TÌM HIỂU VỀ ENZYME LIPASE

I. Tổng quan về Lipase:

Lipase còn có tên gọi khác là tryaciglycerol lipase.
Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu các liên kết ester.
Là enzyme tan trong nước, xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol không tan
trong nước tạo thành các glyceryl và các acid béo tương ứng nhờ hoạt động của nó trên
bề mặt phân pha dầu – nước.
Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α-este chứ không cắt
cùng một lúc 3 liên kết. Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với các enzyme khác.
Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo. Tại bề mặt phân cách giữa
pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất.
1. Cấu trúc enzyme lipase
Tâm hoạt động của lipase là bộ 3 : serine , Histidine và glutamate.
Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được
hoạt hóa .

1
2. Cơ chế sinh tổng hợp lipase .
Enzyme lipase được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau khi
dịch mã. Tất cả các quá trình thực hiện bên trong tế bào chất của vi sinh vật.
Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra bên trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử
mARN, những phân tử này rất dễ bị thủy phân trong môi trường tế bào chất. Vì vậy số
lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm đi đáng kể.
Tiếp theo quá trình dịch mã sẽ dụng thông tin mã hóa trong mRNA để tạo thành mạch
protein có thứ tự acid amin chính xác.
Khi polipeptide enzyme đã được tổng hợp khá nhiều thì những polipeptide ở gần nhau
sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho khối enzyme trở nên không
tan. Điều này làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học.
Hoạt tính của enzyme còn phục thuộc vào cofactor là những ion kim loại. Sự cung cấp
không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme. Vì vậy
phải đảm bảo nồng độ bão hòa của các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các
ion đó trong tế bào chất. Kết thúc quá trình khi enzyme ngoại bào được vận chuyển
qua màng membrane.
3. Phân loại enzyme .

2
Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau: lipase từ thực vật , từ động vật và từ
VSV đặt biệt là từ VK và nấm, đã có một vài lipase thu nhận từ VSV có giá trị thương
mại.
Nguồn lipase từ động vật là quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn.
Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và khó chịu như
trypsine. Bên cạnh đó , nguồn lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật
sang người nên hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ VSV đang đựa ưa chuộng do đặc
tính đa dạng, dễ tách chiết và nguyên liệu vô hạn.
II. Sản xuất Lipase:
1. Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV:
Chọn chủng vi sinh vật nuôi cấy trong 2 môi trường (môi trường đã tiệt trùng): môi
trường lỏng và môi trường bán rắn.
- Trong môi trường lỏng: Thực hiện quá trình lên men (1-5 ngày, nhiệt độ 25-40
độ), sau đó thêm chất bảo quản, chất trợ lọc vào, ly tâm (4000v/15p).
- Trong môi trường bán rắn: thực hiện quá trình lên men (1-7 ngày, nhiệt độ 25-
45 độ), đưa ra khỏi phòng ủ. Tiếp tách chiết bằng nước chứa chất bảo quản rồi
lọc loại cặn bã.
- Song song 2 môi trường thì ta thu được enzyme đã tách chiết trong nước, chia
dịch ra 3 sau đó bổ sung ba chất khác nhau vào từ ống. Ống 1 bổ sung chất bảo
quản lắng đều enzyme từ dạng lỏng chuẩn sang dạng rắn. Ống 2 bổ sung chất
trợ tủa, ly tâm. Ống 3 cô đặc chân không enzyme dạng lỏng đậm đặc, enzyme
dạng rắn tiếp tục nghiền chuyển sang dạng bột.

3
 2. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme từ nguồn động vật, thực vật:
Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Dịch tuỵ
tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, và một số E khác.
Ví dụ: Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đông sữa trong sản xuất fomat.
Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan
dự trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hoá chất ấy.

4
Ví dụ: Hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu nành có nhiều E urease, papain
thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép
của thân và lá cây Ficus…
Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật thì không thể sản xuất chế phẩm E với
quy công nghiệp bởi các nhược điểm:
- Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài
- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được.
- Đây là nguồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm không thể dùng để sản xuất sản
phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực.

5
/* Lưu ý: Các nguyên liệu động vật, thực vật thường có mặt những chất có màu làm
ảnh hưởng đến việc làm sạch và xác định hoạt lực của E, nên ta thêm vào chất khử để
loại màu. Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, hoặc bổ
sung các tác nhân gây kết tủa protein/E để loại một số chất không mong muốn, sau đó
hoà tan E trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp. Protein vì protein không
còn khả năng tương.
3. Quy trình sản xuất lipase ngoại bào từ Cadida sugose:
Nấm sợi tiền xử lý với HCl 2%. Lên men. Lọc hoặc ly tâm thu dịch. Dịch thu được kết
tủa với sodium sulfat .Thẩm tích tách muối. Lọc gel cô đặc, tinh sạch enzyme, sợi nấm
chất nền (sấy 60 °C kích thước hạt mịn). Bảo quản trong điều kiện chống ẩm Cadida
rugosa PDA nghiêng Erlen 250ml. Thu bào tử nấm.
Lọc: Thêm nước cất tỷ lệ 1:10 so với thể tích canh trườg, lắc 120rpm trong 30 phút,
sau đó lọc bằng màng thích hợp -Ly tâm 10000rpm/15p, ở 4 °C. Đệm bằng Tris-HCl
0.2M (pH=8). Đệm phosphate pH =6.5a

6
 4. Tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký ái lực:
Do nguồn thu lipase từ động vật kém bền nhiệt, lại có mùi hôi, sản xuất mất nhiều
công sức và tốn kém. Hơn nữa, việc lây nhiễm virus động vật là mối lo ngại hàng đầu.
Nên việc chủ động nuôi cấy và tách chiết lipase từ VSV ngày càng chiếm ưu thế.
Người ta sử dụng sắc ký ái lực cho độ tinh sạch cao nhất, nhưng phương pháp này tốn
kém, do cột đắt tiền, lại không bền. Do nguyên nhân cột hoạt động trên nguyên tắc sự
bắt cặp giữa enzyme và cơ chất, tạo nên phức hợp E-S. Nhưng bản thân cơ chất của
enzyme được nhồi vào cột là protein, đó là nguyên nhân mà cơ chất dễ bị biến tính và
mất khả năng kết hợp với enzyme.

7
III. Phương pháp cố định Lipase:
Tuy lipase có khả năng xúc tác nhiều phản ứng có giá trị trong đời sống nhưng việc
ứng dụng còn hạn chế bởi chi phí cao. Có thể khắc phục với phương pháp cố định
enzyme với mục đích thu hồi và sử dụng nhiều lần, không tốn chi phí cho quá trình bỏ
enzyme sau khi thu hồi sản phẩm. Có 3 phương pháp được sử dụng.
1. Phương pháp vật lý:
Đây là phương pháp đơn giản nhất liên quan đến sự tương tác bề mặt thuận nghịch
giữa enzyme và chất mang. Lực liên kết chủ yếu là các tương tác kỵ nước.
Phương pháp này có ưu điểm : là chi phí thấp, quá trình thực hiện đơn giản và nhanh
chóng, không có sự biến đổi về mặt hoá học enzyme cũng như chất mang, đây là sự cố
định thuận nghịch.
Nhược điểm: sự phân giải enzyme ra khỏi chất mang, sự cản trở về mặt không gian
của chất mang và sự hình thành các liên kết không đặc hiệu.
Các vật liệu vô cơ như than hoạt tính, silica… và vật liệu hữu cơ như polyme tự nhiên
hoạt tổng hợp có thể được dùng làm chất mang cố định enzyme lipase.
Ví dụ: Dẫn xuất enzyme lipase từ C.antarcrira B cố định trên Octadecyl -sepabead giữ
được 100% hoạt tính sau khi ủ 200h/50 độ C/ pH =7. Lipase được hấp phụ trên chất
mang kỵ nước rất ổn định với nhiệt độ và sự vô hoạt của dung môi hữu cơ. Mặc dù
phương pháp này đơn giản nhưng dẫn xuất của enzyme này có tính ổn định nhiệt hơn
phương pháp khác.
2. Phương pháp cộng hoá trị :
Phương pháp này dựa trên liên kết cộng hoá trị giữa các chất mang và 1 vài nhóm chức
năng của amino acid trên bề mặt của enzyme. Chất mang thường được hoạt hoá trước
bằng các hợp chất đặc biệt làm cho các nhóm chức năng trở nên có ái lực điện tử
mạnh,các nhóm này sau đó phản ứng với các nhóm ái nhân mạnh của enzyme.
Ưu điểm của phương pháp này là tạo được các liên kết bền vững và sự cố định đạt
được sự ổn định cao.
Nhược điểm của phương pháp này là chi phí cao,hiệu suất cố định thấp. Bên cạnh
đó,cấu trúc và hoạt tính của enzyme bị ảnh hưởng bởi các liên kết cộng hoá trị.
Lipase được cố định thành công trên nhiều chất mang khác nhau nhưng thành công
nhất là trên chitosan, agarose và các chất polypeptide kỵ nước sử dụng carbodiimide
làm tác nhân hoạt hoá nhóm cacboxyl của chất mang khi cố định enzyme lipase từ
C.rugosa. Ưu điểm của cacbodiimide là khả năng hoạt hoá cao và độc tính thấp đối với
enzyme.
3. Phương pháp nhốt/ bao gói:
Để cố định enzyme bằng phương pháp bao nhốt có thể dùng các polyme khác nhau ở
dạng hạt như agarose,alginate và chitosan. Agarose có độ trương không mong muốn
nên enzyme dễ bị rửa trôi trong môi trường phản ứng và polyme không được sử dụng.

8
Alginate và chitosan, chitosan được sử dụng phổ biến hơn do có hoạt tính cao hơn.
Nồng độ của alginate có ảnh hưởng đến tỉ lệ enzyme cố định khi tăng nồng độ alginate
thì hoạt độ riêng của enzyme sẽ giảm.

IV. Phương pháp xác định hoạt tính:

Hoạt tính enzyme lipase được xác định dựa trên lượng acid béo tự do được giải phóng.
Đối với lipase, 1 đơn vị hoạt độ U là lượng enzyme cần thiết để xúc tác tạo thành
1µmol acid béo trong 1 phút ở điều kiện xác định. Một số phương pháp thông dụng
như:
- PP chuẩn độ (titrimetry)-pH-stat
- PP quang phổ (Spectroscopy)
- PP sắc ký (Chromatography)
- PP sức căng bề mặt (Interfacial tensionmetry)
- PP hóa học miễn dịch (Immuno-chemistry)
1. Đối với cơ chất dạng lỏng
Dầu olive đã nhũ hóa bị phản ứng thủy phân do xúc tác của lipase tạo thành các acid
béo (ở điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian cụ thể cho các thử nghiệm xác định yếu tố cụ
thể được đo trực tiếp) sau khi bất hoạt enzyme với ethanol 99,5° bằng phương pháp
chuẩn độ acid-bazơ, sử dụng NaOH 0,1 N; chất chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Khi
đó, hoạt tính (HT) và hoạt tính riêng (HTR) của lipase được tính theo công thức:
HT = [(a-b)*1000*0,1] (U/mL)
Trong đó; a: VNaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu có enzyme (mL); b: VNaOH 0,1 N chuẩn
độ ở mẫu trắng (mL).
HTR = ∑ ĐVHT/P
Trong đó: ∑ ĐVHT: Tổng số đợn vị hoạt tính enzyme/g; P: Hàm lượng protein (mg/g)

2. Đối với dạng khô:

Hoạt tính xúc tác của lypase là số đơn vị hoạt độ có trong 1g chất khô môi trường nuôi
cấy vi sinh vật để thu nhậ enzyme. Môi trường sử dụng là bã đậu nành đã sấy khô, nên
công thức hoạt tính lypase được biễu diễn như sau:
Hoạt tính Lypase (IU/g) = (ΔV x N x 1000 x v1) / (v2 x t x m)
Trong đó:
ΔV : số hiệu mL dung dịch NaOH chuẩn độ mẫu so với mẫu trắng
N : nồng độ đương lượng dung dịch NaOH 0,1N trong chuẩn độ
1000 : hệ số quy đổi đơn vị
v1 : số mL nước cất dùng để trích ly
v2 : số mL dịch enzyme thô đem phản ứng
t : thời gian phản ứng tính bằng phút
m : số gam môi trường bã đậu nành đem nuôi cấy

9
 V. Ứng dụng Lipase trong đời sống và sản xuất:
Enzyme Lipase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: Thực phẩm,
Chất tẩy rửa, Nước giải khát, Bao bì thực phẩm…
a. Công nghiệp thực phẩm:
Bơ cocoa chứa palmitic và strearic acid, khi tan chảy trong miệng sinh ra cảm giác mát
lạnh thích thú như chocolate. Công nghệ dựa vào enzyme liase liên quan đến phản ứng
thủy phân và tổng hợp một vài loại mỡ kém chất lượng thành chất thay thế. Quá trình
sử dụng từ Rhizomucor miehe cố định cho phản ứng chuyển ester thay thế palmitic
trong dầu cọ vs strearic acid.
Một vài loài vi khuẩn sản sinh ra ester tạo mùi ứng dụng trong công nghiệp phô mai
như sản phẩm mùi do lipase của vi khuẩn Staphylococcus warneri và Staphylococcus
xylosus.
Quy trình ứng dụng của Lipase trong sản xuất phô mai

Việc bổ sung Lipase cá tác dụng tăng vị béo và hương vị đặc trưng của phô mai.

10
 b. Ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa:
Lipase đã được thêm vào trong các chất tẩy rửa cùng với protease và cellulase. Đó là
một giải pháp hữu ích trong công nghiệp giặt ủi và công nghiệp chất tẩy rửa, làm sạch
được thương mại hóa. Việc loại bỏ vết dầu mỡ bằng lipase có triển vọng rất lớn trong
công nghiệp chất tẩy rửa. Trong điều kiện bình thường của quá trình giặt tẩy, lipase
hoạt động khá tốt. Lipase bổ sung vào chất tẩy rửa phải có một số đặc tính: chịu nhiệt,
chịu kiềm (pH trong khoảng 7,5 đến 11) và chịu được các tác động của các chất cấu
tạo nên chất tẩy rửa.

11
 c. Ứng dụng của Lipase trong hóa sinh dược và y tế:
Lipase được sử dụng để xúc tác ester hóa tinh bột sắn làm chất mang dược chất và làm
vật liệu trong điều trị gãy xương.
Lipase là một chất hoạt hóa yếu tố phá hủy tế bào ung thư, vì vậy có thể sử dụng trong
điều trị ung thư. Lipase Cadida rugose đang được dùng để tổng hợp thuốc hạ
Cholesteron huyết thanh. Lipase còn sử dụng là chất kích hoạt nhân tố ngoại tử khối u
và được dùng trong một số liệu pháp chữa trị các khối u ác tính.

12