______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI KATALAZE

SPEKTROFOTOMETRIJSKOM METODOM (CAT100)

1. TEORETSKI DIO

Katalaza je široko rasprostanjen enzim i sreće se kod prokariaota i eukariota. Predstavlja

dio antioksidativne zaštite organizma. Katalaza razlaže toksični vodikperoksid na
molekul kisika i vodu. Katalaza je tetramer sastavljen od četiri polipeptidna lanca, svaki
sadrži preko 500 aminokiselina. Sadrži četiri porfirinska hema, grupe koje omogućavaju
enzimu da reaguje sa vodikperoksidom.

Zastupljen je gotovo kod svih organizama, počev od mikroorganizama (aerobnih i

anaerobnih), biljaka, životinja do čovjeka. Kod čovjeka je široko zastupljenja posebno u
ćelijama jetre u peroksizomima i crvenim krvnim zrncima. Optimalni pH za ljudsku
katalazu je oko 7, dok kod ostalih organizama, u zavisnosti od vrste pH se kreće između
4-11. Ljudska katalaza djeluje na 37°C, dok kod nekih jednoćelijskih organizama
optimalna temperatura djelovanja je 90°C. Osnovna uloga ovog enzima je razgradnja
vodikperoksida.

Katalaza je veoma aktivan enzim, jedna molekula katalaze konvertuje million molekula
vodikperoksida u vodu i kisik svake sekunde. Iako kompletan mehanizam reakcije nije
poznan, smatra se da reakcija teče u dva koraka:

H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E(.+)

H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) → H 2O + Fe(III)-E + O2
Ovdje Fe ()-E predstavlja centar željeza u grupi hema na koji je vezan enzim. Fe(IV)-E(.+) je
mezomerna forma Fe(V)-E, što znači da željezo nije kompletno oksidirano to +V, ali dobija tzv.
“podržavajući elektron” iz liganda hema. Ovaj hem je stoga označen kao radikalski katjon (·+).
Vodikperoksid ulazi u aktivni centar, u interakciju sa aminokiselinama Asn 147 (asparagin na
poziciji 147) i His74, što dovodi do toga se proton (hidrogen jon) prebacije između atoma kisika.
Slobodni kisik koordinira, oslobađajući novonastalu molekulu vode i Fe(IV)=O. Fe(IV)=O
reaguje sa slijedećim vodikperoksidom formirajući Fe(III)-E i proizvodeći vodu i kisik.
Reaktivnost željeznog centra može biti poboljšana pomoću prisustva fenolatnog liganda na
______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

Tyr357, koji može učestovovari u oksidaciji Fe(III) do Fe(IV). Ova reakcija se može poboljšati i
pomoću interakacije His74 i Asn174 sa intermedijerima reakcije. Brzina reakcije se može
determinirati pomoću Michaelis-Mentenove konstante.

Katalaza može katalizirati i oksidaciju, pomoću vodikperoksida, različitih metabolite i

toksina, kao što su formaldehid, mravlja kiselina, fenoli, acetilaldehid i alkoholi. Dešava
se slijedeća reakcija, čiji mehanizam je i dalje nepoznat.

H2O2 + H2R → 2H 2O + R

Joni teških metala (kao što su bakarni joni) mogu da se ponašaju kao nekompeticijski
inhibitori katalaze. Otrovi, kao što su cijanidi su kompeticijski inhibitori katalaze, snažno
se vezuju za hem katalaze i zaustavljaju enzimsku reakciju.
Kod čovjeka i drugi enzimi mogu da razgrade vodikperoksid. Glutationperoksidaza je u
fiziološkim uslovima (mala koncentracija vodikperoksida) je čak aktivnija od katalaze.
Kada koncentracija vodikperoksida poraste uključuje se katalaza.
Vodikperoksid zajedno sa superoksidnim anjonom (O2-), hidroksilnim radikalom (OH·) i
singletnim kisikom spada u slobodne radikale kisika. Vodikperoksid je štetni produkt
mnogih metaboličkih procesa, a da bi se spriječilo oštećenje ćelija i tkiva, mora se desiti
brza konverzija u manje štetne materije. Stiga katalaza pomaže ćeliji da je ubrza
dekompozicija vodikperoksida u manje reaktivan gasoviti kisik i molekulu vode. Biološki
značaj nije uvijek opravdan, jer kod nekih vrsta miševa genetički nedostaje katalaza, što
ukazuje da nekim organizmima ovaj eznim nije neophodan. Sa druge strane, nedostatak
katalaze može povećati vjerovatnost razvoja diabetesa tipa 2. Katalaza se koristi u
industriji hrane sa uklanjanja vodikperokdisa iz mlijeka prije proizvodnje sira. Može se
koristiti i u tekstilnoj industiriji za uklanjanje vodikperoksida sa materijala.

Katalaza test je jedan od tri glavna testa koji se koristi u mikrobiologiji za identifikaciju
bakterija. Prisustvo enzima katalaze se detektuje upotrebom vodikperoksida. Bakterije
koje su katalaza-pozitivne dodavanjem vodikperoksida „oslobađaju” kisik.

2. EKSPERIMENTALNI DIO

Reagensi
 Pufer za analizu 10x (A.B.10x); 100 ml; šifra proizvoda: A 9725; Natrijum-
fosfatni puffer, 500 mM, pH 7,0
 Hromogeni reagens; 1 vial; šifra proizvoda: C 5237
______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

 Otopina za prekid reakcije;100 ml; šifra proizvoda: S 5691; 15 mM natrijum-azid

u vodi
 Pozitivna kontrola katalaze; 0,25 ml; šifra proizvoda: C 8362 iz goveđe jetre (EC
1.11.16. Kristalna suspenzija u vodi koja sadrži 0,1 % timol, 30-50 mg proteina
po ml (Biuret), 3-10 x 106 jedinica po ml (kolorimetrijska analiza)
 3% (w/w) otopina hidrogen-peroksida; 10 ml; šifra proizvoda: H 6520
 Peroksidaza, 5 mg; šifra proizvoda: P 6782; Izolirana iz hrena (EC 1.11.1.7), bez
prisustva soli; 800-1200 jedinica po mg otopine mjereno sa ABTS kao supstratom
pri 25 °C, pri pH 5,0
 Pufer za razrijeđivanje enzima (EDB); šifra proizvoda E 5779; 50 mm natrijum-
fosfatni pufer, pH 7,0 koji sadrži 0,1 % TRITON X-100

Upotrijebiti vodu HPLC čistoće (0,055 Scm-1) vodu u svim slučajevima. Upute o
pripremi nude reagense dovoljne za 25 kolorimetrijskih analiza plus kalibracionu krivu ili
20 UV analiza.
Otopine supstrata i pufera treba čuvati na sobnoj temperaturi, a otopine enzima na 4 °C.

POSTUPAK

1x Pufer za analizu (A.B. 1x):

Razblažiti sa vodom 2 ml pufera A.B. 10x na 20 ml (10 puta). Pufer A.B. 1x je 50 mM
natrijum-fosfatni pufer, pH 7,0. Čuvati na sobnoj temperaturi.
Otopina peroksidaze:
Odvagati 1 mg čvrste peroksidaze i otopiti u 1,45 ml A.B. 1x. Otopina peroksidaze može
se čuvati na 4 °C do dvije sedmice.
Reagens za razvijanje boje:
150 mM natrijum -fosfatni pufer, pH 7,0, sadrži 0,25 mM 4-aminoantipirin i 2 mM 3,5-
dihlor-2-hidroksibenzensulfonsku kiselinu.
Pripremiti 200 ml hromogene otopine. Pomiješati 60 ml pufera A.B. 10x sa 140 ml vode
u čaši od 250 ml. Dodati 10 ml ovako razrijeđenog pufera u originalnu posudicu
hromogenog reagensa (kat.br. C 5237) i miješati dok se potpuno ne otopi. Prebaciti
hromogenu otopinu u čašu sa puferom i dobro promiješati. Podijeliti na odgovarajuće
alikvote (po 30 ml) i čuvati na -20 °C. Otopina je stabilna 12 mjeseci. Izbjegavati
višestruko zamrzavanje-topljenje. Prije upotrebe pripremiti reagens za razvijanje boje
dodavanjem 30 µL otopine peroksidaze na 30 ml hromogene otopine. Reagens za
razvijanje boje može se čuvati na 4 °C tri dana, ako je potrebno.
Priprema standardne otopine katalaze:
Katalaza je kristalna suspenzija u vodi, a kristali se talože na dnu posudice. Promiješati
energično posudicu sa katalazom da se postigne homogena suspenzija i odmah ukloniti
20 µL suspenzije (preporučuje se pipetiranje mikro-pipetom nekoliko puta – pipette up
and down - prije uklanjanja suspenzije). Razblažiti seriju od po 20 µL suspenzije
enzima 10000 puta (primjer ovakvog razrijeđivanja je razrijeđivanje 20 µL suspenzije
enzima sa puferom za razrijeđivanje enzima (EDB) na 400 µL (1:20), zatim
razrijeđivanje 20 µL prvobitno razrijeđene otopine 400 µL (1:400) i na kraju,
razrijeđivanje 20 µL druge otopine na 500 µL 1:10 000). Za reakciju koristiti između 2-5
µL krajnje razrijeđene otopine. Dobro promiješati prije dodavanja u reakcionu smjesu.
______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

Pripremiti kontrolu katalaze svježu svaki dan. Metoda je linearna u području od 0,25-3
jedinice po reakcionoj smjesi, u zavisnosti od trajanja reakcije.
Otopina supstrata za kolorimetrijsku analizu (200 mM H2O2):
Koncentracija od 3 % H2O2 (H 6520) je u granicama od 3-4 %. Prema tome, bitno je
spektrofotometrijski odrediti tačnu koncentraciju i korigovati je na 200 mM prije
upotrebe otopine supstrata za kolorimetrijsku analizu u metodi. Razrijediti 200 µL 3 %-
ne otopine H2O2 (H 6520) na 1 ml pomoću A.B. 1x pufera. U cilju određivanja tačne
koncentracije otopine supstrata, razrijediti 50 l gornje otopine na 1,00 ml (20 x) sa AB
1x puferom. Očekivana koncentracija je u granicama od 10-15 mM. Odrediti stvarnu
koncentraciju preko UV apsorbanse, mjerenjem apsorbanse na 240 nm (za slijepu probu
koristiti A.B. 1x pufer). Izračunati stvarnu koncentraciju H2O2 pomoću Beer-ovog zakona
(εmM=0,0436):
[H2O2](mM) = A240/0,0436
Nivelirati konačnu koncentraciju otopine supstrata za kolorimetrijsku analizu na tačno
200 mM sa A.B. 1x puferom. Standardizirana otopina supstrata za kolorimetrijsku
analizu može se čuvati na 4 °C 6 dana. Konačna koncentracija H2O2 u ispitivanoj smjesi
je 50 mM.
10 mM H2O2 otopina:
Ova otopina je za dobijanje kalibracionog pravca apsorbanse crvene kinon-iminske boje
prema koncentraciji H2O2. Razblažiti 200 µL standardizirane otopine supstrata za
kolorimetrijsku analizu (200 mM H2O2) na 4 ml sa A.B. 1x puferom. Ova otopina može
se čuvati na 4 °C 6 dana.
Otopina supstrata za UV analizu (20 mM H2O2):
Priprema volumena dovoljnog za 20 direktnih UV analiza. Razblažiti 200 µL 3 %-og
H2O2 (H 6520) na 10 ml sa A.B. 1x puferom. Odrediti stvarnu koncentraciju
spektrofotometrijski kao u prethodno opisanom postupku. Nivelirati konačnu
koncentraciju otopine supstrata za UV analizu na tačno 20 mM sa A.B. 1x puferom.
Standardizirana otopina supstrata za UV analizu može se čuvati na 4 °C 6 dana. Konačna
koncentracija H2O2 u ispitivanoj smjesi je 10 mM.

Ova procedura omogućava reagense dovoljno za 100 testova.

Priprema uzorka:
Kada su uzorci pripremani razgradnjom deterdžentom ili hipotoničnim puferom, za
razblaživanje uzoraka može se koristiti A.B. 1x pufer. Ako su uzorci pripremljeni u
izotoničnom puferu koji održava peroksizome, razblažiti uzorak sa EDB puferom koji
sadrži TRITON X-100. Ako je koncentracija proteina u uzorcima veoma niska (manja od
0,025 mg/ml), albumin goveđeg seruma (A 8022) se može dodati puferu u koncentraciji
od 0,5 mg/ml za stabilizaciju enzima.
Za biološke uzorke količina enzima (razblaženje i volumen) po reakciji moraju se
odrediti. U tabeli 1 su dati primjeri razblaženja i volumena za različite primjere uzorke,
koji se mogu koristiti kao smjernice. Iako se većina reakcija može izvesti za 1-5 minuta,
reakciono vrijeme se može znatno produžiti kod analiza za niske aktivnosti katalaze.
Prilikom analize ekstrakata tkiva količina katalaze će ovisiti o tome iz kojeg organa tkivo
potiče. Najviša aktivnost je u jetri i bubrezima, a najmanja u vezivnom tkivu. Ekstrakti
stanica iz kultura tkiva se često analiziraju bez razblaživanja. Produkti razgradnje krvi
 ______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

pokazuju relativno veliki iznos aktivnosti, pa se prema tome trebaju odgovarajuće

razblažiti.

Tabela 1. Razrijeđenja uzoraka katalaze iz različitih izvora

Razrijeđenje
Volumen Područje od
otopine na
dodan na Reakciono ΔA520 (slijepa
TKIVO zadanu
reakcionu vrijeme (min) proba-uzorak) po
vrijednost
smjesu reakciji
proteina
1,20-1,32 (počevši
Slijepa proba - - - od A520 )
Lizat čovječijih crvenih
0,2 mg/ml 2-6 µL 2 min 0,21-0,71
krvnih zrnaca
Lizat leukocita 2,0 mg/ml 2-4 µL 3 min 0,28-0,64
Lizat hepG2 2,0 mg/ml 2-4 µL 3 min 0,21-0,43
Lizat jetre pacova 0,3 mg/ml 5-10 µL 1 min 0,36-0,78
Lizat mozga pacova 0,7 mg/ml 10-20 µL 3 min 0,014-0,028
Lizat slezene pacova 0,3 mg/ml 5-10 µL 3 min 0,11-0,21
Lizat bubrega pacova 0,3 mg/ml 5-10 µL 3 min 0,28-0,57
Standard katalaze 10,000-puta 2-4 µL 1 min 0,36-0,71

Ako nema raspoloživih informacija o izvoru preporučljivo je da se napravi nekoliko

razblaženja (1, 10, 20 i 50 puta razrijeđenija otopina) i pokrenuti reakciju od jedne minute
sa 10 µL svakog razrijeđenja. Preporučene razrijeđene otopine trebale bi smanjiti
koncentraciju hidrogen-peroksida u reakciji za 30 – 50 % za 1-5 minuta.

Čuvanje/stabilnost
Ovaj proizvod dostavlja se na ledu i preporučuje se čuvanje na 2-8 °C. Kada se čuva
zatvoren, komponente su stabilne 12 mjeseci.

Procedura za kolorimetrijsku i UV analizu

Katalaza ima mogućnost da razgradi hidrogen-peroksid preko dva različita reakciona
puta. U prvom, poznatim kao „katalazni“ put, dvije molekule hidrogen-peroksida se
pretvaraju u vodu i oksigen (katalazna aktivnost):

protein-Fe3+ + H2O2 protein-Fe3+ -OOH + H2O

(Primarni kompleks)

protein-Fe3+ -OOH + H2O2 protein- Fe3+ -OH + H2O + O2

______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

Ukupna reakcija daje: 2 H2O2 2 H2O + O2

Primarni kompleks se može također razložiti po drugom reakcionom putu (peroksidazna
razgradnja):

protein-Fe3+ -OOH + AH2 protein- Fe3+ -OH + H2O + A

gdje je AH2 interni ili eksterni donor vodika. Alkoholi male molekulske mase se mogu
koristiti kao elektron donori. Katalazni put je predominantan kada je koncentracija
hidrogen-peroksida veća od 0,1 mM, a peroksidazni put je dominantan kada je
koncentracija manja od 0,1 mM ili kad je supstrat alkil-peroksid.

Procedura kolorimetrijske analize

Ovaj metod analize se zasniva na mjerenju hidrogen-peroksidnog supstrata zaostalog
nakon djelovanja katalaze. Najprije, katalaza pretvara hidrogen-peroksid u vodu i kisik
(katalitički put), a zatim ova enzimatska reakcija se zaustavlja sa natrijum-azidom.
Alikvot reakcione smjese se tada analizira za određivanje preostale količine hidrogen-
peroksida kolorimetrijskom metodom. U kolorimetrijskoj metodi se koristi supstituirani
fenol (3,5-dihloro-2-hidroksibenzen-sulfonska kiselina) koji se oksidativno spaja na 4-
aminoantipirin u prisustvu hidrogen-peroksida i peroksidaze iz hrena (HRP) dajući
crvenu kinoniminsku boju (N-(4-antipiril)-3-hloro-5-sulfonat-p-benzokinon-monoimin)
koji apsorbira na 520 nm. Aktivnost katalaze se mjeri pri razblaženoj koncentraciji
supstrata (H2O2), pošto nije izvodivo zasititi enzim supstratom pri koncentraciji većoj od
1 M. Također, preko 100 mM H2O2 dolazi do brze deaktivacije katalaze supstratom.
Koncentracija H2O2 koja se koristi u ovoj analizi (50 mM) omogućava mjerljiv signal, a
da ne izaziva inaktivaciju enzima.

Priprema standardne krive

1. Apsorbansa crvene kinoniminske boje prema količini H2O2 (0,0125-0,075 µmol).
Pripremiti seriju standardnih otopina uzimanjem 0, 125, 250, 500 i 750 µL otopine 10
mM H2O2 u kivetama za mikrocentrifugu i dodavanjem A.B. 1x pufera do konačnog
volumena od 1 mL. Miješati okretanjem.

Tabela 2. Razrijeđenja za pripremu kalibracionog pravca hidrogen-peroksida

A.B. 1x
Volumen 10 mM H2O2 H2O2 u standardnim H2O2 u reakcionoj
pufer
(µL) otopinama (µmol) smjesi (µmol)
(µL)
0 1000 0 0
125 875 1,25 0,0125
250 750 2,5 0,0250
500 500 5,0 0,0500
750 250 7,5 0,0750
______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

Napomena: Koncentracije H2O2 prikazane u tabeli 2 zasnovane su na tačno 10 mM

koncentraciji početne otopine. Vrijednosti trebaju biti korigirane na stvarnu
koncentraciju H2O2 određenu spektrofotometrijski (vidjeti pripremu 10 mM H2O2).

2. Prebaciti alikvot od 10 µL od svake otopine u drugu kivetu i dodati 1 mL reagensa za

razvijanje boje. Sačekati 15 minuta, a zatim očitati apsorbansu na 520 nm.
Napomena: Serije standardnih otopina H2O2 trebaju biti svježe pripremljene svaki dan.
3. Nacrtati standardnu krivu apsorbanse na 520 nm prema konačnoj količini H2O2 u
reakcionoj smjesi.

Reakcija kolorimetrijske analize

Reakcija za analizu izvodi se na sobnoj temperaturi (oko 25 °C). Omogućiti da A.B. 1x
pufer, otopina supstrata za kolorimetrijsku analizu (200 mM H2O2) i reagens za razvijanje
boje dostignu sobnu temperaturu.

Enzimatska reakcija katalaze

1. Pripremiti uzorke kao što je predloženo u odjeljku priprema uzorka i dodati
odgovarajući volumen (x µL) u mikrocentrifugalnu kivetu;
2. Dodati (75-x µL) A.B. 1x pufera u mikrocentrifugalnu kivetu;
3. Početi reakciju dodatkom 25 µL otopine supstrata za kolorimetrijsku analizu;
4. Miješati okretanjem i inkubirati 1-5 minuta;
5. Dodati 900 µL otopine za zaustavljanje reakcije, dobro zatvoriti i okrenuti kivetu;

Tabela 3. Reakciona shema kolorimetrijske enzimatske reakcije katalaze

Otopina 200 mM
Volumen uzorka A.B. 1x pufer
H2O2
Slijepa proba 0 µL 75 µL 25 µL

Uzorak x µL 75-x µL 25 µL

Kolorimetrijska reakcija:
6. Uzeti 10 µL alikvota iz enzimatske reakcione smjese katalaze i prebaciti u drugu
kivetu za mikrocentrifugu. Dodati 1 mL reagensa za razvijanje boje. Miješati okretanjem;
Napomena: Izvesti ovaj korak u roku od 15 minuta od zaustavljanja enzimske reakcije.
7. Čekati najmanje 15 minuta na sobnoj temperaturi zbog razvijanja boje, a zatim mjeriti
apsorbansu na 520 nm.

Proračuni
1. Odrediti količinu H2O2 (µmol) koja ostaje u kolorimetrijskoj reakcionoj smjesi
upotrebom H2O2 standardne krive. Npr. OD520 od 1,4 je ekvivalentna sa 0,082 µmol
H2O2.

A520(slijepa roba)= µmol H2O2 u slijepoj probi

______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

A520(uzorak)= µmol H2O2 u slijepoj probi

Δµmol(H2O2)= µmol H2O2 (slijepa proba)- µmol H2O2 (uzorak)

Δµmol (H2O2) je razlika količine H2O2 dodane u kolorimetrijskoj reakciji između slijepe
probe i datog uzorka.

2. Vrijednost iz prethodnog proračuna može se koristiti da se odredi aktivnost katalaze:

Aktivnost (µmol/min/mL)=Δµmol (H2O2)*d*100 / V*t

Δµmol(H2O2) = razlika u količini H2O2 dodanoj u kolorimetrijskoj reakciji između slijepe

probe i datog uzorka
d = razblaženje originalnog uzorka za reakciju katalaze
t = vrijeme trajanja reakcije katalaze (minute)
V = volumen uzorka u reakciji katalaze (x ml = 0,00x mL)
100 = razblaženje alikvota reakcije katalaze u kolorimetrijskoj reakciji (10 µl iz 1 mL)

Procedura UV analize
Ovaj postupak se također može koristiti za izvođenje brze i direktne UV analize. UV
analiza je pogodna za uzorke katalaze koji su oslobođeni supstanci koje mogu interferirati
pri mjerenju u UV području od 240 nm (vidjeti tablicu 5). Interferirajuće supstance, kao
što su TRITON X-100 ili proteini, koji apsorbiraju u UV području, moraju biti prisutni u
koncentracijama dovoljno niskim da bi se mogla mjeriti apsorbansa na 240 nm.
Ova analiza omogućava spektrofotometrijsko praćenje opadanja apsorbanse hidrogen-
peroksida na 240 nm sa kinetičkim programom. Analiza se izvodi u kratkom
vremenskom periodu (30 sekundi), zbog činjenice da je koncentracija H2O2 (10 mM)
mnogo niža od KM (1,2 M) sistema. Analiza reakcije se izvodi na sobnoj temperaturi
(približno 25 °C). Program za kinetiku ima sljedeće parametre:
Početak mjerenja = nakon 3 sekunde
Interval = 5 sekundi
Očitanja = 7

Enzimatska reakcija katalaze (pogledati tabelu 3):

1. Pripremiti uzorak kao što je predloženo u odjeljku priprema uzorka, dodati
odgovarajući volumen (x µl) u kvarcnu kivetu;
2. Dodati (500-x) µL A.B. 1x pufera u kvarcnu kivetu i miješati okretanjem;
3. Početi reakciju dodatkom 0,5 mL otopine supstrata (20 mM H2O2) za UV analizu i
miješati okretanjem;
4. Pratiti opadanje A240 u roku od 30 sekundi pomoću programa za kinetiku.

Napomene: Početna A240 treba biti oko 0,500. Za slijepu probu koristiti pufer kojim je
razrijeđivan uzorak. Koncentracija TRITON X-100 u ispitivanom uzorku ne smije preći
udio od 0,02 %. Pouzdani detekcioni limit je 0,025 ΔA240/min., koji odgovara 0,575
µmol/min.
______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

Tabela 4. Reakciona shema UV enzimatske reakcije katalaze

Volumen uzorka A.B. 1x pufer 20 mM H2O2 otopina

Slijepa proba 0 500 µL 500 µL

Uzorak x µL 500-x µL 500 µL

Proračuni

jedinice/mL =

d = razblaženje originalnog uzorka za reakciju katalaze

V = volumen uzorka u reakciji katalaze, (x µL = 0,00x mL)

0,0436 = εmM za hidrogen peroksid

1 = volumen reakcione smjese u mL

Definicija jedinice: Jedna jedinica katalaze razlaže 1,0 mol hidrogen-peroksida na

oksigen i vodu u minuti, pri pH 7,0 na 25 °C i koncentraciji supstrata od 10 mM
hidrogen-peroksida.

Napomena: Aktivnost određena UV analizom je približno jedna trećina od mjerenja sa

kolorimetrijskom analizom. Razlog tome je razlika u koncentracijama supstrata (20 mM
kod UV analize prema 50 mM u kolorimetrijskoj analizi).

Dijagram kompatibilnosti
Različiti spojevi mogu interferirati u analizama. Budući da je krv jedan od izvora za
određivanje aktivnosti katalaze, antikoagulansi kao što su natrijum citrat, kalijum EDTA
ili heparin su ispitivani na njihov efekat na analizu. Također, endogeni spojevi kao što su
hemoglobin ili albumin imaju uticaja na analizu. Podrazumijeva se da je uzorak razblažen
prije analize, ali u tkivima sa niskim sadržajem katalaze ove komponente mogu
interferirati, zbog niskog faktora razblaženja. Uz to, može biti prednost u primjeni UV
analize ako interferirajuće supstance jako utiču na kolorimetrijsku analizu.
 ______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

Tabela 5. Efekti supstanci na kolorimetrijsku i UV analizu

Očekivana konc. u
Kolorimetrijska
Supstance UV analiza nerazrijeđenom
analiza
uzorku
20 % inhibicije pri 20 Kompatibilno do 100 29 µM u RBC*, 77
Askorbinska kiselina
µM µM µM u plazmi
Kompatibilno pri 50 Kompatibilno pri
Albumin, goveđi 35-50 mg/mL u krvi
mg/mL 1,5mg/mL
Kompatibilno pri 20 Kompatibilno pri 5
Natrijum citrat 10-14 mM u krvi
mM mg/mL
Kompatibilno pri 1
Trikalijum EDTA Kompatibilno pri 4 mM 3,4 mM u krvi
mM
Kompatibilno pri 0,8 Kompatibilno pri 1 120-180 mg/mL u
Hemoglobin
mg/mL mg/mL krvi
Kompatibilno pri 14 Kompatibilno na 20
Heparin 1 jedinica/mL u krvi
jedinica/mL jedinica/mL
Kompatibilno sa 50
Glukoza Kompatibilno sa 5 mM 17-44 mM u krvi
mM
Kompatibilno sa Nije normalno
TRITON x-100 Konmpatibilno sa 0,5%
0,02% prisutno

3. Rezultati

Za pripremu kalibracionog pravca A = f(jedinice katalaze) koristiti standard katalaze

1:10 000, (objašnjenje dato u dijelu Priprema standardne otopine katalaze). Izvesti
kolorimetrijsku reakciju sa 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 i 3,0 jedinice katalaze. A se dobije
kada se od apsorbanse slijepe probe – kolorimetrijska reakcija sa 200 mM H2O2 bez
prisustva katalaze (Ablank) oduzme apsorbansa standarda (Astandard), što odgovara
razgrađenom H2O2, odnosno aktivnosti katalaze. Kada se izmjeri Auzorka (Auzorka =
Ablank - Auzorka), iz jednačine kalibracionog pravca y = ax+b , gdje y odgovara Auzorka
izračuna se broj jedinica katalaze (x) i preračuna na masu tkiva ili proteina.

U tablicu upisati odgovarajuće podatke:

Jedinice A1 A2 Asr A (Ablank-

katalaze Asr)
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
______________________________________Bioanalitička hemija-laboratorijske vježbe

OVJERA VJEŽBE