METODE ODREIVANJA CERUPLAZMINA, HAPTOGLOBINA I

ALFA-1-ANTITRIPSINA

SEMINARSKI RAD

SADRAJ

1.

UVOD3

2.

RAZRADA 4

2.1. CERULOPLAZMIN

2.2. METODE ODREIVANJA CERULOPLAZMINA

2.2.1. Odreivanje bakra u serumu kolorimetrijski
2.2.2. Odreivanje bakra u mokrai

5
6

2.2.3. Odreivanje bakra u mokrai atomskom apsorpcijskom spektrofotometrijom

2.3. HAPTOGLOBIN
2.3.1.
2.4.

Odereivanje haptoglobina u serumu

ALFA 1 ANTITRIPSIN (AAT)

2.4.1.

Dijagnostiki postupak

3.

ZAKLJUAK

11

4.

LITERATURA

12

9
9

1. UVOD

Ceruloplazmin

je

reaktant

kasne

akutne

faze.

Znaajan

je protein koji

vee bakar u krvi, a ima i ulogu u metabolizmu eljeza. Sintetizira se u jetri. U krvi nosi oko
70% od ukupnog bakra, dok albumini nose oko 15%, a stalo se prenosi makroglobulinima. Za
odreivanje ceruloplazmina se uglavnom upotrebljavaju kolorimetrijske i metode atomske
apsorpcijske spektrofotometrije.

Haptoglobini (HAP, Hp) vezuje slobodan hemoglobin u serumu i predstavlja

reaktannt akutne faze. To je 2-glukoprotein koji se sastoji od dva para nejednakih lanaca koji
su vezani disulfidnim vezama. Primarna funkcija HAP se svodi na ireverzibilno vezivanje
slobodnog oksihemoglobina u plazmi, koje se javlja izmeu HAP i -lanca globinskih
dijelova hemoglobina A, F, S ili C. Moe se odrediti radijalnom imunodifuzijom, ali se vie
koristi nefelometrijska metoda. Takoer se moe odrediti i metodom mjerenja kapaciteta da
vee hemoglobin.

Alfa 1-antitripsin pripada skupini visokopolimorfnih proteina s vie od 75 razliitih

genetskih varijanti. Jedan od glavnih proteina plazme, jer na njega otpada gotovo 90% alfa
globulinske frakcije. Dijagnostiki postupak se kod AAT-a sastoji od klinike,
laboratorijske,radioloke i histoloke procjene.

2.RAZRADA

2.1. CERULOPLAZMIN
Ceruloplazmin je reaktant kasne akutne faze, glavni je protein plazme koji sadri bakar. On je
2-glukoprotein sa jednim polipeptidnim lancem koji sadri 6-7 atoma bakra po molekuli.
Zbog svog sadraja bakra ist protein ima plavu boju, te otuda i potie ime.
Njegova glavna funkcija je da slui kao enzim.
U serumu se koncentracija bakra i ceruloplazmina mijenja s dobi.

Referentne vrijednosti za odrasle iznose 11 do 23,5 mol/L seruma. Sline su

koncentracije u eritrocitima i punoj krvi. Urinom se izluuje dnevno 0,3 do 1,25
mol/24h.

Poviena koncentracija bakra u serumu nalazi se u akutnim i hroninim bolestima

jetre. Odreivanje serumskog bakra je najvanije u dijagnostici Wilsonove bolesti.

2.2. METODE ODREIVANJA CERULOPLAZMINA

Ceruloplazmin je protein koji sadri bakar i prema tome osjetljiv je na dejstvo svih faktora
koji utiu i na koncentraciju bakra u plazmi.
Bakar se odreuje pomou nekoliko grupa metoda. Postoje kolorimetrijske metode,
metode emisijske spektografije, atomske apsorpcijske sprektrofotometrije, sprektroskopije X
zrakama i metode neutronske aktivacije.
U rutini se uglavnom upotrebljavaju kolorimetrijske i metode atomske apsorpcijske
spektrofotometrije.
Kako je najvei dio bakra u serumu u ceruloplazminu, prije se mora osloboditi da bi
mogao reagirati s reagensima na bakar. Oslobaa se zakiseljavanjem i deproteinizacijom, a
zatim se izaziva reakcija s jednim od mnogobrojnih reagenasa
Budui da je bakar jako rairen, postoji opasnost od kontaminacije probe, reagencija i
stakla bakrom iz okoline. Zbog toga posebnu panju treba obratiti na pranje stakla, istou
hemikalija i vode te na uvjete pod kojima se uzima materijal za analizu.

Metode atomske apsorpcione spektrofotometrije manje su osjetljive za bakar nego za

neke druge oligoelemente, ali se mnogo upotrebljavaju zbog jednostavnosti i brzine.
Obino se za odreivanje atomskim apsorpcijskim spektrofotometrima serum
razrjeuje 1:5, iako ima metoda gdje se serum razrjeuje vodom 1:2 mol/L HCl.
Meutim, bolje su metode s deproteinizacijom, jer proteini zagauju plamenik aparata.
(voriec D., epelak I., 2009., )

2.2.1. Odreivanje bakra u serumu kolorimetrijski

Bakar stvara s oksalildihidrazidom kompleks koji nakon redukcije s acetaldehidom

u alkalnoj sredini daje crvenkasto-ljubiasti spoj:

Postupak :
U epruvete za centrifugiranje otpipetira se:

Serum ( 1,5), standard, redest.voda,

oksalildihidrazid(reag.2) (1,0). Promijea se i ostavi 10 minuta na sobnoj temperaturi.

Doda se : trikloroctena kiselina(reag.3) (1,5). Promijea se i ostavi 5 minuta na sobnoj
temperaturi, epruvete se prekriju parafilmom i jako centrifugiraju oko 15 minuta.
Pripreme se druge epruvete u koje se stavi citronske kiseline, te doda : supernatant
(2,0). Promuka se da se kristali otope i doda: amonijak (o,5) , acetaldehid(reag.6)
(0,5). Poto se doda amonijak i acetaldehid, svaki put se promuka. Ostavi se 30
minuta na sobnoj temp i onda fotometrira proba, standard i slijepa proba prema vodi
kod 542 nm u kiveti od 10 mm.
Referentne vrijednosti 11 do 23,5 mol/L
2.2.2. Odreivanje bakra u mokrai
Izluivanje bakra urinom varira tokom dana, pa se zato odreuje samo u 24-satnom
urinu.
5

Dnevna koliina urina sakupi se u istu bocu. Izmjeri se cjelokupna koliina urina i u
maloj posudici za isparavanje promijea sa 3 ml urina i 2 ml konc. HNO3 ili 2 ml konc.
H2SO4, te ispari do suha u digestoru.
Suhom ostatku doda se 1,0 ml konc. Perklorne kiseline i ponovo otpari do suha. Suhi
ostatak otopi se 3ml redest.vode, od toga se uzme 1,5ml te izvodi postupak kao i za serum.
Slijepa proba radi se tako da se 3,0ml redest.vode i 2,0 ml HNO3 ispari. Doda se
HclO4 i otpari, a zatim se doda 3,0 ml redest.vodei radi kao i kod seruma.

Referentne vfrijednosti 0,3 1,25 mol/L / dU ( 19-79 g/dU)

2.2.3. Odreivanje bakra u mokrai atomskom apsorpcijskom

spektrofotometrijom
Princip je isti kao kod seruma, samo se prvo vee bakar s helatnim reagensom,
kompleks ekstrahira i bakar odredi u koncentrovanom ekstraktu. (voriec D., epelak I.,
2009.)

2.2.HAPTOGLOBIN
Haptoglobini su serumski proteini koji se sintetizuju u jetri i ija je uloga uklanjanje
slobodnog plazma hemoglobina.
6

2.3.1. Odereivanje haptoglobina u serumu

Haptoglobin se moe odrediti radijalnom imunodifuzijom, ali se vie koristi

nefelometrijska metoda. Sva tri fenotipa reagiraju s antitijelima na tip 1-1. Fenotipovi se
mogu odrediti elektroforezom na krobnom gelu ili poliakrilamidu.
Haptoglobin se moe odrediti i metodom mjerenja kapaciteta da vee hemoglobin.
Kapacitet stvaranja kompleksa haptoglobin-hemoglobin odreuje se tako da se serumu
doda hemoglobin u suviku i nastali kompleks odredi na temelju pseudoperoksidativnog
svojstva hemoglobina, ili da se nastali kompleks odvoji od suvinog hemoglobina
elektroforetski ili gel-filtracijom. Na tom principu temelji se i metoda Ratcliffa i
Hardwicka.

Referentne vrijednosti 0,4-1,8 g/L.

2.4. ALFA 1 ANTITRIPSIN (AAT)

Alfa 1-antitripsin pripada skupini visokopolimorfnih proteina s vie od 75
razliitih genetskih varijanti. Reaktant je akutne faze sa antiproteaznom aktivnou, iji se

naslijeeni nedostatak dovodi u vezu sa oboljenjima plua i jetre. On je jedan od glavnih

proteina plazme, jer na njega otpada gotovo 90% alfa globulinske frakcije.
To je glukoprotein molekularne teine 54 kDa. Njegov proteinski dio je polipeptid
izgraen od 394 aminokiselinska ostatka, a eerna komponenta je izgraena od 3
oligosaharidna lanca, koji su preko asparagina povezani s aminokiselinama na pozicijama
46, 83, 247 i ine 15% molekularne mase.
Alfa 1-antitripsin se sintetizira u jetrenim stanicama koje ga u cirkulaciju lue oko
2 grama na dan. Dodatno se jo sintetizira u alveolarnim makrofagima i monocitima .
Osim u plazmi, alfa 1 antitripsin je naen i u drugim tkivnim tekuinama kao to su suze,
limfa, u i amnionska tekuina.( Topi E., Primorac D., Jankovi S, 2004.)

2.4.1. Dijagnostiki postupak

Dijagnostiki postupak se kod AAT-a sastoji od klinike, laboratorijske,radioloke
i histoloke procjene.
Razliiti oblici jetrenih bolesti mogu se dijagnosticirati kod nedostatka AAT-a:
neonatalni hepatitis; neonatalna kolestaza; akutni hepatitis; kronini hepatitis; ciroza jetre
sa svim svojim komplikacijama.
Laboratorijskom obradom moe se utvrditi sniena koncentracija serumskog alfa1-antitripsina, dok je u elektroforezi proteina smanjena frakcija alfa-1-globulina. Pored
ultrazvunog pregleda abdomena i ezofagogastroduodenoskopije (detekcija varikoziteta
jednjaka i/ili portalne hipertenzivne gastropatije), obavezna je radioloka i pulmoloka
obrada respiratornog sustava. I konano, biopsijom jetre verificira se specifian histoloki
nalaz: citoplazmatske inkluzije alfa-1-antitripsina u hepatocitima (PAS-pozitivne i na
dijastazu rezistentne inkluzije).
Ako je serumska koncentracija alfa-1-antitripsina sniena i/ili ako je klinika slika vrlo
sugestivna na nedostatak AAT-a, indicirano je izoelektrofokusiranje s ciljem utvrivanja
Pi-fenotipa

Referentne vrijednosti
8

Normalne vrijednosti ovog proteina u novoroenadi iznose 1,45-2,70 g/L.

Njegova koncentracija u ranom kolskom uzrastu je vea nego u zdravih odraslih osoba.
Srednja vrijednost AAT pada u prvih 6 mjeseci ivota, a onda ponovo raste u dvanaestom
mjesecu do vrijednosti odraslih.

Srednja vrijednost ovog proteina u serumu odraslih je 2,60 g/L; s varijacijama

od 1,90 g/L do 3,50 g/L. (Topi E., Primorac D., Jankovi S., 2004.)

3.

ZAKLJUAK

S obzirom na veliku ulogu koji ceruloplazmin, haptoglobin i alfa 1-antitripsin

imaju u ljudskom organizmu, vano je istaknuti potrebu brzog reagovanja u sluaju
odstupanja od referentnih vrijednosti ovih proteina.

Stoga je laboratorijska dijagnostika sa svojim metodama odreivanja ovih proteina bitna

karika u pravilnom dijagnosticiranju bolesti i lijeenju pacijenata. U pravilnoj terapiji bilo
kojeg pacijenta, neizostavan je pravilan laboratorijski nalaz koji e usmjeriti lijeenje
pacijenta u pravom smjeru.

Ukoliko dodje do odreenih simptoma koji bi ukazivali na odstupanje nekih od ovih

proteina kod pacijenata, veoma je bitno imati kvalitetan laboratorijski nalaz koji e
usmjeriti dalje lijeenje ka pozitivnom ishodu i konanom izljeenju.

4. LITERATURA

10

1. voriec D., epelak I. trausova Medicinska biokemija, Medicinska naklada, Zagreb

2009.
2. Topi E., Primorac D., Jankovi S. Medicinskobiokemijska dijagnostika u klinikoj praksi,
Medicinska naklada, Zagreb 2004.
3.http://scindeks.ceon.rs/article.aspx?query=ISSID%26and
%26812&page=7&sort=8&stype=0&backurl=%2Fissue.aspx%3Fissue%3D812
4. http://es.wikipedia.org/wiki/Alfa_1-antitripsina

11