Lai phân tử: lai pha rắn

z Đích-đoạn dò
phát hiện
Đích-đoạn dò
Phát hiện và định danh bằng
z
đích-đoạn dò
phát hiện
kỹ thuật SHPT z Lai thay thế
đoạn (strand
displacement)
PGS.TS. Trần Cát Đông z Đánh bắt thuận
nghịch
(reversible target
capture)
z Que nhúng

Nhu cầu thay đổi Lai phân tử: lai pha lỏng
z Các PP truyền thống có từ thời Pasteur, Koch z Nhanh hơn, nhưng cần có bước
z Cấy phân lập trên môi trường chọn lọc, phân biệt tách trước khi phát hiện
z Hydroxyapatite gắn với ADN sợi
z Quan sát khóm, hiển vi, phản ứng sinh hóa
đôi
z Ưu điểm z Sepharose-Methidium
z Rẻ tiền, Đơn giản z Bảo vệ acrydinium ester
z Ít đòi hỏi kinh nghiệm, kỹ thuật cao chemiluminescent
z Được chấp nhận và tiêu chuẩn hóa
z Nhược điểm
z Mất thời gian
z Tốn lao động
z Không tự động hóa được
Que nhúng

Các phương pháp mới: Phát hiện Khuếch đại tín hiệu lai
z Lai acid nucleic
z Khuếch đại acid nucleic

Phương pháp Nhiệt độ Số đoạn mồi Enzyme

PCR Chu kỳ 2 DNA pol
LCR Chu kỳ 4 DNA ligase
TMA Đẳng nhiệt 2 RT, RNA pol RNaseH
SDA Đẳng nhiệt 2 DNA pol, RE
QRA Đẳng nhiệt 2 Qβ replicase
CPR Đẳng nhiệt 1 RNaseH

Lai phân tử Khuếch đại tín hiệu lai

Chiết tách
z Đoạn dò là ADN, ARN sợi đơn ADN vi khuẩn

ngắn (20 nu)

Gắn ADN vào màng
ADN đích
Màng
z Đánh dấu B B Lai với đoạn dò đánh
dấu bằng biotin
Đoạn dò được đánh
z Phóng xạ dấu biotin B B

z Enzyme

z Biotin Streptavidin
B B

z Chất nhuộm AP
B

z Acid nucleic đích: Alkaline phosphatase AP AP

biotinyl hóa B B

z Lựa chọn theo độ đặc hiệu

AP B B AP AP B B AP
B B

mong muốn
z Thường là các vùng bảo tồn
Cơ chất Alkaline
phosphatase Phát quang

z ARN vs ADN
AP AP
B B
AP B B AP AP B B AP
B B
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Phát hiện sản phẩm PCR - Lai
z Tổng hợp ADN mới nhờ
polymerase
z Nguy cơ:
z Ngoại nhiễm

z Không đặc hiệu

z Mất nhiều công

z Biến thể - Cải tiến
z Reverse (RT)

z Nested

z Multiplex

Loại bỏ ngoại nhiễm Phát hiện sản phẩm - ELISA

Mồi xuôi-Biotin ADN khuôn mẫu
B
z Tách riêng khâu 1
B D
xử lý và phân D
tích Sản phẩm Khuếch đại gen Mồi ngược-Digoxin
khuếch đại B
z Sử dụng UV 2 được đánh
z Sử dụng UNG dấu hai đầu
Đánh bắt trong giếng phủ streptavidin
D

z Sử dụng D

3
isopsoralen B
AP
Gắn kháng thể anti-
Giếng phủ Streptavidin
Digoxin có đánh dấu
D

4 B
Có màu
Giếng phủ Streptavidin
Thêm cơ chất AP

5
B

Giếng phủ Streptavidin

6 Máy so màu

Phát hiện sản phẩm khuếch đại Realtime PCR 1. SYBR Green I

Gắn mồi / đoạn dò

2. Phân hủy đoạn dò 3. Lai hóa đoạn dò

Đọc tín hiệu

z Nhuộm ADN z Phát hiện sản phẩm ngay

z Chậm, không tự động hóa trong ống phản ứng
đang diễn ra
z Độc hại
z Cho phép phát hiện sản
z Tăng nguy cơ nhiễm chéo Pha kéo dài 1
phẩm ma không mở ống
z Kỹ thuật lai z Cho phép định lượng
z Sản phẩm khuếch đại được lai với đoạn dò đặc hiệu
z Phát hiện và xác nhận sản phẩm
z PCR dùng primer huỳnh quang Pha kéo dài 2

z Đoạn mồi đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang (thường dùng
fluorescein cho màu lục hay rhodamin cho màu đỏ)
z Mồi thừa sau phản ứng được loại bỏ bằng sắc ký
z Sự hiện diện của sản phẩm PCR có huỳnh quang sẽ được phát hiện
Kết thúc chu kỳ PCR
như là dấu hiệu dương tính. Đọc tín hiệu
Đọc tín hiệu
z Độ nhạy rất cao, dễ dương tính giả.
z ELISA

Phát hiện sản phẩm - Nhuộm Nguyên lý TaqMan

Phân tử phát Phân tử dập
z Sản phẩm được điện di
z Nhuộm bằng ethidim bromid
z Đọc kết quả dưới UV
Biến tính
z So sánh với chứng hay chuẩn
C 1 2 3 4 5 M 6 7
Tín hiệu bị dập

Gắn mồi PCR

và đoạn dò TaqMan

Tín hiệu được giải phóng

Kéo dài
và phân hủy TaqMan
Phản ứng chuỗi ligase (LCR) Khuếch đại nhờ Qβ replicase (QRA)

z LCR: Ligase Chain Reaction z QRA: Qβ Replicase

Amplification
z Sử dụng 2 cặp mồi
z Midivariant-1 RNA (MDV-1)
bắt bổ sung liền được sao chép rất hiệu quả
nhau trên DNA đích nhờ Qβ Replicase
z Sử dụng ligase z MDV-1 tái tổ hợp có chứa
chịu nhiệt nối các trình tự bổ sung với DNA đích
mồi thành sản phẩm
z gap-LCR (PCR-LCR)
kết hợp PCR và LCR

LCR Giảm tín hiệu nền cho QRA

z RNase III có vị trí nhận diện là

Biến tính RNA sợi đôi
z MDV-1 tái tổ hợp
Gắn mồi
lai được với DNA đích làm mất
vị trí nhận diện của RNase III
và
Biến tính Biến tính không bị phân hủy
Nối T4 ligase z MDV-1 tái tổ hợp
không lai được với DNA đích
sẽ bị phân hủy bởi RNase III

Khuếch đại dựa trên sự phiên mã

Phản ứng phân hủy mồi (CPR)
(TMA)
z TMA: Transcription-Mediated Amplification: 3SR, NASBA z CPR: Cycling Probe Reaction

Khuếch đại thải sợi (SDA) So sánh các phương pháp

z SDA: Strand Displacement

Amplification Phương Số mẫu
Thời gian (giờ)
Hãng Kit
z 2 mồi SDA chứa vị trí nhận diện pháp tối đa
Thao tác Tổng
của HincII (downstream probe) và
2 mồi kéo dài (extend probe) LCR Abbott LCx 40 1-1,5 5,5 - 6,25

z 2’-deoxyadenosine 5’-O-(1- PCR Roche Amplicor 92 3 - 3,75 6,75 - 8

thiophosphate) dùng thay cho SDA B&D ProbeTec 46 1 - 1,25 3,1 - 3,8
dATP
TMA Gen-Probe Aptima 98 2,5 5,2