FAKULTET ZDRAVSTVENIH STUDIJA

Mentor: Mr.sci.dr. Marina Deli-arac

Student: Mei Aida

SARAJEVO
LABORATORIJSKE TEHNOLOGIJE

Protona citometrija

Protona citometrija je savremena i sofisticirana tehnologija kojom se mjere fizikalne i

hemijske osobine biolokih estica i stanica tokom njihovog prolaska kroz mjerni ureaj u
struji tekuine. Omoguava fenotipske i funkcijske analize
elija periferne krvi,
kotane sri,
cerebrospinalnog likvora i drugog humanog materijala.
Od fenotipskih analiza izdvajaju se imunofenotipizacija leukocita periferne krvi u cilju ocjene
imunolokog statusa pacijenata koji boluju od autoimunih, alergijskih, hematolokih,
onkolokih i dr. oboljenja.
Svaki protoni citometar se sastoji od 3 osnovna dijela:
Sistem za protok stanica- uvodi stanice iz epruvete u tekuinski prostor i osigurava da u
susretu sa laserskom zrakom stanice protiu pojedinano.
Optiki sistem- sastoji se od 2 dijela : izvora podraajnog svjetla i pripadajuih lea i sistema
za prikupljanje svjetlosnih signala.
Elektronskog sistema
Protona citometrija u imunofenotipizaciji leukemija omoguava identifikaciju i opisivanje
elijskih sublkasa koje se ne mogu prepoznati klasinim morfolokim ispitivanjima.
Imunofenotipske karakterisitike tako odraavaju i stanje zrelosti kao i aktivacioni status
leukocita. U dijagnostici leukemija protona citometrija se koristi
za:

odreivanje loze;
odreivanje diferencijacijskog stupnja
malignih stanica;
odreivanje aberantnih osobina malignih
populacija stanica;

 detekciju klonalnosti;
Koriste se monoklonalna antitijela koja obiljeavaju specifine stanine molekule (leukocitne
antigene tzv. CD-biljege) izraene na membrani ili citoplazmi stanica. Pripadnost malignih
stanica lozi najee se moe precizno odrediti detekcijom citoplazmatskih biljega, kao to su
mijeloperoksidaza (MPO) u mijeloidnoj lozi, CD79 i CD22 u B-stanicama i CD3 u Tstanicama. Membranski biljezi, kao to su CD13 i CD33 u mijeloidnoj lozi, CD19 u B-lozi i
CD7 u T-lozi, takoer su korisni u odreivanju pripadnosti stanica odreenoj lozi, iako nisu
precizni u mjeri u kojoj su to citoplazmatski biljezi.

Protonocitometrijska analiza neseparirane kotane sri djeteta s novootkrivenom

leukemijom A.
Prikaz subpopulacija prema fizikim karakteristikama (veliine/FSC i zrnatosti/SSC)
leukemijskih
stanica B. Prikaz pozitivnog nalaza biljega CD34 i CD19 na populaciji leukemijskih stanica

Procedura za akutnu leukemiju (pravi se krvni razmaz nativni i bojeni)

Kad doe uzorak pie se protokol koji obuhvata podatke sa uputnice, i odredi se koji ce se
panel raditi.
Panel se pravi na osnovu boja (zelena-FIC, svijetlo plava APC, crvena-PE, roza-PERPC). Po
5 mikrolitara svakog se dodaje u epruvetu.
Promijea se epruveta sa uzorkom na 2 300 obrtaja, 4 minute i presipa se u novu konusnu
epruvetu (na kojoj se pie ime, prezime, broj, datum).
Odvoji se supernatant (gornji, uti sloj). Uzorak se vorteksira i dodaje se lajzing. Pasterkom se
prebacuje u konusnu epruvetu dok se ne prebaci cijeli uzorak. Na to se doda do vrha lajzing i
inkubira se 10 min. na sobnoj temperaturi.
Nakon inkubacije vri se centrifugiranje ( 2 300 obrtaja, 4 min) . Odlije se gornji sloj. Mijea
se i ispire sa Cell Wash, ponovo se centrifugira, odlije gornji sloj, promijea, doda Cell Wash,
inkubira se 5 min. Postupak se dalje ponavlja centrifugiranjem, odlijevanjem gornjeg sloja,
mijeanjem, dodavanjem Cell Wash-a. Ponovo se centrifugira, odlije se gornji sloj, mijea i
ostaje potpuno bijeli sloj na dnu epruvete (leukociti) to znai da smo uklonili sve eritrocite,
zatim se doda do 2 ml Cell Wash-a SUSPENZIJA.
Iz suspenzije se uzme po 50 mikrolitara u 13 epruveta oznaenih panelom. Sve epruvete se
promijeaju i inkubiraju se 15 min. u mraku. Nakon inkubacije u mraku dodaju se
citoplazmatska monoklonalna antitijela, potom slijedi inkubacija 20 min. Zatim se dodaje
razrijeeni Perm wash 1 ml, centrifugira, vorteksira i ovaj postupak se ponovi jo jednom. Na
kraju se doda 350 mikrolitara CELL FIX i vorteksira.