MIKROOBIFSIOLOOGIA. 1. Fsioloogiliste protsesside globaalne regulatsioon rakkudes. 2. Geeniekspressiooni kontroll transkriptsiooni tasemel. 3. Posttranskripsiooniline regulatsioon. 4.

Quorum-sensing ja selle mju fsioloogilistele protsessidele rakus. 5. Kahekomponendilised regulatsiooni ssreemid ja signaalide vastuvtt. 6. Bakteriraku struktuur ja funktsioonid. 7. Bakterite jagunemine. 8. Geneetilise informatsiooni lekanne bakterites. 9. Energia tootmine. 10. Metaboliitide transport. 11. Lmmastiku metabolism. 12. Valkude ransport (Tp I-IV sekretsiooni ssteemid). 13. Substraatide metabolism (v. a. glkoos). 14. Bakterite stressi vastused. 15. Bakterite kasv statsionarses faasis. 16. SOS vastus ja DNA reparatsioon. 17. Kemotaksis. 18. Puriinide ja primidiinide sntees. 19. Patogeen-peremees interaktsioon 1. FSIOLOOGILISTE PROTSESSIDE GLOBAALNE REGULATSIOON RAKKUDES. Paljud muutused keskkonnas kutsuvad bakterirakus esile stressi. Hoolimata keskkonna muutustest peavad DNA replikatsioon, rakkude kasv ja jagunemine olema balanseeritud. Translatsiooniaparaadis osalevad vhemalt 150 erinevat geeniprodukti (rRNA-d ja ribosoomi valgud, tRNA-d, aminoatsl-tRNA sntetaasid, translatsiooni initsiatsiooni, elongatsiooni ja terminatsiooni faktorid). Jrk-jrgulised muutused metaboolsete ssteemide aktiivsuses leiavad aset sltuvalt sellest, milline on raku varustatus biosnteesiradade lpp-produktidega. Rikkas kasvukeskkonnas, kus vastavad komponendid on juba valmis kujul olemas, on biosnteetiliste ensmide ekspressioonitase rakus vrreldes vaese kasvukeskkonnaga vhemalt 10 korda alla surutud. Regulatsioon toimub nii struktuurgeenide transkriptsiooni tasemel (repressioon, attenuatsioon) kui ka biosnteetiliste ensmide tagasisidestusliku inhibeerimise kaudu. Juhul, kui suvaline komponent keskkonnast ammendub, katkeb koheselt tagasisidestuslik inhibitsioon. Kui sellest ei piisa, tuseb vastava biosnteesiraja struktuurgeenide transkriptsioonitase. Kui ka sellest ei piisa, vallandub rakus nn. stringent response, mille tulemusena toimuvad geenide ekspressioonitasemes globaalsed muutused. Erinevaid bioloogilisi protsesse koordineeritakse globaalse regulatsiooni kaudu. Globaalsele regulatsioonile alluvad kik operonid. Operonid, mida kontrollib ks regulaatorvalk, moodustavad reguloni. Samasse reguloni kuuluvate operonide induktsioon vib sna ulatuslikult varieeruda. Niteks temperatuurishoki reguloni (Htp) puhul theldatakse osade HSP-del (heat shock proteins) temperatuuri tusu korral 5- kuni 7-kordset induktsiooni, mnede HSP-de tase rakus tuseb aga le 70 korra. Stressivastuse kigus produtseeritakse rakus signaalmolekule e. alarmoone. Tuntumad signaalmolekulid on niteks cAMP ja guanosiintetrafosfaat ppGpp. Erinevaid regulone kontrollivad regulaatorid vivad transkriptsiooni kas stimuleerida (niteks PhoB), inhibeerida (niteks LexA) vi mnede geenide puhul stimuleerida ja teiste puhul inhibeerida (niteks Lrp leucine response protein). Osa regulone on kontrollitud alternatiivsete sigma faktorite poolt (niteks 32 regulon). Regulatsioon vib toimuda mitmel erineval viisil: 1. regulaatori kovalentne modifitseerimine enamasti fosforleerimine/defosforleerimine (PhoB, NtrI), 2. negatiivse regulaatori degradeerimine (nit. LexA), 3. sigma faktori rakulise hulga tstmine (32), 4. valgu konformatsiooni muutmine ligandi sidumisel. Bakteris E. coli on kirjeldatud ligikaudu 1000 erinevat operoni ning paarsada erinevat reguloni. Erinevatesse regulonidesse kuuluvad operonid vi geenid vivad kuuluda modulonidesse. Samasse moduloni kuuluvaid geene/operone vib kontrollida lisaks nende erinevatele regulaatoritele ka hine globaalne regulaator (niteks cAMP retseptorvalk CRP e. CAP). Globaalse regulatsiooni kirjeldamiseks on vetud kasutusele veel miste stimulon. Stimuloni kuuluvad geenid, operonid, regulonid ja modulonid, mille td mjutab ks ja sama keskkonnastiimul. Samasse stimuloni kuuluvate regulatoorsete ksuste td kontrollivad erinevad regulaatorid. Niteks temperatuuri tusu korral aktiveerub Htp (RpoH) regulon ja P-nlja puhul PhoB regulon, kuid lisaks nendesse regulonidesse kuuluvatele geenidele aktiveeruvad veel paljud teised. Niteks P-nlja puhul on indutseeritud 145 erinevat valku, millest ainult 38 on kodeeritud PhoB reguloni kuuluvate geenide poolt. Nlja korral lhevad rakud statsionaarsesse faasi

ja neis indutseeritakse ka RpoH regulon, Lrp regulon, LexA-kontrollitud SOS regulon ja OxyR regulon. Lisaks paljude valkude induktsioonile phjustab P-nlg 137 erineva valgu repressiooni. 2. KONTROLL TRANSKRIPTSIOONI TASEMEL Bakteri elukeskkonna tingimused on sageli vga muutlikud. Tulenevalt sellest, peavad bakterid sageli tegema mberkorraldusi rakus toimuvates fsioloogilistes protsessides. Jrgnevalt vaatleme, kuidas bakterites toimuvate mitmesuguste fsioloogiste protsesside regulatsioon on seotud geeni ekspressiooni regulatsiooniga. Geenide transkriptsiooni regulatsioonis osalevad regulaatorvalgud, mis vivad protsessi prssida (negatiivne kontroll) vi soodustada (positiivne kontroll). Geenid, mida transkribeeritakse korraga, kuuluvad hte operoni (operoni kuuluvad ka nende geenide transkriptsiooni reguleerivad DNA jrjestused) ja operonilt snteesitud RNA molekuli nimetatakse poltsistroonseks RNA-ks. Regulatsioon transkriptsiooni tasemel sltub DNA-ga seonduvatest regulaator-valkudest. Paljudele transkriptsioonifaktoritele on iseloomulikud teatavad struktuursed motiivid nagu tsink-srmed, leutsiini lukud heeliks-ling-heeliks ja heeliks-pre-heeliks. Lisaks regulaatorvalkudele, osalevad transkriptsiooni regulatsioonis ka nn. efektormolekulid. Efektormolekulideks on vikesed molekulid nagu niteks aminohapped vi erinevad suhkrumolekulid. Indutseeritava operoni puhul nimetatakse efektormolekuli induktoriks, represseeritavate operonide puhul aga korepressoriks. Bakterid on vimelised kasvama vga erinevatel ssiniku allikatel. Kasvukeskkonnast ptakse esmalt ra kasutada need C-allikaid, mis on energeetiliselt kasulikumad ja vimaldavad rakkude kiiremat kasvu. Sellest tulenevalt pab rakk oma fsioloogilised protsessid mberkorraldada, et mitte raisata energiat teiste substraatide kasutamisel osalevate valkude produtseerimiseks. Sellist regulatoorset mehhanismi nimetatakse kataboliitseks repressiooniks. Lisaks sellele kivitatakse C-allika omastamiseks vajalike ensmide produksioon vastava hendi olemasolu korral keskkonnas. Seega kitub vastav hend vi mni tema lagundamisel tekkiv vahehend kui induktor. Selleks, et suhkrud oleksid bakteritele kttesaadavad, transporditakse need fosfoenoolpruvaadi (PEP) ja fosfotransferaasi ssteemi (PTS) vahendusel tstoplasmasse. Selle ssteemi moodustavad kaks fosfotransferaasi Ensm I (EI) ja HPr ning sellele lisaks suhkru-spetsiifilised permeaasid - Ensm II (EII). EII koosneb kolmest kuni neljast erinevast funktsionaalsest ksusest. Fosforlrhma lekandmisel PEP-ilt suhkrule osalevad EI, Hpr, EIIA ja EIIB. Kataboliitne repressioon toimib rakkudes bakterite kasvamisel glkoosil, mille tulemusel raku sisene cAMP tase langeb (kasvamisel laktoosil vi suktsinaadil aga tuseb). cAMP snteesi ATP-st viib lbi adenlaattsklaas (cya geeni produkt). Laktoos-operon aktiveeritakse rakus ainult siis, kui aktivaatorvalk CAP (CRP) on seondunud cAMP-ga. cAMP on fosfodiesteraasi poolt kiiresti AMP-ks degradeeritav. Kui bakterite kasvukeskkonnas on glkoos, on cAMP sntees inhibeeritud. Glkoosi-spetsiifiline permeaas EIIGlc koosneb kolmest domeenist IIA, IIB ja IIC. Regulatsiooni seisukohalt on keskse thtsusega EIIAGlc. Kui C-allikaks ei ole glkoos, on EIIAGlc fosforleeritud, mis omakorda aktiveerib adenlaat-tsklaasi ja rakkudes kivitatakse cAMP sntees. Lpptulemusena on transkriptsioon laktoosi operoni promootorilt aktiveeritud. Glkoosi olemasolul bakterite kasvukeskkonnas on EIIAGlc aga fosforleerimata, adenlaat-tsklaasi ei aktiveerita ning inhibeeritud on ka laktoosi permeaas. Kuna laktoosi permeaas on inaktiivne, ei saa laktoos rakku ning rakus ei saa tekkida laktoosi operoni induktormolekuli allolaktoosi, mis prsiks repressori seondumise operoni operaatoralale. Sellist kontrollmehhanismi nimetatakse induktori vlistamiseks (inducer exclusion). EIIAGlc defosforleerimist phjustab glkoos-6-fosfaadi olemasolu rakkudes. CRP-valk reguleerib umbes 100 geeni ekspressiooni bakterites. cAMP-CRP kompleks interakteerub RNApolmeraasiga ja soodustab selle seondumist promootoriga. CRP-valgu poolt reguleeritavad promootorid jagunevad kahte klassi: promootor I ja promootor II. Lisaks cAMP-CRP olulisele rollile fsioloogiliste protsesside regulatsioonis, omab tsentraalset rolli ka Cra (catabolite repressor/activator protein) valk. Selle regulatsiooni fsioloogiline thtsus seisneb selles, et nimetatud valgu vahendusel reguleeritakse nn. perifeerseid lagundamisi, mis vimaldavad rakkudel kasutada C-allikana ka niteks suksinaati vi malaati. Cra-valgu mju tema poolt kontrollitavatele geenidele sltub F-6-P vi F-1,6-biP olemasolust rakus. Kui C-allikaks on glkoos, akumuleerub rakus F-6-P. See seondub Cra-valguga, mille tulemusena derepresseeritakse Cra-represseritud valkude (fosfofruktokinaasi; pruvaatkinaasi; jt) sntees; inaktiveeritakse aga Cra-aktiveeritud valkude (PEP sntetaasi; PEP karbokskinaasi; jt) sntees. Kokkuvttes aktiveeritakse glkoosi lagundamiseks vajalike valkude sntees ja blokeeritakse glkoneogeneesiks vajalike valkude sntees. Selleks, et E. coli oleks vimeline kasutama C-allikana arabinoosi on vajalik kolme valgu AraA, AraB ja AraD sntees. Nende kolme valgu toimel muudetakse arabinoos ksloos-5-fosfaadiks, mis suunatakse edasi pentoosfosfaat-tsklisse. Nende kolme geeni ekspressioon on koordineeritult reguleeritud AraC valgu poolt. AraC valk vib rakus olla kahes erinevas konformatsioonis: kompleksis arabinoosiga kitub ta kui aktivaator, ilma arabinoosita kui repressor. Praeguseks on bakterites kirjeldatud rohkem kui 100 erinevat transkripsiooni-

regulaatorit (AraC-perekond), mis sisaldavad AraC-ga homoloogilist heeliks-pre-heeliks DNA-ga seondumise piirkonda. ATTENUATSIOON Bakterites vib transkriptsioon ja translatsioon toimuda samaaegselt: lpuni snteesimata mRNA-ga vivad seonduda ribosoomid ja algab kohe ka valgu sntees. Selline kahe protsessi samaaegne toimumine vimaldab reguleerida transkriptsiooni termineerumist transkriptsiooni ja translatsiooni elongatsiooni kiiruste kaudu. Regulatsioon toimub spetsiifilistelt liiderjrjestustelt, millel on potentsiaal moodustada RNA sekundaarstruktuure ning protsessis ei osale regulaatorvalgud. Regulatsiooni transkriptsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud niteks aminohapete biosnteesi operonidel, primidiini biosnteesi operonil, aminoatsl tRNA sntetaasi operonil ja trptofaani degradatsiooni operonil. Primidiini biosnteesi operonid. E. colis ja S. entericas on pyrBI ks operonidest, mis osaleb UMP snteesil ja mille ekspressioon sltub UMP kontsentratsioonist rakus. Primidiini biosnteesi kodeeriv pyrBI operon (aspartaat-transkarbamlaas) kodeerib samuti liiderpeptiidi. 20 nt enne liiderpeptiidis olevat terminatsioonisaiti paiknevad jrjestikku 8 uridiinnukleotiidi (T-nukleotiidi DNA-s). Kui rakus on UTP kontsentratsioon madal, aeglustub traskriptsiooni elongatsioon U-jrjestuse snteesil. Protsessi aeglustumisel juab transleeriv ribosoom RNA polmeraasile jrele ning nende koostoimel lhutakse transkriptsiooni terminaatorina toimiv sekundaarstruktuur. Krge UTP kontsentratsiooni korral RNA polmeraas U-jrjestuse kohal ei peatu, mistttu translatsiooni ja transkriptsiooni koosmjul ilmnevat RNA sekundaarstruktuuri lhkumist ei toimu ning sellega blokeeritakse RNA polmeraasi liikumine struktuurgeenidesse. PyrC (dihdroorotaas) sntees on moduleeritud spetsiifilise translatsiooni kontrolli mehhanismi kaudu. Transkriptsiooni alguspunkti valik promootorpiirkonnas sltub primidiini hulgast rakus. Antud juhul RNA polmeraas tunnetab nukleotiidi hulka rakus ja vastavalt sellele sltub transkriptsiooni alguspunkti valik (sntees algab C2 vi G4 juurest). Kui rakus on primidiini piisavalt, algab transkripsioon C2 juurest. Sellise mRNA 5otsas tekib sekundaarstruktuur, mis takistab ribosoomi seondumist. Primidiini puudusel, algab transkriptsioon G4 juurest ning snteesitav mRNA ei moodusta 5otsas ribosoomi seondumist blokeerivat sekundaarstruktuuri. Aminohapete biosnteesi operonid Enamasti on klassikaliseks attenuatsiooni niteks toodud trp operoni transkriptsiooni regulatsioon. Operoni mRNA liiderjrjestuses on 4 regiooni, mille baasil vivad moodustuda alternatiivsed sekundaarstruktuurid. Regioonide 3 ja 4 paardumisel moodustub rho-sltumatu transkriptsiooni terminaator. Omavahel vivad paarduda ka regioonid 1 ja 2 vi 2 ja 3. Just regioonide 2 ja 3 paardumine takistab teminaatorstruktuuri moodustumist. Milliste regioonide baasil juuksenelastruktuurid moodustuvad, sltub sellest, kui palju on rakkudes trptofaani. Trp-operoni poolt kodeeritavas liiderpeptiidis asuvad nn. Trp kontrollkoodonid. Bakterites kodeerib ks operon erinevate aminohappe biosnteesi. Sellisel juhul sisaldavad vastavate operonide liiderpeptiidi kodeerivad jrjestused kigi nende aminohapete koodoneid. B. subtilises ei ole transkriptsiooni regulatsioon atenuatsiooni vahendusel seotud mitte ribosoomide liikumise seiskumisega, vaid attenuatsiooni ssteemis osaleb RNA-seoseline valk, mis reguleerib mRNA 5` otsas spetsiifiliste sekundaarsete struktuuride teket. Trptofani krge kontsentratsiooni korral seondub trptofan TRAP valguga. Selliselt aktiveeritud valk seondub 11 lhestikku paikneva (G/U)AG kordusega, mis paiknevad trpoperoni liiderjrjestuses. TRAP seondumine pidurdab RNA polmeraasi liikumist ja selle tulemusena juab moodustuda transkriptsiooni terminaatorina toimiv sekundaarstruktuur. S. typhimuriumis on eri tpi flagelliini snteesiks vajalike geenide fliC ja fliB ekspressioon reguleeritud rekombinatsiooni protsessi vahendusel. Kumba tpi flagelliini snteesitakse, sltub regulaatorpiirkonna H orientatsioonist fliB geeni ees. Nimetatud piirkonna inversioon toimub tnu valgu Hin vahendusel toimuvale jrjestus-spetsiifilisele rekombinatsioonile H regiooni otstes paiknevate 26 ap jrjestuste vahel.

3. POSTTRANSKRIPTSIOONILINE REGUALTSIOON Rakkude leminekuga eksponentsiaalsest statsionaarsesse kasvufaasi toimuvad olulised mberkorraldused rakus toimuvates fsioloogilistes protsessides. ks snteesirada, mis selles etapis indutseeritakse on glkogeeni sntees, mida paljud bakterid silitavad kui energia reservi. Glkogeeni snteesil osalevad ensmid ADP glkoos-profosforlaas ja glkogeen sntaas (1,4--D-glkaan: 1,4--D-glkaan 6--D- glkanotransferaas). Glkogeeni sntees on reguleeritud nii cAMP kui ka RelA valgu poolt. Suures osas on glkogeeni sntees kontrollitud ka nn. Csr-ssteemi poolt. Nimetatud ssteemi moodustavad CsrA valk ja 350 ap pikkuned regulatoorne RNA (csrB-RNA). CsrA valk seondub mRNA 5regiooniga (SD jrjestusega) ja mjutab transkriptide eluiga. csrB-RNA molekul seob rakus olevat CsrA valku. Sellest tulenevalt arvatakse, et CsrA csrB-RNA suhe rakus on see, mis kontrollib CsrA aktiivsust. CsrA ise on glkogeeni snteesil osalevate geenide negatiivne regulaator. Huvitav on see, et CsrA vib kituda nii positiivse kui ka negatiivse regulaatorina: aktiveerib mningaid glkolsil osalevaid geene - fosfofruktokinaasi geeni (pfkA), kuid represseerib mningaid geene, mis on seotud glkoneogeneesiga fruktoos-1,6- bis-fosfaatfosfataas (fbp).

Csr-ssteemiga sarnaseid regulatsiooni ssteeme on kirjeldatud ka paljudel looma- ja taimepatogeenidel, mis nitab, et geeni ekspressiooni regulatsioon mRNA stabiilsuse kaudu on bakterite hulgas laialt levinud. Alles snteesitavalt mRNA-lt algab koheselt translatsioon, mistttu ta on ribosoomidega kaetud. Translatsioon kaitseb mRNA-d degradatsiooni eest, sest sel juhul on mRNA tnu ribosoomidele vhem nukleaasidele eksponeeritud. Kui aga ribosoomide seostumine on CsrA vi tema analoogide poolt blokeeritud, on vastav mRNA ka nukleaaside poolt paremini atakeeritav. Bakteriaalse mRNA degradatsioonil osalevad kombineeritult nii ekso- kui endonukleaasid. RNA degradasoom on multiensmkompleks, kuhu kuuluvad RNaas E ja PNPaas. Lisaks neile kuuluvad kompleksi veel RhlB (DEAD-box RNA helikaas) ja glkoltiline ensm enolaas. RNA degradasoomiga on assotsieerunud ka chaperonid DnaK ja GroEL ning polfosfaadi kinaas PPK

4. QUORUM-SENSING JA SELLE MJU FSIOLOOGILISTELE PROTSESSIDELE RAKKUDES. Mitmed morfoloogilised ja fsioloogilised muutused bakterirakus on tingitud keemiliste ja fsikaliste parameetrite muutustest mbritsevas keskkonnas. Avastus, et bakterid vivad ise produtseerida ekstratsellulaarseid keemilisi signaale rakkudevaheliseks kommunikatsiooniks nitab, et bakterid on vimelised reguleerima teatud fsioloogilisi protsesse populatsiooni tasemel. Nhtus, mida on hakatud nimetama kvoorumi tunnetamiseks (quorum sensing; QS) vi ka rakk-rakk (cell-to-cell) kommunikatsiooniks, phineb bakterite vimel snteesida, sekreteerida ja ra tunda teatud kindla struktuuriga madalmolekulaarseid hendeid, mida on hakatud nimetama autoinduktoriteks (AI). Kui autoinduktori ekstratsellulaarne kontsentratsioon on saavutanud teatud kindla kriitilise vrtuse, indutseeritakse rakus signaali lekande kaskaad, mis kivitab rakus mitmesugused fsioloogilised protsessid. Nende hulka kuuluvad niteks virulentsusfaktorite produksioon, plasmiidi lekanne konjugatsiooni protsessis. Quorum sensing nhtust kirjeldati esmakordselt 25 aastat tagasi kahel merebakteril Vibrio fischeri ja Vibrio harveyil. Mlemal bakteril on valguse produktsioon sltuv nn. lutsiferaasi operoni luxCDABE ekspressioonist. Nimetatud operon ekspresseerub krgel rakutihedusel vastusena signaalmolekuli e. autoinduktori krgele kontsentratsioonile keskkonnas. Quorum sensing nhtust on kirjeldatud ka mitmetel gram(+) bakteritel. Selle rhma bakteritel on QS signaalmolekulideks tavaliselt lhikesed oligopeptiidid. Nende transport rakust vlja toimub ABC transporterite vahendusel. Signaali vastuvtmisel osaleb nn. kahekomponendiline regulatsiooni ssteem. Preaguseks on qourum sensingu nhtust kirjeldatud Streptococcus spp. (kompetentsus-ssteem ), Enterococcus faecalis (konjugatsioon), Bacillus subtilis (sporulatsiooni-ssteem, kompetentsus-ssteem) jt. Nii et tegemist on bakterite hulgas laialt levinud regulatsiooni-ssteemiga. Gram(-) bakteritel on QS signaalmolekuliks tavaliselt atsleeritud homoseriinlaktooni molekul (AHL). QS protsesis osalevad valgud, mis kuuluvad LuxI-LuxR valkude perekonda. LuxI-tpi valk osaleb AHL snteesis, LuxR valk on aga retseprorvalguks, mis teatud kindla AHL kontsentratsiooni juures moodustab sellega kompleksi. Selliselt aktiveeritud valk seondub tema poolt kontrollitavate geenide regulaator piirkonnaga. Erinevad LuxR-tpi retseptorvalgud on vimelised seonduma ainult teatud kindla AHL molekuliga. AHL seondumine LuxR tpi regulaatoriga aktiveerib viimase, kas tnu valgu molekuli konformatsiooni muutusele, aktiivse di- vi multimeeri tekkele. V. harveyi rakkudes snteesitakse kahte erinevat QS signaalmolekuli: AI-1 [N-(2-oksheksanol)-Lhomoseriinlaktoon] snteesi eest vastutavad luxLM, AI-2 [furanoslboraat diester] snteesi eest vastutab luxS. V. harveyi QS ssteemi anals on nidanud, et selles bakteris kirjeldatud ssteem erineb oluliselt teistest gram() bakterites siiani kirjeltatud ssteemidest. Kui enamikel gram(-) bakteritel seondub AHL LuxR tpi regulaatorvalguga, siis V. harveyi vastutavad QS signaali ratundmise eest kahekomponendilise regulatsioonissteemi sensorvalgud LuxN (AI-1) ja LuxPQ (AI-2). LuxU vahendusel kantakse signaal le regulaatorvalgule LuxO. Madala autoinduktori kontsentratsioonil on LuxO fosforleeritud ning lux-operoni t prsitud, kontsentratsiooni tustes toimub aga LuxO defosforleerimine ning lux-operon hakkab tle. Mnedel patogeensetel E. coli tvedel (EHEC) osaleb virulentsusfaktorite snteesi regulatsioonis autoinduktor AI-3 (struktuur siiani teadmata). AI-3 negatiivstets EHEC tvedes on vimalik virulentsusfaktorite snteesi taastada kui lisada kasvukeskkonda epinefriini vi norepinefriini. See asjaolu viitab vimalusele, et AI-3 on struktuurilt sarnane epinefriin/norepinefriinile. QS ssteem koosneb erinevatest komponentidest ja kontrollib vga erinevaid protsesse bakterirakus. Siiani on kirjeldatud QS ssteemi rohkem kui 50 erineval bakteriliigil. Lisaks on selgunud, et vga paljud bakteriliigid on vimelised produtseerima mitut erinevat QS signaalmolekuli. Nii niteks produtseerib patogeen A. tumefaciens kahte, P. aeruginosa aga nelja erinevat signaalmolekuli. Ka mnedes E. coli tvedes on kirjeldatud quorumregulated nhtust. E. coli`l on leitud LuxR tpi valk SdiA, mis osaleb raku jagunemise regulatsioonis. Konkreetne signaalmolekul on siiani identifitseerimata.

Lux-geenide ekspressioon. Siiani on kige enam uuritud QS funktsioneerimist merebakteris V. fischeri. Vastav ssteem koosneb siin kahest valgust LuxI, mis on vajalik 3-oxo-C6-HSL snteesiks ja LuxR, millega vastav AHL seondub. AHL seondumine LuxR saab vimalikuks teatud kindlal AHL kontsentatsioonil. LuxR-AHL kompleks seondub luxoperoniga ja kivitab viimase ekspressiooni. LuxR geenil on nidatud kahte funktsionaalset domni: Nterminaalne AHL seondumise domn ja C-terminaalne DNA-ga seondumise domn. Praeguseks on leitud, et lisaks luxI geenile on V. fischer-is ka teine AHL snteesi mrav geen ainS (mrab C8-AHL snteesi). C8AHL toimib lbi regulaatorvalgu LuxO (so. nn. response regulator). C8-AHL ja oxo-C6-AHL moodustavad htse ssteemi, mis kontrollib lux-operoni ekspressiooni. C8-AHL teatud kontsentratsioonil toimub LuxO fosforleerimine, mille tulemusena blokeeritakse tema seondumine luxR promootor piirkonnaga, mis teeb vimalikuks LuxR valgu snteesi. Oxo-C6-AHL madalal kontsentratsioonil seondub C8-AHL ka LuxR-iga, mille tulemusena kivitatkse madalal tasemel lux-operoni t. Oxo-C6-AHL kontsentratsiooni suurenedes moodustub LuxR-oxo-C6-AHL kompleks, mis livitab lux-operoni ekspressiooni krgemal tasemel. Teises merebakteris V. harveyi on lux-operoni ekspressioon reguleeritud kahe erineva AHL poolt AI-1 ja AI-2. Autoinduktori AI-1 (4-hdroksl-C4-AHL) snteesi mravad AHL-sntetaasid LuxLM. Autinduktori AI-2 (furanoslboraat diester) snteesi mrab AHL-sntetaas LuxS. AI-1 ja AI-2 signaali ratundmise eest vastutavad sensor-kinaasid vastavalt LuxN ja LuxPQ, mille kaudu siganaal juab LuxU valgu vahendusel regulaatorvalgule LuxO. Madalal rakutihedusel, kui AI-1 ja AI-2 kontsentratsioon on madal, kituvad LuxN ja LuxPQ kinaasidena, mis fosforleerivad regulaatori LuxO, mis omakorda aktiveerib lux-operoni negatiivse regulaatorvalgu. Krgematel AHL kontsentratsioonidel kituvad LuxN ja LuxPQ fosfataasidena. Selle tulemusena kandub fosfaatrhm LuxO-lt LuxU vahendusel LuxN ja LuxPQ, kus fosfaatrhm hdrolsitakse. LuxO defosforleerimine inaktiveerib valgu ja rakud ei ole enam vimelised snteesima lux-operoni repressorit. Transkriptsiooni aktivaator LuxR (V. harveyi LuxR-tpi valk erineb V. fisheri LuxR valgust) kivitab luxoperoni ekspressiooni. AHL sntees. AHL molekul koosneb homoseriinlaktoon rngast ja atsl-klgahelast. Homoseriin snteesitakse paljudes bakterites kui meteoniin-lsiin-treoniin biosnteesiraja vaheprodukt, kuid bakterid ei ole vimelised homoseriini (vi ka homoseriinlaktooni) jki llitama AHL struktuuri. Homoseriinlaktoon rnga snteesiks vajalik komponent adenoslmeteoniin (AdoMet) snteesitakse meteoniinist ja ATP-st valgu MetK (AdoMet sntetaas) vahendusel. AHL snteesiks vajalik klgahel saadakse rasvhapete biosnteesil tekkivast atsl-ACP. Atslklgahel vib olla erineva pikkusega ja sisaldada erinevaid funktsionaalseid rhmasid (=O; -OH). Erinevused klgahelas annavad AHL molekulile spetsiifilisuse, mis vimaldavad tema seondumise ainult teatud kindla retseptorvalguga. Enamikel bakteritel osaleb AHL molekulide snteesil LuxI tpi valgud, mida nimetatakse ka AHL-sntetaasideks. Nimetatud valk kasutab snteesiks S-adenoslmetioniini ja atslrhma doonorina atslatsl kandjavalku (acyl-ACP). Analoogiliselt rasvhapete snteesile, toimub AHL snteesi esimeses etapis atsl-ensm kompleksi moodustumine, milles ensmi tssteiini vi ka seriini jgid on atslrhma aktseptoriks. Nii AdoMet kui ka atsl-ACP sonduvad AI-sntetaasiga. Toimub atsl-rhma seondumine AdoMet lbi amiidsideme moodustumisele atsl- ja aminorhma vahel. Atsl-AdoMet vahehendi laktonisatsiooni tulemusena tekivad vastav AHL ja 5`-metltioadenosiin. AI-2 (furanoslboraatdiester) snteesi lhtehendiks on S-adenoslmeteoniin, millest rakus snteesitakse le mitme vahehendi S-riboslhomotssteiin (SRH). SRH-st snteesitakse LuxS (a zinc metaaloenzyme) vahendusel 4,5-dihdroks-2,3-pentaandioon(DPD), millest peale mningasi mberkorraldusi saadakse AI-2. Quorum sensing teistes bakterites. Lisaks lux-operonide regulatsioonile erinevates Vibrio liikides, toimib AHL vahendatud regulatsioon vga erinevates bakterites. Nii niteks on QS kirjeldatud ka patogeenis P. aeruginosa. Nimetatud patogeen omab kahte QS ssteemi, LasI/LasR ja RhlI/RhlR RhlI mrab N-butrl-AHL ja LasI N-heksanol-AHL snteesi. LasR ja RhlR nol on meil tegemist LuxR-tpi regulaatoritega. Nende kahe QS ssteemi vahel valitseb omavaheline hierarhia, kus LasR/LasI kontrollib RhlR/RhlI ssteemi td. Lisaks sellele on QS-ssteem seotud veel mitmete teiste regulatsiooni ssteemidega (niteks kahekomponendiline regulatsiooni ssteem GacA/GacS). Selline koordineeritud virulentsusfaktorite sntees vimaldab patogeenil vltida peremeesraku kaitsemehhanismide kivitumist infektsiooni varases staadiumis kui patogeeni arvukus nakatumiskohas on veel madal. Paljudes bakterites reguleerib QS ka plasmiidide lekannet. Nii niteks A. tumefaciens tvedes on Ti-plasmiidide lekanne reguleeritud TraR/TraI ssteemi poolt. Lisaks sellele kuulub siia ssteemi TrlR valk, mis blokeerib AHL madal kontsentratsioonil aktiivse AHL-TraR kompleksi teket. Rakkude ellujmine statsionaarses kasvufaasis sltub paljuski nendes toimuvate fsioloogiliste protsesside igeaegsest mberkorraldamisest. heks esimeseks tendiks selle kohta, et QS-ssteem vib signaliseerida rakkude judmisest statsionaarsesse kasvufaasi oli statsionaarse kasvufaasi sigmafaktori S ekspressiooni seoses QS-ssteemi siganaalmolekuli homoseriinlaktooniga. S, geeni rpoS produkt (tuntud ka kui RpoS) on ks olulisi faktoreid nende geenide avaldumiseks, mida bakterid vajavad tingimustes, kus nende kasv on prsitud. Lisaks

sellele on paljudes mikroorganismides antimikroobsetaktiivsust omavate hendite produktsioon reguleeritud QSssteemi poolt (mupirotsiin P. aeruginosa`s, -laktaam antibiootik karbapeneem). 5. KAHEKOMPONENDILISED REGULATSIOONISSTEEMID. Selleks et muutuvates keskkonna tingimustes ellujda, peavad bakterid rakus toimuvaid fsioloogilisi protsesse mberkorraldama vastavalt toimunud muutustele. he vimalusena hankida informatsiooni muutuste kohta mbritsevas keskkonnas, kasutab bakter nn. kahekomponendilisi regulatsioonissteeme. Vastavat protsessi nimetatakse signaalseks transduktsiooniks. Stiimuliteks, mida tunnetatakse kahekomponendiliste ssteemide abil, on niteks pH, osmolaarsus, kemoatraktandid ja repellandid (eemaletukajad), taimepatogeenide puhul taime pinnal kahjustatud kohtades sisalduvad signaalmolekulid. Kahekomponendiline ssteem koosneb sensorist (sageli on selleks histidiini kinaas) ja tstoplasmas asuvast vastuvtvast (response) regulaatorist. Vliskeskkonna stiimuli tunneb ra sensorvalgu N-terminaalne domeen. Selle tulemusena muutub sensori aktiivsus. Niteks histidiini kinaasi puhul toimub autofosforleerumine, kus ATP-lt kantakse fosfaatrhm le konserveerunud histidiini jgile valgu C-termiaalses transmitter-domeenis. See omakorda on signaaliks tstoplasmaatilisele vastuvtvale regulaatorile. Regulaatori N-terminaalses vastuvtvas (receiver) domeenis asub konserveerunud aspartaatjk. Fosfaatrhm kantakse sensorvalgult regulaatori aspartaadile. Sensorid on tavaliselt transmembraansed valgud. Ekstratstoplasmaatiline domn vastutab signaali vastuvtu eest vliskeskonnast. Sellele jrgneb tnu sensori autokinaasele aktiivsusele valgu lekandemoodulis oleva konserveerunud histidiini fosforleerumine. Sensor/kinaasi lekandemoodulilt kantakse fosfaatrhm vastuvtva regulaatori konserveerunud aspartaadi jgile. Regulaatori fosforlimine phjustab konformatsioonilisi muutusi vljunddomnis. Viimane tavaliselt vimaldab valgul seonduda DNA-ga. Kahekomponendiliste regulatsioonissteemide aktiivsust prsivad fosfataasid. Paljudes kahekomponendilistes regulatsiooni ssteemides omavad sensorid nii kinaasset kui ka fosfataasset aktiivsust (EnvZ). Teatud juhtudel vib aga regulaator olla aktiivne just defosforleeritud kujul. Sensorid vib vastavalt nende paiknemisele rakus jagada kahte klassi: membraansed valgud, omavad transmembraanset domni (EnvZ) ja tstoplasmaatilised valgud (NtrB; CheA). Vatavalt struktuurile vib sensorid jagad nn. klassikalised sensorid, mis sisaldavad sisend ja lekande domni. Teise rhma moodutavad nn. hbriidsed sensorid, mis sisaldavad veel liskas regulaatorile sarnast vatuvtudomni. Vastuvtvad regulaatorid jaotatakse nelja rhma: tpilsed DNA-ga seonduvad transkriptsiooniaktivaatorid (OmpR), konserveerunud jrjestus C-terminuses, mis erineb OmpR-ist (Bvg; NalR), NtrC, NifA perekonna valgud, valgud millel on ainult sisenddomn (CheY). Kirjeldatud on ka hekomponendilisi signaali lekandessteeme. Niteks Vibrio cholerae transmembraanne ToxR valk. ToxR tunneb ra raku vliseskkonna signaali, mille tulemusena ta aktiveerub ning seondub seejrel tstoplasmaatilise domeeniga virulentsusgeenide promootorregiooniga. Anorgaaniliste lmmastikhendite assimilatsioon Looduses olev anorgaaniline lmmastiku hend, mida bakterid saavad kasutada orgaaniliste hendite (aminohapped) snteesiks, on ammonium. Ammoniumi puudumisel keskkonnas vib organism kasutada lmmastiku allikana ka histidiini vi proliini. Ammoonium on otseseks substraadiks ainult vheste aminohapete (glutamaat, alaniin, aspartaat) snteesil. Nimetatud aminohappeid kasutab organism lejnud aminohapete snteesil aminorhma doonorina ketohapete prekursorite transamineerimisel. Ammooniumi assimileerimisel vajalikud ensmid on glutamaadi dehdrogenaasid (GDH), glutamiini sntetaas (GS) ja glutamaadi sntaas (GOGAT). Alaniini ja aspartaadi snteesil osalevad alaniini dehdrogenaas ja aspartaas. Philine hend, mida snteesitakse, on siiski glutamaat. Bakterid vivad kasutada ammoniumi assimilatsiooniks erinevaid metabolismiradu: 1. Kui ammoniumi kontsentratsioon keskkonnas on madalam kui 1 mM on GDH poolt lbiviidava reaktsiooni tasakaal nihutatud, mistttu glutamaadi snteesi enam ei toimu. Nendes tingimustes aktiveeritakse seni osaliselt inaktiivne GS. Viimane katalsib glutamiini snteesi, glutamiini hulk rakus tuseb ja sellest snteesitakse glutamaadi sntaasi GOGAT toimel glutamaat (reaktsioonis osalevad glutamiin, -ketoglutaraat ja NADPH). 2. Ammooniumi lehulgas domineerib glutamaadi sntees -ketoglutaraadist ja ammooniumist glutamaadi dehdrogenaasi GDH toimel, kasutades NADPH-d. Vhesel hulgal snteesitakse ka glutamiini sntetaasi GS toimel glutamiini (glutamaat + ammoonium, toimub ATP hdrols) NtrB/NtrC ssteem ammooniumi assimileerimise regulatsioonis Selleks, et vimalikult tpselt reguleerida siin osalevate geenide ekspressiooni, on ammoniumi assimilatsioonis osalevad geenid allutatud kahekomponedilise regulatsiooni ssteemi GlnL / GlnG kontrollile. Kahekomponendilise regulaatorssteemi geenidega hes operonis paikneb ka glutamiini sntetaasi kodeeriv geen glnA. GlnL on tuntud ka nimetuste all NtrB ja NRII ning GlnG asemel kasutatakse sageli nimetusi NtrC ja NRI. Enamlevinud on siiski nimetused NtrB ja NtrC.

Bakterites toimub lmmastiku assimilatsioonil osalevate valkude aktiivsuse kontroll ka biokeemiliste mehhanismide abil. Bakteri rakkudes olev adenlltransferaas (GlnE) on bifunktsionaalne ensm, mis vib glutamiini sntetaasi (GlnS) trosiinijgile adenlrhma kas le kanda vi elimineerida. Selles protsessis osaleb ka valk GlnD, millel on uridlltransferaasi (UT) aktiivsus ja uridllrhma krvaldav (UR) aktiivsus. Madalatel glutamiini kontsentratsioonidel toimub selle valgu mjul uridllrhma lekanne valgule PII, glutamiini kontsentatsiooni tustes aga toimub vastupidine protsess. Adenleeritud GlnS-i vorm on inaktiivne. Selle vormi tekkimist soodustab valk PII see vorm, mis ei sisalda uridllgruppi. Lisaks biokeemilisele regulatsioonile toimub ammoniumi assimilatsioonil osalevate geenide kontroll ka transkriptsiooni tasemel. Juhul, kui N-allikat on bakterite kasvukeskkonnas piisavalt, toimub transkriptsioon nrkadelt 70-sltuvatelt promootoritelt glnAp1 ja glnLp. Lmmastikuallika kontsentratsiooni langedes aktiveerib fosforleeritud NtrC-P transkriptsiooni glnAp2 geeni 54-sltuvalt promootorilt. NtrC fosforleeritakse sensorvalgu NtrB poolt. NtrB-l on bifunktsionaalne valk, millel on nii autokinaasi kui ka fosfataasi aktiivsus, mida kontrollib bifunktsionaalne ensm PII. UT aktiivsus on stimuleeritud N-vaeguse korral, kus glutamiini kontsentratsioon on rakus madal ja -ketoglutaraadi kontsentratsioon krge. Selle tulemusena tekib PII uridleeritud vorm UMP-PII, mis stimuleerib NtrB-l kinaasi aktiivsust ja NtrC fosforleeritakse. Krgel ammooniumi kontsentratsioonil domineerib PII UR-aktiivsus. UR-aktiivsusega valk interakteerub NtrB-ga, stimuleerides NtrB fosfataasset aktiivsust, mille tulemusena NtrB defosforleerib NtrC. Bakteris Klebsiella pneumoniae on nitrogenaasi snteesi eest vastutavad geenid nifHDK samuti fosforleeritud NtrC poolt aktiveeritavad. N-limitatsioonis aktiveerib NtrC-P nifA transkriptsiooni ning NifA omakorda nifHDK geenide transkriptsiooni. NtrB/NtrC poolt on kontrollitud ka selliste operonide transkriptsioon nagu niteks hutoperon, mis kodeerib histidiini utiliseerimist ja put-operon, mis kodeerib proliini utiliseerimist. 6. BAKTERIRAKU STRUKTUUR JA FUNKTSIOONID Nukleoidid Enamikes bakterites lokaliseerub DNA tstoplasma piirkonnas, mis on tstoloogiliselt erinev regioon, kuid mis ei ole lejnud tstoplasmast eraldatud tuumamembraaniga. Vastavat piirkonda nimetatakse nukleoidiks. DNA on rakus kokkupakitult mitmesuguste histooni-sarnaste valkude osavtul. Tnapeva avardunud mikrosoopia vimalused kirjeldavad DNA-valk kompleksi bakteris kui nn. koralli-sarnast struktuuri. Tnapeval on selgunud, et multiploidsus on iseloomulik ka bakteritele. Krge kromosoomi koopiate arv rakus on seotud rakkude kiire kasvamise ja jagunemisega. Rakkudes on kirjeldatud ka terve rida valke ParB/SpoOJ mis osalevad mitoosi sarnases protsessis, mis tagab nukleoidide oriC piirkonna liikumise raku poolustele. Bakterirakus on leitud kahte tpi nukleaarkehasid kestaga seotud nukleoidid ja vabad nukleoidid. Kestaga seotud nukleoid sisaldab lisaks DNA-le RNA-d, valke, lipiide ja peptidoglkaani. Vaba-nukleoid sisaldab vhem mitte-DNA komponente. E. coli genoom on pakitud nukleosoomi sarnasesse struktuuri, mille koosseisus on kirjeldatud 12 erinevat valku. HU - on eukarootsete histoonide prokarootne homoloog, mis koos Fis valguga on ks philisi nukleoidi komponente. HU valgud koosnevad kahest 10kDa alahikust, HU- ja HU- Teoreetiliselt peaks olema DNA-ga seondunud ks HU dimeer iga 300 400 bp tagant. Fis - on vike aluseline DNA-ga jrjestusspetsiifiliselt seonduv valk, mis kirjeldati esmalt lhikeste DNA piirkondade inversioonil (viburite faasi variantsioonil). Fis on oluline ka eksponentsiaalses faasis tugevalt ekspresseeruvate geenide (rRNA ja tRNA geenid) transkriptsioonil ja DNA replikatsioonil. Fis on kasvavates rakkudes heks philiseks nukleoidiga assotsieeruvaks valguks. Kui statsionaarses kasvufaasis olevad rakud klvata rikkale-stmele, suureneb Fis molekulide arv rakus 100-lt 50000-le. H-NS - on globaalne transkriptsiooni repressor, mis kontrollib le 35 geeni ja operoni td, sealhulgas ka jrjestus-spetsiifilises rekombinatsioonis osalevate geenide ekspressiooni. CbpA (curved DNA-binding protein A) seondub DNA-ga mittespetsiifiliselt ja on detekteeritav alles hilises statsionaarses faasis. 36 tunni vanuses rakukultuuris on seda valku 3% totaalvalgust, mis teeb ligikaudu 15000 valgumolekuli raku kohta. CbpB (Rob) (curved DNA-binding protein B, right origin binding protein) ekspresseerub maksimaalsel tasemel eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes, kus teda on le 10000 molekuli raku kohta. Statsionaarse faasi rakkudes vheneb CppB hulk 60%-le maksimaalsest tasemest. Selle valgu osalust on nidatud nii transkriptsiooni kui ka replikatsiooni kontrollis. DnaA (DNA-binding protein A) on DNA-ga jrjestus-spetsiifiliselt seonduv valk, mis on olulise thtsusega DNA replikatsiooni initsiatsioonil, kuid kitub paljudel juhtudel ka transkriptsiooni aktivaatorina vi repressorina. DnaA-d on rakus 900 2700 molekuli: maksimaalne kontsentratsioon on tuvastatav eksponentsiaalse faasi keskmises osas ning teine kontsentratsioonitus ilmneb statsionaarses faasis. Dps (DNA-binding protein from starved cells) rakusisene hulk on maksimaalne (150000 200000 molekuli raku kohta) statsionaarses faasis vi oksdatiivse stressi korral. Selle valgu seondumine DNA-ga nib toimuvat mittespetsiifiliselt. Eksponentsiaalse faasi rakkudes on ligikaudu 6000 Dps molekuli raku kohta. Valgu hulk suureneb statsionaarse faasi kigus.

Hfq (host factor for phage Qb ), tuntud ka faktori i nimetuse all, seondub nii DNA-ga kui ka RNA-ga. Seondumine on mittespetsiifiline, kuid toimub eelistatult paindunud DNA-le. Eksponentsiaalses faasis on Hfq-d ligikaudu 55000 molekuli raku kohta. Statsionaarses faasis valgu hulk langeb jrk-jrgult, judes tasemeni, mis vastab 1/3-le maksimaalsest. Lisaks DNA-le on Hfq assotsieerunud ka ribosoomidega ning kontrollib mitmete mRNA-de translatsiooni (niteks statsionaarse faasi sigma faktorit kodeeriva rpoS mRNA ja DNA mismatchreparatsiooni ensmi MutS kodeeriva mutS mRNA translatsiooni). IciA (inhibitor of chromosome initiation A) seondub spetsiifiliselt 3-le 13 nt pikkusele kordusjrjestusele DNA replikatsiooni alguspunkti oriC piirkonnas ning inhibeerib DNA replikatsiooni initsiatsiooni, blokeerides DnaA poolt vahendatud DNA ahelate lahtisulamise oriC regioonis. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 400 IcaA dimeeri ja statsionaarses faasis on IcaA hulk langenud 250 dimeerile. IHF (integration host factor) seondub DNA-ga spetsiifiliselt heterodimeerina. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on le 12000 IHF-i monomeeri raku kohta ning IHF-i hulk hakkab tusma rakkude kasvu aeglustumisel, judes statsionaarses faasis 55000 monomeerini raku kohta. Sgavamas statsionaarses faasis langeb IHF-i hulk poolele maksimaalsest vrtusest. IHF on DNA-d tugevalt painutav valk, mistttu tema seondumine DNA-ga on nii struktuurse kui ka funktsionaalse thtsusega. IHF osalust on nidatud nii transkriptsiooni aktivatsiooni regulatsioonil, DNA replikatsiooni initsiatsioonil kui ka geneetilise materjali mberkorraldustel. E. coli IHF-defektsete mutantide puhul on mningates ssteemides theldatud IHF-i funktsiooni komplementeerimist HU poolt. Lrp (leucine-responsive regulatory protein) on globaalne transkriptsiooni regulaator mis kontrollib nii positiivselt kui ka negatiivselt rohkem kui 75 geeni transkriptsiooni. Kasvavates rakkudes on 1200 1300 Lrp dimeeri, kuid statsionaarse faasi rakkudes langeb nende hulk 10 korda. Vrreldes rikka stmega on minimaalstmel kasvates rakkudes Lrp hulk ligikaudu 2,5-korda krgem. Nlgivates rakkudes aktiveeritud geenide puhul toimib Lrp positiivse transkriptsiooni faktorina. StpA (supressor of td mutant phenotype A) on H-NS-i homoloog, mis avastati faagi T4 td fenotbi supressorina. StpA on vimeline komplementeerima H-NS-i mutante. Eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes on 25000 StpA molekuli raku kohta, statsionaarse faasi rakkudes 8000 10000. Rakupind Rakupind kaitseb raku sees paiknevaid komponente vliskeskkonna kahjuliku toime eest. Enamike bakterite rakupinda katab kristallilise struktuuriga S-kiht. S-kiht koosneb tavaliselt kas valgulistest vi glkoproteiinsetest subhikutest. Rakupinna ehitus varieerub erinevatel bakteritel mrkimisvrselt. Gram (+) bakteritel on S-kiht seotud peptidoglkaan kihiga vi sellega seotud sekundaarsete rakuseina polmeeridega. Gram (-) bakteritel on S-kiht seotud vlismembraani lipopolsahhariididega. Tavaliselt sisaldavad selles kihis paiknevad valgud rohkesti happelisi ja hdrofoobseid aminohappeid, vhe on neis leitud arginiini, histidiini ja meteoniini. S-kiht tidab erinevaid funktsioone bakterites, sealhulgas osaleb ta rakkude kinnitumisel pindadele vi peremeesorganismi rakkudele (nit. patogeenide puhul). Rakukest 1884-ndal aastal mrkas taani mikrobioloog Christian Gram, et bakterirakkude vrvimisel kristallvioletiga silus osadel bakterirakkudel vrvus ka prast rakkude ttlemist 95%-lise etanooliga. Vastavaid baktereid hakati nimetama grampositiivseteks. Neid baktereid, mille rakkudelt nnestus vrv etanooliga maha pesta, nimetatakse gramnegatiivseteks bakteriteks. Vrreldes grampositiivsete bakteritega on gramnegatiivsete bakterite raku pinnaehitus mrksa komplekssem. Mlemat tpi bakteritel on mureiinkesta philiseks komponendiks peptidoglkaan. Archaedel moodustab rakukesta pseudomureiin ja sellega seotud S-kiht (koosneb valkudest ja glkoproteiinidest). Paljudel Archedel on S-kiht ainuke pinna struktuur, mis paikneb vljaspool plasma-membraani. Gram (+) bakteritel on eristatavad rakukest ja rakumembraan. Nende rakukest koosneb paljudest peptidoglkaani kihtidest. Peptidoglkaan on lineaarne polmeer, mis koosneb -1,4-N-atsetlglkosamiinist (NAG) ja Natsetlmuraamhappest (NAM), mis on omavahel hendatud -1,4-glkosiidsidemega. Ahelad on omavahel hendatud vrgustikuks. NAM piimhappe jgiga on seotud kindlatest aminohapetest koosnev tetrapeptiid. Ahelas oleva diaminohappe aminorhma ja naaberahela tetrapeptiidi terminaalse D-ala karbokslrhma vahel moodustub peptiidside. Selliselt tekkiv vrgustik annab bakterirakule kindla ja psiva kuju. Lbi peptidoglkaani kihtide ulatuvad lipoteihohappe molekulid, mis on suunatud membraani pinnale. Gram (-) bakteritel on suhteliselt huke peptidoglkaan-kiht. See-eest on neil kaks membraani vlis- ja sisemembraan, mille vahel on periplasmaatiline ruum. Periplasmaatiline ruum ei ole thi. Seal asuvad mitmed ensmid ja muud valgud (hdroltilised ensmid, retseptorid, transporti vahendavad valgud). Mureiinhdrolaasid Peaaegu kik bakterid snteesivad ensme, mis hdrolsivad erinevaid sidemeid peptidoglkaani struktuuris. 1. Glkaanahelat hdrolsivad ensmid 2. Peptiidahelaid hdrolsivad ensmid Endo-N-atsetlmuramidaasid 3. N-atsetlmuramol-L-alaniin amidaas Endo-N-atsetlglkoosamidaasid Hdrolsib sidet glukaan- ja peptiidahela vahel.

Eelpool loetletud ensmid omavad rolli rakkude kasvamisel, jagunemisl, kompetentsuse saavutamisel transformatsioonil ja ka toksiinide ning eksoensmide sekretsioonil. (Osa autoreid seostab neid ensme ka apoptoosiga ebasoodsates keskkonnatingimustes). Peptidoglkaani sntees. See on mitmeastmeline protsess, mille erinevad etapid toimuvad tstoplasmas, membraanidel ja ka periplasmas. Polmeeri phikomponendid NAM ja NAG snteesitakse tstoplasmas. Esmalt liidetakse Natsetlglkoosamiin-1-P (GlcNac-1-p) molekulile UTP, mille tulemusena moodustub UDP-GlcNAc. Osa UDPGlcNAc muudetakse UDP-N-atsetlmuraamhappeks (UDP-MurNAc). Viimasele liidetakse jrjest aminohapped L-Ala, D-Glu, m-DAP ja lpuks D-Ala dimeer. Peptiidsidemete sntees kasutab ATP energiat. Lpptulemusena saadakse UDP-N-atsetlmuramolpentapeptiid. Edasised reakstsioonid toimuvad lipiidsekandja (undekaprenlfosfaat) pinnal. Kasvavas rakus toimub pidevalt peptidoglkaani osaline lhkumine ja asendamine uue materjaliga. Peptidoglkaani snteesi eest vastutavad geenid paiknevad E. coli kromosoomis htse suure klastrina. Selles piirkonnas paiknevad geenid murC, murD, murE, ddl, murF, mraY ja murG osalevad peptidoglkaani snteesi erinevatel etappidel, mille tulemusena UDP-GlcNAc-st moodustub undekaprenl-UDP-Natsetlmuramolpentapeptiid. murC L-alaniin liitmine murD D-glutamaadi liitmine murE diaminopimelaadi liitmine ddl D-alaniin: D-alaniin ligaas murF D-alanl-D-alaniini liitmine mraY UDP-N-atstlmuramolpentapeptiidtransferaas murG N-atsetlglkoosaminltransferaas Teihoehape ja lipoteihoehape. Teihoehapet on leitud ainult gram(+) bakterites. Teihoehape on polmeer, mis koosneb kas ribitoolfosfaadi vi gltseroolfosfaadi monomeeridest, mis on omavahel seotud fosfodiestersideme kaudu. Teihoehappega vivad olla seotud suhkrud ja aminohapped. Teihoehappe molekulid on kovalentselt seotud peptidoglkaaniga. Teihoehappe molekulid ulatuvad raku pinnale ja on olulised antigeensed determinandid. Lipoteihoehape (LTA) on membraanseoseline polmeer, milles 16-40 omavahel fosfodiestersidemega seotud gltseroolfosfaadi jki on kovalentselt seotud membraanides olevate glkolipiididega. LTA heks fsioloogiliseks rolliks on autolsiini produktsiooni regulatsioon. Membraanid. Nii gram (+) kui ka gram (-) bakterite membraani phikomponentideks on fosfolipiididest ja lipopolsahhariididest koosnev lipiidne kaksikkiht. Gram (-) bakteritel on vlismembraan kovalentselt seotud peptidoglkaan kihiga. Lipiidne kaksikiht on asmeetriline: vline kiht koosneb valdavalt lipopolsahhariididest, sisemine kiht aga fosfolipiididest. Lipopolsahhariidses komponendis vib eristada kolme regiooni. Gram (-) bakteritel paiknevad vlismembraanis spetsiifilised valgud poriinid -, mis on vajalikud mitmesuguste molekulide transpordiks lbi vlismembraani periplasmaatilisse ruumi. Hdrofiilsed komponendid suurusega kuni 600 700 Da (suhkrud, aminohapped, mitmed ioonid) lbivad poorid passiivse difusiooni teel. Mned poriinid osalevad ainult teatud kindlate metaboliitide liikumisel lbi vlismembraani. Lipopolsahhariid (LPS) koosneb kolmest elemendist O-antigeenist (koosneb erinevatest suhkrutest), oligosahhariidsest sdamikust (koosneb sisemisest ja vlimisest kihist) ja lipiid A-st (koosneb D-glkoosamiini dimeeridest, mille hdrokslrhmad on asendatud rasvhapetega). Kik kolm komponenti snteesitakse eraldi ja seejrel ligeeritakse kokku ning transporditakse vlismembraani. O-antigeen on heteropolmer, mis koosneb korduvatest trisahhariidsetest hikutest, mis sisaldavad N-atsetl-Dglkoosamiini, N-atsetl-D-mannoosaminuroonhapet ja 4-atseetamido-4,6-dideoks-D-galaktoosi. E. coli oligosahhariidse sdamiku vlimise osa snteesi eest vastutavad geenid paiknevad rfaKJIGB operonis, sisemise osa snteesis osalevad geenide rfaC,D produktid. Lipiid A sntees toimub 3 etapis: 1. UDP-GlcNAc atsleerimine, 2. disahhariidi moodustumine, 3. KDO (2keto-3-deoksoktlosoonhape) lekanne ja atsleerimine. Tstoplasmaatiline membraan. Tstoplasmaatiline membraan takistab ainete vaba difusiooni tstoplasmasse. Membraan koosneb fosfolipiidide kasikkihist, millega on seotud valgud. Valgud paiknevad mosaiikselt, kusjuures osa valke lbib membraane. Kaua aega ksitleti rakumembraani kui struktuuri, mille lbi toimub ainete diffusioon tnu pH ja ioonseju erinevusele tstoplasma ja vliskeskkonna vahel. Rakumembraan on vajalik osmootse barjri kujunemiseks ja ainete valikulise lbilaskvuse tagamiseks. Lisaks sellele toimuvad siin veel mitmed raku elutegevuse jaoks thtsad protsessid: oksdatiivnefosforleerimine, raku seina biosntees, fosfolipiidide biosntees, ekstratsellulaarsete ensmide sekretsioon. Rakkude jagunemisel seonduvad replitseerunud DNA molekulid spetsiifiliste retseporsaitidega, mis tagab nende sattumise mlemasse ttarrakku.

Periplasma. Gram (-) bakteritel paikneb sise- ja vlismembraani vahel nn. periplasmaatiline ruum. Praeguseks on nidatud, et see ruum on tidetud periplasmaatilise geeliga, mille phiosa koosneb peptidoglkaanist. Mesosoomid. Paljude gram(+) bakterite rakumembraanis on leitud erinevaid membraanseid-struktuure, mis on nhtavad elektronmikroskoobis. Neid struktuure on hakatud nimetama mesosoomideks. Nitromonas europaea ja teised nitrifitseerivad bakterid omavad selgelt eristatavaid membraanseid ssteeme. Selliste membraansete organellide esinemine nitrifitseerivates organismides (muudavad NH4+ NO2- ja NO3) on ilmselt kuidagi seotud energia omastamisega nendes protsessides. Praeguste teadmiste kohaselt on nende membraansete struktuuride seos vastavate oksdatsiooni-protsessidega testamata. Kapsel. Bakterirakk on lisaks rakukestale sageli mbritsetud lima vi ka kapsliga. Kapsel koosneb tavaliselt polsahhariidist on kirjeldatud nii homo- kui ka heteropolsahhariidseid kapsleid. Paljudel E. coli tvedel koosneb kapsel kolaanhappest e. M- antigeenist. Pneumokokkidel moodustab kapsli polsahhariid, mis koosneb glkopranoosi ja glukuroonhappe jkidest, mis on omavahel seotud -1,3- ja -1,4-sidemetega. 7. BAKTERITE JAGUNEMINE Selles peatkis ksitleme protsesse, mis on vajalikud rakkude normaalseks jagunemiseks. Rakkude jagunemisele eelneb rakus oleva DNA kahekordistumine e. replikatsioon. Sellele jrgneb mitmeasmeline protsess, mis tagab rakuvaheseina snteesi ja selle lppedes kahe ttarraku moodustumise. DNA replikatsioon. Nagu juba eespool mainitud toimub vahetult enne rakkude jagunemist DNA replikatsioon, mis kindlustab mlemad ttarrakud geneetilise materialiga. Rakkudes toimub DNA replikatsioon poolkonservatiivse mudeli jrgi. DNA snteesi viib lbi DNA polmeraas III, kasutades selleks olemasolevat DNA ahelat. E. coli on kirjeldatud viit erinevat DNA-polmeraasi: Pol I (polA), Pol II (dinA), Pol III (dnaE), Pol IV (dinB) ja Pol V (umuDC). DNA sntees toimub 5`3`suunas ja ensm vajab snteesi alustamiseks vaba 3`OH rhmaga praimerit. DNA polmeraas III on philine bakteri DNA replikatsioonil osalev ensm. Multiensmkompleks on V- kujuline, sisaldab 2 apoensmi, lejnud subhikutes on erinevusi. Apoensmi moodustavad subhikud a, e ja q. E. coli tve K-12 kromosoom on 4639221 bp pikkune. Bakteri kromosoomi replikatsioon algab teatud kindlast piirkonnast, mida nimetatakse oriC ja toimub mlemas suunas. Kogu genoomi replikatsiooniks (C periood, eukarootidel vastab sellele S-faas) kulub 40 minutit. Replikatsiooni terminatsioonijrgselt toimub ttarmolekulide dekatenatsioon ja jaotumine, rakuvaheseina moodustumine ning 20 minutit prast replikatsiooni terminatsiooni ttarrakud jagunevad (D periood, eukarootidel vastavalt mitoos ja tstokinees). Seega kulub replikatsiooni initsiatsioonist rakkude jagunemiseni kokku 60 minutit (C + D periood). Aeglaselt kasvavate rakkude puhul (generatsiooniajaga le 60 minuti) eristatakse ka B perioodi(eukarootidel vastavalt G1 faas), kus ttarrakkudes ei toimu seni replikatsiooni, kuni nad on saavutanud teatud suuruse, initsiatsiooni massi. oriC jrjestus on 245bp pikkune ja sisaldab oma koosseisus kolme 13 nukleotiidi pikkust AT rikast jrjestust (L, M, R ja R1) ja nelja 9 nukleotiidi pikkust DnaA-boxi (R1-4). SeqA on replikatsiooni negatiivne regulaator, mis eraldab oriC membraanist (tpsemalt vlismembraanist). SeqA seondumine takistab replitseeruval kromosoomil uue replikatsiooni initsiatsiooni. oriC sisaldab GATC saite, mis on metleeritavad. Kromosoomi replikatsioon initseeritakse ainult selliselt molekulilt, mille mlemad ahelad on metleeritud. Prast replikatsiooni initsiatsiooni jb oriC teatud ajaks ainult hest DNA ahelast metleerituks. Vimalik, et GATC saite aitab hemimetleerituna hoida SeqA. DNA replikatsiooni regulatsioonis osaleb ka nn. datA jrjestus. DatA jrjestus paikneb oriC lheduses ning konkureerib DnaA seondumise prast oriC- jrjestusega. Replikatsioonis osaleva DnaA seondumiseks oriC-le on vajalik mitme nn. abivalgu seondumine oriC piirkonda: HU valk, mis seondub kaksikahelalise DNA-ga ja soodustab DNA paindumist ning DNA ahelate lahtikeerdumist. Lisaks seob oriC DNA-d painutavaid valke IHF ning Fis. oriC piirkonnas paikneb kaks promootorit, mioC, millelt toimub transkriptsioon oriC suunas ning gidA, millelt transkriptsioon oriC suhtes eemaldub. Mis kivitab DNA replikatsiooni? he vimalusena pakutakse vlja, et replikatsiooni initsiatsioon sltub aktiivse DnaA (DnaA-ATP) ja nn DnaA-sltuva initsiatsiooni-hperstruktuuri tasemest rakus. Replikatsiooni terminatsioon toimub replikatsioonikahvlite judmisel jrjestusteni terC ja terB vasakult ning terD ja terA paremalt. Nende kahe regiooni vahe on 275 kb. Lisaks osaleb protsessis valk Tus, mis seostub ter jrjestustega ja blokeerib replikatsioonikahvli liikumiseks vajaliku helikaasi t. Rekombinatsioon dif saitides XerD rekombinaasi toimel tagab ttarmolekulide teineteisest eraldumise, dekatenatsiooni. FtsK valk, mis lokaliseerub jagunevate rakkude vahel moodustuvas rakuvaheseinas, modifitseerib moodustunud Holliday struktuuri sobivaks substraadiks rekombinaasile XerD, mis osaleb replitseerunud kromosoomi dekatenatsioonis.

Divisoomi moodustumine. Enne rakkude pooldumist valgu FtsZ molekulid agregeeruvad ja moodustavad pooldumissaidis tstoplasmaatilise membraani sisepinnale ringi, mis on signaaliks tstokineesile ja rakuvaheseina moodustumisele. Lisaks FtsZ valgule osaleb selle ringstruktuuri moodustamisel veel terve rida nn. abivalkusid, mis inhibeerivad rakkude jagunemist kuid ei mjuta nende pikenemist. Moodustunud ringstruktuuri ja selle komponente nimetatakse divisoomiks. Siia kuuluvad valgud, mis osalevad peptidoglkaani snteesil ja rakkude jagunemisel. Rakkude pooldumisel osalev FtsZ on GTP-aasse aktiivsusega ja sisaldab eukarootsetele tubuliinidele krgelt konserveerunud jrjestusega GGGTGSG sarnanevat jrjestust GGGTGT. Mutatsioonide teke sellesse regiooni viib valgu aktiivsuse kadumisele. Arvatakse, et eukarootne tubuliin on evolutsioneerunud FtsZ-ist. Divisoomi kuuluvad membraanseoseline valk ZipA, aktiini homoloog, mis on vajalik rakkude jagunemiseks. ZipA valk vib tita kahesugust funktsiooni: heltpoolt kitub see kui FtsZ membraaniga siduv valk, teiseltpoolt aga stabiliseerib ta moodustuvat FtsZ polmeeri. Lisaks neile kahele valgule osaleb divisoomi moodustumisel veel terve rida valke FtsQ, FtsL, FtsI, FtsN, FtsK. Kik nimetatud valgud on vajalikud rakuvaheseina moodustumise initsiatsiooni etapis, kuid lisaks sellele osalevad mned neist ka kromosoomi replikatsioonil tekkinud DNA dimeeride lagundamisel. Olulist rolli omab ka valk EnvA, mille puudumine phjustab kiiresti kasvavate rakkude puhul aheldunud rakkude teket (phjuseks on rakkude kasvamine pikkuses kuid kuna ei toimu normaalset vaheseina teket, tekivadki pikad rakkude ahelad). Nimetatud valgu nol on meil tegemist N-atsetlglkoosaminl-L-alaniin amidaasiga, mis lagundab sidet peptidoglkaani molekulis N-atsetlmuraamhappe jgi ja pentapeptiidahela vahel. Rakkude pooldumist mjutavad ka mned antibiootikumid, niteks -laktaamid. Raku pooldumismehhanismide uurimiseks kasutatakse tavaliselt temperatuuritundlikke mutante mis kasvavad normaalselt 30C juures, kuid defektne fenotp avaldub 42C juures. Rakkude jagunemisel osalevad valgud vib jagada kolme suurde rhma. Esimesse rhma kuuluvad valgud, mis osalevad peptidoglkaan mbrise moodustumisel mber kasvava raku. Nende valkude puudumisel omandavad rakud sfrilise kuju ja suurenevad ilma jagunemata. Teise rhma moodustavad valgud, mis on vajalikud arenevale peptidoglkaan mbrisele silidrilise kuju andmiseks. Siia rhma kuuluvad nn. RodA-PBP2 ssteemi valgud. Nimetatud valgud peavad funksioneerima kogu rakupinna ulatuses, v.a. raku poolused. Kolmanda rhma moodustavad valgud, mis on vajalikud uue rakuvaheseina moodustamiseks. Need valgud toimivad rakus perioodiliselt ja ainult rakuvaheseina moodustumise kohal. -laktaam-antibiootikumid phjustavad pikkade multituumsete filamentsete ilma vaheseinteta rakkude tekkimise. heks olulisemaks valguks selles rhmas on PBP3 (geen ftsI), PBP3 on peptidoglkaani transpeptidaas, mis viib lbi peptidoglkaani transglkosleerimise ning ahelate krosslinkimise. Lisaks interakteerub PBP3 ka teiste valkudega FtsA, FtsQ, FtsW ja RodA- peptidoglkaani snteesi regulatsioonis. Arvatakse, et FtsZ interakteerub FtsA-ga, mis seejrel aktiveerib PBP3. Dimeersed valgud PBP2-Rod2 ja PBP3-FtsW osalevad vajalike morfoloogiliste modifitseerimiste lbiviimisel, mis on vajalikud kasvava mureiin mbrise modifitseerimisel. PBP3 ning temaga assotsieerunud valkude toimel moodustub peptidoglkaani kaksikkiht jaguneva raku keskele. EnvA toimel toimub nende kihtide eemaldumine ja sellele jrgneb vlismembraani sissekasvamine.

Rakkude jagunemine on tihedalt seotud kromosoomi replikatsiooniga, sest tekkivad ttarrakud peavad omama ka funktsionaalset kromosoomi. E. coli rakus on terve rida valke, mis osalevad replikatsiooni kigus tekkinud dimeeride lagundamisel. Siin toimivad kaks valku XerC ja XerD jrjestus-spetsiifilised rekombinaasid, protsessis osalevad ka topoisomeraas IV ja geenide parA ja parE produktid. Lisaks on nidatud, et rakuvaheseinas peab olema ka valk FtsK, et saaks toimuda Xer-vahendatud kromosoomide lahknemine. he kontseptsiooni kohaselt toimub tstokinees alles siis, kui duplitseerunud nukleoidid on tielikult lahknenud. Optimaalsel kasvutemperatuuril nukleoidid lahknevad normaalselt ja FtsZ rngas paikneb raku keskel. Krgemal temperatuuril nukleoidide lahknemine ei ole tielik ja FtsZ rngas paigutub rakus asmmeetriliselt. See toob endaga kaasa nukleoidi mittesisaldavate rakkude tekkimise, mis tavaliselt hukkuvad. Rakkude jagunemisel omavad thtsat rolli ka min-operoni valgud. Normaalsetes kasvutingimustes, paikneb vaheseina moodustumise koht tpselt raku keskel. Potensiaalsed jagunemiskohad paiknevad ka raku poolustel, kuid MinC, D ja E valgud blokeerivad nende kasutamise. Kui MinC ja MinD blokeerivad vaheseina moodustumise, siis MinE blokeerib MinC/D toime raku keskel paiknevas pooldumiskohas. MinC ja/vi MinD

mutantid produtseerivad arvukalt minirakke, mis nitab, et jagunev rakk kasutab kiki vaheseina moodustumise kohti. 8. GENEETILISE INFORMATSIOONI LEKANNE BAKTERITES. Konjugatsioon. Konjugatsiooni protsessis toimub DNA lekanne hest bakteritakust teise tnu kahe rakuvahelise agregaadi e. ristuva paari kompleksi (maiting pair formation complex Mpf) tekkele. Selles protsessis vib eristada erinevaid etappe: relaksosoomi teke (valk/DNA kompleks oriT-piirkonnas), DNA translokatsioon (transmembraansete kanalite kaudu), rakk-rakk kompleksi e. agregaadi teke piilide vahendusel. DNA protsessing konjugatsiooni protsessis algab ksikahelalise katkega oriT saidis. Selles protsessis osaleb terve valkude kompleks, mis tagab katkemise T ahelas (lekanduv DNA ahel). DNA 5otsaga seonduvatest valkudest ks thtsamaid on relaksaas, mis vib koos DNA-ga kanduda le retsipientrakku. Lisaks on nidatud, et retsipienti kanduvad le ka valgud, mis ei ole seotud DNA. Selliste valkude hulka kuulub nit. plasmiidi ColIb-B9 Sog-primaas; F ja RP4 lekandel RecA valk. Agrocacterium tumefacisensi T-DNA mutandid on vimelised lekandma VirE2 ja VirF valke taimerakku. See nitab, et konjugatsioonil vib valkude lekanne toimuda sltumatult DNA lekandest. Konjugatsioonil osalevad veel kahte tpi faktorid sidestusvalgud (coupling proteins) ja chaperonid mis on vajalikud DNA ja valguliste faktorite suunamiseks transmembransesse kanalisse kuid ei ole vajalikud relaksosoomi moodustumisel. Sidestusvalgud kuuluvad TraG valkude perekonda; TraG RP4 ja Ti plasmiidides; TrwB R388-s; TraD F-s ja VirD4 T-DNA lekandes. Praeguseks on kogunenud andmeid, et nimetatud valgud osalevad ka paljudes tp IV sekretsiooni ssteemides. Nende funktsiooniks on DNA-valgu kompleksi sidumine transmembraanse kanaliga. Chaperonide hulka kuuluvad niteks VirC1 ja VirC2, mis osalevad T-DNA lekandel. he vimaliku mudeli kohaselt muudavad VirC valgud VirD2 T-DNA kompleksi konformatsiooni sobilikuks transportimiseks lbi kanali taimerakku. Erinevad konjugatsiooni ssteemid kasutavad morfoloogiliselt erinevaid piilisid. F-rhma plasmiidid mravd pikkade (~8nm) painduvate piilide snteesi, mis vimaldavad plasmiidide efektiivset lekannet vedelstmes. IncP, N, W ja Rh1 mittesobivusgruppi kuuluvad plasmiidid ning T-DNA lekandessteem kasutab lhemaid ja jigemaid piilisisd, mis vimaldavad DNA efektiivset lekannet tardstmel. Kui kaua aega arvati, et piilide funktsiooniks on agregaadi tekitamine kahe raku vahel, siis praeguseks on nidatud, et RP4 derivaadid, mis on defektsed pilide snteesi mravate geenide osas, moodustavad agregaate sarnaselt normaalsele RP4-le, kuid DNA lekannet siiski ei toimu. Seega vivad piilid vhemalt osade plasmiidide puhul osaleda aktiivselt ka DNA lekandel. Ka gram (+) bakterites vib toimud plasmiidse DNA lekanne konjugatsiooni protsessis. Enterokokkides on kirjeldatud kahte tpi plasmiide: 1. plasmiidid, mis kanduvad le krge sagedusega pAD1, pPD1, pAM1 jt., 2. plasmiidid, mis kanduvad le ainult filtril ristamisel pAC1, pIIP501 jt. Plasmiidide lekanne on reguleeritud retsipientraku poolt produtseeritud lhikeste oligopeptiidide e. seksferomonide poolt. Plasmiidi pAD1 lekanne algab plasmiidse repressorvalgu valgu TraA inaktiveerimisega. Retsipiendi poolt snteesitav feromon cAD1 interakteerub doonorraku pinnal oleva permeaasiga ning transporditakse rakku. Doonoris moodustub cAD1-TraA kompleks, mis blokeerib repressori seondumise. Sellele jrgneb positiivse regulaatori TraE sntees, mis kivitab teiste konjugatsiooniks vajalike valkude snteesi, sealhulgas ka Asa1 e. agregatsiooni-substantsi produktsiooni. Agregatsiooni substanst on rakupinnal paknev mikrofibrillaarne struktuur, mis on vajalik agregaadi tekkeks doonori ja retsipiendi vahel. Peale plasmiidi lekandumist retsipienti kivitatakse selles inhibiitori iAD1 sntees, mis seob ekstratsellulaarse cAD1 neutraliseerides selle efekti. Transfomatsioon. Geneetilise informatsiooni lekanne bakterirakku ei eelda mitte alati rakkude vahelist kontakti. Griffith avastas 1928 a. fenomeni, mida ta nimetas transformatsiooniks. Mned aastakmned hiljem tstati, et transformatsioonil kandub bakterirakku DNA, mis eelnevalt seondub raku pinnaga, millele jrgneb he DNA ahela sisenemine rakku. Gram (+) bakterites toimub transformatsioon nn. Streptococcus-Bacillus mudeli jrgi. Kompetentsus - faas on lhiajaline ning saavutatakse rakkude poolt teatud kindlas kasvufaasis. Pneumokokid muutuvad kompetenseks kui nende poolt snteesitud kompetentsust-stimuleeriv valk (CPS valk) saavutab keskkonnas teatud kindla kontsentratsiooni. CPS valk seondub tstoplasmaatilises membraanis paikneva retseptoriga, mille tulemusena indutseeritakse rakus kmnekonna transformatsiooniks vajaliku valgu sntees. Sellele jrgnevalt seondub DNA raku pinnal olevate retseptorsaitidega, mida nimetatkse ka transformosoomideks. Sellele jrgnevalt toimub he DNA ahela sisenemine rakku, mis seejrel rekombineerub raku kromosoomiga. Teatud kasvufaasis CPS valk (comC geeni produkt) protsessitakse ning saadud valk transporditakse rakust vlja. Teatud kindlal kontsentratsioonil aktiveerib CPS valk kahekomponendilise regulatsioonissteemi ComD/E vahendusel kompetensus-spetsiifilise operoni comCDE. Nimetatud geenide produktid osalevad transformosoomi

moodustamisel ja lisaks modifitseerivad nad rakuseina selle mber. Kompetensuse teke on veel ks nide quorum-sensingust. Peale DNA ahela sisenemist rakku rekombineerub see kromosoomiga. Vimalikud valesti paardumised krvaldab spetsiifiline Hex-reparatsioonissteem (E. colis oleva MutLS ssteemi analoog). B. subtilises seondub DNA membraanis paiknevate ComEA valkudega ja jb nendega seotuks nii kauaks kuni see transporditakse rakku. B. subtilisel sltub kompetentsus toitainetest, kasvufaasist ja raku tbist. Kompetensuse saavutamine toimub kahes etapis: I etapis snteesitakse kaks feromoni e. quorum sensingu signaali CSF ja ComX. Feromonide teatud kontsentratsioonil kivitatkse ComS valgu sntees; II etapis vastusena ComS valgu snteesile jrgnevalt kivitatakse regulaatorvalgu ComK sntees, mis aktiveerib teiste kompetentsusvalkude snteesi. ComK seondub rakus adaptor valguga MecA ja tekkinud kompleks on rakus degradeeritav ClpCP proteaasi poolt. ComS valgu kontsentratsiooni tustes rakus seostub see valk eelistatult ClpCP proteaasiga ning ComK valgu hulk rakus tuseb. Gram (-) bakteris nagu Neisseria gonorrheae ja Haemophilus influenzae ei ole kompetensus indutseeritud CSF valgu poolt, vaid rakkude vastuvttlikkus DNA-le tuseb kui rakud on judnud statsionaarsesse kasvufaasi. Transformatsioon osades gram(-) bakterites on jrjestus-spetsiifiline. Neisseria transformatsioonil sltub DNA seondumine raku pinnaga spetsiifilise jrjestuse GCCGTCTGAA olemasolust transformeeritavas DNA-s. DNA transpordiks rakku moodustub tp IV piilide sarnane struktuur, milles osalevad tstoplasmaatilises membraanis paiknevad valgud PilD, T, F ja G. Piili ise on moodutunud valgust PilE, mis ulatub raku pinnale lbi PilQ moodustunud poori. DNA transpordiks vajaliku kanali moodustumisel osaleb valk PilC. Haemophilus influenzae ei sekreteeri mingeid kompetentsusfaktoreid. Rakud muutuvad peaaegu 100% kompetenseteks kui nad satuvad C-allika nlga. Kompetensus on sltuv ka cAMP hulgast rakus. cAMP hulga tus rakus aktiveerib ka kompetensuse saavutamiseks vajalike valkude snteesi rakus. Seda reguleerib ka valk Sxy. Kompetentsuse saavutamiseks vajalikud geenid paiknevad comA-comF operonis. Lisaks osalevad siin valgud Por (periplasmas lokaliseeruv valk, mis on vajalik ComA-ComC valkude igeks kokkupakkimiseks) ja DprA (osaleb DNA transpordil lbi tstoplasmaatilise membraani). Efektiivseks transformatsiooniks peab DNA sisaldama spetsiifilist jrjestust AAGTGCGGTCA. Transduktsioon. DNA-d on vimalik bakterirakku lekanda ka faagide abil. Seda protsessi nimetatkse transduktsiooniks. ldisetransduktsiooni vahendusel on vimalik lekanda hest rakust teise suvalist bakteri genoomi osa. Sellisel juhul sisaldab faagi partikkel ainult bakteri DNA-d. Kui rakku sisenemise jrgselt ei toimu DNA integreerumist kromosoomi nimetatkse protsessi abortiivseks-transduktsiooniks. Spetsialiseeritud-transduktsiooni vahendusel kandub le DNA fragment, mis paikneb faagi integratsiooni saidi (att-sait) lheduses. Selle protsessi korral sisaldab rakus moodustunud uus partikkel nii bakteri kui ka faagi DNA-d. 9. ENERGIA TOOTMINE. Energia Kige enam kasutatakse bioloogiliste protsesside lbiviimiseks rakus ATP-sse salvestatud energiat. ATP-d genereeritakse rakus kahel moel: substraadi tasemel toimuva fosforlimise kaudu ja oksdatiivsel fosforleerimisel. Substraatsel fosforlimisel moodustub ATP fosforlrhma lekandmisel ADP-le mnelt makroergiliselt katabolismi vaheproduktilt. EMP rajas moodustub gltseeraldehd-3-P-st 1,3difosfogltseraat. ks fosfaatrhmadest on substraadiga seotud makroergilise sideme abil. 1,3difosfogltseraadist 3-fosfogltseraadi moodustumisel (fosfogltseraadi kinaasi abil) toimub fosforlrhma lekandmine ADP-le ja ATP moodustumine. ATP erilised fsiko-keemilised omadused vimaldavad tal energiat lekanda seda vajavatele ssteemidele. Sellisel juhul on energia lekanne seotud fosforlrhma lekandega. Teistes ssteemides vib energia lekanne olla seotud elektronide ja prootonite lekandega redoksreaktsioonides. Snteesitavate ATP molekulide arv sltub sellest, millist katabolismi rada ssivesikute lagundamiseks kasutatakse. Nii tekib pentooside fermentatsioonil he mooli pentoosi kohta 2 mooli ATP kui vahehendina tekib atsetlfosfaat. Fosfoketolaas lagundab pentoosi atsetlfosfaadiks ja gltseeraldehd-3-P. Atsetlfosfaat vidakse muuta atsetaatkinaasi vahendusel atsetaadiks, mille kigus vabaneb 1 mool ATPd. Gltseeraldehd-3-P vidakse lagundad EMP rada md, mis annab veel 2 mol ATP-d. Mitmed bakterid snteesivad ATP-d membraansel e oksdatiivsel fosforleerimisel. Selles protsessis energia salvestatakse rakumembraaniga seostunud ATPaasi abil anorgaanilise fosfaadi liitmise teel ADP molekulile Prootonite H+ ning elektronide lekandmisel metabolismiradade (niteks glkolsi ja tsitraaditkli) vahehenditelt membraanseoseliste tstokroomide abil tekib rakumembraani sise- ja vlisklje vahele elektrokeemiline gradient. Prootonid vi elektronid, mis on rastatud oksdeeritavatelt substraatidelt sisenevad ETAsse (orgaaniliste ainete oksdatsiooni puhul on nende doonoriks NADH) ja nende terminaalseks elektronaktseptoriks aeroobsetes tingimustes on hapnik, anaeroobsetes tingimustes aga niteks nitraat. ETA kuuluvad flavoproteiinid, FeS-valgud, kinoonid ja tstokroomid. Elektronide transportimisel vabanenud energiat kasutatakse prootonite rakust vljapumpamiseks. Sel viisil tekkinud elektrokeemilist potentsiaali (laengu ja pH

erinevust), mida nimetatakse ka prootonpotentsiaaliks (proton motive force) kasutatakse ATP genereerimiseks. Energia hulk, mis saadakse membraansel fosforlimisel sltub elektroni doonori ja aktseptori loomusest. ks paremini uuritud elektrontranspordi ahel (ETA) on E. colil. Selles ETA toimuvad jrgmised protsessid: 1. Esimese reaktsiooni kigus toimub NADH-lt NADH-dehdrogenaasi abil 2 elektroni ja 2 prootoni lekanne flavoproteiinkompleksis sisalduvale FMN-le. Reaktsiooni tulemusena tekib FMNH2. 2. Sellele jrgneb elektronide lekanne Fe-S rhmale. Paralleelselt elektronide lekandega vabaneb 2 prootonit (H+). Koos elektronide lekandega kaasneb prootonite transport rakust vlja, millega genereeritakse prootonpotentsiaali (proton motive force PMF). 3. Jrgmises etapis toimub elektronide lekanne Fe-S rhmalt ubikinoonile. Selle tulemusena moodustub hdrokinoon ja toimub 2 elektroni (2 e-) lekanne, millega kaasneb ka 2 prootoni (2 H+) lekanne. 4. Aeroobsetes tingimustes liiguvad elektronid hdrokinoonilt tstokroom o kompleksile (kodeeritud geenide cyoABCDE poolt). Rakust transporditakse vlja veel (2 H+), mille tulemusena suureneb prootonpotentsiaal veelgi. Kui hapnikku on keskonnas vhe, kantakse elektronid tstokroom d kompleksile (kodeeritud geenide cydAB poolt), mis sisaldab hapnikule krge afiinsusega terminaalset oksdaasi. Vastavate geenide transkriptsiooni reguleerib ArcB-ArcA 2-komponendiline ssteem. ATP snteesi katalsib ATP-sntaas. ATP-sntaas koosneb kahest nii funktsionaalselt kui ka struktuuriliselt erinevast komponendis. F1 ehk peaosa, mis paikneb membraani sisepinnal ja F0 ehk sabaosa, mis lbistab membraani ning milles paikneb prootoneid juhtiv kanal. F1 komponent koosneb viiest subhikust: 3 3 ; F0 komponent kolmest subhikust a1 b1 c101. F1 kujutab struktuurilt heksameeri, mille ja subhikud moodustavad aktiivtsentri, kus ADP muudetakse ATP-ks ja vastupidi. ATPaas vib ttada ka vastupidises suunas, s.t. pumbata prootoneid rakust vlja, genereerides prootonpotensiaali, mis on vajalik viburite liikumiseks ja transportssteemide ts hoidmiseks. F1 subhiku 3 3 heksameer katalsib ka ATP hdrolsi. Mrkimist vrib ka regulatsiooni ssteem, mis tagab kigi ATPaasi subhikute snteesi iges vahekorras. Kik ATPaasi snteesi eest vastutavad geenid paiknevad hes operonis, mis viitab sellele, et erinevate subhikute sntees ei ole reguleeritud transkriptsiooni tasemel. Ilmselt saavutatakse kontroll tnu iga geeni ees paiknevale translatsiooni initsiatsiooni regioonile (TIR), mis phjustab ribosoomide seondumise erineva efektiivsuse SD jrjestusega. 10. METABOLIITIDE TRANSPORT. Raku tstoplasmaatiline membraan moodustab hdrofoobse barjri, mis on lbimatu paljudele hdrofiilsetele molekulidele. Jrelikult peavad bakterites eksisteerima spetsiifilised mehhanismid, mis transpordivad hendeid rakust vlja ja sisse. Gram (-) bakterite vlismembraanis paiknevad kitsad kanalid, mis vimaldavad suhkrute, aminohapete ja mnede ioonide passiivset difusiooni periplasmasse (ained mille molekulmass on viksem kui 700 daltonit). Nende kanalite moodustumisel osalevad spetsiifilised valgud poriinid (OmpF, OmpC jt). Mnede ainete nagu niteks vitamiin B12. oligosahhariidid, transport rakku toimub spetsiifiliste transportvalkude vi kanalite kaudu (maltoosi transpordil osalevad maltoporiinid). Enamus raku elutegevuseks vajalikke aineid vajab spetsiifilisi transpordi ssteeme sisemebraani lbimiseks, et juda tstoplasmasse. Soodustatud difusioon. See on ainuke transpordi ssteem, mis ei vaja energiat. Selles ssteemis toimub ainete transport lbi spetsiifiliste pooride kontsentratsioonigradiendi languse suunas. Sageli osaleb selles protsessis nn. difusiooni soodustav valk, mis kiirendab protsessi (see on vajalik substraadi kontsentratsiooni madala gradiendi korral). Gltserooli difusioon bakterirakkudesse toimub poriin tpi kanalite kaudu, mille philiseks struktuurseks komponendiks on valk GlpF. Viimati nimetatud valgu snteesi mrav geen glpF on hes operonis glpK (gltseroolkinaas) geeniga. Ka vee sisenemiseks ja vljumiseks rakust lbi lipiidide kihi on olemas spetsiifilised kanalid, millede moodutumisel on vajalik Aqp valk. Kuna aga aqp- mutatsioon ei ole rakule letaalne, on rakus ilmselt ka teisi kanaleid vee molekulide transpordiks. Mehhano-tundlikud kanalid MscL, MscS ABC-transporterid. Periplasmas paiknevate valkude hulgas on ks rhm valkusid, mida nimetatakse seostusvalkudeks (binding proteins). Need valgud vivad rakku transportida S04 2-, aminohappeid, suhkruid. Gram(+) bakteritel kujutavad nimetatud valgud endast lipoproteiine vi raku pinnaga seotud valke. Seostusvalgud kannavad nendega seostunud substraadi molekuli(d) spetsiifilise neljast membraanseoselisest valgust koosneva kompleksi juurde. Selle kompleksi kaks liiget sisaldavad oma struktuuris ATP sidumise motiivi (Walker A box`i). Substraadi lekanne seostusvalgult membraan kompleksile kivitab ATP hdrolsi, mis omakorda phjustab pooride avanemise ja substraadi hesuunalise liikumise raku tstoplasmasse. Kemo-osmoos vahendatud transport (chemiosmotic-driven transport). See ssteem tagab molekulide liikumise lbi memebraani tnu eelnevalt moodustunud ioon-gradiendile (prooton- ja naatriumgradient). Membraanil luuakse prootongradient ja lbi transporteri kanali sisenevad rakku

nii prootonid kui ka transporditavad molekulid. Enamasti ttavad need ssteemid vastu kontsentratsioonigradienti ja vajavad toimimiseks energiat. Seega on tegemist aktiivse transpordiga. Transportimisel eristatakse 3 ssteemi: 1. Smport he kandja poolt vahendatud kahe substraadi samaaegne transport samas suunas. Prootongradient vimaldab smportida vastupidiselt laetud ioone vi neutraalseid molekule (niteks laktoosi transportimine rakku laktoosi permeaasi LacY abil). 2. Antiport kahe sarnaselt laetud hendi samaaegselt vastassuunaline transportimine. Sellesse ssteemi kuulub niteks Na+ ja H+ ioonide transportimine NhaA ja NhaB abil, mis vimaldab rakkudel aluselises keskkonnas kasvamisel silitada tstolasmas neutraalse pH. 3. Uniport transporditava substraadi membraani lbimine ei sltu teiste hendite kontsentratsioonist vi transportimisest. Phimtteliselt toimub sel viisil eelpoolkirjeldatud gltserooli soodustatud difusioon. Spetsiifilised transpordi ssteemid ATP seoselised ioonpumbad. Sellese rhma kuulub kahte tpi ioon pumpasid F-tpi (F1F0) ja P-tpi (E1E2) ATPaasid. F-tpi ATPaasid pumpavad H+ vlja vi kaasneb H+ rakku sissepumpamisega ATP tootmine. Erinevad P-tpi ATPaasid on mrkimisvrselt sarnased ksteisega, vaatamat sellele, et nad osalevad vga erinevate ioonide transpordis (K, Na, Mg, Cd). E. colis on kirjeldatud ioonide transpordis osalevat Kdp ATPaasi. See koosneb kolmest subhikust A2B2 C2. KdpB valk lokaliseerub membraanis ja on homoloogne teiste P-tpi ATPaasidega, mis seostuvad ATPga ning milledel on ATP hdrolsiv toime. KdpA subhik on membraani lbiv transporter, mis moodustab kanali K+ ioonide transpordiks. Kui P-tpi ATPaaside puhul kaasneb he iooni transpordiga rakust vlja teise iooni transport rakku (K+ Na+ ATPaas), siis Kdp ATPaasi korral toimub ainult ioonide transport rakku. Kogu ssteemi kontrollib KdpD/KdpE kahekomponendiline regulatsioonissteem. Raua transport Enamus baktereid vajab normaalseks elutegevuseks rauda. Raud kuulub paljude ensmide aktiivtsentrisse. Aeroobses keskkonnas esineb raud III-valentsena ja on organismidele raskesti omastatav. Paljud bakterid produtseerivad selliseid aineid siderofoore -, mis moodustavad Fe3+ kompleksi ja moodustunud kompleks vimaldab raua transpordi rakku. Bakterite poolt snteesitud siderofoorid on erineva struktuuriga. E. coli snteesib siderofoori enteroheliin. Vastav siderofoor moodustab Fe3+ kompleksi ferrienteroheliin, mis transporditakse Fep valkude vahendusel rakku. Transpordissteemi kuuluvad FepA vimaldab Fe3+ transpordi le vlismembraani. FepB transpordib ferrienteroheliini sisemembraanis paikneva FepCDG kompleksini, mis omakorda viib raua iooni rakku. Rakku transporditud Fe3+ redutseeritakse Fe2+. Viimase kontsentratsiooni tustes blokeeritakse rakus Fe3+ ioonide transpordiks vajalike valkude sntees. Fosfotransferaas-ssteem. Selles ssteemis toimub transpordi kigus ka substraadi fosforlimine. Nimetatud transpordi ssteemi on phjalikult uuritud E. colis. Esimeses etapis fosforlitakse valk PstI PEP arvel ja sellelt kantakse fosfaatrhm le valgule PstH (histidiin kinaas) ja sealt edasi valgule EII. Ssteemi kuuluv valk EII on suhkruspetsiifiline ja koosneb kolmest domnist IIA, IIB ja IIC. Selles lekandessteemis kantakse fosforlrhm PEP-ilt eespool mainitud valkude vahendusel rakku transporditavale suhkrule. Valk IIC moodustab transpordikanali ja osaliselt ka suhkruspetsiifilise seondumissaidi. EII valgud vib grupeerida, vastavalt jrjestuse homoloogiale, nelja klassi: mannitool, glkoos, mannoos ja laktoos klass. 11. LMMASTIKU METABOLISM N2 fikseerimine atmosfrist. Looduses on kirjeldatud mitmeid baktereid, kes on vimelised omastama N2 atmosfrist (niteks mitmed Rhizobiumi liigid, Klebsiella pneumoniae) ja muutma selle ammooniumiks. Protsessi viib lbi multikomponentne nitrogenaasi ssteem. Erinevatel bakteritel on nitrogenaasi ssteem llatavalt sarnase ehitusega. See koosneb kahest komponendist: 1. komponent I dinitrogenaas (molbdeeni ja rauda sisaldav kahest subhikust koosnev valk) ja 2. komponent II dinitrogenaasi reduktaas (raua ja vvli-seoseline valk, mis kannab elektronid dinitrogenaasile). ldiselt on N2 fikseerimine energiakulukas protsess, mis vajab toimumiseks 12-16 molekuli ATP-d. Reaktsiooni tulemusena tekib ammoonium ning vabaneb ka H2. N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi ks paremini kirjeldatud nitrogenaasi ssteem on K. pneumoniae. Siia ssteemi kuuluv dinitrogenaas (komponent I) on 2 2 tetrameerne multiensmkompleks. Dinitrogenaas on kodeeritud geenide nifK ja nifD poolt. Lisaks kuulub ssteemi dinitrogenaasi reduktaas (komponent II), mille sntees on kodeeritud nifH geeni poolt. Kolmanda komponendina kuulub ssteemi rauda ja molbdeeni sisaldav kofaktor FeM-Co, mille snteesil osalevad 6 erinevat nif geeni (nifQBVNEH). nif geenide transkriptsiooni reguleerivad geenid nifLA, mis on lmmastiku limitatsioonis aktiveeritavad valgu NtrC poolt. NifA on positiivne transkriptsiooni aktivaator, mis aktiveerib transkriptsiooni 54-sltuvalt promootorilt. nifL geeni produkt interakteerub NifA-ga, takistades

NifA-vahendatud transkriptsiooni aktivatsiooni fikseeritud lmmastiku (ammoonium vi aminohapped) olemasolul. Lmmastiku fikseerimine smbioosis elevate bakterite poolt. Smbioos sellise bakteri nagu Sinorhizobium meliloti ja peremestaime (nit. Medicago sativa) vahel kulmineerub mgarate e. Noodulite moodustumisega, mis kujutavad endast krgelt diferentseerunud taimeorganeid. Kui bakterid sattuvad taimerakku, hakkavad nad seal paljunema ja differentseeruvad N2 siduvateks bakteroidideks, mis on taimeraku tstosoolist eraldatud spetsiifilise membraaniga. Noodulite moodustumine on keeruline protsess, milleks on vajalik teatud kindlate taime- ja bakteri geenide koordineeritud ekspressioon. Noodulite moodustumiseks on vajalik bakterites olevate nn. nod geenide aktivatsioon. Nod geenide induktoriks on taimerakus snteesitavad flavonoidid. Lisaks noodulite moodustumisele indutseerivad osad flavonoidid ka bakterite kasvu ja kemotaksist. Reeglina paiknevad nod geenid plasmiidis, mida nimetatkse Sym plasmiidiks. Noodulite snteesiks vajalike geenide ekspressioon on reguleeritud positiivse transkriptsiooni fakori NodD poolt (induktoriks on taimede poolt snteesitavad flavonoidid). nodABC geenid on leitud kigil rhizobiumi tvedel. Nimetatud geenide ekspressioon on vajalik mitmete polsahhariidide snteesiks: suktsinoglkaan (EPS I), eksopolsahhariid II (EPS II). Nitrogenaasi komponentide snteesil osalevad nif-geenid. Lisaks osalevad lmmastiku fikseerimisel veel mitmed fix-geenide produktid. Kui bakter varustab taime lmmastikuga, siis vastusena varustab taim bakteroidi ssiniku allikaga. Sym-plasmiidil paiknevad lisaks lmmastiku fikseerimises osalevatele geenidele ka geenid, millede produktid on vajalikud taimedes snteesitavate dikarbokslhapete (suktsinaat, malaat, fumaraat) transpordiks bakterisse (dct-geenid). Dikarbokslhappeid on bakterid vimelised kasutama energiaallikana. Anorgaaniliste lmmastikhendite assimilatsioon. Looduses olev anorgaaniline lmmastiku hend, mida bakterid saavad kasutada orgaaniliste hendite (aminohapped) snteesiks, on ammonium. Ammoniumi puudumisel keskkonnas vib organism kasutada lmmastiku allikana ka histidiini vi proliini. Ammoonium on otseseks substraadiks ainult vheste aminohapete (glutamaat, alaniin, aspartaat) snteesil. Nimetatud aminohappeid kasutab organism lejnud aminohapete snteesil aminorhma doonorina ketohapete prekursorite transamineerimisel. Ammooniumi assimileerimisel vajalikud ensmid on glutamaadidehdrogenaas (GDH), glutamiinisntetaas (GS) ja glutamaadisntaas (GOGAT). Alaniini ja aspartaadi snteesil osalevad alaniinidehdrogenaas ja aspartaas. Philine hend, mida snteesitakse, on siiski glutamaat. Bakterid vivad kasutada ammoniumi assimilatsiooniks erinevaid metabolismiradu. 1. Kui ammoniumi kontsentratsioon keskkonnas on madalam kui 1 mM on GDH poolt lbiviidava reaktsiooni tasakaal nihutatud, mistttu glutamaadi snteesi enam ei toimu. Nendes tingimustes aktiveeritakse seni osaliselt inaktiivne GS. Viimane katalsib glutamiini snteesi, glutamiini hulk rakus tuseb ja sellest snteesitakse glutamaadi sntaasi GOGAT toimel glutamaati (reaktsioonis osalevad glutamiin, -ketoglutaraat ja NADPH). 2. Ammooniumi lehulgas domineerib glutamaadi sntees -ketoglutaraadist ja ammooniumist glutamaadi dehdrogenaasi GDH toimel, kasutades NADPH-d. Vhesel hulgal snteesitakse ka glutamiini sntetaasi GS toimel glutamiini (glutamaat + ammoonium, toimub ATP hdrols) NtrB/NtrC ssteem ammooniumi assimileerimise regulatsioonis Selleks, et vimalikult tpselt reguleerida siin osalevate geenide ekspressiooni, on ammoniumi assimilatsioonis osalevad geenid allutatud kahekomponedilise regulatsiooni ssteemi GlnL/GlnG kontrollile. Kahekomponendilise regulaatorssteemi geenidega hes operonis paikneb ka glutamiini sntetaasi kodeeriv geen glnA. GlnL on tuntud ka nimetuste all NtrB ja NRII ning GlnG asemel kasutatakse sageli nimetusi NtrC ja NRI. Enamlevinud on siiski nimetused NtrB ja NtrC. Bakterites toimub lmmastiku assimilatsioonil osalevate valkude aktiivsuse kontroll ka biokeemiliste mehhanismide abil. Glutamiinsntetaasi aktiivsust reguleerivad valgud GlnE ja PII. Bakteri rakkudes olev adenlltransferaas (GlnE) on bifunktsionaalne ensm, mis vib glutamiinsntetaasi (GlnS) trosiinile adenlrhma kas le kanda vi elimineerida. Selles protsessis osaleb ka valk GlnD, millel on uridlltransferaasi (UT) aktiivsus trosiinile ja uridllrhma krvaldav (UR) aktiivsus. Madalatel glutamiini kontsentratsioonidel toimub selle valgu mjul uridllrhma lekanne valgule PII, glutamiini kontsentatsiooni tustes aga vastupidine protsess. Adenleeritud GlnS-i vorm on inaktiivne. Selle vormi tekkimist soodustab valgu PII see vorm, mis ei sisalda uridllgruppi. Lisaks biokeemilisele regulatsioonile toimub ammoniumi assimilatsioonil osalevate geenide kontroll ka transkriptsiooni tasemel. Juhul, kui N-allikat on bakterite kasvukeskkonnas piisavalt, toimub transkriptsioon nrkadelt 70-sltuvatelt promootoritelt glnAp1 ja glnLp. Lmmastikuallika kontsentratsiooni langedes aktiveerib fosforleeritud NtrC-P transkriptsiooni glnAp2 geeni 54-sltuvalt promootorilt. NtrC fosforleeritakse sensorvalgu NtrB poolt. NtrB-l on bifunktsionaalne valk, millel on nii autokinaasi kui ka fosfataasi aktiivsus, mida kontrollib bifunktsionaalne ensm PII. UT aktiivsus on stimuleeritud N-vaeguse korral, kus glutamiini kontsentratsioon on rakus -ketoglutaraadi kontsentratsioon krge. Selle tulemusena tekib PII uridleeritud vorm UMP-PII, mis stimuleerib NtrB-l kinaasi aktiivsust ja NtrC fosforleeritakse. Krgel

ammooniumi kontsentratsioonil domineerib PII puhul UR-aktiivsus. UR-aktiivsusega valk interakteerub NtrB-ga, stimuleerides NtrB fosfataasset aktiivsust, mille tulemusena NtrB defosforleerib NtrC. Bakteris Klebsiella pneumoniae on nitrogenaasi snteesi eest vastutavad geenid nifHDK samuti fosforleeritud NtrC poolt aktiveeritavad. N2-limitatsioonis aktiveerib NtrC-P nifA transkriptsiooni ning aktiveeritud NifA omakorda nifHDK geenide transkriptsiooni. NtrB/NtrC poolt on kontrollitud ka selliste operonide transkriptsioon nagu niteks hut operon, mis kodeerib histidiini utiliseerimist ja put operon, mis kodeerib proliini utiliseerimist. 12. VALKUDE TRANSPORT (TP I-IV SEKRETSIOONI SSTEEMID). Ligikaudu 20% bakterites snteesitud polpeptiididest paikneb osaliselt vi tielikult vljaspool tstoplasmat. Suurem osa valkudest transporditakse rakust vlja nn. ldise sekretsiooni mehhanismi e. Sec-sltuv mehhanismi (general secretory pathway GSP) vahendusel. Kik sekreteeritavad valgud omavad N-terminaalset signaaljrjestust, mille funktsiooniks on valkude sidumine membraaniga. Signaaljrjestus koosneb 15-30 aminohappest. Enne transporti seondub valguga kas trigger factor vi SRP kompleks (signal recognition partical). SRP koosneb Ffh valgust ja ffs RNA-st (4.5S RNA). SRP-ga seondunud valgud transporditakse (kotranslatsiooniline eksport) membraan-seoselise retseptorvalgu FtsY juurde. Sec-sltuva transpordissteemi philine komponent on SecYE translokon, mis paikneb tstoplasmaatilises membraanis. Osa sekreteeritavaid valke interakteeruvad kigepealt trigger factoriga ja seejrel chaperoniga SecB. Seejrel transporditakse valk SecA (ATPaas) valgu juurde, mis on seotud translokoniga SecYE. Valgu transport periplasmasse toimubki lbi SecYE translokoni. SRP-kompleksiga interakteeruvad valgud seonduvad tstoplasmaatilises membraanis paikneva retseptoriga FtsY, millele jrgnevalt transporditav valk llitatakse membraani vi suunatakse SecYE translokoni. Translokatsiooni ajal vi vahetult peale seda eemaldatakse valgust signaaljrjestus signaalpeptidaasi (LepB) poolt. Valkude transport lbi vlismembraani. Tp I sekretsioon (ABC transporterid). See on lihtsaim valkude sekretsioonissteem, mis koosneb kolmest komponendist: vlismembraanis paiknevast kanalist, sisemembraanil paiknevast ABC transporterist ja periplasmas lokaliseeruvast valgust. Kaks viimast komponenti on substraadi spetsiifilised. E. colis on kirjeldatud sekretsiooni ssteemi, mis on vajalik hemolsiini (HlyA) transpordiks rakust vlja. Sisemembraanil paiknev transporter (HlyB2) sisaldab ATP seondumise kassetti, ssteemi kuulub veel preiplasmas paiknev valk HlyD. Vlismembraanis paikneb valk TolC. Tp II sekretsioon. Seda ssteemi nimetatakse sageli ka Sec-sltuva sekretsioonitee phiharuks. Valk transporditakse periplasmasse ldise sekretsiooni mehhanismi vahendusel, periplasmast vlja toimub transport spetsiifilise ssteemi abil, mis sltub konkreetsest valgust. Tp II sekretsiooniteed kasutab V. cholerae koolera toksiini transpordiks rakust vlja. Toksiini A ja B subhikud trasnporditakse periplasmasse Sec-sltuva mehhanismi abil. Periplasmas toimub toksiini subhikute assambleerimine ning funktsionaalne toksiin transporditakse lbi vlismembraani sptsiifiliste Esp valkude vahendusel (spetsiifiline tp II sekretsioonissteem). Nimetatud bakteris EpsD valk moodustab sekretsiooni poori, EpsE, EpsL ja EpsM reguleerivad ekstratsellulaarset sekretsiooni. Valgud EpsG, H, I, J ja K osalevad pili sarnase struktuuri moodustamisel, mis on vajalik valkude sekretsioonis. Paljud taimepatogeenid kasutavad ekstratsellulaarsete ensmide sekretsiooniks nn. out-ssteemi. See ssteem sisaldab tavaliselt 12 valku, mis moodustavad pili-sarnase struktuuri. Tp II sekretsioonissteem erineb kikidest teistest selle poolest, et see ssteem transpordib eelnevalt periplasmas kokkupakitud valke rakust vlja. Tp III sekretsioon. Tp kolm sekretsioonissteemi kuuluvad valgud moodustavad sstla-sarnase struktuuri, mis tagab valgu transpordi bakteri tstoplasmast otse eukaroodirakku. Seda tpi sekretsioonissteemi kasutavad patogeenid toksiinide vi farmakoloogiliselt aktiivsete valkude transpordiks peremees rakku. Sekretsioonissteemi moodustavate valkude sntees suureneb oluliselt patogeeni sattumisel peremees organismi. Nii niteks on ftopatogeenil Ralstonia solanacearum kolmest valgust (PrhA, PrhI ja PrhR) koosnev ssteem, mis kontrollib tp III sekretsioonissteemi valkude produktsiooni. Sekretsioonissteemi valkude produktsiooni mjutavad keskkona pH, homoseriinlaktoonid, kahevalentsed ioonid ja paljud teised keskkonna faktorid. Sekretsioonissteemi baasalosa, mis koosneb tstoplasmaatilises membraanis ja vlismembraanis paiknevast ringstruktuurist, sarnaneb viburite basaalkehaga. Kikidele tp III sekretsioonissteemidele on iseloomulik nela-sarnane struktuur, mis ulatub rakupinnale ja mis koos basaalosaga (kaks ringstruktuuri), moodustab htse terviku. Ftopatogeenidel on nela-sarnane osa asendatud valkude kompleksiga, mis oma struktuurilt meenutab pilit. Patogeenide hulka, mis omavad tp III sekretsioonissteemi kuuluvad: Yersinia liigid, Salmonella enteritica, Shigella flexneri, jt. Sekreteeritavad valgud transporditakse tstoplasmaatilise membraani juurde spetsiifiliste chaperonide vahendusel. Nii niteks paljudes Yersinia tvedes on tstotoksiini YopE sekretsiooniks vajalik selle eelnev seondumine tshaperoniga SycE.

Tp VI sekretsioonissteem (T4SS). Mitmed patogeenid kasutavad sekretsiooni ssteemi, mille komponendid sarnanevad konjugatsiooni ssteemile (see osaleb DNA lekandes doonorist retsipient-rakku. Vt. konjugatsioon). Mnede patogeenide nn. adhesiivsete pilide moodustumine raku pinnale on sarnane tp IV sekretsiooni kompleksi moodustumisele. Uropatogeense E. coli vajab rakkudele kinnitumiseks P-pilisid, millede snteesi kodeerivad pap-geenid. Pili koosaneb kuuest subhikust Pap A, G, K, E, F ja G. Pilide moodustumiseks vajalike valkude transpordiks periplasmas on vajalik chaperoni PapC. Agrobacterium tumefaciens kasutab tp IV sekretsiooni ssteemi T-DNA ja effektorvalkude liikumisel bakterist taimerakku. VirB/VirD ssteem on ks paremini kirjeldatud tp IV ssteem. T4SS ssteemi kuuluvad virB-operoni poolt kodeeritud 11 valku (VirB1-B11) ja valk VirD4. Kanali moodustumisel osalevad valgud VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 ja VirB10 ning lisaks veel VirD4. Protsessi efektiivseks toimumiseks vajatakse ka kahte ATPaasi VirB4 ja VirB11. Heliobacter pylori kasutab seda tpi sekretsiooni ssteemi CagA valgu transporiks imetajarakkudesse. Valkude proteoltiline protsessing E. coli rakkudes on identifitseeritud le 20 endoproteaasi. Paljudel neist on nn. housekeeping funktsioon, kuid mningad proteaasid omavad ka regulatoorset funktsiooni, et hoida teatavate valkude hulk rakus madal kas pidevalt vi muuta valkude ekspressioonitaset vastusena keskkonna signaalidele. Miks bakterid lagundavad rakus olevaid valke, millede snteesiks on kulutatud palju energiat? Proteaaside philiseks lesandeks on krvaldada rakust mittefunktsionaalsed vigaselt transleeritud, muteerunud, valesti volditud vi organismile vrad valgud. Sellised anormaalsed valgud krvaldatakse rakust tunduvalt kiiremini kui nende normaalsed teisikud. Rakkude sattumisel ebasoodsasse keskkonda (madal pH; krge temperatuur) suureneb rakus mittefunktsionaalsete valkude hulk. Osadel proteaasidel on rakus regulatoorne funktsioon, mis tagab teatud regulatoorsete valkude ige koguse rakus. Niteks reguleerib proteaas ClpXP sigma faktori S hulka rakus sltuvalt kasvufaasist. Enamus E. coli proteaase kasutavad ATP energiat. Individuaalsete valkude poolestusaeg on rakus vga erinev, see vib varieeruda mnest pevast kuni mne tunnini. Niteks valgud, mis reguleerivad DNA replikatsiooni vi rakkude jagunemist, alluvad vga kergesti proteolsile ja nende poolestusaeg vib olla isegi alla paari minuti. Vga ebastabiilne on niteks SulA valk. Valkude allumine proteoltilisele degradatsioonile sltub mrkimisvrselt rakkude kasvutingimustest. Kui eksponentsiaalselt kasvavates rakkudes degradeeritakse 15% valke poolestusajaga alla 5 tunni, siis nlgivates rakkudes tuseb selliste valkude osakaal juba 50%-ni. Kasvavates E. coli rakkudes degradeeritakse 60% valkudest ATP-sltuvate proteaaside Lon ja Clp poolt Lon proteaas Lon proteaas on ATP-sltuv seriini endoproteaas, mis degradeerib nii ebanormaalseid valke kui ka spetsiifilisi regulaatorvalke nagu niteks raku jagunemise inhibiitor SulA, kapsli snteesi reguleerivat valku RcsA. Kui SulA-d rakus ei degradeerita, moodustuvad pikad rakkude filamendid ning rakud surevad. Lon on tetrameerne valk, mis koosneb 87 kDa suurustest subhikutest ja mis lagundab ainult kokkupakkimata valke. Substraadi lagundamise tulemusena tekivad 5 20 aminohappe pikkused oligopeptiidid. lon mutantides tuseb looduslikult ebastabiilsete valkude eluiga, samuti temperatuuri-tundlike valkude ning organismile vraste valkude (niteks teisest organismist kloneeritud geenide produktid) eluiga. Clp proteaas Clp proteaasis paiknevad ATPaasne ja proteaasne aktiivtsenter erinevates valgu subhikutes. ClpP proteaasset aktiivsust omav subhik vib rekombineeruda kas ClpA vi ClpX ATPaasse subhikuga, mille tulemusena tekivad vastavat ClpAP vi ClpXP proteaas. ClpAP proteaas molekulmassiga 750 kDa on dodekameerne 21,5 kDa suuruste ClpP subhikute osas ja heksameerne ClpA subhikute osas. ClpA-l on ATPaasne aktiivsus, ClpPl proteaasne aktiivsus. ClpA puudumisel vib ClpP degradeerida vikesi peptiide ning denatureerida suuri valke. Suuremate valkude degradatsioonil on oluline, et ClpP subhikud oleksid assotsieerunud ClpA-ga. ClpP ja ClpA hulk tuseb rakkudes eksponentsiaalse kasvufaasi lpus. LexA repressori autoproteoltiline inaktivatsioon DNA kahjustuste tulemusena (niteks UV kiirguse toimel) vallandub rakkudes terve rea valkude sntees, mis pavad tekkinud kahjustust krvaldada. Sellist kompleksset protsessi rakus nimetatkse SOS vastuseks. Rakus toimub aktiivse repressori LexA autokataltiline inaktivatsioon Gly-Ala sideme degradeerimise kaudu. LexA proteoltilist aktiivsust mjutab ssDNA-ga assotsieerunud RecA kompleks. Repressori lagundamisel kulutatakse ATP energiat. RecA kitub rakus kui aktivaator ka faag lambda CI valgu ja UmuD autoproteaassele aktiivsusele. 13. SUBSTRAATIDE METABOLISM (v.a. glkoos). Vaatamata sellel, et glkoos on heterotroofsete bakterite eelistatuim ssiniku- ja energiaallikas, on bakterid glkoosi puudumisel vimelised kasutama ka mitmeid teisi suhkruid kui ssiniku ja energia allikaid. Kui bakter kasutab niteks polsahhariide, lagundatakse need esmalt eksoensmide toimel rakku transporditavateks molekulideks. Di- ja oligosahhariidid lagundatakse tavaliselt vahehenditeks (sageli glkoosiks vi glkoos-6-P), mis siseneb kas EMP, Entner-Doudoroffi vi teistesse tsentraalsetesse lagundamis radadesse. Paljude

alternatiivsete ssinikuallikate kasutamine on vimalik peale nn. induktsiooni perioodi, mis on vajalik vastava lagundamisraja ensmide snteesiks. Laktoos. E. coli vajab laktoosi kasutamiseks spetsiifilist permeaasi (suhkru transpordiks rakku) ja -galaktosidaasi. Laktoos lagundatakse rakus D-galaktoosiks ja D-glkoosiks. D-galakoosist moodustub galaktokinaasi toimel galaktoos-1-fosfaat, mis muudetakse fruktoos-6-p (Leloir rada). Tekkiv fruktoos-6-P siseneb EMP ratta. Mningad bakterid, kellel puudub lac-operon (Lactobacillus casei) on siiski vimelised kasutama laktoosi. Sellisel juhul transporditakse laktoos fosfoenoolpruvaadi (PEP) ja fosfotransferaas ssteemi (PTS) vahendusel rakku. Rakku transporditud laktoos lagundatakse fosfo--galaktosidaasi vahendusel glkoosiks ja galaktoos-6-P. Viimane lagundatakse mda tagatoos-6-P rada gltseeraldehd-3-P ja dihdroksatsetoon-P. Maltoos E. coli vajab maltoosi kasutamiseks spetsiifilist transpordi ssteemi malEGF, malK ja lamB ja malPG operoni poolt snteesitavaid amlomaltaasi ja maltodekstriinfosforlaasi. Rakku transporditud maltoos hdrolsitakse amlomaltaasi toimel D-glkoosiks ja maltodekstriiniks (polsahhariid). Maltodekstriin muudetakse maltodekstriinfosforlaasi toimel glkoos-1-P, mille isomerisatsioonil fosfoglkomutaasi toimel saadakse glkoos-6-P. Nii tekkinud glkoos kui ka glkoos-6-P lagundatakse mda EMP rada. Mannitool. Mannitooli ja teiste heksitoolide (sorbitool, D-galaktitool) kasutamine eeldab spetsiifilise fosfoenoolpruvaadi (PEP) ja fosfotransferaasi ssteem (PTS) olemasolu bakteris. Fosforleeritud suhkrud oksdeeritakse rakus spetsiifiliste heksitoolfosfaatdehdrogenaaside vahendusel. Mannitooli puhul oksdeeritakse mannitool-1-P spetsiifilise NAD-sltuva dehdrogenaasi toimel fruktoos-6-P, mis lagundatakse mda EMP rada. E. coli vib toimuda ka mannitooli oksdatsioon ribuloos-5-P moodustamisega, mis on tasakaalus riboos-5-P ja ksloos-5-Pga. Pektiinid. Pektiin on ks philise taime rakuseina komponente. Tegemist on polmeeriga, mis koosneb metleeritud pol-1,4-D-galakturoonhappest. Paljud ftopatogeensed bakterid on vimelised lagundama pektiini, phjustades sellega taimedel mitmesuguseid haigusi. Lisaks sellele on bakterid vimelised kasutama pektiini lagundamisel tekkivaid oligogalakturoniide ka ssiniku ja energia allikana. Pektiini lagundamisel osalevad erinevad ensmid, mis jrkjrgult lagundavad polmeeri. Kigepealt eemaldatakse pektiinmetlesteraaside poolt C-6 kljes olevad metokslrhmad, mille tulemusena tekib polgalakturonaat, mis edasi lagundatakse pektaatlaaside ja polgalakturonaaside toimel oligogalakuroniidideks. Need lagundatakse 2-keto-3-deoks-6- fosfoglkonaadiks (KDPG), mis lagundatakse mda Entner-DoudoroffI rada pruvaadini. Tselluloos. Tselluloos on polmeer, milles D-glkoosi jgid on omavahel seotud -1,4-glkosiidsidemetega. Tselluloosi lagundamisel osalevad kolme tpi ensmid: 1) endo--1,4-glkanaasid, 2) exo--1,4-glkanaasid ja 3) glkosidaasid. Tselluloosi on vimelised lagundama mitmed filamentsed seened, aktinomtseedid, aga ka mitmed ftopatogeensed bakterid ja rohusjate soolestikus olevad bakterid. Aromaatsed hendid. Viimasel sajandil on tnu tstuse ja pllumajanduse kiirele arengule sattunud loodusesse erinevaid snteetilisi orgaanilisi hendeid, mida teadaolevalt looduses ei leidu. heks peamiseks keskkonna saastajaks on mitmesugused aromaatsed hendid (fenooli, benseeni jt. derivaadid). Ent sellest hoolimata on paljud bakterid vimelised kasutama neid hendeid ssiniku ja energia allikana. Selline paindlik metabolism on bakteritel vga oluline, kuna see suurendab vimalike ssinikuallikate ringi. Ssivesinikud, mis sisaldavad aromaatset tuuma ptakse muuta selliselt, et oleks vimalik aromaatne tuum avada. Aeroobsetes tingimustes liidavad mono- ja dioksgenaasid tuumale hdrokslrhma, mis soodustab aromaatse tuuma lagunemist. Bakterid kasutavad aromaatsete hendite lagundamiseks erinevaid ensme, mis muudavad erinevad aromaatsed hendid tsentraalseteks vaheproduktideks, mis seejrel lagundatakse ldistes katabolismiradades. Selliseks hendiks mitmesuguste fenoolsete hendite lagundamisel on katehhool. Katehhooli aromaatse tuuma edasine lagundamine toimub kas kahe hdrokslrhma krvalt (meta asendist) vi kahe hdrokslrhma vahelt (orto asendist). Meta-lagundamisraja lpp produktideks on pruvaat ja atseetaldehd, orto-lagundamisrada lpeb ketoadipaadi moodustumisega, mis lagundatakse suktsinaadiks ja atsetaadiks. 14. BAKTERITE STRESSI VASTUSED Bakterirakk vajab normaalseks kasvuks ja paljunemiseks piisavalt toitaineid, optimaalset temperatuuri, pH-d. Kui mni neist parameetritest muutub, siis phjustavad need muutused bakterirakkudes stressi. Kiire kasvutingimuste muutuse tunnetamine ja raku kogu fsioloogilise aparaadi mberkorraldamine vastavalt muutunud tingimustele, on rmiselt thtis bakterite ellujmise seisukohalt. Vljaspool laboritingimusi elavad bakterid pidevalt stressi tingimustes, mis on viinud kompleksse ssteemi vljakujunemiseni, mis vimaldab bakteritel oma elu mberkorraldada vastavalt muutuvatele keskkonnatingimustele.

Lahustunud ainete kontsentratsioon mngib olulist rolli mikroobide kasvamisel. Tavaliselt kasvatatkse baktereid stmetes, mille osmolaarsus on madal. Paljude bakterite jaoks hpertoonilise vi hperosmootsed tingimused phjustavad vee kaotust tstoplasmast (plasmolsi). Hpotoonilised vi hpoosmootsed tingimused phjustavad vee tungimise tstoplasmasse, mis phjustab rakkude paisumist. See protsess vib lppeda ka osmootse lsiga. Vee liikumine rakku toimub diffusiooni teel, kuid lisaks sellele toimub see ka lbi spetsiifiliste kanalite e. akvaporiinide. Bakterirakus on soolade kontsentratsioon krgem, kui teda mbritsevas stmes. See phjustab mrkimisvrse rhu rakuseinale, kuna raku ruumala pab suureneda samal ajal kui rakusein takistab rakku paisumast. Rakkude elutegevuse seisukohalt on oluline, et rakuseinale rakenduks kindla vrtusega siserhk e. turgor. Kui raku vliskeskkonna osmootne rhk tuseb, peab turgori silimiseks tusma ka tstoplasma osmootne rhk. Kui osmootne rhk rakus suureneks ainult soolade kontsentratsiooni tusu arvel, inhibeeriks see ensmid. Selleks, et ensmid ei inaktiveeruks, kuid turgor rakus siiski siluks, snteesitakse rakkudes betaiini, ektoiini, trehhaloosi, gltserooli, sahharoosi, proliini ja vikeseid peptiide. Need hendid on lahustuvad krgel kontsentratsioonil, keemiliselt neutraalsed, ei mjuta ensmide aktiivsust vaid pigem stabiliseerivad ensme denatureerivate soolade suhtes ning tagavad rakus krge osmootse rhu. Trehhaloosi snteesi eest vastutab otsAB operon. OtsA on trehhaloos- 6-fosfaat sntetaas ja OtsB trehhaloos-6-fosfaat fosfataas. Neid hendeid on rakkudel vimalik hankida ka kasvukeskkonnast. E. coli`s ja S. enterica`s vastutavad nende transpordi eest kaks permeaasi ProP ja ProU. Krge osmolaarsus. Kui kasvukeskkonna osmolaarsus suureneb, turgor langeb ning selle tulemusena aeglustub ka rakkude kasv. Makromolekulide sntees ja hingamine aeglustuvad. Raku kige kiirem vastus sellisele muutusele on kiirendada K+ ioonide transporti rakku. E. coli`s on vhemalt kolm erinevat ssteemi, mis osalevad K+ ioonide transpordil rakku: Trk, Kdp ja Kup-ssteem. Trk ja Kdp ssteeme on kirjeldatud ka teistes bakterites. Trk-ssteem koosneb kolmest valgust TrkA, TrkE ja TrkH vi TrkG. Kdp-ssteemist oli juttu eespool. Philine anioon, mis osaleb osmoregulatsioonis on glutamaat. Glutamaadi transport sltub K+ ioonide transpordist. Glutamaati snteesivad glutamaatdehdrogenaas (GDH) ja glutamaat sntetaas (GS). Madal osmolaarsus. Kui keskkonna osmolaarsus langeb (hpoosmootiline shokk), kaasneb sellega kiire veevool rakku, mis suurendab turgorit. See omakorda phjustab raku ruumala suurenemist, millega vivad kaasneda mrad membraanides vi ka olemaolevate pooride vljavenimine. Rakkude permeaablus suureneb, kuid see on ajutine nhtus. Geeni ekspressiooni osmootne kontroll. Keskkonna osmootse rhu muutumisega kaasnevad ka ulatuslikud muutused raku ldises metabolismis. Rakkude kasv on ajutiselt inhibeeritud, aktiveerub statsionaarse faasi-spetsiifiline sigma faktor S, rakkudesse koguneb ppGpp. E. coli vlismembaanis paiknevad valgud OmpC ja OmpF, mille ekspressioonitase sltub vliskekkonna osmootsest rhust. OmpC ja OmpF on poriinid, millest moodustuvad raku vlismembraani akvapoorid. Vliskeskkonna madala osmolaarsuse korral on lekaalus OmpF, krge osmolaarsuse korral aga OmpC. Nende valkude ekspressiooni reguleerib kahekomponendiline-regulatsioonissteem EnvZ ja OmpR. EnvZ on transmembraanne sensorvalk, mis krge osmolaarsuse korral autofosforleerub. Seejrel transfosforleerib vastuvttev regulaator OmpR, mis kontrollib ompC ja ompF geenide transkriptsiooni. Geenid paiknevad kromosoomi erinevates piirkondades. OmpR-P madala kontsentratsiooni korral on aktiveeritud ainult ompF transkriptsioon, kuna sel juhul toimub regulaatori seondumine krge afiinsusega saitidele. OmpR-P kontsentratsioonitusu korral toimub seondumine ka madala afiinsusega saitidele. Selle tulemusena aktiveeritakse ompC geeni transkriptsioon ning prsitakse ompF geeni transkriptsiooni. Madala osmolaarsuse korral avaldub EnvZ-il fosfataasne aktiivsus, mille tulemusena defosforleeritakse nii EnvZ kui ka OmpR. OmpF-i ekspressioonitaset kontrollitakse ka antisens-RNA kaudu. ompF-i mRNA translatsiooni inhibeerib antisens-RNA micF, mida transkribeeritakse ompC geenist vastupidises suunas ja mis on komplementaarne ompF mRNA 5 otsaga. micF transkriptsioon on aktiveeritud krge osmolaarsuse korral. EnvZ-OmpR ssteem ei reguleeri rakus mitte ainult poriinide snteesi vaid osaleb ka viburi valkude, raku jagunemise, rasvhapete ja paljude muude protsesside kontrollis. Oksdatiivne stress. Aeroobse hingamise kigus tekivad rakus reaktiivsed hapniku vormid ensmaatiliste ja spontaansete keemiliste reaktsioonide tulemusena. O2 + e-+oksdatiivne ensm O2 ' NADPH+H++2O2NADP++ O2_' + H2O2 Superoksiidid vivadkse keemiliste reaktsioonide kigus konverteeruda krgelt aktiivseteks henditeks nagu vesinikperoksiid, hdrokslradikaal, jt. Oluline reaktiivse hapniku detoksifitseerimine toimub mitmesuguste ensmide abil: katalaasid, peroksdaasid ja superoksiid-dismutaasid. O2- ' konverteeritakse superoksiidi dismutaasi (SOD) abil vesinikperoksiidiks, mis on vhem toksiline 2H2O22H2O+ O2 (katalaas)

O2- ' +O2- '+ O2+ H2O2 (SOD) E. coli produtseerib kahte tstoplasmaatilist SOD Mn-SOD (SodA) ja Fe-SOD (SodB). Nende ensmide suhtes mutantsed tved kasvavad aeglasemalt ja on tundlikumad DNA kahjustuste suhtes kui algsed tved. Periplasmas lokaliseeruv Cu/Zn-SOD (SodC) kaitseb periplasma ja membraani komponente reaktiivsete hapnikuradikaalide eest. Reaktiivsete hapnikuradikaalide mitteensmaatiline kahjutustamine toimub glutatiooni toimel. O2- ' , OH ja H2O2 redutseerimisel glutatiooni abil tekib H2O. Glutatiooni rakusisene kontsentratsioon on krge (kuni 10 mM). Oksdatiivse stressi vastased kaitsemehhanismid. Normaalse metabolismi kigus tekivad bakterirakus superoksiid ja vesinikperoksiid. Nendest kahest hendist vivad tekkida vga reaktiivsed hdrokslradikaalid, mis kahjustavad rakus bioloogilisi makromolekule. Praeguseks on tpsemalt kirjeldatud kahte ssteemi, mis reguleerivad oksdatiivse-stressi vastust rakkudes, need on OxyR ja SoxRS. OxyR-regulon koosneb heksast geenist, millede ekspressioon on aktiveeritud vesinikperoksiidi poolt. Kikide nende geenide ekspressiooni kontrollib OxyR. Nimetatud valk kuulub klass I tpi aktivaatorite hulka, mis olles seondunud DNAga interakteerub RNA polmeraasi -subhikuga. OxyR aktiveerimiseks on vajalik tema oksdeerimine, mille tulemusena tekib disulfiidside tssteiini jkide vahel positsioonides C199 ja C208. OxyR reguleerib jrgmiste geenide ekspressiooni: katalaas (katG), glutatioonreduktaas (gorA), jt. SoxRS reguloni kuulub heksa geeni, millede ekspressioon on aktiveeritud superoksiidi kuid mitte vesinikperoksiidi poolt. Esmalt tunneb signaali ra SoxR valk, mis kannab selle le SoxS valgule, mis omakorda seondub oksdatiivse stressi reguloni teiste geenidega. SoxR valgu aktiivtsentris paikneb kaks stabiilset 2Fe-2S aktiivtsentrit, mis on seotud nelja tssteiinijgiga. Oksdatiivsestressi tingimustes nimetatud aktiivtsentrid oksdeeruvad kiiresti. Muutused valgu redoksolekus indutseerivad valgu lemineku aktiivsesse vormi, kuid ei muuda tema seondumise afiinsust nii SoxR redutseeritud kui ka oksdeeritud vormid seonduvad soxS promootoriga. pH-stress. Keskonna pH mjutab mikroobide kasvu, kusjuures see mju vib olla nii otsene kui ka kaudne. Enamus mikroobe eelistab kasvukeskkonda, mille pH on neutraalne vi sellele lhedane (pH 5-8). Selliseid baktereid nimetatakse neutrofiilideks (E. coli, S. enterica, Bacillus subtilis). Bakterite hulgas leidub aga ka selliseid, kes suudavad elada soodajrvedes, kus pH vib olla 11, selliseid baktereid nimetatakse alkalofiilideks. Teise rmusse kuuluvad atsidofiilid suudavad ellujda ka keskkonnas, kus pH~1.0. Kui mikroobid satuvad rmuslikult madala pHga keskkonda, llituvad tle spetsiifilised kaitsemehhanismid. Sellises situatsioonis llituvad sageli tle ensmid, mis muudavad happelised metaboliidid neutraalseteks vi neutraalsed metaboliidid aluselisteks. Headeks nideteks selliste ensmide kohta on glutamaatdekarbokslaas, lsiindekarbokslaas, ureaas, mille ekspressioon indutseeritakse vastusena pH langusele keskkonnas. Mnedes bakterites on tolerantsus happelise pH suhtes seotud ka Mg2+ sltuvate ATPpaasidega. Vimet hoida tstoplasmaatilist pH-d konstantsena sltumata vliskeskkona pH-st nimetatakse homostaasiks. Gram(-) bakterid kasutavad enamasti stabiilse pH silitamiseks, kas prootonpumpa vi ka K+/H+ vi Na+/H+ antiportereid. Kui bakterirakke on lhiajaliselt inkubeeritud pH 4,3-6,0 juures, on nende ellujvus pH 3,0 juures mrksa krgem, kui neutraalse pH juures kasvanud sama organismi rakkudel. Geneetilisi ja fsioloogilisi muutusi, mis rakkus toimuvad nimetatakse ka acid tolerance response (ATR). Happeline keskkond indutseerib statsionaarse faasi sigmafaktori S ekspressiooni, mis kutsub rakus esile leldise stressivastuse. Rakud on adapteerunud tnu uute valkude snteesile. Kokku indutseeritakse rakus ATR korral ligikaudu 50 uue valgu sntees, vastavaid valke on hakatud nimetama happeshoki valkudeks (acid shock protein). Aeglase kasvukiirusega vi statsionaarse faasi rakud on happelise keskkonna suhtes mrksa resistentsemad kui eksponentsiaalse faasi rakud. Tstoplasma pH muutustega aktiveeritakse rakus ka mitmed DNA reparatsioonissteemid, nende hulgas niteks SOS DNA reparatsiooni ssteemi komponendid. Temperatuuristress Temperatuuri kikumisel optimaalsest les vi alla phjustab rakkude kasvu aeglustumise vi peatumise. Suurte temperatuuri kikumiste korral tekivad hired membraanide normaalses funktsioneerimises. Temperatuuritusu korral suureneb membraanide lipiidse kihi voolavus, mis phjustab mnede ioonide kontrollimatut liikumist lbi membraanide. Selle tulemusena kaob prootongradient. Termofiilidel (kasvavad edukalt 80 C juures) on seetttu vlja kujunenud energiagenereerimise ssteem, mis pumpab prootonite (H+) asemel rakku Na+ ioone, kuna membraani lbilaskvus Na+ ioonide suhtes temperatuuritusu korral mrkimisvrselt ei suurene. Selleks, et membraanide lbilaskvus psiks enam-vhem hesugune, snteesitakse erinevatel temperatuuridel erinevaid rasvhappeid. Madalal temperatuuril snteesitakse lhikese ahelaga ja lahustuvaid (kullastamata e. unsaturated) rasvhappeid, temperatuuritusu korral aga lahustumatuid, pika ahelaga rasvhappeid. Muutused membraani lipiidses komponendis ei vaja ldjuhul uute ensmide snteesi, kuna vastavate ensmide aktiivsust mjutab temperatuur. Kui temperatuur tuseb bakteri kasvamiseks optimaalsest krgemale, vib see viia valkude denatureerumisele ning selle tulemusena vheneb rakus toimuvate fsioloogiliste protsesside aktiivsus. Phimtteliselt tuseb

ensmi aktiivsus temperatuuri tstmisel 10 C vrra ligikaudu 2-korda. lempiiriks on ensmi stabiilsus. Termofiilsete bakterite ensmid on termostabiilsemad tnu mittekovalentsetele interaktsioonidele aminohapete vahel. ldist seadusprasust on siin raske vlja tuua, kuna iga ensmi puhul on sidemete kombinatsioon erinev. Temperatuuri tustes peab rakk suutma stabiliseerida rakus olevat DNA. heks kaitsemehhanismiks on DNA positiivse superspiralisatsiooni suurendamine. Lisaks on DNA kaetud histoonilaadsete ja teiste DNA-ga seonduvate valkudega. Temperatuuri tustes 30C juurest 40C indutseerib E. coli rakus terve hulga valkude snteesi, mida nimetatakse kuumashoki valgud (heat shock proteins, HSP). Paljud neist on vajalikud ka rakkude elutegevuseks krgematel temperatuuridel DnaJ ja DnaK; GroES ja GroEL (shaperonid), Lon-proteaas, LysU. Kokku indutseritakase ligikaudu 50 valku. H-regulon kontollib tstoplasmaatiliste HSP valkude snteesi. E. coli`s kodeerib selle faktori snteesi rpoH lookus. rpoH transkriptsioon vib toimuda mitmelt erinevalt promootorilt. Promootorid P1, P4 ja P5 on transkribeeritavad normaalsel temperatuuril, P3 HS vastusena (E kontrolli all) ja P5 on reguleeritud cAMP poolt. Promootorite P4 ja P3 ees on DnaA boxid. H tase rakus on reguleeritud peamiselt transkriptsioonijrgselt. Regulatsioon toimub nii translatsiooni efektiivsuse, mRNA stabiilsuse kui ka valgu stabiilsuse kaudu. rpoH mRNA 5 otsas on jrjestus, mille baasil moodustub sekundaarstruktuur, mis blokeerib osaliselt translatsiooni initsiatsiooni. Selle sekundaarstruktuuri psivus rakus sltub temperatuurist. Krgemal temperatuuril sekundaarstruktuur laguneb, muutes mRNA ribosoomidele kttesaadavaks. H vahendatud regulatsioon on rakus seotud DnaK-DnaJ-GrpE shaperonidega. Madalal temperatuuril DnaK-DnaJ-GrpE kompleks blokeerib H seondumise RNA-polmeraasiga. Temperatuuri tstmisel suureneb rakus vigaste valkude hulk, mis seondudes vhendavad vaba kompleksi DnaK-DnaJ-GrpE hulka, mis omakorad tstab vaba H hulka. Selles regulatsiooni ssteemis osaleb alarmon diadenosiintetrafosfaat, mida snteesib aminoatsl-tRNA sntetaas madala tRNA kontsentratsioonil. E regulon kaitseb ekstratstoplasmaatilise stressi eest. E reguleerib degP (htrA) periplasmas lokaliseeruva proteaasi, fkpA ja rpoE rseABC operonide ekspressiooni. RseA on transmembraanne valk, mille tstoplasmas paiknev domn interakteerub E kui anti sigma faktor. Lisaks interakteerub RseA ka periplasmas paikneva RseBga. Stressi tingimustes proteaas DegS lagundab RseA, mille tulemusena viimane kaotab oma mju E. Normaalsel temperatuuril RseB kaitseb RseAd DegSi proteoltilise aktiivsuse eest. Sellese ssteemi kuulub ka kahekomponendiline regulatsioonissteem CpxR/A. Nlgivas kultuuris tekkiv stress. Bakterirakkude kasvukiirus sltub toitainete kttesaadavusest kasvukeskkonnast ning keskkonna fsikalistest parameetritest. Looduses on tavaliselt vimalike toitainete hulk vga limiteeritud. Kui E. coli satub keskkonda, kus toitainete kttesaadavus on piiratud, reprogrammeeritakse rakus mber paljud fsioloogilised protsessid, mida nimetatakse ka starvation-stress response (SSR). SSR vimaldab bakteritel ellujda tingimustes, kus toitaineid normaalseks kasvuks ei ole kllaldaselt. Bakterite kasvamine sellistes tingimustes muudab ta ka resistentsemaks paljude teiste stressi faktorite suhtes (krge temperatuur, pH, osmootne stress). Eristada tuleb kindlasti kahte tpi rakke ja neis olevat fsioloogilist situatsiooni: nlgivad rakud ja statsionaarse-faasi rakud. Statsionaarse-faasi rakud ei paljune, kuigi see ei ole tingitud toitainete vi mnede muude kasvuks vajalike ainete puudumisest (kasvu prssivad tegurid ei ole sageli selgelt defineeritavad). Nlgivas rakukultuuris aga on limiteerivaks faktoriks mingi kindel komponent (ssinikuallikas, vitamiin, aminohape). Teiseks philiseks erinevuseks statsionaarses-faasis oleva kultuuri ja nlgiva kultuuri vahel on rakkude arvukus 1 ml kultuuris. Lisaks sellele on nlgivad rakud nii morfoloogiliselt kui fsioloogiliselt normaalsetest rakkudes erinevad. Kige esmane vastus ssinikuallika limitatsioonile keskkonas on mehhanismide kivitumine rakus, mis vimaldaksid bakteril hakata kasutama mingit alternatiivset ssinikuallikat. Vajadusest kogu raku fsioloogilised protsessid mberkorraldada, annavad bakterile mrku kahe nn. signaalmolekuli kogunemine rakus. Kaks olulist signaalmolekuli, mis nlgivates rakkudes kogunevad on: tskliline 3`-5`adenosiinmonofosfaat (cAMP) ja guanosiin 3`-5`difosfaat (ppGpp). Lisaks sellele osalevad SSR protsessis ka kaks alternatiivset sigmafaktorit: S ja E . Nimetatud faktorid kontrollivad SSR nn. globaalse regulatsiooni tasandil. Lisaks sellele osalevad siin ka nn. spetsiifilised regulaatorid, mis kontrollivad ksikute geenide ekspressiooni. Nende hulka kuuluvad: Fis (factor for inversion stimulation), FadR (regulator of fatty acid metabolism, (represseerib rasvhapete biosnteesi ja soodustab degradatsiooni), Lrp (leucine-reponsive protein), ArcA/ArcB regulatsiooni ssteem jt. Stringent response Kikide vajalike toitainete olemasolu korral kasvukeskkonnas paljunevad bakterid optimaalse kiirusega. Kui keskkonnatingimused muutuvad toitainete ammendumise tttu ebasoodsamaks, toimub rakkudes RNA hulga vhenemine (eriti rRNA ja tRNA), aeglustub DNA replikatsioon ja valkude, lipiidide, nukleotiidide biosntees. Samuti pidurdub paljude makromolekulide transport rakku. Sellist kompleksset mberkorraldust rakus on hakatud nimetama stringent response vi stringent control (SR). SR vallandub rakkudes vastusena aminohapete nljale ja vimaldab neil adapteeruda tingimustes, kus energiaressursid on viksemad. Selle tulemusena pikeneb rakkude generatsiooniaeg.

Kiiresti kasvavates rakkudes kulutatakse suurem osa energiast ribosoomide snteesiks. Ribosoomide snteesi blokeerimine on ks philisi energia konserveerimise viise. Pikemaajalise nlgimise puhul vib rakkude kasv hoopis peatuda ja rakud psivad puhkeasendis e. statsionaarses faasis. Statsionaarsesse faasi minekul vib olla ka muid phjuseid kui ainult toitainete nlg. Kui kasvu limiteerivaks faktoriks on aminohapete nlg, hakatakse rakkudes snteesima ebaharilikku nukleotiidi ppGpp-d (guanosiintetrafosfaat). Mingi aminohappe puudusel seondub transleeriva ribosoomi aktseptorsaiti laadimata tRNA molekul. Selle tulemusena translatsioon peatub ning aktiveerub ribosoomi 50S subhikuga seondunud RelA. Nimetatud valk on (p)ppGpp sntetaas I, mis katalsib ATP-lt profosforlrhma lekande GTP 3 hdrokslrhmale. ppGpp snteesi puhul on kirjeldatud ka RelA-sltumatut rada, milles osaleb (p)ppGpp sntetaas II nimetusega SpoT. SpoT aktiveerub vastusena pikemaajalisele C-nljale ja ei sltu ribosoomide seisundist. Kui kasvukeskkond normaliseerub (kik vajalik bakteri normaalseks kasvuks on olemas), ppGpp lagundatakse. ppGpp degradatsiooni GDP-ks viib lbi SpoT. 16. SOS VASTUS JA DNA REPARATSIOON. Raku elutegevuse seisukaohalt on rmiselt thtis, et ta oleks vimeline krvaldama DNA-s tekkinud mutatsioone. Bakterites on kirjeldatud mitmesuguseid mehhanisme, mis vastutavad DNA ahelasse valesti llitatud vi mutageenide ning kiirguse toimel muutunud nukleotiidide krvaldamise eest. Reparatsiooni ssteeme vib jaga pre- ja postreplikatiivseteks. Osa reparatsiooni protsesse on sltuvad RecA valgust. RecA on valk, mis osaleb homoloogilse rekombinatsiooni lbiviimisel. Lisaks RecA valgule on homoloogilise rekombinatsiooni toimumiseks vajalik RecBCD osalemine. RecBCD kompleksil on helikaasne aktiivsus, millega kaasneb ka eksonukleaasne aktiivsus, mis avaldub siis, kuni kompleks juab Chi saidini (asmeetriline 8-nukleotiidne jrjestus) ning seal toimib RecBCD endonukleaasina. Chi sait inaktiveerib RecBCD eksonukleaasse aktiivsuse ning edasi kitub RecBCD kompleks ainult kui helikaas. RecA valk seondub ssDNA-ga ja moodustunud ssDNA-RecA kompleks seondub teise kaksikahelalise DNA molekuliga. Homoloogiliste piirkondade olemasolul moodustub kahe DNA molekuli vahel Holliday struktuur kus DNA ahelad on risti. Holliday riststruktuur liigub edasi helikaaside RuvA ja RuvB toimel. Kui homoloogiline regioon kahe DNA molekuli vahel lpeb, lagundatakse tekkinud Holliday struktuur RuvC valgu toimel. RecA valk osaleb ka nn. postreplikatsioonilises reparatsioonis. Kui niteks DNA ahelast ei ole krvaldatud primidiini dimeeri enne DNA replikatsiooni, jb selle vastu uuesti snteesitavas ahelas thimik, sest DNA polmeraas ei ole vimeline kasutama dimeeri templeidina. Selle defekti krvaldamiseks viib RecA homoloogia alusel omavahel kontakti kahjustusega ja intaktse DNA molekuli. RecA valk osaleb ka DNA rekombinatsioonilises reparatsioonis ssDNA ja dsDNA katkete puhul. DNA kahjustuste (UV-kiirgus, alkleerivad hendid, tmiini vaegus, ravimid) tagajrjel tekib rakkudes sageli ssDNA. Viimane aktiveerib RecA valgu ning moodustub nukleoproteiinne struktuur. RecA aktiveeritud vorm RecA* interakteerub LexA-ga, mis on paljude reparatsioonil osalevate regulonide repressoriks. RecA*-ga interakteerumise tagajrjel toimub LexA autoproteols. Raku sellist reaktsiooni DNA kahjustusele nimetatkse SOS vastuseks. Lisaks tmiini dimeeride tekkele DNA ahelas on raku fsioloogiliseks vastuseks UV kiirgusele ka raku jagunemise peatumine. Selle tulemusena tekivad vljaveninud nn. filamentsed rakud. LexA valgu lagundamine rakus kivitab SulA valgu snteesi, mis on oma funktsioonilt raku jagunemise inhibiitor, blokeerides ftsZ geeni ekspressiooni. Aeglustunud rakkude jagunemine vimalda reparatsiooni ssteemidel krvaldada DNA kajustused enne replikatsiooni ja vltida sellega nende prandumist. he SOS vastusena kivitatakse rakkudes ka SOS mutagenees. Selle protsessi tulemusena DNA ahelast vigu ei krvaldata, vaid jtkatakse vigade rohket DNA replikatsiooni. LexA valgu puudumisel aktiveeritakse umuDC operon. RecA valgu toimel aktiveeritakse UmuD ning tekib aktiivne UmuD. Vigaderohkel DNA replikatsioonil osaleb UmuD2C kompleks. UmuD intaktne valk on SOS mutageneesi inhibiitoriks, ta moodustab inaktiivse UmuD-UmuD heterodimeeri. Kui replikatsioon peatub vigase nukleotiidi juures, llitatakse snteesitavasse ahelasse juhuslik nukleotiid ja replikatsioon saab jtkuda. Praeguse mudeli kohasel UmuD2C toimel vheneb DNA polmeraas III 3 5 proofreading aktiivsus. Lisaks mjutavad modifitseerimata UmuD ja UmuC rakkude kasvu nlgivas kultuuris, mis annab rakkudele lisaaega mutatsioonide krvaldamiseks. Sellele jrgneb RecA sltuv UmuD modifitseerimine, mis vimaldab UmuD2C replikatsiooni kohtades, kus vigased lmmastikalused jid krvaldamata. DNA reparatsioon. DNA ahelast vigade (valede nukleotiidide) krvaldamiseks on bakteritel mitmeid vimalusi. Replikatsioonil DNA ahelsse valesti llitunud nukleotiidi vib krvaldada DNA polmeraas III tnu 35eksonukleaassele aktiivsusle. Kige lihtsamaks ja otsesemaks mehhanismiks on vea parandamine kohapeal, ilma nukleotiide DNA ahelast krvaldamiseta. Alkleerivate hendite (lmmastikushape) toime vib phjustada alklrhma lisamist lmmastikalusele. Tekkinud kahjustuste krvaldamine toimub metltransferaaside abil. Nii niteks kannab metltransferaas Ada metlguaniinilt O6-MeG metlrhma iseenda tssteiini jgile (Cys-321). Mitmed

DNA reparatsioonissteemid krvaldavad DNA kahjustust sisaldava segmendi hest ahelast ja snteesivad puuduva DNA jrjestuse teise ahela nukleotiidse jrjestuse baasil. Lisaks vib toimuda defektse jrjestuse asendamine korrektsega rekombinatsioonilise vahetuse teel (RecA valgu vahendusel). Mitmete reparatsioonissteemid krvaldavad DNA ahelas oleva kahjustatud nukleotiidi vljalikamise teel. Sageli satuvad bakterid UV kiirguse ktte, mille tulemusena tekivad DNA ahelas kahjustused. Selliste kahjustuse krvaldamise eest vastutab UvrABC kompleks. Kuigi uvrA, uvrB ja uvrD geene transkribeeritakse rakus pidevalt, on nende transkriptsioonitase LexA repressori poolt mahareguleeritud ning tuseb SOS vastuse kigus. UvrA (defektset N-alusti tundev valk) ning UvrB tunnevad DNA-l ra vigase koha, seejrel dissotsieerub kompleksist UvrA ning sellele jrgnevalt seondub UvrB ja defektse alaga UvrC. UvrB omab endonukleaasset aktiivsust ning ta krvaldab vigastatud nukleotiidi koos klgneva ~12 nukleotiidiga. DNA polomeraas I ja UvrD helikaas krvaldavad vljaligatud piirkonna ning asemele snteesitakse ilma veata DNA fragment. Rakus omab thtsat rolli ka nn. mismatch reparatsiooni ssteem, millesse kuuluva mutH, mutL ja mutS. Nimetatud mismatch reparatsioon krvaldab vea vahetult peale DNA replikatsiooni toimumist, krvaldades valestipaardunud nukleotiidi metleerimata DNA ahelast. Vga erinevatel phjustel vivad bakterirakus tekkida aktiivsed hapnikuradikaalid, mille toimel vib guaniinist moodustuda 8-hdroksguaniin (GO). Replikatsioonil viib DNA polmeraas GO vrdse efektiivsusega nii C kui A vastu. Valepaardumisest phjustatud asendusmutatsioonide vltimiseks on E. colis olemas 3 valku MutM, MutT ja MutY. 17. KEMOTAKSIS. Bakterirakud liiguvad kas viburite abil (enamus grampositiivseid ja gramnegatiivseid baktereid) vi libisevad tahkel pinnal (fototroofsed tsanobakterid). Liikumine toimub viburite abil, mis vivad omada erinevat asetust raku pinnal. Bakterite liikumine on tingitud viburite prlemisest. Viburid prlevad, kas pripeva (CW, clockwise) vi vastupeva (CCW, counter clockwise). Kemoatraktandi vi mne muu atraktandi puudumisel keskkonnas on bakteriraku liikumine kaootiline. Viburite prlemissuund vahetub perioodiliselt. E. colil vahelduvad 1-sekundiline periood, kus viburid prlevad vastupeva perioodiga, kus viburite prlemine toimub pripeva (0,1 sekundit), selle tulemusena rakk tmbleb he koha peal (tumblig), kuna iga vibur lkkab rakku erinevas suunas. Seega on raku liikumise trajektoor sik-sakiline. Kemoatraktandina ilmumisel keskkonda, ujuvad bakterirakud selle kontsentratsioonigradiendi suunas. Tavaliselt liiguvad bakterid atraktandi suunas ja eemalduvad ebasoodsatest signaalidest. Liikumist e. taksist stimuleerivad lisaks keemilistele henditele ka osmootne rhk (osmotaksis), valgus (fototaksis), temperatuurimuutused (termotaksis), mehhaanilised stiimulid (tigmotaksis), elektrivool (galvanotaksis) vi magnetvli (magnetotaksis). Kemotaksise mehhanismide uurimisel on heks oluliseks probleemiks selgitada, kuidas bakterid tunnetavad erinevate kemoatraktantide olemasolu keskkonnas ning vastavalt sellele moduleerivad viburite liikumist. E. colis reguleerivad viburite liikumist raku membraanis paiknevad retseptorid ja kuus tstoplasmas lokaliseeruvat Che-valku, mis osalevad signaali lekandes retseptoritelt viburi mootorile. Che valkude hulka kuuluvad: CheA, CheW, CheY vi CheZ. CheY kuulub response regulaatorite hulka, mis fosforleeritud olekus seondub viburi mootorile, pannes selle prlema pripeva. lejnud Che valgud osalevad kas otseselt vi kaudselt signaalse transduktsiooni rajas, mis moduleerib CheY fosforleerimist. Viburi mootor on suur makromolekulaarne kompleks. Selle struktuuriga on seotud Fli valgud, mille kaudu toimub prlemise llitamine CW suunalt CCW suunale ja vastupidi. Fosforleeritud CheY interakteerub FliM-ga ning vibur hakkab prlema CW suunas. Signaali lekanne rakkudele. Spetsiifilised membraanis paiknevad reteptorid interakteeruvad adaptervalguga CheW, mis omakorda moduleerib histidiini proteiini kinaasi CheA. CheA fosforleerib nii CheY kui ka CheB. CheY omab ka autofosfataasset aktiivsust, mistttu ta silitab fosforleeritud oleku ainult lhiajaliselt. Lisaks mjutab CheY defosforleerimist ka CheZ. Kemoatraktandi seondumisel retseptorvalguga ei interakteeru retseptorvalk CheWga ning signaali lekannet CheY fosforleerimiseks ei toimu. Seega, kui kemoatraktandi kontsentratsioon tuseb, viib see alla CheY fosforleerimise taseme ning viburid prlevad vastupeva (CCW suunas), vimaldades rakkude suunatud liikumist. Juhul, kui rakk puutub aga kokku negatiivse stiimuliga vi kui positiivse kemoatraktandi mju lakkab, kivitub signaalse trasduktsiooni rada, mille tulemusena CheY fosforleeritakse ning viburite prlemine llitub pripeva suunale (CW suunale). Rakkude adapteerumine Transmembraansed retseptorvalgud (MCP valgud) vivad olla kas metleeritud vi demetleeritud olekus. Nendes protsessides osalevad metltransferaas CheR ja metlesteraas CheB. Fosforleeritud CheB, mis kitub metlesteraasina, hdrolsib metlrhmad. Arvestades asjaolu, et CheR-i aktiivsus psib rakus muutumatuna, mjutab MCP valkude metlatsiooni taset philiselt CheB olek rakus valk vib esineda nii CheB kui ka CheBP vormis. Positiivsed stiimulid inhibeerivad CheA ning sellises olukorras ei toimu ka CheB aktiveerimist. Kuna metltransferaas CheR on rakus pidevalt aktiivne, metleeritakse positiivse stimulatsiooni korral enamus saite. Negatiivse stimulatsiooni puhul on aga ainult vhesed saidid metleeritud, kuna sel juhul on CheB aktiveeritud.

Kui MCP retseptorvalk on metleeritud, vheneb selle afiinsus atraktandile. MCP valkude metleerimine kutsub esile vastupidise efekti kemoatraktandi seondumisele see soodustab CheA autofosforleerumist. Selleks, et laguneks retseptori kompleks CheW ja CheA-ga ning viburid hakkaksid uuesti prlema CCW suunas, on vaja krgemat atraktandi kontsentratsiooni. Seega vimaldab adapteerumine rakkudel otsustada, kas liikuda suunatult edasi vi psida paigal. 18. PURIINIDE JA PRIMIDIINIDE SNTEES. Puriin ja primidiin nukleotiidid on hed philised energia kandjad, nukleiinhapete komponendid ja selliste kofaktorite nagu NAD ja SAM prekursorid. Nukleotiidide snteesiks on kaks philist snteesirada: de novo ja nn. pstmis (salvage) snteesi tee. De novo snteesi korral lhtub rada 5-fosforibosl-1-profosfaadist (PRPP) ning lisaks kasutatkse snteesil selliseid lihtsaid molekule nagu CO2 , aminohapped ja tetrahdrofolaat. Puriinide sntees Puriin nukleotiidide sntees lhtub 5-fosforibosl-1-profosfaadist (PRPP) ja mitmeetapilisi snteesiprotsessi tulemusena lpeb inosiin-5-monofosfaadi (IMP) tekkega. Snteesi esimeses etapis toimub amido-rhma lekanne glutamiinilt PRPP molekulile mida viib lbi ensm PRPP amidotransferaas. Kuna PRPP kasutatkse ka histidiini, trptofani ja NAD snteesil, mjutavad hired PRPP snteesil mitmeid organismi eluthtsaid protsesse. IMP molekuli snteesiks kulub 5 molekuli ATP-d, 1 molekul gltsiini, 1 molekul glutamiini, 1 molekul CO2, 1 molekul aspartaati ja kaks molekuli formiaati. Formljgi kandjaks on N10-forml-tetrahdrofolaat. Moodustunud IMP-st edasi toimub puriinide biosnteesi raja hargnemine. IMP on lhtehendiks nii AMP kui GMP snteesiks. AMP snteesiks vajalik energia saadakse GTP hdrolsil ning GMP snteesiks vajalik energia aga ATP hdrolsil. GTP tarbimine AMP snteesiks vimaldab hoida rakus AMP ja GMP hulka vajalikul tasemel. GTP liigne akumulatsioon rakus phjustab AMP snteesi kiirenemist IMP-st. Liigse GTP kogunemine rakku phjustab AMP snteesi kiirenemist IMP-st rakus oleva GMP arvel. Ja vastupidi, kuna GMP sntees IMP-st vajatakse ATP-d, viib ATP kogunemine rakus GMP kiiremale snteesile vrreldes AMP-ga. Puriinide snteesi regulatsioon Puriinide tootmist rakus reguleeritakse philiselt snteesiraja kahe esimese ensmi aktiivsuse kaudu. 5-fosforibosl-1-profosfaadi (PRPP) snteesi lbiviiva ensmi PRPP sntetaasi (PrsA) aktiivsuse regulatsioon toimub peamiselt tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu biosnteesiraja lpp-produkti AMP ja GMP poolt. Inhibitsioon on kige tugevam siis kui rakus on saavutatud mlema nukleotiidi optimaalne kontsentratsioon. PRPP amidotransferaasi (PurF) aktiivsuse regulatsioon toimub samuti tagasisidestuslikul inhibitsioonil. Nimetatud ensm omab kahte erinevat seondumissaiti, ks ATP, ADP vi AMP joks, teine GTP, GDP vi GMP jaoks. Nukleotiidi seondumine ensmiga phjustab selle inhibitsiooni. PRPP seondumine ensmiga phjustab vastupidise efekti. Lisaks toimub puriinide snteesi regulatsioon biosnteesiraja hargnenud ahelates. IMP dehdrogenaasi (GuaB) aktiivsus on inhibeeritud tagasisidestusliku inhibitsiooni vahendusel, lisaks represseerib GMP vastava ensmi snteesi. Kaks ensmi, PurA ja PurB, mis osalevad AMP snteesil, on samuti reguleeritud tagasisidestusliku inhibitsiooni kaudu. Puriini biosnteesi rajas osalevate ensmide sntees on reguleeritud ka transkriptsiooni tasemel. Kik puriinide snteesis osalevad 8 operoni on reguleeritud negatiivse regulaatori PurR ja tema vastatvate korepressorite poolt. purR geeni pealt snteesitakse aporepressor, mis hineb korepressorite kas hpoksantiini vi guaniiniga ja blokeerib operonide t. Primidiinide sntees De novo primidiinide sntees toimub mda nn. orotaat-rada, kus UMP snteesitakse karbamolfosfaadist. he primidiinaluse snteesiks kulub 1 mool glutamiini, 1 mool ATP-d, 1 mool CO2 ja 1 mool aspartaati. Lisaks on snteesi lpus vaja veel 1 mool glutamiini ja ATP-d, et snteesida UTP-st CTP. Primidiin nukleotiidi sntees algab karbamolfosfaadist, mis moodustub HCO-3, ATP ja glutamiinist ning mille viib lbi karbamolfosfaat-sntetaas. Rakus on veel olemas karbamolfosfaatsntetaas A, mis snteesib karbamolfosfaati arginiini snteesiks. Kolme jrgneva reaktsiooni kigus toimub primidiintuuma moodustumine. Edasi toimub PRPP vetud fosforibosl-rhma liitmine primidiintuumaga, mille tulemusena moodustub oroditiin -5-monofosfaat. Viimase dekarboksleerimisel saadakse esimene primidiinnukleotiid UMP. Primidiinide sntees erineb puriinide snteesist kahes olulises punktis. Esiteks, ringstruktuur moodustub kui vaba alus, mitte ei ehitata eda les PRPP molekuli peale. Siin lisatakse PRPP alles lplikult snteesitud primidiin alusele (orotic acid), mille tulemusena moodutub orotaatmonofosfaat (OMP), mis jrgnevalt dekarbokleeritakse ning moodutud UMP. Teiseks, ei toimu biosnteesiraja hargnemist. UMP fosfolrleeritakse kaks korda, mille tulemusena moodustub UTP. Esimest fosforleerimis katalsib uridlaatkinas, teis fosforleerimist nukleosiiddifosfaatkinaas. CTP saadakse UTP-st viimase amineerimisel. Primidiinide snteesi regulatsioon. Primidiinide snteesi regulatsioon toimub philiselt raja esimese ensmi aspartaat-karbamlaasi (ATCaas) kaudu. E. colis koosneb vastav ensm kataltilisest (pyrB) ja regulatoorsest (pyrI) subhikust. Ensmi

aktiivsust sltub sellest, missugune nukleotiid on seostunud regulatoorse subhikuga ATP seondumine soodustab, CTP ja UTP seondumine aga inhibeerib ensmi blokeerides substraadi seondumist ensmi kataltilise subhikuga. 19. PEREMEES-PATOGEEN INTERAKTSIOON. Esimene etapp peremees-patogeen interaksioonis on esmane kontakt mikroobi ja peremehe vahel. Sellele jrgnevalt vib tekkida kaks situatsiooni: mikroob hukkub vi tekib tekivad teatud tpi suhted mikroobi ja peremeesraku vahel, mis vib eksisteerida jrgmistes vormides: kommensialism kooselu vorm, mis ei kahjulik ei mikroobile ega peremees rakule, smbioos kooselu vorm, mis on kasulik mlemale osapoolele, parasitism patogeenne mikroob elab peremees raku arvel. Infektsiooni esimeses etapis toimub patogeeni esmane kinnitumine permees rakule ja sellele jrgnev koloniserumine raku pinnal. Tavaliselt kasutab patogeen selleks vibureid vi piilisid. Koloniseerimisele jrgnevalt toimub kas patogeeni vi tema poolt produtseeritud produktide (nit. toksiinide) tungimine nakatatud rakku, millele jrgneb mikroobi paljunemine ja levimine nakatunud organismis. Selleks et peremeesorganismis edukalt paljuneda ja levida, peab patogeen olema vimeline rakust omastama vajalikke toitaineid. Nii niteks on patogeenidel vljakujunenud spetsiifilised mehhanismid, mis vimaldavad neil omastada nakatunud organismist rauda. Kuid kuna ka peremees rakud samuti vistlevad aktiivselt raua omastamise eest, on osadel patogeenidel olemas spetsiifilised ssteemid, mis vimaldavad vabastada peremeesrakust rauda. Nii produtseerivad mned patogeenid hemolsiini, mis lsib ertrotste ning mille tulemuse vabaneb rakkudes olev hemoglobiin. Adhesioon/Koloniseerimine. Enamus gram(-) patogeene (E. coli, Salmonella enterica jt.) kinnitub peremees raku pinnale viburite vi piilide abil. Patogeenid omavad keerulist valkude kompleksi, mis viib lbi nende biogeneesi. Tavaliselt osalevad selles spetssifilised valgud chaperonid ja usherid. Viburit moodustavad valgud transporditakse periplasmasse, kus nad interakteeruvad chaperonidega, et neid stabiliseerida vltimaks nende enneaegset vastastikkust interaktsiooni. Sellele jrgnevalt transporditakse nad usher valkude juurde, mis moodustavad vlismembraanis paikneva kanali, lbi mille toimub nende translokatsioon bakteri pinnale. Samaaegselt translokatsiooniga toimub ka viburite lpplik assambleerumine funktsioonaalseteks viburiteks. Viburid jagatakse nelja rhma: tp I, II, III ja IV. Tp I vibureid omaval patogeenil on vime seonduda ertrotstide pinnale. Seda seondumis on vimalik blokeerida mannoosi lisamisega keskkonda. Selleprast nimetatakse seda tpi seondumist ka mannoos-tundlikuks hemaglutinatsiooniks (MSHA). Tp I vibureid omavad paljud patogeensed E. coli, Salmonella enterica, Klebsiella spp. ja Vibrio spp. tved. Praeguseks on selgunud, et mitte kik tp I viburid ei ole mannoosi tundlikud, seega esineb ka mannoos-mittetundlikku hemaglutinatsiooni (MRSA). Tp II viburid on tp I viburite mutantsed vormid, kuna nad on sarnased tp I viburitele, kuid on mitte adhesiivsed. Tp III viburid vivaldavad MRSH kuid ainult siis kui rakke on eelnevalt tdeldud taniiniga. Tp IV viburid on immunoloogiliselt erinevad tp I viburitest kuid phjustavad siiski MRHA. Selline klasifikatsioon on juba vananenud ning praegu kasutatakse klassifikatsiooni, mis phineb viburite aminohappelise jrjestuse vrdlemisel. Lisaks sellele kasutatakse ka klassifikatsiooni, mis phineb ka viburite spetsiifilistel omadustel: polonefriidiga seotud viburid (Pap e. p viburid), kimpe moodustavad viburid (BFP viburid), toksiiniga koos reguleeritud viburid (TCP viburid). Praeguseks on heks paremini biogeneesi seisukohalt uuritud viburiks uropatogeense E. coli Pap vibur e. P vibur, mis vimaldavad patogeenil kinnituda raku pinnal olevatele retseptoritele. Vastavad geenid paiknevad papoperonis. Viburi philiseks subhikuks on valk PapA, mis on seotud bakteri vlismembraaniga seotud valgu PapH vahendusel. Viburi tipus paikneb fibrilliin PapE valk ja vibur lpeb tipu adhesiiniga Pap G, mis on valalik seondumiseks peremees raku pinnal paiknevate glkolipiididega. Preaguseks on kirjeldatud kolme PapG alleeli klass I, II ja III mis vimaldavad seondumist eritpi retseptoritega. Viburi snteesis omab thtsat funktsiooni chaperon PapD. Mitte-viburilised adhesiinid. Hingamisteedes olev patogeen Bordetella pertussis (lkakha tekitaja) snteesib nii rakkudele kinnitumiseks nii vibureid kui ka mitteviburilisi-adhesiine. Viimaste hulka kuuluvad sellised nagu filamentne hemaglutinatsiooni phjustav valk, pektratsiin, lkakha-toksiin ja BrkA valk. Analoogse funktsiooniga valke on kirjeldatud ka Yersisnia enterocolitical YadA valk (seondub fibronektiiniga), Streptococcus pyogenesel valk F ja kompleks M (valk/lipoteihhoehape). Peremeesrakuga seondumise spetsiifilisus. Peremees raku retsptorite ja adhesiini vaheline interaksioon mrab ra selle, millise koe rakkudel patogeen saab koloniseeruda. Nii suudab V. choleae ja enteropatogeensed E. coli tved (EPEC) koloniseerida kaksteistsrmiksoole ja peensoole epiteeli rakke. EPEC tved vajavad kinnitumiseks kimpe moodutavaid vibureid, V. cholerae aga toksiin koreguleeritud vibureid. E. coli enterotoksilised tved vajavad aga rakkudele

kinnitumiseks K88 vibureid ja koloniatsiooni-faktor antigeeni. Salmonella enterica vajab soole epiteelrakkudega seondumiseks pikki polaarseid plasmiid kodeeritud vibureid. Virulentsusfaktorite sekretsioon. Enamus virulentsusfaktorieid lokaliseerub patgeeni pinnal vi sekreteeritakse rakust vlja. Gram(-) bakterid kasutavad tp I, II. III vi IV sekretsioonissteemi (vaata sekretsiooni osa lk. ). Tp I ssteemi abil sekreteeritakse valke, milledel puudub tpiline N-terminaalne signaaljrjestus, kll omavad need valgud C-terminaalses osas 60 aminohappe pikkust jrjestust, mis on vajalik nende sekretsiooniks. Selle ssteemi vahendusel transporditakse E. coli -hemolsiini, Bordetella pertussis adenlltsklaasi, Pseudomonas aeruginosa lipaasi LipA ja proteaasi PrtA. Tp II sekretsiooni mehhanismi abil transporditakse Klebsiella oxytoca pullulanaasi, Pseudomonas aeruginosa elastaasi ja eksotoksiin A. Siin toimub protsessi esimene etapp Sec valkude vahendusel, mille tulemusena valk transporditakse periplasmasse. Transport lbi vlismembraani toimub spetsiifilise sekretsioonissteemi vahendusel (V. cholerae Esp ssteem, Aeromonas hydrophila Exe ssteem). Tp III sekretsioonissteem (TTSS) on ks enamlevinumaid patogeenide hulgas. Huvitav on see et mitmed TTSS komponendid vajavad enda transpordiks Sec valkusid. TTSS ssteem vimaldab virulentsusfaktorite transpordi otse bakteri tstoplasmast peremeesraku tstoplasmasse. Kromosoomi piirkondi, kus paiknevad TTSS ja nende poolt sekreteeritavate valkude snteesi mravad geenid on hakatud nimetama patogeensus-saarteks (PAI). Tp IV sekretsioonissteemi (T4SS) kasutavad patogeenid nii valkude (Heliobacter pylori Cag ssteem, mis paikneb PAI-s) kui ka DNA (Agrobacterium tumefaciens VirB/D4 ssteem T-DNA lekanne; plasmiidse DNA lekanne konjugatsioonil) trasnpordiks. A. tumefaciensI T4SS koosneb 11 VirB ja lisaks VirD4 valgust. T4SS sekretsiooni ssteemi funktsioneerimiseks on vajalik ka spetsiifilise ATPaasi olemasolu, mille snteesi mrab virB11 geen. VirB11 tpi ATPaasid on vajalikud nii DNA lekandel kui ka toksiinide sekretsioonil. Lisaks on osadel patogeenidel kirjeldatud ka autotransportereid, need on valgud, mis kasutavad ainult Sec ssteemi transpordiks periplasmasse, edasi vahendavad nad juba ise enda transporti rakust vlja (Shigella flexneri SepA valk).