Hromatografija

Klasifikacija Hromatografije
 Hromatografija na tankom sloju
(TLC)
• distance of spot from origin

• distance of solvent front from origin

d1
Rf =
d2

d1 = put hromatografiranog spoja u cm

d2 = put eluenta u cm
Upotreba TLC u industriji hrane
 Hromatografija na koloni
• TLC se koristi za separaciju malih kolicina
smjese.
• Ako zelimo razdvojiti vece kolicine komponenti u
smjesi-vise cvrste faze i vise rastvaraca. To se
postize hromatografijom na koloni.
• Cvrsta faza se pakuje u kolonu
• Rastvarac prolazi kroz kolonu
• Aplicira se uzorak (smjesa) na vrh kolone
• Zavisno od vrste mobilne faze, komponete smjese
se krecu prema izlazu kolone.
• Svaka komponenta smjese izlazi u razlicio vrijeme
• Sakupljanjem mobilne faze u porcijama zvanih
frakcije, mozemo razdvojiti svaku komponentu
smjese.
• Promjenom polarnosti mobilne faze koji se krece
kroz kolonu, mozemo povecati polarnost mobilne
faze, i tako mogu zaostati na koloni manje polarne
komponente iz smjese.
 High-performance liquid
chromatography, HPLC
• Mnogo sofisticiraniji metod hromatografije je
hromatografija poznata kao HPLC.
• Koriste se veoma fine cvrste cestice, pakovane u
koloni.
• Ovo poveceva povrsinu dostupnu za adsorpciju, pa
tako povecava efikasnost separacije.
• Kako su cvrste cestice pakovane cvrsto jedna uz
drugu, neophodna je pumpa da bi da bi pomogla
mobilnoj fazi da se krece kroz kolonu.
Komponente uređaja za HPLC

• Rezervoar mobilne faze

• Pumpa
• Injektor
• Kolona
• Detektor
 Tipovi HPLC-a

• Hromatografija na normalnim fazama

• Hromatografija na obrnutim fazama

 Hromatografija na normalnim
fazama
Ova metoda koristi:
• polarnu stacionarnu fazu
• nepolarnu mobilnu fazu
Koristi se kada je supstanca koja se analizira
polarna
• Polarna supstanca se adsorbira i zadržava na
česticama stacionarne faze. Jačina
adsorpcije je veća što je veća polarnost
supstance, a samim time je duze i vrijeme
zaržavanja. Korištenje polarnijih rastvarača
u mobilnoj fazi smanjuje retenciono
vrijeme.
• Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa
RMe2SiCl, gdje je R alkilna grupa ravnog lanca kao C18H37
ili C8H17.
• Vrijeme zadržavanja je duže za manje polarne supstance.
Vrijeme zadržavanja se povećava dodatkom polarnih
rastvarača u mobilnu fazu a smanjuje se dodatkom
hidrofobnih rastvarača.
• RP-HPLC funkcioniše na principu hidrofobnih interakcija,
koje su rezultat odbijajućih sila između polarnog rastvarača
i relativno nepolarne supstance koja se analizira i
nepolarne stacionarne faze.
 Hromatografija na obrnutim
fazama

• HPLC na obrnutim fazama (RP-HPLC)

• koristi nepolarnu stacionarnu fazu i
• polarnu mobilnu fazu.
 Detektori za HPLC
• Detektor ima važnu ulogu da detektuje
komponente koje izlaze iz kolone nakon eluiranja.
Detektor generiše električni signal koji je
proporcionalan intenzitetu neke osobine mobilne
faze ili supstance koja se eluira. Primjeri tipova
detektora u HPLC-u su:
• UV-VIS detektor
• Fluorescentni detektor
• Elektrohemijski detektor
• Detektor indeksa loma
GC/MS
•Kompleksne smjese se mogu veoma lako razdvojiti
gasnom hromatografijom, a MS se koristi za identifikaciju
individualnih komponenata, jer maseni spektar daje
informacije o njihovoj strukturi.

•obje tehnike koriste približno istu količinu uzorka u

gasovitom stanju (manje od 1 ng)