SADRAJ Sta su bioreaktori ......................................................................... Error! Bookmark not defined. Uloga bioreaktori ........................................................................ Error! Bookmark not defined.

Vrsta biokatalizatora .................................................................... Error! Bookmark not defined. Metaboliko stanje elija .............................................................. Error! Bookmark not defined. Agregatno stane supstrata............................................................. Error! Bookmark not defined. Sloenost supstrata....................................................................... Error! Bookmark not defined. supstrata ...................................................................................... Error! Bookmark not defined. Nain izvodjenja procesa ............................................................. Error! Bookmark not defined. Sterilnost i kontaminacija ............................................................. Error! Bookmark not defined. Banka elije ................................................................................. Error! Bookmark not defined. Faze biotehnoloke proizvodnje ................................................... Error! Bookmark not defined. Sterilisanje bioreaktora ................................................................ Error! Bookmark not defined. Pranje bioreaktora ........................................................................ Error! Bookmark not defined. priprema supstrata ........................................................................ Error! Bookmark not defined. Obrada bioprodukata.................................................................... Error! Bookmark not defined. Procesi koncentrovanja bioprodukata ........................................... Error! Bookmark not defined. Razvo j populacije mikroorganizama ............................................ Error! Bookmark not defined. Sterilizacije medijuma.................................................................. Error! Bookmark not defined. Utivaj temperature na kinet iku sterilizacije ..................................Error! Bookmark not defined. arna sterilizacija ....................................................................... Error! Bookmark not defined. Kont inualna sterilizacija............................................................... Error! Bookmark not defined. Kinet ika arne kult ivacije-Mondova kinetika .............................. Error! Bookmark not defined. klasifikacija bioreaktora ............................................................... Error! Bookmark not defined. Biotehnoloka proizvodnja ant ibiotika penicilin .......................... Error! Bookmark not defined. Proizvodni mikoorganizam .......................................................... Error! Bookmark not defined. Proces biosinteze penicilina ......................................................... Error! Bookmark not defined. Gajenje u bioreaktoru................................................................... Error! Bookmark not defined. Uslovi biosinteze ......................................................................... Error! Bookmark not defined. Proces izolacije penicilina ............................................................ Error! Bookmark not defined. Upotreba penicilina ...................................................................... Error! Bookmark not defined. ENZIMI .....................................................................................................................................19 Podela enzima ............................................................................................................................19 Imobilizacija enzima ..................................................................................................................21 INENJERSKI ASPEKTI BIOPROCESA ................................................................................22 KINETIKA MIKROBIOLOKIH PROCESA ...........................................................................23

Page

Kinetika rasta mikroorganizama u diskontinualnim ...................................................................24 bioreaktorima ............................................................................................................................24 Dobijanje enzima .......................................................................................................................26 Proizvodnja enzima ..................................................................................................................26 Preiavanje enzima .................................................................................................................27 Priprema enzima za prodaju .......................................................................................................27 TEHNIKA REKOMBINATNE DNK ........................................................................................28 Proces dobijanja rekombinantne DNK .......................................................................................29 Biotehnoloki process gajenja kulture ........................................................................................30 Analiza medijuma ......................................................................................................................31 Insulin........................................................................................................................................33 Proizvodnja rekombinantnog humanog inzulina (rhi) .................................................................33 BIOREAKTORI ZA BILJNE ELIJE .....................................................................................34 POREENJE SUSPENZIJE BILJNIH ELIJA I KULTURE....................................................35 MIKROBNIH ELIJA ..............................................................................................................35 Osnovni tehnoloki uslovi neophodni za uzgo j biljnih elija u bioreaktoru: ................................37 BIOREAKTORI KOJI SE NAJEE KORISTE U PROIZVODNJI SA KULTURAMA BILJNIH ELIJA ......................................................................................................................37 -Bioreaktori za suspenzije biljnih elija-.....................................................................................39 TRENDOVI U PROJEKTOVANJU BIOREAKTORA ZA .......................................................39 BILJNE ELIJE ........................................................................................................................39 IMOBILISANE BILJNE ELIJE I NJIHOVI ............................................................................40 PROIZVODI..............................................................................................................................40 Karakterist ike imobiliziranih stanica ..........................................................................................43 Oslobaanje produkta ................................................................................................................43 Reaktori za imobilizirane elije: .................................................................................................43 KVASCI ....................................................................................................................................44 Pekarski kvasac..........................................................................................................................44 Uslovi za uzgo j pekarskog kvasca ..............................................................................................45 Kriva rasta .................................................................................................................................46 Aparatura ...................................................................................................................................47 Hemikalije .................................................................................................................................47 Priprema hranjive podloge .........................................................................................................47 Hranjiva podloga za pripremu inokuluma je identinog sastava. .................................................48 Priprema inokuluma ...................................................................................................................48 Uzgoj pekarskog kvasca u kotlastom bioreaktoru .......................................................................48 Page Proputanjem azota kroz destiliranu vodu ..................................................................................48

ta su bioreaktori?
Bioreaktori su posebni ureaji u ko jima se izvodi glavni deo biotehnolokog proizvodnog procesa. U bioreaktorima delovanjem biokatalizatora (ive elije, njeni delovi ili ivi mikroorganizmi) na supstrat nastaje proizvod. Bioreaktori se proizvode od visokootpornog, nerajueg elika. Mogu bit i razliit ih konfiguracija, a mogu se razlikovati i po veliini, od nekoliko deset ina litara do nekoliko hiljada litara. Obino su opremljeni merno m i regulacio nom opremo m potrebno m za odravanje optimalnih procesnih parametara, kao to su: temperatura, pH, koncentracija rastvorenog kiseonika ili ugljen-dioksida, meanje, stvaranje pene. Bioreaktori imaju iroku primenu u raznim biotehnolokim procesima u oblastima prehrambene tehnologije, zat ite ivotne sredine, farmacije i bio medicine. Bioreaktori slue za: 1. proizvodnju proteina odreenog soja elija iz metana, mineralnih frakcija ulja, poljoprivrednog otpada, itd.; 2. proizvodnju hrane (npr. pekarskog kvasca, sireta, alkoholnih pia), farmaceutskih proizvoda (antibiot ika, vitamina, steroida) i organskih jedinjenja (kiselina, aminokiselina, rastvaraa, polisaharida); 3. degradaciju zagaivaa i korisnih sirovina materijala iz otpada, otpadnih voda i izduvnih gasova; 4. remedikaciju zemljita (OTA-Report, 1988< Peyton, 1984); 5. proizvodnju energije (vodonik, metan, etanol) i sirovih materijala mikrobnim kvaenjem ruda; 6. korienje mikroorganizama kao katalizatora u organskim reakcijama (biooksidacija, bioredukcija, biofosforhlorisanje) i kao izvora vanih enzima (deterdenti, industrija hrane, medicina). Zahtevi pri projektovanju bioreaktora Pri projektovanju bioreaktora neophodno je da se zadovolje kriterijumi: 1. Sterilini uslovi rada; 2. Zadravanje biokatalizatora; 3. Optimalno meanje sa minimalnim smicajnim naponima; 4. Adekvatan prenos mase (nutrijenata i kiseonika); 5. Jasno definisani uslovi strujanja; 6. Kontrolisano napajanje supstratom (nutrijentima); 7. Suspendovanje vrste faze; 8. Efikasan prenos toplote. 3

Page

ta utie na projektovanje ili izbor bioreaktora? Najvaniji faktori koje treba uzeti u obzir za projektovanje ili izbor bioreaktora su: vrsta elija, metaboliko stanje elija, kinet ika biohemijske reakcije, eljeni proizvod i mesto na kome bioreaktor treba da bude lociran. Vrsta biokatalizatora ive elije ko je se koriste u biorektorima mogu biti bakterije, kvasci, gljive, biljne i ivotinjske elije. Svaki od ovih tipova elija zahteva odreene uslove sredine, odreene hranljive sastojke i utie na proizvod biohemijskog procesa. Postoje dva tipa elija: prokariotske i eukariotske tj. proste i sloene. Prokariotski organizmi su veliine od 0,2 do 10 m i mogu se nai u razliit im oblicima kao izolovane elije ili micele. Rastu brzo pa zahtevaju odreene uslove (optimalna temperatura i pH sredina). Mora se obezbedit i i dotok odreenih hranljivih materija u bioreaktor. Dotok kiseonika moe prouzrokovati problem zbog velike brzine rasta elija. Eukariotski organizmi imaju sloenu strukturu. Veliine su od 5 do 30 m. Mnogo ih je tee kontrolisat i nego prokariotske organizme. Posebno kad se nau u obliku micela, da bi se izbegla vea ili manja mehanika naprezanja treba izbegavati dovod energije u fermentor preko mehanikih mealica. Mogu se koristit i velike, sporo rotirajue mealice ili kaskadne mealice. Treba izbegavati rashladne zavo jnice i pregrade da bi se spreile mrtve zone u reaktoru. elije biljaka su krhke i relat ivno velike, oko 50 m. One rastu sporo i zahtevaju posebne uslove, potrebno je podesit i koliinu odgovarajuih nutrijenata i hormona koji omoguavaju rast i diferenciranje. Zato su bioreaktori za kult ivaciju elija biljaka relat ivno malih dimanzija. Dotok kiseonika se obino vri preko vieslo jnog omotaa. Prednost imaju bioreaktori sa unutranjo m ili spoljanjo m cirkulacijo m fluida (air-lift bioreaktori). ivotinjske elije su velike od 50 do 100 m, sloene su strukture i vrlo su osetljive na mehanika naprezanja. Mogu da se otete ak i pri formiranju ili rasprskavanjem mehurova. Da bi se to spreilo esto se primenjuje aeracija kroz silikonsku ili poliuretansku cev ili stvaranje velikog broja mehurova. Da bi se kult ivisale osetljive ivot injske elije bez elijskog zida potrebna je upotreba velikih, sporo rotirajuih mehanikih mealica, reaktora sa malim odnosom visina-prenik, dodavanje zat itnih agenasa, izbegavanje brzog strujanja kako bi se sudari est ica sveli na najmanju moguu meru. Kod elijskih kultura sisara koje zahtevaju pogodnu povrinu za adheziju i rast mogu se korist it i Roller boce, Roux boce, ploasti razmenjivai toplote, mikronosai i makroporozni stakleni

Page

nosai.

Organizmi sa rekombinovanim DNK sadre elije sa razliit im bro jem kopija plazmida. elije sa veim brojem kopija se razmnoavaju sporije u odnosu na one sa manjim brojem kopija.

Metaboliko stanje elija Na izbor reaktora odluujuu ulogu ima tip i stanje metabolizma elija ko je se koriste. Pri aerobnim procesima mora se obezbedit i efekt ivno i adekvatno snabdevanje kiseonika dispergovanjem i kasnijim meanjem u svim zonama bioreaktora. Zbog toga su bioreaktori sa aerobnim proceso m esto opremljeni instrument ima za merenje koncentracije kiseonika u teno j i gasovito j fazi (dispergatorima gasa). Pri anaerobnim procesima dispergovanje gasa nije potrebno. Meanje nije preduslov jer su procesi spori. U toku reakcije moraju se kontrolisati samo temperatura i pH. Fizikohemijske osobine medijuma Na izbor, projektovanje i nain rada bioreaktora utiu i fizikohemijske osobine medijuma. Agregatno stanje supstrata Da bi se obezbedila adekvatna brzina rastvaranja i prenosa u teno j fazi gasoviti supstrati moraju bit i dispergovani u medijumu to homogenije. Za dispergovanje se koriste perforirane ploe ili kaskadne mealice. Da bi se postigla potrebna brzina prenosa mase i obezbedilo odgovarajue vreme boravka mehurova u reaktoru koriste se posebne pregrade i mealice. Kod isparljivih supstrata gubici isparavanjem zbog aeracije se mogu umanjit i korienjem ili ureaja sa istostrujnim tokovima sa blagim aksijalnim meanjem ili viestepenih ureaja. vrsti supstrati moraju bit i suspendovani jer mogu da otete osovinu mealice reaktora. Ne treba korist it i sitaste posude, perforirane ploe i otvorene rasprivae jer se mogu zapuit i. Sloenost supstrata Toplotna sterilizacija sloenih medijuma (npr. ekstrakt kvasca, kukuruzni ekstrakt) je mogua samo do odreenog stepena. Zagaenje se spreava procesom sterilizacije, veliko m koliino m inokuluma, odravanjem optimalne temperature i pH, i veliko m koncentracijo m supstrata i proizvoda. Izbor opreme za aeraciju, meanje, ureaja za uvoenje are i kontrolu nastajanja pene zavisi od toga da li je koalescencija mehurova potpomognuta ili spreena medijumo m. Ukoliko je koalescencija potpomognuta medijumo m potrebna je upotreba velikih viestepenih mealica ili kolona sa statikim mealicama.

Page

Reologija medijuma Viskozitet medijuma odreuje brzinu prenosa kiseonika, vreme meanja, dovod energije, nain strujanja fluida, nastajanje i koalescenciju mehurova. Visoko viskozni medijumi su povezani sa visokim koncentracijama supstrata, suspenzijama, proizvodima visokih molekulskih masa (celuloza), plesnima ko je stvaraju micelije i emulzijama. Za aeraciju treba korist it i dovode gasova malih dimenzija i uvoditi veliku snagu u reaktor. Pogodni su viestepeni reaktori sa velikim odnoso m prenika mealica/reaktor.

Nastajanje pene Formiranje pene moe bit i znaajno pri izboru reaktora. Nastajanje pene se moe izbei modifikovanjem sastava medijuma i kontrolo m spiranja elija, starenja elija i unitavanja elija prouzrokovanog mehanikim smicanjem ili se moe smanjit i po mou ant ipenuavih agenasa, sniavanjem pH, ubrizgavanjem pare i primeno m specijalnih tipova reaktora (npr. reaktori sa potopljeno m mlaznico m). Supstrati Na izbor bioreaktora utiu i stepen redukovanja supstrata (npr. kiseonika), brzina potronje supstrata; nastajanje proizvoda i brzina rasta; inhibicija ili akt ivacija biokatalizatora. U sluaju supstrata sa visokim stepeno m redukovanja supstrata (nizak sadraj kiseonika), potrebni su vea brzina uvoenja kiseonika i specifina brzina nastajanja toplote nego u sluaju supstrata sa niskim stepeno m redukovanja. Moraju se korist iti reaktori sa dobrim sistemo m odvoenja toplote, jer je potrebno odravat i temperaturu bioprocesa na optimalno j i konstantnoj vrednosti. Bioreakcije koje su osetljive na pH vrednost treba da se izvode u reaktorima sa velikim intezitetom meanja, kratkim vremeno m meanja i pH regulatorima. Nain izvoenja procesa Nain izvoenja procesa u bioreaktoru moe bit i: arni (sve komponente dodaju se u medijum na poetku, a na kraju procesa se izdvaja proizvod), polikont inualni (u toku procesa dodaju se hranljivi sastojci i supstrati) i kontinualni (u toku procesa dodaju se hranjiva i odvaja proizvod). Prema nainu izvoenja procesa razvijeno je vie razliit ih konfiguracija bioreaktora, kao: 1. arni bioreaktor sa inokulacijo m i punjenjem svim hranljivim sastojcima i supstratima. 2. arni bioreaktori sa razliit im brzinama uvoenja are i razliit im modelima strujanja u reaktoru. 3. arni bioreaktori sa kontinualnim uvoenje m are, tako da koncentracija supstrata ostaje

Page

konstantna. 4. Ponovljeni arni procesi; poto je jedna arna reakcija zavrena, manja koliina fermentacionog proizvoda se ostavlja u reaktoru, kao inokulum za sledeu aru.

5. Kontinualni bioreaktor sa meanjem sa ulaznim i izlaznim tokovima reakcio nog medijuma; ovaj reaktor se naziva hemostatom u sluaju kada gustina elija i koncentracija supstrata ostaju nepro menjeni. 6. Kaskadni kont inualni bioreaktor sa meanjem, sa ili bez intermedijarnog punjenja i recirkulacijo m medijuma i biokatalizatora. 7. Kombinacija bioreaktora sa klipnim strujanjem i kont inualnog reaktora sa meanjem; kontinualni reaktor sa meanjem slui kao inokulum. Sterilnost i kontaminacija Za sterilne procese mogu se koristit i svi standardni hemijski reaktori ukoliko njihovi filteri, zatvarai, ventili, ureaji za uzimanje uzoraka, senzori i osovine ispunjavaju osnovne zahteve sterilnog procesa: 1. jednostavan geometrijski oblik; 2. minimalan bro j ivica i spo jeva; 3. eliminacija mrtvih zona; 4. dovodi, ispusti i vent ili koji se mogu sterilisati; 5. mogunost da se pojedinane zone reaktora zasebno steriliu; 6. spreavanje nadprit iska u reaktoru; 7. minimalan bro j ureaja za merenje i uzimanje uzoraka; 8. minimalna hrapavost povrina; 9. osovine mealica koje mogu da se steriliu. Banka elije elije ko je se koriste za industrijsku proizvodnju se mogu izolovat i iz prirodnih stanita, ili se mogu korist it i so jevi iz postojeih zbirki, to jest banki mikroorganizama. Polazni materijal za proizvodnju biolokog proizvoda su kulture elija bakterija, kvasca ili sisara koje lue proteine ili specifina mo noklonska ant itela. Proizvoai koriste sistem zasejane are elija. Zasejana ara elija sastoji se od alikvota jedne kulture. Glavna banka elija MCB ( Master cell bank) dobija se od jedne kolonije (bakterije, kvasac) i ili jedne eukariotske elije koja se uva u kriogenim uslovima da bi se osigurala genetska stabilnost banki elija. Glavna banka elija (MCB) se sastoji od dovoljnog broja ampula sa elijsko m kulturom i obezbeuje izvor materijala za radnu banku elija WCB ( Working cell bank). Radna banka elija je odreena koliina elija, dobijenih iz jedne ili vie ampula glavne banke elija, koja se uva u kriogenim uslovima i korist i za pokretanje proizvodnog ciklusa. Poto je genetska stabilnost banke elija veoma znaajna, glavna banka elija ampula se uva zamrznuta ili liofilizirana i korist i se samo jedno m. Nova glavna banka elija moe se dobit i, u odreenim sluajevima, iz radne banke elija. Nova glavna banka elija mora da bude testirana i

Page

da zadovolji odgovarajue kriterijume. Takoe, zahtev za licenco m mora bit i odobren pre nego to se MCB generie iz WCB.

Faze biotehnoloke proizvodnje Bioproces se odvija kroz nekoliko faza: o sterilizacija perifernih i prateih delova bioreaktorskog sistema (cevovod, dovodni i odvodni ventili, posude za prikupljanje proizvoda, pumpe, senzori); o sterilizacija i autoklaviranje medijuma termiki ili upotrebom sterilnih filterskih jedinica; o analiza fenotipa i funkcio nalne biokompatibilnosti radne banke elija; o predreaktorska kult ivacija elija na nivou flaska odnosno roller boca u statikim uslovima do postizanja potrebne elijske koncentracije za njihov prenos u radni bioreaktor; o propagacija, razmnoavanje elija u radno-proizvodno m bioreaktoru-fermentoru zapremine od 10 do 5000 L u zavisnosti od vrste procesa. Sterilisanje bioreaktora Za bioprocese je potreban rad bioreaktora pod sterilnim uslovima. Bioreaktor i svi ulazno-izlazni delovi treba da budu sterilisani, to znai: - na poetku procesa treba obezbedit i sistem bez kontaminirajuih mikroorganizama i - treba spreit i curenje mikroorganizama tokom izvoenja fermentacije, kako u samo m sistemu, tako i ka spoljno j okolini. Sterilisanje parom Kod sterilizacije bioreaktora parom neophodno je da se iz njega uklone svi gasovi i vazduh da smrtnost kontaminanata koju treba da izazove vrela para bude vea. Takoe, kad se vri sterisanje parom ukoliko je zaostao vazduh u reaktoru dovodi do vieg pritiska. Sterilizacija u autoklavu Manji reaktori od stakla (3-5 L) mogu se sterilisat i u autoklavu. Prednost sterilizacije u autoklavu je to se ceo reaktor sterilie zajedno sa prateim i perifernim delovima, a nedostatak je to esto dolazi do oteenja prilikom prenoenja bioreaktora od procesnog mesta do autoklava, vazduh zaostaje u reaktoru i zagrevanje u autoklavu je nekontrolisano i esto traje dugo jer nema meanja medijuma. Automatska sterilizacija punog reaktora (SIP) Sterilizacija na mestu na kome radi reaktor SIP (sterilizat ion in place) vri se zagrevanjem tenosti (medijum ili voda) u reaktoru da bi se proizvela para neophodna za sterilizaciju. Zagrevanje se vri uobiajenim metodama (direktnim uvoenjem pare, toplotnim o motaima, zavo jnicama, elektrinim ureajima) uz meanje. Pri isputanju pare iz bioreaktora u vazduh,

Page

temperatura pare je oko 100C. Prikljuci i ostali pratei element i moraju se sterilisat i posebno.

Automatska sterilizacija praznog reaktora (SIP) Sterilizacija se vri uvoenjem iste pare u prazan reaktor. Primenjuje se kada je medijum osetljiv na visoke temperature ili kada treba smanjiti vreme zagrevanja (naroito velikih bioreaktora). Kontinualna sterilizacija vodom i paro m Kont inualno m sterilizacijo m postie se krae vreme (oko 90 s) sterilizacije na viim temperaturama (viim od 130C). Za kontinualnu sterilizaciju potrebna je dodatna oprema, koja prethodno mora bit i sterilisana (pumpa, razmenjivai toplote, otpusni ventil). Sterilna filtracija Ulazne i izlazne struje bioreaktora moraju se sterilisati da bi se spreila kontaminacija u samo m reaktoru i da bi se spreilo zagaenje okoline. Za sterilizaciju se koriste dva tipa filtera: dubinski i membranski. Spaljivanje Ureaji za spaljivanje se koriste za sterilizaciju izlaznih gasova. Pe za spaljivanje patogenih mikroorganizama iz izlaznih struja gasa radi kontinualno s temeraturom od 350 do 450 C. Pranje bioreaktora Nakon bioprocesa neophodno je reaktor oistit i. Iz bioreaktora je potrebno uklonit i ostatke eera, mast i i proteina. Nakon ienja, posebnim ureajima mere se koncentracije odreenih komponenata-kontaminanata (organskih jedinjenja, DNK, proteina, enzima) koje trebaju bit i ispod odreenih vrednosti kada je reaktor oien. Runo pranje Runo pranje primenjuje se i za male i za velike bioreaktore. Reaktor se najpre ispere obino m vodom iz esme, zatim se napuni rastvorom za pranje koji se mea i zagreva. Pranje se vri u fazama: - pranje rastvorom 0,1-1M NaOH na temperaturi od 60 do 140 C nekoliko sati; - pranje rastvorom 0,1 do 0,5M H3PO4 ili HNO3 na temperaturama do 90C manje od jednog sata; - pranje rastvorima proteaza nekoliko sati.

Page

Izmeu faza i na kraju procesa reaktor se ispira obino m ili demineralizovano m vodom.

Automatsko pranje bioreaktora (CIP) Pranje reaktora na istom mestu na kome i radi reaktor CIP (cleaninig in place) je najee potpuno ili delimino automat izovano, pa je mnogo bre i lake u odnosu na runo pranje. Za automatsko pranje (sanitaciju) reaktor treba da bude dodatno opremljen (posebni vent ili, specijalni rasprivai (brizgaljke), razmenjivai toplote sa pumpama), a rastvori za pranje se pripremaju u posebno j zoni procesnog postrojenja CIP kuhinji. Pranje se vri u nekoliko faza: - ispiranje alkalnim rastvorom; - ispiranje kiselim rastvorom; - ispiranje dejo nizovano m vodom ili vodeno m parom pod visokim prit isko m. Da bi se obezbedilo automatsko pranje bioreaktora pratei procesni element i (cevovodi, ventili, pumpe) moraju bit i otporni na temperaturu sterilizacije i na sredstva (hemikalije) za pranje i sanitaciju. Priprema supstrata U bioprocesima posebno je vano vrlo precizno doziranje supstrata, koje mora bit i izvedeno na sterilan nain. Problemi sterilnost i supstrata izraeniji su pri kontinualnim biotehnolokim procesima, za koje je potrebno kontinualno uvoenje supstrata. Kod ovog procesa, umesto jedne supstance, kao supstrat uvode se vieko mponentne smee (medijum) za kult ivaciju mikroorganizama ili elijskih linija. Za kontinualnu pripremu supstrata bitno je precizno doziranje supstrata, koje mora bit i izvedeno na sterilan nain. Za precizna doziranja supstrata pokazala su se reenja sa upotrebom peristalt ikih pumpi. Obrada bioprodukata Reaktorski medijum je po izlasku iz bioreaktora smea vrsto-teno koja sadri elije, elijske produkte u ili van elije, ostatke nutrijenata itd. Ta smea je vrlo razblaena suspenzija, ko ju treba koncentrovati. Takoe, bioproizvod moe bit i: sama elija (bio masa, npr. pekarski kvasac) intracelularan (nastali proizvod ostaje unutar elije, npr. insulin) ekstracelularan (nastali proizvod je izluen u reaktorski medijum, npr. ant ibiotici)

1 0

Page

10

Obrada bioprodukata (reaktorskog medijuma) vri se u nekoliko faza: izdvajanja bio mase, razbijanje elijskih membrana, koncentrovanje bioprodukata, izolacija i fino preiavanje bioprodukata, konana obrada bioprodukata.

Procesi separacije vrsto-teno Procesi izdvajanja bio mase su procesi separacije vrsto-teno pri emu se primenjuju metode centrifugiranja i filtracije. Zavisno od veliine elija i filterskog sistema, filtracija moe bit i tradicio nalna, mikrofiltracija, ultrafiltracija i rezervna osmoza. U cilju po jednostavljenja separacije je razvo j novih kult ivacionih medijuma kao npr. medijum bez seruma za razvo j ivotinjskih elija radi dobijanja proteina. Na kraju procesa ostaju samo produkovani proteini, ime je separacija proizvoda (proteina) iz medijuma svedena na preiavanje jednog proteina. Takoe, u toku pripreme medijuma pre procesa separacije moe se uticat i na po jednostavljenje separacije i to: zagrevanjem (smanjuje se viskoznost, razbija se struktura gela, poveava se agregacija), hlaenjem (poveava se agregacija, poboljava se uklanjanje vode) i hemijski (menjanjem pH). Procesi dezintegracije elija Pri dobijanju intercelularnih bioproizvoda mora se razbit i- otvorit i elijska membrana, uz uslov da se bioproizvod ne oteti. Otvaranje elija moe se ostvarit i mehanikim, mikrobiolokim (enzimskim) ili hemijskim putem. Najpoznat ijiji mehaniki ureaji su kuglini mlin i ho mogenizator. Uspenost razbijanja elijske membrane zavisi od brzine mlevenja kao i od koncentracije i veliine kuglica u mlinu. Princip rada ho mogenizatora se svodi na strvaranje visokih smicajnih sila visokim prit iscima ko ji nastaju u fluidu. Procesi koncentrovanja bioprodukata Nakon izdvajanja elija ili elijskih ostataka, medijum (vrlo razblaena suspenzija) treba koncentrovati da bi se smanjila radna zapremina pri procesima izolacije i finog preiavanja bioprodukata. Poznat proces za koncentrovanje bioprodukata je uparavanje. Izvodi se u vakuumu ili u vrlo kratkim vremenskim intervalima. Za bioloke materijale pogodniji su drugi procesi koncentrovanja, procesi ekstrakcije organskim rastvaraima. Tako postoji reaktivna ekstrakcija, pri kojo j se organsko j fazi dodaje neki alifatski sekundarni amin ija je rastvorljivost u vodi

1 1

Page

11

zanemarljiva (npr. ekstrakcija penicilina u dve protivstrujne kolone), zatim ekstrakcija u dve vodene faze, pri kojo j se za ekstrakciju upotrebljava polietilenglikol K3PO4 pri emu se razdvajaju proteini (npr. kontinualno izdvajanje enzima) i ekstrakcija superkritinim (tenim) CO2 (npr. etanol). Takoe, za koncentrovanje bioprodukata pogodni su membranski procesi, posebno ultrafiltracija, a u poslednje vreme znaajna je elektrodijaliza.

Izolacija i fino preiavanje bioprodukata Za izolaciju i fino preiavanje bioprodukata najee se upotrebljavaju metode kristalizacije i hromatografije. Upotrebljavaju se svi oblici hro matografije: o jono-izmenjivaka hro matografija, o HPLC (tena hro matografija pod visokim protisko m), i o afinit ivna hromatografija (npr.za monoklonska antitela). Razvoj populacije mikroorganizama arni rast predstavlja rast elija na podlozi odreenog sastava u toku koga se ne vri nikakvo dodavanje nutrijenata ili pro mene sastava podloge nakon zasejavanja elija. elije u toku arnog rasta prolaze kroz etiri osnovne faze: lag faza, logaritamska faza ili faza eksponencijalnog rasta, stacionarna faza i opadajua faza.

Lag faza je poznata kao faza mirovanja ili poetna faza. Mikroorganizmi kada se nau u novoj hranjljivo j sredini (podlozi) poinju se prilagoavati izmenjenim fiziko-hemijskim uslovima. U ovoj fazi nema razmnoavanja ve samo uveanje elija. Vremensko trajanje lag faze je razliito, prema vrst i, soju, starosti kulture, njeno m fizioloko m stanju, poetnom broju elija, kao i od fiziko-hemijskih uslova sredine (pH, temperatura, sastav podloge). Logaritamska ili eksponencijalna faza - U ovoj fazi sve se elije nalaze u aktivno m stanju razmnoavanja. Proces razmnoavanja je najbri. Populacija raste konstantno m brzino m. Vreme deljenja od jedne elije do druge uvek je isto. Od jedne elije nastaju dve, od dve nastaju etiri, od etiri osam, od osam esnaest. U eksponencijalno j fazi sve elije mikroorganizama su ive. Veoma su osetljive na dejstvo spoljapnjih inilaca i najlake ih je unit it i. Akt ivnost elije je poveana i sintet ie se itav niz vanih sastojaka elije.

1 2

Page

12

Stacionarna faza U ovoj fazi populacija po broju mikroorganizama dostie svo j maksimum. Broj novonastalih elija i elija koje odumiru je isti. U ovoj fazi dolazi do maksimalnog stvaranja odreenih proizvoda (antibiot ika, acetona, etanola, butanola, odreenih vitamina). Faza odumiranja Posle stacionirane faze ivotna sposobnost mikroorganizama opada, jer je dolo do pogoranja uslova sredine, koja je pretrpela znatne fiziko-hemijske izmene. Broj mikrorganizama koji odumire poinje da prevazilazi broj ivih elija. Vei bro j mikroorganizama nestaje nego to nastaje. Tokom vremena cela populacija odumire, to moe trajat i nekoliko dana (bakterije, mlene kiseline), nedelja ili godina kod veoma otpornih predstavnika (sporogene bakterije).

Sterilizacije medijuma Sterilizacija medijuma je veo ma vana za biotehnoloki proces. Obuhvata sve metode kojima se neeljeni mikroorganizmi unitavaju. Tehnike koje se mogu primenit i za sterilizaciju su: filtracija, flotacija, jonska izmena, centrifugranje. Ove tehnike se primenjuju na manje sisteme, izuzev filtracije ko ja se se moe primenit i na industrijsko m nivou. Najee se korist i sterilizacija medijuma parom. arna sterilizacija Izvodi se tako to se medijum uvodi u sterilizator, autoklav ili posebno projektovan fermentor. Medijum se zagreva do zadate temperature sterilizacije i definisanog pritiska. Poto se temperatura medijuma menja tokom grejanja i hlaanja, kinet ika konstanta se takoe menja. Kontinualna sterilizacija Ima prednost u odnosu na arnu sterilizaciju. Pri kontinualno j sterilizaciji laka je kontrola procesa, manja je potronja pare, krae vreme sterilizacije i dobijaju se vei prinosi fermentacionih proizvoda, zato to se medijum izlae kratko vreme visoko j temperaturi, pa je degradacija medijuma minimalna. Nedostatak kontinualne sterilizacije su vei invest icio ni trokovi. Klasifikacija bioreaktora Na projektovanje bioreaktora utiu koncentracija bio mase, zahtevi sterilnost i, meanje, suspendovanje, aeracija, prenos toplote i osetljivost elija na smicajne napone. Bioreaktori se mogu podelit i na osnovu tipa i forme biokatalizatora na nekoliko grupa: 1. Bioreaktori sa slobodnim elijskim kulturama; 2. Bioreaktori sa imobilisanim elijama ili enzimima; 3. Bioreaktori sa zadravanjem ili recirkulacijo m biokatalizatora

1 3

Page

13

Na osnovu konfiguracije bioreaktori se mogu podelit i: 1. Rezervoari (visina/prenik <_3); 2. Kolone (visina/prenik >_ 3) 3. Rezervoari sa unutranjo m ili spoljanjo m cirkulacijo m fluida; 4. Kolone sa unutranjo m ili spoljanjo m cirkulacijo m fluida. Bioreaktori za aerobne procese s obzirom na vrstu koriene energije mogu se podelit i: 1. Bioreaktori sa unutranjim mehanikim meanjem; 2. Bioreaktori sa spoljanjim dovoenjem tenosti; 3. Bioreaktori u kojima se dovod energije vri korienjem ko mprimovanog vazduha (pneumatsko meanje).

Bioreaktor sa mehanikim meanjem Bioreaktor sa mehanikim meanjem je najjednostavniji i najvie korien za gajenje animalnih elija. Sastoji se od cilindrine posude sa mealico m. Posude su konstruisane tako da im je dno zaobljeno da bi se obezbedilo meanje korienjem malih brzina. Mealice se projektuju tako da omoguavaju i vert ikalan i horizontalan tok fluida. Za bioreaktore manjih razmera korist i se eksterno zagrevanje po principu duplih zidova da bi se odrala optimalna temperatura koja se kree oko 37C. Kod reaktora velikih razmera zagrevanje se vri kroz unutranje cevi. Izbegava se upotreba grejaa jake snage jer bi to moglo otetiti elije.

Biotehnoloka proizvodnja antibiotika penicilina

Proizvodnja penicilina Prvi otkriveni ant ibiotik je penicilin. Penicilin je sluajno otkrio britanski bakteriolog Aleksandar Fleming 1928. U posudu sa gajenim kulturama bakterija stafilokoka upao je komadi plesni Penicillium notatum i unit io bakterijske kolonije. Fleming je kasnije utvrdio da ta plesan izluuje neku supstancu ko ja unitava bakterije i nazvao je penicilin. Masovna proizvodnja ovog antibiotika poinje 1944. i smatra se jedno m od prekretnica u biotehnologiji. U industrijsko j proizvodnji penicilina ve od 1951. Flemingova plesan Penicillium notatum je zamenjena novo m vrstom Penicillium chrysogenum, ko ja je izolovana iz plesnjive bundeve. Penicilin se na industrijsko m nivou proizvodi u bioreaktorima, velikim cilindrinim sudovima izgraenim od nerajueg elika, koji sadre teni medijum u ko jem se gaji plesan. Bioreaktori su opremljeni merno m i regulaciono m tehniko m koja meri bioprocesne parametre i automatski ih kontrolie: temperatura, pH vrednost, koncentracija hranljivih materija i kiseonika, stvaranje pene, i sterilnost podloge i vazduha.

1 4

Page

14

Proizvodni mikroorganizam Mikroorganizam producent u industrijsko j proizvodnji penicilina je plesan Penicillium chrysogenum. Plesni su prave gljive konastog izgleda, ija su pojedinana vlakna poznata kao hife. Splet konast ih vlakana (hifa) poznat je kao micelijum. Razmnoavaju se vegetativno formiranjem spora. Spore (konidije) su elipt inog oblika, veliine 4x3 m, a nalaze se na sterigama koje dre metule i konidioforu. Spore se rasejavaju u okolnu sredinu. Klijanjem (germinacijo m) spora poinje razvo j plesni. Na vrstim podlogama rastu u obliku kolonija, prenika su od 4 do 5 cm nakon 10 do 12 dana gajenja, okrugle su, radijalno naborane.

Sojevi Penicillium chrysogenum su visoko produktivni (do 60 g/l). Potrebna je njihova stalna selekcija i kontrola, a temelji se na morfolokim i fiziolokim karakteristikama. Sojevi producenti se uvaju na due vreme. Razvijene su metode uvanja: 1. liofilizacijo m, 2. uvanje na sterilno m pesku, 3. uvanje na sterilnim zrnima itarica (zamrznuto). Podloga za uvanje i selekciju so jeva je sastava: maltoza 28 g glukoza 2g pepton (ekstrakt kvasca) 8 g voda 1000 ml pH 5,5-6,0

Poboljanje produktivnosti sojeva mikroorganizma producenta Prvi so jevi su se proizvodili samo povrinskim gajenjem. Bili su sa vrlo niskim prinoso m. Poboljanje proizvodnih osobina Penicillium chrysogenum je prvih dvadesetak godina postignuto mutacijama i selekcijo m (uticajem UV, rendgenskog zraenja ili dejst vom hemikalija). Poboljanje procesa je takoe postignuto prehranjivanjem sa izvorima C, N, S i P; prekursorima, kontrolo m procesa i poboljanjem izolacije. U novije vreme veliki napredak u poveanju prinosa penicilina se moe ostvarit i genetikim modifikacijama (rekombinacijo m) haploidnih segreganata dobijenih ukrtanjem izmeu mutanata razliit ih linija so jeva.

1 5

Page

Proces biosinteze penicilina

15

Umnoavanje poinje od istog laboratorijskog soja, koji se umnoava presejavanjem u laboratorijske posude sa rastuom zapremino m dok se ne razvije dovoljno bio mase za zasejavanje industrijskih bioreaktora. Proces biosinteze se provodi kroz tri faze: 1. Rast micelijuma u germinatoru 2. Rast micelijuma u predfermentoru 3. Rast micelijuma i biosinteza penicilina u bioreaktoru (fermentoru)

Rast micelijuma u germinatoru i predfermentoru Proces zapoinje akt iviranjem proizvodne kulture (spora) u tenoj hranljivo j podlozi u malim posudama konusnog oblika (Erlenmajer posudama) 7 do 10 dana na temperaturi 25C. Kada su uspostavljeni opti uslovi za rast, spore se prebacuju u germinator. U germinatoru gajenje inokuluma traje od 36 do 50 asova, temperatura je od 24 do 26C, aeracija 1 do 1,5 l / min, pH vrednost 6,0 do 7,0; micelij postie III fazu rasta. Umnoavanje bio mase se dalje nastavlja prebacivanjem inokuluma iz germinatora u predfermentor, kult ivacija traje od 12 do 18 asova pri istoj temperaturi, iste pH vrednosti i aeracije. Micelijum postie III fazu rasta. Hranljiva podloge je sastava: Kukuruzni ekstrakt 2% Glukoza 2% Laktoza 0,5 % NH4NO3 0,125 % KH2PO4 0,2 % MgSO4 0,025 % Na2SO4 0,05 % CaCO3 0,5 % Voda do 100 % pH 6,0 6,5 Gajenje u bioreaktoru Gajenjem inokuluma u germinatoru i predfermentoru potrebno je dobit i dovoljnu koliinu bio mase, koja osigurava pri gajenju u industrijskom bioreaktoru intenzivan rast producenta i visok prinos penicilina.

1 6

Page

16

Gajenje u bioreaktoru se moe podelit i u dva dela: a) Brzi rast micelijuma, faze rasta II i III, brza potronja ugljenika i azota, intenzivno disanje (aeracija), porast pH, nema biosinteze penicilina (1). b) Polagani rast micelijuma, polagano asimiliranje izvora ugljenika i azota, faze rasta micelijuma IV, V i VI, smanjeni intenzitet disanja-aeracije, konstantna vrednost pH, maksimalna biosinteza penicilina (2). Uslovi gajenja u bioreaktoru su takvi da se postigne pravovremeni prelaz iz faze (1) u fazu biosinteze penicilina (2)

Sastav hranljive podloge za biosintezu penicilina Hranjivi sastojci koji su potrebni za rast micelijuma i odravanje bio mase su: 1. Makronutrijent i ili makroelement i: ugljenik, azot, kiseonik, vodonik, fosfor, sumpor; 2. Mikronutrijent i ili mikroelementi: Mg, Zn, Fe, K, i dr.; Proizvodni proces pospeuju prekursori. Oni se ugrauju u molekul penicilina i usmeravaju biosintezu u odreeni penicilin. Visoko produktivni so jevi ugrauju do 90%, a nisko produktivni oko 10% prekursora u molekul penicilina. Najbolji prekursori su fenilsiretna kiselina (pri emu nastaje benzilpenicilin) i fenoksisiretna kiselina (fenoksimet ilpenicilin). Sloena podloga za proizvodnju penicilina sadri: 1. Glukoza ili melasa (kontinualno doziranje) 10% 2. Ekstrakt od moenja kukuruza 1 do 5% 3. Fenilsiretna kiselina (kontinualno doziranje) 0,5 do 0,8% 4. Biljno ili ivot injsko ulje kao antipenuavce (kontinualno dodavanje) 0,5% 5. pH podesit i na 6,5 do 7,5 dodatkom baze Uslovi biosinteze U toku procesa korist i se arni postupak gajenja sa prehranjivanjem supstrata. Trajanje kult ivacije je od 200 do 300 asova. Temperatura je do 48 asova 28C, a posle toga 24C, pH vrednost se odrava i regulie sa CaCO3 . Penicillium chrysogenum pri submerzno m gajenju moe rast i u obliku peleta (strukturirane i agregirane hife) ili filamentozno (rastresite hife). Rast u obliku peleta mnogo manje utie na viskoznost i difuziju, pa je povoljniji za proizvodnju penicilina. Oblik, veliina i koncentracija peleta se osigurava koncentracijo m spora pri gajenju inokuluma. Neophodno je snabdevanje kulture sa kiseonikom. Mala brzina meanja uslovljena je potrebom za osiguranjem strukture peleta (pri veoj brzini se raspadnu). Kao sredstva za suzbijanje pene koriste se biljna i ivotinjska ulja i mast i (so jino, suncokretovo,

1 7

Page

17

kukuruznih klica i dr.). Koriste se i sintetska sredstva (glicerinska, stearinska i oleinska kiselina) Zbog odravanja uslova gajenja optimalnih za biosintezu penicilina neophodna je sterilnost podloge i vazduha. Sami aparat i i oprema treba da su takvi da se lako odrava sterilnost. Proces izolacije penicilina Nakon to je bioproces zavren, pristupa se izolovanju penicilina iz tene podloge, njegovo m preiavanju. Posebna panja u proizvodnji penicilina se poklanja preiavanju to podrazumeva potpuno uklanjanje svih neistoa, tako da se na kraju dobije proizvod visoke koncentracije i istoe. Proces izolacije penicilina se provodi u tri faze: 1. Filtracija i dodatna obrada filtrata 2. Ekstrakcija tekue-tekue (preiavanje) 3. Dobijanje kristala soli penicilina i suenje

Filtracija je prvi stepen u procesu izdvajanja penicilina. Filtracija predstavlja razdvajanje elija mikroorganizma i ostalih krupnih est ica od filtrata. Obino se provodi s vakumskim bubanjskim rotacionim filterima. Obrado m filtrata se uklanjaju proteini (stabilizatori emulzije pri ekstrakciji) obino dodatnom filtracijo m i taloenjem proteina (solima Al, Fe, Zn ili tanino m). Najvei gubici pri izolaciji su pri filtraciji (ak do 10%). Hlaenjem filtrata (+4C) u protivstrujnim izmenjivaima se spreava termalna inaktivacija penicilina. Ekstrakcija (preiavanje penicilina) se sprovodi u protivstrujnim centrifugalnim ekstraktorima ili protivstrujnim ekstraktorima dekanterima. Kao rastvor koriste se amilacetat, but ilacetat, butanol (rastvor:filtrat=1:3). Kod pH ekstrakcije 1,9 do 2,0 penicilin je nedisosovan, topljiv u organsko m rastvoru, netopljiv u vodi. Brzo se raspada, inakt ivira. Pri pH 6,0 do 7,0 penicilin je disosovan i topljiv u vodi. Ekstrakcija se sprovodi brzo (do 30 sekundi) uz istovremeni ulazak u ekstraktor filtrata s penicilino m i kiseline. Centrifugalno polje osigurava brzo provoenje ekstrakcije i razdvajanje emulzije. Pre taloenja, kristalizacije otopini penicilina se dodaje akt ivni ugljenik (uklanja neistoe), pa se ponovo filtrira. Ukoliko su niski prinosi penicilina u biosintezi ekstrakcija se moe ponovo provesti. Kristalizacija se provodi dodatkom kalijumovih ili natrijumovih soli (acetata) u organskom rastvarau, odnosno povienjem pH vrednosti na 6,0 do 7,0. Kristali se filtriraju, potom peru rastvorom i sue. Suenjem se uklanja voda iz istog preparata penicilina. Sue se u struji toplog vazduha na sitastoj beskonano j traci. Suenje se moe sprovest i i liofilizacijo m. Liofilizacija je suenje sublimacijo m leda u vakumu. Proces je podeljen u dva dela: 1. zamrzavanje materijala u tankom slo ju, pri temperaturi -15 S 2. suenjem zamrznutog materijala u vakumu pri niskim temperaturama Odavde penicilin moe da bude preraen i upakovan za marketing i distribuciju na globalno m tritu.

1 8

Page

18

Upotreba penicilina Penicilin ima uzak spektar delovanja. Unitava G+ bakterije. Korist i se u leenju pneumo nije, stafilokokne upale, sifilisa, gonoreje, tetanusa, meningit isa (bakterijskog). Obino dolazi u obliku injekcija i kapsula. Izaziva alergije (anafilaktiki ok).

ENZIMI Enzimi su prvi put izolovani u istom obliku 1928. godine, od kada broj poznat ih enzima raste. Danas je njihov bro j vei od 2000. To su proteini sa molsko m maso m od 15.000 pa ak i do millio n. Reakcije u eliji odigravaju se veliko m brzino m, to je omogueno prisustvom prirodnih (biolokih) katalizatora enzima (gr. en - u; zyme - kvasac). Odlika katalizatora je da ubrzava hemijsku reakciju i usmerava njen tok, ali se tokom te reakcije ne troi. Enzimi ubrzavaju biohemijske reakcije tako to sniavaju energiju aktivacije ko ja je potrebna da bi otpoela odreena reakcija. Bez enzima je nemogua razmena materije i energije u eliji.

Podela enzima Podela prema grai Prema grai se dele na: proste i sloene. Prosti enzimi se sastoje samo od proteina, dok sloeni pored proteinskog imaju i neproteinski deo. Sloeni enzimi (holoenzimi) , dakle, se sastoje od: 1. apoenzima (proteinski deo) i 2. neproteinskog dela koji moe da bude koenzim ili prostetina grupa.

1 9

Page

19

Najvaniji koenzimi su oni koji uestvuju u procesima oksidacije, kao to je npr. NAD (nikotinamid-adenin-dinukleotid), NADP (nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat). Mnogi koenzimi su vitamini (bitni sastojci, koji se moraju unosit i hrano m). Prema mestu delovanja Prema mestu gde se stvaraju, a gde deluju dele se na: endoenzime i egzoenzime. Endoenzimi deluju u samo j eliji u ko jo j se stvaraju, a egzoenzimi deluju van elije u kojo j se stvaraju. Neki enzimi se sintet iu kao neakt ivni proenzimi i akt iviraju se samo kada su potrebni, obino pomou drugog enzima. Takvi su, npr. enzimi pankreasa koji uestvuju u varenju hrane i izluuju se u neakt ivnom obliku (da ne bi razloili elije ko je ih sintet iu), a aktiviraju se tek kad dospeju u tanko crevo gde vare hranu. Prema katalit iko m delovanju.

2 0

Page

Prema vrst i reakcije koju katalizuju dele se na: y oksido-reduktaze, katalizuju rekacije oksido-redukcije; pripadaju im: o dehidrogenaze o oksidaze o preoksidaze o hidroksilaze o oksigenaze y tranferaze, katalizuju prenoenje funkcio nalnih grupa, aldehidnih ili keto ostataka, grupa koje sadre fosfor ili sumpor; y hidrolaze, vre hidrolizu (uvoenje molekula vode) razliit ih veza; y liaze, katalizuju odstranjivanje grupa iz jedinjenja na ko ja deluju ili uvode grupe u jedinjenja namestu gde se nalaze dvogube veze; pripadaju im i: o karboksilaze o aldolaze o dehidrataze itd. y izo meraze, katalizuju prelaenje jednog izo mera u drugi; ovog grupi pripadaju: o racemaze o cis-trans izo meraze o epimeraze itd. y ligaze, katalizuje reakcije u kojima dolazi do uspostavljanje neke veze (C-O, C-S, C-N ili C-C) izmeu dva molekula to je praeno razlaganjem ATP-a Izolovanje enzima

20

Od stotinak enzima koji se koriste u industriji preko pola se dobija iz gljiva i kvasaca, preko jedne treine se dobija iz bakterija a ostatak iz ivotinjskih elija (8%) i biljaka (4 %). Prednosti mikroorganizama za izolovanje enzima su: nia cena proizvodnje sadraj enzima je predvidljiv i podloan kontroli lake se obezbeuje sirovi materijal konstantnog sastava biljke i ivotinje imaju vei sadraj endogenih inhibitora i proteaza

Imobilizacija enzima Priliko m primene enzima u rastvoru enzimi gube deo svoje akt ivnosti nakon zavretka reakcije u postupku izolovanja proizvoda. Pored ovoga gubitka javlja se i problem kontaminacije proizvoda. Ovaj problem se moe prevazii primeno m imobilizovanih enzima. Imobilizovani enzimi su nerastvorni enzimi. U reakcijama koje se izvode u vodenoj sredini enzimi se mogu uinit i nerastvornim umreavanjem ili fiksiranjem enzima za vrst i nosa. U organsko j sredini mogu se korist it i suspenzije liofilizovanih enzima ili enzimi fiksirani za nosa.

Prednosti imobilizovanih enzima su: 1. viestruko korienje 2. enzim se lako odvaja od ostatka reakcione smese 3. rigorozna kontrola procesa 4. visoka otpornost na mehanika oteenja 5. manja kontaminacija 6. proces je bri 7. Automatizacija Nedostaci imobilizovanih enzima su: 1. potreba za istim enzimom poskupljuje proces 2. difuziona ogranienja 3. skupi polimeri 4. faza vie u pripremi enzima 5. reagensi za imobilizaciju poskupljuju proces 6. gubi se deo aktivnosti tokom imobilizacije Kataliticka sposobnost enzima

2 1

Page

21

Vezana je za njihovu hemijsku grau i prostornu orijentaciju molekula, koja se naziva konformacija. Konformacija enzima se formira zahvaljujui primarno j, sekundarno j, tercijalno j i kvaternerno j strukturi. Primarnu strukturu ini visokomolekularni pept idni niz, tj. veliki broj aminokiselina povezan pept idno m vezo m. Peptidni niz se specifino orijent ie u prostoru formirajui prvo sekundarnu, zatim tercijernu i na kraju kvaternernu strukturu. Prostorna struktura se stabilizuje pomou vodoninih mostova, jonskih veza i van der Waals-ovih sila. Od svih struktura najstabilnija je primarna, jer je ine prave hemijske (peptidne) veze. Sve ostale veze u konformaciji su nedovoljno stabilne i relat ivno se lako raskidaju nepovoljnim faktorima okoline. Zbog toga, enzimi imaju optimalnu katalit iku efikasnost u uslovima optimalne temperature, pH vrednosti, koncentracije jona, posebno tekih metala.

INENJERSKI ASPEKTI BIOPROCESA

Bioproces predstavlja proces u kome se organska sirovina (supstrat) prevodi u proizvod delovanjem ivih elija mikroorganizama ili viih organizama ili enzima.Enzimski bioprocesi se mogu prikazat i po mou jednaine:
E A R

(1) a bioproces pomou ivih elija sa:

A C R+C

(2) gde je A supstrat (organska supstanca), R proizvod, E enzim i C iva elija. Osnovna razlika izmeu ova dva bioprocesa je u tome to enzim deluje na supstrat tokom nastajanja proizvoda i ne poveava mu se koliina, dok se u drugom sluaju ive elije

2 2

Page

22

reprodukuju i poveava im se koncentracija tokom izvoenja bioprocesa. Izuavanje kinet ike bioprocesa je znaajno da bi se razumelo na koji nain se on odvija. Kad se govori uopteno o kinet ici bioprocesa, onda se razlikuje: makrokinet ika (na nivou elija, tj. bioreaktora) i mikrokinet ika (na nivou molekula, tj. procesa koji se odvijaju unutar elija). Makrokinet ika se moe odnosit i na nestacionarne procese, ije se promenljive menjaju sa vremeno m, i stacionarne procese, ije se promenljive ne menjaju sa vremeno m, tj. kontinualne procese. Diskont inualni (arni) procesi su, po svojo j prirodi, nestacionarni, dok kontinualni procesi mogu bit i stacionarni. U diskont inualnim procesima koriste se diskontinualni (arni) bioreaktori, a u kontinualnim protoni bioreaktori. U kintekim analizama se, najee, koriste modeli idealnih bioreaktora. Idealni diskont inualni (arni) bioreaktor se odlikuje idealnim meanjem reakcio ne smee, to ima za posledicu homogen sastav i uniformnu temperaturu reakcione smee. U ovaj bioreaktor ne dovode se reaktanti, nit i se odvodi reakcio na smea. Osnovni t ipovi idealnih protonih reaktora su bioreaktor sa potpunim meanjem i cevni bio-

reaktor. Model prvog bioreaktora zasniva se na pretpostavci o proticanju sa perfektnim meanjem, ko ja podrazumeva: idealno meanje reakcione smee, nepro menljivu zapreminu reakcione smee (tj. jednakost brzine prit icanja i isticanja reakcio ne smee), homogen sastav i uniformnu temperaturu reakcione smee i ident inost sastava reakcione smee u bioreaktoru i reakcione smee koja ist ie iz njega. Model drugog bioreaktora odlikuje se klipnim proticanjem, koje znai da ne postoji pro mena aksijalne brzine po poprenom preseku (tj. ne postoji povratno meanje).

Kinet ika bioprocesa se najee prouava u diskontinualnim bioreaktorima, ali zbog toga nije mogue pratit i promene u elijama, tj. na molekuls kom nivou (mikrokinet ika). Kinetiki parametri, koji se odreuju na ovaj nain, imaju svoju vrednost za projektovanje industrijskih bioreaktora, koji rade diskont inualno, pa ak i kontinualno.

KINETIKA MIKROBIOLOKIH PROCESA U bioprocesima, gde su biokatalizatori ive elije mikroorganizama, odigravaju se istovremeno i meusobno povezano rast, razmnoavanje, troenje supstrata i sinteza primarnih i sekundarnih metabolita. Kinet ika ovih procesa prouava brzine rasta elija mikroorganizama, troenja limit irajueg supstrata iz hranljive podloge i sinteze metabolita, kao i uticaj faktora okoline na

2 3

Page

23

njih. Jasno je da se mikrobioloki procesi sastoje, u principu, od dva meusobno veoma zavisna sistema, i to ive elije mikroorganizama i okolne sredine, gde se odvijaju svi navedeni procesi. Mikrobioloki proces poinje inokulacijo m hranljive podloge koja se nalazi u bioreaktoru. Nakon adaptacije inicijalne koliine iste kulture mikroorganizama (inokuluma), dolazi do rasta i razmnoavanja elija i konverzije supstrata iz hranljive podloge u: bio masu, zbog ega se koliina mikroorganizama poveava i eljeni proizvod, tj. primarni ili sekundarni metabolit. U oba sluaja, brzina nastajanja bio mase i proizvoda je funkcija koncentracije i biohemijske aktivnosti elija mikroorganizama. Kinetika rasta mikroorganizama u diskontinualnim bioreaktorima

Mikroorganizmi rastu i razmnoavaju se u veo ma irokom spektru fiziolokih stanja elije i faktora okoline. Npr, ako se u hranljivu podlogu doda mala koliina ivih elija mikroba, onda u odgovarajuim uslovima okoline elije poinju da rastu, tj. poveavaju se svi sastojci ive elije. Direktna posledica rasta elije je njihovo razmnoavanje. Kad se prat i promena koncentracije mikroorganizama ili broja elija sa vremeno m u diskont inualno m bioreaktoru, onda se dobija kriva rasta, iji je tipian izgled prikazan na slici 12. Analizo m krive rasta, zapaaju se et iri faze, i to: lag ili faza adaptacije, eksponencijalna faza, stacionarna faza i faza odumiranja.

Slika 12 Diskontinualni rast mikroorganizama

2 4

Page

24

Na krivo j se razlikuju etiri postupne karakterist ine faze sa meufazama: lag faza, faza ubrzanog razmnoavanja, eksponencijalna faza, faza usporenog razmnoavanja, stacionarna faza I faza odumiranja. Lag faza tj. faza mirovanja ili poetna faza- mikroorganizmio kada se nau u novo j, sveo j hranljivo j podlozi, poinju se prilagoavati izmenjenim fiziko- hemijskim uslovima, U ovoj fazi nema razmnoavanja ve samo uveanje elija. U eliji se odigravaju sloeni procesi Vremensko trajanje lag faze je razliito, to zavisi od vrste, soja, starosti culture, njeno m fizioloko m stanju, poetnom bro ju elija, kao I od fiziko- hemijskih uslova sredine (pH. Temperature, sastav podloge) Faza ubrzanog razmnoavanja- ova faza je prelazna, unjo j mikrobi poinju da se razmnoavaju I to postupno poveaavajui brzinu razmnoavanja. Eksponencijalna faza- u ovoj fazi sve se elije nalaze u aktivno m stanju razmnoavanja. Brzina rasta mikroorganizama ( rC ) u ovoj fazi je najvea i definie se pomou jednaine:

Populacija raste konstantno m brzino m. Vreme deljenja jedne elije do druge, uvek je isto. Od jedne elije nastaju dve, od dve nastaju etiri, od etiri osam, od osam esnaest. Posle odreenog vremena dolazi do nakuplanja ogromnog broja populacije mikroorganizama. U eksponencijalno j fazi sve elije mikroorganizama su ive. Veoma su osetljive na dejstvo spoljanjih inilaca I najlake ih je unit it i. Osim toga aktivnost elije je poveana I sintetie se itav niz vanih sastojaka eliije. Faza usporenog razmnoavanja- U ovpj fazi poveanje broja ivih elija populacije se postupno smanjuje. Stacionarna faza- populacija po broju mikroorganizama dostie svoj maksimum. Broj novonastalih elija I broj ko ji odumiru je ist i. Isti broj elija nastaje I isti broj nestaje. Zbog toga je koncetracija ivih elija konstantna. Mikroorganizmi su ovde manje osetljivi na dejstvo spoljanjih faktor Sa aspekta praktine primene, ova faza u razvo ju populacije moe bit i veo ma znaajna jer ba u njo j dolazi do maksimalnog stvaranja odreenih proizvoda (ant ibiotika, acetone, etanola, butanola, odreenih vitamina). Faza odumiranja mikroorganizama- posle stacionarne faze ivotna sposobnost mikroba opada, jer je dolo do pogoranja uslova sredine koja je pretrpela znatne fiziko- hemijske izmene. BRo j koji odumire prevazilazi broj ivoh elija. Brzina pdumiranja takoe zavisi od delovanja spoljanjih inilaca I svo jstava samih mikroorganizama. Tokom vremena cela populacija odumire, to moe trajati nekoliko dana (bakterije mlene kiseline), nedelja ili godina kpd veo ma otpornih predstavnika (sporogene bakterije)

2 5

Page

25

Dobijanje enzima Enzimi su prirodni proizvodi i dobijaju se iz razlicitih vrsta bioloskih organizama (od virusa i bakterija do biljaka, zivotinja i coveka). Od enzima koji su nasli primenu u razlicit im oblast ima, samo oko 4% se dobijaju iz razlicit ih biljnih, a samo oko 8% iz razlicit ih zivot injskih vrsta. Vecina drugih enzima se dobija iz mikroorganizama i to preko jedne polovine iz gljivica i kvasaca, a preko jedne trecine iz bakterija.razlozi za ovo su pre svega je sto se za razliku od zivotinja i biljaka, u celijama mikroorganizama kolicina stvorenog enzima moze lako povecat i selekcijo m, izborom hranljive podloge i genetskim manipulacijama. Prinos enzima kod mikroorganizama se moze povecati: izborom so ja, koriscenjem mutiranih mikroorganizama, sastavo m hranljive podloge, temperature, pH, aeracije. Industrijski enzimi dobivaju se iz: 1. Biljaka ( amilaze slada, papain, bromelin, ficin i dr.) 2. ivotinja (enzimi pankreasa, katalaza, renin i dr) 3. Mikroorganizama (amilaze, proteaze, pektinaze, invertaze i td) Danas se jo uvijek dobiva znatan bro j enzima iz biljaka i ivot inja. Meutim, iz tehnikih i ekonomskih i javno zdravstvenih razloga moe se oekivat i dalje poveanje proizvodnje enzima mikrobnog podrijetla. Naime, za dobivanje enzima iz biljaka potrebne su velike povrine i dosta radne snage. Osim toga broj enzima iz biljaka je ogranien. Enzimi iz ivotinja dobivaju se iz ljezda, koje slue i za druge svrhe (na pr. iz pankreasa se dobiva insulin), i njihova je koliina ograniena. Aktualni problem mogunosti prijenosa uzronika govee spongiformne encefalopat ije (GSE), dodatni je razlog za trajni prestanak koritenja enzima dobivenih iz goveih organa. Optimizovanje procesa kultivacije Podrazumeva izbor sastava hranljive podloge(vrste I koncentracije izbora ugljenika, azota,fosfora, faktora rasta I dr.) I fizickih parametara koji obezbedjuje maksimalni prinos enzima. Tehnologija reko mbinantne DNK omogucava: Industrijsku proizvodnju enzima I drugih proteina koji se inace stvaraju u organizmu coveka I drugih zivih bica u veo ma malim kolicinama.

Proizvodnja enzima Dobijanje enzima vrsi se iz mikroorganizama. Prvo se vrsi gajenje (kult ivacija) mikroorganizama (najcesce 1-2 dana kod bakterija). Ekstracelularni enzimi se (u sirovom, ne precisceno m obliku) dobijaju prostim uklanjanjem celija centrifugiranjem, dok je kod intracelularnih neophodno razvijanje celije I ekstrakcija enzima. Posle ovoga obicno je potrebno izvrsit i I preciscavanje enzima. 2 6

Page

26

Molekuli enzima su mnogo slozeni da se sintet isu iz cist ih hemijskih srestava pa je mnogo lakes koriscenje zivih organizama. Problem je sto se enzimi proizvode iz mikroorganizama koji se veo ma tesko gaje u industrijskim uslovima jer mogu stvorit i nezeljen nus-proizvod. Savremeno industrijsko dobijanje(gajenje) enzima pocinje fermentacijo m bocica suve ili smrznut ih mikroorganizama, koja se zove proizvodnja so ja. Ova proizvodnja soja je izabrana za proizvodnju velikih kolicina enzima. Proizvodnja soja se prvo uzgaja u malim pljoskama koja sadrzi hranljive materije. Pljkoska je smestena u incubator koji obezbedjuje optimalnu temperaturu za prethodno smrznute susene celije za klijanje. Kada je pljoska spremna, celija se prenosi u fermentor. Fermentor prethodno sadrzi medijum. Fermentor omogucava da se seme celije reprodukuje(razmnozava) uz koriscenje hrenljivog medijuma koja se u njemu nalazi. Zat im se celija prenosi na veci tenk, glavni fermentor gde je temperature, pH I rastvoreni kiseonik pazljivo kontrolise da bi optimizovao proizvodnju enzima. Dodatne hranljive materije mogu bit i dodate kako bi se poboljisala produktivnost. Kada se glavna fermentacija zavrsi,dobija se smesa celija, hranljiva materije I enzima (supa) koja se zatim vodi dalje na filtraciju I preciscavanje.

Preiavanje enzima Enzimi se u industriji slino kao u laboratoriji preiavaju hro matografskim metodama. Za preiavanje enzima koriste se uglavno m tri tipa hro matografskog preiavanja: jonoizmenjivaka hromatografija gel-permeabilna hromatografija afinitetna hromatografija Priprema enzima za prodaju Nakon preiavanja enzima i koncentrovanja esto se dobija via aktivnost enzima od one koja je potrebna u industriji. Osnovni problem je odrati aktivnost enzima due vreme. Da bi se to postiglo neophodno je stabilizovat i enzim. Industrijski enzimi sadre relat ivno malu koliinu aktivnog enzima (manje od 10 %). Ostatak ine neaktivni proteini, stabilizatori, soli i drugo. U cilju stabilizacije enzima primenjuju se tri pristupa: dodavanje aditiva kovalentna modifikacija proteina i imobilizacija enzima Enzimi su znatno stabilniji u suvo m stanju nego u rastvoru. Stoga se mnogo ee enzimi isporuuju u suvo m obliku. Za prevoenje enzima u suvi oblik primenjuju se dva postupka: y liofilizacija i

2 7

Page

27

y sprej suenje Drugi postupak se zbog ekonominosti u industriji mnogo ee korist i. U rastvor enzima se dodaju skrob, laktoza, karboksi metilceluloza i polielektrolit i ko ji poveavaju stabilnost enzima priliko m suenja.

TEHNIKA REKOMBINATNE DNK

Tehnika reko mbinatne DNK ili danas poznat ije pod nazivo m genetiko inenjerstvo je revolucio narno dostignuce u podruju prirodnih nauka ko je je izazvalo revoluciju u biologiji i to naroito se odnosi na onaj dio u ko me se prouava nasledjivanje gena i funkcionisanje ivih organizama. Rekombinacija DNK pripada molekularno j genet ici. Zbog toga sto se genet iko inenjerstvo svakodnevno primjenjuje u razliit im prirodnim naukam kao sto su: biologija, agronomija, medicina, biotehnoligija i mnoge druge... ova tehnika je postala svakodnevnica. Genet iko inenjerstvo je tehnika pri ko jo j se dobijaju novi hribridni molekula van elije i njihovo spajanje sa posredniko m koji se naziva vektor. Nauna dost ignua su postigla da se dva molekula DNK iz razliit ih organizama po mijeaju u epruvt i i unesu u organizam do maina, gdje bi ta novonastala molekula DNK ispoljila svo je svo jstvo. Ovim postupkom se o moguava unoenje novih hribridnih molekula u organizam domaina ko je prirodnim putem ne postoje ali se mogu razmnoavat i. Ova tehnika unoenje hribridnih molekula DNK u organizam do maina se naziva jo i klo niranje. Escherichia coli (skraeno E. coli), koju je otkrio pedijatar i bakteriolog Theodor Escherich, je jedna od glavnih vrsta bakterija ko je ive u donjem dijelu probavnog trakta sisavaca. Nune su za pravilnu probavu hrane te sudjeluju u radu crijevne flore. Njezina je prisutnost u podzemnim vodama obino indikator fekalne zaraze. Svrstava se u skupinu Enterobacteriaceae te se esto korist i kao modelni organizam za bakterije uopte.

2 8

Page

28

Ova bakterija igra vanu ulogu u bioloko m inenjerstvu. Za strunjake postaje ,,tvornica za proizvodnju velikih koliina DNK. Jedna od prvih vanijih primjena tehnologije reko mbinantne DNK je bila upravo genet ika manipulacija E. coli za proizvodnju inzulina kod pacijenata oboljelih od dijabetesa.

Proces dobijanja rekombinantne DNK

Da bi napravili kulturu rekombinatne molekule DNK mora se potovati pravilo: da jedna od molekula DNK mora da bude plazmidskog ili virusnoh porijekla i ona mora da posjeduje gene koji jo j o moguavaju da se automno replicira u celijama. Ovu DNK nazivamo vektorom i ona nam slui za repliciranje druge DNK. Tu drugu DNK nazivamo stranom jer upravo nju pruoavamo i ko ju elimo razmnoavat i ona po pravili nije srodna sa vektorskom DNK nit i je srodna sa elijo m u ko ju e ui nakon spajanja sa vektorom Za reakciju spajanja vektorske DNK i strane DNK uzima se postupak rekombinacija in vitro a prozvod postupka naziva se rekombinatno m DNK. Za autonomnu replikaciju strane DNK koriste se bakterijske elije. Unoenje replicirane DNK u bakteriju naziva se transformacijo m ili transfekcijo m, zavisno od toga da li je vektor plazmidskog ili virusnog porijekla. U tehnologiji rekombinantne DNK postoji 5.faza rada: 1. stvaranje fragmenata DNK, sa ciljem da se u nekom od njih nadje odredjeni gen ili deo molekula DNK 2. ugradjivanje fragmenata DNK u pogodan vektor, to je u stvari reko mbinantni deo procesa, 2 9

Page

29

3. uvodjenje vektora u pogodnog domaina (najee E. coli), 4. kult ivisanje kompleksa do main-vektor na hranljivim podlogama radi dobijanja klo nova domaina, tj. dobijanja brojnih kopija fragmenta DNK ugradjenog u vektor 5. ubiranje klo nova koji sadre odredjeni fragment DNK Do fragmeta se moe doi i seckanjem ali je ovo nasumino pa su dobijeni fragment i nedefinisani. Restrikcio ne endonukleaze prepoznaju specifine, najee palindro mske, sekvence od 4-8 nukleotida i seku DNK na tano odredjeno m mestu u okviru t ih nizova. Mesta preseka se zovu restrikcio na mesta. Zahvaljujui komplementarno m karakteru baznog sparivanja u molekulu DNK, restrikcio ne endonukleaze dovode uvek do prekida oba lanca DNK. Svaka restrikcio na endonukleaza oznaava se prema mikroorganizmu iz koga potie. Kada se molekul DNK isee po mou odredjene restrikcio ne endonukelaze dobijeni fragment i imaju jednolanane krajeve, koji su ,,lepljivi. Na DNK vektora se takodje deluje ist im restrikcio nim enzimo m, a zatim se po mou enzima ligaze spajaju ko mplementarni krajevi fragmenta i DNK vektora. Tako dobijeni molekul DNK se naziva rekombinovani ili hibridni molekul. U pomenute svrhe koriste se razliit i t ipovi vektora, koji svi imaju sposobnos replikacije (razmnoavanja) u bakterijsko j eliji. Klasini vektori su plazmidi (kruni, dvolanani molekuli DNK ko ji se nalaze van glavnog hro mozoma bakterije i stabilno se nasledjuju), bakteriofagi (virusi ko ji obavljaju ivotni ciklus u bakteriji) i kozmidi (plazmidna DNK smetena u o mota faga). Izbor vektora zavisi od vrste upotrebljenog restrikcio nog enzima. Vektori se unose u eliju do maina, a to je najee E. coli, na vie naina: tarnsformacijo m, transfekcijo m, mikroinjiciranjem.Ko mpleks do main-vektor se umnoava kult ivacijo m in vitro, u cilju dobijanja klonova koji sadre odredjene fragmente ispit ivane DNK. Za odabiranje klonova sa rekombinovanim fragmentom DNK se korist i itav niz postupaka. To moe da bude selekcija na osnovu promenjenih svo jstava rekombinovane bakterije, ili hibridizacija otisaka bakterijskih kolonija sa obeleenim DNK probama. Klo niranjem razliit ih fragmenata DNK omogueno je dobijanje genskih, hro mozomskih i geno mskih biblioteka.

Biotehnoloki process gajenja kulture

Kulture Escherichia coli ko je se ubacuju u bioreactor sadre veliku gust inu elija. Kult ivacija je uradjena na dijalizi bioreaktora koji se sastoji iz dve ko more. Unutranja ko mora je odvojena od spoljanje membrano m. Escherichia coli se nalazi na bazi glicerola I drugih komponenata, koje se razmenjuju po mou membrane u ko more. Inhibitoran material se nalazi id unutranje do spoljanje membrane sa materijalo m ko ji je naknadno uklonjen sa otpadnih voda iz spoljanje membrane. U poetku, matemat iki modeli su korieni za opisivanje procesa, optimalnog gajenje kao to su parametari, poetni koncentracija glicerola u dva dijela, eljeni prolaz kroz membranu

3 0

Page

30

koncentracije glicerola u hrani / dialising medij, i vreme da se pone srednji kurs, odreeni su iz prethodnog eksperimente i proraune. Stvarni rezultat i gajenje odgovorali su veo ma dobro sa modelom predvianja. Veoma visoka koncentracije elije 174 g suve mase / 1 je dobijena. Ova elija je koncentracija u rasponu od maksimalne teorijske koncentracije E. coli u kult uri supa (160-200 g / l).Temperatura je bila postavljena na 25 C ili 37 C kao to je prikazano u svako m eksperimentu. Protok vazduha je regulisano izmeu 1 i 6 L min-1. Pored istog kiseonika u vazduhu ulaznih tok je(do 100 %).Rast kulture usledio je merenje svetla apsorbancije na 600 nm , merenjem elije mokre teine, kao i odreivanje elije suve teine. Zato 1 ml suspenzije elija je centrifugirano u suvog i pre izmjerenih 1 ml epruvete u 13000 g za 5 min. Nakon uklanjanja pluta, uzorci su mereni za mobilne vlane mase, a zat im sui na 80 C najmanje 24 h. Adsorbancijo m od 600 nm od 1 rezultat u eliji mokre teine dobijeno 1,7 g i 0.39 g suve mase. Poboljan dotok kiseonika trebalo bi da na taj nain dovede do vee gustine elija. Korienjem 10 L Cult iBag RCG ko ji je opremljen optikim senzorima za pH iparcijalnog pritiska kiseonika, bio je ispunjen sa 4 L kult ivacije medijuma. Poetne koncentracije glukoze od samo 10 g L-1 obezbeena je brzina prenosa kiseonik ko ja je bila dovoljna da u potpunosti podrava aerobni rast tokom poetne faze procesa. Nakon 13,5 sat i, kada je poetni nivo glukoze bio iscrpljen, kont inuirano hranjenje sa visoko m koncentracijo m glukoze poela sa konstantnom brzino m . Ishrana se poveala eksponencijalno tokom vremena, koja garantuje odreenu stopu rasta od 0,13 h-1. Shodno tome i parcijaln i pritisak kiseonika smanjen je eksponencija lno. Kada je st igao parcija lni prit isak kiseonika taku od 50%, kontroler parcijalni prit isak kiseonika je poeo da se odrava na ovo m nivou. Prvo, vazduh protoka je povean na maksimalno 6 L min-1, i drugo, sadraj kiseonika je bio postepen povean od istog kiseonika do maksimalno 100% od ukupne stope protoka gasa. Sa ovom procedurom, kultura je porasla na optiku gustinu OD600 = 58 na 37 C uz veo ma mali obim poveala se samo oko 150 ml Analiza medijuma Za merenje sadraja polisaharida je izvedena sa hidrolizo m kiselina. Stoga 100 l uzorka su pomean sa 100 l od 2 N HCl i zagreva do 100 C za 2 sata. Neutralizacija je uinjeno sa 100 l 2 N NaOH i 100 l 0,5 m Sorensen bafer. Nakon neutralizacije, glukoza koncentracije enzimat icalli meri u polisaharid uzorke.Acetat, laktata i etanol su analizirani po mou HPLC 1200 hro matografija sistema (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA) opremljen indeks prelamanja detektor (RID). Kao kolone, HiperRez KSP-ugljikohidrata H + (300 7,7 mm, 8 m, Fisher Scient ific Inc) je primenjen. 5 mm surna kiselina je korien kao t bafer. Vrhovi su integrisani u softverski paket Chemstation Verzija Rev B.04.01 (Agilent). Pre analize, kultura uzoraka E. coli je centrifugiran za 5 min na 13000 g i 4 C i posle filtracije

3 1

Page

31

Primena tehnike rekombinantne DNK u proizvodnji insulina

Uprkos nekim toksinost i na E.coli,iz kojih smo dobili elije ko je sadre do 18 % enzima ukupnog proteina,sirovi ekstrakt ovih kultura je specifina aktivnost priblino 220 puta vea od ekstakta inficiranih E.coli.

3 2

Page

32

Insulin
Insulin je hormon ko ji lui lijezda guteraa (pankreas), a slui za regulaciju eera u krvi. On pokree elije da iz krvi uzimaju potrebni eer (glukozu) ili jetru da ga podhranjuje. Poveanje koncentracije glukoze u krvi iznad normalnih vrijednosti predstavlja signal za luenje isulina. Insulin o moguava i ubrzava unoenje glukoze iz krvi u miiei masno tkivo,gdje biva razgradjeno. U jetri postoje elijske membrane koje su propustljive za glukozu pa zbog toga insulin indikuje sintezu enzima. Ti enzimi katalizuju degradaciju glukoze i njenu polimerzaciju u glukogen. Insulin inhibira i enzime ko ji katalizuju razlaganje glikogena na glukozu. Nedostatak insulina u organizmu izaziva eernu bolest (Diabetes melitus). Spada u polipept ide i sadri 51 aminokiselinu, ima oblik dva lanca medjusobno povezana disufildnim vezama. Prvi postupci izdvajanja insulina bila su ekstrakcijo m iz govedje ili svinjske guterae. Taj insulin se dosta primjenjivao jer se nije puno razlikovao od ljudskog insulina, ali poto insulin nije bio ist, ve je ima i primjese pankreasa mogao je da dovede do alergijskih reakcija.Zbog toga se istraivalo da se dobije to istiji insulin ko ji se ne razlikuje od ljudskog.

Proizvodnja rekombinantnog humanog inzulina (rhi)

Tri nauna otkria su veo ma bitna za primjenu insulina: biosinteza humanog insulina, upotreba penskih brizgalica i otkrie insulinskih analoga. Proizvodnja rekombinatnog humanog insulin poinje od 1980 godina. . Danas se dobija ist i insulin tehnologijo m reko mbinantne DNK tj. proizvodnja uz pomo genetski modificirane bakterije Escherichije coli. Kultura ove bakterije se lako gaji. Bakterija se brzo razmnoava, na svakih 20 minuta dolazi do deobe bakterijske elije. Escherichije coli je poznata kao pontecijaln i pathogen koja ima mogunost zadravanja proteiskog proizvoda u eliji. S obziro m na brzinu, intenzitet i trajanje djelovanja dijelimo ih na 4 grupe: y Insulini brzog djelovanja - sadre samo insulin ili lispro-insulin y Insulini srednjedugog djelovanja - sadre protein protamin i insulin (NHP-insulin) y Insulini srednjedugog djelovanja s brzim nastankom uinka - sadre ko mbinacije istog insulin i NHP-insulina y Insulini dugog djelovanja - sadravaju tzv. "ultralente insulin" ili insulin-glargin . Raznim ko mbinacijama insulina, cinka, protamina i pufera danas se mogu nainit i rastvori insulina s tano odreenim brzinama djelovanja, intenzitet ima i trajanjem djelovanja. Lisproinsulin je vetaki insulin sa izmjenjenim redosljedima aminokiselina ko ji neobino brzo djeluje. Insulin-glargin, novi oblik insulina koji se nedavno pojavio, jest pegilirani insulin, a zapravo predstavlja insulin-depo.

3 3

Page

33

y Modifikacije inzulina y - utjecaj na brzinu disocijacije agegata terapijskog inzulina u mo nomere nakon subkutanog injekt iranja y - bazalana konc. inzulina u krvno j plazmi (zdrave osobe): ~1 x 10-9 mol/L y -mijenja se ovisno o vremenu unosa hrane u organizam y Analozi inzulina y - modifikacije terapijskog r.h. Inzulina _ trajanje djelovanja y Regularni terapijski inzulin _ mjeavina mono mera, dimera i agregata

BIOREAKTORI ZA BILJNE ELIJE

Ko mercijalno zanimljivi biljni produkti najee se odnose na sekundarne metabolite koji se mogu podelit i u tri grupe: o o o esencijalna ulja glikozidi alkaloidi

Esencijalna ulja - smesa terpena koji se koriste kao spojevi arome i mirisa. Glikozidi - fenolni spo jevi, flavanoidi, saponini, tanini, cijanogeni glikozidi itd, a koriste se kao bo je u tekstilno j i prehrambeno j industriji i kao lekovi. Alkaloidi - preko 4 000 razliit ih struktura spojeva koji su fizioloki akt ivni u ljudsko m organizmu (npr. kokain, nikotin, morfin) Biljne elije se mogu korist iti i u proizvodnji vanih terapeutskih proteina kao to su o o B) o o o mo noklonska ant itela proteini ko ji deluju kao imunogeni (jest ive vakcine za koleru, malariju, hepat it is humani serum albumin interferon humani hemoglobin

3 4

Page

34

OSNOVNE KARAKTERISTIKE KULTURE BILJNIH ELIJA U PROIZVODNJI

BIOTEHNOLOKOJ

Pod pojmo m kulture biljnih elija u biotehnolokoj proizvodnji podrazumijevaju se: izolovane elije ili male grupe elija u teno j podlozi (suspenzija elija) izolovani biljni organi (kultura organa) izolovani embrio ni (kultura embriona)

U proizvodnji metabolita, biljnim elijama glavni problemi su: niska produktivnost elija spori rast genet ika nestabilnost elijskih linija slaba kontrola diferencijacije elija potekoe u uspostavljanju fotoautotrofnih uslova rasta

POREENJE SUSPENZIJE BILJNIH ELIJA I KULTURE MIKROBNIH ELIJA

Karakterist ike Veliina elija Svo jstva elija Brzina rasta Vreme udvostruenja

Kultura mikrobnih elija mala (promer 1-10 m) pojedinane elije i grupe velika Sati

Suspenzija biljnih elija velika (promer 40-200 m) najee grupe (agregati) Mala Dani umerena do visoka Page

Oset ljivost na smicanje niska

3 5

35

Stabilnost Nakupljanje produkta

stabilna esto ekstracelularno

nestabilna najaee intracelularano

PROCES Podloga Gustina inokuluma Temperatura Aeracija Penjenje Vreme uzgo ja

Kultura mikrobnih elija najee jednostavna niska 26-36 C visoka esto izraeno dani

Suspenzija biljnih elija najee sloena visoka (5-10 %) U zavisnost i od niska ponekad sedmice

3 6

Page

36

Osnovni tehnoloki uslovi neophodni za uzgoj biljnih elija u bioreaktoru:

1) homogenost i meanje podloge kako bi se ostvario efikasan prenos hranjivih materija bez taloenja i aglo meracije elija 2) optimalna aeracija s odgovarajuim hidrodinamikim uslovima 3)dugorono sterilni uslovi zbog sporog rasta biljnih elija 4)uvoenje izvora svetlosti kod heterotrofnih, fotomiksotrofnih i fotoautotrofnih kultura elija radipoboljanja efikasnosti biosinteze Kako bi se ostvarili optimalni uslovi proizvodnje, upotreba biljnih elija u biotehnolokoj proizvodnji iziskuje mut idisciplinarna istraivanja iz podruja:

y y y y y

fiziologije biljaka molekularne biologije farmakologije toksikologije hemije i hemijskog inenjerstva

Uz tehnoloke uslove, preduslovi ko ji se moraju zadovoljit i da bi se neka kultura biljnih elija upotrebljavala u proizvodnji su: 1) 2) visok prinos eljenog metabolita genet ika stabilnost elijske linije

Pre odabira tipa bioreaktora potrebno je napravit i: o o metabolita o studije vijabilnost i elija studije dinamike rasta elija s praenjem biosinteze i izolovanja eljenog studije toka, meanja i prenosa mase

U bioreaktorima se ostvaruju kontrolisani uslovi koji o moguavaju optimalni uzgo j biljnih elija i proizvodnju eljenog metabolita. Prednost uptrebe bioreaktora za uzgoj biljnih elija je mogunost bolje kontrole prenoenja u industrijsko merilo zbog strogo kontrolisanih uslova.

3 7

Page

37

BIOREAKTORI KOJI SE NAJEE KORISTE U PROIZVODNJI SA KULTURAMA BILJNIH ELIJA

Tip kulture elija

Vrsta bioreaktora

Proizvod

reaktori s ajmalicin, antrakinon, berberin, bio masa, mealico m rumarinska kiselina, ikonin, vinkrist in reaktor s rotirajuim bubnjem air-lift reaktori reaktori s teniim slo jem antocijani, bio masa, ikonin ajmalicin, berberin, bio masa, jatrorizin, saponini, vinkrist in, F-karoten betalaini, bio masa

Suspenzija elija

Tip kulture stanica Kultura embriona

Vrsta bioreaktora reaktori s mealico m barbotirajue kolone

Proizvod aliin, kumarini, diferencirana bio masa aliin, kumarini diferencirana bio masa kumarini

Kultura posude s izdanka i embriona aeracijo m air-lift reaktori

3 8

Page

38

-Bioreaktori za suspenzije biljnih elija-

Glavni problemi prenosa proizvodnje sa suspenzijom biljnih elija u industrijsko merilo su: promene ko je nastaju u dinamici rasta biljnih elija i proizvodnji bio mase ogranien prenos mase kiseonika i hranjivih sastojaka neho mogenost sastava dovodi do taloenja i smrt i elije osetljivost elija na hidrodinamike uslove meanje radnog medijuma to uzrokuje smrt elije u industrijskoj proizvodnji najvie se koriste bioreaktori s mealico m promena u projektovanju klasinih bioreaktora s mealico m najee se odnose na dizajn meala i rasprivaa vazduha, kako bi se hidrodinamiki uslovi prilagodili biljnim elijama, ali i osigurao dovoljan prenos kiseonika i ho mogenost radnog medija.

TRENDOVI U PROJEKTOVANJU BIOREAKTORA ZA BILJNE ELIJE

Ekonomska isplat ivnost odluujui je kriterijum za komercijalnu proizvodnju biljnih sekundarnih metabolita u bioreaktorima Kako bi se smanjili invest icio ni trokovi uvode se bioreaktori nove generacije pri ijem se dizajnu koriste materijali za jednokratnu upotrebu to znatno smanjuje cenu bioreaktora. Koriste se bioreaktori ija je unutranjost obloena sterilno m plast iko m (smanjuje se troak sterilizacije)  wave reaktori

3 9

Page

39

imerzijski reaktor RITA

Osim smanjenja investicionih trokova razvoj biotehnoloke proizvodnje zavisie i od napretku metoda genetikog inenjerstva

IMOBILISANE BILJNE ELIJE I NJIHOVI PROIZVODI

Imobilizacija je generiki naziv za metodu ograniavanja slobodnog kretanja bilo ko jeg biokatalizatora, a karakterisana je vezanjem biokatalizatora u odreenom ogranienom prostoru da bi se mogao kontinuirano upotrebljavati. Imobilizacija elija na ili u polimerni matriks najee utie na diferencijaciju elija to esto rezult ira poveanjem produktivnost i proizvodnje u odnosu na suspenziju elija. Metode imobilizacije: elija vezana (uhvaena) u nosau: vezana u matrici mikrokapsulirana Stanica vezana na nosau: o adsorbirana o kovalentno

Biljne elije u suspenzijsko j kulturi relativno su velike (do 100 mm u promjeru) i rastu u skupinama (agregatima); stoga je najpogodnija metoda imobilizacije biljnih elija uklapanje (entrapment) u matricu (polimerni gel). Polimeri ko ji se najee koriste za uklapanje biljnih elija su: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Alginat alginat agar i agaroza karagenan poliakrilamid poliuretan membrane

4 0

Page

40

elije ostaju potpuno vijabilne najee se korist i kalcijumov alginat kopolimer D-manouronata i L-glukouronata vezanih 1,4-glikozidno m vezo m

vodeni rastvor polisaharida formira stabilan gel u prisustvu vievalentnih kat iona (Ca2+, Ba2+ ili Al3+) est ice okruglog oblika alginata koje sadre uklopljene elije dobijaju se kapanjem suspenzije stanice/alginat u medijum sa kalcijum-hlorido m koncentracija alginata je 2-5 % koncentracija elija unutar gela je 5-20 % mogua povratna reakcija otapanjem gela dodatkom kelirajueg agensa (EDTA ili citrat) koji vee kalcijum i uklopljene elije se oslobaaju problemi mehanikog integriteta-nestabilnost matrice zbog kontinuiranog rasta elija Agar ili agaroza kopolimer 1,3-vezane D-galaktopiranoze i 1,4-vezane 3,6-L-galaktopiranoze stvaranje gela hlaenjem zagrejanog vodenog rastvora gelirajua temperatura se moe menjat i hemijsko m modifikacijo m strukture (uvoenjem hidroksiet ilne skupine) za veinu biljnih elija pogodna gelirajua temperatura od 30 C koncentracija otopine agaroze je 2-5 % konana koncentracija biljnih elija je 5-20 % est ice gela mogu se dobiti u razliit im oblicima: kao blok koji se moe razbit i u est ice odreene veliine ili kao sferine est ice koje se dobiju disperzijo m suspenzije elije/polimer u netoksinoj hidrofobno j fazi uz meanje Karagenan sadri ponavljajue disaharidne jedinice D-galaktoza-4 sulfata i 3,4-anhidro-D-galaktoze jako gelirajui anjonski hidrokoloid slian alginatu osim to se rastvor polimera mora zagrevat i da bi se odrao u tekuem stanju koncentracija karagenana je 2-5 % kuglice se stvaraju kapanjem suspenzije elije/karagenan u medijum sa kalijumovim jo nima

4 1

Page

41

Poliakrilamid izvedena prva imobilizacija u njemu toksian za biljne elije biljne elije se suspenduju u vodeno m rastvoru prepolimerizovnog linearnog poliakrilamida delimino supstituisanog sa acilhidrazidno m funkcio nalno m grupom suspenzija je umreena dodatkom odreene koliine dialdehida glioksala dobijeni gel se mehaniki dezintegrire u manje estice Poliuretan poliuretanske estice sadre pore u koje se veu biljne elije koje se mogu korist it i do 21 dan elije se uklapaju umreavanjem prepolimera uretana Membrane upotrebljavaju se razni membranski sastavi najee reaktori sa upljim vlaknima

Prednosti imobilizacije biljnih elija vea koncetracija elija, to poboljava kontakt meu elijama i poveava volumetrijsku produktivnost viestruka ili ponovljiva upotreba imobilisanih elija u velikim koncentracijama poveava produktivnost podloga za gajenje se moe lako promenit i u skladu s potrebama proizvodnjE manja osetljivost na hidrodinamike uslove kontinuirana mogunost uklanjanja produkata i/ili toksinih metabolita ime se pospeuje elijski metabolizam bolja kontrola diferencijacije elija i proizvodnja sekundarnih metabolita olakana separacija eljenog metabolita upotrebom naprednih separacijskih metoda (npr. u matriks se ugradi magnet te se magnetskom separacijo m metabolit i izdvajaju iz podloge)

4 2

Page

42

Karakteristike imobiliziranih elija

preivljavanje (vijabilnost) vijabilne elije rastu i dele se nepoeljno kod imobilisanih elija rast elija moe dovest i do njihovog oslobaanja ili destrukcije estica priprema medijuma koji odravaju elije u vijabilnom stanju kroz dui period, ali da se ne dele praenje vijabilnost i direktno i indirektno plazmoliza i tehnike bo jenja za odreivanje integriteta plazmatske membrane (npr. bo janje s fluorescein-diacetatom) merenje respiracije praenje staninog rasta i deljenja (prati se broj elija ili njihova gustina unutar imobilisanih est ica odnosno mitotiki indeks ko ji daje broj elija u mitozi) Oslobaanje produkta sekundarni produkti esto uskladiteni unutar elija odnosno vakuola imobilizacija ponekad dovodi do oslobaanja produkta (spontano oslobaanje) -oslobaanje indolnih alkaloida u podlogu iz uklopljenih elija Catharanthus roseus da bi se oslobodili produkti iz vakuola imobilisanih elija trebaju prei dve membrane (plazmatsku membranu i tonoplast) koji okruuje vakuolu 5%-tni dimet ilsulfoksid (DMSO) kroz 30 minuta moe uinit i permeabilnima plazmatsku membranu i tonoplast elije ostaju vijabilne (kemijsko oslobaanje) sa DMSO se moe oslobodit i oko 90 % intracelula rno uskladitenih produkata metoda je primenljiva samo za rastvorne produkt Reaktori za imobilizirane elije:

4 3

Page

43

jednostavne aparature za arni uzgo j (Erlenmeyerove tikvice na tresilici) reaktori s nasutim slo jem barbotirajui reaktori reaktori s lebdeim slo jem membranski reaktori

KVASCI

Kvasci pripadaju carstvu Fungi, zajedno sa plesima i mesnat im gljivama. Fungi su eukarioti. S obziro m da nemaju hlorofil, nemaju mogunost obavljanja fotosinteze, pa do hrane dolaze adsorpcijo m iz okoline. elije kvasca su okruglog ili jajolikog oblika, veliine 5-8 m. Razmnoavaju se najee nepolnim naino m, tj. pupanjem. Na roditeljsko j stanici raste pup, jezgro se deli i jedno odlazi u pup, koji se otkida kada dostigne veliinu osnovne elije. Kvasci zasigurno po brojnosti ine ekono mski najznaajniju skupinu mikroorganizama. Saccharomyces cerevisiae je najpoznatija vrsta iz roda Saccharomyces, tako da se esto pojam kvasac i Saccharomyces cerevisiae upotrebljavaju kao sinonimi. Inae kvasci iz roda Saccharomyces su specifini po tome to se ubrajaju meu malobrojne kvasce ko ji mogu rasti i u anaerobnim uslovima. Drugi fermentativni kvasci kao to su oni iz rodova Candida i Kluyveromyces trebaju odreenu koliinu kiseonika za rast. Takvi kvasci zahtevaju strogu kontrolu dobave kiseonika tokom procesa, te stoga imaju manju produktivnost pri proizvodnji etanola. Nadalje kvasci iz roda Saccharomyces manje su osetljivi na visoke koncentracije etanola, pa se upravo zbog toga koriste za proizvodnju etanola. U mnogim industrijskim procesima kvasci se koriste vie nego bakterije za proizvodnju mnogih heterolognih proteina, zbog injenice da pripadaju u eukariotske organizme. To im o moguuje pravilno provoenje post-translacijskih promena, to ima za posledicu dobijanje proteina eljene bioloke akt ivnosti. Dalje, znaajna prednost kvasaca u poreenju s bakterijama je ta to u hranjivu podlogu mogu izluit i u potpunosti pravilno nabrane heterologne proteine. Obziro m da kvasci izluuju samo ogranien bro j proteina, strani proteini mogu bit i proizvedeni u relat ivno istom obliku to ujedno procese izolacije ini manje kompleksnim. Pekarski kvasac U elementarno m sastavu pekarskog kvasca prevladavaju ugljenik (48 %), kiseonik (31 %), azot (8%) i vodonik (7 %). Bio masa se takoe sastoji od kalijuma, fosfora, magnezijuma, kalcijuma, sumpora i ostalih elemenata u tragovima. Populacije kvasca, uz to to imaju veliku ulogu u proizvodnji hleba, piva, vina i alkohola, ali se sve vie upotrebljavaju i za biotransformacije, u proizvodnji proteina uz modificiranje populacija genet ikim inenjeringo m. Iako se kvasac upotrebljava za proizvodnju alkoholnih pia jo od davnih vremena, biohemijski putevi pri proizvodnji etanola i sama uloga kiseonika u njima jo uvek nije sasvim objanjena.

4 4

Page

44

Kiseonik je sigurno potreban za biosintezu sterola i zasienih masnih kiselina i vrlo verovatno nikotinske kiseline, pa se mora dodavati u hranjivu podlogu. Kod procesa proizvodnje pekarskog kvasca mora se teit i maksimalo m iskoritenja kvaeve bio mase, dok se kod procesa proizvodnje alkoholnih pia zahteva minimaliziranje broja elija kvasca, a sam proces je usmeren na poveanje akumulacije metabolita, posebno etanola. Za proizvodnju kvasca u velikim koliinama, potrebno je dodavati supstrat postupno, da se ogranii koliina proizvedenog etanola. Iako elije naknadno mogu rasti na etanolu kada se potroi glukoza, mnogo je bolje postii veliku gustou elija izbegavanjem proizvodnje etanola.

Uslovi za uzgoj pekarskog kvasca

Za odgovarajui rast pekarskog kvasca (Saccharomyces cerevisiae) potrebno je osigurati odgovarajui hranjivu podlogu kao energetski izvor, izvor azota, fosfora i nekih metala (K, Ca, Fe, Zn, Mg, Cu). Kao izvori energije koriste se jedinjenja s visokim sadrajem eera ili ist i eer. Izvor azota su uglavno m amonijeve soli ili amo nijak, a fosfora ortofosfat i ili fosforna kiselina. Kalijum je vaan za izgradnju protoplazme. Kalcijum ucestvuje u uklanjanju otrovnih materijala koji nastaju za vreme uzgo ja pekarskog kvasca, a gvozdje i sumpor u reakcijama oksidacije i redukcije. Magnezijum je neophodan za aktivaciju fosfataza koje ucestvuju u alkoholno j fermentaciji. Bakar ubrzava oksidacijske procese, vaan je za izgradnju vitamina i sintezu belanevina. Pekarski kvasac nije osetljiv mikroorganizam. Tolerise irok raspon koncentracija vodikovih jo na, pa moe rasti pri pH izmeu 3,6 i 6, meut im optimum se nalazi pri pH izmeu 4,5 i 5. Industrijski uzgo ji pekarskog kvasca obino zapoinju pri niim pH vrednostima jer je tada kontaminacija bakterijama minimalna, a kasnije se pH povisuje dodatkom alkalija do optimalne vrednosti. Temperatura proizvodnje uzgoja pekarskog kvasca je obino 30 C jer je tada generaciono vreme najkrae. Generacio no vreme je vreme potrebno za udvostruenje poetne populacije mikroorganizama. Kako bi se omoguio normalan rast i razvo j kvasca i u laboratorijskim uslovima, potrebno mu je dati sve potrebne hranjive materije. Zato se pripremaju posebne podloge hemijski definisanog sastava. ak i uz prisustvo svih potrebnih elemenata za rast, dolazi do pojava koje nije uvek mogue predvideti, a to su inhibicije glukozom i etanolo m, te neodgovarajuo m koliino m azota u mediju. Uzgo j pekarskog kvasca jako zavisi od koncentracije glukoze i azota. One kontrolisu dva mogua katabolit ika puta glukoze, a to su pretvaranje u etanol i ugljen dioksid, ili pretvaranje u ugljen dioksid i vodu.

4 5

Page

45

Prvi kataboliki put (C6H12O6 2C2H5OH +2CO2 +2ATP) ne daje znatnu koliinu energije jer ona ostaje vezana u energetski bogatijim molekulama etanola, dok za drugi kataboliki put (C6H12O6 6CO2 + 6H2O + 16-28 ATP) to nije sluaj. Etanol proizveden uzgo jem pekarskog kvasca moe bit i oksidiran u sledeem stupnju arnog uzgoja prema reakciji: C2H5OH + 3O2 2CO2 + 3H2O + 6-11ATP. Pokazano je da se tokom prve faze uzgo ja pekarskog kvasca proizvodi etanol i nakon to se sva glukoza potroi, dolazi do oksidacije etanola ko jeg bio masa takoe korist i za svo j rast. Interakcija izmeu koncentracije azota i glukoze u oekivanim putevima se moe opisati na sledei nain: pri niskim koncentracijama glukoze i azota nastaje etanol. Isto se dogaa pri niskim koncentracijama azota i visokim koncentracijama glukoze, te pri visokim koncentracijama azota i glukoze. Pri visokim koncentracijama azota I niskim koncentracijama glukoze nastaje bio masa. Osim azota i glukoze na uzgo j pekarskog kvasca takoe utie i etanol. Etanol inhibira rast kvasca Saccharomyces cerevisiae na glukozi. To je neko mpet itivna inhibicija jer etanol utie na maksimalnu specifinu brzinu rasta, ali ne i na afinitet sustava prema glukozi.

Kriva rasta Rast i razvo j pekarskog kvasca u uslovima arnog uzgoja odvija se nekoliko faza. Faza indukcije ili lag faza je vreme u kojem se kvasac prilagoava novonastalim uslovima. U toj se fazi ne poveava bro j celija, ali je prisutna znatna metabolika aktivnost jer celije sintetiu potrebne enzime kako bi mogle rast i u novonastaloj sredini. Trajanje te faze zavisi od: sastava novog medija, sastava podloge na kojo j je mikroorganizam rastao, vrsti i starosti celije, raznim fiziiloskim faktorima i o vrst i produkata metabolizma. Tokom faze eksponencijalnog rasta celije dostiu maksimalnu brzinu rasta, a njihov hemijski sastav se vie ne menja. Duina te faze zavisi od velikog broja meuzavisnih parametara, a traje toliko dugo dok mikroorganizmi imaju dovoljno hranjivih podloge. Na duinu faze eksponencijalnog rasta utie i vrsta produkta metabolizma mikroorganizma i njihov uticaj na brzinu rasta bio mase. Tokom stacionarne faze celije su maksimalne veliine i volumen populacije je najvei. Ova faza nastupa kada koncentracija neke od komponente neophodne za rast ili koncentracija nekog katalit ikog otrova dostiu takvu veliinu ko ja vie ne moe podrati maksimalnu brzinu rasta.

4 6

Page

46

Faza odumiranja celija moe imat i razliito vreme trajanja, koje zavisi od uslova u kojima se vri proces i od vrste mikroorganizama. Ova faza poinje kada pojedine celije liziraju (dolazi do pucanja celijske membrane), pa unutarcelijske komponente iz takvih celija (eeri, aminokiseline, vitamini) slue za odravanje ivotnih funkcija preostalih stanica. Svaka od ovih faza znaajna je za mikrobioloki proces koji se prouava ili vodi pa je poznavanje zakonitosti zbivanja u svako j pojedino j fazi od izuzetne vanosti. Tako je, npr., osnova dobrog oblikovanja procesa smanjit i vreme trajanja faze indukcije i to vie produit i vreme trajanja eksponencijalnog rasta.

Aparatura Bioreaktor je opremljen polarografsko m azotovom elektrodom, aparaturom za regulaciju temperature, aparaturom za regulaciju bro ja okretaja, aparaturom za regulaciju pH, aparaturom za uzimanje uzorka, etiri razbijaa vrtlonog gibanja, aparatura za meanje vazduha sa drugim supstancama, dve mealice sa et iri lopat ice, meraem protoka vazduha (rotametar), filtero m za sterilno dovoenje vazduha i prikljuko m za dovod antipenila. Azotova elektroda je preko pojaala spo jena na merac s mogunou akvizicije podataka svaku sekundu. Odabran je pekarski kvasac Saccharomyces cerevisiae. ista kultura pekarskog kvasca se uva u hladnjaku na 4C. Hemikalije Pri uzgo ja pekarskog kvasca upotrebljene su sledee hemikalije: glukoza, FeSO4 7H2O , (NH4)2SO4 , CaCl2, CuSO4 5H2O, KH2PO4 , ZnSO4 7H2O i MgSO4 7H2O, NaCl, malt-agar i maslinovo ulje. Priprema hranjive podloge Hranjiva podloga za uzgoj pekarskog kvasca prireena je na temelju literaturnih podataka i slijedeeg je sastava: glukoza 10 g/dm-3, FeSO4 7H2O 0,012 g/dm-3, (NH4)2SO4 7,500 g/dm-3, CaCl2 0,030 g/dm-3, CuSO4 5H2O 0,001 g/dm-3, KH2PO4 1,500 g/dm-3, ZnSO4 7H2O 0,006 g/dm-3 i MgSO4 7H2O 0,691 g/dm-3. Komponente hranjive podloge potopljene su u 1dm3 dest ilirane vode. Nakon pripreme hranjiva podloga, fizioloki rastvor i ant ipenilo(maslinovo ulje) sterilisu se u autoklavu 30 minuta vodeno m parom temperature 115 C.

4 7

Page

47

Hranjiva podloga za pripremu inokuluma je identinog sastava. Priprema inokuluma Pet dana pre provoenja uzgo ja pekarskog kvasca u bioreaktoru kultura kvasca je precijepljena sa malt-agara (koji je bio koriten za odravanje kulture kvasca) na sveu podlogu malt-agara (47 g malt-agara u 1 dm3 dest ilirane vode) i na dve podloge s glukoznim agarom (13-15 g agara u 1 dm3 hranjive podloge). Nakon 72 h inkubacije na 30 C u termostatu kulturu iz jedne epruvete sa glukoznim agarom je preneen ezo m uz sterilnu tehniku rada u erlemajer sa 100 cm3 hranjive podloge. Isti postupak je ponovljen i sa drugom epruvetom. Dobijen inokulum je termostailan pri 30 C kroz 24 h. Tako pripremljen inokulum (200 cm3) koriten je za uzgoj pekarskog kvasca u reaktoru.

Uzgoj pekarskog kvasca u kotlastom bioreaktoru Pre sterilizacije bioreaktora provedi se badarenje pH elektrode sa komercijalnim puferima na dve take (pH 4 i pH 7). Bioreaktor se sterilie vodeno m parom temperature 121 C, pri prit isku od 1,5 bar tokom 30 minuta. Nakon sterilizacije u bioreaktor se sterilno doda 0,8 dm3 hranjive podloge koja je termostabilana na 30 C. Zat im se provodi badarenje kiseonikove elektrode na dve take pomou azota i vazduha. Proputanjem azota kroz destiliranu vodu u bioreaktoru se odredi nulta taka koncentracije kiseonika, a proputanjem vazduha se odredi druga taka u kojo j je koncentracija otopljenog kiseonika jednaka koncentraciji zasienja za atmosferski pritisak i temperaturu Trenutak poetka reakcije aproksimira se sterilnim dodavanjem 200 cm3 inokuluma. Istovremeno se zapone akvizicija podataka o koncentraciji otopljenog kiseonika na merau. Uzgoj pekarskog kvasca provodi se na temperaturi 30 C i pH 5 koji se odrava dodatkom rastopa NaOH ili HCl koncentracije 5 mol/dm-3. Koncentracija otopljenog kiseonika u reakcijsko m mediju regulira se menjanjem broja obrtaja mealice. Uzorak za analizu, zapremina 15 cm3, uzima se sterilno svakih sat vremena.

4 8

Page

48

4 9

Page

http://dalspace.library.dal.ca/bitstream/handle/10222/13046/MacIntosh,%20Andrew,%20MASc, %20August%202010.pdf?sequence=1

49

Diagram of Microferm Fermentor reactor vessel.