4.

DETEKCIJA OTROVA
Uvod

kljuan korak

detekcija:

otrova: ciljano odreivanje skupine ili odreenog

otrovnosti: je li prisutno ita otrovno

otrova

Svaka tvar je otrov; ne postoji niti jedna koja nije otrov. Samo doza ini tvar otrovom ili lijekom
Uvod

eksperiment je neophodan u istraivanju odgovora na kemijsku tvar

bilo koja tvar moe prouzroiti oteenja ili smrt pod odreenim uvjetima izloenosti

nema apsolutno sigurne tvari, koja ne bi mogla izazvati tetne uinke

skoro sve to konzumiramo (sol, eer, krob, mast, proteini, neki minerali i vitamini, ak i voda) u
dovoljno visokim koliinama moe djelovati tetno
Otkrivanje otrovnosti

stara metoda za vodu, hranu i zrak

bioloki model za otkrivanje otrovnosti

Otkrivanje otrovnosti

rano otkrivanje otrovnosti

u hrani, vodi, zraku,...

detekcija (stalna ili povremena) tono odreenog otrova prikladnom metodom

mjerenje posebnih uinaka otrova

otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu

Kvalitativne i kvantitativne analitike metode

opi protokol za kvantitativna odreivanja toksikanata u biolokim uzorcima:

cilj analize uzorkovanje ekstrakcija izolacija identifikacija i mjerenje analiza

podatakadetekcija, identifikacija i odreivanje toksinosti i koncentracija toksinih tvari

klasifikacija analitikih metoda:

bioloke metode (bioassays)

fizikalne i/ili kemijske metode

metode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)

fizikalne i/ili kemijske metode

klasine/suvremene analitike i biokemijske tehnike

temelj: fizikalna i/ili kemijska svojstva ispitivane tvari

kromatografija, elektroforetske tehnike, spektrofotometrija (UV/VIS), GC, HPLC, MS, AAS,

ICP-MS (Inductively coupled plasma - mass spectroscopy), IR, NMR

metode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)

temelj: specifina reakcija liganda i vezujueg proteina

metode razvrstane u tri osnovne kategorije:

imunometode

metode koje koriste vezanje na receptor

metode koje koriste vezujue proteine u krvotoku

metode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)

imunometode

najee koritene

ligand: antigen

vezujui protein: specifino antitijelo

brza, visoko osjetljiva i specifina analiza

odreivanje koncentracije antigena ili

jednostavnost izvoenja

jednostavnost interpretacije rezultata

metode ovisne o vezanju dva reaktanta (binding assays)

metode koje koriste vezanje na receptor

prisutnog antitijela

metode koje koriste vezujue proteine u krvotoku

problem: izbor ivog organizma, organa ili stanice

za takve pokuse

cilj: odreivanje opasnosti za ovjeka (razlike u

odnosu na model, neki modeli
posebno
osjetljivi na neki otrov lani rezultati)
paralelno koritenje dva modela

bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli:

praenje odgovora biolokog sustava na otrov (biljka ili ivotinja, organ ili tkivo,
mikroorganizmi ili stanice)

bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu

proteini prirodno prisutni u plazmi (npr. tiroksin vezujui protein (TBG) analiza
tiroksina)

bioloke metode (bioassays)

podrazumijevaju prethodnu ekstrakciju receptorskog proteina iz ciljnog organa za

odreeni hormon ili ksenobiotik

bakterije

najbolje definiran i razvijen model

rezultati relativno brzo

velik broj stanica koje sudjeluju u pokusu vea sigurnost rezultata

izbor bakterijskog soja ovisi o

mediju i metodi

bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli:

bakterije

2 naina utvrivanja otrovnosti

inhibicija rasta (jednostavnija, sporija, moe detektirati vei broj uinaka

otrova broj bakterija ili neki drugi imbenik, za vodu i sve to je u vodi
topljivo)

bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli:

bakterije

2 naina utvrivanja otrovnosti

mjerenje nekog specifinog parametra (npr. funkcija enzima, potronja

kisika,...) djelovanja otrova na ve uzgojenu bakterijsku koloniju (bre, za sve
medije)

alge (rast, odreivanje

klorofila,...)

bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli:

kulture prikladnih stanica

velika sigurnost u ponovljivosti

stanine linije mije jetre
LD raeno na mievima)

inhibicija rasta stanine kulture ili

ispitivanja na stanicama viih

rezultata, etiki
(najvie pokusa utvrivanja

neki uinak otrova na stanice

organizama

bioloke metode - otkrivanje ope otrovnosti na biolokom modelu - najei modeli:

ivotinje

mi, takor (otrov primjenjen na usta, kou, intravenski, intramuskularno, akutni

pokus traje 24 sata, zapisivanje svih promjena, rtvovanje na kraju pokusa)
posebno osjetljive ivotinje na neke otrove ili na otrove u nekim medijima (kanarinci,
rijene pastrve)

bioloke metode (bioassays)

beskraljenjaci:

najdue koriten model, najpouzdaniji

vodena buha (Daphnia sp.) akutna smrtnost kroz 24-48 sati

rakovi (Palaemonetes spp.) toksinost topljivih pesticida, klora, tekih metala,
industrijskih otpadnih tvari; smrtnost unutar grupa od 10-20 rakova izloenih 5-6
koncentracija testirane tvari

bioloke metode (bioassays)

kraljenjaci

ribe: pastrva, keder, aran, zebra fish

vrste testova toksinosti na ribama:

test akutne toksinosti: min. 5 konc. testirane tvari, 7 riba u grupi,

vidljive promjene i smrtnost tijekom 96 sati

toksinost na rast mladih riba: deformacije, rast, smrtnost, test

period 1 mjesec
ivotni ciklus: produkcija jajaaca, odnos spolova, vie generacija,
nekoliko mjeseci do godina

bioloke metode (bioassays)

vii kraljenjaci

procjena redoslijeda koritenja:

toksinost u ranim fazama ivota: jajaca, novo izlegnute ribe, test

period 1 mjesec

mi takor koko vodozemci morska svinja hrak zec riba pas

gmizavci maka prepelica puran primati

bioloke metode (bioassays)

prednosti: vea slinost biotransformacijskim procesima u ovjeku

nedostaci:

mogunost primjene biolokih metoda samo za tvari koje proizvode bioloki

odgovor u ivim organizmima i tkivima
bioloka varijabilnost (manja preciznost, slabija reproducibilnost, potreba
ponavljanja pokusa)

cijena (nekoliko tisua do nekoliko stotina tisua dolara)

vrijeme

prostor

bioloke metode (bioassays)

koritenje ivotinja etika?

klasine bioloke metode samo ako nema odgovarajuih alternativnih

prednosti metoda sa staninim kulturama:

minimalne potrebe koritenja ivotinja

primjena uglavnom u poetnim ispitivanjima biolokih (toksinih) djelovanja
ksenobiotika

praenje morfolokih i biokemijskih promjena u staninoj kulturi

olakano prepoznavanje tetnih uinaka ksenobiotika

svoenje na minimum brojnih testova na ivotinjama

Etika?

bioloke metode vs. imunometode

bioloke: odreivanje koncentracije temeljeno na biolokoj aktivnosti ispitivane tvari

imunometode: prepoznavanje samo dijela strukture antigena - njegove antigenske
determinante; vea osjetljivost

otkrivanje otrovnosti u ekotoksikologiji

je li ono to se ispituje otrovno za biosferu ekosustava (voda, tlo, zrak) u koji je dospjelo
hoe li primjena nekog novog proizvoda tetiti okoliu (za sve proizvode s vie od 1 000
t/god.)
izbor organizma i vremena izloenosti

bar 2 predstavnika ekosustava koji se prouava (vii i nii organizam)

OTKRIVANJE OTROVNOSTI

otkrivanje otrovnosti u ekotoksikologiji

bakterije (za vode i tlo)

plijesni (za razliite materijale)

alge (za vode)

muice (za vodu)

koljke, puevi (beskraljenjaci, za razl. ekosustave)

otkrivanje otrovnosti u ekotoksikologiji

ribe ili njihove kulture stanica (za vode)

gliste (za tlo)

kraljenjaci ili njihove kulture stanica (za sve uzorke)

Provjera i dokazivanje valjanosti analitike metode

cilj provjere: pokazati da ispravno primijenjen postupak daje rezultate koji udovoljavaju svrsi

parametri provjere valjanosti metode:

iskoritenje: mjerena koliina ispitivane tvari (aktivna tvar i odgovarajui metaboliti)

izraena kao % dodane u uzorak tonost metode)
selektivnost: granice do kojih metoda moe biti koritena za odreivanje pojedine tvari u
smjesi ili uzorku bez interferencije sa slinim komponentama
kalibracija: mogunost mjernog sustava da daje prihvatljivu korelaciju odgovora
instrumenta i koncentracije ispitivane tvari

parametri provjere valjanosti metode:

ponovljivost: bliskost podudaranja uzajamno neovisnih rezultata testa (u kratkim

vremenskim razmacima, isti operator, ista metoda, identian ispitivani materijal, isti
laboratorij, koritena ista oprema)
reproducibilnost: bliskost podudaranja neovisnih rezultata dobivenih istom metodom na
identinom ispitivanom materijalu, ali pod razliitim uvjetima

unutarlaboratorijska reproducibilnost : dan-na-dan varijacije uslijed promjene

analitiara, proizvodne serije reagencija, rekalibracije instrumenata, laboratorijskog
okolia (npr. temperatura)
meu-laboratorijska reproducibilnost: varijacije uslijed razliitih kalibracijskih
standarda, razlika u interpretacijama protokola, razlika opremi ili izvoru reagencija,
faktora okolia (npr. klimatski uvjeti)
Provjera i dokazivanje valjanosti analitike metode

parametri provjere valjanosti metode:

granica detekcije: najmanja koliina ispitivane tvari, koja se moe detektirati, ali ne nuno i
kvantificirati kao egzaktna veliina
granica kvantifikacije: najnia koncentracija kod koje je mogua jednoznana identifikacija
ispitivane tvari i sa kojom se postie prihvatljivo iskoritenje
Otkrivanje i dokazivanje otrova

putevi ulaska u organizam:

respiratorni trakt (inhalacija)

koa (apsorpcija uslijed dermalnog kontakta)

digestivni trakt (s hranom, vodom)

neposredan unos u krvotok (ozlijede, ubodi, injekcije)

toksikokinetika (put toksine tvari u organizmu)

toksikodinamika (zbivanja na staninoj i molekularnoj razini koja dovode do toksinog odgovora

razlike u toksinosti s obzirom na otrov, nain unosa, vrstu i spol

LD50 za diklorvos s obzirom na vrstu i put izloenosti:

stupnjevanje akutne oralne toksinosti (LD50) - klasifikacija temeljena na masi tvari:

ekstremno toksine tvari (botulin): 1 mg/kg tj. m.

vrlo toksine tvari (strihnin): 1-50 mg/kg tj. m.

umjereno toksine tvari (DDT): 50-500 mg/kg tj. m.

slabo toksine tvari (morfin): 0.5-5 g/kg tj. m.

vrlo slabo toksine tvari (etanol): 5-15 g/kg tj. m.

netoksine tvari: 15 g/kg tj. m.

pribline LD50 vrijednosti ksenobiotika za ovjeka prosjene tjelesne mase 70 kg:

subletalni efekt

rezultat djelovanja mikro koliina toksinih tvari, koje neprekidno tijekom dueg vremena, u
malim koliinama dospijevaju u organizam iz biosfere

industrija - otpadne vode, sastojci dima, industrijske kemikalije, meuprodukti

sinteza, farmaceutski proizvodi

poljoprivreda - pesticidi, umjetna gnojiva

produkti sagorijevanja goriva

otpaci iz kuanstva, zdravstvenih ustanova

Otkrivanje i dokazivanje otrova

subletalni efekt

posljedice:

suptilne biokemijske lezije u vitalnim organima

smanjenje obrambenih sposobnosti organizma

nepovoljno djelovanje na reprodukcijski sustav

promjene genetskih faktora

mutageno, teratogeno i kancerogeno djelovanje

ocjenu otrovnosti tvari temeljiti ne samo na akutnoj, ve nuno i na subletalnoj toksinosti

otkrivanje otrova u biolokim materijalima

glavni cilj: utvrditi stanje bolesnika, a zatim eventualno uzrok trovanja

kliniko-laboratorijsko otkrivanje obuhvaa:

odreivanje biokem. pokazatelja stanja bolesnika

utvrivanje posebnih uinaka otrova

analize prosijavanja

testove dokazivanja prisutnosti otrova

otkrivanje otrova u biolokim materijalima

odreivanje biokem. pokazatelja stanja bolesnika

sve pretrage koje se moraju uiniti kod bolesnika kojima treba odrati vitalne funkcije
acidobazni status (kada dolazi do promjena pH i/ili parcijalnih tlakova O 2 i CO2 u
krvi, alkalne ili kisele dijureze kao tehnike ubrzanog otklanjanja otrova)
elektroliti (kada dolazi do dehidracije povraanje, proljev, znojenje, mokrenje; za
vrijeme lijeenja)
druge specifine biokemijske pretrage (jetreni enzimi)

otkrivanje otrova u biolokim materijalima

utvrivanje posebnih uinaka otrova

mjerenje aktivnosti acetilkolinesteraze

razgrauje neurotransmiter acetilkolin

acetilkolin izaziva kontrakciju miia, suenje zjenica, pojaava peristaltiku
crijeva, usporava rad srca, pojaava luenje lijezda znojnica, slinovnica, ima
ulogu u odravanju svijesti,...

na biosintezu, pohranu i razgradnju acetilkolina utjeu brojni lijekovi i otrovi

kod sumnje u primjenu bojnih otrova, organofosfornih insekticida

inhibicija enzima potvrda iz analitikog laboratorija

otkrivanje otrova u biolokim materijalima

utvrivanje posebnih uinaka otrova

koagulacijske pretrage

mjerenje pokazatelja zgruavanja krvi

kod trovanja antikoagulansima

mjerenje postotka methemoglobina (eljezo u hemu nije Fe 2+ nego Fe3+) i

karboksihemoglobina (COHb)

kod poara i kemijskih nesrea (NO3-, NO2-, CO)

testovi za prosijavanje i dokazivanje otrova

izravno dokazivanje otrova

imunokemijske metode, kromatografija, spektrofotometrija,...

otkrivanje otrova u zraku

kolorimetrijski testovi

NH 3 u krvi)

otkrivanje otrova u biolokim materijalima

specifine pretrage (zelena pupavka

gotovi setovi reagensa

na prikladnom sorbensu nalaze se sve potrebne kemikalije koje u kontaktu s otrovom
daju obojeni produkt
testovi na papiru
reagensom
tehnike indikatorskih
za velik broj polutanata)

natopljenom prikladnim

cjevica (sorbens, sisaljka,

otkrivanje otrova u zraku

instrumentalne metode

elektrokemijske metode (ISE, stalno praenje kvalitete zraka,...)

spektrometrija masa (najpouzdanija metoda)

mobilni sustav plinski kromatograf-spektrometar masa

otkrivanje otrova u vodi

kolorimetrijski testovi

gotovi setovi za najee polutante (nitrati, nitriti, cijanidi, amonijak, halogeni anioni,
teki metali, cijanidi, pesticidi,...) jednostavni, najee kvalitativni odgovor

instrumentalne metode

za kontinuirana mjerenja

elektrokem. (ISE)

Testovi toksinosti

obavezno testiranje toksinosti za tvari kojima mogu biti izloeni ovjek i drugi ivi organizmi u
okoliu (lijekovi, aditivi u hrani, kontaminanti u hrani porijeklom iz okolia, industrijske kemikalije,
pesticidi, tvari iz svakodnevne uporabe u domainstvu, kozmetiki pripravci)

kontrola i testiranje propisani zakonskim regulativama

odabir testova toksinosti ovisan o:

vrsti kemijske tvari

predvienoj uporabi

moguim nainima izloenosti

propisima zemlje u kojoj se provodi registracija

osnovni principi testiranja toksinosti:

testovi na eksperimentalnim ivotinjama ili biljkama

epidemioloke studije: utvrivanje odnosa izloenosti i uinaka ksenobiotika na zdravlje
pojedinih populacija
ekotoksikoloke studije: primjena preciznih analitikih metoda u odreivanju ostataka
ksenobiotika u okoliu
ispitivanje perzistentnosti i ponaanja ksenobiotika kao kontaminanata unutar prehrambenog
lanca

pitanja koja prethode ispitivanju toksinosti ksenobiotika:

Da li je spoj potpuno nov, ili je ve bio u uporabi u nekom vremenskom periodu?

Da li e biti koriten u okoliu?

Da li e biti dodavan u hranu?

Da li primjena podrazumijeva jednokratnu ili ponavljanu dozu?

U kojim dozama e se primjenjivati?

Koja e starosna skupina biti izloena?

Da li se moe oekivati izloenost trudnica ili djece?

razmatranja u pripremi testiranja toksinosti na ivotinjama:

najpogodnija vrsta za ispitivanje

slinosti biotransformacija s onima u ovjeka

uvjeti i nain uzgoja ivotinja

nain prehrane i sastav hrane

zdravstveno stanje ivotinja

spol ivotinja

razmatranja u pripremi testiranja toksinosti na ivotinjama:

broj ivotinja u testu

nain aplikacije pri tretmanu

trajanje testiranja

testovi akutne toksinosti

razliite jednoktatne doze, odreivanje LD50

najee na glodavcima

daju informaciju o potencijalnoj toksinosti novih ksenobiotika

ukazuju na nain toksinog djelovanja, toksinost za ciljni organ i letalnost - polazite za

odabir doza u testovima s ponavljanom izloenou

testovi subakutne, subkronine i kronine toksinosti

najmanje 3 doze

hematoloka ispitivanja

kliniko-kemijska ispitivanja

testovi na teratogenost i reprodukciju, multigeneracijski testovi

testovi na mutagenost

specijalni testovi toksinosti:

testovi one i kone iritacije (ekstremni pH)

imunotoksinost (uinci na imunoloki sustav praenje otpornosti na infekcije)

neurotoksinost (uinci na sredinji i periferni ivani sustav praenje promjena u

ponaanju)

toksikokinetiki parametri

toksikodinamiki parametri