Professional Documents
Culture Documents
Mol Metode Finalna
Mol Metode Finalna
Aktuelno:
Tradicionalne metode:
Simptomatologija bolesti
Morfoloke i fizioloke osobine
Razvojni ciklus gljiva
Kako?
Opisno
Izolacija na hranljive podloge
Karakterizacija morfolokih i
fiziolokih parametara
Testovi patogenosti
Posmatranje,
Kvantifikovanje,
Standardizacija i
Analiza
TEKO i
NEPOUZDANO
Molekularne metode:
Kako?
Identifikacija
vrsta,
Velika brzina
1.
IZBOR ODGOVARAJUE
SEKVENCE NUKLEOTIDA
KOJA E BITI
KORIENAgenetike
ZA IDENTIFIKACIJU
Detektovanje
Osetljivost
varijabilnosti unutar vrsta,
Preciznost
2.
IZOLACIJA
DNK MATERIJALA
IZ UZORKA
Utvrivanje
srodnosti
dve jedinke
Olakano tumaenje rezultata
Pravac evolucije patogena
3. METODOLOKI PRISTUP ZA DETEKCIJU PRISUSTVA CILJNE SEKVENCE
Delovanje evolutivnih faktora
DNK U UZORKU
PCR reakcija:
Nedostaci:
Visoka senzitivnost
minimalna koliina
materijala DNK iz
samo jedne elije
Visoka specifinost
odreena selektivnom
hibridizacijom
prajmera
Jednostavnost, brzina,
niska cena
PCR inhibitori u
biljnom tkivu ili
zemljitu
Kontaminacija
Ne mogu se
diskriminisati stvarni
patogeni
Etidijum bromid
Kriterijum:
razlikovanje samo na
osnovu velicine
(molekulske mase)
Rezultati su
kvalitativni, ne
kvantitativni
Mehanizam
Prednosti
Mane
3. Nested PCR
dvostruka PCR
reakcija
Poveana
Poveana mogunost
specifinost i
kontaminacije i trajanje
osetljivost
procesa
detekcije
patogena
Mala koliina DNK
4. Co PCR
Uz upotrebu DNK
proba
Vea osetljivost
od Nested PCRa
Smanjena
mogunost
kontaminacije
Vrlo specifina
Visoka cena
5. Multiplex PCR
Nekoliko
prajmera u istoj
reakciji
Uteda vremena I
novca
Detekcija I
diferencijacija
vie patogena
Krae sekvence se
obimnije umnoavaju
6. RT PCR
Detekcija mRNK
Ekspresija
fungalnih gena
Razlikuje ive I
mrtve elije u
uzorku
Mehanizam
Prednosti
Nedostaci
RFLP
Sekvencno specifini
restrikcioni enzimi, ispituje
polimorfizam homolognih
sekvenci;
PCR-RFLP
Elektroforeza
Visoka cena
Velika strunost
Mnogo vremena
Komplikovana
Ne zahteva
prethodno
identifikaciju vrste
Brza metoda
pogodna za analizu
Analiza genetikog
diverziteta izmeu
populacija
Restrikcioni enzimi
primenjeni na celokupnu
DNK. Iseenim fragmentima
se prikljuuje adapter
molekul, kasnije prajmeri
poseduju sekvencu
komplementarnu adapteru;
vizuelizacija na
irok spektar
diverziteta koji
moe da detektuje
Restriction
Fragment
Length
Polymorphism
RAPD
Random
Amplified
Polymorphic
DNK
AFLP
Amplified
Fragment
Length
Polymorphism
Mehanizam
Prednosti
Nedostaci
Mikrosateliti
Minisateliti
Mapiranje genoma
Populaciona
genetika
Zahteva ispitivanje
velikog broja
mikrosatelitiskih lokusa
Neophodna identifikacija
organizma
Nije pouzdana za
filogenetske
rekontrukcije I
taksonomiju
Simple
sequence
repeats
Short tandem
repeats
Sekvenciranje
Sekvenciranje podrazumeva utvrivanje redosleda nukleotida u
DNK molekulu.
Postoji nekoliko metoda sekvenciranja; veina je zasnovana na
Sangerovoj (Frederik Sanger) metodi.
Sangerova metoda je poznata kao metoda Terminacije sinteze
lanaca, ili kao dideoksi metoda.
Dideoksi metoda - jednolanani DNK molekuli koji se razlikuju u
duini za samo jedan nukleotid, mogu razdvojiti elektroforezom u
denaturiuem poliakrilnom gelu.
Sekvenciranje
U
reakcionoj
smei
ugradnjom
ddNTPova dolazi do terminacije sinteze
novog lanca. Zbog toga to se u reakcionoj
smei nalazi milijarde kopija, terminacija
sinteze moe biti prekinuta na bilo kojoj
poziciji.
Kao posledica,
dobijaju se fragmeni
razliite duine
(obeleeni
fluorescentnim
bojama
karakteristinim za
svaki nukleotid) koji
se razdvajaju na
osnovu duine.
Najbre putuju
najkrai fragmenti,
pa se njihova
Sekvenciranje
DNK je negativno naelektrisan molekul,
kree se ka pozitivnoj elektrodi. Kretanje
DNK kroz gel je zavisno od veliine.
Milione kopija iste veliine kretae se
istom brzinom i zauzee odreenu poziciju
na gelu (traka na odreenoj poziciji).
Nakon zavrene elektroforeze, gel se
vizuelizuje pomou X zraka.
Zakljuak:
Poznavanje evolutivne istorije patogena, sagledavanje diverziteta, naina irenja
infekcije i razmnoavanja su kljuni za prevenciju I kontrolu biljnih bolesti.
Dalja unapreenja molekularne biologije, automatizacije i kompjuterske
tehnologije i dalje e imati pozitivan efekat na razvoj brih, osetljivijih i pouzdanijih
metoda za detekciju fitopatogenih gljiva
Tano ime vrste i pravovremena detekcija rezistentnosti na fungicide u
populacijama fitopatogenih gljiva omoguavaju efikasniji menadment zatite
prirodnih I agrikulturalnih resursa.
Primena molekularnih tehnika u prouavanju ini se da je esencijalna
potpora za fitopatologiju; da jedino zajedno sa tradicionalnim, fenotipskim
pristupom mogu omoguiti otkrivanje, opisivanje i klasifikaciju gljiva.