SEMINARSKI RAD

IZOLACIJA RNK
 Izolacija RNK iz elijskih linija i tkiva,
neophodan je korak u izuavanju elijski
specifine genske ekspresije, mehanizama
koji reguliu gensku ekspresiju, kao i u svim
procedurama koje iziskuju pravljenje
komplementarne DNK (cDNK).
elija sisara sadri priblino, a najvei dio
ove RNK je lociran u citoplazmi
MOLEKULA RNK
 vie od 80% RNK je ribosomalna, 10% RNK
predstavljaju male RNK kakva je transportna
RNK (tRNK) i mala jedarna RNK .
iRNK sainjava samo 1-3% od totalne RNK.
iRNK je u eliji prisutna u formi nukleotidnih
nizova, ije su duine i sekvence razliite.
Zavisno od vrste i uloge same elije razliite
iRNK mogu biti asocirane sa polisomima,
neke od njih lokalizovane su u mikrosomima,
ali veina iRNK prisutna je kao slobodna u
citoplazmi
 Za izolaciju i rad sa intaktnom RNK najvanije je
eliminisati svaku potencijalnu mogunost za
dejstvo endogenih ili egzogenih RNaza.
Pridravanje odreenim pravilima moe pomoi u
eliminaciji prisustva i dejstva egzogenih RNaza.
1.) Koristiti sterilno plastino posue, koje ne
posjeduje RNaze (sa oznakom Rnase free).
2.) Koristiti nastavke za pipete, koji ne
posjeduju RNaze (sa oznakom Rnase free).
3.) Koristiti plastine rukavice, koje ne smiju biti
pokidane, jer su ruke potencijalni izvor RNaza.
4.) Kada god je to mogue koristiti rastvore koji
su autoklavirani i/ili pripremljeni sa
autoklaviranom dejonizovanom vodom.
 5.) Voda i rastvori koji ne sadre primarnu
amino grupu, kao i stakleno posue, mogu se
tretirati sa 0.1% rastvorom
dietilpirokarbonata (DEPC) preko noi.
6.) Uvijek koristiti vodu tretiranu sa DEPC
(DEPC-treated water), koja se kao takva
kupuje, a proces njenog fabrikog
spravljanja podrazumjeva dodavanje 0.1%
DEPC u vodu, lagano mukanje, inkubaciju
6h na sobnoj temperaturi i autoklaviranje 20
minuta.
 IZOLACIJA RNK POMOU
RNEASY MINI KITA
RNeasy Mini Kit namenjen je izolaciji totalne
RNK iz male koliine startnog materijala.
Predstavlja brzu i jednostavnu metodu za
izolaciju vie od 100 g totalne RNK iz
animalnih elija i tkiva, bakterija i kvasaca
(RNeasy Mini Kits), kao i iz biljnih elija i
tkiva i filamentoznih gljiva (Rneasy Plant
Mini Kits).
IZOLACIJA RNK POMOU
RNEASY MINI KITA
IZOLACIJA RNK POMOU
RNEASY MINI KITA
Ova metoda bazira se na selektivnom
vezivanju za silica-gel membranu.
Specijalizovani puferski sistem obezbjeuje
da se vie od 100 g RNK, due od 200 baza
vee za RNeasy silica-gel membranu. Pre
vezivanja za silica-gel membranu bioloki
uzorci moraju se lizirati i homogenizovati u
prisustvu pufera, koji sadri visoko
denaturiuu komponentu tzv. guanidin
izocijanat (GITC), koji ima ulogu u
inaktivaciji RNaza, kako bi se obezbijedila
izolacija intaktne RNK.
IZOLACIJA RNK POMOU
RNEASY MINI KITA
Nakon liziranja uzorak se prenosi na
QIAshredder homogenizer (specifian
ependorf), koji obezbjeuje homogenizaciju
uzorka, redukuje viskoznost lizata i eliminie
genomsku DNK. Zatim se na lizat dodaje
etanol, koji treba da obezbjedi uslove za
selektivno vezivanje RNK za RNeasy silica-gel
membranu. Nakon tretmana sa etanolom
lizat se prebacuje na RNeasy mini kolonu
(specifian ependorf, koji sadri RNeasy
silica-gel membranu).
IZOLACIJA RNK POMOU
RNEASY MINI KITA
Totalna RNK se vezuje (adsorbuje) za RNeasy
silica-gel membranu, dok se kontaminanti
spiraju sa membrane specifinim puferima.
Naposljetku se totalna RNK spira sa membrane
pomou 30-50 l RNase free vode.
Efikasno razaranje (liziranje) i
homogenizacija startnog materijala dva su
vana koraka u izolaciji totalne RNK.
Kompletno razaranje plazma membrane same
elije, kao i njenih organela neophodno je za
oslobaanje kompletne RNK iz uzorka.
IZOLACIJA RNK POMOU
RNEASY MINI KITA
Razliiti uzorci (biljni, ivotinjski i sl.)
zahtijevaju razliite metode za
obezbeivanje kompletnog razaranja.
Nekompletno razaranje rezultira u
znaajnom smanjenju totalne RNK izolovane
iz elija. Homogenizacija je neophodna za
redukciju viskoznosti elijskih lizata, koja se
poveava tokom procesa razaranja.
Homogenizacijom se eliminie genomska DNK
visoke molekulske mase, kao i druge elijske
komponente visoke molekulske mase, a sve u
cilju dobijanja homogenog lizata.
IZOLACIJA RNK POMOU
RNEASY MINI KITA
. Nekompletna homogenizacija dovodi do
smanjene efikasnosti RNK da se vee za
RNeasy silica-gel membranu, to takoe,
redukuje krajnju koliinu izolovane totalne
RNK
UVANJE I STABILIZACIJA STRANOG
MATERIJALA ZA IZOLACIJU RNK

RNK u tkivu nije zatiena nakon izolacije

tkiva ili elija, sve dok se uzorak ne tretira
sa RNK stabilizujuim reagensom . Uzorci se
uvaju uranjanjem u odgovarajuu koliinu
RNK stabilizujueg reagensa, ODMAH nakon
izolacije startnog materijala. Ovaj postupak
sprijeava svaku nepoeljnu promenu u
genskoj ekspresiji, RNK degradaciju, kao i
indukciju novih gena, tokom perioda uvanja
RNK.
UVANJE I STABILIZACIJA STRANOG
MATERIJALA ZA IZOLACIJU RNK
RNAlater RNA stabilization reagent ulazi u elije
difuzijom i uva elijsku RNK. Neposredno
nakon kontakta sa materijalom RNAlater
difunduje u individualne elije. Kako bi se
osigurala brza i pouzdana stabilizacija RNK uzorak
mora biti izrezan na delove koji nisu vei od 0.5
cm. elije saene u petri ploi mogu se uvati u
RNAlater-u, tako to se u petri plou na koju su
elije zalepljene dodaje odreena koliina (3-5 ml
RNAlater-a), petri ploa se zatvori i oblijepi
parafilmom. Uzorci tretirani RNAlater-om stabilni
su:
UVANJE I STABILIZACIJA STRANOG
MATERIJALA ZA IZOLACIJU RNK
Uzorci tretirani RNAlater-om stabilni su:
1 dan na 37C
7 dana na 18-25C
4 nedjelje na 2-8C (u friideru)
Neogranieno dugo na -20C ili -70C
Uzorci elija, iz kojih e se izolovati RNK,
takoe, se mogu uvati bez dodatka RNA
later-a na -70 u specijalnim zamrzivaima ili
u tenom azotu. To mogu biti ependorfi u
kojima se nalaze elije, petri ploe sa
zalepljenim elijama i sl.
LITERATURA
http://www2.dbe.pmf.uns.ac.rs/PDF/fiziolog
ija/Izolacija%20RNK.pdf
vob, T. i sradnici: Osnovi ope i humane
genetike, kolska knjiga, Zagreb, 1990.
Prentis S: Biotehnologija, kolska knjiga,
Zagreb, 1991.