovirus/Serum
Doku Kltrne
Kabakulak virusu/Serum
Embriyonlu Yumurta
Kuduz As/Serum
Fareye


Ntralizasyon nvitro ve invivo yaplabilir
N VVO 3 EKLDE YAPILABLR:
4 Deney Hayvanlarnda
En sk Fare kullanlr
4 Doku Kltrnde
En sk bu yntem kullanlr
Prensip CPEnin yok edilmesidir.
CPnin grlmedii titre ntr. titresidir.
4 Embriyonlu Yumurta
^nfluenzae- Kabakulak
Allantoik keseye
^ iek-Herpesviruslar
Karioallantoik zara
N VTRO OLARAK
4 ASO deneyi
AGBHS de Streptolysin Oya kar
Anti- Streptolysin O oluur
Ntrolizasyon sonucu
ndikatr olarak eritrositlerde erime olmaz

4METABOLK NHBSYON
TEST
Ntralizasyon Testi gibidir
Virus/Serum karm
zerine hcre sspansiyonu konur
Fenol krmzs(ndikatr)
+Ntralizasyon varsa renk SARI
+Ntralizasyon yoksa renk KIRMIZI
+rnein; Enteroviruslarda renk krmz kalr,
Adenoviruslarda renk deiiklii olur.
G)MMUNOASSAY TESTLER
aretli antikorlarn kullanlmasyla
4 1942de;
FA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar)
4 1954de;
IFA (ndirekt Fluoresan Antikor)
4 1960da;
RIA (Radyoizotopla- iyotla)
4 1970de;
EIA (enzimle) kullanma girmitir
Antikor yada antijen saptamak iin
kullanlrlar


I- mmun Fluoresan (IF) testler
FLUORESANS
4 Fluorokrom veya florofor boyalarn
4 Ultraviyole k altnda
4 Ik enerjisini emerek
4 Bu enerjiyi farkl dalga boyuna
evirmesine denir
Antikorlar en sk fluoresin isotiyosiyanat (FITC) ile iaretlenir.
BUNA GRE;
4 Direk fluoresan antikor (DFA)
Kat fazda klinik rnek (Ag)
zerine FITCli Ab
Pozitif sonu (fluoresan-yeil grnt)
Bakteri ve viruslerin hzl tanda
Kuduzda negri cisimcii
Kolera tansnda
4 ndirek fluoresan antikor (FA)
Kat fazda hazr Ag
Hasta serumu(aranan Ab)
FITCli Anti-Ig
Pozitif sonu (fluoresan grnt)
Birok bakteri virus enf ve otoimmun hast.
FTA- Abs (T.pallidum)
ANA, AMA vb
IF yntemiyle klinik rneklerden hem Ag hem Ab aranr
Fluoresan mikroskobu olmas ve uzman kii gereklidir
II-Radioimmuno Assay (RIA)
Yntem ayn IF ve EIA gibidir
Antikorda iaretliyici madde olarak
4 Radyoaktif madde
I. 125 ve I. 132 kullanlr
4 Gamma sayalarnda deerlendirilir
4 Radyoaktif madde kullanmndan dolay snrldr
zellikle hormon testlerinde (TSH, T3, T4) kullanlr
Radyo allergo sorbent (RAST) deneyi
Allerjene spesifik IgE tayininde kullanlr
Radioimmunosorbent (RIST)
Serumda total IgE tayininde
III. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbend
Assay)
ENZMLE ARETLENR.
4 Antijen veya antikorun;
eitli vcut svlarnda varln
ok duyarl bir biimde (<1 g) gsterilmesine dayanr.
4 Makro ve mikrosistem ekilleri vardr.
HIV, hepatit, TORCH ve sitokin almalarnda;
ok sk kullanlr
4 Son yllarda gelitirilen
MEMBRAN ELISA ad verilen;
Ag ve Abnin kromotografik (renkli bir izgi veya noktack) olarak,
Bir membran zemindeki reaksiyonuna dayanan
Rapid (hzl) yntemleri gelitirilmitir.
Acil durumlarda kullanlrlar
ANCAK duyarllklar hazrlanma tekniine bal olarak dk
olup,
YALANCI NEGATFLERE dikkat etmek gerekir.


EIA OTOMATK SSTEMLER
Kan bankas rutin almalarna son yllarda giren
sistemlerdir.
Makro sistem, kapal sistem olarak da bilinen sistemlerdir.
alma sistemleri ve Prensipleri;
4 Kapal bir cihaz
Ve bu cihazda almaya uygun kitler ile
Cihaza bal bilgisayar ve yazc.
Piyasada en sk bulunan
4 EIA otomatik sistemler;
Enzyme-linked flureskent assay (ELFA)
Mikro partikl enzim immuno assay (MPEIA)
Fluoresan polorizasyon immuno assay (FPIA)
Chemiluminescent Assay (CA)
yntemleri ile almaktadr.

ELIZA yntemi drt ekilde uygulanr:

A) Serumda Ab aranyorsa:
(sandwich)
Kat yzeyde Ag + pheli serum (Ab)
Ykama
zerine;
4 Enzimle iaretli anti-Ab konjugat
Substrat ilave edilir
Renk oluur.

B) Serumda Ag aranyorsa:
(sandwich)
Kat yzeyde Ab+pheli serum (Ag)
Ykama,
zerine;
4 Enzimle iaretli Anti-Ab konjugat
Substrat ilave edilir
Renk oluur


C) SERUMDA AG ARANIYORSA
(Competetive-Yarma)
Kat yzeyde Ab
4 pheli serum (Ag aranan klinik rnek)
4 Ve enzimle iaretli antijenin beraber konulduu,
Antijen rekabet (Competetive) yntemidir.
aretli antijen kat yzeye balanrsa,
4 Substratla da birleir
RENK OLUUR.
Bu sonu klinik rnekteki Agnin olmad bir
sonutur.
Fakat klinik rnekteki antijen kat faza balanrsa
4 Enzim olmadndan substratla reaksiyon olmaz.
RENK OLUMAZ.
Bu sonu klinik rnekteki Agnin olduunu
gsterir


D) spesifik antijen ve antikor yakalama
(immun capture)
Sklkla;
4 Enfeksiyoz etkene ynelik,
Spesifik IgM ve IgG saptama testidir

1)Spesifik Ag saptama
4 Kat faza poliklonal veya M.ablar konulur
4 Poli Abler,
M Ablere gre
Farkl Ag epitoplarn balad iin
gvenilirdir
2)Spesifik Ab (IgM) saptama


Kat faz formu
IgMin Fc blgesine kart anti-IgM Ab kat faza balanr
zerine hasta serumu (IgM?) konulur
zerine viral antijen
Enzimle iaretli antikor
Substrat
Konjugat faz formu
4 Kat fazda viral Ag
4 Hasta serumu (IgM?)
4 ENZMLE ARETL anti IgM Ab
(KONJUGAT)
4 Substrat

IV-WESTERN- BLOT
Viral lizat veya rekombinant antijenler Sodyum dodesilsulfat yardmyla
(SDS)
POLACRYLAMD JEL zemininde, molekl arlklarna gre
elektroforetik olarak ayrlr.
Polipeptit antijenler, ikinci bir elektroforez ile NTROSELLOZ
MEMRAN ERTLER ZERNE transfer edilir.
Hasta serumu ile erit zerindeki antijenler zel bir testte temas ettirilir
(elektroforetik yntem)
Hasta serumunda aranlan antikorlar varsa, erit zerindeki antijen bulunan
BANDLARDA RENK KOYULUU (KOYU-ZAYIF-RENKSZ)
oluur.
Kitin internal Pozitif ve Negatif kontrollerindeki band renkleri
deerlendirmede nemlidir.
Ve band iin, HANG ANTJEN VARSA REAKTF kabul edilir.
eritlerin zerindeki bandlarn pozitifliine gre o hasta iin, etkenin sonu
virulans patternlerine gre POZTF-NEGATF VEYA
SAPTANMAYAN sonu verilir.
4 Etkene zg IgM, IgG, IgA antikorlarna gre test yaplabilir.
4 HIV, H.pylori ve T.pallidum enfeksiyonlarnn tansnda
zgll yksek olarak kullanlmaktadr.


Western blot (WB)
III-HCRESEL MMUNTE LM
YNTEMLER

HCRESEL MMUNTEYE
YNELK TEST YNTEMLER
4 K BALIK ALTINDA NCELENR
A) NVTRO TEST YNTEMLER
B) NVVO TEST YNTEMLER
A)NVTRO TEST YNTEMLER

1)LKOST SAYIM VE FENOTPLEMES
LKOST SAYIMI
4 Mikroskopik yntemlerle
Hemositometrik hcre saym
Ik mikroskobu (40lk)
Thoma ve Neabaur lamlar
%0.4lk tripan mavisi
Rutinde Pek kullanlmyor
4 Gelimi immuno hemotolojik cihazlar
En uygun yntemdir
Piyasada farkl firma cihazlar var


LKOST FENOTPLEMES
4 Vcudun deiik blgelerinde
Kemik ilii, kan, dalak ve lenf nodllerinde
Lkositlerin say ve tipleri
Lenfositlerin
+ B lenfositleri
+ T lenfositleri
+ T4 ve T8
Monositlerin
Granlositlerin
+ Ntrofiller
+ Bazofiller
+ Eozinofiller
+ mmuno hematolojik cihazlar,
+ Flowsitometrik cihazlarla

4 Hcre yzey molekllerinin (Marker) fenotiplemesi
CD (cluster of differntiation farkllama kmeleri)
antijenleri
Hematopoetik hcrelerin yzeyinde yer alrlar
250ye yakn CD tanmlanmtr
rnein CD4 T, CD8 T, CD45 B lenfosit gibi
Lkositlerin yzeyindeki CD antijenik epitoplar
Monoklonal antikorlarn (MAbs)
+ Fluoresan boyalar
+ Enzimlerle konjuge edilerek
+ Fluoresan mikroskobuyla
+ Flow sitometri cihazlaryla( EN SIK)
* Kantitatif analizi ve
* Hcre ayrm ve tanmlamas yaplr
FLOWSTOMETR
ALIMA PRENSB;
Fluoresanlanm (FITC ile) M Ab ile iaretlenmi
hcreler
Sv bir ortamda sra halinde uyarc ktan (Argon
lazer) 488nmde geirilirler
4 Uyarc
Hcreler krarlar veya
Florokromla iaretlenmi m Ablerin baland hcre
tarafndan emilir ve yaylr
Bu yaylan n iddetini ve niteliini alglayan dedektrler
bilgisayara aktarrlar
Buna gre;
Hcrenin tipi ve says belirlenir


1den 10a kadar renk
eklenebilir ve bu say
artmaktadr
KLNK KULLANIMI
4 Lkosit fenotiplemesi (EN SIK)
Konjenital veya kazanlm immun yetersizlik tans (en sk
AIDS)
HIV pozitifliinde prognoz deerlendirilmesi
mmun yetersiz hastalarda immuniteyi yada kemoterapi
monitrizasyonu
KT yaplan hastalarda yeni immun durumun takibi
4 Tmr hcre fenotiplemesi
4 Lsemi ve lenfoma tan ve snflamas
4 B lenfositlerinde klonal tayini ve lenfoma ve lsemi ayrmnda
Hcre ii antijenlerin (myeloperoksidaz miktar) tayini
4 Hematopoetik hcrelerin (CD4)
Hematopoetik olmayan
Tmrler ve hcrelerden ayrt edilmesi


DNA analizi
4 Anploidi tayini
4 Hcre siklsu kinetiinin belirlenmesi
Apoptozis
Ntrofil fonksiyon analizleri
4 O2nin oluumunun tayini ile;
Granulomatoz hastalk tayini
Dier kullanm alanlar
4 Retiklosit saym
4 Transplant hastalarnda Cross-Match
4 Sitogenetik

ENFEKSYON HASTALIKLARINDA
4 Mikroorganizma- hedef hcre ilikisi;
Apoptozisin incelenmesi
HIV ile enfekte kiilerde
Monunkleer hcrelerinde apoptosis oranlar
+ CD8 T ve
+ CD19 B hcrelerinde en sktr
Konak hcreye ait proteinlerdeki deiimler
EBV ile enfekte B lenfositlerinde;
BCR2 ekpresyonu
HIV ile enfekte T lenfositlerinde;
CD4 ekpresyonu
CMV ile fibroblastlarda;
MHC I ekpresyonu

Mikroorganizmann hcreye balanmasnn incelenebilmesi
EBVnin
B lenfositlerine
Epitel hcrelerine
+ CR2 reseptrne
Poliovirus
MNH CD14 reseptrlerinde
Kzamk virusu
Hedef hcrelerin CD46 reseptrnde
Hcre ii ve yzeyi mikroorganizma antijenlerini inceleme
VZV ile enfekte hcre yzeyinde
gp1
HIV ile enfekte CD4 T lenfositlerinde
gp 160/120
nfluenzae ile enfekte hcrelerde
HA antijenileri




4 Klinik virolojide kullanlmaktadr
Enfekte kiilerin hcrelerinden
Virusle enfekte olanlar sratle belirler
CMV ile enfekte MNHler kantitatif olarak
HIV seropozitif kiilerde
+ MNH lerde kantitatif Ag tayini
+ Bylelikle;
*Antiviral tedavinin izlemi
4 Spesifik antikor tayini
CMV, HSV, HIV gibi viruslara
H. pylori gibi bakterilere
T.gondii gibi parazitlere kar
Gelien spesifik Abler llebilir

2-LENFOST SAYIMI VE AKTVASYON TESTLER
a) Lenfosit izolasyonu
Dansite- Gradient Santrifj Yntemi
4 Kan hcre gruplar birbirinden farkl dansite zelliine
sahiptir
3 ml ficol-isopak (Dansite 1077 gr/lt) konur
3 ml heparinli periferik kan konur
1500 devirde, 45 dakika santrifj edilir
Lenfositler orta tabakada younlarlar
En altta eritrosit ve granlositler
Dansiteleri 1077 den fazla
En stte buff-coat toplanr
Dansiteleri 1077den dk
Buff- Coatdan
+ Trombositler (santrifj)
+ Monositler petri kabnda tutularak uzaklatrlr
b) Lenfosit ayrm
T lenfosit ayrm
4 Rozet testi
Koyun eritrositlerine kar CD2
reseptr vardr
Periferik kanda E-Rozet yapan
%65-70 T lenfosit vardr
B lenfositi E-Rozet yapmaz
B lenfosit ayrm
4 Direkt immun fluoresan yntemi
Fluoresanlanm (FITC) anti- Ig Ab ile yaplr
Toplam lenfositlerin %20-25i B lenfositleridir
Periferik kandaki
4 T ve B lenfosit orann saptamak
mmun yetmezlik hastalklarnn tansnda
Lenfosit lsemi ve lenfomadaki lenfosit
tipinin tayininde
Otoimmun hastalklar ve kanserli olgularda
hcresel immun yantn deerlendirilmesinde
kullanlr

NK sitotoksisite lm
4 Antikora baml hcresel sitotoksisite lm
CR 51 ile iaretlenmi ve ykanm hedef
hcrelere
Anti- hedef hcre Ig G ile
FcR bulunan effektr hcreler (NK, makrofajlar)
eklenir
Hedef hcrelerden CR 51 salnr
Gamma sayacnda CR 51 llr
CR 51 miktar,
NK hcre say ve aktivite dzeyi ile
doru orantldr
c) Lenfosit Aktivasyon testleri(LAT)
Lenfosit uyarm
4 Otoimmunite
4 Kanser patogenezinde
4 ntraseller enfeksiyonlarda
Hcresel immun yantn lmnde uygulanmaktadr
Genelde T hcre bazen B hcre yant deerlendirilir
Aktive olan T hcreleri
4 Morfolojik ve fenotipik deiiklie urarlar
Bykl deiir
Histolojik boyamada kromatik deiiklik
Dinlenme halinde olmayan
Ancak; aktive olduunda ortaya kan yzey
proteinleri meydana gelir
LAT;
4 Hasta lenfositlerinin
zgl antijenle
Veya zgl olmayan antijenlerle
nvitro uyarlmasna dayanr
4 ki tipi vardr
1)Yzey fenotipi (aktivasyon belirteleri)
deiikliklerini belirlemek
Aktivasyon belirteleri
Ya enflamasyon blgesinden direkt
hcrelerden
Ya da invitro uyarlan lenfositlerden aranr
FLOWSTOMETR ile belirlenir
2) Uyar sonras lenfositin proliferasyon yeteneini lmek
4 Lenfoblast transformasyon testi (LTT)
96 kuyucuklu plaklarda yaplr
T hcre uyaranlar olarak
Fitohemaglutin (PHA)
Konkovalin A (ConA)gibi lektinlerle
Sperantijenler gibi bakteriyel toksinlerle
B hcre uyaranlar olarak,
Sperantijenler
LPS kullanlr

LTT TESTNDE;
Antijen ve lenfositlerin 72 saat kltr yaplr
H timidin eklenir
H timidin oalan DNA yapsna girer
Radyoaktif veya fluoresan boya ile
DNA sentez hz ve miktar llr
Hasta ve kontrol karlatrmalar ile
yorumlanr

4 Kark lenfosit kltr
Alc ve verici kanndan ayrlan lenfositler
nvitro besiyerinde kartrlarak
Lenfosit kltr yaplr
Antijenik farkllk varsa
Biri dierini aktive eder
Blastik dnmle DNA miktar artar
+ DNA sentezinin kantitatif lm yaplr
Bazen verici lenfositleri
X nlar ile ileme sokulur
Blastik dnm olmaz
Alcnn lenfositleri uyarlr
Alcnn verilecek Dokuya kar reaksiyon llr
+ Buna tek ynl kark lenfosit kltr denir
+ Doku transplantasyonunda
* HLA- D (LD antijenleri) antijenleri saptanr
+ Sitolitik T hcre yantnn deerlendirilmesinde
4 Lenfositotoksik test
Test prosedr
HLA antijeni saptanacak total lenfositler veya CD 19 B lenfosit
Hangi HLAya ait olduu bilinen anti-serum
Kompleman
Tripan mavisi veya eozin boyas
Antijen + antikor birleir
Kompleman balanr
Lenfosit zar zedelenir
Boya lenfosit iine girer
Mikroskopta %50den fazla boyanan lenfosit miktar
+ Denenen lenfositleri, bilinen anti- HLA tipine ait olduunu
gsterir
+ Doku transplantasyonunda
* HLA A,B,C antijenlerin gstermede kullanlr



Sitokin sentezini belirleme testleri
4 Aktive T hcreler deiik sitokinler retirler
4 Enflamasyon blgesinden elde edilen T lenfositler
nvitro kltr yaplr
Total sitokin sentezini verir
ELISPOT (Enzimle iaretli immunspot)
Gama- IFN (Quantiferon) sentezleyen hcre says yzde olarak
belirlenir
ELISA ile TH1lerce sentezlenen gama IFN
(Quantiferon) miktar kantitatif olarak saptanr
Flowsitometrik yntemle
Tm farkl sitokin sentezleri llebilir
3- MONOST/MAKROFAJ TESTLER
M/M Hcreleri
Doal baklkta rol alrlar
4 Ve zgl bakl sitokinlerle koordine ederler
Spesifik patojenleri yok eden efektr hcrelerdir
Apoptosizde apoptotik hcreleri temizlerler
4 Bu hcreler doku rnekleri yada hcre sspansiyonlarndan
MAbs ile saptanrlar
4 Monositin en iyi belirlenmesi;
FLOWSTOMETRDE
Anti, CD14 mAbs ile olur
Ayrca CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64 gibi tadklar
reseptrlerle tanmlanmalar yaplr
4 Histokimyasal boyama olarak
Non spesifik esteraz Boyamas
Monositer lsemi tansnda kullanlr
MAKROFAJ GN NLENM TEST
Duyarl lenfosit ile antijen temas sonucu
4 Salglanan MIF (Makrofaj gn nleyen faktr)
Saptama testidir
4 Kapiller tpte
Lenfosit
zgn antijen varsa MIF pozitiftir
MIF TESTNN POZTFL
O antijene kar hcresel
immun yant gsterir

4-NTROFL FONKSYON TESTLER
Polimorf nveli ntrofiller (PMN)
4 Doal immunitenin efektr (fagositik) hcreleridirler
4 Enflamasyon blgesine ilk gelen hcrelerdir
4 PMN yetersizlii
Ya PMN saysal azl
Yada PMN fonksiyon bozukluu eklinde olabilir
Bakteriyel enfeksiyonlara yatknlk salar
Yetersizlik lm testleri;
a) Ntrofil saysal deerlendirmesi testleri
b) Ntrofil adhezyon deerlendirme testleri
c) Kemotaksi deerlendirme testleri
d) Opsonizasyon deerlendirme testleri
e) Fagositoz yapmay saptama testleri
f) Oksidatif patlama ve degranlasyon deerlendirmesi
g) Bakteriyel ldrmeyi deerlendirme testleri
olarak snflandrlr
a)Ntrofil says
Ntropeni
4 500/ml kanda olmas
4 Kemik ilii, malignite, otoimmunite ve kemoterapiye
bal geliir
Mikroskobik boyama yntemleri
Gelimi hematoloji ve immuno
hemotoloji cihazlaryla saptanr
FLOWSTOMETR

b) Kemotaksi(KT) testleri
Ntrofillerin
4 Enflamasyon blgesine hareketine (migrasyonu) KT denir
Bakteri rnleri (endotoksin, hcre duvar yaplar, bakteri enzimleri)
Konak faktrleri (C3a ve C5a, LTB4) rol oynar
Bu kemotaktik molekllere yantszlk;
Defektif migrasyon (g) yant ile sonulanr
4 Defektif g saptamada
BOYDEN odack testi kullanlr
Filtre zerinde;
Kemotaktik madde
Ntrofillerle yaplr
Petride agaroz jelde;
Kemotaktik maddeler
Ntrofillerle yaplr
4 Kemotaksi testleri
dyopatik immun yetersizlik hastalklarnn tansnda kullanlr
c) Ntrofil adhezyonu
NTROFLLERN
Endotele adhezyonu ve enflamasyon blgesine g
4 L-selectin ve ntegrinle salanr
4 Bu iki adezindeki yetersizlie
Lkosit adhezyonu yetersizlii (LAY) denir
Bu durumda;
Ntrofil enflamasyon blgesine ulaamaz
Bakteriyel enfeksiyon yaylr
Abse olumaz
LAY hastalarnda
4 CD11a/CD 18a LFA-1 (lenfosit fonksiyon antijen-1) lkosit
integrini yoktur
4 Mabslerle FLOWSTOMETR ile belirlenir
d) Opsonizasyon testleri
OPSONN
Mikroorganizmalarn fagositlere balanmasn
salayarak fagositozu kolaylatran molekllere denir
4 IgG1,3 ve IgM, C3b ve iC3bdir
4 Opsoninler iin
Ntrofillerde
FcR III (IgG ve IgM)
CR1 ve CR3 (C3b ve iC3b)
Makrofajlarda
FcR I,II,III (IgG ve IgM) reseptrleri bulunur
OPSONOSTOFAJK TEST
4 I-tpe
Norm serum + norm lk + kukulu bakteri
4 II-tpe
mmun (hasta) serum + norm lk + kukulu bakteri
37Cde 20 dakika inkbasyon
Her iki tpden ayr preparat hazrlanr
May Grunwald Giemsa boyama
Lkositlerin iine girmi bakteri saylr
Normal serumda ve immun serumda
Ayr saylan bakterilerin toplam
Saylan lkosit saysna blnr
Bir lkosite den bakteri says bulunur
+ Buna fagositoz endeksi (FE) denir
4 S/NS oran OPSONK ENDEKSni verir
Orann bykl Sdeki Ab titresi ile orantldr
ERTROST AMBOSEPTR-KOMPLEMAN(EAC) TEST
4 Kompleman C3b parasna kar
Ntrofillerde bulunan reseptrlerin belirlenme testine
denir
4 Koyun eritrositleri
zgl antikorlar ile birleir
Kompleman balarlar
Hemoliz oluur
Kompleman C5 paras eksik olarak deneye sokulursa
E+Ab/C kompleksi
+ C3b reseptrl ntrofillerle rozet yaparlar
e) Fagositoz
Mikrobiyal ldrmenin ilk basamadr
Antikor ve komplemanla opsonize mikroorganizmann
4 PMN ve makrofajlarla temasndan sonra
eriye alnma ilemidir
Fagositoz testleri
4 Opsonize partikller ile
4 Ntrofillerin inkbasyonu sonucu
Mikroskopta partiklleri iine alan
Ntrofiller grlr
4 Opsonize olmu
Ancak hcre iine alnmam partikller
Asit muamelesi ile uzaklatrlrlar
Fluoresan veya radyoaktif madde ile iaretlenirler
Direkt saymlar yaplr
f) Oksidatif patlama ve degranlasyonun deerlendirilmesi
I- Oksidatif patlamaya ynelik
Ntrofillerin fonksiyonun deerlendirilmesinde
4 En sk uygulanan test
Speroksit sentez yeteneinin deerlendirilmesidir
Kronik granlomatz hastaln taramasnda
4 Bu deerlendirme kullanlr
NK;
Bu hastalk fagositoz defekti sonucu geliir
Ntrofil iinde NADPH (nikotin amid adenin di nkleotid
fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz enzimdeki bozukluktur
Drt test yntemi kullanlr
1)NBT (Nitroblue tetrazolium test)
Testin prensibi
4 NBT in redksiyonuna dayanan bir testtir
Redkte olduunda sar renkten koyu mora
dnr
4 Ntrofiller;
NBT iinde 37 C de 15 dakika tutulur
NBT, ntrofil iine alnr
Pyridine ile ekstrakte edilir
515 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur
Veya mikroskopta boyanarak grlebilir


Testin deerlendirilmesi
4 Ntrofiller iinde speroksit ve H
2
O
2

oluur
4 Bunlarn redktan etkisiyle
NBT redkte olur (renk deiir)
ldrme ilemi olduunu
gsterir

Lkositlerin mikroorganizmalar ldrme
ilemi bozuk olan hastalklarda
4 Kronik granlamatz hastalk
4 Chediak- Higashi sendromu
4 Myeloperoksidaz yetmezlii olanlar
4 Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz eksiklii
olanlarda
4 Akut lsemi
4 Down sendromu
4 Akut enfeksiyonu olanlarda
NBT negatiftir

2)Sitokrom b llmesi
Fagositlerde bulunan;
4 Oksidaz enziminin paras olan sitokrom b nin
mmunolojik cihazlar
Ve biokimyasal yntemlerle llmesidir

3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yntemi
Bu test H
2
O
2
oluumunu ler
Kronik granlomatoz hastaln tansnda kesin sonu verir

4)Kemlimunisansa Dayal immuno hematolojik cihazlar
H
2
O
2
, O
-
, O
2
radikallerini lmeye dayanr

II- Degranlasyona dayal testler
Degranlasyon
4 Fagozom ve lizozomlarn fzyonu sonucunda
Fagolizozomun iine lizozom ieriinin
boalmasdr
ELISA yntemiyle
4 Lizozom ieriinin
Asid hidroloz
Lizozim
Laktoferrin
Katyonik proteinlerin lm yaplr
III- Mikrobik ldrme
Mikrobisidal test
4 Hasta ve kontrol grubundan ntrofiller alnr
4 Hastalardan izole edilen bakteri ve mantar ile
kltr yaplr
Bir gece beklenir
Ertesi gn yaayan bakteri veya mantar
yoksa mikrobik ldrme tamdr
B)NVVO TEST YNTEMLER
DER TESTLER;
Ge ar duyarllk reaksiyonunu lerek
4 Hcresel bak yantn deerlendirmesini
4 Belirli bir patojeni veya temas antijenini tanyan bellekli T lenf
varln saptar
4 Test pozitiflii ancak klinik ykyle anlamldr
En sk uygulanan model
4 ntraseller bakteri enfeksiyonlarnda
4 Tberklin deri testi olarak
Old tberklin(OT)
1890 ylnda R.Koch buldu
PPD( purified protein derivide) uygulanr
Saybert ve Glen 1941 ylnda tanmladlar
PPD-s olarak standardize edildi
1-T : 0.00002 mgr PPD-s ierir
M.tuberculosis enfeksiyonlarnn tansnda kullanlr



AYRICA;
4 Blastomisin (blastomikoz)
4 Histoplazmin (histoplazmoz)
4 Brucellin (bruselloz)
4 Frei testi (LGV)
4 Toksoplazmin (toksoplazmoz)
4 Ekinokokkin(ekinokokkoz)
Deri testleride kullanlr
Bunlarn dnda;
4 Kontak duyarllnda ila, metal, bitkisel maddelere kar
Dermatit tansnda panel antijenler kullanlr
4 Prausnitz-Kstner (PK) reaksiyonu
Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin
Dier bir kiinin deri iine verilmesiyle
Anafilaksinin pasif transferi gsterilir
TBERKLN DER TEST
PPD;
Montoux deri ii uygulamas ile yaplr
4 5 T U (0.1ml) n kol i yzeyinin deri iine
4 48 -72 saat sonra endurasyon deerlendirilir
Endurasyonu (Sertlii);
10 mm olan,
BCG olmam ocuk ve yetikinlerde
Pozitiflii gsterir
15 mm olan
BCGli ocuklarda pozitiflii gsterir
5-10 mm aras
BCG alanmasna
Atipiklerle apraz reaksiyona
Anerjiye bal olarak grlr
Pozitif deri testinin anlaml olmas iin;
4 Klinik belirtilerden nce negatif daha sonra pozitif olmas
gerekir
Tuberculin
PPD
2 - 3 gn sonra
Cilt zerinde ilik llr.
Deri testinde teknik hatalar
Uygunsuz antijen konsantrasyonu
Enjeksiyonun cildin derinine yaplmas
Subjektif deerlendirme
Test yerine dsal mdahaleler
Booster olay geliebilir
4 Yala
4 BCG alamas
4 M.tuberculosis ve atipiklere kar oluan ar duyarllk
Booster artrr

IV- MMUNO GENETK YNTEMLER
Nkleik asit teknolojisine (NAT) dayal test
yntemleri
4 Klinik immunoloji laboratuvarnda daha yenidirler
Konvansiyonel yntemlerin yerini ne kadar
alacaklar zamanla grlecektir
4 ANCAK;
Enfeksiyon hastalklarnn tanmnda
Etkenlere ynelik DNA ve RNA saptanmas
Sklkla yer almaktadr
NATa dayal test yntemleri

1)Hibridizasyon (birleme)
2)Amplifikasyon (oaltma)
balklar altnda incelenir
1)HBRDZASYON
Bir DNA molekl
4 Kompementerlik (birbirinin tamamlaycs)
zelliindedir
4 Is ya eitli kimyasal maddelerle ayrlabilen
4 Uygun s, tuz konsantrasyonu, PHda yeniden
birleebilen
ki sarmal zincire sahiptir
te tan amacyla nkleik asitlerin aratrlmas
4 Molekln bu zelliklerine dayanmaktadr
YNTEMN PRENSB
Klinik rnekte varsaylan etkenin nkleik asidi s ve
kimyasal maddelerle iki zincire ayrlr
Bu zincirlerin varl PROB ad verilen iaretli DNA ve
RNA parasyla gsterilmektedir
PROB ad verilen reaktiflerin iaretlenmesinde
4 Flurokrom
4 Enzim
4 Kemlminesan madde
4 Radyoizotop kullanlmaktadr
PROBLAR
4 Hedef nkleik asitlerin belirli blgelerine komplementerdir
4 50 bpden kktrler
HBRDZASYON TEKNKLER

a)Sv faz hibridizasyonu
Sv ortamda prob ve hedef nkleik asit serbesttir
4 DNA/DNA
4 DNA/RNA
b)Kat faz hibridizasyonu
I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yntemi
Nitro selloz ve Naylon gibi porlu yzeylerde
yaplr
Southern blot
4 DNAlar;
Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membran
kada aktarlr
Restriksiyon enzimleri ile klinik rnek temas ettirilir
4 DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz)
4 Nokta mutasyonlar, delesyonlar ve translokasyon sonucu
farkllklarn saptanmasyla hematolojik malignitelerin zelliklerinin
belirlenmesinde kullanlr
Burkitt lenfoma, Folikler lenfoma
Kronik myeloid lsemi
Philadelphia kromozomu
AYRICA;
B hcre lenfomalarnda
B hcre klonizitesinin incelenmesinde
T hcre lenfomasnda
T hcre klonizitesinin incelenmesinde
4 Nkleik asit boyutlar konusunda yardmc olur
Northern blot
4 RNAlar,
Nitroseluloz katlara aktarlr
mRNA /cDNA-cRNA hibridlemesinde
32p-Biotin/AP iaretlemesi
kullanlr
Dot blot
4 DNAlar nitroselloz katlarda
4 DNA/DNA
32 p-Biotin/AP iaretlemesi kullanlr


II-MKROARRAY
Porsuz yzeyleriyle plastik, cam ve silikon kullanlr
Klinik rnekten
4 Nkleik asidin prifikasyonu
4 Amplifikasyonu
4 Hibridizasyonu
4 Tespiti
25- 75 mmlik slaytlarda yaplmaktadr
Uygulama alanlar
4 Antimikrobiyal ila kefi ve gelitirilmesi ile a almalar
4 Kanserlerin snflandrmas ve derecelendirmesinde
4 Mikroorganizmalarn tespit, tan tiplendirme ve ila
direncinde
4 Konak baklk sistemindeki polimorfizmler

c) n Situ Hibridizasyon
Doku yada hcrelerdeki;
4 Nkleik asitleri saptar
DNA/DNA hibridlemesinde;
4 Biotin/AP iaretlemesi kullanlr
16S/23S r-RNAlar hedefleyen
4 Fluorokromla iaretleme olur
FISH (flouresan inn situ hibridizasyon
yntemi)
FISH yntemiyle;
Belirli genlerin;
4 Kromosomal lokalizasyonunu haritalamak
4 Veya kromozomal bozukluklarnn saptanmasnda
kullanlr
Klinik Mikrobiyolojide;
4 16 S ve 23 S r RNA hedeflenmesiyle patojen bakterilerin
Filogenetik analizleri
Tr, cins, aile, filum
4 Patojen bakterilerin diret tespiti ve identifikasyonu
4 evredeki ekosistemlerde ve kark enfeksiyonlarda
Mikrobiyal hcreleri ayrmada
4 Yava reyen, kltr zor bakterilerin
Legionella, Bordetella, Mycobacterium, Brucella vb hzl tan
ve identifikasyonunda kullanlr

2)NKLEK AST AMPLFKASYONU
(OALTMA)(NAA)

NAA yntemleri
a) Hedef Amplifikasyon Sistemleri
b) Sinyal Amplifikasyon Sistemleri
ad altnda incelenmektedir
a) Hedef Amplifikasyon Sistemleri

ncelenecek rnekteki az sayda hedef
molekln (DNA, RNA)
4 nvitro enzimatik replikasyon
yntemleriyle
Saptanabilecek dzeylere
karlmasdr
Yntemler
PCR
4 Klinik rnekte DNA aranyorsa
4 adet deoksinkleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
zgl oligonkleotik primerleri (15-30 bazlk)
Isya dayankl Tag polimeraz enzimi
94 Cde (denatrasyon)
54 Cde (balama)
72 Cde (Genileme)
Bu ilem 25-30 kez yaplr
Southern hibridizasyonla tanmlama yaplr
4 Klinik rnekte RNA aranyorsa
RNAnn elde edilmesinden sonra
Revers-Transkriptaz uygulanarak
cDNAya evrilir
Daha sonra cDNA amplifiye edilir
4 Deiik PCR tipleri
Arbitrarily primer PCR(APP)
Multiplex PCR(MP)
Nested PCR(NP)
RT-PCR(RTP)
Kantitatif PCR(KP)
Real time PCR(RTP)
En gelimi sistem
oaltma ve tanmlama ayn anda ve tpte
4 PCR IN KULLANIM ALANLARI
ZELLKLE;
Enfeksiyz mikroorganizmalarn
Saptanmas
dentifikasyonu
Kantitasyonu
Alt tip deerlendirmesi
Bakterilerde antibiyotik direnci
Enterokoklarda vankomisin direnci
(Van A,B,C)
S.aureusda mecA geni
Epidemiyolojik tiplendirmede (ayn kkenin iki tipi)
Enfekte hastalarn antimikrobiyal tedavisini izlemede
nsan ve kanser genotipi incelemelerinde
DNA yapsndaki mutasyonlar
Gen tayini ve dizilimi saptamas
Gen ve genetik polimorfizmi saptama
Transkriptlerin zellikleri ve miktar saptanmas
Genetik manplasyonun saptanmas

GENEL OLARAK;

PCR
4 Klinik ve Adli tp, mmunoloji, Mikrobiyoloji
4 Epidemiyoloji, Fizyoloji, la ve a almalar
4 Veterinerlik, Ziraat ve tarm, Zooloji
alanlarnda kullanlmaktadr
LCR(Ligaz Zincir Reaksiyonu)
SDA(Strant Displacement Amp-Zincir Yer Deitirme)

Transkripsiyon temelli Amplifikasyon
teknikleri

4 Hedef moleklleri RNAdr
TAS( Transcription based Amp)
TMA(Transcription mediated Amp)
NASBA (Nkleik Asid Sequence based Amp)
Northern blot ile tanmlama yaplr
b)Sinyal (Prob) Amplifikasyon sistemleri(SAS)
Hedef Amplifikasyon tekniinin aksine
Bu sistemde
4 Amplifiye edilen ve saptananlar
Problar veya
Hedef dizilime zgl b-DNA (branced DNA)
Hedef DNA
bDNA probu ile hibridize edilir
Bu proba zgn
+ Alkali fosfatazla iaretli ek problar eklenir
Substrat eklenir
Luminimetrede okunur
HBV, HCV, HIV-1 tayininde kullanlr


SAS ta Yntemler olarak
4 Direkt hibridizasyon yntemi;
Hibrid capture
CMV, HBV, HPV
4 CPT (dng prob teknolojisi)
MRSAda Mec A geni
M.tuberculosiste gen dizilimleri
VRE lerde VanA, Van B
4 RCA (Rolling Circle Amp)
Tek nkleotid polymorfizm
Allellik ayrmnda kullanlr
V-MAJOR HSTOCOMPATIBILITY COMPLEX
(MHC) GEN BLGESNE YNELK TESTLER
MHC ve RNLER
4 nsan 6. kromozom ksa kolunda yer alrlar
4 gen blgesine sahiptirler
MHC Snf I gen blgesi
HLA-A,B,C,E,F,G antijenleri
MHC Snf II gen blgesi
HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleri
MHC Snf III gen blgesi
Hsp, TNF, C4A,C4B, C2, Bf
4 HLA moleklleri
Glikoprotein yapsndadrlar
Transmembranz yapda bulunurlar
Yksek polimorfizm (bireyden bireye) gsterirler
HLA-I;
En fazla lenfosit, lkosit olmak zere
Tm ekirdekli somatik hcrelerin ounda,
Eritrositler hari
HLA-II ise;
Snr olup APC (dendritik hcre, makrofaj)
B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri,
Endotel, bbrek glomerl hcrelerde bulunur
HLA Doku tipi tayinindeki amalar
Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu
Adli tpta
4 Babalk tayininde
4 Kimlik tanmlamasnda
Baz otoimmun hastalklarn tansnda
4 HLA-B 27 ile ankilozan spondilit
4 HLA-B 51 ile behet hastal
HLA Doku Tipi Tayin Yntemleri
grup altnda yaplmaktadr
1)Antikor Temelli Yntemler
2)DNA Temelli Yntemler
3)Hcre Temelli Yntemler
1)Antikor Temelli (Serolojik)Yntemler

a) Mikrolenfositotoksisite yntemi
Hcre yzeyindeki HLA-I zellikle ve HLA-II antijenik
saptamada
Terasaki plaklarnda yaplr
4 Hangi HLA antijene zgl olduu bilinen bak serum
4 ukurcua antijen tipi tayin edilecek lenfositler
4 Kompleman konur
4 nhibitr olarak eozin boya maddesi eklenir
Ag ve Ab birleirse
Kompleman balanr
Lenfosit zar tahrip olur
Boya ieriye girer
DEERLENDRMEDE;
4 Kuyucuktaki lenfositlerin ounun boyanm olmas
O lenfositlerin zgl antikora zgl antijen olduklarn gsterir

b) Sandwich ELISA yntemi
HLA-1 ve zellikle HLA-2 antikor tayini iin
yaplr
4 Plaklarda solid fazda bilinen HLA antijeni
4 zerine hasta serumu (aranan ab)
4 Konjugat
4 Substrat

c)Lenfosit Cross-Match Yntemi
Doku- organ alcsnda vericinin HLA antijenlerine kar
antikor olup olmadn saptamak iin
4 zel plaklarda ukurlara alcnn serumuna
4 Vericinin lenfositleri ilave edilir
4 Kompleman ilave edilir
4 Eozin boyama(indikatr)
Alcnn serumunda Ab varsa
Lenfositlerle birleir
Kompleman ikisine balanr
Lenfosit zar zarar grr
Boya lenfositlerin iine girer
DEERLENDRME;
4 Boya maddeleri lenfosit ukurcukta fazla ise
Hasta serumunda antikor vardr
2)DNA temelli yntemler
PCR yntemi
MHC gen blgesinde;
4 Sekansa spesifik Primerleri (SSP) kullanarak
HLA-I ve II tiplemesi yaplr
MHC gen blgesinde
4 Sekansa spesifik oligonkleotid (SSO) prob
hibridizasyonu ile
HLA-I ve II tayini
Her iki yntem sonras;
4 Restriction fragments lenght polymorfizm (RFLP)
Uygalanarak DNA paralara ayrlarak spesifik problarla
tanmlanr


Sekanslama (dizi analiz) temelli HLA
tiplemesi
4 PCR ile oaltlan HLA gen
segmentinin
4 SEKANS CHAZINDA, nkleotid
sekans (dizi analiz)yaplmaktadr


3) Hcre temelli yntemler
KARIIK LENFOST KLTR
(mixed lymhocyte culture-MLC)
4 HLA molekllerinin allograft
reddinde
Hedef molekl oluturmas
esasna dayanarak tespit edilir
4 HLA tiplemesinde kullanlr
(zellikle HLA-D alt tipleri)
4 BU AMALA;
Alc ve verici lenfositleri karlatrlarak
KARIIK LENFOST KLTR (Mixed lymhocyte
culture)
Kltrde HLAs bilinen uyarc lenfosit ile
Yant verecek ve HLAs bilinmeyen lenfosit
Kltr yaplr
+ Antijenik farkllk varsa
+ Uyar sonucunda yant veren hcrede
blastik dnmle mitoz olur
+ DNA yapmndaki art iaretli timidin ile
llr
+ DNA sentezi kantitatif olarak llr
+ Antijenik benzerlik varsa
+ Sre almayacaktr